PRODUKSI REKOMBINAN PROTEIN VIRUS JEMBRANA (J Gag 6) UNTUK ANTIGEN ELISA.

(The Production of Jembrana Virus Recombinant Protein for Elisa Antigen(J Gag 6) Ni Luh Putu Agustini dan Nining Hartaningsih Balai Penyidikan dan Pengujian Veteriner, Regional VI, Denpasar

ABSTRAK Uji Elisa untuk mendeteksi antibodi Jembrana pada sapi yang terinfeksi Jembrana Disease (JD) telah dikembangkan sejak tahun 1993. Sampai tahun 2001, uji ini masih menggunakan antigen sucrose (N 90) yang dibuat dari whole Jembrana virus, yang dalam produksinya selalu membutuhkan hewan donor (sapi Bali) dan ultracentrifuge. Sebagai alternatif dari proses produksi antigen N90 yang mahal tersebut, diupayakan pembuatan antigen dengan teknik rekombinan protein. Sejak tahun 2003, teknik pembuatan antigen J Gag 6 telah berhasil dilakukan di Laboratorium Bioteknologi, BPPV, Regional VI, Denpasar dan digunakan untuk antigen Elisa. Produksi rekombinan protein ini bertujuan untuk mendapatkan antigen baru sebagai pengganti dari sucrose antigen untuk menghasilkan diagnose yang cepat dan akurat. Dalam proses produksi antigen J Gag 6, potongan gen virus Jembrana dimasukkan ke dalam plasmid, kemudian rekombinan plasmid ditransfeksikan ke dalam E. coli dan selanjutnya dilakukan produksi protein yang diperbanyak dalam media 2 YT. Hasil perbanyakan tersebut kemudian disonikasi dan dilisiskan untuk mengeluarkan kembali potongan virus yang sebelumnya dimasukkan, selanjutnya dilakukan purifikasi dengan menggunakan soflink avidin resin untuk mendapatkan antigen yang murni. Sebelum digunakan sebagai antigen Elisa dan Western Blotting, dilakukan kuantifikasi untuk mendapatkan volume pengenceran yang harus dilakukan. Kata kunci : virus Jembrana, protein rekombinan, antigen Elisa

ABSTRACT The Elisa to detecs Jembrana disease antibodies in infected cattle has been developed since 1993. Until 2001 the sucrose antigen still be used for the Elisa test. It was produced from the whole Jembrana virus. The production of the antigen requires Bali cattle and ultracentrifugation technique. Since 2003 new recombinant capsid protein (J Gag 6) has been succsessfully produced by the Biotechnology Laboratory of BPPV (DIC) and now being used as an Elisa antigen in DIC Denpasar. The aim of the antigen production is to get a new that can replace the sucrose antigen, hopely it will give a quicker and more accurate diagnose. The production of J Gag 6 antigen have been done by inserting JDV genes into plasmid. The recombinant plasmid was then transfected into E. coli and protein produced in E. coli. using was multiplied 2 YT media. Biotinylated protein was purified using a soflink avidin resin. The successfull production of the antigen can be identified by using streptavidin conjugated to alkaline phosphatase. Successfully of the production the antigen showed by was found the same molecular weigh protein with J Gag 6 control. Before used as an antigen, the protein must be quantified in order to know the antigen dilution for Elisa and Western Blotting. Keywords : Jembrana virus, recombinant protein, Elisa antigen

PENDAHULUAN Penyakit Jembrana merupakan penyakit viral yang bersifat akut dan kadang fatal pada sapi Bali. Selain diprovinsi Bali, kasus JD dilaporkan telah terjadi dibeberapa daerah di Indonesia seperti : Lampung, Bengkulu, Sumatera Barat,

Sumatera Selatan, Kalimantan Selatan, dan Kalimantan Timur.(Hartaningsih , 2005). Dalam mendiagnosa penyakit Jembrana, beberapa macam uji telah dikembangkan. Salah satunya adalah uji serologis Elisa yang telah

