P. 1
Isolasi Dna

Isolasi Dna

|Views: 2,963|Likes:
Published by Annisa Chaerani

More info:

Categories:Types, School Work
Published by: Annisa Chaerani on Jul 18, 2010
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

06/01/2013

pdf

text

original

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER I

ISOLASI DNA

Oleh: Annisa Nurul Chaerani 411109059

DIII ANALIS KESEHATAN SEKOLAH TINGGI ILMU KESEHATAN JENDERAL AHMAD YANI CIMAHI 2010

1

ISOLASI DNA

A. Hari/ tanggal Praktikum Selasa/ 22 Juni 2010

B. Tujuan

Untuk mengukur konsentrasi dan kemurnian DNA

C. Prinsip Sentrifugasi DNA diikatkan dalam suatu fasa yaitu silica, setelah itu dilakukan pencucian dengan buffer kemudian di elusi (dilarutkan).

D. Dasar Teori DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orang tua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan

2

berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon DNA terdapat pada seluruh jaringan dan cairan tubuh. Oleh karena itu DNA genom dapat diisolasi dari semua bahan biologis yang mengandung sel berinti, seperti darah, semen, rambut, tulang, liur dan lain-lain. Bahan yang paling sering digunakan untuk tujuan isolasi DNA adalah darah dan rambut beserta akarnya, karena kedua bahan tersebut relatif mudah diperoleh. DNA genom yang diisolasi dapat digunakan untuk identifikasi DNA suatu organisme, baik dengan metode PCR (polymerase chain reaction) atau menggunakan enzim endonuklease restriksi (”DNA fingerprinting”). Hasil pemeriksaan dari kedua teknik tersebut kemudian dapat digunakan untuk diagnosis penyakit infeksi yang disebabkan oleh virus atau bakteri, mendeteksi adanya mutasi gen yang menimbulkan penyakit keganasan, penyakit herediter, menentukan jenis kelamin prenatal serta sebagai alat bantu forensik dalam bidang kedokteran. Darah (whole blood) dan sumsum tulang mamalia mengandung baik sel-sel berinti (sel darah putih) maupun sel-sel tidak berinti (sel darah merah). Untuk mengisolasi DNA dari darah dan sumsum tulang, sel darah merah yang tidak mengandung DNA genom harus dilisiskan dahulu agar dapat dipisahkan dari sel darah putih. Sel-sel darah putih yang sudah dipisahkan kemudian dilisiskan dengan bantuan bahan pengawet DNA yaitu, deterjen anionik yang dapat melarutkan komponen seluler. Bahan pengawet DNA juga dapat mengurangi aktivitas Dnase yang terdapat di dalam sel. Bila perlu dapat ditambahkan Rnase untuk menyingkirkan kontaminasi RNA. Selanjutnya dengan presitasi garam, DNA genom dipisahkan dari protein plasma dan inti. Akhirnya DNA genom diisolasi dengan presipitasi dengan alkohol dan pelarutan kembali endapan yang terbentuk dari larutan dapar yang mengandung suatu bahan pengawet DNA. Hasil isolasi DNA dikatakan baik apabila didapatkan DNA yang murni dan utuh.
3

Jumlah DNA yang didapat dari darah umumnya > dari 35 µg DNA per mL darah. Dari 150 µL sediaan, hasil DNA yang diharapkan berkisar antara 2,5 sampai 7,5 mg. DNA yang diperoleh sangat tergantung pada jumlah sel darah putih dalam sampel darah atau sumsum tulang. Jumlah sel darah putih dalam sampel bervariasi, tapi rata-rata terdapat 7 × 106/ mL darah. Setiap sel rata-rata mengandung 6 pikogram DNA. Hasil yang didapat mungkin lebih rendah, bila sampel darah dikumpulkan tanpa EDTA atau penyimpanannya tidak tepat, atau bila sampel disimpan lebih dari 5 hari sebelum digunakan dalam prosedur isolasi DNA ini. Pengukuran serapan DNA dilakukan pada panjang gelombang 260 nm (A 260). Pada A260 = 1, konsentrasi DNA adalah 50 mg/mL. Konsentrasi DNA (mg/mL) = A260 × 50 mg/m; Kemurnian DNA ditentukan dengan indeks kemurnian. DNA dikatakan murni bila memiliki indeks kemurnian > 1,75. Indeks Kemurnian = A260 / A280.

4

E. Alat dan Bahan 1. Spektrofotometer (Gene Quant) 2. Mikrosentrifuge 3. Mikrotube 4. Mikropipet 5. Binding buffer Komposisi : Guanidin Urea Tris HCl Tripton x 6. Proteinase K 7. Isopropanol 8. Inhibitor removal buffer Komposisi : Guanidin HCl Tris HCl 9. Wash buffer Komposisi : NaCl Tris HCl 10. Elution buffer 11. Sampel darah 20 mmol 20 molar, pH 7,5 5 molar 20 mmol, pH 6,6 6 molar 10 molar 10 mmol 20%, pH 4,4

5

F. Cara Kerja 1. Sampel dipipet sebanyak 200 µL dimasukkan ke dalam mikroube dan ditambahkan 200 µL binding buffer untuk mengikat DNA. 2. Ditambahkan 40 µL protease K (pelisis sel), homogenkan dengan mixer (mix max plus) selama 5 detik. kemudian diinkubasi pada suhu 70oC selama 10 menit. 3. Supernatan dipindahkan ke dalam mikrotube yang mengandung silica. 4. Ditambahkan 100 µl isopropanol untuk melarutkan DNA, disentrifuge 8000 g selama 1 menit. 5. Ditambahkan 500 µL inhibitor removal buffer untuk menghilangkan pengotor-pengotor, disentrifuge 13.000 rpm selama 10 detik. 6. Ditambahkan 500 µL wash buffer, disentrifuge 13.000 rpm selama 10 detik. Wash buffer dilakukan 2x untuk meyakinkan proses pembersihan. Buang supernatan. 7. Ditambahkan 200 µl elution buffer, disentrifuge 8000 g selama 1 menit. Pada saat penambahan elution buffer harus dipanaskan terlebih dahulu agar DNA lebih mudah larut. Setelah itu pindahkan isolat DNA ke dalam tube yang baru. 8. Selanjutnya pengukuran konsentrasi dan kemurnian dengan spektrofotometer atau disimpan pada suhu -4oC untuk penundaan identifikasi, pada suhu -200C (3 bulan) dan pada suhu -80oC (untuk penyimpanan lebih lama). 9. Untuk pengukuran konsentrasi dan kemurnian, DNA harus diencerkan terlebih dahulu. Dengan pengeceran 1/10 menggunakan larutan DD H2O (Double Destilat H2O/aquabidest). Pengenceran 1/10 : Isolat DNA 7 µL + DD H2O 63 µL

6

10. Pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA yang diperoleh dengan spektrofotometer: a. Kuvet dibilas dengan aquadest. b. Kemudian dibilas dengan DD H2O. c. Kuvet diisi DD H2O diset sebagai blanko, pada kuvet terdapat huruf Q, harus menghadap ke depan. Saat pengujian blanko absorbance harus = 0, kemudian tekan set ref. d. Masukkan isolat DNA yang telah diencerkan, tekan enter. e. Serapan DNA diukur pada panjang gelombang 260 nm.

Mekanisme kerja isolasi DNA

7

G. Hasil Pengamatan

Gambar 1. Hasil isolasi DNA

Gambar 2. Hasil pengukuran DNA menggunakan spektrofotometer Consentration : 22,85 µg/ml 230 280 260 260/230 260/280 : 0,524 A : 0,399 A : 0,457 A : 0,872 : 1,145

8

H. Pembahasan Berdasarkan hasil pengamatan didapat konsentrasi dan kemurnian DNA dari sampel darah menggunakan spektrofotometer (Gene Quant) adalah sebesar 22,85 µg dan 1,1. Nilai kemurnian yang diperoleh kurang dari standar yaitu 1,1. Nilai 1,1 menandakan, mungkin masih terdapat adanya protein pada saat proses pengendapan DNA, sehingga benang-benang kromosom masih bercampur dengan protein dan sampel darah yang digunakan sudah lama, sehingga hasil yang didapat kurang dari standar.

I. Kesimpulan Berdasarkan hasil pengamatan dan pembahasan didapat konsentrasi dan nilai kemurnian DNA dari sampel darah sebesar 22,85 µg dan 1,1. Dan dapat disimpulkan nilai kemurnian yang didapat 1,1 kurang dari standar 1,62,0 dan perlu dilakukan pemurnian ulang (urifikasi).

9

DAFTAR PUSTAKA

http://id.wikipedia.org/wiki/isolasi_dna.html http://www.chem-is-try.org/author/Sinly_Evan_Putra/ http://www.rbcbioscience.com/index.php http://miss-purplepharmacy.blogspot.com/2010/01/isolasi-dna.html

10

A

B

C Keterangan:

D

A. Homogenisasi sampel dengan Mixer (Mix max plus) B. Inkubator C. Mikrosentrifuge D. Spektrofometer (Gene Quant)

11

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->