P. 1
ELISA

ELISA

|Views: 188|Likes:
Published by Elvi_Pemmielit_687

More info:

Published by: Elvi_Pemmielit_687 on Aug 15, 2010
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

08/14/2014

pdf

text

original

PRODUKSI REKOMBINAN PROTEIN VIRUS JEMBRANA (J Gag 6) UNTUK ANTIGEN ELISA.

(The Production of Jembrana Virus Recombinant Protein for Elisa Antigen(J Gag 6) Ni Luh Putu Agustini dan Nining Hartaningsih Balai Penyidikan dan Pengujian Veteriner, Regional VI, Denpasar

ABSTRAK Uji Elisa untuk mendeteksi antibodi Jembrana pada sapi yang terinfeksi Jembrana Disease (JD) telah dikembangkan sejak tahun 1993. Sampai tahun 2001, uji ini masih menggunakan antigen sucrose (N 90) yang dibuat dari whole Jembrana virus, yang dalam produksinya selalu membutuhkan hewan donor (sapi Bali) dan ultracentrifuge. Sebagai alternatif dari proses produksi antigen N90 yang mahal tersebut, diupayakan pembuatan antigen dengan teknik rekombinan protein. Sejak tahun 2003, teknik pembuatan antigen J Gag 6 telah berhasil dilakukan di Laboratorium Bioteknologi, BPPV, Regional VI, Denpasar dan digunakan untuk antigen Elisa. Produksi rekombinan protein ini bertujuan untuk mendapatkan antigen baru sebagai pengganti dari sucrose antigen untuk menghasilkan diagnose yang cepat dan akurat. Dalam proses produksi antigen J Gag 6, potongan gen virus Jembrana dimasukkan ke dalam plasmid, kemudian rekombinan plasmid ditransfeksikan ke dalam E. coli dan selanjutnya dilakukan produksi protein yang diperbanyak dalam media 2 YT. Hasil perbanyakan tersebut kemudian disonikasi dan dilisiskan untuk mengeluarkan kembali potongan virus yang sebelumnya dimasukkan, selanjutnya dilakukan purifikasi dengan menggunakan soflink avidin resin untuk mendapatkan antigen yang murni. Sebelum digunakan sebagai antigen Elisa dan Western Blotting, dilakukan kuantifikasi untuk mendapatkan volume pengenceran yang harus dilakukan. Kata kunci : virus Jembrana, protein rekombinan, antigen Elisa

ABSTRACT The Elisa to detecs Jembrana disease antibodies in infected cattle has been developed since 1993. Until 2001 the sucrose antigen still be used for the Elisa test. It was produced from the whole Jembrana virus. The production of the antigen requires Bali cattle and ultracentrifugation technique. Since 2003 new recombinant capsid protein (J Gag 6) has been succsessfully produced by the Biotechnology Laboratory of BPPV (DIC) and now being used as an Elisa antigen in DIC Denpasar. The aim of the antigen production is to get a new that can replace the sucrose antigen, hopely it will give a quicker and more accurate diagnose. The production of J Gag 6 antigen have been done by inserting JDV genes into plasmid. The recombinant plasmid was then transfected into E. coli and protein produced in E. coli. using was multiplied 2 YT media. Biotinylated protein was purified using a soflink avidin resin. The successfull production of the antigen can be identified by using streptavidin conjugated to alkaline phosphatase. Successfully of the production the antigen showed by was found the same molecular weigh protein with J Gag 6 control. Before used as an antigen, the protein must be quantified in order to know the antigen dilution for Elisa and Western Blotting. Keywords : Jembrana virus, recombinant protein, Elisa antigen

PENDAHULUAN Penyakit Jembrana merupakan penyakit viral yang bersifat akut dan kadang fatal pada sapi Bali. Selain diprovinsi Bali, kasus JD dilaporkan telah terjadi dibeberapa daerah di Indonesia seperti : Lampung, Bengkulu, Sumatera Barat,

Sumatera Selatan, Kalimantan Selatan, dan Kalimantan Timur.(Hartaningsih , 2005). Dalam mendiagnosa penyakit Jembrana, beberapa macam uji telah dikembangkan. Salah satunya adalah uji serologis Elisa yang telah

tepat. JDV juga memiliki gen tambahan yaitu : gen tat dan rev. Saat ini pengembangan produksi protein rekombinan juga dilakukan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI). Pengembangan produksi antigen JD dengan teknik rekombinan protein masih terus dilakukan dalam proyek kerjasama pemerintah Indonesia dan Australia (ACIAR project) untuk mendapatkan antigen yang betul-betul spesifik untuk mendeteksi antibodi Jembrana. Cibinong. Virus Penyakit Jembrana (JDV) merupakan satu molekul rantai tunggal yang terdiri atas 7732 basa nukleotida. Dengan teknik ini. antigen merupakan salah satu faktor penting yang harus ada karena prinsip dasar dari uji Elisa adalah ikatan antara antigen dengan antibodi yang homolog. . Perth. produksi antigen Jembrana saat ini sudah bisa dilakukan dengan teknik rekayasa genetika (recombinant protein). teknik ini berhasil diadopsi dan mulai tahun 2003 diaplikasikan di Laboratorium Bioteknologi. Protein yang akan diperbanyak disimpan dalam glycerol stock dan untuk produksinya dilakukan perbanyakan pada media 2 YT. 1994). envelope. dan long terminal repeat (LTR) . antigen sucrose (N 90) masih dipergunakan untuk uji Elisa. 1996) sedangkan pengembangan rekombinan protein untuk uji serologis infeksi lentivirus pada hewan dikembangkan di Italia (Rosati et al.dikembangkan sejak tahun 1993. Pada tahun 2002. Produksi dari antigen ini masih menggunakan seluruh virus Jembrana dan dalam proses produksinya tidak bisa terlepas dari penggunaan sapi Bali sebagai hewan donor dan alat ultra sentrifugasi sehingga biaya produksi antigen tersebut menjadi sangat mahal. Keunggulan dari produksi antigen dengan teknik rekombinan antara lain tidak dibutuhkan hewan donor (sapi Bali) dan alat ultra sentrifuge serta proses produksinya lebih cepat sehingga biaya produksi menjadi lebih murah dibandingkan dengan antigen sucrosa/N90.. yang khas pada lentivirus. Western Australia (Moira Desport. Produksi antigen dengan teknik rekombinan ini bertujuan untuk menghasilkan antigen baru sebagai pengganti antigen yang lama (antigen sucrose/N90) sehingga bisa dilakukan diagnosa secara cepat. Protein capsid (CA) yang disintesis oleh gen gag subunit capsid (gag-ca) dan protein transmembrane yang disintesis oleh gen env subunit Transmembran(env-tm) dari JDV ternyata bereaksi positif dengan antibodi hewan yang terinfeksi JDV. Selain mengandung gen yang umum pada Retrovirus seperti : gen gag. Teknik rekombinan untuk antigen JD ini awalnya dikembangkan di Murdoch University. MATERI DAN METODE Construct Protein Construct protein adalah potongan gen virus Jembrana yang telah dimasukkan dengan Pin Point System Promega. Proses pembuatan construct protein ini dilakukan di Australia. personal communication). pol. BPPV. dan akurat. Pengembangan teknik rekombinan protein pada Eschericia coli telah dilakukan di Australia (Burkala et al. Sampai tahun 2001. Denpasar. Dalam uji Elisa. 2004). antigen JD diproduksi hanya dari bagian Gag saja. Karena itu kedua protein ini dianggap epitop yang bersifat immunogenik (Hartaningsih.. Regional VI. Sejalan dengan perkembangan teknologi dan ilmu pengetahuan.

Buang buffer dan ganti dengan supernatan hasil sonikasi dan inkubasi sambil dirocking pada suhu 4 0 C selama 2 jam. Pellet yang telah dilarutkan ini dapat disimpan pada suhu -200C . Perbanyak biakan di atas dengan cara menumbuhkan kembali pada 200 ml media 2 x YT yang mengandung biotin dan ampicillin dan dikocok kembali 225 rpm pada suhu 370C selama 1-2 jam. Sentrifugasi hasil biakan dengan kecepatan 8000 rpm selama 15 menit pada suhu 40C sampai terbentuk pellet. 6. 7. Keluarkan pellet yang telah dilarutkan dan hancurkan pellet tersebut dengan disonikasi melalui proses sebagai berikut : pellet dimasukkan ke dalam 30 ml yellow top tubes yang diletakkan dalam kotak berisi es dan disonikasi selama 4 x 30 detik. 4. Biarkan resin mengendap atau bisa juga diendapkan dengan Sentrifugasi 500 rpm selama 5 menit. Cuci dengan 8 ml phosphate buffer pH 7. 4. 5. . Inokulasikan biakan JGag6 dalam glycerol stock pada 10 ml media 2 YT dan tumbuhkan pada suhu 370C dengan cara dikocok 225 rpm semalam.33 ml resin dan equilibrate dengan 3 ml lysis buffer di atas es selama 15 menit. 6. Antigen siap dimurnikan (dipurifikasi). Untuk 200 ml biakan awal. 9. 8. 2. kemudian pelletnya diambil. tambahkan 200µl IPTG stock untuk merangsang ekspresi protein dan dikocok selama 3-4 jam 5. Siapkan 1 liter media 2 x YT dan tambahkan 100 µl biotin stock (20mM) dan 1 ml Ampicillin stock (100mg/ml) 2. Larutkan pellet dengan 3 ml cold lysis buffer di atas es.0 selama 10 menit. Bila Resin baru dipergunakan untuk pertama kali maka resin harus di preabsorb dengan 5 mM biotin dalam lysis buffer. Pemurnian Antigen Dengan Menggunakan Softlink Avidin Resin 1. Kontrol pH larutan dan biarkan resin mengembang selama 30 menit.Kontrol Positif Kontrol positif yang dipergunakan adalah antigen J Gag 6 yang telah standar.000 G pada suhu 4 0 C selama 15 menit. Caranya adalah tambahkan 2 ml biotin lysis buffer ke dalam 1 ml resin dan dibiarkan selama 30 menit. 3. Cuci dengan 8 ml 10 % acetic acid untuk setiap 1 ml resin selama 10 menit. Bila media sudah terlihat keruh. Bagi larutan antigen hasil sonikasi menjadi alliquot dalam tabung Effendorf dan Sentrifugasi dengan kecepatan 10. gunakan 0. Simpan supernatannya pada suhu -20 0 C. yang diproduksi oleh Murdoch University dan dengan konsentrasi 150 ug/ml Proses Produksi Protein Recombinant Dengan Sistem PinPoint 1. 3.

Washing elution 3 7.66 ml lysis buffer yang mengandung 5 mM Biotin semalam pada suhu 40 C. HASIL Hasil produksi protein diketahui dengan menganalisis protein dengan uji Western Blotting dengan menggunakan conjugate streptavidin alkalin phosphatase. perlu dilakukan proses purifikasi dengan menggunakan softlink avidin resin. 8. Elute biotinylated recombinant protein dalam 0. Cuci resin 3 kali dengan lysis buffer dingin dengan lama pencucian masing-masing 10 menit. J Gag 6 glycerol stok 2. Murninya protein yang dihasilkan ditunjukkan oleh adanya hanya satu band protein yang mempunyai berat molekul yang sama dengan protein kontrol (J Gag 6 = 39.Hasil sonikasi 4. Untuk mendapatkan protein yang murni.Washing resin solution 2 11. Kontrol J Gag 6 8. Marker protein . Keberhasilan produksi protein ditunjukkan dengan munculnya band protein dengan berat molekul yang sama dengan berat molekul kontrol protein J Gag 6 .7.5 kDa) pada uji Western Blotting seperti terlihat pada gambar berikut ini (Gambar 1). Western Blotting Antigen J Gag 6 Keterangan : 1. Washing resin solution 1 10. 9.Crude protein 3.Washing elution 1 5. J Gag 6 hasil produksi 9.Washing elution 2 6. Ambil supernatannya dan regenerasi resin dengan acetic acid dan phosphate buffer untuk selanjutnya disimpan pada suhu 40C. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Gambar 1.

nondenaturing purification method for recombinant protein in E. Antibody response to Jembrana Disease Virus in Bali cattle. Mannelli A. Endang Tri Margawati. Journal of Virological Methods. Wilcox . Kertayadnya G. . 2002.. Protein Rekombinan Capsid Dan Sistem Produksinya. Shcultz J. 121 : 73-78. B. 117 – 119.5 kDa) pada uji SDS-PAGE /WB menunjukkan bahwa protein JGag 6 dari glycerol stok (construct) sudah berhasil diproduksi dan antigen yang dihasilkan sudah murni.. Wilcox G. Expression of Recombinant Jembrana Disease Virus Env Protein in Eschericia coli. Development of Recombinant Capsid antigen/Transmembrane epitope Fusion Proteins for Serological Diagnosis of Animal Lentivirus Infection. Veterinary Microbiology. Agustini. maka protein yang dihasilkan tersebut perlu distandarkan atau diquantifikasi sehingga didapatkan pengenceran antigen yang tepat .. SARAN Untuk bisa dipergunakan sebagai antigen untuk uji Elisa dan Western Blotting. Ortoffi M.. Materi Pelatihan Produksi Protein Rekombinan Dari Virus Penyakit Jembrana (JDV).E.. Profiti M.html. Bandecchi P. Hal. Moira Desport.. Jembrana Disease and The Bovine Lentiviruses. Pembuatan Rekombinan Elisa Antigen (J Gag 6).. 2004. 2002. 2003. and Astawa N.KESIMPULAN Munculnya satu band protein dengan berat molekul yang sama dengan kontrol J Gag 6 (39. Pusat Penelitian Bioteknologi – LIPI Cibinong. coli. A one-step. and Breitlow S.E...com/pnotes/42/pinpp nt/Pinppnt..promega. NLP. 75. Tolari F. and G.. 1996. 39 : 15-23. DAFTAR PUSTAKA Narayani. ACIAR Proceedings No. Lorenzetti R. and Ciabatti I. Hartaningsih N. Manual Diagnosa Laboratorik Penyakit Jembrana.. : 150-151. N.E. Hartaningsih . http://www.M. 1994. Rosati S.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->