P. 1
Metode Ekspresi Kloning Gen

Metode Ekspresi Kloning Gen

|Views: 1,478|Likes:
DOWNLOAD : http://www.ziddu.com/download/10801444/METODEEKSPRESIKLONINGGEN.pdf.html
DOWNLOAD : http://www.ziddu.com/download/10801444/METODEEKSPRESIKLONINGGEN.pdf.html

More info:

Published by: Hendrik_Nurfitrianto on Jul 20, 2010
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOC or read online from Scribd
See more
See less

05/26/2013

BAB I PENDAHULUAN Saat ini kita telah diperlihatkan struktur dan fungsi utama gen.

Kita siap untuk memulai studi lebih rinc dari biologi molekuler. Titik berat pada penyelidikan akan eksperimenkan para ahli biologi molekuler telah ditampilkan struktur dan fungsi gen. Berdasarkan pendapat ini, kita akan membahas poin iniuntuk mendiskusiksn metode eksperimen yang penting dari biologi molekuler.Kita akan memulai pembahasan ini dengan tenik revolusi cloning gen. Bayangkan kamu seorang ahli genetika pada tahun 1972. kamu ingin mengamati struktur dan fungsi gen eukariotik pada tingkat molekuler. Kamu akan terkesan dengan hormon pertumbuhan manusia (gen hgH). Apakah kandungan utama dari gen ini? Mengapa promotor terlihat seperti itu? Apa peran RNA polimerase pada gen? Apa yang terjadi pada gen jika kondisi berubah?. Pertanyaan-pertanyaan tersebut tidak akan bias dijawab jika tidak mempelajari gen dengan jelas. Dengan menyisipkan gen asing pada bakteri, maka bakteri tersebut dapat memproduksi banyak gen baru dengan bentuk yang jelas. Hal ini akan dibahas bagaimana klon gen pada bakteri dan eukariotik.

BAB II KAJIAN PUSTAKA METODE EKSPRESI KLONING GEN Mengapa kita ingin mengkloning gen? Untuk sebuah sebab yang terlupakan mendorong untuk memulai materi ini. Cloning termasuk usaha memproduksi dalam jumlah yang luas sesuai dengan fakta rangkaian DNA yang telah kita pelajari secara terperinci. Demikian gen dengan sendirinya mampu menjadi produk berharga dari cloning gen. Cloning gen merupakan jalan lain untuk memperluas jumlah produk gen. Salah satu keuntungan untuk menyelidiki tujuan ini. Jika jalan menggunakan bakteri untuk memproduksi produk protein dari sebuah cloning gen eukariotik khususnya yang lebih tinggi tingkatannya. DNA mungkin akan bekerja lebih baik dari pada sebuah gen yang dipotong secara langsung dari genom. Karena paling banyak gen eukariotik tinggi berisi penghambat sehingga bakteri tidak dapat menghadapi sel-sel eukariotik tersebut. Sel-sel eukariotik ini biasanya diterjemahkan oleh penghambat penyusun pre mRNA dan memotong keluar susunan sisanya secara bersama untuk menyusun mRNA dewasa. Demikian sebuah DNA yang mengkopi sebuah mRNA yang telah siap memindah penghambat dan mampu mengekspresikan secara benar dalam sel bakteri. Vector ekspresi Vektor yang kita miliki untuk mengamati sangat jauh akan digunakan utamnaya dalam cloning langkah pertama ketika pertama kali kita mengamil DNA dari dlam dan memasukkan ke sebuah bakteri untuk mendapatka replikasi. Pada umumnya mereka bekerja untuk tujuan tersebut, siap tumbuh dalam E. Coli dan memproduksi hasil yang tinggi dari DNA rekombinan. beberapa dari mereka bekerja pada vector ekspresi yang dapat menghasilkan produk protein dari gen yang dikloning. Contohnya pUC dan pBS yang terletak pada sisipan vector dan diatur oleh promotor utama, bekerja di daerah kelipatan cloning. Jika sebuah DNA disisipkan di tempat yang sama dengan gen Lac z, peleburan protein akan dihasilkan. Ini akan mempunyai sebuah bagian dari protein beta galaktosida pada

amino terakhir dengan penyusun protein lain, diterjemahkan dalam sisipan DNA, pada karboksil terakhir. Bagaimanapun jika kita mengutamakan ekspresi tinggi dari gen cloning khususnya vector ekspresi biasanya akan bekerja lebih baik. Vector ekspresi bakteri mempunyai sifat 2 elemen yang pasti bekerja aktif dalam ekspresi gen, pengatur yang kuat dan ribosom yang digabung di daerah inisiasi kodon ATG. Salah satu promotor yang kuat adalah promotor trp (trytophan operon) tersusun dengan dasar untuk beberapa vector ekspresi, termasuk ptrp. Vector yang bekerja mempunyai promotor triptophan ataupun wilayah operator, termasuk dengan kumpulan berbagai wilayah ribosom dan dapat digunakan secara langsung untuk vector ekspresi dengan sisipan gen wilayah ribosom. Penyebab vector ekspresi biasanya menguntungkan untuk gen yang dikloning dan menahan sampai waktunya. Suatu alasan protein eukaryotik diproduksi dalam jumlah yang besar pada bakteri untuk menghambat racun. Ratarata protein ini bukan merupakan racun sebenarnya , tetapi mereka dapat meningkatkan perlindungan mereka untuk ikut serta dalam pertumbuhan bakteri. Masalah lain jika cloning gen termasuk penghambat secara tetap. Gen bakteri bersifat tidak akan tumbuh menjadi konsentrasi yang cukup besar untuk memproduksi jumlah produk protein yang signifikan. Solusi untuk menjaga cloning gen dimatikan dengan menempatkan pada barisan promotor yang memungkinkan. Promotor lac adalah penyebab menjadi luas, kira-kira diartikan sampai rangsangan yang dibuat sebagai penyebab isipropilgalaktoside (IPTG). Bagaimanapun, menahan disebabkan oleh penahan lac yang tidak komplet (bocor) dan beberapa cloning gen akan diamati keberadaannya. Salah satu jalan keluar dari masalah ini adalah ekspresi gen dalam plasmid atau pembawa lac itu sendiri (penyebab gen). Kelebihan penahan diproduksi sebagai vector yang menjaga cloning gen dihentikan sampai waktu yang telah ditentukan. Strategi lain menggunakan promotor sempit yang diatur sebagai bagian alfa. Vector ekspresi dengan system promotor yang dikloning dalam sel induk yang mempunyai temperatur sensitive terhadap gen alfa. Sel-sel ini terjaga dalam tempratur yang relatif rendah (320C), penyebab fungsi dan ekspresi bekerja .

bagaimanpun ketika suhu meningkat sampai suhu yang tidak diinginkan (420C), temperatur ini menyebabkan fungsi cloning gen tidak dapat diperpanjang. Metode yang sangat terkenal menjamin kontrol yang sempit, dengan meninggikan level mampu mengakibatkan ekspresi, sampai tempatnya gen akan berekspresi dengan plasmid yang diatur oleh T7. kemudian plasmid ini ditaruh dalam sel yang berisi regulasi sempit untuk RNA polimerase T7. sebagai contoh gen RNA mungkin dibawah pengaruh promotor lac yang dimodifikasi dalam sel untuk menahan promotor lac. Gen T7 dengan kuat menahan factor lac sampai polimerase T7 diberikan sepanjang gen trankripsi. Secepatnya penyebab lac diakhiri sel mulai membuat T7 polymerase , gen penting polymerase diterjemah. Dan karena banyak molekul T7 polymerase yang dibuat, gen ini berpindah dalam level yang sangat tinggi dan jumlah produk protein yang dibuat berlebihan. Ringkasan: garis ekspresi didesain untuk menghasilkan produk protein berupa gen cloning, biasanya mungkin dalam jumlah yang sangat besar untuk memastikan ekspresi, garis ini masuk dalam promotor bakteri yang kuat dan ribosom bakteri digabung diwilayah yang memungkinkan terjadinya gen eukaryotik. Sebagian besar garis cloning merupakan penyebab yang termasuk produksi berlebihan sebelum waktunya sebuah produk yang mampu meracuni protein dalam sel. Gen ekspresi yang memproduksi protein peleburan. Sebagian besar vector ekspresi memproduksi protein peleburan ini mungkin terlihat sebagai keuntungan karena produk alami gen sisipan yang tiadak dihasilkan. Bagaimanapun asam amino ekstra dalam peleburan protein dapat menjadi besar dengan bantuan dalam membersihkan produk protein. Pertimbangan garis ekspresi oligohistidin. suatu yang terkenal dengan nama PpTrcHis. Ini mempunyai susunan pendek sebagai barisan wilayah lipatan cloning yang diterjemahkan dengan 6 histidin. Demikian ekspresi protein sebagai garis akhir yang kan melebur menjadi enam histidin sebagai amino akhir. Oligohistidin wilayah ini mempunyai afinitas tinggi untuk metal seperti nikel. Setelah bakteri membuat peleburan protein kemudian meletakkannya dengan histidin atau histidin sebagai analog yang disebut imidazole. Ini mungkin terjadi karena terlalu sedikit protein alami yang termasuk wilayah histidin, jadi peleburan protein ini hanya salah satu penggabungan kolom.

Wilayah alfa juga telah bergiliran sebagai tempat untuk vector ekspresi, satu disusun kusus untuk tujua ini. Wilayah cloning terletak tanpa gen lac z jadi produk sisipan gen masuk dengan benar masuk dalam garis ini akan melebur protein dengan pengaruh beta galaktosida. Garis ekspresi alfa menjadi sarana penting untuk melihat dan membuat DNA. Dalam contoh yang telah dibuat dengan cepat telah diketahui dengan nukleotida atau polinukleotida. Bagian utama disusun dengan prosedur kumpulan DNA dan antiserum yang digabung dalam kumpulan penting. Bagian alfa dengan variasi cDNA disisipkan pada tempatnya dan protei ditempatkan dengan cloning sendiri yang mendorong nitroselulosa, suatu protein dari bagian masing-masing telah dikirimkan kenitroselulosa,mereka dapat menjaga dengan antiserum. Berikutnya antibody ditemukan protein dari bagian particular yang ditemukan menggunakan protein A dari Staphilococcus aurius. Protein ini di gabung dengan sempit untuk antibody dan pemberian tanda pengirim titik nitroselulose. Tercatat beberapa protein peleburan yang ditemukan bukan protein utama dari sel inang. Selanjutnya jika bahan bukan cDNA dikloning ataupun tidak anti serum dicampur dengan antibody anti beta galaktosida. Rata-rata bagian cDNA mampu karena mereka dapat melengkapi dengan RACE, kita dapat melihatnya dengan cepat pada bagian ini. Beta galaktosida sebagai pelebur protein membantu menyeimbangkannya dalam sel bakteri dan rata-rata dapat membuat penyebaran dengan mudah afinitas kromatografi dalam bagian yang tersusun dari antibody anti beta galaktosida. Rangkuman : garis ekpresi berkali kali memproduksi peleburan protein dengan satu bagian protein dating dari penandaan susunan garis dan bagian lain dari susunan cloning gen itu sendiri. Banyak peleburan protein telah mendapat keuntungan besar menjadi pelindung sederhana dengan afinitas kromatografi garis λ gt11 memproduksi protein peleburan yang dapat dideteksi dalam tempat dengan anti serum yang spesifik.

BAB III PEMBAHASAN Produksi protein peleburan cloning P dalam plasmid. Sisipan dalam DNA (kuning) ke dalam lipatan daerah cloning (MCS). Transkripsi dari promotor lac (ungu) memberi sifat beda untuk memulai dengan sidikit kodon lac z yang dipakai untuk sisipan disusun kemudian kembali ke lac z (merah). mRNA ini ditranslasikan untuk melebur protein. Asam amino yang tersusun dari sedikit beta galaktosida pada awal (akhir asam amino) termasuk sisipan asam amino untuk sisa protein, karena sisipan tersusun dari translasi kodon stop, sisa kodon lac z tidak ditranslasikan. Dua batasan kegunaan ekspresi ptprL 1 Vektor yang mengandung sisi cloning Clal yang didahului oleh Cahaya, yaitu sisi perakitan ribosom dalgarno (SD) dan daerah operator-promotor trp (trpO,P), proses transkripsi terjadi berlawanan arah jarum jam secara langsung yang ditunjukkan oleh barisan (atas). Vektor yang digunakan sebagai pengekspresian sederhana (kiri) dengan menyisipkan kode daerah asing (X, hijau) kedalam sisi Clal. Atau dengan jalan lain (kanan). Daerah pengatur trp (ungu) dapat dipotong dengan Clal dan HindIII dan disisipkan dalam plasmid lain sebagai kode daerah (Y, kuning) diekspresikan. Menggunakan vector pengekspresian Oligohistidin a. Peta dari vector oligohistidin generic. Hanya setelah kodon inisiasi ATG (hijau) meninggalkan daerah penkodean (merah) diakhiri dengan penterjemahan 6 histidin dalam satu baris [(His)6]. Ini membiarkan daerah (orange) sisi pembangun untuk proteolitik enzim enterokinase (EK). Akhirnya, Vektor mempunyai sisi cloning yang banyak (MCS, biru). Biasanya, vector terbentuk 3 susunan dengan sisi MCS dalam masing-masing bingkai yang terbaca. Satu dapat dipilih vector yang mengambil gen wilayah kanan yang sesuai untuk oligohistidin. b. penggunaan vector: 1. menyisipkan gen penting (kuning) ke vector dalam wilayah dengan oligohistidin ditandai daerah (merah) dan membentuk kembali sel-sel bakteri dengan vector rekombinan. Sel-sel memproduksi protein peleburan (merah

dan kuning), protein yang dihasilkan oleh protein (hijau). 2. Sel-sel lyse membentuk campuran protein. 3. Menyebarkan sel lysate setelah kolom afinitas kromatografi nikel, yang menggabung protein peleburan tetapi bukan protein lain. 4. membentuk protein peleburan dari kolom dengan hidtidin atau imidazole, mirip histidin yang bersaing dengan hidtidin untuk begabung dengan nikel. 5. memotong protein peleburan dengan enterokinase. 6. melewati protein yang telah dipotong kolom nikel sekali untuk disebarkan oligohistidin dari protein yang diperlukan. Pembentukan protein peleburan dalam λ gt11 Gen diekspresikan (hijau) yang disisipkan dalam dekat sisi EcoRI berakhir dengan wilayah pengkodean lac z (merah). Hanya dialirkan dalam pengakhir transkripsi. Demikian induksi gen lac z oleh IPTG, arah peleburan mRNA, mengandung daerah pengkodean yang disisipkan hanya untuk memindahkan bagian terbesar kode wilayah beta galaktosida. mRNA ini ditranslasi oleh sel asal ke protein peleburan. Deteksi positif λ gt11 mengkloning dengan lapisan antibody Sebuah penyaring digunakan untuk butiran protein dari fage plak dalam petri disk. Satu cloning (merah) telah memproduksi sebuah plak yang berisi protein peleburan termasuk beta galaktosida dan sebagian protein penting. Penyaring dengan butiran protein diinkubasi dengan ditandai protein A Staphylococcus, yang digabung dengan sebagian besar antibody. Hal ini akan hanya mengikat antibody dan antigen komplek pada titik pelaku cloning positif. Titik gelap dalam tempat dhubungkan dengan penyaring menampakkan lokasi cloning positif.

BAB IV SIMPULAN Metode ekspresi cloning gen terdiri dari 5 macam proses, yaitu : 1. Produksi protein peleburan cloning P dalam plasmid. 2. Dua batasan kegunaan ekspresi ptprL 1 3. Menggunakan vector pengekspresian Oligohistidin 4. Pembentukan protein peleburan dalam λ gt11 5. Deteksi positif λ gt11 mengkloning dengan lapisan antibody

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->