.1 Latar Belakang Penemuan yang berpengaruh terhadap perkembangan ilmu biologi molekuler salahsatunya adalah PCR (Polymerase Chain

Reaction). Teknik ini mempunyai fungsi utama untuk memperbanyak DNA target. Proses yang terjadi melibatkan suatu primer yang berfungsi sebagai cetakan untuk membuat DNA baru (David, 2005). Aplikasi PCR yang paling besar adalah melakukan pengkopian DNA dalam waktu yang relatif cepat, sehingga kemudian DNA tersebut cukup banyak untuk dapat dideteksi, dikaji, dan dipergunakan untuk berbagai aplikasi (Lairmore, 1990). Teknik PCR memerlukan keterampilan khusus dalam pelaksanaannya, tidak hanya bergantung pada alat PCR tetapi diperlukan hal-hal teknis yang perlu diperhatikan demi kelancaran PCR. Salah satu keahlian teknis yang diperlukan adalah mendesain primer yang dipergunakan sebagai cetakan dalam PCR. Selain hal tersebut diatas, PCR dapat dipergunakan untuk sekuensing, melakukan deteksi gen patologis, serta pembuatan probe. Berdasarkan haltersebut di atas, maka praktikum ini penting untuk dilaksanakan. 1.2 Rumusan Permasalahan Permasalahan yang dapat ditelaah adalah bagaimana teknik cara melakukan teknik PCR dan mendesain primer yang berfungsi sebagai langkah awal sebelum melakukan PCR ? 1.3 Tujuan Praktikum bertujuan untuk mengetahui pelaksanaan teknik PCR dan cara mendesain primer 1.4 Manfaat Salah satu kemampuan PCR adalah dapat mengamplifikasi gen-gen yang diduga terkait dengan penyakit tertentu sehingga akan mempermudah diagnosis penyakit tersebut, sehingga teknik ini dapat digunakan dalam bidang medis.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 PCR (Polymerase Chain Reaction) Polymerase Chain Reaction adalah metode untuk amplifikasi primer oligonukleotida yang dikendalikan secara enzimatis untuk sekuen DNA yang diinginkan. Teknik tersebut mampu mengamplifikasi sekuen hingga berlipat pada tingkatan 105 - 106 dari sejumlah kecil (nanogram) DNA templat, dengan latar sekuen yang tidak relevan (dari DNA genom total. Prasyarat untuk mengamplifikasi sekuen dengan mempergunakan PCR adalah mengetahui sekuen tertentu yang mengapit sekuen DNA yang diamplifikasi sehingga oligonukleotida spesifik dapat diperoleh. Produk PCR diamplifikasi dari templat DNA dengan menggunakan DNA polymerase yang stabil terhadap panas, dan diperoleh dari Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) serta mempergunakan cycler termal otomatis. Tiga tahapan utama PCR (terdiri dari denaturasi, annealing primer, dan polimerisasi) diulang hinggga berlangsung 30 - 40 siklus. Hal ini dilakukan dengan cycler otomatis, yang dapat memanaskan tabung yang berisi campuran reaksi dan mendinginkannya dalam waktu yang sangat singkat (Eavier, 1999). Denaturasi DNA double strand menjadi single strand terjadi pada tahap denaturasi. Hal

fragmen molekuler (DNA. Syarat sebuah primer dalam PCR adalah : 1. Dua primer dari pasangan primer tidak mengandung struktur komplemen lebih dari 2 kb. termasuk segmen DNA yang akan diamplifikasi. Tm (suhu melting) berkisar antara 55-80oC 5. 2005). Primer yang ideal memiliki kandungan GC vs.. 6. Menurut Clark dan Russel (2005). primer PCR. 2. AT yang seimbang (45-55% GC). 7. sehingga saling dapat membentuk ikatan atau menyatu. Hal ini menghindari terjadinya "breathing" pada ujung dan meningkatkan efisiensi priming. nukleotida yang dibutuhkan untuk membuat DNA baru. Tiga atau lebih sekuen C atau G pada ujung 3' primer dapat memicu terjadinya kesalahan priming pada sekuen yang kaya akan G dan C (karena stabilitas annealing).ini terjadi sebagai akibat akibat perlakuan temperatur tinggi yang akan memisahkan strand komplemennya.3 Elektroforesis Gel Agarose Teknik pemisahan fragmen . Dengan kelengkapan prasyarat di atas diharapakan proses PCR berjalan dengan semestinya. Primer PCR biasanya berukuran panjang 20-30 bp.2 Desain Primer Desain primer merupakan salah satu prasyarat sebelum melakukan proses pengkopian gen dengan PCR. Komposisi basa adalah 50-60% (G+C) 3. atau CG atau GC. Jarak amplifikasi atau sekuens target yang diamplifikasi mempunyai ukuran sekitar 200-400 bp (David. 4. Ujung 3' primer bukan merupakan komplementer (pasangan basa). Waktu yang diperluakan ini tergantung pada ukuran templat. Sebaliknya. karena akan mengakibatkan terjadinya dimer primer. enzim yang diperlukan untuk mengatur salinan DNA. Tahapan berikutnya adalah denaturasi pada temperatur 95?C selama 30 detik hingga 1 menit. Prinsip dasar elektroforesis adalah memisahkan molekul berdasarkan muatan listrik intrinsiknya. semakin besar. maka akan memerlukan waktu yang semakin lama.5 ?C (David. primer yang dibutuhkan ini berjumlah dua buah berupa potongan pendek DNA single strand yang sesuai dengan sekuens yang akan diamplifikasi. dan tanpa untaian satu basa yang terlalu panjang. Menurut Innis dan Gelfand (1990). RNA ataupun protein) adalah Elektoforesis gel. muatan negatif akan menarik muatan positif . Tahap pertama dari PCR adalah awal yang panas dengan temperatur 95 ?C selama 2-4 menit. 2. sehingga harus dihindari. dan mesin PCR yang dibutuhkan untuk mengatur temperatur. Ujung 5' pada primer menentukan ujung produk PCR yang dihasilkan. Ukuran primer berkisar antara 17-28 basa 2. 2005). DNA polymerase kemudian akan membuat salinan DNA target menggunakan dNTP. komponen-komponen untuk melakukan PCR terdiri dari: sejumlah kecil molekul DNA. sedangkan pada akhir siklus maka sekuens target pada kedua strand akan dapat dikopi (Prescott dkk. 2003). Muatan listrik positif akan menarik muatan negatif dan menolak sesama muatan positif. Temperatur selanjutnya diturunkan agar primer dapat membentuk ikatan hidrogen pada kedua sisi DNA target (annealing). Primer Reverse dan primer forward harus dihindari saling berkomplemen. Primer PCR tidak boleh memiliki ujung (3') berupa G atau C. Tahapan annealing mempergunakan temperatur yang ditentukan oleh rumus Tm .

3. Menurut hukum listrik. 27. tanggal 23 Oktober 2007. BAB III METODE PENELITIAN 3.dan menolak sesama muatan negatif.1 Waktu Dan Tempat Praktikum PCR dan desain primer dilaksanakan pada hari Selasa. Gel yang mengeras nampak seperti konsentrat campuran gelatin tanpa pewarna. buffer TE.1 Program PCR Perlakuan awal berupa pencampuran bahan-bahan untuk PCR berbeda untuk sampel DNA plasmid dan tail cut dengan sampel DNA tanaman. T 2. microwave. dan terakhir ditambahkan sampel DNA. Taq . 2805. Elektroforesis DNA biasanya dipergunakan untuk memisahkan DNA dalam beragam ukuran. tabung.3 Cara Kerja 3. P 5. Tanaman : KMB. BR 1. sampel DNA (Tail cut : TC 1.1. Jurusan Biologi.2. Ukuran pori agarose bergantung pada konsentrasi dari bubuk agarose yang digunakan. blue tip.2 ?L. MgCl2. sebanyak 8.2H2O dan aquades steril). dan penyokong buffer seperti kertas saring. Bila agarosa dan air dicampur dan direbus.2. TC 2. Loading dye. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. elektroda. Tabung kapiler terbuka dipergunakan untuk berbagai jenis sampel.5 g H3BO3 dan 3. buffer PCR.00 WIB di Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler. gel agarosa. 2005). Universitas Brawijaya Malang. Dua elektrode. maka agarosa akan meleleh menjadi larutan homogen. buffer Taq. atau tabung kapiler.4 ?l akuades steril 1 x buffer Taq 4 ?l. mikropipet. sebanyak 13. Taq Polimerase.2 ?l. yang berguna untuk memperkirakan ukuran fragmen yang berbeda-beda pada DNA sampel yang dielektroforesis (Clark. primer HLA. Taq DNA polymerase 0.2 Alat dan Bahan 3. sentrifuse. serta sekuen DNA untuk desain primer. buffer. 3. masing-masing bermuatan postif dan negatif dihubungkan dengan sumber tegangan tinggi. dNTP mix 0.2. Agarosa merupakan polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut. dan penyokong lainnya dipergunakan untuk sampel biologis seperti campuran protein atau fragmen DNA. Untuk sampel DNA tanaman.1 Alat Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah PCR unit. Bila larutan tersebut suhunya mulai turun suhunya.2 Bahan Bahan yang digunakan adalah PCR mix solution yang terdiri atas 16. PA 3. 2005).2. dengan bagian pori terisi oleh air.2 ?l. Plasmid : PA 2. TB 1) sebanyak 0. Peralatan serta kondisi yang diperlukan untuk proses elektrforesis adalah tegangan tinggi.30-19.5 ?l (50 ng/ ?l). primer aux1. maka gel akan membentuk jaring-jaring berlubang.2 ?l ddH2O (free water nuclease) ditambah dengan dNTP. Untuk sampel DNA plasmid dan tail cut. 3. primer HLA dan primer aux1 (10 pmol) 0.72 g Na2EDTA. dan kamera polaroid. Etidium Bromida (EtBr).1. seperangkat alat elektoforesis. muatan yang berbeda muatan akan saling tarik (Clark. TC 2. Tris Borac EDTA (TBE) (yang terdiri atas 54 g Tris-base.6 ?l ddH2O (free water nuclease) ditambah dengan master mix yang tersusun atas dNTP. Marker pada elektroforesis gel adalah serangkaian fragmen DNA standar dilalukan secara beriringan pada gel yang sama.3. pukul 09. strip asetat selulosa.

Konsentrasi gel yang diinginkan sebesar 0. EtBr dalam jumlah sedikit ditambahkan secara merata ke dalam larutan tersebut setelah larutan tersebut cukup dingin. Larutan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam cetakan yang sudah dipasang sisiran besar (12 sumuran). Program yang kedua meliputi hot start pada temperatur 930C selama 1 menit.polimerase.1 Program PCR DNA yang dipergunakan berasal dari hasil isolasi DNA dari praktikum sebelumnya. Gel agarose ditimbang sesuai dengan konsentrasi gel yang diinginkan serta jumlah sumuran yang digunakan.60%.1.2 Desain Primer Primer forward dipilih secara acak pada sekuen urutan basa nukleotida dengan ketentuan bahwa panjang basa berkisar antara 18 -23 pasangan basa. dan jajaran G/C maksimal sebanyak dua buah.24 gram. . campuran dimasukkan ke dalam sumuran gel dengan hati-hati hingga semua sampel mengisi setiap sumuran yang tersedia. temperatur melting (Tm) ditentukan melalui rumus : Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T) Selanjutnya. Sebanyak 3 l sampel DNA dicampur dengan 2 l loading dye sehingga perbandingan antara keduanya adalah 3 : 2. Presentase (G+C) berkisar antara 45 . denaturasi pada temperatur 920C selama 30 detik. Gel agarosa dilarutkan dengan 30 ml larutan TBE dan dihomogenisasi dengan stirer. Setelah itu. denaturasi pada temperatur 930C selama 1 menit.8% sehingga gel agarose yang ditimbang seberat 0.3 Elektroforesis Gel Agarosa Larutan TBE diencerkan dari 5 kali menjadi 1 kali. ekstensi pada temperatur 720C selama 1 menit. Hal ini dilakukan dengan aturan yang sama seperti penentuan primer forward. tetapi selisih Ta antara primer forward dan reverse tidak boleh lebih dari 10C.1 Analisis Prosedur 4. ekstensi akhir pada temperatur 720C selama 10 menit dan post-ekstensi pada temperatur 370C selama 1 menit. Running dilakukan bila larutan gel agarosa dalam cetakan memadat.50C Bila primer forward telah ditentukan. temperatur annealing (Ta) ditentukan dengan rumus : Ta = Tm .3. dan sampel DNA. ekstensi pada temperatur 720C selama 45 detik. Program yang pertama meliputi hot start pada temperatur 920C selama 1 menit.3. melainkan G atau C. annealing pada temperatur 580C selama 30 detik. 3. Program PCR yang dipergunakan sebanyak dua program yang berbeda. Program yang pertama dipergunakan untuk sampel DNA dari tail cut mencit dan plasmid bakteri. serta mempergunakan siklus sebanyak 30 siklus. sedangkan program yang kedua dipergunakan untuk sampel DNA tanaman. dan post-ekstensi pada temperatur 720C selama 7 menit. Larutan yang telah homogen kemudian dimasukkan ke dalam microwave pada suhu medium (4800C) selama ± 4 menit. annealing pada temperatur 560C selama 30 detik. serta mempergunakan siklus sebanyak 35 siklus. Sekuen primer yang dipergunakan tidak boleh region DNA repetitive. Running dilakukan pada tegangan 50 mV selama satu jam. maka selanjutnya ditentukan primer reverse. Gel kemudian dIletakkan pada UV transiluminator untuk mengetahui hasil elektroforesis BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4. 3. Ujung sekuen 3' bukan T atau A.

Setiap perlakuan pemindahan larutan atau reagen dillakukan pipetting dan mix gentle-finger agar setiap komponen homogen. ion Mg2+ berasal dari MgCl2 (Fester. sedangkan untuk tumbuhan adalah aux1. dan setiap gen yang dianalisis(Van Fleteren. Hal ini penting untuk mendukung terjadinya reaksi PCR terkait dengan sensitivitas PCR (Fester. sel. Larutan ddH2O (free water nuclease) dipergunakan sebagai pelarut DNA dan sebagai media terjadinya reaksi yang tidak mengandung ion ataupun DNA/RNA.2 Elektroforesis Gel Agarosa Langkah pertama adalah larutan TBE diencerkan dari 5 kali menjadi 1 kali untuk memperoleh konsentrasi TBE yang sesuai. template. 1999). buffer Taq juga dipergunakan untuk menstabilkan DNA dan komponen lain dalam reaksi (Van Fleteren. Gel agarose ditimbang agar sesuai dengan konsentrasi gel yang diinginkan serta jumlah sumuran yang digunakan. buffer Taq juga dipergunakan untuk menstabilkan DNA dan komponen lain dalam reaksi. Thawing dilakukan pada tiap komponen yang ingin dimasukkan (yang telah disimpan pada temperatur rendah). Buffer Taq berfungsi untuk menjaga kondisi fisiologis enzim Taq Polimerase. Optimalisasi pemanjangan primer dilakukan melalui melalui tahapan setelah ekstensi. Konsentrasi standar Mg2+ adalah 2 mM.8% sehingga gel agarose yang ditimbang seberat 0. 2000). Penambahan ddH2O (free water nuclease) dipergunakan sebagai pelarut DNA dan sebagai media terjadinya reaksi yang tidak mengandung ion ataupun DNA/RNA. sedangkan primer reverse merupakan penyalin DNA templat bagian reverse. 1999). Primer. Hal ini dilakukan untuk memastikan bahwa komponen tersebut telah siap dipergunakan (The American Heritage. Primer merupakan oligonukleotida pendek yang mengawali reaksi polimerisasi dan berfungsi untuk menentukan awal serta akhir bagian yang akan diamplifikasi (Van Fleteren. Hot start berfungsi untuk untuk lebih memaksimalkan pembukaan untai ganda DNA. 1999).1. DNA tail cut tikus. 4. Buffer Taq berfungsi untuk menjaga kondisi fisiologis enzim Taq Polimerase. Selain itu. temperatur yang dipergunakan untuk masing-masing tahapan bervariasi tergantung pada jenis organisme. Selain itu. Masing-masing komponen yang terdapat pada master mix memiliki fungsi yang berbeda. Perlakuan awal yang dipergunakan untuk sampel DNA plasmid dan tail cut berbeda dengan perlakuan untuk DNA tanaman. Coli). dan DNA tanaman (kacang koro dan buncis) untuk membandingkan hasil amplifikasi PCR pada ketiga sampel. Primer terdiri dari forward dan reverse. 2005). dan dNTP juga akan mengikat pada Mg2+ sehingga konsentrasinya harus lebih tinggi daripada konsentrasi total dNTP. yakni ekstensi akhir pada DNA tanaman dan post-ekstensi pada DNA tail cut serta plasmid. Konsentrasi gel yang diinginkan sebesar 0. Menurut Van Fleteren (1999). Pencampuran yang tidak merata akan mengakibatkan terjadinya kegagalan pada reaksi. Sampel DNA dipergunakan sebagai DNA templat yang akan diamplifikasi. Hal ini penting untuk mendukung terjadinya reaksi PCR terkait dengan sensitivitas PCR (Fester. Masing-masing komponen yang terdapat pada master mix memiliki fungsi yang berbeda. Primer forward merupakan penyalin DNA templat bagian forward.yakni DNA plasmid (E. Pengadukan . Perbedaan ini terletak pada penggunaan master mix yang berbeda. Primer yang dipergunakan untuk sampel DNA tail cut dan plasmid adalah HLA. 2005). Hal ini dilakukan agar dapat meminimalisasi terjadinya kesalahan pengenalan primer pada DNA non target. tetapi terkadang konsentrasinya dinaikkan untuk menghasilkan produk PCR yang lebih baik.24 gram dan TBE yang dipergunakan untuk melarutkan gel agarosa sebanyak 30 ml. 2005).

Hal ini dikarenakan agarosa tidak dapat terlarut dalam buffer pada suhu ruang sehingga harus dididihkan. Akan tetapi. Setelah itu. EtBr dapat ditambahkan pada larutan tempat terendamnya gel setelah elektroforesis atau dapat ditambahkan pada larutan agarosa di awal pembuatannya.dengan stirer dilakukan dengan tujuan untuk menghomogenisasi gel agarosa dengan solvennya. Sampel DNA yang dipergunakan lebih banyak agar molekul DNA memiliki persebaran yang lebih merata di antara loading dye. Pemberian EtBr ketika gel masih beruap akan menyebabkan EtBr juga ikut menguap. Zat ini memiliki muatan negatif seperti DNA dan berfungsi sebagai penunjuk seberapa jauh proses elektroforesis berlangsung. Hal ini penting karena sebagian besar nuklease yang mendegradasi DNA memerlukan kation divalen untuk aktivasinya. Menurut Bowen (2000). 1999).1.0%. loading dye merupakan suatu zat pewarna pelacak yang dapat ikut bermigrasi di sepanjang gel. Konsentrasi tersebut akan memisahkan fragmen pada kisaran yang lebar. Larutan tersebut mengoptimalkan pH dan konsentrasi ion dalam gel serta melapisi gel agar dapat mengalirkan arus listrik yang menggerakkan DNA melalui gel. Running dilakukan bila larutan gel agarosa dalam cetakan memadat. Larutan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam cetakan yang sudah dipasang sisiran besar (12 sumuran) dan dibiarkan dingin hingga memadat. Hal ini karena DNA yang terdapat dalam sampel tersebut telah mengalami pengenceran sehingga memiliki konsentrasi rendah. 2002). yakni dengan memasukkannya ke dalam microwave. Semakin banyak agarose akan membentuk gel yang makin padat dan menghasilkan matriks yang lebih sulit dilalui DNA. Larutan yang telah homogen kemudian dimasukkan ke dalam microwave pada suhu medium (4800C) selama ± 4 menit. 1999). yakni larutan TBE. Penambahan EtBr di awal pada larutan agarosa memiliki keuntungan yakni tidak diperlukannya periode perendaman setelah elektroforesis. sisiran dapat diambil dengan hati-hati agar sumuran tidak rusak dan selanjutnya running elektroforesis dapat dilakukan. Sebanyak 3 l sampel DNA dicampur dengan 2 l loading dye sehingga jumlah total larutan adalah 5 l. Larutan TBE merupakan larutan buffer yang memungkinkan DNA bergerak lancar melalui gel. Pemerataan DNA pada loading dye diharapkan menghasilkan pendaran DNA di bawah sinar UV dapat . Informasi ini dapat dipergunakan untuk optimalisasi kondisi eksperimen bila ukuran fragmen DNA diketahui (Viers. Hal ini dilakukan untuk memperoleh hasil yang optimal karena running diawali dengan memasukkan sampel DNA pada sumuran. Tris merupakan bahan kimia yang membantu mempertahankan konsistensi pH larutan. loading dye juga dapat meningkatkan densitas DNA sehingga dapat mengendapkan DNA pada sumuran (Warder. Menurut Viers (1999). EtBr dalam jumlah sedikit ditambahkan secara merata ke dalam larutan tersebut setelah larutan tersebut cukup dingin. Asam borak menyediakan konsentrasi ion yang sesuai untuk buffer . Salah satu cara meminimalisasi ancaman karsinogenik dari EtBr adalah dengan menambahkannya ketika suhu gel telah sedikit menurun (tidak beruap). yakni antara 500 bp hingga 20 kb. kerugiannya adalah EtBr bersifat karsinogen sehingga selama penggunaanya harus berhati-hati (Viers. EDTA merupakan agen pengkelat kation divalen seperti magnesium. Selain itu.8 . Pemisahan mampu mendiferensiasikan antara dua atau lebih fragmen pada ukuran yang bebeda-beda. Konsentrasi agarose yang digunakan sebesar 0. Perbandingan antara loading dye dan DNA yang dipergunakan adalah 2 : 3. Perlu diperhatikan bahwa uap EtBr bersifat karsinogen sehingga harus berhati-hati.

ini disebabkan oleh hal-hal . dan di potret menggunakan kamera polaroid. Selain itu. hasil elektroforesis tidak menampilkan band-band DNA pada gel seperti yang diharapkan tujuan praktikum kali ini. dengan kata lain primer R dan primer F akan berjalan bersamaan pada temperatur yang sama juga. Running dilakukan dengan mengalirkan arus listrik yang dipergunakan sebagai faktor pendorong gerakan molekul DNA dengan elektroda positif terletak berhadapan dengan sumuran. pada PCR hampir tidak terdapat band pada hasil elektroforesis. melainkan G atau C. Terdapat pebedaan yang nyata antara hasil PCR dan RFLP pada praktikum kali ini. Dimungkinkan hasil PCR yang tidak bagus sehingga mempengaruhi hasil pada saat elelktroforesis 2. 2002).lebih representatif terhadap jumlah DNA. misal kecocokan primer. 4. Visualisasi menggunakan UV transluminator. Presentase (G+C) berkisar antara 45 .50C Selanjutnya dicari primer reverse nya dengan ketentuan seperti di atas. serta menghindari pipetting pada saat pencampuran larutan pCR pada thin wall. Tegangan yang dipergunakan cukup kecil karena DNA sangat rentan terhadap tekanan fisik. Peletakan sampel pada gel yang kurang berhati-hati sehingga dapat merobek gel Sehingga untuk menghindari kegagalan pada saat elektroforesis diperlukan suatu langkah preventif misalnya:memperhatikan semua syarat untuk terjadinya PCR.60%. Dimungkinkan pada saat elektroforesis voltase yang digunakan tidak sesuai dengan komponen Elektroforesis pada saat itu 3.1 Analisis Hasil Elektroforesis.2 Desain Primer Langkah pertama dari desain primer adalah memilih primer forwar.2 Analisis Hasil 4.2. Setelah itu. Primer forward dipilih secara acak pada sekuen urutan basa nukleotida dengan ketentuan bahwa panjang basa berkisar antara 18 -23 pasangan basa. pcr mix yang digunakan. Ujung sekuen 3' bukan T atau A. tegangan yang lebih rendah menghasilkan resolusi yang lebih baik di antara fragmen-fragmen yang berukuran hampir sama (Warder. Hal ini karena DNA bermuatan negatif sehingga harus dipergunakan kutub yang berlawanan untuk dapat menggerakkan DNA. temperatur melting (Tm) ditentukan melalui rumus : Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T) Selanjutnya. 3. dan jajaran G/C maksimal sebanyak dua buah. Sekuen primer yang dipergunakan tidak boleh region DNA repetitive. Tegangan listrik yang dipergunakan adalah 50 mV selama satu jam. temperatur annealing (Ta) ditentukan dengan rumus : Ta = Tm . Hal yang perlu diperhatikan adalah Ta antara primer forward dan reverse tidak boleh lebih dari 10C. hal ini disebabkan oleh beberapa hal berikut ini: 1. PCR dan RFLP Pada praktikum ini.3.

serta untuk mendesain primer. menentukan sisi pemotongan RE. Hasil Elektroforesis dari PCR menunjukkan bahwa hampir tidak terdapat band DNA yang muncul pada film polaroid hasil UV transluminator. Selalu memerlukan suatu primer untuk menjalankan PCR 2. Memerlukan analisis RE untuk menentukan gen traget yang akan di potong 2. Akan lebih memerlukan waktu relatif lama untuk mengamplifikasi minimal 30-40 siklus Keuntungan teknik PCR 1. asisten menyediakan software-software untuk melakukan sekuensing. hal ini disebabkan karena: pipetting yang dilaksanakan pada pencampuran larutan pcr mix pada thin wall. ini membuktikan bahwa enzim restriksi Hae III dan Hind III dapat bekerja pada sampel. Akan tetapi dari hasil elektroforesis tidak semua bisa tampil ini memuktikan juga bahwa fragmen hasil RFLP terlalu kecil atau terjadi difusi pada cairan elelktroforesis. Biasanya dipergunakan secara luas dalam analisis bidang molekuler botani.2 Saran Sebaiknya pada praktikum kali ini. User harus mengetahui sisi sequens pemotongan oleh enzim RE 3. secara bersinergi. Diperlukan PCR mix 3. komposisi larutan pada thin wall yang tidak seimbang.yang tersebut diatas. berdampingan dengan marker yang digunakan. 5. dan tidak rusak Keuntungan RFLP 1. .2. BAB V PENUTUP 5. RE harus dalam keadaan yang masih baik. sedangkan pada hasil RFLP masih terdapat satu band DNA yang begitu mencolok pada sampel. Kerugian teknik RFLP 1.1 Kesimpulan Secara umum PCR berfungsi untuk melakukan kopi pada DNA target berdasarkan primer yang digunakan. serta kurang bercampurnya larutan pada thin wall PCR. . PCR sangat sensitif terhadap semua perlakuan yang tidak sesuai dengan protokol pada saat pencampuran larutan thin wall 4.2 Keuntungan dan Kerugian Teknik PCR dan RFLP Kerugian teknik PCR 1. oligonuklueotide dapat dipesan langsung pada perusahaan penyedia primer PCR. Porgram PCR relatif lebih mudah dilaksanakan 2. Terdapat PCR mix solution pabrikan yang tidak memerlukan pencampuran oleh user 3. Dapat melakukan analisis gen Polimorfisme pada sutu spesies dan lebih akurat daripada PCR 2.

Cold Spring Harbor Laboratory Press.org. 2003. DNA & PCR. Fifth Edition. PCR Primer Design and Reaction Optimalization. http://elchem. http://allsevv. P. W. Tanggal akses 3 Maret 2007 Prescott. Electrophoresis.dnalc.meb. J. D.ac. Harley. http://users. http:// www. M.jp. New York. Suinsky.biotech ubc. 2004. PCR Aplications : Protocols for Functional Genomics. 2005.ugent.com /onionDNA. McGraw Hil.kaist. 2003. Microbiology.. 2001. dan D.be/ %7Eavierstr/.A. dan J. 1999.be /~avierstr/index. 2000. http://www. J. Polymerase Chain Reaction. Academic Press. 2000. R. Halaman 3-12 Lairmore.htm. M. 1999. L. Yogyakarta Clark. Tanggal akses 3 Maret 2007 Henegariu.wfcc.ca. O. Yayasan Essentia Medica.html.med. Academic Press.yale. http://www.be/mariester/principles/pcr. Molecular Biology : Understanding the Genetic Evolution.com. .D. PCR: an outstanding method. Pengantar Kloning Gen. science-projects. N. http://www. Rybicky. DAFTAR PUSTAKA Bowen. PCR Protocols. 1990. DNA Analysis by Agarose Gel Electrophoresis.574 Clark. Protocol for PCR with Taq DNA Polymerase. Principle of the PCR.html. New York Tissue. Houghton Mifflin Company. Tanggal akses 3 Maret 2007 Warden. Isolation of DNA from Agarosa and Polyacrylamide Gels.org /shockwave/ pcranwhole.Software tersebut bisa di download dari internet secara gratis misal GENtle.kr/ vt/ chem -ed/sep/electrop/disc-el. 1999. Molecular Biology : Made Simple and Fun.se/chemistry/laureates/1993/mullis-lecture. Brown. D. dan L. B. 2005. W. H. Klein. Tanggal akses 3 Maret 2007 Fermentas. A. M. New York The American Heritage. Third Edition. Gelfand. D. New York.html.htm.nobel. Russel. W. Editor Prof. H. Tanggal akses 3 Maret 2007 Fester. Elsevier Inc. 2005. Gelfand.. Tanggal akses 3 Maret 2007 Eavier. PCR Lab.html.. Principle of the PCR. Tanggal akses 3 Maret 2007 Viers. J. A. 1990. Molecular Cloning : A Laboratory Manual Volume 2. Cache River Press. Tanggal akses 3 Maret 2007 Van Fleteren. http://users. Halaman 565 . Louis. Tanggal akses 3 Maret 2007 Innis. 2002. Molecular Technique Lecture Note 2005. St. California. A.edu/genetics/ward/taxi/pog.html. J dan D.htm.2a/ed.ac. Soemanti Ahmad Muhammad Praseno.P. 1999. San Diego Innis. Tanggal akses 3 Maret 2007 Sambrook. 2001. http:// www. http://fermentas. DNA Purification and Analysis.ac. H. http://info.nig. P. Russel. Tanggal akses 3 Maret 2007 Mullis. David Ng. Polymerase Chain Reaction. T. http://www. E. 1026 halaman. D.ugent. 1993. 1999. 2005.ac. 2005.vct.

html. biasanya 20 sampai 40 siklus. tapi tetap saja hasilnya akan sangat banyak.http://biology.edu/biosci /graduate/amb. Secara sederhana PCR merupakan reaksi penggandaan daerah tertentu dari DNA cetakan (template) dengan batuan enzim DNA polymerase.gif .824 kali! Tentu saja nilainya tidak tepat seperti itu. Mungkin Anda bingung bagaimana caranya polisi bisa mengungkap pelaku kejahatan dengan berbekal sehelai rambut pelaku yang tercecer di TKP. Beginning Molecular Biology Laboratory Manual : PCR Amplification of DNA. 2003. ajaib! Ternyata hal ini gak lepas dari yang namanya PCR alias Polymerase Chain Reaction. 2 pangkat 30 alias 1.be/~avierstr/principles/pcrcopies.edu /sciconn /lessons2 /lessons .umbc. kita masih harus memperhitungkan efisiensi reaksi.arizona. dll. sekarang bayangkan bahwa pada setiap siklus DNA polymerase akan menggandakan DNA sebanyak 2 kali. J. Tanggal akses 3 Maret 2007 Tentu Anda sudah mengenal yang namanya DNA.ugent. Maka pantes aja dengan berbekal DNA yang terkandung dalam sampel yang cuma secuil itu bisa diperoleh banyak sekali informasi sesuai kebutuhan kita. http://www. Reaksi PCR meniru reaksi penggandaan atau replikasi DNA yang terjadi dalam makhluk hidup. PCR terdiri atas beberapa siklus yang berulang-ulang.073.be/~avierstr/principles/pcrcopies. atau dari tetesan sperma pemerkosa yang mengering di tubuh korban.741. B.html. Nah. Sumber: http://users. diagnosa penyakit. Tanggal akses 3 Maret 2007 Wolf. DNA ini sering disebut-sebut terutama berkaitan dengan kriminalitas. dan coba hitung berapa salinan utas ganda DNA yang akan dihasilkan setelah 30 siklus? Yup.gif Sumber: http://users. Padahal kan sampel yang dianalisa jumlahnya sangat sedikit.ugent. penentuan ‘keabsahan’ keturunan. Proses yang berlangsung secara in vitro dalam tabung reaksi sebesar 200 µl ini mampu menggandakan atau mengkopi DNA hingga miliaran kali jumlah semula.

dNTP (deoxynucleoside triphosphate) dNTP alias building blocks sebagai ‘batu bata’ penyusun DNA yang baru. Buffer Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase. dGTP dan dTTP. Ion Logam • • Ion logam bivalen. fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. umumnya Mg++. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template. komponen lain yang dibutuhkan adalah: Primer Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. yaitu dATP. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. dCTP. Ion logam monovalen. dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.Komponen PCR Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja. . kalsium (K+). dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja.

Ekstensi/elongasi .be/~avierstr/principles/pcrsteps.be/~avierstr/principles/pcrsteps. suhu diturukan ke kisaran 40-60oC selama 20-40 detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer. yaitu: Denaturasi Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama 30-60 detik.ugent.gif Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap.gif Sumber: http://users.Tahapan Reaksi Sumber: http://users. Pada suhu ini DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal. Annealing Setelah DNA menjadi utas tunggal.ugent.

Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. Dari sekian panjang DNA genome. Pada awalnya orang menggunakan tiga penangas air (water bath) untuk melakukan denaturasi. Lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi. Aplikasi teknik PCR Kita harus berterima kasih kepada Kary B Mullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan PCR pada tahun 1984. maka akan dipasang dNTP. yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein. Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut: Pra-denaturasi Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu). Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya. jika basa pada template adalah A. diantaranya: Isolasi Gen Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar. annealing dan ekstensi secara manual. gen itu apaan ya? Sebagaimana kita tahu bahwa fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik. Tapi syukurlah sekarang mesin Thermal Cycler sudah terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler yang dapat menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR. RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. berpindah dari satu suhu ke suhu lainnya menggunakan tangan.Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase. DNA manusia saja panjangnya sekitar 3 miliar basa. begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T. DNA ditranskrip menghasilkan RNA. secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp. dan C dengan G. Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan. . begitu pula sebaliknya). dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Oh ya. biasanya 70-72oC. bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen. Final Elongasi Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna.

Berkat teknologi rekayasa genetik. kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari. metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator.littletree. maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan. kemudian menjadikannya obat diabetes. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun. dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda. Dan ajaib! Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia. Kembali ke pembahasan isolasi gen. dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi atau babi. kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia. yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. misalnya ibu atau bapak kandung. Forensik Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban). atau korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri. Sebagai contoh.com.sisanya tidak menyandikan protein atau disebut ‘junk DNA’. Nah. Diagnosa Penyakit . Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan. proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia. para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. lebih cepat. DNA ‘sampah’ yang fungsinya belum diketahui dengan baik.htm]. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah. DNA Sequencing Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing. Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud.au/dna. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut. dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus ‘mengorbankan’ sapi atau babi. yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda. diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama ‘probe’ yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin juga [http://www. untuk mengisolasi gen. mudah. Konon banyak kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua ‘sesungguhnya’ dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.

Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini. Denaturasi Newton and Graham (1997) dalam Rohmy (2001). Proses ini dapat dikelompokkan dalam tiga tahap berurutan yaitu denaturasi templat. Faktor yang mempengaruhi tahap ini antara lain suhu annealing dan primer. Proses dalam PCR Polymerase Chain Reaction (PCR) terdiri dari tiga proses. Tahap annealing primer merupakan tahap terpenting dalam PCR. menyatakan bahwa denaturasi merupakan proses memisahkan DNA menjadi utas tunggal. . 1997 dalam Rohmy 2001).. yaitu suhu optimal untuk TaqDNA polimerase. sehingga diperoleh amplifikasi DNA antara 108 – 109 kali (Retnoningrum. Denaturasi yang tidak berlangsung secara sempurna dapat menyebabkan utas DNA terputus. A. 2. Tahap denaturasi yang terlalu lama dapat mengakibatkan hilangnya aktivitas enzim polimerase (Lisdiyanti. Prinsip dasar PCR Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan salah satu metode untuk mengidentifikasi penyakit infeksi. Proses pemanjangan primer (tahap extension) biasanya dilakukan pada suhu 72 oC. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat. Teknik PCR didasarkan pada amplifikasi fragmen DNA spesifik di mana terjadi penggandaan jumlah molekul DNA pada setiap siklusnya secara eksponensial dalam waktu yang relatif singkat. 1997). Suhu annealing yang terlalu rendah dapat mengakibatkan timbulnya pita elektroforesis yang tidak spesifik. 2001). B. annealing (penempelan) pasangan primer pada untai DNA target dan extension (pemanjangan atau polimerisasi). yaitu: 1. Maka tak salah panitia Nobel menganugrahkan hadiah Nobel bidang kimia yang bergengsi ini kepada Kary B Mullis hanya 9 tahun setelah penemuannya (1993). Denaturasi awal dilakukan selama 1 – 3 menit diperlukan untuk meyakinkan bahwa DNA telah terdenaturasi menjadi untai tunggal. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya. PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Annealing Merupakan proses penempelan primer. Tahap denaturasi DNA biasanya dilakukan pada kisaran suhu 92 – 95 oC. karena jika ada sedikit saja kesalahan pada tahap ini maka akan mempengaruhi kemurnian dan hasil akhir produk DNA yang diinginkan. sedangkan suhu yang tinggi dapat meningkatkan kespesifikan amplifikasi (Saiki et al. bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Kenaikan suhu setelah tahap annealing hingga mencapai 70–74 oC bertujuan untuk mengaktifkan enzim TaqDNA polimerase. Masih banyak aplikasi PCR lainnya yang sangat bermanfaat. Metode ini dikembangkan untuk mengatasi kelemahan metode diagnosis konvensional seperti imunologi dan mikrobiologi. 1988 dalam Rohmy.

Selain itu. 1996 dalam Wahyudi. 3. Hasil sintesa DNA dalam satu siklus dapat berperan sebagai cetakan (template) pada siklus berikutnya sehingga jumlah DNA target menjadi berlipat dua pada setiap akhir siklus. 1988 dalam Rohmy. Extension Merupakan proses pemanjangan DNA. tetapi bila tidak memungkinkan. Proses ini disebut dengan reaksi rantai polimerase (polymerase chain reaction. yaitu proses elektroforesis. Selanjutnya. 2004). hasil elektroforesis yang berupa band RNA dapat dilihat dengan UV transluminator dan diabadikan dengan kamera polaroid (Sunarto dkk. Proses penggandaan ini dikenal sebagai proses amplifikasi. 2. enzim polimerase bergabung bersama dengan nukleotida dan pemanjangan primer lengkap untuk sintesis sebuah DNA utas ganda. sehingga setelah 30 siklus akan menjadi milyaran amplifikasi DNA target. PCR) karena merupakan siklus penggandaan yang berulang sehingga kegiatan ini seolah-olah merupakan suatu proses reaksi berantai. atau cairan hemolim. Satu jenis primer bertanggung jawab atas penggandaan satu jenis DNA tertentu sehingga primer satu jenis virus hanya dapat digunakan untuk deteksi virus tersebut saja. sampel dapat disimpan dalam larutan alkohol 95% dengan perbandingan 1 : 9 (1 bagian sampel dengan 9 bagian alkohol 95%). Sampel yang akan diuji PCR sebaiknya dalam kondisi segar. Dengan kata lain DNA target meningkat secara eksponensial. Hal ini bertujuan untuk mencegah terjadinya kerusakan DNA/RNA (Haliman dan Adijaya. Hasil uji PCR selanjutnya digunakan pada tahap ketiga.. 2005). Menurut Haliman dan Adijaya (2005). Selain suhu. semakin lama waktu extension maka jumlah DNA yang tidak spesifik semakin banyak (Saiki et al. Proses tersebut dilakukan pada kondisi suhu dan siklus penggandaan tertentu. DNA dari sel-sel sampel diekstraksi dengan larutan lysis buffer (IQ2000TM). Hasil ekstraksi DNA di-sentrifus hingga diperoleh butiran atau pelet DNA. Sementara untuk mengekstraksi RNA digunakan RNA ekstraction solution (IQ2000TM). DNA yang telah diklon pada tahap kedua dimasukkan ke dalam lubang-lubang kecil yang terdapat pada lempengan agar agarose . Dengan bantuan buffer TAE atau TBE. Dalam tahap extension atau sintesis DNA. Uji PCR untuk mendeteksi keberadaan virus dilakukan di laboratorium dengan pengambilan sampel udang Vannamei dari tambak budidaya. RNA ekstraction solution (IQ2000TM) juga berfungsi mengamankan RNA dari kerusakan akibat kerja enzim rNase. yang dapat diatur pada mesin PCR (thermocycle). secara umum uji PCR di laboratorium dilakukan dengan tahapan-tahapan sebagai berikut: 1. 2001). pada masa peralihan suhu dari suhu annealing ke suhu extension sampai 70 oC juga menyebabkan terputusnya ikatan-ikatan tidak spesifik antara DNA cetakan dengan primer karena ikatan ini bersifat lemah. Lysis buffer (IQ2000TM) juga berfungsi untuk mengamankan hasil ekstraksi dari kerusakan akibat kerja enzim dNase. 2001). Hasil ekstraksi DNA pada tahap pertama digandakan dengan bantuan enzim-enzim yang dikenal sebagai primer. 3. Setelah diwarnai dengan Ethidium Bromida (ETBr).. Sampel udang Vannamei yang diambil tersebut selanjutnya dilakukan pemotongan bagian insang. DNA virus yang telah berlipat ganda jumlahnya dapat dideteksi dengan elektoforesis sel agarosa. Reaksi ini akan berubah dari satu siklus ke siklus selanjutnya mengikuti perubahan konsentrasi DNA (Hsu et al. kaki renang (pleopoda).

R. Jurusan Farmasi FMIPA ITB. Program Studi Budidaya Perairan. D. Akhmad Rukyani. 2001. Penerapan Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Diagnosis Penyakit Infeksi. Prosedur PCR untuk diagnosa Cepat Penyakit Bercak Putih pada Udang.W. www. Pengaruh Suhu Annealing dan Jumlah Siklus yang Berbeda pada Program PCR Terhadap Keberhasilan Isolasi dan Amplifikasi mtDNA Ikan Patin (Pangasius hypophthalmus). Rohmy. Skripsi. Agus. Hasil proses elektroforesis akan menampilkan pita-pita DNA yang letaknya tersebar. dan Adiwijaya. terinfeksi virus atau bebas dari virus. Skripsi. Daftar Pustaka Haliman. 1997. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan.go. T. Isti Koesharyani. Disketkanling. umur reagen atau enzim yang dipakai.S. Pembudidayaan dan Prospek Pasar Udang Putih yang Tahan Penyakit. Bandung. Sunarto. tergantung pada berat molekulnya. Taukhid. Dari hasil proses elektroforesis ini dapat disimpulkan status sampel. 2005. Udang Vannamei. H. Pita-pita DNA kemudian dibandingkan dengan posisi pita-pita pada lajur penanda DNA (DNA marker). seperti faktor kontaminasi silang.id Wahyudi.2%. Jakarta Retnoningrum. 2005). 2001. serta kondisi larutan buffer dan larutan etidium bromida yang dipakai. Penebar Swadaya. 2004. D. Keberhasilan Penggunaan Primer Spesifik DNA Mitokondria (mtDNA) Ikan Patin (Pangasius hypophthalmus) pada Beberapa Ikan Budidaya dengan Metode PCR (Polymerase Chain Reaction). sebaiknya operator pengujian PCR harus benar-benar terlatih dan teliti (Haliman dan Adijaya. ketelitian saat poses ekstraksi. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. S. Agar kontaminasi silang dapat dihindarkan. Keberhasilan pengujian sampel dengan metode PCR dipengaruhi oleh beberapa hal. Institut Pertanian Bogor . jumlah enzim yang dipakai. Institut Pertanian Bogor. Program Studi Budidaya Perairan.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful