You are on page 1of 5

PRODUKSI REKOMBINAN PROTEIN VIRUS JEMBRANA (J Gag 6)

UNTUK ANTIGEN ELISA.


(The Production of Jembrana Virus Recombinant Protein for Elisa Antigen(J Gag 6)

Ni Luh Putu Agustini dan Nining Hartaningsih


Balai Penyidikan dan Pengujian Veteriner, Regional VI, Denpasar

ABSTRAK

Uji Elisa untuk mendeteksi antibodi Jembrana pada sapi yang terinfeksi Jembrana Disease (JD) telah
dikembangkan sejak tahun 1993. Sampai tahun 2001, uji ini masih menggunakan antigen sucrose (N 90)
yang dibuat dari whole Jembrana virus, yang dalam produksinya selalu membutuhkan hewan donor (sapi
Bali) dan ultracentrifuge. Sebagai alternatif dari proses produksi antigen N90 yang mahal tersebut,
diupayakan pembuatan antigen dengan teknik rekombinan protein. Sejak tahun 2003, teknik pembuatan
antigen J Gag 6 telah berhasil dilakukan di Laboratorium Bioteknologi, BPPV, Regional VI, Denpasar
dan digunakan untuk antigen Elisa. Produksi rekombinan protein ini bertujuan untuk mendapatkan
antigen baru sebagai pengganti dari sucrose antigen untuk menghasilkan diagnose yang cepat dan akurat.
Dalam proses produksi antigen J Gag 6, potongan gen virus Jembrana dimasukkan ke dalam plasmid,
kemudian rekombinan plasmid ditransfeksikan ke dalam E. coli dan selanjutnya dilakukan produksi
protein yang diperbanyak dalam media 2 YT. Hasil perbanyakan tersebut kemudian disonikasi dan
dilisiskan untuk mengeluarkan kembali potongan virus yang sebelumnya dimasukkan, selanjutnya
dilakukan purifikasi dengan menggunakan soflink avidin resin untuk mendapatkan antigen yang murni.
Sebelum digunakan sebagai antigen Elisa dan Western Blotting, dilakukan kuantifikasi untuk
mendapatkan volume pengenceran yang harus dilakukan.

Kata kunci : virus Jembrana, protein rekombinan, antigen Elisa

ABSTRACT
The Elisa to detecs Jembrana disease antibodies in infected cattle has been developed since 1993. Until
2001 the sucrose antigen still be used for the Elisa test. It was produced from the whole Jembrana virus.
The production of the antigen requires Bali cattle and ultracentrifugation technique. Since 2003 new
recombinant capsid protein (J Gag 6) has been succsessfully produced by the Biotechnology Laboratory
of BPPV (DIC) and now being used as an Elisa antigen in DIC Denpasar. The aim of the antigen
production is to get a new that can replace the sucrose antigen, hopely it will give a quicker and more
accurate diagnose. The production of J Gag 6 antigen have been done by inserting JDV genes into
plasmid. The recombinant plasmid was then transfected into E. coli and protein produced in E. coli. using
was multiplied 2 YT media. Biotinylated protein was purified using a soflink avidin resin. The successfull
production of the antigen can be identified by using streptavidin conjugated to alkaline phosphatase.
Successfully of the production the antigen showed by was found the same molecular weigh protein with J
Gag 6 control. Before used as an antigen, the protein must be quantified in order to know the antigen
dilution for Elisa and Western Blotting.

Keywords : Jembrana virus, recombinant protein, Elisa antigen

PENDAHULUAN Sumatera Selatan, Kalimantan Selatan,


dan Kalimantan Timur.(Hartaningsih ,
Penyakit Jembrana merupakan penyakit 2005).
viral yang bersifat akut dan kadang fatal
pada sapi Bali. Selain diprovinsi Bali, Dalam mendiagnosa penyakit Jembrana,
kasus JD dilaporkan telah terjadi beberapa macam uji telah
dibeberapa daerah di Indonesia seperti : dikembangkan. Salah satunya adalah uji
Lampung, Bengkulu, Sumatera Barat, serologis Elisa yang telah
dikembangkan sejak tahun 1993. Dalam teknik rekombinan protein pada
uji Elisa, antigen merupakan salah satu Eschericia coli telah dilakukan di
faktor penting yang harus ada karena Australia (Burkala et al., 1996)
prinsip dasar dari uji Elisa adalah ikatan sedangkan pengembangan rekombinan
antara antigen dengan antibodi yang protein untuk uji serologis infeksi
homolog. Sampai tahun 2001, antigen lentivirus pada hewan dikembangkan di
sucrose (N 90) masih dipergunakan Italia (Rosati et al., 2004). Saat ini
untuk uji Elisa. Produksi dari antigen ini pengembangan produksi protein
masih menggunakan seluruh virus rekombinan juga dilakukan di Lembaga
Jembrana dan dalam proses produksinya Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI),
tidak bisa terlepas dari penggunaan sapi Cibinong. Pengembangan produksi
Bali sebagai hewan donor dan alat ultra antigen JD dengan teknik rekombinan
sentrifugasi sehingga biaya produksi protein masih terus dilakukan dalam
antigen tersebut menjadi sangat mahal. proyek kerjasama pemerintah Indonesia
dan Australia (ACIAR project) untuk
Virus Penyakit Jembrana (JDV) mendapatkan antigen yang betul-betul
merupakan satu molekul rantai tunggal spesifik untuk mendeteksi antibodi
yang terdiri atas 7732 basa nukleotida. Jembrana.
Selain mengandung gen yang umum
pada Retrovirus seperti : gen gag, pol, Keunggulan dari produksi antigen
envelope, dan long terminal repeat dengan teknik rekombinan antara lain
(LTR) , JDV juga memiliki gen tidak dibutuhkan hewan donor (sapi
tambahan yaitu : gen tat dan rev, yang Bali) dan alat ultra sentrifuge serta
khas pada lentivirus. Protein capsid proses produksinya lebih cepat sehingga
(CA) yang disintesis oleh gen gag biaya produksi menjadi lebih murah
subunit capsid (gag-ca) dan protein dibandingkan dengan antigen
transmembrane yang disintesis oleh gen sucrosa/N90.
env subunit Transmembran(env-tm) dari
JDV ternyata bereaksi positif dengan Produksi antigen dengan teknik
antibodi hewan yang terinfeksi JDV. rekombinan ini bertujuan untuk
Karena itu kedua protein ini dianggap menghasilkan antigen baru sebagai
epitop yang bersifat immunogenik pengganti antigen yang lama (antigen
(Hartaningsih, 1994). sucrose/N90) sehingga bisa dilakukan
diagnosa secara cepat, tepat, dan akurat.
Sejalan dengan perkembangan teknologi
dan ilmu pengetahuan, produksi antigen
Jembrana saat ini sudah bisa dilakukan MATERI DAN METODE
dengan teknik rekayasa genetika
(recombinant protein). Dengan teknik Construct Protein
ini, antigen JD diproduksi hanya dari Construct protein adalah potongan gen
bagian Gag saja. Teknik rekombinan virus Jembrana yang telah dimasukkan
untuk antigen JD ini awalnya dengan Pin Point System Promega.
dikembangkan di Murdoch University, Proses pembuatan construct protein ini
Perth, Western Australia (Moira dilakukan di Australia. Protein yang
Desport, personal communication). Pada akan diperbanyak disimpan dalam
tahun 2002, teknik ini berhasil diadopsi glycerol stock dan untuk produksinya
dan mulai tahun 2003 diaplikasikan di dilakukan perbanyakan pada media 2
Laboratorium Bioteknologi, BPPV, YT.
Regional VI, Denpasar. Pengembangan
Kontrol Positif kotak berisi es dan disonikasi selama
Kontrol positif yang dipergunakan 4 x 30 detik.
adalah antigen J Gag 6 yang telah
standar, yang diproduksi oleh Murdoch 8. Bagi larutan antigen hasil sonikasi
University dan dengan konsentrasi 150 menjadi alliquot dalam tabung
ug/ml Effendorf dan Sentrifugasi dengan
kecepatan 10.000 G pada suhu 4 0 C
Proses Produksi Protein Recombinant selama 15 menit.
Dengan Sistem PinPoint
1. Siapkan 1 liter media 2 x YT dan 9. Simpan supernatannya pada suhu -20
0
tambahkan 100 µl biotin stock C. Antigen siap dimurnikan
(20mM) dan 1 ml Ampicillin stock (dipurifikasi).
(100mg/ml)

2. Inokulasikan biakan JGag6 dalam Pemurnian Antigen Dengan


glycerol stock pada 10 ml media 2 Menggunakan Softlink Avidin Resin
YT dan tumbuhkan pada suhu 370C 1. Bila Resin baru dipergunakan untuk
dengan cara dikocok 225 rpm pertama kali maka resin harus di
semalam. preabsorb dengan 5 mM biotin dalam
lysis buffer. Caranya adalah
3. Perbanyak biakan di atas dengan cara tambahkan 2 ml biotin lysis buffer ke
menumbuhkan kembali pada 200 ml dalam 1 ml resin dan dibiarkan
media 2 x YT yang mengandung selama 30 menit.
biotin dan ampicillin dan dikocok
kembali 225 rpm pada suhu 370C 2. Cuci dengan 8 ml 10 % acetic acid
selama 1-2 jam. untuk setiap 1 ml resin selama 10
menit.
4. Bila media sudah terlihat keruh,
tambahkan 200µl IPTG stock untuk 3. Cuci dengan 8 ml phosphate buffer
merangsang ekspresi protein dan pH 7,0 selama 10 menit. Kontrol pH
dikocok selama 3-4 jam larutan dan biarkan resin
mengembang selama 30 menit.
5. Sentrifugasi hasil biakan dengan
kecepatan 8000 rpm selama 15 menit 4. Untuk 200 ml biakan awal, gunakan
pada suhu 40C sampai terbentuk 0,33 ml resin dan equilibrate dengan
pellet, kemudian pelletnya diambil. 3 ml lysis buffer di atas es selama 15
menit.
6. Larutkan pellet dengan 3 ml cold
lysis buffer di atas es. Pellet yang 5. Biarkan resin mengendap atau bisa
telah dilarutkan ini dapat disimpan juga diendapkan dengan Sentrifugasi
pada suhu -200C . 500 rpm selama 5 menit.

7. Keluarkan pellet yang telah 6. Buang buffer dan ganti dengan


dilarutkan dan hancurkan pellet supernatan hasil sonikasi dan
tersebut dengan disonikasi melalui inkubasi sambil dirocking pada suhu
proses sebagai berikut : pellet 4 0 C selama 2 jam.
dimasukkan ke dalam 30 ml yellow
top tubes yang diletakkan dalam
7. Cuci resin 3 kali dengan lysis buffer HASIL
dingin dengan lama pencucian
masing-masing 10 menit. Hasil produksi protein diketahui dengan
menganalisis protein dengan uji Western
8. Elute biotinylated recombinant Blotting dengan menggunakan conjugate
protein dalam 0,66 ml lysis buffer streptavidin alkalin phosphatase.
yang mengandung 5 mM Biotin Keberhasilan produksi protein
semalam pada suhu 40 C. ditunjukkan dengan munculnya band
protein dengan berat molekul yang sama
9. Ambil supernatannya dan regenerasi dengan berat molekul kontrol protein J
resin dengan acetic acid dan Gag 6 . Untuk mendapatkan protein yang
phosphate buffer untuk selanjutnya murni, perlu dilakukan proses purifikasi
disimpan pada suhu 40C. dengan menggunakan softlink avidin
resin. Murninya protein yang dihasilkan
ditunjukkan oleh adanya hanya satu band
protein yang mempunyai berat molekul
yang sama dengan protein kontrol (J Gag
6 = 39,5 kDa) pada uji Western
Blotting seperti terlihat pada gambar
berikut ini (Gambar 1).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Gambar 1. Western Blotting Antigen J Gag 6

Keterangan :
1. J Gag 6 glycerol stok
2.Crude protein
3.Hasil sonikasi
4.Washing elution 1
5.Washing elution 2
6.Washing elution 3
7. Kontrol J Gag 6
8. J Gag 6 hasil produksi
9. Washing resin solution 1
10.Washing resin solution 2
11. Marker protein
KESIMPULAN Endang Tri Margawati, 2003. Protein
Rekombinan Capsid Dan Sistem
Produksinya. Materi Pelatihan Produksi
Munculnya satu band protein dengan Protein Rekombinan Dari Virus Penyakit
berat molekul yang sama dengan kontrol Jembrana (JDV). Pusat Penelitian
J Gag 6 (39,5 kDa) pada uji SDS-PAGE Bioteknologi – LIPI Cibinong.
/WB menunjukkan bahwa protein JGag
6 dari glycerol stok (construct) sudah Hartaningsih N., Wilcox G.E., Kertayadnya G.,
and Astawa N. 1994. Antibody response
berhasil diproduksi dan antigen yang to Jembrana Disease Virus in Bali cattle.
dihasilkan sudah murni. Veterinary Microbiology, 39 : 15-23.

Hartaningsih , N, Agustini, NLP, Moira Desport,


SARAN 2002. Pembuatan Rekombinan Elisa
Antigen (J Gag 6). Manual Diagnosa
Laboratorik Penyakit Jembrana, Hal. 117
Untuk bisa dipergunakan sebagai antigen – 119.
untuk uji Elisa dan Western Blotting,
maka protein yang dihasilkan tersebut Shcultz J, and Breitlow S, 2002. A one-step,
perlu distandarkan atau diquantifikasi nondenaturing purification method for
recombinant protein in E. coli.
sehingga didapatkan pengenceran http://www.promega.com/pnotes/42/pinpp
antigen yang tepat . nt/Pinppnt.html.

Rosati S., Profiti M., Lorenzetti R., Bandecchi


DAFTAR PUSTAKA P., Mannelli A., Ortoffi M., Tolari F., and
Ciabatti I.M., 2004. Development of
Narayani, B.E., and G.E. Wilcox . 1996. Recombinant Capsid
Expression of Recombinant Jembrana antigen/Transmembrane epitope Fusion
Disease Virus Env Protein in Eschericia Proteins for Serological Diagnosis of
coli, Jembrana Disease and The Bovine Animal Lentivirus Infection. Journal of
Lentiviruses. ACIAR Proceedings No. 75, Virological Methods, 121 : 73-78.
: 150-151.

You might also like