STRUKTUR BAKTERI DAN FUNGI

Sudah sepatutnya dunia kedokteran berterima kasih kepada 'Bapak

Biologi' Antonie Philips van Leeuwenhoek atas dedikasinya dalam
pengembangan mikroskop di tahun 1723. Dengan mikroskop kita
dapat mengamati morfologi sel maupun motilitas mikroorganisme
seperti bakteri dan fungi yang berukuran kecil. Salah satu metode
yang sering digunakan untuk mengamati morfologi, dengan metode
tersebut dapat diamati pula proses replikasi seperti binary fission
pada bakteri maupun budding pada khamir (yeast). Meski demikian,
karena sebagian besar mikroorganisme tersebut tidak
berwarna/transparan sehingga kontras sel dengan latar/background
sulit dibedakan. Susunan kimiawi dinding maupun membran sel
bakteri sangat bervariasi, hal tersebut akan terlihat pada proses
staining. Salah satu metode staining yang paling banyak digunakan
adalah Gram staining yang ditemukan oleh Hans Cristian Gram pada
tahun 1884. Dengan Gram staining bakteri dapat dibedakan
menjadi dua kelompok, yaitu Gram positif dan Gram negatif. Namun
demikian ada juga bakteri yang termasuk dalam kelompok Gram
variabel dan Gram indeterminant. Pada perkembangan metode
staining lanjut, diaplikasikan untuk pengamatan flagela, spora,
maupun kapsul, untuk fungi, metode ini banyak digunakan untuk
kepentingan identifikasi fungi seperti pengamatan struktur hifa,
konidia, konidiospora, dan makrokonidia pada kapang/mold dan
morfologi sel pada khamir/yeast.

Wet Mount
Wet mount adalah suatu metode preparasi spesimen dimana
spesimen hidup dibiakan dengan cairan yang diletakkan pada kaca
cekung atau kaca datar. Bagian cekung dari kaca membentuk
semacam wadah yang akan terisi oleh substansi tebal mirip sirup
seperti carboxymethyl cellulose. Mikroorganisme bebas bergerak
dalam cairan tersebut, walaupun viskositas substansi menghambat
pergerakan mikroorganisme. Hal ini memudahkan kita untuk
mengobservasi mikroorganisme. Spesimen dan substansi dilindungi
agar tidak tumpah atau terkontaminasi dengan menutup kaca
cekung dengan kaca datar.

Menumbuhkan Biakan Bakteri

Bakteri secara normal bereproduksi menggunakan proses
pembelahan biner (binary fission)
1. Sel memanjang dan kromosom DNA bereplikasi.
2. Dinding sel dan membran sel menekuk ke dalam dan mulai
membelah.
3. Lekukan dinding sel saling bertemu, membentuk dinding
pemisah antara dua DNA yang membelah.
4. Sel terpisah menjadi dua individu sel.

Beberapa bakteri bereproduksi dengan bertunas (budding).

Semacam tunas kecil muncul dari bakteri dan membesar sampai
berukuran seperti sel induk. Setelah berpisah, maka akan
membentuk dua sel yang identik. Beberapa bakteri, disebut bakteri
filamen (actinomycetes), bereproduksi dengan memproduksi rantai
atau spora yang terletak pada ujung filamen. Filamen akan
terfragmen dan fragmen ini menginisiasi pertumbuhan sel baru.

Pewarnaan Spesimen
Tidak semua spesimen dapat terlihat jelas di bawah mikroskop.
Seringkali spesimen bercampur dengan objek lain pada latar
belakang karena mereka menyerap dan memantulkan panjang
gelombang cahaya yang hampir sama. Kita dapat memperjelas
bentuk dan rupa dari spesimen dengan menggunakan pewarnaan.
Pewarnaan digunakan untuk membedakan spesimen dari latar
belakang.
Pewarnaan menggunakan bahan kimia yang melekat pada struktur
mikroorganisme sehingga memberikan efek warna kepada
mikroorganisme agar mudah dilihat dibawah mikroskop. Pewarnaan
pada mikrobiologi terdapat dua jenis, asam dan basa.
Pewarnaan basa merupakan kationik dan memberikan listrik positif.
Pewarna basa yang digunakan antara lain methylene blue, crystal
violet, safranin dan malachite green. Pewarna tersebut ideal untuk
mewarnai kromosom dan membran sel pada kebanyakan bakteri.
Pewarnaan asam merupakan anionik dan memberikan listrik
negatif. Pewarna asam yang digunakan antara lain eosin dan picric
acid. Pewarnaan asam digunakan untuk mewarnai materi
sitoplasma dan organel-organel atau inklusi.

Tipe Pewarnaan
Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana menggunakan teknik pewarnaan basa yang
digunakan untuk menunjukkan bentuk dari sel dan struktur di dalam
sel. Methylene blue, safranin, carbolfuchsin dan crystal violet adalah
pewarna yang umum digunakan pada laboratorium mikrobiologi.
Pewarnaan Diferensial
Pewarnaan diferensial terdiri atas dua atau lebih teknik pewarnaan
dan digunakan untuk prosedur identifikasi bakteri. Dua dari banyak
pewarnaan diferensial yang umum digunakan adalah pewarnaan
Gram (Gram stain) dan Ziehl-Nielsen acid-fast stain.
Pada tahun 1884 Hans Christian Gram, seorang dokter dari
Denmark, mengembangkan pewarnaan Gram. Pengecatan Gram
merupakan metode pewarnaan untuk mengklasifikasikan bakteri.
Mikroorganisme Gram-positif tercat ungu, sedangkan
mikroorganisme Gram-negatif tercat merah muda. Staphylococcus
aureus, sejenis bakteri yang meracuni makanan, adalah gram-
positif. Escherichia coli merupakan gram-negatif.

Teknik Pewarnaan Gram

1. Siapkan spesimen menggunakan heat fixation process:

- Siapkan kaca objek yang bersih

- Ambil sampel biakan bakteri

- Letakkan mikroorganisme hidup pada kaca objek

- Keringkan sebentar di udara terbuka kemudian lewatkan melalui

pembakar bunsen tiga kali

- Panas menyebabkan mikroorganisme melekat pada kaca objek.

2. Teteskan pewarna crystal violet pada spesimen

3. Teteskan iodin pada spesimen menggunakan tetes mata, iodin

membantu crystal violet untuk menempel pada spesimen. Iodin
merupakan bahan kimia yang melekatkan pewarna ke spesimen.

4. Cuci spesimen menggunakan etanol atau larutan alkohol-aseton, lalu

bilas dengan air.

5. Cuci spesimen untuk menghilangkan kelebihan iodin. Spesimen akan

menunjukkan warna ungu.

6. Cuci spesimen dengan etanol atau alkohol-aseton untuk

menghilangkan warna.

7. Cuci spesimen dengan air.

8. Teteskan safranin ke spesimen menggunakan tetes mata.

9. Cuci spesimen.

10.Gunakan tisu/kertas hisap untuk mengeringkan spesimen.

11.Spesimen siap dilihat dibawah mikroskop. Gram-positif terlihat ungu,

dan gram-negatif terlihat merah muda.
PEMBUATAN PREPARAT DAN PENGECATANNYA

Mikroorganisme yang ada dialam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-
sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak
berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan.
Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk
diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut
juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi
dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jaweta, 1986;
Dwidjoseputro, 1994; Assani, 1994).

Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan

mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar
dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-
sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta
meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Pelczar & Chan,
1986; Volk & Wheeler, 1993; Lim, 1998).

Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi,

peluntur warna, subtrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna
penutup. Pewarnaan gram pertama kali mulai dikembangkan pada tahun 1884
oleh ahli histologi yaitu Cristian Gram (Cappuccino & Sherman, 1983).

Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus
Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteri-
bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial
(berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut
relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri
tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan
sederhana atau Garm (Ratna, 1993; Dwidjoseputro, 1994).

Tujuan dari percobaan ini adalah dapat melakukan pembuatan preparat dari
bahan yang berasal dari penderita baik itu dengan media cair dan media
padat.Dapat melakukan pengecatan bakteri khususnya dapat membedakan
bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.

Mikroorganisme merupakan populasi makhluk hidup di alam yang jumlahnya

sangat besar namun, semua mikroorganisme mempunyai morfologi, struktur dan
sifat-sifat yang khas, sama halnya dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir
tidak berwarna dan kontras dengan air. Pengecatan dan pewarnaan merupakan
salah satu cara untuk mengamati sel-sel bakteri (Sutedjo, 1991).

Bakteri-bakteri dari genus Mycobacterium dan spesies tertentu dari genus

Nocardia mengandung sejumlah besar zat lipoidal (berlemak) di dalam dinding
selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel
terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel baktei tersebut tidak terwarnai
oleh pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram. Kelompok
bakteri tahan asam ini juga dapat hidup sebagai flora normal pada usus ternak
unggas, dengan demikian sumber tersebut memudahkan dalam upaya
mendapatkan isolat bekteri yang tahan asam (Cappuccino & Sherman, 1983)

Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya)
dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna
sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan
satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi
dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik
(suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan
sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan
positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi,
peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna
penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci
dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga
preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan
bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies
(Dwidjoseputro, 1994).

Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya
berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif.
Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena
reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah
yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri (Sutedjo, 1991).

Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika
warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa.
Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat
warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan
anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna
asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian
sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian
inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti: fiksasi,
peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna
penutup (Sutedjo, 1991).

Sel–sel bakteri mempunyai muatan yang agak negatif bila pH lingkungannya

mendekati netral. Muatan negatif dari sel bakteri akan bergabung dengan
muatan positif dari ion zat warna misalnya methylen blue, sehingga selnya akan
berwarna. Perbedaan muatan inilah yang menyebabkan adanya ikatan atau
gabungan antara zat warna dan sel bakteri (Schegel, 1993).

Sebagian besar dari genus anaerobik Clostridium dan Desulfotomaculum dan

genus aerobik Bacillus adalah contoh-contoh organisme yang mempunyai
kapasitas untuk pertahanan, salah satunya adalah sel vegetatif yang aktif secara
metabolik, tipe-tipe sel inaktif secara metabolik disebut spora. Kondisi
lingkungan yang tidak menguntungkan untuk keberlangsungan aktivitas sel
vegetatif, biasanya pada saat kurangnya sumber nutrisi karbon, sel ini
mempunyai kapasitas untuk mengalami sporogenesis dan memberikan reaksi
untuk pembentukan struktur intraseluler baru (endospora) yang dilindungi oleh
lapisan yang tidak dapat ditembus air (tahan penetrasi) dikenal sebagai jaket
spora (spore coats) (Cappuccino & Sherman, 1983)

Kondisi yang terus memburuk membuta endospora dibebaskan dari degenerasi

sel vegetatif dan menjadi sel independen yang disebut spora yang diakibatkan
komposisi lapisan kimia spora bersifat tahan terhadap efek-efek merusak,
misalnya pemanasan berkelebihan, pembekuan, radiasi, pengeringan, dan agent
kimia lainnya sehingga diperlukan pewarnaan khusus secara mikrobiologi dan
ketika kondisi lingkungan kembali normal, spora bebas kembali untuk aktif
secara metabolik dan sel vegetatif berkurang resisten melalui germinasi.
Sporogenesis dan germinasi tidak dimaksudkan untuk reproduksi tetapi hanya
mekanisme yang menjamin ketahanan sel dibawah kondisi lingkungan
(Suriawiria, 2005).

***or jika dirasa belum lengkap, silakan bisa buka2 buku:

-Assani, S. 1994. Mikrobiologi Kedokteran. Fakultas Kedokteran Universitas

Indonesia, Jakarta.
-Cappuccino, J. G. & Natalie. S. 1983. Microbiology A Laboratory Manual. Addison-
Wesley Publishing Company, New York.
-Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.
-Gupte, S. 1990. Mikrobiologi Dasar. Binarupa Aksara, Jakarta.
-Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia, Jakarta.
-Jaweta, E. 1986. Mikrobiologi Untuk Profesi Kesehatan. EGC, Jakarta.
-Lim,D. 1998. Microbiology, 2nd Edition. McGrow-hill book, New york.
-Pelczar, M. J. & E. C. S. Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. UI Press, Jakarta.
-Ratna, S. H. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek , Teknik dan Prosedur
Dasar Laboratorium. Penerbit Gramedia, Jakarta.
-Schegel, G.H. 1993. General Microbiologi seventh edition. Cambrige University
Press, USA.
-Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti, Jakarta.
-Sutedjo, M. 1991. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta. Jakarta.
-Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga, Jakarta.

ANATOMI JAMUR (FUNGI)

Yang dimaksud badan dari fungi adalah bagian panjang, terdapat susunan
filamen longgar yang disebut hifa (hyphae).

Hifa dipisahkan oleh dinding sel yang disebut septa. Pada kebanyakan jamur,
hifa dipisahkan menjadi satu unit sel yang disebut septate hyphae. Pada
beberapa fungi, hifa tidak mempunyai septa dan terlihat seperti sel panjang
multinukleus yang disebut coenocytic hyphae. Sitoplasma bergerak melalui hifa
menembus pori-pori pada septa. Dibawah kondisi lingkungan yang baik, hifa
tumbuh membentuk massa filamen yang disebut miselium. Jamur dapat
 Makalah Tentang Pewarnaan Gram atau Pengecatan Bakteri

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan
gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini
diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram
(1853-1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna

metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan
mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara
bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal
(counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri
gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna
untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur
dinding sel mereka.

Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti

mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan
dengan komponen tertentu pada dinding sel gram-negatif, terutama lapisan
lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin).

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum.
Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam.
Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.
Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak),
diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur. Khusus pada
spirul hanya dibagi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung. Bakteri
juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram
tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif
ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah
(Textbook, 2008). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada
akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore yang bisa
diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres
karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di
lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008).

Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat

mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram
negatif sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui
jalannya mekanisme pewarnaan gram.
1.2 Perumusan Masalah

Rumusan masalah adalah faktor-faktor apa sajakah yang berpengaruh

terhadap keberlangsungan pewarnaan pada bakteri dan endospora,
bagaimanakah karakteristik dari ketiga spesimen, serta bagaimana teknik
pengecatan

1.3 Tujuan

Tujuan praktikum adalah mempelajari proses pewarnaan struktur sel

bakteri, mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri dan memahami
pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaan dan memahami reaksi
kimia di dalam prosedur tersebut.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada

tahun 1884. Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu
bakteri gram positif dan gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat
bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh
komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada
mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.
(Tryana, S.T, 2008). Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu: 1. Struktur dasar
(dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri) Meliputi: dinding sel, membran plasma,
sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan 2. Struktur tambahan
(dimiliki oleh jenis bakteri tertentu) Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria,
klorosom, Vakuola gas dan endospora Gambar Bakteri Gram Positip dan Bakteri
Gram Negatif (Edukasi, 2008). Staphylococcus adalah bakteri Gram-positif yang
berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentu seperti buah buah
anggur.

Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada dua jenis warna

staphylococci yaitu: Staphylococcus aureus yang berwarna kuning dan
Staphylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karakterististik yang
dimiliki Staphylococcus Aureus diantaranya hemolytic pada darah agar, catalase-
oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45
derajat dan lingkungan NaCl pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan
menghasilkan enzim coagulase. Selain itu,biasanya S. Aureus merupakan
patogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru,
radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing
osteomyelitis dan endocarditis serta menyebabkan keracunan makanan yaitu
dengan melepakan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik
dengan melepasan superantigens ke dalam aliran darah (Kenneath, 2008).

Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan

secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di
berbagai mesophilic suhu berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga
telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan
lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH
rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau
etanol Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set
kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode
gen protein. Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan
antibiotik dalam jumlah besar ke luar dari sel (Scetzer, 2006). Menurut Kenneath
tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang
termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup
dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan
manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru
dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare
dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang
mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada
level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang
disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008).

Endospore adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres

karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di
lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008). Bakteri juga dapat
dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut
dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai
dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook,
2008).

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Praktikum

Pewarnaan Sel (Bakteri dan Jamur) dan Pewarnaan dan Endospora

dilaksanakan pada hari Rabu 24 September 2008 pukul 13.00-16.00 WIB di
Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang.

3.2 Cara Kerja

3.2.1 Pewarnaan Bakteri

Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70%

kemudian ditetesi dengan aquades steril. Kemudian dibuat apusan dari
biakan miring dan disuspensikan sampel sampai homogen, lalu difiksasi
di atas api bunsen. Apusan bakteri yang telah jadi ditetesi gram A
selama 1 menit, dicuci denan air mengalir, dan dikeringanginkan.
Kemudian ditetesi gram B selama 1 menit, dicuci dengan air mengalir,
dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram D selama 30 detik,
dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan. Lalu diamati dengan
mikroskop dengan perbesaran 1000 x, kemudian dicatat bentuk dan
warna sel bakteri.

3.2.2 Pewarnaan Endospora

 Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70%
kemudian ditetesi dengan aquades steril. Kemudian dibuat apusan dari
biakan miring dan disuspensikan sampel sampai homogen, lalu difiksasi
di atas api bunsen. Apusan bakteri digenangi dengan pewarna malakit
hijau lalu dipanaskan preparat di atas penangas air mendidih sampai
muncul uap air (10 menit) dan dijaga jangan sampai pewarna kering.
Kemudian dicuci dengan air mengalir, dikeringanginkan, diwarnai
dengan safranin (1-2 menit) lalu dicuci dengan air mengalir dan
dikeringanginkan lagi. Kemudian diamati ada tidaknya spora dalam sel
(bentuk, letak, ukuran terhadap sel vegetatif) menggunakan mikroskop
dengan perbesaran.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Pewarnaan Bakteri dan Endospora dilakukan dengan menggunakan 8 isolat

bakteri untuk 8 kelompok yang bertujuan untuk mengidentifikasi bentuk
kedelapan bakteri tersebut dan termasuk dalam bakteri gram positif atau negatif
dan letak endosporanya. Proses perwarnaan dilakukan dengan membersihkan
gelas objek dan gelas penutup dengan alkohol 70% untuk sterilisasi agar tidak
kontaminasi. Kemudian ditetesi aquades steril untuk meletakkan bakteri dan
dibuat preparat apusan dari biakan miring agar mudah diamati dan difiksasi.
Sampel disuspensikan sampai homogen agar bakteri dapat menyebar di gelas
objek dan tidak menumpuk. Kemudian difiksasi di atas api bunsen yang
bertujuan untuk membunuh bakteri secara cepat dengan tidak merubah bentuk
dan struktur bakteri, melekatkan bakteri di atas objek gelas dan meningkatkan
sifat salinitas pewarna (Tortora, 2002).

Proses pewarnaan bakteri dengan cara apusan bakteri yang telah dibuat
kemudian ditetesi dengan gram A selama 1 menit, gram B selama 1 menit, gram
C selama 1 menit, dan gram D selama 30 detik. Setelah perlakuan pewarnaan,
preparat selalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan, kecuali setelah
pewarnaan gram B preparat dicuci dengan gram C kemudian dikeringanginkan.
Hal ini dilakukan karena gram C mengandung alkohol yang bertujuan untuk
melunturkan cat sebelumnya. Gram A mengandung kristal violet yang berwarna
ungu merupakan cat primer yang akan mewarnai bakteri, pewarnaan dilakukan
1 menit agar cat ini dapat melekat sempurna pada dinding bakteri. Gram B
mengandung garam iodin merupakan cat mordan yang berfungsi melekatkan
atau memfiksasi cat primer yang diserap bakteri, dilakukan selama 1 menit agar
pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih kuat. Gram C mengandung alkohol
sehingga tidak berwarna dan berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya,
dilakukan selama 1 menit agar cat dapat luntur secara sempurna dan tidak ada
yang tersisa. Gram D mengandung safranin sehingga bewarna merah yang
merupakan cat sekunder atau kontras berfungsi untuk memberikan warna
bakteri non target, dilakukan selama 30 detik agar bakteri yang catnya telah
luntur dapat terwarnai (Heritage, 2000). Pencucian dengan air mengalir
dimaksudkan agar cat dapat hilang secara sempurna dan tidak tersisa,
dikeringanginkan bertujuan agar warna melekat pada bakteri dan segera kering
sehingga bila diwarnai lagi warna sebelumnya tidak tercampur dengan warna
yang baru. Kemudian dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 x
agar dapat mengamati bentuk dan warna sel bakteri. Bakteri gram positif akan
berwarna ungu, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah. Proses
pewarnaan endospora dilakukan setelah fiksasi dan setelah dibuat apusan
preparat. Kemudian preparat digenangi malakit hijau yang berfungsi sebagai
pewarna primer yang digunakan untuk melumuri fiksasi panas dan dipanaskan
sampai menggepul. Preparat dipanaskan di atas penangas air mendidih sampai
timbul uap air (10 menit) bertujuan membantu warna menembus dinding
endospora dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan
air mengalir dan dikeringanginkan bertujuan menghilangkan malakit hijau dari
seluruh bagian sel endospora. Pewarnaaan dengan safrani (1-2 menit) bertujuan
sebagai counterstain yang digunakan untuk melumuri bagian warna dari sel
yang lain daripada endospora (Prescot, 2002). Kemudian dicuci dengan air
mengalir agar warna safranin luntur dan dikeringanginkan agar warna cepat
kering.