Dengan teknik ini. antigen merupakan salah satu faktor penting yang harus ada karena prinsip dasar dari uji Elisa adalah ikatan antara antigen dengan antibodi yang homolog. Regional VI. Dalam uji Elisa.. Sejalan dengan perkembangan teknologi dan ilmu pengetahuan. Protein yang akan diperbanyak disimpan dalam glycerol stock dan untuk produksinya dilakukan perbanyakan pada media 2 YT. 1994). MATERI DAN METODE Construct Protein Construct protein adalah potongan gen virus Jembrana yang telah dimasukkan dengan Pin Point System Promega. 2004). antigen sucrose (N 90) masih dipergunakan untuk uji Elisa. pol. Proses pembuatan construct protein ini dilakukan di Australia. JDV juga memiliki gen tambahan yaitu : gen tat dan rev. Protein capsid (CA) yang disintesis oleh gen gag subunit capsid (gag-ca) dan protein transmembrane yang disintesis oleh gen env subunit Transmembran(env-tm) dari JDV ternyata bereaksi positif dengan antibodi hewan yang terinfeksi JDV. Sampai tahun 2001. personal communication). Denpasar. Pengembangan teknik rekombinan protein pada Eschericia coli telah dilakukan di Australia (Burkala et al.dikembangkan sejak tahun 1993. Keunggulan dari produksi antigen dengan teknik rekombinan antara lain tidak dibutuhkan hewan donor (sapi Bali) dan alat ultra sentrifuge serta proses produksinya lebih cepat sehingga biaya produksi menjadi lebih murah dibandingkan dengan antigen sucrosa/N90. envelope. Perth. Selain mengandung gen yang umum pada Retrovirus seperti : gen gag. Teknik rekombinan untuk antigen JD ini awalnya dikembangkan di Murdoch University. Pengembangan produksi antigen JD dengan teknik rekombinan protein masih terus dilakukan dalam proyek kerjasama pemerintah Indonesia dan Australia (ACIAR project) untuk mendapatkan antigen yang betul-betul spesifik untuk mendeteksi antibodi Jembrana. . dan long terminal repeat (LTR) . tepat. BPPV. Karena itu kedua protein ini dianggap epitop yang bersifat immunogenik (Hartaningsih. produksi antigen Jembrana saat ini sudah bisa dilakukan dengan teknik rekayasa genetika (recombinant protein). 1996) sedangkan pengembangan rekombinan protein untuk uji serologis infeksi lentivirus pada hewan dikembangkan di Italia (Rosati et al. Western Australia (Moira Desport. Cibinong. yang khas pada lentivirus. Virus Penyakit Jembrana (JDV) merupakan satu molekul rantai tunggal yang terdiri atas 7732 basa nukleotida. teknik ini berhasil diadopsi dan mulai tahun 2003 diaplikasikan di Laboratorium Bioteknologi. antigen JD diproduksi hanya dari bagian Gag saja.. dan akurat. Produksi dari antigen ini masih menggunakan seluruh virus Jembrana dan dalam proses produksinya tidak bisa terlepas dari penggunaan sapi Bali sebagai hewan donor dan alat ultra sentrifugasi sehingga biaya produksi antigen tersebut menjadi sangat mahal. Saat ini pengembangan produksi protein rekombinan juga dilakukan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI). Produksi antigen dengan teknik rekombinan ini bertujuan untuk menghasilkan antigen baru sebagai pengganti antigen yang lama (antigen sucrose/N90) sehingga bisa dilakukan diagnosa secara cepat. Pada tahun 2002.

Antigen siap dimurnikan (dipurifikasi). 5.33 ml resin dan equilibrate dengan 3 ml lysis buffer di atas es selama 15 menit. Inokulasikan biakan JGag6 dalam glycerol stock pada 10 ml media 2 YT dan tumbuhkan pada suhu 370C dengan cara dikocok 225 rpm semalam. Larutkan pellet dengan 3 ml cold lysis buffer di atas es. Cuci dengan 8 ml 10 % acetic acid untuk setiap 1 ml resin selama 10 menit. Bila Resin baru dipergunakan untuk pertama kali maka resin harus di preabsorb dengan 5 mM biotin dalam lysis buffer. Cuci dengan 8 ml phosphate buffer pH 7. Pemurnian Antigen Dengan Menggunakan Softlink Avidin Resin 1. 3. Sentrifugasi hasil biakan dengan kecepatan 8000 rpm selama 15 menit pada suhu 40C sampai terbentuk pellet. .Kontrol Positif Kontrol positif yang dipergunakan adalah antigen J Gag 6 yang telah standar. yang diproduksi oleh Murdoch University dan dengan konsentrasi 150 ug/ml Proses Produksi Protein Recombinant Dengan Sistem PinPoint 1. Caranya adalah tambahkan 2 ml biotin lysis buffer ke dalam 1 ml resin dan dibiarkan selama 30 menit. kemudian pelletnya diambil. 4. 9. 6.0 selama 10 menit. Untuk 200 ml biakan awal. gunakan 0. 3. 6. Simpan supernatannya pada suhu -20 0 C. Kontrol pH larutan dan biarkan resin mengembang selama 30 menit. Keluarkan pellet yang telah dilarutkan dan hancurkan pellet tersebut dengan disonikasi melalui proses sebagai berikut : pellet dimasukkan ke dalam 30 ml yellow top tubes yang diletakkan dalam kotak berisi es dan disonikasi selama 4 x 30 detik. Pellet yang telah dilarutkan ini dapat disimpan pada suhu -200C . 7. Buang buffer dan ganti dengan supernatan hasil sonikasi dan inkubasi sambil dirocking pada suhu 4 0 C selama 2 jam. 8. Biarkan resin mengendap atau bisa juga diendapkan dengan Sentrifugasi 500 rpm selama 5 menit. 2. Siapkan 1 liter media 2 x YT dan tambahkan 100 µl biotin stock (20mM) dan 1 ml Ampicillin stock (100mg/ml) 2. Bagi larutan antigen hasil sonikasi menjadi alliquot dalam tabung Effendorf dan Sentrifugasi dengan kecepatan 10. tambahkan 200µl IPTG stock untuk merangsang ekspresi protein dan dikocok selama 3-4 jam 5. 4. Bila media sudah terlihat keruh.000 G pada suhu 4 0 C selama 15 menit. Perbanyak biakan di atas dengan cara menumbuhkan kembali pada 200 ml media 2 x YT yang mengandung biotin dan ampicillin dan dikocok kembali 225 rpm pada suhu 370C selama 1-2 jam.

