P. 1
1 Latar Belakang

1 Latar Belakang

|Views: 540|Likes:
Published by Moch Ahmad Yanuar

More info:

Published by: Moch Ahmad Yanuar on Nov 26, 2010
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOC, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

05/20/2013

pdf

text

original

.1 Latar Belakang Penemuan yang berpengaruh terhadap perkembangan ilmu biologi molekuler salahsatunya adalah PCR (Polymerase Chain

Reaction). Teknik ini mempunyai fungsi utama untuk memperbanyak DNA target. Proses yang terjadi melibatkan suatu primer yang berfungsi sebagai cetakan untuk membuat DNA baru (David, 2005). Aplikasi PCR yang paling besar adalah melakukan pengkopian DNA dalam waktu yang relatif cepat, sehingga kemudian DNA tersebut cukup banyak untuk dapat dideteksi, dikaji, dan dipergunakan untuk berbagai aplikasi (Lairmore, 1990). Teknik PCR memerlukan keterampilan khusus dalam pelaksanaannya, tidak hanya bergantung pada alat PCR tetapi diperlukan hal-hal teknis yang perlu diperhatikan demi kelancaran PCR. Salah satu keahlian teknis yang diperlukan adalah mendesain primer yang dipergunakan sebagai cetakan dalam PCR. Selain hal tersebut diatas, PCR dapat dipergunakan untuk sekuensing, melakukan deteksi gen patologis, serta pembuatan probe. Berdasarkan haltersebut di atas, maka praktikum ini penting untuk dilaksanakan. 1.2 Rumusan Permasalahan Permasalahan yang dapat ditelaah adalah bagaimana teknik cara melakukan teknik PCR dan mendesain primer yang berfungsi sebagai langkah awal sebelum melakukan PCR ? 1.3 Tujuan Praktikum bertujuan untuk mengetahui pelaksanaan teknik PCR dan cara mendesain primer 1.4 Manfaat Salah satu kemampuan PCR adalah dapat mengamplifikasi gen-gen yang diduga terkait dengan penyakit tertentu sehingga akan mempermudah diagnosis penyakit tersebut, sehingga teknik ini dapat digunakan dalam bidang medis.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 PCR (Polymerase Chain Reaction) Polymerase Chain Reaction adalah metode untuk amplifikasi primer oligonukleotida yang dikendalikan secara enzimatis untuk sekuen DNA yang diinginkan. Teknik tersebut mampu mengamplifikasi sekuen hingga berlipat pada tingkatan 105 - 106 dari sejumlah kecil (nanogram) DNA templat, dengan latar sekuen yang tidak relevan (dari DNA genom total. Prasyarat untuk mengamplifikasi sekuen dengan mempergunakan PCR adalah mengetahui sekuen tertentu yang mengapit sekuen DNA yang diamplifikasi sehingga oligonukleotida spesifik dapat diperoleh. Produk PCR diamplifikasi dari templat DNA dengan menggunakan DNA polymerase yang stabil terhadap panas, dan diperoleh dari Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) serta mempergunakan cycler termal otomatis. Tiga tahapan utama PCR (terdiri dari denaturasi, annealing primer, dan polimerisasi) diulang hinggga berlangsung 30 - 40 siklus. Hal ini dilakukan dengan cycler otomatis, yang dapat memanaskan tabung yang berisi campuran reaksi dan mendinginkannya dalam waktu yang sangat singkat (Eavier, 1999). Denaturasi DNA double strand menjadi single strand terjadi pada tahap denaturasi. Hal

maka akan memerlukan waktu yang semakin lama. Temperatur selanjutnya diturunkan agar primer dapat membentuk ikatan hidrogen pada kedua sisi DNA target (annealing). muatan negatif akan menarik muatan positif . sedangkan pada akhir siklus maka sekuens target pada kedua strand akan dapat dikopi (Prescott dkk. 2005).. Ujung 3' primer bukan merupakan komplementer (pasangan basa). 6. sehingga saling dapat membentuk ikatan atau menyatu. Komposisi basa adalah 50-60% (G+C) 3. nukleotida yang dibutuhkan untuk membuat DNA baru. komponen-komponen untuk melakukan PCR terdiri dari: sejumlah kecil molekul DNA. primer PCR. Primer PCR biasanya berukuran panjang 20-30 bp. Primer PCR tidak boleh memiliki ujung (3') berupa G atau C. dan tanpa untaian satu basa yang terlalu panjang. Jarak amplifikasi atau sekuens target yang diamplifikasi mempunyai ukuran sekitar 200-400 bp (David. Dengan kelengkapan prasyarat di atas diharapakan proses PCR berjalan dengan semestinya. Tahapan berikutnya adalah denaturasi pada temperatur 95?C selama 30 detik hingga 1 menit. 7. enzim yang diperlukan untuk mengatur salinan DNA. atau CG atau GC.2 Desain Primer Desain primer merupakan salah satu prasyarat sebelum melakukan proses pengkopian gen dengan PCR. karena akan mengakibatkan terjadinya dimer primer. Tm (suhu melting) berkisar antara 55-80oC 5. termasuk segmen DNA yang akan diamplifikasi. AT yang seimbang (45-55% GC). Prinsip dasar elektroforesis adalah memisahkan molekul berdasarkan muatan listrik intrinsiknya. dan mesin PCR yang dibutuhkan untuk mengatur temperatur. Waktu yang diperluakan ini tergantung pada ukuran templat. Tiga atau lebih sekuen C atau G pada ujung 3' primer dapat memicu terjadinya kesalahan priming pada sekuen yang kaya akan G dan C (karena stabilitas annealing). 2005).fragmen molekuler (DNA. 4. primer yang dibutuhkan ini berjumlah dua buah berupa potongan pendek DNA single strand yang sesuai dengan sekuens yang akan diamplifikasi. Ujung 5' pada primer menentukan ujung produk PCR yang dihasilkan. Muatan listrik positif akan menarik muatan negatif dan menolak sesama muatan positif.5 ?C (David. Syarat sebuah primer dalam PCR adalah : 1. Dua primer dari pasangan primer tidak mengandung struktur komplemen lebih dari 2 kb.ini terjadi sebagai akibat akibat perlakuan temperatur tinggi yang akan memisahkan strand komplemennya. Tahapan annealing mempergunakan temperatur yang ditentukan oleh rumus Tm . Menurut Innis dan Gelfand (1990). 2003). Hal ini menghindari terjadinya "breathing" pada ujung dan meningkatkan efisiensi priming.3 Elektroforesis Gel Agarose Teknik pemisahan fragmen . 2. 2. Primer yang ideal memiliki kandungan GC vs. Primer Reverse dan primer forward harus dihindari saling berkomplemen. DNA polymerase kemudian akan membuat salinan DNA target menggunakan dNTP. Ukuran primer berkisar antara 17-28 basa 2. semakin besar. sehingga harus dihindari. Menurut Clark dan Russel (2005). Sebaliknya. Tahap pertama dari PCR adalah awal yang panas dengan temperatur 95 ?C selama 2-4 menit. RNA ataupun protein) adalah Elektoforesis gel.

muatan yang berbeda muatan akan saling tarik (Clark. mikropipet. Agarosa merupakan polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut. Tanaman : KMB. maka agarosa akan meleleh menjadi larutan homogen. yang berguna untuk memperkirakan ukuran fragmen yang berbeda-beda pada DNA sampel yang dielektroforesis (Clark.30-19. 3. P 5. 2805. Peralatan serta kondisi yang diperlukan untuk proses elektrforesis adalah tegangan tinggi. Etidium Bromida (EtBr). Taq Polimerase.1. elektroda. Marker pada elektroforesis gel adalah serangkaian fragmen DNA standar dilalukan secara beriringan pada gel yang sama. gel agarosa.2H2O dan aquades steril).dan menolak sesama muatan negatif. Elektroforesis DNA biasanya dipergunakan untuk memisahkan DNA dalam beragam ukuran.2. dan penyokong lainnya dipergunakan untuk sampel biologis seperti campuran protein atau fragmen DNA.00 WIB di Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler. Gel yang mengeras nampak seperti konsentrat campuran gelatin tanpa pewarna. Menurut hukum listrik. Untuk sampel DNA tanaman. Bila agarosa dan air dicampur dan direbus. masing-masing bermuatan postif dan negatif dihubungkan dengan sumber tegangan tinggi. 3. maka gel akan membentuk jaring-jaring berlubang. Bila larutan tersebut suhunya mulai turun suhunya. Tabung kapiler terbuka dipergunakan untuk berbagai jenis sampel. BR 1. buffer Taq. sebanyak 13. Dua elektrode.2 ?L.2 ?l ddH2O (free water nuclease) ditambah dengan dNTP. 3. buffer PCR.2. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. primer HLA dan primer aux1 (10 pmol) 0.1 Waktu Dan Tempat Praktikum PCR dan desain primer dilaksanakan pada hari Selasa.1 Program PCR Perlakuan awal berupa pencampuran bahan-bahan untuk PCR berbeda untuk sampel DNA plasmid dan tail cut dengan sampel DNA tanaman. buffer.2. TC 2. primer HLA. strip asetat selulosa.5 ?l (50 ng/ ?l). 27.72 g Na2EDTA. sentrifuse. blue tip.2 Bahan Bahan yang digunakan adalah PCR mix solution yang terdiri atas 16.6 ?l ddH2O (free water nuclease) ditambah dengan master mix yang tersusun atas dNTP. sampel DNA (Tail cut : TC 1. dengan bagian pori terisi oleh air. atau tabung kapiler.2 ?l. TB 1) sebanyak 0.1 Alat Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah PCR unit. tanggal 23 Oktober 2007. 2005). dan kamera polaroid. 2005). seperangkat alat elektoforesis.3 Cara Kerja 3. Plasmid : PA 2. pukul 09. Taq DNA polymerase 0.2 Alat dan Bahan 3. serta sekuen DNA untuk desain primer. MgCl2. PA 3. dan penyokong buffer seperti kertas saring. dNTP mix 0. sebanyak 8. Untuk sampel DNA plasmid dan tail cut.5 g H3BO3 dan 3.4 ?l akuades steril 1 x buffer Taq 4 ?l. Universitas Brawijaya Malang. Taq . Jurusan Biologi. buffer TE.2 ?l. TC 2.2.3. primer aux1. BAB III METODE PENELITIAN 3. tabung. Tris Borac EDTA (TBE) (yang terdiri atas 54 g Tris-base. T 2. Loading dye.1. dan terakhir ditambahkan sampel DNA. Ukuran pori agarose bergantung pada konsentrasi dari bubuk agarose yang digunakan. microwave.

dan sampel DNA. campuran dimasukkan ke dalam sumuran gel dengan hati-hati hingga semua sampel mengisi setiap sumuran yang tersedia. annealing pada temperatur 560C selama 30 detik. 3. ekstensi akhir pada temperatur 720C selama 10 menit dan post-ekstensi pada temperatur 370C selama 1 menit. EtBr dalam jumlah sedikit ditambahkan secara merata ke dalam larutan tersebut setelah larutan tersebut cukup dingin. dan jajaran G/C maksimal sebanyak dua buah. Hal ini dilakukan dengan aturan yang sama seperti penentuan primer forward. dan post-ekstensi pada temperatur 720C selama 7 menit. Gel kemudian dIletakkan pada UV transiluminator untuk mengetahui hasil elektroforesis BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.50C Bila primer forward telah ditentukan. Program PCR yang dipergunakan sebanyak dua program yang berbeda.2 Desain Primer Primer forward dipilih secara acak pada sekuen urutan basa nukleotida dengan ketentuan bahwa panjang basa berkisar antara 18 -23 pasangan basa. Gel agarosa dilarutkan dengan 30 ml larutan TBE dan dihomogenisasi dengan stirer. Setelah itu. ekstensi pada temperatur 720C selama 45 detik.1 Analisis Prosedur 4. Running dilakukan bila larutan gel agarosa dalam cetakan memadat.24 gram. Running dilakukan pada tegangan 50 mV selama satu jam. 3. denaturasi pada temperatur 920C selama 30 detik. tetapi selisih Ta antara primer forward dan reverse tidak boleh lebih dari 10C. denaturasi pada temperatur 930C selama 1 menit. sedangkan program yang kedua dipergunakan untuk sampel DNA tanaman. ekstensi pada temperatur 720C selama 1 menit. Sekuen primer yang dipergunakan tidak boleh region DNA repetitive. serta mempergunakan siklus sebanyak 35 siklus. . annealing pada temperatur 580C selama 30 detik. Larutan yang telah homogen kemudian dimasukkan ke dalam microwave pada suhu medium (4800C) selama ± 4 menit. Program yang kedua meliputi hot start pada temperatur 930C selama 1 menit.8% sehingga gel agarose yang ditimbang seberat 0. Konsentrasi gel yang diinginkan sebesar 0.1 Program PCR DNA yang dipergunakan berasal dari hasil isolasi DNA dari praktikum sebelumnya. maka selanjutnya ditentukan primer reverse.3 Elektroforesis Gel Agarosa Larutan TBE diencerkan dari 5 kali menjadi 1 kali. serta mempergunakan siklus sebanyak 30 siklus. temperatur annealing (Ta) ditentukan dengan rumus : Ta = Tm .polimerase. Presentase (G+C) berkisar antara 45 . Sebanyak 3 l sampel DNA dicampur dengan 2 l loading dye sehingga perbandingan antara keduanya adalah 3 : 2. Program yang pertama dipergunakan untuk sampel DNA dari tail cut mencit dan plasmid bakteri. Ujung sekuen 3' bukan T atau A. melainkan G atau C. Program yang pertama meliputi hot start pada temperatur 920C selama 1 menit. Larutan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam cetakan yang sudah dipasang sisiran besar (12 sumuran).3.3. temperatur melting (Tm) ditentukan melalui rumus : Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T) Selanjutnya.60%.1. Gel agarose ditimbang sesuai dengan konsentrasi gel yang diinginkan serta jumlah sumuran yang digunakan.

Coli). Primer forward merupakan penyalin DNA templat bagian forward. Konsentrasi standar Mg2+ adalah 2 mM. buffer Taq juga dipergunakan untuk menstabilkan DNA dan komponen lain dalam reaksi (Van Fleteren. Primer terdiri dari forward dan reverse. 1999). Primer merupakan oligonukleotida pendek yang mengawali reaksi polimerisasi dan berfungsi untuk menentukan awal serta akhir bagian yang akan diamplifikasi (Van Fleteren. Menurut Van Fleteren (1999). 1999). Gel agarose ditimbang agar sesuai dengan konsentrasi gel yang diinginkan serta jumlah sumuran yang digunakan.8% sehingga gel agarose yang ditimbang seberat 0. tetapi terkadang konsentrasinya dinaikkan untuk menghasilkan produk PCR yang lebih baik. dan dNTP juga akan mengikat pada Mg2+ sehingga konsentrasinya harus lebih tinggi daripada konsentrasi total dNTP. yakni ekstensi akhir pada DNA tanaman dan post-ekstensi pada DNA tail cut serta plasmid. dan setiap gen yang dianalisis(Van Fleteren. Pengadukan . dan DNA tanaman (kacang koro dan buncis) untuk membandingkan hasil amplifikasi PCR pada ketiga sampel. Masing-masing komponen yang terdapat pada master mix memiliki fungsi yang berbeda.yakni DNA plasmid (E. Penambahan ddH2O (free water nuclease) dipergunakan sebagai pelarut DNA dan sebagai media terjadinya reaksi yang tidak mengandung ion ataupun DNA/RNA. sel. DNA tail cut tikus. 2005). sedangkan untuk tumbuhan adalah aux1.2 Elektroforesis Gel Agarosa Langkah pertama adalah larutan TBE diencerkan dari 5 kali menjadi 1 kali untuk memperoleh konsentrasi TBE yang sesuai. Perlakuan awal yang dipergunakan untuk sampel DNA plasmid dan tail cut berbeda dengan perlakuan untuk DNA tanaman. Perbedaan ini terletak pada penggunaan master mix yang berbeda. Konsentrasi gel yang diinginkan sebesar 0. Selain itu. template. Pencampuran yang tidak merata akan mengakibatkan terjadinya kegagalan pada reaksi. sedangkan primer reverse merupakan penyalin DNA templat bagian reverse. Hal ini dilakukan agar dapat meminimalisasi terjadinya kesalahan pengenalan primer pada DNA non target. 4. 2005). 1999). Thawing dilakukan pada tiap komponen yang ingin dimasukkan (yang telah disimpan pada temperatur rendah). Sampel DNA dipergunakan sebagai DNA templat yang akan diamplifikasi. Primer. Hot start berfungsi untuk untuk lebih memaksimalkan pembukaan untai ganda DNA. ion Mg2+ berasal dari MgCl2 (Fester. buffer Taq juga dipergunakan untuk menstabilkan DNA dan komponen lain dalam reaksi. Buffer Taq berfungsi untuk menjaga kondisi fisiologis enzim Taq Polimerase. Hal ini dilakukan untuk memastikan bahwa komponen tersebut telah siap dipergunakan (The American Heritage. temperatur yang dipergunakan untuk masing-masing tahapan bervariasi tergantung pada jenis organisme. Primer yang dipergunakan untuk sampel DNA tail cut dan plasmid adalah HLA. Hal ini penting untuk mendukung terjadinya reaksi PCR terkait dengan sensitivitas PCR (Fester.1. Buffer Taq berfungsi untuk menjaga kondisi fisiologis enzim Taq Polimerase.24 gram dan TBE yang dipergunakan untuk melarutkan gel agarosa sebanyak 30 ml. 2000). 2005). Masing-masing komponen yang terdapat pada master mix memiliki fungsi yang berbeda. Optimalisasi pemanjangan primer dilakukan melalui melalui tahapan setelah ekstensi. Hal ini penting untuk mendukung terjadinya reaksi PCR terkait dengan sensitivitas PCR (Fester. Selain itu. Setiap perlakuan pemindahan larutan atau reagen dillakukan pipetting dan mix gentle-finger agar setiap komponen homogen. Larutan ddH2O (free water nuclease) dipergunakan sebagai pelarut DNA dan sebagai media terjadinya reaksi yang tidak mengandung ion ataupun DNA/RNA.

Akan tetapi. Salah satu cara meminimalisasi ancaman karsinogenik dari EtBr adalah dengan menambahkannya ketika suhu gel telah sedikit menurun (tidak beruap). Penambahan EtBr di awal pada larutan agarosa memiliki keuntungan yakni tidak diperlukannya periode perendaman setelah elektroforesis. Larutan tersebut mengoptimalkan pH dan konsentrasi ion dalam gel serta melapisi gel agar dapat mengalirkan arus listrik yang menggerakkan DNA melalui gel. Tris merupakan bahan kimia yang membantu mempertahankan konsistensi pH larutan. Setelah itu. Konsentrasi agarose yang digunakan sebesar 0. Informasi ini dapat dipergunakan untuk optimalisasi kondisi eksperimen bila ukuran fragmen DNA diketahui (Viers. Semakin banyak agarose akan membentuk gel yang makin padat dan menghasilkan matriks yang lebih sulit dilalui DNA. Hal ini karena DNA yang terdapat dalam sampel tersebut telah mengalami pengenceran sehingga memiliki konsentrasi rendah.0%. Menurut Viers (1999). Hal ini dikarenakan agarosa tidak dapat terlarut dalam buffer pada suhu ruang sehingga harus dididihkan. EtBr dapat ditambahkan pada larutan tempat terendamnya gel setelah elektroforesis atau dapat ditambahkan pada larutan agarosa di awal pembuatannya.8 . EtBr dalam jumlah sedikit ditambahkan secara merata ke dalam larutan tersebut setelah larutan tersebut cukup dingin. EDTA merupakan agen pengkelat kation divalen seperti magnesium. loading dye juga dapat meningkatkan densitas DNA sehingga dapat mengendapkan DNA pada sumuran (Warder. Selain itu. Perbandingan antara loading dye dan DNA yang dipergunakan adalah 2 : 3. loading dye merupakan suatu zat pewarna pelacak yang dapat ikut bermigrasi di sepanjang gel. yakni antara 500 bp hingga 20 kb. Pemerataan DNA pada loading dye diharapkan menghasilkan pendaran DNA di bawah sinar UV dapat . sisiran dapat diambil dengan hati-hati agar sumuran tidak rusak dan selanjutnya running elektroforesis dapat dilakukan. Konsentrasi tersebut akan memisahkan fragmen pada kisaran yang lebar. Pemisahan mampu mendiferensiasikan antara dua atau lebih fragmen pada ukuran yang bebeda-beda. Menurut Bowen (2000). Larutan yang telah homogen kemudian dimasukkan ke dalam microwave pada suhu medium (4800C) selama ± 4 menit. Hal ini dilakukan untuk memperoleh hasil yang optimal karena running diawali dengan memasukkan sampel DNA pada sumuran. Asam borak menyediakan konsentrasi ion yang sesuai untuk buffer . 1999). Sampel DNA yang dipergunakan lebih banyak agar molekul DNA memiliki persebaran yang lebih merata di antara loading dye.1.dengan stirer dilakukan dengan tujuan untuk menghomogenisasi gel agarosa dengan solvennya. kerugiannya adalah EtBr bersifat karsinogen sehingga selama penggunaanya harus berhati-hati (Viers. Larutan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam cetakan yang sudah dipasang sisiran besar (12 sumuran) dan dibiarkan dingin hingga memadat. yakni larutan TBE. Running dilakukan bila larutan gel agarosa dalam cetakan memadat. yakni dengan memasukkannya ke dalam microwave. Pemberian EtBr ketika gel masih beruap akan menyebabkan EtBr juga ikut menguap. Zat ini memiliki muatan negatif seperti DNA dan berfungsi sebagai penunjuk seberapa jauh proses elektroforesis berlangsung. 2002). Larutan TBE merupakan larutan buffer yang memungkinkan DNA bergerak lancar melalui gel. 1999). Sebanyak 3 l sampel DNA dicampur dengan 2 l loading dye sehingga jumlah total larutan adalah 5 l. Hal ini penting karena sebagian besar nuklease yang mendegradasi DNA memerlukan kation divalen untuk aktivasinya. Perlu diperhatikan bahwa uap EtBr bersifat karsinogen sehingga harus berhati-hati.

temperatur annealing (Ta) ditentukan dengan rumus : Ta = Tm .50C Selanjutnya dicari primer reverse nya dengan ketentuan seperti di atas.2. Terdapat pebedaan yang nyata antara hasil PCR dan RFLP pada praktikum kali ini. hasil elektroforesis tidak menampilkan band-band DNA pada gel seperti yang diharapkan tujuan praktikum kali ini. Setelah itu.lebih representatif terhadap jumlah DNA. Hal ini karena DNA bermuatan negatif sehingga harus dipergunakan kutub yang berlawanan untuk dapat menggerakkan DNA. ini disebabkan oleh hal-hal . Dimungkinkan hasil PCR yang tidak bagus sehingga mempengaruhi hasil pada saat elelktroforesis 2.2 Desain Primer Langkah pertama dari desain primer adalah memilih primer forwar. 4. pcr mix yang digunakan. Primer forward dipilih secara acak pada sekuen urutan basa nukleotida dengan ketentuan bahwa panjang basa berkisar antara 18 -23 pasangan basa. Hal yang perlu diperhatikan adalah Ta antara primer forward dan reverse tidak boleh lebih dari 10C. Visualisasi menggunakan UV transluminator. Tegangan listrik yang dipergunakan adalah 50 mV selama satu jam.1 Analisis Hasil Elektroforesis.60%. Presentase (G+C) berkisar antara 45 . 2002). dan di potret menggunakan kamera polaroid. Tegangan yang dipergunakan cukup kecil karena DNA sangat rentan terhadap tekanan fisik.2 Analisis Hasil 4. Ujung sekuen 3' bukan T atau A. temperatur melting (Tm) ditentukan melalui rumus : Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T) Selanjutnya. PCR dan RFLP Pada praktikum ini. misal kecocokan primer. Dimungkinkan pada saat elektroforesis voltase yang digunakan tidak sesuai dengan komponen Elektroforesis pada saat itu 3. Peletakan sampel pada gel yang kurang berhati-hati sehingga dapat merobek gel Sehingga untuk menghindari kegagalan pada saat elektroforesis diperlukan suatu langkah preventif misalnya:memperhatikan semua syarat untuk terjadinya PCR. dan jajaran G/C maksimal sebanyak dua buah. Running dilakukan dengan mengalirkan arus listrik yang dipergunakan sebagai faktor pendorong gerakan molekul DNA dengan elektroda positif terletak berhadapan dengan sumuran.3. serta menghindari pipetting pada saat pencampuran larutan pCR pada thin wall. 3. melainkan G atau C. Selain itu. tegangan yang lebih rendah menghasilkan resolusi yang lebih baik di antara fragmen-fragmen yang berukuran hampir sama (Warder. pada PCR hampir tidak terdapat band pada hasil elektroforesis. hal ini disebabkan oleh beberapa hal berikut ini: 1. Sekuen primer yang dipergunakan tidak boleh region DNA repetitive. dengan kata lain primer R dan primer F akan berjalan bersamaan pada temperatur yang sama juga.

PCR sangat sensitif terhadap semua perlakuan yang tidak sesuai dengan protokol pada saat pencampuran larutan thin wall 4. berdampingan dengan marker yang digunakan.2 Keuntungan dan Kerugian Teknik PCR dan RFLP Kerugian teknik PCR 1. Biasanya dipergunakan secara luas dalam analisis bidang molekuler botani. User harus mengetahui sisi sequens pemotongan oleh enzim RE 3. ini membuktikan bahwa enzim restriksi Hae III dan Hind III dapat bekerja pada sampel. . dan tidak rusak Keuntungan RFLP 1. secara bersinergi.2 Saran Sebaiknya pada praktikum kali ini. 5. . Selalu memerlukan suatu primer untuk menjalankan PCR 2. menentukan sisi pemotongan RE. asisten menyediakan software-software untuk melakukan sekuensing. sedangkan pada hasil RFLP masih terdapat satu band DNA yang begitu mencolok pada sampel. Hasil Elektroforesis dari PCR menunjukkan bahwa hampir tidak terdapat band DNA yang muncul pada film polaroid hasil UV transluminator. komposisi larutan pada thin wall yang tidak seimbang. serta kurang bercampurnya larutan pada thin wall PCR. oligonuklueotide dapat dipesan langsung pada perusahaan penyedia primer PCR. Kerugian teknik RFLP 1.2. Memerlukan analisis RE untuk menentukan gen traget yang akan di potong 2. hal ini disebabkan karena: pipetting yang dilaksanakan pada pencampuran larutan pcr mix pada thin wall. RE harus dalam keadaan yang masih baik. Dapat melakukan analisis gen Polimorfisme pada sutu spesies dan lebih akurat daripada PCR 2. Diperlukan PCR mix 3.yang tersebut diatas. Porgram PCR relatif lebih mudah dilaksanakan 2. Akan lebih memerlukan waktu relatif lama untuk mengamplifikasi minimal 30-40 siklus Keuntungan teknik PCR 1.1 Kesimpulan Secara umum PCR berfungsi untuk melakukan kopi pada DNA target berdasarkan primer yang digunakan. Akan tetapi dari hasil elektroforesis tidak semua bisa tampil ini memuktikan juga bahwa fragmen hasil RFLP terlalu kecil atau terjadi difusi pada cairan elelktroforesis. BAB V PENUTUP 5. serta untuk mendesain primer. Terdapat PCR mix solution pabrikan yang tidak memerlukan pencampuran oleh user 3.

edu/genetics/ward/taxi/pog. Suinsky. J.med.meb.html.jp. David Ng. Editor Prof. 1026 halaman. http://www.com. New York Tissue. 1999. Tanggal akses 3 Maret 2007 Mullis. 1999.ac.ac. San Diego Innis. dan D. Tanggal akses 3 Maret 2007 Warden. Tanggal akses 3 Maret 2007 Eavier.be/mariester/principles/pcr. 1990. 2003.htm. Cache River Press. Russel. PCR Lab. DNA Purification and Analysis. 2005. A. D. Rybicky.be/ %7Eavierstr/. D.be /~avierstr/index. http://users. Isolation of DNA from Agarosa and Polyacrylamide Gels. PCR Primer Design and Reaction Optimalization.html. Elsevier Inc. http://allsevv. 2004. A. Polymerase Chain Reaction.P. B. Fifth Edition.ugent. Molecular Cloning : A Laboratory Manual Volume 2. O. M. E.dnalc. St. Molecular Biology : Understanding the Genetic Evolution. 2001. 2000. Cold Spring Harbor Laboratory Press.html. 2005. H.html.biotech ubc. New York. Houghton Mifflin Company. M. Brown. http://elchem. http://users.kr/ vt/ chem -ed/sep/electrop/disc-el.ca.. Academic Press.D. 2005. Principle of the PCR. D. http://fermentas.yale.kaist. http://info.htm. Third Edition. J.com /onionDNA.wfcc. New York The American Heritage. Microbiology. . Principle of the PCR. PCR Protocols. http:// www. Halaman 565 . Tanggal akses 3 Maret 2007 Sambrook.htm. Academic Press. N. science-projects. Tanggal akses 3 Maret 2007 Viers. 2002. 1999. Tanggal akses 3 Maret 2007 Henegariu. Halaman 3-12 Lairmore. P. http:// www. McGraw Hil. Electrophoresis. Protocol for PCR with Taq DNA Polymerase. Tanggal akses 3 Maret 2007 Prescott. J dan D.nobel. 2000.html. Polymerase Chain Reaction. P. http://www.. Yogyakarta Clark. Molecular Technique Lecture Note 2005.se/chemistry/laureates/1993/mullis-lecture. Tanggal akses 3 Maret 2007 Fester. D. 2001. PCR: an outstanding method. W. Harley.574 Clark. Molecular Biology : Made Simple and Fun.nig. Tanggal akses 3 Maret 2007 Innis. Yayasan Essentia Medica.ac. W. 1999. Louis. Tanggal akses 3 Maret 2007 Fermentas. 2005. DAFTAR PUSTAKA Bowen. New York. R.org /shockwave/ pcranwhole. Soemanti Ahmad Muhammad Praseno. Tanggal akses 3 Maret 2007 Van Fleteren. T. 2003. PCR Aplications : Protocols for Functional Genomics. 1993. 1999. M.Software tersebut bisa di download dari internet secara gratis misal GENtle.2a/ed. DNA & PCR.org.vct.. W. Pengantar Kloning Gen. DNA Analysis by Agarose Gel Electrophoresis. L. A. H. dan L. http://www. J.A. California. Gelfand. 2005. dan J. H. 1990. http://www. Russel.ac. Gelfand.ugent. Klein.

arizona.html.edu/biosci /graduate/amb.824 kali! Tentu saja nilainya tidak tepat seperti itu. J.gif Sumber: http://users. diagnosa penyakit. PCR terdiri atas beberapa siklus yang berulang-ulang. Maka pantes aja dengan berbekal DNA yang terkandung dalam sampel yang cuma secuil itu bisa diperoleh banyak sekali informasi sesuai kebutuhan kita.edu /sciconn /lessons2 /lessons . penentuan ‘keabsahan’ keturunan.gif . ajaib! Ternyata hal ini gak lepas dari yang namanya PCR alias Polymerase Chain Reaction. Beginning Molecular Biology Laboratory Manual : PCR Amplification of DNA.html. DNA ini sering disebut-sebut terutama berkaitan dengan kriminalitas. 2 pangkat 30 alias 1.be/~avierstr/principles/pcrcopies. 2003.be/~avierstr/principles/pcrcopies.741.http://biology.ugent. tapi tetap saja hasilnya akan sangat banyak.ugent. B. Padahal kan sampel yang dianalisa jumlahnya sangat sedikit. Tanggal akses 3 Maret 2007 Wolf. atau dari tetesan sperma pemerkosa yang mengering di tubuh korban. biasanya 20 sampai 40 siklus. Nah.073. sekarang bayangkan bahwa pada setiap siklus DNA polymerase akan menggandakan DNA sebanyak 2 kali. http://www.umbc. dll. Mungkin Anda bingung bagaimana caranya polisi bisa mengungkap pelaku kejahatan dengan berbekal sehelai rambut pelaku yang tercecer di TKP. Tanggal akses 3 Maret 2007 Tentu Anda sudah mengenal yang namanya DNA. kita masih harus memperhitungkan efisiensi reaksi. dan coba hitung berapa salinan utas ganda DNA yang akan dihasilkan setelah 30 siklus? Yup. Reaksi PCR meniru reaksi penggandaan atau replikasi DNA yang terjadi dalam makhluk hidup. Proses yang berlangsung secara in vitro dalam tabung reaksi sebesar 200 µl ini mampu menggandakan atau mengkopi DNA hingga miliaran kali jumlah semula. Secara sederhana PCR merupakan reaksi penggandaan daerah tertentu dari DNA cetakan (template) dengan batuan enzim DNA polymerase. Sumber: http://users.

. dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA. umumnya Mg++. Buffer Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase. dGTP dan dTTP. kalsium (K+). coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. yaitu dATP. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja. dNTP (deoxynucleoside triphosphate) dNTP alias building blocks sebagai ‘batu bata’ penyusun DNA yang baru. jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan. fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja. Ion Logam • • Ion logam bivalen. dCTP. Ion logam monovalen. komponen lain yang dibutuhkan adalah: Primer Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA.Komponen PCR Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E.

be/~avierstr/principles/pcrsteps. yaitu: Denaturasi Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama 30-60 detik. Pada suhu ini DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal. suhu diturukan ke kisaran 40-60oC selama 20-40 detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer.ugent.gif Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap.be/~avierstr/principles/pcrsteps.ugent.gif Sumber: http://users.Tahapan Reaksi Sumber: http://users. Annealing Setelah DNA menjadi utas tunggal. Ekstensi/elongasi .

Final Elongasi Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. DNA manusia saja panjangnya sekitar 3 miliar basa. Oh ya. bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen. jika basa pada template adalah A. Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut: Pra-denaturasi Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu). Tapi syukurlah sekarang mesin Thermal Cycler sudah terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan. maka akan dipasang dNTP. Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya. annealing dan ekstensi secara manual. DNA ditranskrip menghasilkan RNA. Dari sekian panjang DNA genome. Aplikasi teknik PCR Kita harus berterima kasih kepada Kary B Mullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan PCR pada tahun 1984. begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T. yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein. Pada awalnya orang menggunakan tiga penangas air (water bath) untuk melakukan denaturasi.Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase. Lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi. gen itu apaan ya? Sebagaimana kita tahu bahwa fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik. berpindah dari satu suhu ke suhu lainnya menggunakan tangan. dan C dengan G. RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. dan di dalamnya mengandung ribuan gen. diantaranya: Isolasi Gen Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar. Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. begitu pula sebaliknya). biasanya 70-72oC. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler yang dapat menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR. . secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.

littletree. yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Diagnosa Penyakit . kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia. lebih cepat. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut. metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator. lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. Dan ajaib! Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia. Konon banyak kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua ‘sesungguhnya’ dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.sisanya tidak menyandikan protein atau disebut ‘junk DNA’. Nah. dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah.au/dna. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda. dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi atau babi. mudah. Kembali ke pembahasan isolasi gen.com.htm]. Sebagai contoh. maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan. untuk mengisolasi gen. para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin juga [http://www. misalnya ibu atau bapak kandung. dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda. Berkat teknologi rekayasa genetik. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun. diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama ‘probe’ yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia. kemudian menjadikannya obat diabetes. maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus ‘mengorbankan’ sapi atau babi. DNA Sequencing Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing. atau korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud. Forensik Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban). DNA ‘sampah’ yang fungsinya belum diketahui dengan baik. yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari.

Denaturasi Newton and Graham (1997) dalam Rohmy (2001).. Proses dalam PCR Polymerase Chain Reaction (PCR) terdiri dari tiga proses. bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya. A. yaitu suhu optimal untuk TaqDNA polimerase. Masih banyak aplikasi PCR lainnya yang sangat bermanfaat. . Annealing Merupakan proses penempelan primer. yaitu: 1. Prinsip dasar PCR Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan salah satu metode untuk mengidentifikasi penyakit infeksi. Suhu annealing yang terlalu rendah dapat mengakibatkan timbulnya pita elektroforesis yang tidak spesifik. Tahap denaturasi DNA biasanya dilakukan pada kisaran suhu 92 – 95 oC. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. menyatakan bahwa denaturasi merupakan proses memisahkan DNA menjadi utas tunggal.Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini. Tahap annealing primer merupakan tahap terpenting dalam PCR. B. 1997). annealing (penempelan) pasangan primer pada untai DNA target dan extension (pemanjangan atau polimerisasi). sehingga diperoleh amplifikasi DNA antara 108 – 109 kali (Retnoningrum. 2001). 1997 dalam Rohmy 2001). Maka tak salah panitia Nobel menganugrahkan hadiah Nobel bidang kimia yang bergengsi ini kepada Kary B Mullis hanya 9 tahun setelah penemuannya (1993). Kenaikan suhu setelah tahap annealing hingga mencapai 70–74 oC bertujuan untuk mengaktifkan enzim TaqDNA polimerase. Metode ini dikembangkan untuk mengatasi kelemahan metode diagnosis konvensional seperti imunologi dan mikrobiologi. Tahap denaturasi yang terlalu lama dapat mengakibatkan hilangnya aktivitas enzim polimerase (Lisdiyanti. Denaturasi awal dilakukan selama 1 – 3 menit diperlukan untuk meyakinkan bahwa DNA telah terdenaturasi menjadi untai tunggal. PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat. 1988 dalam Rohmy. Faktor yang mempengaruhi tahap ini antara lain suhu annealing dan primer. sedangkan suhu yang tinggi dapat meningkatkan kespesifikan amplifikasi (Saiki et al. Proses ini dapat dikelompokkan dalam tiga tahap berurutan yaitu denaturasi templat. karena jika ada sedikit saja kesalahan pada tahap ini maka akan mempengaruhi kemurnian dan hasil akhir produk DNA yang diinginkan. Teknik PCR didasarkan pada amplifikasi fragmen DNA spesifik di mana terjadi penggandaan jumlah molekul DNA pada setiap siklusnya secara eksponensial dalam waktu yang relatif singkat. Denaturasi yang tidak berlangsung secara sempurna dapat menyebabkan utas DNA terputus. 2. Proses pemanjangan primer (tahap extension) biasanya dilakukan pada suhu 72 oC.

kaki renang (pleopoda). yang dapat diatur pada mesin PCR (thermocycle). 2004).. Menurut Haliman dan Adijaya (2005). Hasil ekstraksi DNA pada tahap pertama digandakan dengan bantuan enzim-enzim yang dikenal sebagai primer. 2001). Hasil sintesa DNA dalam satu siklus dapat berperan sebagai cetakan (template) pada siklus berikutnya sehingga jumlah DNA target menjadi berlipat dua pada setiap akhir siklus. Sampel yang akan diuji PCR sebaiknya dalam kondisi segar. tetapi bila tidak memungkinkan. yaitu proses elektroforesis. Selanjutnya. Dengan kata lain DNA target meningkat secara eksponensial. DNA virus yang telah berlipat ganda jumlahnya dapat dideteksi dengan elektoforesis sel agarosa. Sampel udang Vannamei yang diambil tersebut selanjutnya dilakukan pemotongan bagian insang. 3. Satu jenis primer bertanggung jawab atas penggandaan satu jenis DNA tertentu sehingga primer satu jenis virus hanya dapat digunakan untuk deteksi virus tersebut saja. 1996 dalam Wahyudi. Uji PCR untuk mendeteksi keberadaan virus dilakukan di laboratorium dengan pengambilan sampel udang Vannamei dari tambak budidaya. Proses tersebut dilakukan pada kondisi suhu dan siklus penggandaan tertentu. DNA dari sel-sel sampel diekstraksi dengan larutan lysis buffer (IQ2000TM). Extension Merupakan proses pemanjangan DNA. secara umum uji PCR di laboratorium dilakukan dengan tahapan-tahapan sebagai berikut: 1. Proses ini disebut dengan reaksi rantai polimerase (polymerase chain reaction. 2. Proses penggandaan ini dikenal sebagai proses amplifikasi.. Sementara untuk mengekstraksi RNA digunakan RNA ekstraction solution (IQ2000TM). Dengan bantuan buffer TAE atau TBE. atau cairan hemolim. DNA yang telah diklon pada tahap kedua dimasukkan ke dalam lubang-lubang kecil yang terdapat pada lempengan agar agarose . 1988 dalam Rohmy. 3. Reaksi ini akan berubah dari satu siklus ke siklus selanjutnya mengikuti perubahan konsentrasi DNA (Hsu et al. semakin lama waktu extension maka jumlah DNA yang tidak spesifik semakin banyak (Saiki et al. 2005).Selain itu. sehingga setelah 30 siklus akan menjadi milyaran amplifikasi DNA target. Hasil uji PCR selanjutnya digunakan pada tahap ketiga. Selain suhu. Setelah diwarnai dengan Ethidium Bromida (ETBr). Hal ini bertujuan untuk mencegah terjadinya kerusakan DNA/RNA (Haliman dan Adijaya. PCR) karena merupakan siklus penggandaan yang berulang sehingga kegiatan ini seolah-olah merupakan suatu proses reaksi berantai. hasil elektroforesis yang berupa band RNA dapat dilihat dengan UV transluminator dan diabadikan dengan kamera polaroid (Sunarto dkk. pada masa peralihan suhu dari suhu annealing ke suhu extension sampai 70 oC juga menyebabkan terputusnya ikatan-ikatan tidak spesifik antara DNA cetakan dengan primer karena ikatan ini bersifat lemah. Lysis buffer (IQ2000TM) juga berfungsi untuk mengamankan hasil ekstraksi dari kerusakan akibat kerja enzim dNase. RNA ekstraction solution (IQ2000TM) juga berfungsi mengamankan RNA dari kerusakan akibat kerja enzim rNase. Hasil ekstraksi DNA di-sentrifus hingga diperoleh butiran atau pelet DNA. sampel dapat disimpan dalam larutan alkohol 95% dengan perbandingan 1 : 9 (1 bagian sampel dengan 9 bagian alkohol 95%). Dalam tahap extension atau sintesis DNA. enzim polimerase bergabung bersama dengan nukleotida dan pemanjangan primer lengkap untuk sintesis sebuah DNA utas ganda. 2001).

Keberhasilan pengujian sampel dengan metode PCR dipengaruhi oleh beberapa hal. Institut Pertanian Bogor. Pembudidayaan dan Prospek Pasar Udang Putih yang Tahan Penyakit.go. H. Prosedur PCR untuk diagnosa Cepat Penyakit Bercak Putih pada Udang. Skripsi. Skripsi. tergantung pada berat molekulnya.S. umur reagen atau enzim yang dipakai. 2005). Jurusan Farmasi FMIPA ITB. 2004. D. R. dan Adiwijaya. Agar kontaminasi silang dapat dihindarkan. serta kondisi larutan buffer dan larutan etidium bromida yang dipakai. Sunarto. Program Studi Budidaya Perairan. terinfeksi virus atau bebas dari virus. Keberhasilan Penggunaan Primer Spesifik DNA Mitokondria (mtDNA) Ikan Patin (Pangasius hypophthalmus) pada Beberapa Ikan Budidaya dengan Metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Dari hasil proses elektroforesis ini dapat disimpulkan status sampel. Penebar Swadaya. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. www. ketelitian saat poses ekstraksi. Bandung. Penerapan Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Diagnosis Penyakit Infeksi. S. Jakarta Retnoningrum. Disketkanling. Udang Vannamei. Taukhid. Hasil proses elektroforesis akan menampilkan pita-pita DNA yang letaknya tersebar. Pita-pita DNA kemudian dibandingkan dengan posisi pita-pita pada lajur penanda DNA (DNA marker). D. Pengaruh Suhu Annealing dan Jumlah Siklus yang Berbeda pada Program PCR Terhadap Keberhasilan Isolasi dan Amplifikasi mtDNA Ikan Patin (Pangasius hypophthalmus). Program Studi Budidaya Perairan. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. sebaiknya operator pengujian PCR harus benar-benar terlatih dan teliti (Haliman dan Adijaya. Daftar Pustaka Haliman. Rohmy.id Wahyudi. T. 1997. seperti faktor kontaminasi silang. Agus. jumlah enzim yang dipakai.W. 2001. 2001. 2005. Institut Pertanian Bogor . Akhmad Rukyani. Isti Koesharyani.2%.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->