BAB I

PENDAHULUAN

Saat ini kita telah diperlihatkan struktur dan fungsi utama gen. Kita siap
untuk memulai studi lebih rinc dari biologi molekuler. Titik berat pada
penyelidikan akan eksperimenkan para ahli biologi molekuler telah ditampilkan
struktur dan fungsi gen. Berdasarkan pendapat ini, kita akan membahas poin
iniuntuk mendiskusiksn metode eksperimen yang penting dari biologi
molekuler.Kita akan memulai pembahasan ini dengan tenik revolusi cloning gen.
Bayangkan kamu seorang ahli genetika pada tahun 1972. kamu ingin
mengamati struktur dan fungsi gen eukariotik pada tingkat molekuler. Kamu akan
terkesan dengan hormon pertumbuhan manusia (gen hgH). Apakah kandungan
utama dari gen ini? Mengapa promotor terlihat seperti itu? Apa peran RNA
polimerase pada gen? Apa yang terjadi pada gen jika kondisi berubah?.
Pertanyaan-pertanyaan tersebut tidak akan bias dijawab jika tidak mempelajari
gen dengan jelas.
Dengan menyisipkan gen asing pada bakteri, maka bakteri tersebut dapat
memproduksi banyak gen baru dengan bentuk yang jelas. Hal ini akan dibahas
bagaimana klon gen pada bakteri dan eukariotik.
 BAB II
KAJIAN PUSTAKA

METODE EKSPRESI KLONING GEN

Mengapa kita ingin mengkloning gen? Untuk sebuah sebab yang
terlupakan mendorong untuk memulai materi ini. Cloning termasuk usaha
memproduksi dalam jumlah yang luas sesuai dengan fakta rangkaian DNA yang
telah kita pelajari secara terperinci. Demikian gen dengan sendirinya mampu
menjadi produk berharga dari cloning gen. Cloning gen merupakan jalan lain
untuk memperluas jumlah produk gen. Salah satu keuntungan untuk menyelidiki
tujuan ini.
Jika jalan menggunakan bakteri untuk memproduksi produk protein dari
sebuah cloning gen eukariotik khususnya yang lebih tinggi tingkatannya. DNA
mungkin akan bekerja lebih baik dari pada sebuah gen yang dipotong secara
langsung dari genom. Karena paling banyak gen eukariotik tinggi berisi
penghambat sehingga bakteri tidak dapat menghadapi sel-sel eukariotik tersebut.
Sel-sel eukariotik ini biasanya diterjemahkan oleh penghambat penyusun pre
mRNA dan memotong keluar susunan sisanya secara bersama untuk menyusun
mRNA dewasa. Demikian sebuah DNA yang mengkopi sebuah mRNA yang telah
siap memindah penghambat dan mampu mengekspresikan secara benar dalam sel
bakteri.
Vector ekspresi
Vektor yang kita miliki untuk mengamati sangat jauh akan digunakan
utamnaya dalam cloning langkah pertama ketika pertama kali kita mengamil DNA
dari dlam dan memasukkan ke sebuah bakteri untuk mendapatka replikasi. Pada
umumnya mereka bekerja untuk tujuan tersebut, siap tumbuh dalam E. Coli dan
memproduksi hasil yang tinggi dari DNA rekombinan. beberapa dari mereka
bekerja pada vector ekspresi yang dapat menghasilkan produk protein dari gen
yang dikloning. Contohnya pUC dan pBS yang terletak pada sisipan vector dan
diatur oleh promotor utama, bekerja di daerah kelipatan cloning. Jika sebuah
DNA disisipkan di tempat yang sama dengan gen Lac z, peleburan protein akan
dihasilkan. Ini akan mempunyai sebuah bagian dari protein beta galaktosida pada
amino terakhir dengan penyusun protein lain, diterjemahkan dalam sisipan DNA,
pada karboksil terakhir.
Bagaimanapun jika kita mengutamakan ekspresi tinggi dari gen cloning
khususnya vector ekspresi biasanya akan bekerja lebih baik. Vector ekspresi
bakteri mempunyai sifat 2 elemen yang pasti bekerja aktif dalam ekspresi gen,
pengatur yang kuat dan ribosom yang digabung di daerah inisiasi kodon ATG.
Salah satu promotor yang kuat adalah promotor trp (trytophan operon)
tersusun dengan dasar untuk beberapa vector ekspresi, termasuk ptrp. Vector yang
bekerja mempunyai promotor triptophan ataupun wilayah operator, termasuk
dengan kumpulan berbagai wilayah ribosom dan dapat digunakan secara langsung
untuk vector ekspresi dengan sisipan gen wilayah ribosom.
Penyebab vector ekspresi biasanya menguntungkan untuk gen yang
dikloning dan menahan sampai waktunya. Suatu alasan protein eukaryotik
diproduksi dalam jumlah yang besar pada bakteri untuk menghambat racun. Rata-
rata protein ini bukan merupakan racun sebenarnya , tetapi mereka dapat
meningkatkan perlindungan mereka untuk ikut serta dalam pertumbuhan bakteri.
Masalah lain jika cloning gen termasuk penghambat secara tetap. Gen bakteri
bersifat tidak akan tumbuh menjadi konsentrasi yang cukup besar untuk
memproduksi jumlah produk protein yang signifikan. Solusi untuk menjaga
cloning gen dimatikan dengan menempatkan pada barisan promotor yang
memungkinkan.
Promotor lac adalah penyebab menjadi luas, kira-kira diartikan sampai
rangsangan yang dibuat sebagai penyebab isipropilgalaktoside (IPTG).
Bagaimanapun, menahan disebabkan oleh penahan lac yang tidak komplet (bocor)
dan beberapa cloning gen akan diamati keberadaannya. Salah satu jalan keluar
dari masalah ini adalah ekspresi gen dalam plasmid atau pembawa lac itu sendiri
(penyebab gen). Kelebihan penahan diproduksi sebagai vector yang menjaga
cloning gen dihentikan sampai waktu yang telah ditentukan.
Strategi lain menggunakan promotor sempit yang diatur sebagai bagian
alfa. Vector ekspresi dengan system promotor yang dikloning dalam sel induk
yang mempunyai temperatur sensitive terhadap gen alfa. Sel-sel ini terjaga dalam
tempratur yang relatif rendah (320C), penyebab fungsi dan ekspresi bekerja .
bagaimanpun ketika suhu meningkat sampai suhu yang tidak diinginkan (420C),
temperatur ini menyebabkan fungsi cloning gen tidak dapat diperpanjang.
Metode yang sangat terkenal menjamin kontrol yang sempit, dengan
meninggikan level mampu mengakibatkan ekspresi, sampai tempatnya gen akan
berekspresi dengan plasmid yang diatur oleh T7. kemudian plasmid ini ditaruh
dalam sel yang berisi regulasi sempit untuk RNA polimerase T7. sebagai contoh
gen RNA mungkin dibawah pengaruh promotor lac yang dimodifikasi dalam sel
untuk menahan promotor lac. Gen T7 dengan kuat menahan factor lac sampai
polimerase T7 diberikan sepanjang gen trankripsi. Secepatnya penyebab lac
diakhiri sel mulai membuat T7 polymerase , gen penting polymerase diterjemah.
Dan karena banyak molekul T7 polymerase yang dibuat, gen ini berpindah dalam
level yang sangat tinggi dan jumlah produk protein yang dibuat berlebihan.
Ringkasan: garis ekspresi didesain untuk menghasilkan produk protein berupa gen
cloning, biasanya mungkin dalam jumlah yang sangat besar untuk memastikan
ekspresi, garis ini masuk dalam promotor bakteri yang kuat dan ribosom bakteri
digabung diwilayah yang memungkinkan terjadinya gen eukaryotik. Sebagian
besar garis cloning merupakan penyebab yang termasuk produksi berlebihan
sebelum waktunya sebuah produk yang mampu meracuni protein dalam sel.
Gen ekspresi yang memproduksi protein peleburan. Sebagian besar vector
ekspresi memproduksi protein peleburan ini mungkin terlihat sebagai keuntungan
karena produk alami gen sisipan yang tiadak dihasilkan. Bagaimanapun asam
amino ekstra dalam peleburan protein dapat menjadi besar dengan bantuan dalam
membersihkan produk protein.
Pertimbangan garis ekspresi oligohistidin. suatu yang terkenal dengan
nama PpTrcHis. Ini mempunyai susunan pendek sebagai barisan wilayah lipatan
cloning yang diterjemahkan dengan 6 histidin. Demikian ekspresi protein sebagai
garis akhir yang kan melebur menjadi enam histidin sebagai amino akhir.
Oligohistidin wilayah ini mempunyai afinitas tinggi untuk metal seperti nikel.
Setelah bakteri membuat peleburan protein kemudian meletakkannya dengan
histidin atau histidin sebagai analog yang disebut imidazole. Ini mungkin terjadi
karena terlalu sedikit protein alami yang termasuk wilayah histidin, jadi peleburan
protein ini hanya salah satu penggabungan kolom.
 Wilayah alfa juga telah bergiliran sebagai tempat untuk vector ekspresi,
satu disusun kusus untuk tujua ini. Wilayah cloning terletak tanpa gen lac z jadi
produk sisipan gen masuk dengan benar masuk dalam garis ini akan melebur
protein dengan pengaruh beta galaktosida.
Garis ekspresi alfa menjadi sarana penting untuk melihat dan membuat
DNA. Dalam contoh yang telah dibuat dengan cepat telah diketahui dengan
nukleotida atau polinukleotida. Bagian utama disusun dengan prosedur kumpulan
DNA dan antiserum yang digabung dalam kumpulan penting.
Bagian alfa dengan variasi cDNA disisipkan pada tempatnya dan protei
ditempatkan dengan cloning sendiri yang mendorong nitroselulosa, suatu protein
dari bagian masing-masing telah dikirimkan kenitroselulosa,mereka dapat
menjaga dengan antiserum. Berikutnya antibody ditemukan protein dari bagian
particular yang ditemukan menggunakan protein A dari Staphilococcus aurius.
Protein ini di gabung dengan sempit untuk antibody dan pemberian tanda
pengirim titik nitroselulose. Tercatat beberapa protein peleburan yang ditemukan
bukan protein utama dari sel inang. Selanjutnya jika bahan bukan cDNA
dikloning ataupun tidak anti serum dicampur dengan antibody anti beta
galaktosida.
Rata-rata bagian cDNA mampu karena mereka dapat melengkapi dengan
RACE, kita dapat melihatnya dengan cepat pada bagian ini. Beta galaktosida
sebagai pelebur protein membantu menyeimbangkannya dalam sel bakteri dan
rata-rata dapat membuat penyebaran dengan mudah afinitas kromatografi dalam
bagian yang tersusun dari antibody anti beta galaktosida.
Rangkuman : garis ekpresi berkali kali memproduksi peleburan protein
dengan satu bagian protein dating dari penandaan susunan garis dan bagian lain
dari susunan cloning gen itu sendiri. Banyak peleburan protein telah mendapat
keuntungan besar menjadi pelindung sederhana dengan afinitas kromatografi garis
λ gt11 memproduksi protein peleburan yang dapat dideteksi dalam tempat
dengan anti serum yang spesifik.
 BAB III
PEMBAHASAN

Produksi protein peleburan cloning P dalam plasmid.

Sisipan dalam DNA (kuning) ke dalam lipatan daerah cloning (MCS).
Transkripsi dari promotor lac (ungu) memberi sifat beda untuk memulai dengan
sidikit kodon lac z yang dipakai untuk sisipan disusun kemudian kembali ke lac z
(merah). mRNA ini ditranslasikan untuk melebur protein. Asam amino yang
tersusun dari sedikit beta galaktosida pada awal (akhir asam amino) termasuk
sisipan asam amino untuk sisa protein, karena sisipan tersusun dari translasi
kodon stop, sisa kodon lac z tidak ditranslasikan.

Dua batasan kegunaan ekspresi ptprL 1

Vektor yang mengandung sisi cloning Clal yang didahului oleh Cahaya,
yaitu sisi perakitan ribosom dalgarno (SD) dan daerah operator-promotor trp
(trpO,P), proses transkripsi terjadi berlawanan arah jarum jam secara langsung
yang ditunjukkan oleh barisan (atas). Vektor yang digunakan sebagai
pengekspresian sederhana (kiri) dengan menyisipkan kode daerah asing (X, hijau)
kedalam sisi Clal. Atau dengan jalan lain (kanan). Daerah pengatur trp (ungu)
dapat dipotong dengan Clal dan HindIII dan disisipkan dalam plasmid lain
sebagai kode daerah (Y, kuning) diekspresikan.

Menggunakan vector pengekspresian Oligohistidin

a. Peta dari vector oligohistidin generic. Hanya setelah kodon inisiasi ATG (hijau)
meninggalkan daerah penkodean (merah) diakhiri dengan penterjemahan 6
histidin dalam satu baris [(His)6]. Ini membiarkan daerah (orange) sisi pembangun
untuk proteolitik enzim enterokinase (EK). Akhirnya, Vektor mempunyai sisi
cloning yang banyak (MCS, biru). Biasanya, vector terbentuk 3 susunan dengan
sisi MCS dalam masing-masing bingkai yang terbaca. Satu dapat dipilih vector
yang mengambil gen wilayah kanan yang sesuai untuk oligohistidin. b.
penggunaan vector: 1. menyisipkan gen penting (kuning) ke vector dalam wilayah
dengan oligohistidin ditandai daerah (merah) dan membentuk kembali sel-sel
bakteri dengan vector rekombinan. Sel-sel memproduksi protein peleburan (merah
dan kuning), protein yang dihasilkan oleh protein (hijau). 2. Sel-sel lyse
membentuk campuran protein. 3. Menyebarkan sel lysate setelah kolom afinitas
kromatografi nikel, yang menggabung protein peleburan tetapi bukan protein lain.
4. membentuk protein peleburan dari kolom dengan hidtidin atau imidazole, mirip
histidin yang bersaing dengan hidtidin untuk begabung dengan nikel. 5.
memotong protein peleburan dengan enterokinase. 6. melewati protein yang telah
dipotong kolom nikel sekali untuk disebarkan oligohistidin dari protein yang
diperlukan.

Pembentukan protein peleburan dalam λ gt11

Gen diekspresikan (hijau) yang disisipkan dalam dekat sisi EcoRI berakhir dengan
wilayah pengkodean lac z (merah). Hanya dialirkan dalam pengakhir transkripsi.
Demikian induksi gen lac z oleh IPTG, arah peleburan mRNA, mengandung
daerah pengkodean yang disisipkan hanya untuk memindahkan bagian terbesar
kode wilayah beta galaktosida. mRNA ini ditranslasi oleh sel asal ke protein
peleburan.

Deteksi positif λ gt11 mengkloning dengan lapisan antibody

Sebuah penyaring digunakan untuk butiran protein dari fage plak dalam petri disk.
Satu cloning (merah) telah memproduksi sebuah plak yang berisi protein
peleburan termasuk beta galaktosida dan sebagian protein penting. Penyaring
dengan butiran protein diinkubasi dengan ditandai protein A Staphylococcus,
yang digabung dengan sebagian besar antibody. Hal ini akan hanya mengikat
antibody dan antigen komplek pada titik pelaku cloning positif. Titik gelap dalam
tempat dhubungkan dengan penyaring menampakkan lokasi cloning positif.
 BAB IV
SIMPULAN

Metode ekspresi cloning gen terdiri dari 5 macam proses, yaitu :

1. Produksi protein peleburan cloning P dalam plasmid.
2. Dua batasan kegunaan ekspresi ptprL 1
3. Menggunakan vector pengekspresian Oligohistidin
4. Pembentukan protein peleburan dalam λ gt11
5. Deteksi positif λ gt11 mengkloning dengan lapisan antibody