Uji Peroksida Lipid Dalam Cairan Biologis

I. Tujuan :

Menetapkan kadar peroksida lipid dalam cairan biologis

II. Teori Singkat :

Asam lemak tidak jenuh jamak (PUFA) dapat mengalami proses peroksidasi menjadi
peroksida lipid. PUFA (Poly Unsaturated Fatty Acids) pada manusia disintesis dari MUFA
(Mono Unsaturated Fatty Acid ), melalui penambahan ikatan rangkap antara ikatan rangkap yang
sudah ada (D9) dan gugus karboksil – menghasilkan asam lemak w-9.

Peroksidasi lipid adalah reaksi penyerangan radikal bebas terhadap asam lemak tidak
jenuh jamak (PUFA) yang mengandung sedikitnya tiga ikatan rangkap. Reaksi ini dapat terjadi
secara alami di dalam tubuh yang diakibatkan oleh pembentukan radikal bebas secara endogen
dari proses metabolisme di dalam tubuh. Peroksidasi lipid diinisiasi oleh radikal bebas seperti
radikal anion superoksida, radikal hidroksil dan radikal peroksil. Radikal bebas secara
berkesinambungan dapat dibuat oleh tubuh kita. Setiap radikal bebas yang terbentuk oleh tubuh
dapat memulai suatu reaksi berantai yang akan terus berlanjut sampai radikal bebas ini
dihilangkan oleh radikal bebas lain dan oleh sistem antioksidan tubuh (Halliwell & Gutteridge
1999).

Peroksida lipid selanjutnya mengalami dekomposisi menjadi malondialdehid (MDA).

MDA produk akhir proses peroksidasi lipid dan yang paling sering digunakan untuk mengukur
proses peroksidasi lipid. Pengujian MDA dilakukan dengan TBA (Asam tiobarbiturat) yaitu akan
membentuk senyawa warna merah muda dan diukur serapan pada panjang gelombang 532 nm,
juga dapat diukur dengan HPLC ( High Performance Liqiud Chromatography )

Proses peroksidasi lipid

Akibat serangan ROS terhadap asam lemak tidak jenuh jamak (PUFA) pada membran 3
tahap:
 1Bahan

1. Hemolisat darah
2. Larutan asam tikoloroasetat (TCA) 10%
3. Larutan TBA

III. Cara Kerja

Uji 1
Uji II
Uji III
IV. Hasil Pengamatan
a) Uji 1

Absorbansi = 0,107

Kadar MDA = A/ε

= 0,107/153.000 M-1 cm -1
=
7 x 10-4

b) Uji 1

Absorbansi = 0,090

Kadar MDA = A/ε

= 0.09/153.000 M-1 cm -1
 = 6x 10-4

c) Uji 1

Absorbansi = 0,031

Kadar MDA = A/ε

= 0.031/153.000 M-1 cm -1

=2 x 10-4

V. Pembahasan

Pada praktikum uji peroksida lipid dalam cairan biologis. Kita mengukur kadar peroksida
lipid di dalam cairan biologis, cairan biologis yang digunakan adalah darah. Asam lemak tidak
jenuh jamak (PUFA) dapat mengalami proses peroksidasi menjadi peroksida lipid. PUFA (Poly
Unsaturated Fatty Acids) pada manusia disintesis dari MUFA (Mono Unsaturated Fatty Acid ),
melalui penambahan ikatan rangkap antara ikatan rangkap yang sudah ada (D9) dan gugus
karboksil – menghasilkan asam lemak w-9. .

Peroksidasi lipid adalah reaksi penyerangan radikal bebas terhadap asam lemak tidak
jenuh jamak (PUFA) yang mengandung sedikitnya tiga ikatan rangkap. Reaksi ini dapat terjadi
secara alami di dalam tubuh yang diakibatkan oleh pembentukan radikal bebas secara endogen
dari proses metabolisme di dalam tubuh. Peroksidasi lipid diinisiasi oleh radikal bebas seperti
radikal anion superoksida, radikal hidroksil dan radikal peroksil. Radikal bebas secara
berkesinambungan dapat dibuat oleh tubuh kita. Setiap radikal bebas yang terbentuk oleh tubuh
dapat memulai suatu reaksi berantai yang akan terus berlanjut sampai radikal bebas ini
dihilangkan oleh radikal bebas lain dan oleh sistem antioksidan tubuh (Halliwell & Gutteridge
1999).
 Peroksidasi lipid merupakan proses yang bersifat kompleks akibat reaksi asam lemak tak
jenuh jamak penyusun fosfolipid membran sel dengan senyawa oksigen reaktif (ROS),
membentuk hidroperoksida. Pertama, ROS ialah senyawa turunan oksigen yang lebih reaktif
dibandingkan oksigen pada kondisi dasar (ground state).Kedua, ROS tidak hanya terdiri atas
molekul oksigen tanpa pasangan elektron seperti radikal hidroksil (·OH), radikal superoksida
(·O2-), dan nitrit oksida (NO·), tetapi juga molekul reaktif yang memiliki electron berpasangan.
Molekul oksigen yang memiliki electron berpasangan tersebut diantaranya, hidrogen peroksida
(H2O2), asam hipoklorous (HOCl), dan anion peroksinitrit (ONOO-).3

Target utama peroksidasi oleh ROS adalah asam lemak tak jenuh majemuk (PUFA)
dalam lipid membran. PUFA didegradasi oleh radikal-radikal bebas membentuk malondialdehid
(MDA). Kadar MDA dalam serum berfungsi sebagai sebuah penanda kerusakan seluler akibat
radikal bebas.

Peroksidasi lipid dapat menghasilkan oksigen tunggal, hidroperoksida dan epoksida

lipid. Aldaheida yang dapat terbentuk pada peroksidasi lipid adalah malondialdehida (MDA) dan
4-hidroksinonenal (4-HNE). MDA adalah metabolit utama pada asam lemak arakidonat (20:4).
Uji MDA (TBARS) digunakan untuk mengukur peroksidasi yang terjadi pada membran lipid. 4-
HNE dihasilkan oleh arakidonat melalui autooksidasi. 4-HNE bereaksi dengan komponen seluler
lebih kuat dibandingkan dengan MDA. Oleh karena itu 4-HNE lebih toksik dibandingkan MDA
akan tetapi tidak reaktif dengan TBA (Best, 2007). Gambar 13 Peroksidasi lipid pada asam
lemak tak jenuh rantai panjang (Murray)
 Hal pertama yang harus dilakukan adalah mengambil darah dari probandus dalam
hal ini darah yang di ambil pada bagian lengan dengan volume pengambilan 2 ml untuk
dua uji dan satu blanko.
Criteria probandus yaitu harus sehat dan memiliki postur badan agak gemuk agar
dari darah yang di ambil mengandung lipid yang diinginkan..
Pada uji 1 dan 2 masing – masing ditambah kan 1ml darah sedangkan blanko
ditambahkan aquadest selanjutnya pada uji 1,2 dan blanko ditambahkan TCA 10%
penambahan TCA bertujuan agar protein yang terkandung dalam darah pada uji 1 dan 2
mengalami presipitasi setelah di sentrifugasi pada 4000rpm. Presipitasi protein dilakukan
karena kandungan protein yang terkandung dalam darah akan mengganggu penetapan
kadar peroksida lipid.
Mekanisme TCA 10 % sebagai agen presipitasi yakni ion negatif dari TCA akan
bergabung dengan protein yang sedang berada pada kondisi sebagai kation (pH larutan
dalam kondisi asam hingga pH isoelektrik protein) hingga membentuk garam protein.
Beberapa garam yang dihasilkan tersebut tidak larut dengan demikian metode ini dapat
digunakan untuk memisahkan protein dari larutan. . Umumnya agen presipitasi akan
melarut sedangkan garam protein akan terdekomposisi dengan adanya penambahan basa
(membentuk protein yang bermuatan negatif atau anionic protein). TCA umumnya
digunakan untuk protein-protein yang telah berada dalam keadaan bebas pada filtrat
darah dan pada pemeriksaan awal materi biologis.
Selanjutnya setelah disentrifugasi pada 4000rpm dan supernatantnya diambil dan
tambahkan larutan TBA 0,67% yang telah dipanaskan. Tujuan pemanasan adalah agar
TBA segera bereaksi dengan supernatant dan memberikan warna merah yang
menandakan bahwa mengandung malondialdehida (MDA). Selanjutnya didihkan selama
10 menit, dan setelah dingin dibaca pada panjang gelombang 532 nm
 Malonaldehida, 4-hidroksinonenal, dan heptanal,merupakan aldehida-aldehida
hasil dekomposisi senyawa hidroperoksida, yang bereaksi dengan TBA dan
menghasilkan warna merah. Warna merah tersebut menyerap cahaya ultraviolet pada
panjang gelombang (λ) 532 nm (Inoue dkk., 1998). Kemampuan TBA bereaksi dengan
aldehida atau keton, karena adanya atom karbon nomor 5 (C-5) TBA yang reaktif
(Guzman-Chozas dkk., 1998).Rasio reaksi antara TBA dengan aldehida
berbedabeda,misalnya rasio reaksi TBA dengan 2-heksenal adalah 1:1 dan rasio reaksi
TBA dengan malonaldehida adalah 2:1 (Gambar 1) (Guzman-Chozas dkk., 1998).
Ada tidaknya ikatan rangkap pada asam lemak dapat mempengaruhi hasil akhir
oksidasi lemak. Kishida dkk. (1993b) menyatakan, bahwa oksidasi asam lemak tak-jenuh
menghasilkan thiobarbituric acid reactive substances, sedangkan oksidasi asam lemak
jenuh tidak menghasilkan thiobarbituric acid reactive substances.
Uji TBA hanya mendeteksi MDA bebas dan mengukur jumlah MDA bebas dalam
sistem lipid peroksidasi. Pada uji 1 dan 2 menunjukkan warna merah muda yang bearti
positif terkandung Malondialdehida. Malondialdehida merupakan proses akhir dari
peoksidasi lipid. Sedangkan blanko tidak menunjukkan perubahan warna dan larutan
blanko tetap bening. Pada pembacaan panjang gelombang 532 nm oleh UV VIS
diperoleh kadar Malondialdehida (MDA) sebagai berikut
  Uji 1 = 7 x 10-4
 Uji 2 = 6 x 10-4
 Blanko = 2 x 10-4

VI. Kesimpulan
1) Kadar MDA yang terkandung di dalam darah adalah Uji 1 = 7 x 10-4 dan
Uji 2 = 6 x 10-4
2) Penambahan TBA 0,67 % memberikan warna merah muda pada uji 1 dan
2
3) Penambahan TBA 0,67 % tidak memberikan reaksi apapun pada blanko
4) Kemampuan TBA bereaksi dengan aldehida atau keton, karena adanya atom karbon
nomor 5 (C-5) TBA yang reaktif.
5) Penambahan TCA bertujuan untuk mengendapkan protein yang terdapat
pada darah sehingga tidak mengganggu penetapan kadar peroksida lipid

VII. Daftar Pustaka

1) Suhartono Bambang Setiawan, Peroksidasi Lipid dan Penyakit Terkait Stres
Oksidatif pada Bayi Prematur Eko