Cuci resin 3 kali dengan lysis buffer dingin dengan lama pencucian masing-masing 10 menit. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Gambar 1. 8.Hasil sonikasi 4. Elute biotinylated recombinant protein dalam 0.5 kDa) pada uji Western Blotting seperti terlihat pada gambar berikut ini (Gambar 1).Washing elution 1 5. Ambil supernatannya dan regenerasi resin dengan acetic acid dan phosphate buffer untuk selanjutnya disimpan pada suhu 40C. Untuk mendapatkan protein yang murni. 9. Washing resin solution 1 10.Washing elution 3 7.66 ml lysis buffer yang mengandung 5 mM Biotin semalam pada suhu 40 C. HASIL Hasil produksi protein diketahui dengan menganalisis protein dengan uji Western Blotting dengan menggunakan conjugate streptavidin alkalin phosphatase. Western Blotting Antigen J Gag 6 Keterangan : 1.Washing resin solution 2 11. Marker protein . perlu dilakukan proses purifikasi dengan menggunakan softlink avidin resin. J Gag 6 hasil produksi 9. J Gag 6 glycerol stok 2.Crude protein 3. Kontrol J Gag 6 8.7.Washing elution 2 6. Keberhasilan produksi protein ditunjukkan dengan munculnya band protein dengan berat molekul yang sama dengan berat molekul kontrol protein J Gag 6 . Murninya protein yang dihasilkan ditunjukkan oleh adanya hanya satu band protein yang mempunyai berat molekul yang sama dengan protein kontrol (J Gag 6 = 39.

117 – 119. Jembrana Disease and The Bovine Lentiviruses. coli. Bandecchi P. Hal. N.. Antibody response to Jembrana Disease Virus in Bali cattle. Ortoffi M. Shcultz J. Wilcox G. 2004. 39 : 15-23. nondenaturing purification method for recombinant protein in E. Journal of Virological Methods.promega. 2003.E. Profiti M. B.com/pnotes/42/pinpp nt/Pinppnt. ACIAR Proceedings No. Veterinary Microbiology.. Hartaningsih N. Pembuatan Rekombinan Elisa Antigen (J Gag 6). Materi Pelatihan Produksi Protein Rekombinan Dari Virus Penyakit Jembrana (JDV).5 kDa) pada uji SDS-PAGE /WB menunjukkan bahwa protein JGag 6 dari glycerol stok (construct) sudah berhasil diproduksi dan antigen yang dihasilkan sudah murni.M. and Ciabatti I.. 121 : 73-78... and G.E. 75.. 1994.. Protein Rekombinan Capsid Dan Sistem Produksinya. A one-step. Agustini.. and Breitlow S. NLP. 2002. Rosati S. Tolari F. Expression of Recombinant Jembrana Disease Virus Env Protein in Eschericia coli. Manual Diagnosa Laboratorik Penyakit Jembrana.E. Mannelli A. Hartaningsih . Wilcox . Kertayadnya G. SARAN Untuk bisa dipergunakan sebagai antigen untuk uji Elisa dan Western Blotting.KESIMPULAN Munculnya satu band protein dengan berat molekul yang sama dengan kontrol J Gag 6 (39.... maka protein yang dihasilkan tersebut perlu distandarkan atau diquantifikasi sehingga didapatkan pengenceran antigen yang tepat . 1996.. DAFTAR PUSTAKA Narayani.html. Endang Tri Margawati. Pusat Penelitian Bioteknologi – LIPI Cibinong. http://www. 2002. Moira Desport. : 150-151. Lorenzetti R. and Astawa N. Development of Recombinant Capsid antigen/Transmembrane epitope Fusion Proteins for Serological Diagnosis of Animal Lentivirus Infection. .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful