.1 Latar Belakang Penemuan yang berpengaruh terhadap perkembangan ilmu biologi molekuler salahsatunya adalah PCR (Polymerase Chain

Reaction). Teknik ini mempunyai fungsi utama untuk memperbanyak DNA target. Proses yang terjadi melibatkan suatu primer yang berfungsi sebagai cetakan untuk membuat DNA baru (David, 2005). Aplikasi PCR yang paling besar adalah melakukan pengkopian DNA dalam waktu yang relatif cepat, sehingga kemudian DNA tersebut cukup banyak untuk dapat dideteksi, dikaji, dan dipergunakan untuk berbagai aplikasi (Lairmore, 1990). Teknik PCR memerlukan keterampilan khusus dalam pelaksanaannya, tidak hanya bergantung pada alat PCR tetapi diperlukan hal-hal teknis yang perlu diperhatikan demi kelancaran PCR. Salah satu keahlian teknis yang diperlukan adalah mendesain primer yang dipergunakan sebagai cetakan dalam PCR. Selain hal tersebut diatas, PCR dapat dipergunakan untuk sekuensing, melakukan deteksi gen patologis, serta pembuatan probe. Berdasarkan haltersebut di atas, maka praktikum ini penting untuk dilaksanakan. 1.2 Rumusan Permasalahan Permasalahan yang dapat ditelaah adalah bagaimana teknik cara melakukan teknik PCR dan mendesain primer yang berfungsi sebagai langkah awal sebelum melakukan PCR ? 1.3 Tujuan Praktikum bertujuan untuk mengetahui pelaksanaan teknik PCR dan cara mendesain primer 1.4 Manfaat Salah satu kemampuan PCR adalah dapat mengamplifikasi gen-gen yang diduga terkait dengan penyakit tertentu sehingga akan mempermudah diagnosis penyakit tersebut, sehingga teknik ini dapat digunakan dalam bidang medis.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 PCR (Polymerase Chain Reaction) Polymerase Chain Reaction adalah metode untuk amplifikasi primer oligonukleotida yang dikendalikan secara enzimatis untuk sekuen DNA yang diinginkan. Teknik tersebut mampu mengamplifikasi sekuen hingga berlipat pada tingkatan 105 - 106 dari sejumlah kecil (nanogram) DNA templat, dengan latar sekuen yang tidak relevan (dari DNA genom total. Prasyarat untuk mengamplifikasi sekuen dengan mempergunakan PCR adalah mengetahui sekuen tertentu yang mengapit sekuen DNA yang diamplifikasi sehingga oligonukleotida spesifik dapat diperoleh. Produk PCR diamplifikasi dari templat DNA dengan menggunakan DNA polymerase yang stabil terhadap panas, dan diperoleh dari Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) serta mempergunakan cycler termal otomatis. Tiga tahapan utama PCR (terdiri dari denaturasi, annealing primer, dan polimerisasi) diulang hinggga berlangsung 30 - 40 siklus. Hal ini dilakukan dengan cycler otomatis, yang dapat memanaskan tabung yang berisi campuran reaksi dan mendinginkannya dalam waktu yang sangat singkat (Eavier, 1999). Denaturasi DNA double strand menjadi single strand terjadi pada tahap denaturasi. Hal

ini terjadi sebagai akibat akibat perlakuan temperatur tinggi yang akan memisahkan strand komplemennya. Temperatur selanjutnya diturunkan agar primer dapat membentuk ikatan hidrogen pada kedua sisi DNA target (annealing). atau CG atau GC.fragmen molekuler (DNA. 4. Menurut Clark dan Russel (2005). komponen-komponen untuk melakukan PCR terdiri dari: sejumlah kecil molekul DNA. Tiga atau lebih sekuen C atau G pada ujung 3' primer dapat memicu terjadinya kesalahan priming pada sekuen yang kaya akan G dan C (karena stabilitas annealing). Ujung 3' primer bukan merupakan komplementer (pasangan basa). Primer Reverse dan primer forward harus dihindari saling berkomplemen. sehingga saling dapat membentuk ikatan atau menyatu. termasuk segmen DNA yang akan diamplifikasi. nukleotida yang dibutuhkan untuk membuat DNA baru. Tm (suhu melting) berkisar antara 55-80oC 5. dan mesin PCR yang dibutuhkan untuk mengatur temperatur. 6. Primer PCR biasanya berukuran panjang 20-30 bp. 2. karena akan mengakibatkan terjadinya dimer primer. 7.5 ?C (David. AT yang seimbang (45-55% GC). 2005). Menurut Innis dan Gelfand (1990). Primer PCR tidak boleh memiliki ujung (3') berupa G atau C. muatan negatif akan menarik muatan positif . Tahap pertama dari PCR adalah awal yang panas dengan temperatur 95 ?C selama 2-4 menit. Muatan listrik positif akan menarik muatan negatif dan menolak sesama muatan positif. enzim yang diperlukan untuk mengatur salinan DNA. Komposisi basa adalah 50-60% (G+C) 3.. Prinsip dasar elektroforesis adalah memisahkan molekul berdasarkan muatan listrik intrinsiknya. RNA ataupun protein) adalah Elektoforesis gel. Ujung 5' pada primer menentukan ujung produk PCR yang dihasilkan. Tahapan annealing mempergunakan temperatur yang ditentukan oleh rumus Tm . maka akan memerlukan waktu yang semakin lama. Waktu yang diperluakan ini tergantung pada ukuran templat. Jarak amplifikasi atau sekuens target yang diamplifikasi mempunyai ukuran sekitar 200-400 bp (David. Syarat sebuah primer dalam PCR adalah : 1. Ukuran primer berkisar antara 17-28 basa 2. 2. sedangkan pada akhir siklus maka sekuens target pada kedua strand akan dapat dikopi (Prescott dkk. 2005).3 Elektroforesis Gel Agarose Teknik pemisahan fragmen . sehingga harus dihindari. 2003). primer PCR. Dengan kelengkapan prasyarat di atas diharapakan proses PCR berjalan dengan semestinya. Dua primer dari pasangan primer tidak mengandung struktur komplemen lebih dari 2 kb. semakin besar.2 Desain Primer Desain primer merupakan salah satu prasyarat sebelum melakukan proses pengkopian gen dengan PCR. DNA polymerase kemudian akan membuat salinan DNA target menggunakan dNTP. Tahapan berikutnya adalah denaturasi pada temperatur 95?C selama 30 detik hingga 1 menit. primer yang dibutuhkan ini berjumlah dua buah berupa potongan pendek DNA single strand yang sesuai dengan sekuens yang akan diamplifikasi. dan tanpa untaian satu basa yang terlalu panjang. Sebaliknya. Primer yang ideal memiliki kandungan GC vs. Hal ini menghindari terjadinya "breathing" pada ujung dan meningkatkan efisiensi priming.

2 ?L. Elektroforesis DNA biasanya dipergunakan untuk memisahkan DNA dalam beragam ukuran. maka agarosa akan meleleh menjadi larutan homogen. dan penyokong buffer seperti kertas saring. strip asetat selulosa.2 ?l. Peralatan serta kondisi yang diperlukan untuk proses elektrforesis adalah tegangan tinggi. Etidium Bromida (EtBr). yang berguna untuk memperkirakan ukuran fragmen yang berbeda-beda pada DNA sampel yang dielektroforesis (Clark. Jurusan Biologi. blue tip. masing-masing bermuatan postif dan negatif dihubungkan dengan sumber tegangan tinggi. buffer PCR. tanggal 23 Oktober 2007.2.2. BAB III METODE PENELITIAN 3. buffer. Bila agarosa dan air dicampur dan direbus.1. Ukuran pori agarose bergantung pada konsentrasi dari bubuk agarose yang digunakan. TC 2. gel agarosa. T 2. Taq DNA polymerase 0. dan terakhir ditambahkan sampel DNA. Tris Borac EDTA (TBE) (yang terdiri atas 54 g Tris-base. dengan bagian pori terisi oleh air. Bila larutan tersebut suhunya mulai turun suhunya. atau tabung kapiler. buffer TE. Untuk sampel DNA plasmid dan tail cut.1 Alat Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah PCR unit. Tabung kapiler terbuka dipergunakan untuk berbagai jenis sampel.2 ?l ddH2O (free water nuclease) ditambah dengan dNTP. Universitas Brawijaya Malang. maka gel akan membentuk jaring-jaring berlubang. 27. Agarosa merupakan polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut. TB 1) sebanyak 0. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.2 Bahan Bahan yang digunakan adalah PCR mix solution yang terdiri atas 16.4 ?l akuades steril 1 x buffer Taq 4 ?l. sebanyak 13. 2005).2. Taq .2H2O dan aquades steril).2.00 WIB di Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler. microwave. Untuk sampel DNA tanaman.1.2 Alat dan Bahan 3. dan penyokong lainnya dipergunakan untuk sampel biologis seperti campuran protein atau fragmen DNA. Marker pada elektroforesis gel adalah serangkaian fragmen DNA standar dilalukan secara beriringan pada gel yang sama. Gel yang mengeras nampak seperti konsentrat campuran gelatin tanpa pewarna. TC 2. Loading dye. 2805.1 Waktu Dan Tempat Praktikum PCR dan desain primer dilaksanakan pada hari Selasa. 2005). sebanyak 8.3. dNTP mix 0. buffer Taq. 3. primer HLA.1 Program PCR Perlakuan awal berupa pencampuran bahan-bahan untuk PCR berbeda untuk sampel DNA plasmid dan tail cut dengan sampel DNA tanaman. BR 1. MgCl2. Plasmid : PA 2. muatan yang berbeda muatan akan saling tarik (Clark. 3.5 g H3BO3 dan 3. seperangkat alat elektoforesis. sentrifuse. primer HLA dan primer aux1 (10 pmol) 0.30-19. tabung. serta sekuen DNA untuk desain primer. dan kamera polaroid. PA 3. mikropipet.3 Cara Kerja 3. pukul 09.72 g Na2EDTA. Tanaman : KMB.5 ?l (50 ng/ ?l). Menurut hukum listrik. primer aux1. sampel DNA (Tail cut : TC 1.2 ?l. Taq Polimerase. 3.6 ?l ddH2O (free water nuclease) ditambah dengan master mix yang tersusun atas dNTP. elektroda. P 5. Dua elektrode.dan menolak sesama muatan negatif.

temperatur melting (Tm) ditentukan melalui rumus : Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T) Selanjutnya.3. EtBr dalam jumlah sedikit ditambahkan secara merata ke dalam larutan tersebut setelah larutan tersebut cukup dingin.24 gram. Ujung sekuen 3' bukan T atau A.3 Elektroforesis Gel Agarosa Larutan TBE diencerkan dari 5 kali menjadi 1 kali.polimerase. Setelah itu. denaturasi pada temperatur 920C selama 30 detik.3. annealing pada temperatur 560C selama 30 detik. Sebanyak 3 l sampel DNA dicampur dengan 2 l loading dye sehingga perbandingan antara keduanya adalah 3 : 2. serta mempergunakan siklus sebanyak 35 siklus.8% sehingga gel agarose yang ditimbang seberat 0.1.2 Desain Primer Primer forward dipilih secara acak pada sekuen urutan basa nukleotida dengan ketentuan bahwa panjang basa berkisar antara 18 -23 pasangan basa. Running dilakukan pada tegangan 50 mV selama satu jam. annealing pada temperatur 580C selama 30 detik. ekstensi akhir pada temperatur 720C selama 10 menit dan post-ekstensi pada temperatur 370C selama 1 menit. Gel agarosa dilarutkan dengan 30 ml larutan TBE dan dihomogenisasi dengan stirer. Program yang pertama dipergunakan untuk sampel DNA dari tail cut mencit dan plasmid bakteri.1 Analisis Prosedur 4. tetapi selisih Ta antara primer forward dan reverse tidak boleh lebih dari 10C. temperatur annealing (Ta) ditentukan dengan rumus : Ta = Tm . Larutan yang telah homogen kemudian dimasukkan ke dalam microwave pada suhu medium (4800C) selama ± 4 menit. dan post-ekstensi pada temperatur 720C selama 7 menit. Gel agarose ditimbang sesuai dengan konsentrasi gel yang diinginkan serta jumlah sumuran yang digunakan. 3. Program PCR yang dipergunakan sebanyak dua program yang berbeda. Gel kemudian dIletakkan pada UV transiluminator untuk mengetahui hasil elektroforesis BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4. melainkan G atau C. maka selanjutnya ditentukan primer reverse. sedangkan program yang kedua dipergunakan untuk sampel DNA tanaman. Program yang kedua meliputi hot start pada temperatur 930C selama 1 menit. Presentase (G+C) berkisar antara 45 . dan sampel DNA. Sekuen primer yang dipergunakan tidak boleh region DNA repetitive. Konsentrasi gel yang diinginkan sebesar 0. Larutan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam cetakan yang sudah dipasang sisiran besar (12 sumuran).60%. . Program yang pertama meliputi hot start pada temperatur 920C selama 1 menit.1 Program PCR DNA yang dipergunakan berasal dari hasil isolasi DNA dari praktikum sebelumnya.50C Bila primer forward telah ditentukan. ekstensi pada temperatur 720C selama 45 detik. ekstensi pada temperatur 720C selama 1 menit. campuran dimasukkan ke dalam sumuran gel dengan hati-hati hingga semua sampel mengisi setiap sumuran yang tersedia. serta mempergunakan siklus sebanyak 30 siklus. dan jajaran G/C maksimal sebanyak dua buah. Hal ini dilakukan dengan aturan yang sama seperti penentuan primer forward. denaturasi pada temperatur 930C selama 1 menit. 3. Running dilakukan bila larutan gel agarosa dalam cetakan memadat.

yakni ekstensi akhir pada DNA tanaman dan post-ekstensi pada DNA tail cut serta plasmid. Thawing dilakukan pada tiap komponen yang ingin dimasukkan (yang telah disimpan pada temperatur rendah). 4. Selain itu. Pencampuran yang tidak merata akan mengakibatkan terjadinya kegagalan pada reaksi. Pengadukan . Sampel DNA dipergunakan sebagai DNA templat yang akan diamplifikasi. buffer Taq juga dipergunakan untuk menstabilkan DNA dan komponen lain dalam reaksi. Primer yang dipergunakan untuk sampel DNA tail cut dan plasmid adalah HLA. Perlakuan awal yang dipergunakan untuk sampel DNA plasmid dan tail cut berbeda dengan perlakuan untuk DNA tanaman. 2005). Masing-masing komponen yang terdapat pada master mix memiliki fungsi yang berbeda. Penambahan ddH2O (free water nuclease) dipergunakan sebagai pelarut DNA dan sebagai media terjadinya reaksi yang tidak mengandung ion ataupun DNA/RNA. sel. Selain itu.1. 2000). sedangkan primer reverse merupakan penyalin DNA templat bagian reverse. Hal ini penting untuk mendukung terjadinya reaksi PCR terkait dengan sensitivitas PCR (Fester. temperatur yang dipergunakan untuk masing-masing tahapan bervariasi tergantung pada jenis organisme. Menurut Van Fleteren (1999). Primer forward merupakan penyalin DNA templat bagian forward. Buffer Taq berfungsi untuk menjaga kondisi fisiologis enzim Taq Polimerase. Konsentrasi standar Mg2+ adalah 2 mM. Larutan ddH2O (free water nuclease) dipergunakan sebagai pelarut DNA dan sebagai media terjadinya reaksi yang tidak mengandung ion ataupun DNA/RNA. template. buffer Taq juga dipergunakan untuk menstabilkan DNA dan komponen lain dalam reaksi (Van Fleteren.8% sehingga gel agarose yang ditimbang seberat 0. Masing-masing komponen yang terdapat pada master mix memiliki fungsi yang berbeda. Gel agarose ditimbang agar sesuai dengan konsentrasi gel yang diinginkan serta jumlah sumuran yang digunakan. ion Mg2+ berasal dari MgCl2 (Fester. Perbedaan ini terletak pada penggunaan master mix yang berbeda. dan DNA tanaman (kacang koro dan buncis) untuk membandingkan hasil amplifikasi PCR pada ketiga sampel. Konsentrasi gel yang diinginkan sebesar 0.24 gram dan TBE yang dipergunakan untuk melarutkan gel agarosa sebanyak 30 ml. Primer. Setiap perlakuan pemindahan larutan atau reagen dillakukan pipetting dan mix gentle-finger agar setiap komponen homogen. 2005).2 Elektroforesis Gel Agarosa Langkah pertama adalah larutan TBE diencerkan dari 5 kali menjadi 1 kali untuk memperoleh konsentrasi TBE yang sesuai. 2005). Coli). Hal ini dilakukan untuk memastikan bahwa komponen tersebut telah siap dipergunakan (The American Heritage. Hal ini dilakukan agar dapat meminimalisasi terjadinya kesalahan pengenalan primer pada DNA non target. dan dNTP juga akan mengikat pada Mg2+ sehingga konsentrasinya harus lebih tinggi daripada konsentrasi total dNTP. Primer terdiri dari forward dan reverse. Primer merupakan oligonukleotida pendek yang mengawali reaksi polimerisasi dan berfungsi untuk menentukan awal serta akhir bagian yang akan diamplifikasi (Van Fleteren. 1999). Hal ini penting untuk mendukung terjadinya reaksi PCR terkait dengan sensitivitas PCR (Fester. dan setiap gen yang dianalisis(Van Fleteren. Hot start berfungsi untuk untuk lebih memaksimalkan pembukaan untai ganda DNA. DNA tail cut tikus. sedangkan untuk tumbuhan adalah aux1. tetapi terkadang konsentrasinya dinaikkan untuk menghasilkan produk PCR yang lebih baik. Optimalisasi pemanjangan primer dilakukan melalui melalui tahapan setelah ekstensi. 1999). Buffer Taq berfungsi untuk menjaga kondisi fisiologis enzim Taq Polimerase. 1999).yakni DNA plasmid (E.

yakni dengan memasukkannya ke dalam microwave. Semakin banyak agarose akan membentuk gel yang makin padat dan menghasilkan matriks yang lebih sulit dilalui DNA. Akan tetapi. loading dye merupakan suatu zat pewarna pelacak yang dapat ikut bermigrasi di sepanjang gel. Larutan yang telah homogen kemudian dimasukkan ke dalam microwave pada suhu medium (4800C) selama ± 4 menit. yakni larutan TBE. Running dilakukan bila larutan gel agarosa dalam cetakan memadat. loading dye juga dapat meningkatkan densitas DNA sehingga dapat mengendapkan DNA pada sumuran (Warder. Hal ini karena DNA yang terdapat dalam sampel tersebut telah mengalami pengenceran sehingga memiliki konsentrasi rendah. 1999). Pemerataan DNA pada loading dye diharapkan menghasilkan pendaran DNA di bawah sinar UV dapat . Sampel DNA yang dipergunakan lebih banyak agar molekul DNA memiliki persebaran yang lebih merata di antara loading dye. Pemisahan mampu mendiferensiasikan antara dua atau lebih fragmen pada ukuran yang bebeda-beda. 1999). Larutan tersebut mengoptimalkan pH dan konsentrasi ion dalam gel serta melapisi gel agar dapat mengalirkan arus listrik yang menggerakkan DNA melalui gel. Setelah itu. Tris merupakan bahan kimia yang membantu mempertahankan konsistensi pH larutan. Zat ini memiliki muatan negatif seperti DNA dan berfungsi sebagai penunjuk seberapa jauh proses elektroforesis berlangsung. Sebanyak 3 l sampel DNA dicampur dengan 2 l loading dye sehingga jumlah total larutan adalah 5 l. Hal ini dikarenakan agarosa tidak dapat terlarut dalam buffer pada suhu ruang sehingga harus dididihkan.0%. Konsentrasi agarose yang digunakan sebesar 0. sisiran dapat diambil dengan hati-hati agar sumuran tidak rusak dan selanjutnya running elektroforesis dapat dilakukan. Asam borak menyediakan konsentrasi ion yang sesuai untuk buffer . 2002). kerugiannya adalah EtBr bersifat karsinogen sehingga selama penggunaanya harus berhati-hati (Viers. Penambahan EtBr di awal pada larutan agarosa memiliki keuntungan yakni tidak diperlukannya periode perendaman setelah elektroforesis. Hal ini dilakukan untuk memperoleh hasil yang optimal karena running diawali dengan memasukkan sampel DNA pada sumuran. Perlu diperhatikan bahwa uap EtBr bersifat karsinogen sehingga harus berhati-hati. Salah satu cara meminimalisasi ancaman karsinogenik dari EtBr adalah dengan menambahkannya ketika suhu gel telah sedikit menurun (tidak beruap). EtBr dapat ditambahkan pada larutan tempat terendamnya gel setelah elektroforesis atau dapat ditambahkan pada larutan agarosa di awal pembuatannya. EtBr dalam jumlah sedikit ditambahkan secara merata ke dalam larutan tersebut setelah larutan tersebut cukup dingin. Informasi ini dapat dipergunakan untuk optimalisasi kondisi eksperimen bila ukuran fragmen DNA diketahui (Viers. yakni antara 500 bp hingga 20 kb. Konsentrasi tersebut akan memisahkan fragmen pada kisaran yang lebar.8 . EDTA merupakan agen pengkelat kation divalen seperti magnesium. Selain itu. Perbandingan antara loading dye dan DNA yang dipergunakan adalah 2 : 3. Pemberian EtBr ketika gel masih beruap akan menyebabkan EtBr juga ikut menguap.dengan stirer dilakukan dengan tujuan untuk menghomogenisasi gel agarosa dengan solvennya. Menurut Bowen (2000).1. Menurut Viers (1999). Hal ini penting karena sebagian besar nuklease yang mendegradasi DNA memerlukan kation divalen untuk aktivasinya. Larutan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam cetakan yang sudah dipasang sisiran besar (12 sumuran) dan dibiarkan dingin hingga memadat. Larutan TBE merupakan larutan buffer yang memungkinkan DNA bergerak lancar melalui gel.

1 Analisis Hasil Elektroforesis. temperatur melting (Tm) ditentukan melalui rumus : Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T) Selanjutnya. PCR dan RFLP Pada praktikum ini. Setelah itu. Peletakan sampel pada gel yang kurang berhati-hati sehingga dapat merobek gel Sehingga untuk menghindari kegagalan pada saat elektroforesis diperlukan suatu langkah preventif misalnya:memperhatikan semua syarat untuk terjadinya PCR.60%. dan di potret menggunakan kamera polaroid. misal kecocokan primer.3. 2002). 4. Presentase (G+C) berkisar antara 45 . tegangan yang lebih rendah menghasilkan resolusi yang lebih baik di antara fragmen-fragmen yang berukuran hampir sama (Warder. Hal ini karena DNA bermuatan negatif sehingga harus dipergunakan kutub yang berlawanan untuk dapat menggerakkan DNA. Visualisasi menggunakan UV transluminator. melainkan G atau C. Ujung sekuen 3' bukan T atau A. Dimungkinkan pada saat elektroforesis voltase yang digunakan tidak sesuai dengan komponen Elektroforesis pada saat itu 3. hal ini disebabkan oleh beberapa hal berikut ini: 1. Running dilakukan dengan mengalirkan arus listrik yang dipergunakan sebagai faktor pendorong gerakan molekul DNA dengan elektroda positif terletak berhadapan dengan sumuran.lebih representatif terhadap jumlah DNA. dan jajaran G/C maksimal sebanyak dua buah.2 Analisis Hasil 4.2. serta menghindari pipetting pada saat pencampuran larutan pCR pada thin wall. Selain itu. Sekuen primer yang dipergunakan tidak boleh region DNA repetitive. pcr mix yang digunakan. pada PCR hampir tidak terdapat band pada hasil elektroforesis. Primer forward dipilih secara acak pada sekuen urutan basa nukleotida dengan ketentuan bahwa panjang basa berkisar antara 18 -23 pasangan basa.2 Desain Primer Langkah pertama dari desain primer adalah memilih primer forwar. Dimungkinkan hasil PCR yang tidak bagus sehingga mempengaruhi hasil pada saat elelktroforesis 2. 3. temperatur annealing (Ta) ditentukan dengan rumus : Ta = Tm . ini disebabkan oleh hal-hal .50C Selanjutnya dicari primer reverse nya dengan ketentuan seperti di atas. Terdapat pebedaan yang nyata antara hasil PCR dan RFLP pada praktikum kali ini. hasil elektroforesis tidak menampilkan band-band DNA pada gel seperti yang diharapkan tujuan praktikum kali ini. Tegangan listrik yang dipergunakan adalah 50 mV selama satu jam. Hal yang perlu diperhatikan adalah Ta antara primer forward dan reverse tidak boleh lebih dari 10C. Tegangan yang dipergunakan cukup kecil karena DNA sangat rentan terhadap tekanan fisik. dengan kata lain primer R dan primer F akan berjalan bersamaan pada temperatur yang sama juga.

Porgram PCR relatif lebih mudah dilaksanakan 2. hal ini disebabkan karena: pipetting yang dilaksanakan pada pencampuran larutan pcr mix pada thin wall. Terdapat PCR mix solution pabrikan yang tidak memerlukan pencampuran oleh user 3. Biasanya dipergunakan secara luas dalam analisis bidang molekuler botani. Akan tetapi dari hasil elektroforesis tidak semua bisa tampil ini memuktikan juga bahwa fragmen hasil RFLP terlalu kecil atau terjadi difusi pada cairan elelktroforesis. serta kurang bercampurnya larutan pada thin wall PCR.2 Saran Sebaiknya pada praktikum kali ini. menentukan sisi pemotongan RE.2. sedangkan pada hasil RFLP masih terdapat satu band DNA yang begitu mencolok pada sampel. .1 Kesimpulan Secara umum PCR berfungsi untuk melakukan kopi pada DNA target berdasarkan primer yang digunakan. asisten menyediakan software-software untuk melakukan sekuensing. RE harus dalam keadaan yang masih baik.2 Keuntungan dan Kerugian Teknik PCR dan RFLP Kerugian teknik PCR 1. Memerlukan analisis RE untuk menentukan gen traget yang akan di potong 2. ini membuktikan bahwa enzim restriksi Hae III dan Hind III dapat bekerja pada sampel. PCR sangat sensitif terhadap semua perlakuan yang tidak sesuai dengan protokol pada saat pencampuran larutan thin wall 4. komposisi larutan pada thin wall yang tidak seimbang. Akan lebih memerlukan waktu relatif lama untuk mengamplifikasi minimal 30-40 siklus Keuntungan teknik PCR 1. serta untuk mendesain primer. User harus mengetahui sisi sequens pemotongan oleh enzim RE 3. oligonuklueotide dapat dipesan langsung pada perusahaan penyedia primer PCR.yang tersebut diatas. 5. Dapat melakukan analisis gen Polimorfisme pada sutu spesies dan lebih akurat daripada PCR 2. Selalu memerlukan suatu primer untuk menjalankan PCR 2. BAB V PENUTUP 5. Diperlukan PCR mix 3. Kerugian teknik RFLP 1. berdampingan dengan marker yang digunakan. secara bersinergi. . Hasil Elektroforesis dari PCR menunjukkan bahwa hampir tidak terdapat band DNA yang muncul pada film polaroid hasil UV transluminator. dan tidak rusak Keuntungan RFLP 1.

htm. Third Edition. Cache River Press.A. 2002. 2001.com /onionDNA. L. Microbiology. dan D. J.ugent. J.edu/genetics/ward/taxi/pog. H. http://info. Tanggal akses 3 Maret 2007 Innis. 2000.se/chemistry/laureates/1993/mullis-lecture. San Diego Innis. 1990.. New York The American Heritage. dan J. David Ng. science-projects. 2005. PCR: an outstanding method. 1999. PCR Aplications : Protocols for Functional Genomics. A. D. E. Academic Press.htm. 2004. W. New York. O.dnalc. Molecular Technique Lecture Note 2005. Tanggal akses 3 Maret 2007 Van Fleteren. Principle of the PCR. D. http://users. Isolation of DNA from Agarosa and Polyacrylamide Gels. Rybicky.kr/ vt/ chem -ed/sep/electrop/disc-el.wfcc. PCR Protocols.vct.com.ac. Tanggal akses 3 Maret 2007 Viers. Russel.ca.be/mariester/principles/pcr. http://elchem. Gelfand.html. 1999.ac. T. Soemanti Ahmad Muhammad Praseno. Houghton Mifflin Company. Pengantar Kloning Gen. B. Halaman 3-12 Lairmore. Tanggal akses 3 Maret 2007 Eavier. St.be /~avierstr/index. Elsevier Inc. Editor Prof. Suinsky. PCR Primer Design and Reaction Optimalization. 2003. Molecular Biology : Made Simple and Fun. 2005.org /shockwave/ pcranwhole. W.med. Tanggal akses 3 Maret 2007 Prescott. D.ugent. http://fermentas. McGraw Hil. 1999. California. P. M. Klein. 1999. R. http://www. 2005.Software tersebut bisa di download dari internet secara gratis misal GENtle.nig. http://www.html.574 Clark. D. 2000.jp. Tanggal akses 3 Maret 2007 Mullis. Harley. 1999.yale. Electrophoresis. Gelfand. http://allsevv. H.nobel. Polymerase Chain Reaction.be/ %7Eavierstr/. Fifth Edition. Yayasan Essentia Medica.P. 2005. Tanggal akses 3 Maret 2007 Henegariu. 2003.html. Principle of the PCR. A.. DNA Analysis by Agarose Gel Electrophoresis. Yogyakarta Clark. http://users. http://www. DNA & PCR. M. A. http://www. New York. http:// www. Tanggal akses 3 Maret 2007 Fermentas. Halaman 565 .. DAFTAR PUSTAKA Bowen.meb. Tanggal akses 3 Maret 2007 Warden.D. 2005. Louis.kaist.ac. 1990. Tanggal akses 3 Maret 2007 Sambrook. P.ac. N. Cold Spring Harbor Laboratory Press. http:// www. DNA Purification and Analysis.html.biotech ubc. dan L. PCR Lab.2a/ed. Academic Press.org. J dan D. Tanggal akses 3 Maret 2007 Fester. W.html. New York Tissue. Brown. J. Molecular Biology : Understanding the Genetic Evolution. Russel. . Protocol for PCR with Taq DNA Polymerase. H. Molecular Cloning : A Laboratory Manual Volume 2. Polymerase Chain Reaction.htm. 1993. M. 1026 halaman. 2001.

sekarang bayangkan bahwa pada setiap siklus DNA polymerase akan menggandakan DNA sebanyak 2 kali. Tanggal akses 3 Maret 2007 Wolf.http://biology.073. Sumber: http://users. Tanggal akses 3 Maret 2007 Tentu Anda sudah mengenal yang namanya DNA.ugent.gif Sumber: http://users. tapi tetap saja hasilnya akan sangat banyak.741.html. DNA ini sering disebut-sebut terutama berkaitan dengan kriminalitas. Maka pantes aja dengan berbekal DNA yang terkandung dalam sampel yang cuma secuil itu bisa diperoleh banyak sekali informasi sesuai kebutuhan kita. Mungkin Anda bingung bagaimana caranya polisi bisa mengungkap pelaku kejahatan dengan berbekal sehelai rambut pelaku yang tercecer di TKP. B. PCR terdiri atas beberapa siklus yang berulang-ulang. dan coba hitung berapa salinan utas ganda DNA yang akan dihasilkan setelah 30 siklus? Yup. ajaib! Ternyata hal ini gak lepas dari yang namanya PCR alias Polymerase Chain Reaction.edu /sciconn /lessons2 /lessons . Padahal kan sampel yang dianalisa jumlahnya sangat sedikit. Secara sederhana PCR merupakan reaksi penggandaan daerah tertentu dari DNA cetakan (template) dengan batuan enzim DNA polymerase. http://www. J. Reaksi PCR meniru reaksi penggandaan atau replikasi DNA yang terjadi dalam makhluk hidup.html. Proses yang berlangsung secara in vitro dalam tabung reaksi sebesar 200 µl ini mampu menggandakan atau mengkopi DNA hingga miliaran kali jumlah semula.ugent.be/~avierstr/principles/pcrcopies.edu/biosci /graduate/amb.824 kali! Tentu saja nilainya tidak tepat seperti itu. penentuan ‘keabsahan’ keturunan.arizona. Beginning Molecular Biology Laboratory Manual : PCR Amplification of DNA. kita masih harus memperhitungkan efisiensi reaksi. 2 pangkat 30 alias 1.gif . biasanya 20 sampai 40 siklus.be/~avierstr/principles/pcrcopies.umbc. Nah. atau dari tetesan sperma pemerkosa yang mengering di tubuh korban. diagnosa penyakit. 2003. dll.

jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA. dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. . PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja. dGTP dan dTTP. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. dNTP (deoxynucleoside triphosphate) dNTP alias building blocks sebagai ‘batu bata’ penyusun DNA yang baru. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja. umumnya Mg++.Komponen PCR Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase. Ion logam monovalen. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template. dCTP. kalsium (K+). Ion Logam • • Ion logam bivalen. yaitu dATP. komponen lain yang dibutuhkan adalah: Primer Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Buffer Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase.

Tahapan Reaksi Sumber: http://users.gif Sumber: http://users. Annealing Setelah DNA menjadi utas tunggal. Ekstensi/elongasi .ugent. suhu diturukan ke kisaran 40-60oC selama 20-40 detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer. yaitu: Denaturasi Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama 30-60 detik. Pada suhu ini DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal.ugent.be/~avierstr/principles/pcrsteps.gif Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap.be/~avierstr/principles/pcrsteps.

Oh ya. Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. annealing dan ekstensi secara manual. begitu pula sebaliknya). diantaranya: Isolasi Gen Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar. Tapi syukurlah sekarang mesin Thermal Cycler sudah terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan. Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya. Final Elongasi Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Aplikasi teknik PCR Kita harus berterima kasih kepada Kary B Mullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan PCR pada tahun 1984. begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T. Lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi. DNA manusia saja panjangnya sekitar 3 miliar basa. secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp. DNA ditranskrip menghasilkan RNA. . Dari sekian panjang DNA genome. Pada awalnya orang menggunakan tiga penangas air (water bath) untuk melakukan denaturasi. Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut: Pra-denaturasi Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu). biasanya 70-72oC.Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler yang dapat menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR. maka akan dipasang dNTP. dan C dengan G. RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. gen itu apaan ya? Sebagaimana kita tahu bahwa fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik. berpindah dari satu suhu ke suhu lainnya menggunakan tangan. jika basa pada template adalah A. bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen. yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein.

mudah.sisanya tidak menyandikan protein atau disebut ‘junk DNA’. yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. lebih cepat. Diagnosa Penyakit . Konon banyak kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua ‘sesungguhnya’ dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda. Forensik Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban). dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda. maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan. atau korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus ‘mengorbankan’ sapi atau babi. DNA Sequencing Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut. dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi atau babi. kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari.littletree. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin juga [http://www. diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama ‘probe’ yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. kemudian menjadikannya obat diabetes. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun. maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E.com. untuk mengisolasi gen. para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator. Berkat teknologi rekayasa genetik. misalnya ibu atau bapak kandung.au/dna. Kembali ke pembahasan isolasi gen. Sebagai contoh. dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan. Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud. kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia. proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia. DNA ‘sampah’ yang fungsinya belum diketahui dengan baik. Dan ajaib! Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia.htm]. Nah.

. karena jika ada sedikit saja kesalahan pada tahap ini maka akan mempengaruhi kemurnian dan hasil akhir produk DNA yang diinginkan. Masih banyak aplikasi PCR lainnya yang sangat bermanfaat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya. 1988 dalam Rohmy. 1997).. B. Tahap denaturasi DNA biasanya dilakukan pada kisaran suhu 92 – 95 oC. Denaturasi yang tidak berlangsung secara sempurna dapat menyebabkan utas DNA terputus. Proses dalam PCR Polymerase Chain Reaction (PCR) terdiri dari tiga proses. annealing (penempelan) pasangan primer pada untai DNA target dan extension (pemanjangan atau polimerisasi). A. Denaturasi Newton and Graham (1997) dalam Rohmy (2001). Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. 1997 dalam Rohmy 2001). Faktor yang mempengaruhi tahap ini antara lain suhu annealing dan primer. Annealing Merupakan proses penempelan primer. sedangkan suhu yang tinggi dapat meningkatkan kespesifikan amplifikasi (Saiki et al. Proses ini dapat dikelompokkan dalam tiga tahap berurutan yaitu denaturasi templat. Suhu annealing yang terlalu rendah dapat mengakibatkan timbulnya pita elektroforesis yang tidak spesifik. Teknik PCR didasarkan pada amplifikasi fragmen DNA spesifik di mana terjadi penggandaan jumlah molekul DNA pada setiap siklusnya secara eksponensial dalam waktu yang relatif singkat. Metode ini dikembangkan untuk mengatasi kelemahan metode diagnosis konvensional seperti imunologi dan mikrobiologi. Tahap denaturasi yang terlalu lama dapat mengakibatkan hilangnya aktivitas enzim polimerase (Lisdiyanti. Prinsip dasar PCR Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan salah satu metode untuk mengidentifikasi penyakit infeksi. Denaturasi awal dilakukan selama 1 – 3 menit diperlukan untuk meyakinkan bahwa DNA telah terdenaturasi menjadi untai tunggal. 2.Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini. PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat. bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Kenaikan suhu setelah tahap annealing hingga mencapai 70–74 oC bertujuan untuk mengaktifkan enzim TaqDNA polimerase. Proses pemanjangan primer (tahap extension) biasanya dilakukan pada suhu 72 oC. 2001). Maka tak salah panitia Nobel menganugrahkan hadiah Nobel bidang kimia yang bergengsi ini kepada Kary B Mullis hanya 9 tahun setelah penemuannya (1993). Tahap annealing primer merupakan tahap terpenting dalam PCR. yaitu suhu optimal untuk TaqDNA polimerase. menyatakan bahwa denaturasi merupakan proses memisahkan DNA menjadi utas tunggal. sehingga diperoleh amplifikasi DNA antara 108 – 109 kali (Retnoningrum. yaitu: 1.

kaki renang (pleopoda). DNA yang telah diklon pada tahap kedua dimasukkan ke dalam lubang-lubang kecil yang terdapat pada lempengan agar agarose . atau cairan hemolim. Dalam tahap extension atau sintesis DNA. 3. yaitu proses elektroforesis. Hal ini bertujuan untuk mencegah terjadinya kerusakan DNA/RNA (Haliman dan Adijaya. Extension Merupakan proses pemanjangan DNA. DNA virus yang telah berlipat ganda jumlahnya dapat dideteksi dengan elektoforesis sel agarosa. 1996 dalam Wahyudi. Proses penggandaan ini dikenal sebagai proses amplifikasi. Setelah diwarnai dengan Ethidium Bromida (ETBr). sehingga setelah 30 siklus akan menjadi milyaran amplifikasi DNA target. Menurut Haliman dan Adijaya (2005). hasil elektroforesis yang berupa band RNA dapat dilihat dengan UV transluminator dan diabadikan dengan kamera polaroid (Sunarto dkk.. 3. Dengan bantuan buffer TAE atau TBE. Uji PCR untuk mendeteksi keberadaan virus dilakukan di laboratorium dengan pengambilan sampel udang Vannamei dari tambak budidaya. secara umum uji PCR di laboratorium dilakukan dengan tahapan-tahapan sebagai berikut: 1. Satu jenis primer bertanggung jawab atas penggandaan satu jenis DNA tertentu sehingga primer satu jenis virus hanya dapat digunakan untuk deteksi virus tersebut saja. 2. 1988 dalam Rohmy. RNA ekstraction solution (IQ2000TM) juga berfungsi mengamankan RNA dari kerusakan akibat kerja enzim rNase. Hasil uji PCR selanjutnya digunakan pada tahap ketiga. Proses tersebut dilakukan pada kondisi suhu dan siklus penggandaan tertentu. PCR) karena merupakan siklus penggandaan yang berulang sehingga kegiatan ini seolah-olah merupakan suatu proses reaksi berantai. Sampel udang Vannamei yang diambil tersebut selanjutnya dilakukan pemotongan bagian insang. 2005). Proses ini disebut dengan reaksi rantai polimerase (polymerase chain reaction. 2001). Hasil ekstraksi DNA di-sentrifus hingga diperoleh butiran atau pelet DNA.Selain itu. Hasil sintesa DNA dalam satu siklus dapat berperan sebagai cetakan (template) pada siklus berikutnya sehingga jumlah DNA target menjadi berlipat dua pada setiap akhir siklus. Dengan kata lain DNA target meningkat secara eksponensial. sampel dapat disimpan dalam larutan alkohol 95% dengan perbandingan 1 : 9 (1 bagian sampel dengan 9 bagian alkohol 95%). pada masa peralihan suhu dari suhu annealing ke suhu extension sampai 70 oC juga menyebabkan terputusnya ikatan-ikatan tidak spesifik antara DNA cetakan dengan primer karena ikatan ini bersifat lemah. Reaksi ini akan berubah dari satu siklus ke siklus selanjutnya mengikuti perubahan konsentrasi DNA (Hsu et al. Selain suhu. 2001). Sampel yang akan diuji PCR sebaiknya dalam kondisi segar.. 2004). tetapi bila tidak memungkinkan. Hasil ekstraksi DNA pada tahap pertama digandakan dengan bantuan enzim-enzim yang dikenal sebagai primer. Lysis buffer (IQ2000TM) juga berfungsi untuk mengamankan hasil ekstraksi dari kerusakan akibat kerja enzim dNase. yang dapat diatur pada mesin PCR (thermocycle). Sementara untuk mengekstraksi RNA digunakan RNA ekstraction solution (IQ2000TM). semakin lama waktu extension maka jumlah DNA yang tidak spesifik semakin banyak (Saiki et al. DNA dari sel-sel sampel diekstraksi dengan larutan lysis buffer (IQ2000TM). enzim polimerase bergabung bersama dengan nukleotida dan pemanjangan primer lengkap untuk sintesis sebuah DNA utas ganda. Selanjutnya.

www. Udang Vannamei. R. Keberhasilan Penggunaan Primer Spesifik DNA Mitokondria (mtDNA) Ikan Patin (Pangasius hypophthalmus) pada Beberapa Ikan Budidaya dengan Metode PCR (Polymerase Chain Reaction). tergantung pada berat molekulnya. Pengaruh Suhu Annealing dan Jumlah Siklus yang Berbeda pada Program PCR Terhadap Keberhasilan Isolasi dan Amplifikasi mtDNA Ikan Patin (Pangasius hypophthalmus). Program Studi Budidaya Perairan. Taukhid.S. Institut Pertanian Bogor. Institut Pertanian Bogor . 2005).W.2%. Isti Koesharyani. T. Disketkanling. serta kondisi larutan buffer dan larutan etidium bromida yang dipakai. 2001. seperti faktor kontaminasi silang. Keberhasilan pengujian sampel dengan metode PCR dipengaruhi oleh beberapa hal. jumlah enzim yang dipakai. Program Studi Budidaya Perairan. D. ketelitian saat poses ekstraksi. Agus. Bandung. Penerapan Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Diagnosis Penyakit Infeksi. Skripsi. Dari hasil proses elektroforesis ini dapat disimpulkan status sampel. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. dan Adiwijaya. Akhmad Rukyani. D. Jurusan Farmasi FMIPA ITB. 1997. Penebar Swadaya. 2005. Daftar Pustaka Haliman. S.go. Hasil proses elektroforesis akan menampilkan pita-pita DNA yang letaknya tersebar. Jakarta Retnoningrum. Pita-pita DNA kemudian dibandingkan dengan posisi pita-pita pada lajur penanda DNA (DNA marker). Agar kontaminasi silang dapat dihindarkan. Pembudidayaan dan Prospek Pasar Udang Putih yang Tahan Penyakit. terinfeksi virus atau bebas dari virus. sebaiknya operator pengujian PCR harus benar-benar terlatih dan teliti (Haliman dan Adijaya. 2001.id Wahyudi. Rohmy. Prosedur PCR untuk diagnosa Cepat Penyakit Bercak Putih pada Udang. 2004. H. Skripsi. umur reagen atau enzim yang dipakai. Sunarto. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan.