2

Yap Kok Leong Abdul Hamid Abdul Aziz Mohd Salleh Mohd Yasin

PENERBIT UNIVERSITI KEBANGSAAN MALAYSIA BANGI • 1999

3

Cetakan Pertama / First Printing, 1999 Hak cipta / Copyright Universiti Kebangsaan Malaysia, 1999 Hak cipta terpelihara. Tiada bahagian daripada terbitan ini boleh diterbitkan semula, disimpan untuk pengeluaran atau ditukarkan ke dalam sebarang bentuk atau dengan sebarang alat juga pun, sama ada dengan cara elektronik, gambar serta rakaman dan sebagainya tanpa kebenaran bertulis daripada Penerbit UKM terlebih dahulu. All rights reserved. No part of this publication may be reproduced or transmitted in any form or by any means, electronic or mechanical including photocopy, recording, or any information storage and retrieval system, without permission in writing from the Penerbit UKM. Reka bentuk kulit dan ilustrasi olh Hassan Majid Diterbitkan di Malaysia oleh / Published in Malaysia by
PENERBIT UNIVERSITI KEBANGSAAN MALAYSIA 43600 UKM Bangi, Selangor D.E. Malaysia

Penerbit UKM adalah anggota / is a member of the PERSATUAN PENERBIT BUKU MALAYSIA /
MALAYSIAN BOOK PUBLISHERS ASSOCIATION

No. Ahli / Membership No. 8302 Dicetak di Malaysia oleh / Printed in Malaysia by
AMPANG PRESS SDN. BHD.

6 & 8, Jalan 6/91, Taman Shamelin Perkasa, Jalan Cheras, 56100 Kuala Lumpur, MALAYSIA Perpustakaan Negara Malaysia Data Pengkatalogan-dalam-Penerbitan

Yap, Kok Leong Mikrobiologi makmal / Yap Kok Leong, Abdul Hamid Abdul Aziz, Mohd Salleh Mohd Yasin. Mengandungi indeks 1. Microbiological laboratories. I. Abdul Hamid Abdul Aziz. II. Mohd Salleh Mohd Yasin. III. Judul. 579.078 ISBN 967-942-439-1

4

KANDUNGAN

Prakata . . . 7 1. Amalan dan Peraturan dalam Makmal Mikrobiologi . . . 9 1.1. Prosedur Umum di dalam Makmal Mikrobiologi . . . 9 1.2. Bantuan Pemula Kecemasan di dalam Makmal . . . 9 1.3. Disinfektan untuk Kegunaan Makmal . . . 10 1.4. Tatacara Aseptik . . . 11 2. Mikroskop Cahaya dalam Mikrobiologi . . . 14 2.1. Tatacara Mikroskop Cahaya . . . 14 3. Pengamatan Mikrob . . . 17 3.1. Pengamatan Bakteria . . . 17 3.2. Pengamatan Fungus . . . 30 3.3. Pengamatan Virus dengan Mikroskop Elektron . . . 38 3.4. Reagan Pewarnaan: Rumusan dan Persediaan . . . 42 4. Pengkulturan Mikrob . . . 44 4.1. Pengkulturan Bakteria . . . 44 4.2. Pengkulturan Fungus . . . 54 4.3. Pengkulturan Virus . . . 59 5. Pengenalpastian Agen Mikrob . . . 73 5.1. Ujian Makmal dalam Pengenalpastian Bakteria . . . 73 6. Ujian Sensitiviti Antibiotik In Vitro . . . 91 6.1. Ujian Resapan Disk . . . 91 6.2. Ujian Pencairan Tabung . . . 94 7. Ujian Serologi dalam Mikrobiologi . . . 97 7.1. Ujian ELISA . . . 97 Indeks . . . 101

5

Oleh itu. Buku ini mengandungi 81 teknik dan maklumat teknikal. Menyedari hakikat di atas. Yap Kok Leong Abdul Hamid Abdul Aziz Mohd Salleh Mohd Yasin Jabatan Sains Bioperubatan Fakulti Sains Kesihatan Bersekutu UKM 6 . sebuah buku yang menyentuh tentang teknik-teknik dasar makmal dan tradisional mikrobiologi amat diperlukan. terdapat beberapa kaedah seperti pewarnaan bakteria yang boleh dianggap sebagai teknik asas dalam amalan sains ini. Sering juga terdapat soalan serta kemusykilan yang sama yang diajukan oleh mereka. di samping menambahkan sebuah lagi judul teks ke dalam senarai buku-buku teknikal dalam Bahasa Melayu yang tercinta. selain mempelajari dan mengumpul fakta serta konsep adalah penting bagi pelajar dan pengamal mikrobiologi mahir dan cekap dalam mengendalikan kaedah-kaedah makmal mikrobiologi. Penggunaan setiap teknik ini sengaja diolah berdasarkan konsep yang dimaksudkan di atas. Oleh yang demikian. Teknik asas ini biasanya diajarkan kepada pelajar mikrobiologi dalam sesi amali yang terancang. Ini dilakukan supaya pelajar dapat memahami teori serta penggunaan teknik-teknik di atas dengan lebih mendalam kerana buku ini menyertakan beberapa petunjuk dan petua bagi mencapai hasil yang baik dan diharapkan. Daripada pengalaman kami dalam mengendalikan sesi amali mikrobiologi terdapat beberapa kesilapan serta amalan yang tidak sewajarnya diulangi oleh setiap kumpulan pelajar baru. tetapi juga merangkumi pengenalan ringkas dan tepat mengenai teknik-teknik tersebut. Sungguhpun kaedah yang digunakan dalam mikrobiologi banyak dan berbagai-bagai. Kami menaruh harapan agar buku ini berguna dalam mempertingkatkan lagi kemahiran pelajar mahupun pengamal mikrobiologi.PRAKATA Mikrobiologi merupakan suatu sains praktik. kami menulis buku ini yang bukan sahaja memaparkan kaedah serta pelaksanaan yang sempurna.

.

2. Jangan memasukkan pensil. jari atau sebarang objek ke dalam mulut atau membasahkan pelekat dengan menggunakan lidah. 10. Jangan nyalakan mancis semasa bekerja dengan/atau berdekatan dengan reagen meruap seperti alkohol dan eter. 6. Pakai kot makmal dan kasut pada setiap waktu anda bekerja di dalam makmal. Jangan makan. Periksa penunu Bunsen dari semasa ke semasa untuk memastikan tidak berlaku kebocoran gas.1. minum atau merokok di dalam makmal pada setiap waktu. 9. PROSEDUR UMUM DI DALAM MAKMAL MIKROBIOLOGI Mikroorganisma boleh menyebabkan penyakit pada manusia. Simpan buku dan catatan berjauhan daripada tempat bekerja anda di dalam makmal untuk menghindari daripada tercemar. pecah atau tercemar kepada instruktor. 8.1. 1. 5. pekerja makmal haruslah mempunyai sedikit sebanyak pengetahuan mengenai bantuan pemula dan tindakan yang perlu diambil serta sedar akan keperluan ini. 2. 4. 11. khususnya dalam kes-kes kecederaan ringan. Tutup gas dan paip air dengan rapat dan bersihkan meja setelah anda selesai bekerja dan bersiap sedia untuk meninggalkan makmal. bakteria dan virus. Basuh tangan dengan sabun dan air atau dengan disinfektan kulit sebelum anda memulakan sebarang pekerjaan di makmal. 2. Tumpuan khusus perlu diberikan kepada aspek-aspek keselamatan dan ketelitian di dalam makmal mikrobiologi demi kepentingan diri sendiri mahupun pekerja-pekerja lain. Jangan menyentuh kawasan muka atau mulut anda semasa bekerja. misalnya bikar yang berisi disinfektan atau bekas yang disediakan khas. Untuk mencapai matlamat ini sentiasalah mengingati dan mematuhi peraturan-peraturan umum makmal berikut: 1. Gantikan tiubnya jika perlu. 4. 7. Antiseptik ringan untuk luka dan luka terbakar Kain kasa (gauz) atau pembalut steril Larutan asid asetik 2% Natrium bikarbonat Jeli petroleum/vaselin 9 . 12. Basuh tangan anda semula dengan sabun dan air atau dengan disinfektan kulit sebelum meninggalkan makmal. AMALAN DAN PERATURAN DALAM MAKMAL MIKROBIOLOGI 1. 3. 14. 13. 5. Jangan menyedut sebarang cairan ke dalam pipet dengan mulut. Panggillah instruktor dengan segera jika berlaku sebarang KEMALANGAN terutama yang berkaitan dengan kultur mikroorganisma. 3. Buangkan semua bahan dan kultur yang tercemar ke dalam bekas khusus yang disediakan. Kot makmal janganlah dipakai di luar makmal. Mikrobiologi adalah mengenai mikroorganisma atau jasad renik yang mempunyai saiz kecil seperti fungus (kulat). BANTUAN PEMULA KECEMASAN DI DALAM MAKMAL Oleh kerana kemalangan boleh berlaku di dalam makmal. Jangan membawa keluar dari makmal sebarang kultur atau bahan-bahan dalam kelas amali. Jangan membawa bahan-bahan makmal yang rosak. Gunakan penyedut getah atau alat penyedut khas untuk tujuan ini. Bekalan Bantuan Pemula Kecemasan 1. Oleh itu adalah penting bagi kita menyedari dan mengawasi prosedur dan perilaku dengan betul serta penuh tanggungjawab semasa bekerja dengannya.

2. Luka. Contoh: Clearsol. sesuai untuk menginaktivasi virus. iaitu pemusnahan semua bentuk hidupan. jumpalah doktor. pipet dan slaid mikroskop juga sering tercemar. Elak daripada menggunakan air kerana boleh menyebarkan alkali berkenaan. Disinfektan Jenis Hipoklorit 1. Disinfektan Jenis Fenolik Jernih 1. Jika formalin atau mana-mana cairan tersimbah ke dalam mata. 3. Hipoklorit sesuai digunakan dengan detergen anionik dan bukan ionik tetapi tidak sesuai 3. objek di dalam makmal seperti tempat kerja. jangan berikan sebarang rawatan tetapi bawalah mangsa ke hospital. 4. Bilas bersungguh-sungguh dengan asid asetik 2%. Bahan antimikrob ini menyerang logam. Untuk luka ringan dan cakaran. 4. Luka bakar asid. 10 . Umumnya. sapukan lapisan tipis jeli petroleum di kawasan berkenaan. Luka bakar api. 2. Sudol. Namun demikian. 3. cuci luka dan teliti sama ada terdapat bendasing (kaca) di dalam luka. Disinfektan adalah bahan kimia yang dimaksudkan di atas yang digunakan untuk memusnahkan mikrob patogenik pada sesuatu objek tak bernyawa (inanimate). Digunakan pada pencairan seperti yang ditetapkan oleh pengeluar disinfektan. Sebatian kimia halogen dan fenol adalah di antara agen yang penting sebagai disinfektan. Gunakan hipoklorit untuk bahan yang mengandungi hanya sedikit bahan organik atau sedikit darah. 5. 4. Untuk mengelakkan penyebaran patogen. hematologi dan patologi kimia di dalam balang buangan sisa makmal. Luka bakar alkali. balang pipet terpakai dan untuk mendisinfeksi permukaan. Untuk luka bakar kulit yang ringan (kulit kemerahan tetapi tidak sampai mengelupas). pastikan mata dicuci dengan air yang banyak dengan air paip. objek seperti spesimen klinikal dan pipet dikumpulkan di dalam bekas yang sesuai sebelum disterilkan dan dibuang. Segera simbah dengan sabun dan air dan sapukan dengan natrium bikarbonat.3. Bilas dengan alkohol 70% atau dengan antiseptik. spesimen dan bahan terpakai terlebih dahulu disimpan buat sementara di dalam bahan kimia tertentu sehingga pekerjaan di makmal tersebut selesai. tidak digunakan untuk darah dan virus. Bagi luka bakar yang lebih serius. Segera berjumpa doktor. Balut dengan kain pembalut berperekat atau dengan balutan longgar. Jika keradangan pada mata tersebut masih berterusan. DISINFEKTAN UNTUK KEGUNAAN MAKMAL Pekerja di makmal mikrobiologi sentiasa berhadapan dengan bahan-bahan berbahaya terutamanya yang mengandungi mikrob patogenik. balang buangan sisa makmal. 1. Aktiviti antimikrobnya dikurangkan oleh bahan organik. Boleh digunakan dalam bidang virologi. Sesuai untuk kerja mikrobiologi umum. Jika luka kelihatan parah. tahap pemusnahan di peringkat ini tidaklah perlu mencapai tahap pensterilan.Tatacara Rawatan Bantuan Pemula 1. bahan tuberkulosis dan bahan bakteriologi umum. Di samping ini. Aktiviti antimikrobnya tidak banyak dikurangkan oleh bahan organik dan tidak bertindak terhadap logam. 2. tetapi tidak digunakan untuk bahan tuberkulosis atau yang diperbuat daripada logam. Digunakan untuk kebanyakan bahan organik. jangan menggunakan antiseptik.

P E R H AT I A N 1. Balang pipet: 2500 ppm klorin bebas. Gelung dawai Rak gelung dawai Penunu Bunsen TATA C A R A 1.5 mm yang dibentuk melingkar seperti gelung pada salah satu penghujungnya. 7.1. Tatacara Pensterilan Gelung Dawai dengan Api BAHAN 1. Contoh: Chloros. 6. 1. 3. Presept. 2. gelung dawai ini disterilkan setiap kali selepas digunakan. Gelung dawai ini merupakan alat utama di makmal bakteriologi yang digunakan untuk memindahkan bakteria daripada suatu kultur ke tempat-tempat lain. pakaian mahupun tempat anda bekerja di makmal) dan juga ke atas pekerja-pekerja lain. Lakukan pembakaran sehingga peringkat keseluruhan dawai menjadi merah membara. Dengan perkataan lain. Pastikan gelung dawai yang steril ini tidak tersentuh sebarang objek sebelum digunakan. 11 . TATACARA ASEPTIK Teknik aseptik bukan sahaja bertujuan untuk menjamin kesterilan bahan yang anda sedang kendalikan (iaitu tanpa berlakunya sebarang pencemaran ke atas bahan berkenaan) tetapi juga merangkumi tindakan menghindari daripada berlakunya pencemaran mikroorganisma yang sedang dikaji ke atas diri anda sendiri (tangan. 4. gelung dawai ini disterilkan.4. Masukkan gelung dawai ke dalam api penunu Bunsen seperti yang ditunjukkan pada Rajah 1. dengan detergen kationik. Gelung dawai haruslah sentiasa disterilkan melalui pembakaran merah membara seperti di atas sebelum dan sesudah digunakan. Penghujung lainnya dicantumkan kepada sebatang pemegang dawai. Biarkan ia supaya dingin semula (sama ada dengan memegang atau meletakkannya di atas rak khas) sebelum digunakan. Adalah penting juga dalam mengamalkan teknik aseptik. Nyalakan penunu Bunsen dan buka sepenuhnya liang kemasukan udaranya. Keluarkan dawai.5. gelung dawai ini terlebih dahulu dibakar supaya semua mikrooganisma yang terdapat pada permukaannya musnah dan terhapus serta tidak akan tercampur atau mencemari kultur bakteria murni yang akan diambil dengannya nanti. 2. Letakkan ia di atas rak khas atau pegang sahaja sementara menunggu dingin. Penggunaan umum: 1000 ppm klorin bebas. 3. 2. Elakkan daripada meletakkannya langsung di atas meja. Pensterilan Gelung Dawai dengan Api Gelung dawai adalah sejenis dawai yang umumnya terdiri daripada nichrome atau platinum dengan garis pusat berukuran 0. Sebelum digunakan.

Tatacara Pensterilan Alat dengan Alkohol yang Membakar BAHAN 1. mikroorganisma yang terdapat pada permukaan objek tersebut juga turut terbakar dan akhirnya dihapuskan. Balang alkohol (mengandungi etanol 70%) Penunu Bunsen TATACARA 1. ia kurang meyakinkan dibandingkan dengan pensterilan yang diperolehi dengan menggunakan autoklaf. Pegang objek kecil seperti slaid mikroskop atau penutup slaid dengan forseps dan objek yang lebih besar pada pemegangnya. 12 . RAJAH 1. Seterusnya bakar keseluruhan dawai sehingga menjadi merah sebelum dikeluar dan didinginkan di udara. 3. seperti bahagian memotong gunting ialah dengan mencelupkan objek atau bahagian daripada objek berkenaan ke dalam alkohol dan kemudian membakar objek beralkohol tersebut. Dalam tempoh alkohol pada permukaan objek tersebut terbakar. 4. Singkirkan alkohol yang berlebihan. 2. Celup objek atau bahagian yang akan disterilkan ke dalam balang alkohol. misalnya.Mulakan dengan memasukkan gelung dawai langsung ke dalam api (biru) di bahagian gas tak terbakar. Naikkan gelung perlahan-lahan sehingga bahagian gelung keluar dari kemuncak api biru dan biarkan terbakar sehingga merah membara. 2. Sentuhkan objek beralkohol kepada api penunu Bunsen supaya alkohol terbakar. Sungguhpun ini merupakan suatu kaedah pensterilan yang boleh digunakan dalam keadaan-keadaan tertentu.1 Cara membakar gelung dawai Pensterilan Alat dengan Alkohol yang Membakar Suatu tatacara cepat untuk mensterilkan objek kecil atau sebahagian daripada sesuatu objek.

Kaedah ini hanya boleh digunakan untuk objek kaca dan logam sahaja. 13 . dipercayai bahawa bekerja berdekatan dengan sesuatu sumber api umumnya boleh mengurangkan kadar pencemaran dari udara. PERHATIAN 1. segera lalukan mulut botol/tabung ke dalam api beberapa kali dan kemudian masukkan sesuatu yang diambil dengan gelung dawai atau pipet steril dengan tangan kanan. 4. tanpa meletakkannya (lakukan prosedur ini berdekatan dengan api penunu Bunsen). iaitu mensterilkan mulut botol/tabung sambil menghindari daripada berlakunya pencemaran udara dan mengambil inokulum daripada sejenis media kultur ataupun memasukkan inokulum ke dalam media. Jadi udara di persekitaran api akan terbawa arus ini ke atas dan akan mencegah partikel kecil seperti debu dan sebagainya daripada mendap di kawasan persekitaran ini. Sentiasalah memegang objek supaya parasnya lebih rendah daripada paras tangan untuk mengelak daripada alkohol yang sedang terbakar mengalir ke tangan dan mengakibatkan kebakaran pada diri sendiri. Letakkan balang berisi alkohol berjauhan daripada api penunu Bunsen untuk mengelak daripada disambar api tersebut. PERINGATAN Amalkan prosedur ini setiap kali anda melakukan penginokulasian supaya pencemaran khususnya dari udara di sekitar kita dapat dihindari. Dengan demikian. ia dapat mengelak daripada berlakunya pencemaran dari udara disebabkan partikel-partikel yang kecil apatah lagi spora fungus dan bakteria yang biasanya terapung atau berterbangan akan bergerak ke atas menurut arus dan tidak akan terjatuh ke dalam mana-mana media yang terdedah di bawahnya berdekatan dengan api. ATAU dengan peralatan yang sama keluarkan sesuatu bahan (misalnya kultur) daripada botol/tabung berkenaan. 3. Lalukan semula mulut botol/tabung ke dalam api beberapa kali sebelum botol/tabung tersebut ditutup. Pada prinsipnya. Teknik ini membolehkan anda melakukan dua perkara secara serentak dengan kedua-dua tangan. 5. Mata gunting mestilah dalam keadaan terbuka semasa proses pensterilan supaya bahagian tajamnya terdedah kepada alkohol dan pembakaran. 2. Jauhkan objek daripada api penunu Bunsen dan biarkan sehingga api pembakaran alkohol tersebut padam dengan sendirinya. 2. Dengan tangan kiri. 2. Tanggalkan penutup botol/tabung tersebut dengan jari kelengkeng kanan dan pegang terus penutup ini dengan jari berkenaan. 3. Berdasarkan konsep ini. 2. bekerja berdekatan dengan api ini amat digalakkan dan seharusnyalah menjadi amalan di bidang mikrobiologi. NOTA 1. Longgarkan dahulu penutup botol/tabung yang ketat dengan tangan kanan. Peganglah botol/tabung di bahagian dasarnya (iaitu agak berjauhan daripada mulut botol/ tabung) dengan tangan kiri. Oleh itu.5. untuk melaksanakan pengambilan inokulum dari spesimen tertentu atau penginokulasian sesuatu media. NOTA 1. Tatacara Mengeluarkan dan Memasukkan Bahan daripada Botol yang Tertutup 1. iaitu arus udara yang bergerak ke atas disebabkan haba dari api tersebut. Bahan kaca seperti slaid atau penutupnya akan pecah sekiranya dibiarkan dalam api pembakar terlalu lama. api penunu Bunsen menghasilkan arus perolakan.

Putarkan pula tombol pengatur fokus halus untuk mendapatkan imej objek yang tajam dan terang.2. Pusingkan tombol pengatur fokus kasar perlahan-lahan supaya objektif bergerak ke atas sehingga anda dapat melihat dan memfokus sesuatu pada slaid. 9. Kanta okular (mata) biasanya mempunyai kuasa pembesaran 10X. Walau bagaimanapun. struktur dan saiznya amat sukar dipastikan. Putarkan objektif (40X) supaya berada tepat di atas apusan. kuasa sederhana (40-45X) dan kuasa tinggi (100X) atau rendaman minyak (kuasa yang paling tinggi). 2. 4. Pusingkan tombol pengatur fokus halus perlahan-lahan supaya objektif bergerak ke atas sehingga dapat memfokus sesuatu objek pada slaid. MIKROSKOP CAHAYA DALAM MIKROBIOLOGI Antara teknik asas makmal yang seharusnya diketahui oleh seseorang penuntut mikrobiologi ialah pengamatan ke atas mikrooganisma serta sel-sel yang terinfeksi mikroorganisma dengan menggunakan mikroskop.1).2 mikron (µm) atau 200 nm kerana ini adalah had yang ditentukan oleh gelombang cahaya yang dapat dilihat. Turunkan objektif dengan memutarkan tombol pengatur fokus kasar sehingga jarak objektif berada kira-kira 1 mm di atas slaid. 4. Cahaya menjadi tertumpu dengan intensiti yang meningkat dan akan memberikan resolusi yang tinggi. Kemudian. Sungguhpun kini terdapat pelbagai jenis mikroskop. Ulangi prosedur di atas dengan kanta objektif rendaman minyak (100X). peringkat yang paling halus sekali yang boleh kita lihat (kuasa resolusi) adalah 0. 8. 3. 2. Sebaliknya. 7. 14 . Spesimen dihubungkan secara fizikal dengan kanta rendaman minyak melalui minyak rendaman. Keadaan ini memberikan imej yang lebih terang kerana cahaya yang melalui slaid mikroskop dan terkena pada spesimen yang sedang diamati tidak dibiaskan dan oleh yang demikian disalurkan ke dalam kanta rendaman minyak sebab indeks refraktif kaca dan minyak rendaman adalah hampir sama. letakkan satu titis minyak rendaman di dalam lingkaran apusan pada slaid. jika ruang antara spesimen dan kanta adalah udara. Sebenarnya. sebahagian besar daripada cahaya akan dibiaskan disebabkan perbezaan indeks refraktif yang besar antara kaca dan udara. Letakkan slaid di atas pentas/dataran mikroskop dengan apusan di sebelah atas. 2. 6. resolusi mikroskop cahaya biasa ialah 300 nm. kuasa resolusi 200 nm ini adalah dalam keadaan optimum dan sungguhpun objek boleh ‘diamati’.1. Jumlah kuasa pembesaran adalah kuasa pembesaran objektif darab kuasa pembesaran kanta okula. cahaya yang dibiaskan pasti tidak akan masuk ke dalam kanta. 10. Dengan menggunakan cahaya biasa untuk memancarkan imej objek. Tukarkan kepada kanta objektif (100X) dan turunkannya sehingga hampir-hampir menyentuh permukaan slaid. Amatilah apusan melalui kanta okular (mata). yang lazim dan paling sering digunakan ialah mikroskop cahaya jenis kompaun iaitu mempunyai dua set kanta (Rajah 2. 5. Mikroskop makmal yang biasa mempunyai sekurang-kurangnya tiga kanta objektif: objektif kuasa rendah (pembesaran 10X). Oleh yang demikian. Mikroskop cahaya Slaid apusan bakteria yang telah diwarnai Minyak rendaman Kertas/tisu kanta TATACARA 1. 3. TATACARA MIKROSKOP CAHAYA Tatacara Menggunakan Mikroskop Cahaya Biasa BAHAN 1. Sebelum memulakannya terlebih dahulu naikkan kanta objektif (100X) sehingga ke had maksimum. Amatilah apusan melalui kanta okular.

putarkan tombol fokus halus perlahan-lahan supaya objektif bergerak ke atas sehingga anda dapat memfokus dan meneliti morfologi sel bakteria dengan jelas. atau minyak rendaman yang diletakkan di atas apusan tidak mencukupi. Lapkan minyak rendaman daripada objektif dengan kertas kanta kering atau dibasahi dengan sedikit xilena diikuti dengan kertas kanta kering yang bersih lainnya sejurus selepas setiap kali anda selesai melakukan pengamatan minyak rendaman. Adalah suatu amalan yang baik jika dalam melaksanakan pemfokusan ke atas sesuatu objek.1 Komponen-komponen mikroskop cahaya 15 .11. 14. atau slaid melekat kepada kanta objektif dan turut bergerak ke atas semasa kanta digerakkan (masalah ini boleh diatasi dengan menekan slaid dengan satu jari semasa objektif digerakkan). Sambil mengamati melalui kanta okular. pastikan terlebih dahulu apusan pada permukaan slaid berada di sebelah atas atau slaid tidak diletakkan dalam keadaan terbalik. Jika spesimen masih tidak kelihatan dengan kanta rendaman minyak ada kemungkinan spesimen tidak dapat difokus kerana tombol pengatur objektif mikroskop diputarkan terlalu cepat. 3. objektif dapat diturunkan sehingga boleh melampaui paras pentas mikroskop dan apabila ini berlaku semasa pemfokusan besar kemungkinan penghujung objektif akan menekan ke atas slaid dan boleh menyebabkan slaid pecah. atau mungkin juga slaid dalam keadaan terbalik dan apusan berada di sebelah bawah. Tiub binokular Bahagian mata (eye piece) Bahagian mercu yang berputar Objektif Pentas Kondenser Tombol pengatur fokus Lampu Pentas mikroskop RAJAH 2. 12. Ini kerana dalam sesetengah jenis/jenama mikroskop. Turunkan objektif semula sehingga terendam di dalam minyak rendaman dan hampir-hampir menyentuh slaid. Sebelum melakukan pengamatan. gerakkan objektif ke atas menjauhi slaid. 2. 13. yang digerakkan adalah objektif mikroskop daripada permukaan slaid ke arah atas dan bukan sebaliknya. Setelah selesai pengamatan. NOTA 1.

atau tisu tandas atau sapu tangan untuk membersihkan permukaan kanta hanya akan mengakibatkan calar ke atas kanta dan ini akan mempersulitkan pengamatan seterusnya. Cara yang mudah dan baik untuk mengatasi hal ini adalah dengan menyimpan mikroskop di dalam bilik atau ruangan tertutup yang dilengkapi dengan alat penyahlembap (dehumidifier) yang akan mempastikan suasana udara di dalam bilik atau ruangan tersebut sentiasa kering. Jika minyak rendaman pada kanta rendaman minyak tidak dilap dengan baik. Terdapat jenama mikroskop yang kantanya dilapisi dengan bahan kimia untuk mencegah masalah ini. tetapi perlindungan ini. dipercayai tidak berkekalan. Penggunaan kertas tisu lain seperti kertas tisu muka. 16 . Ia perlu dirawat secara berterusan khususnya dengan menyalutkan semula bahan kimia berkenaan pada waktu tertentu. 5. lambat-laun debu akan melekat dan menutupi kanta tersebut dan akan menyebabkan pengamatan kabur serta menimbulkan kesulitan.4. Tatacara Penjagaan Mikroskop Cahaya Iklim di Malaysia adalah lembap dan keadaan ini menggalakkan pertumbuhan fungus pada permukaan kanta mikroskop.

misalnya untuk menentukan pergerakannya (motiliti).1. 3. 5. Sentuhkan gelung dawai steril kepada 1 koloni bakteria pada plat kultar. 3.1. Letakkan 1 gelung penuh kultur cecair bakteria (yang agak keruh atau tebal) ke atas slaid mikroskop. 5. Pengamatan motiliti bakteria di dalam suspensi cairan digunakan khusus untuk bakteria yang dikulturkan dalam media broth kerana tidak dapat tumbuh dengan baik pada media padat (agar). Walau bagaimanapun. Letakkan lingkaran tersebut di atas penutup slaid supaya titisan suspensi berada tepat di tengahtengah lingkaran plastisin dan tekan sedikit supaya lingkaran ini melekat kepada penutup slaid. PENGAMATAN PERGERAKAN BAKTERIA DI DALAM SUSPENSI CAIRAN Bakteria dalam keadaan semulajadi susah untuk diamati dengan mikroskop cahaya kerana bersifat transparen atau tidak mempunyai warna. Kultur bakteria (dalam botol media broth atau plat kultur) Slaid mikroskop Penutup slaid Botol larutan salin (steril) TATACARA 1. Tatacara Pelekapan Titisan Tergantung BAHAN 1.1. 2. Tatacara Pelekapan Basah Bakteria BAHAN 1. PENGAMATAN MIKROB PENGAMATAN BAKTERIA 3. 4. 2. pengamatan dalam keadaan seperti ini terpaksa dilakukan juga. 4b. 4. Sekiranya menggunakan kultur broth tukarkan langkah 4 kepada berikut: 4a. 3. Kultur bakteria (dalam botol media broth atau plat kultur) Slaid mikroskop Penutup slaid Plastisin Botol larutan salin (steril) TATACARA 1. Dalam hal ini terdapat dua tatacara yang boleh digunakan. Letakkan sekeping penutup slaid di atas suspensi bakteria seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3. 4. 2. 6.3. 17 . iaitu pelekapan basah dan titisan tergantung. Buatkan suspensi bakteria dari gelung dawai di dalam titisan salin di atas. 2. Buatkan 1 lingkaran/cincin plastisin berukuran tidak melebihi luas penutup slaid. Sterilkan gelung dawai melalui kaedah pembakaran dan biarkannya sehingga sejuk. Sterilkan gelung dawai melalui kaedah pembakaran dan biarkannya sehingga sejuk. Sediakan 1 titis suspensi bakteria di tengah-tengah sebuah penutup slaid mengikut tatacara pelekapan basah. Letakkan setitis kecil salin steril di atas sekeping slaid mikroskop bersih. 3.1. 3. Amati pergerakan bakteria dengan kanta objektif 40X.

Ini membolehkan sel bakteria kelihatan lebih jelas dan pergerakannya dapat diamati dengan mudah. 3. Amati pergerakan bakteria dengan kanta objektif 40X. Ini adalah untuk mengelak daripada suspensi bakteria mengalami gegaran goncangan yang akan menyulitkan pengamatan. atau berlakunya 18 . 6.1 Tatacara melakukan pelekapan basah Rajah muka surat 18 4. partikel (termasuk bakteria) bergerak perlahan-lahan secara bolak-balik (to and fro) tanpa arah tertentu. 1. atau disebabkan mikroskop tergoncang. Letakkan sebuah penutup slaid mikroskop dan dengan berhati-hati lekapkan di atas suspensi bakteria (usahakan supaya tidak terbentuk gelembung udara). 5. RAJAH 3. 2. Intensiti cahaya perlu dikurangkan dengan menurunkan kondenser dan mengecilkan diafragma untuk memberikan kontras yang secukupnya. Semasa melakukan pengamatan jangan letakkan tangan di atas meja ataupun menekan meja di mana mikroskop berada.Letakkan setitis larutan salin di atas slaid mikroskop bersih dan sentuh 1 koloni bakteria dengan gelung dawai dan buatkan suspensi. Angkat dan terbalikkan slaid mikroskop dengan cepat supaya penutup slaid berada di atas dan suspensi bakteria menjadi tergantung. Kadangkala kesemua partikel bergerak ke satu arah menurut aliran cecair. Dalam pergerakan Brown. NOTA Letakkan sebuah slaid mikroskop yang bersih di atas lingkaran plastisin dan tekan sedikit supaya ia melekat kepada plastisin. Amatilah pelekapan basah ini di bawah kanta objektif pembesaran 40X.

atau buatkan suspensi bakteria di atasnya. disarankan agar kultur cecair digunakan. Letakkan kaca penutup slaid di atas permukaan yang bersih dan titiskan. Dengan berhati-hati sekali angkat dan terbalikkan slaid mikroskop dengan cepat. atau partikel individu bergerak dengan pantas menuju ke sesuatu arah tertentu. Kemudian letakkan sebuah slaid mikroskop yang bersih di atas plastisin dan tekan sedikit supaya melekat kepada plastisin. yakni 22°C atau 25°C. Oleh yang demikian. dalam hal ini. untuk melakukan ujian motiliti. RAJAH 3. Kebanyakan spesies yang diambil daripada kultur padat sering memberikan hasil yang negatif untuk motiliti (memperlihatkan tidak motil). penyejatan dari sisi kaca penutup.4. Pengeraman optimum yang biasanya digunakan. Dengan demikian suatu suspensi bakteria yang tergantung akan dihasilkan. adalah kira-kira 2 jam dan bagi kebanyakan bakteria. Dengan hati-hati letakkan cincin plastisin melingkari suspensi tanpa menyentuhnya. Motiliti sebenarnya ditunjukkan dengan gerakan yang aktif bercorak putaran.2 Tatacara melakukan pelekapan titisan tergantung 19 . Kelebihan tatacara ini daripada tatacara pelekapan basah adalah perubahan rupa bentuk (distortion) bakteria dikurangkan kerana tidak ditindih oleh penutup kaca. suhu pengeramannya adalah di bawah 37°C. 5.

TATACARA 1. 4.85% (steril) TATACARA 1. 3. 4.5%. 2. 2. PERHATIAN 1. PERHATIAN Pastikan balang slaid tidak diletak berhampiran penunu Bunsen atau sebarang sumber api kerana alkohol mudah terbakar. 7.1. PENYEDIAAN UNTUK PEWARNAAN BAKTERIA Tatacara Membersihkan dan Menyimpan Slaid Mikroskop BAHAN 1. Lakukan di dalam kabinet asap. Letakkan slaid di atas kertas penyerap dan biarkan sehingga sejuk. 2. Jangan pegang slaid yang dibakar dengan forseps secara tegak untuk mengelak kemungkinan alkohol mengalir ke atas tangan dan menyebabkan kebakaran.3. Pegang slaid supaya aras tangan berada lebih tinggi daripada slaid. Simpan di dalam balang tertutup yang mengandungi metanol 95%. Slaid mikroskop yang disimpan di dalam metanol 95% di dalam bekas yang tertutup Forseps Kertas turas Penunu Bunsen Gelung dawai Pensil gris/pena tanda (marker) kalis air Kultur bakteria Larutan salin 0. Campurkan 5 ml asid hidroklorik pekat kepada 1 liter etanol 70%. 2. 6. 4. 3. 3. Cuci dengan air suling. Slaid mikroskop Etanol 70% Metanol 95% Asid hidroklorik pekat PERSEDIAAN REAGEN Alkohol asid 0. Keluarkan slaid mikroskop yang disimpan di dalam bekas yang mengandungi alkohol dengan menggunakan sebuah forseps bersih. 3. Tatacara Membuat Apusan Bakteria BAHAN 1. Hapuskan alkohol dengan membakarnya dengan api penunu Bunsen. 8. 2.2. Rendam slaid kaca di dalam alkohol asid semalaman. Jauhkan bekas slaid yang mengandungi alkohol daripada api. 20 . 5.

Sebarkan suspensi bakteria sehingga membentuk bulatan seluas kira-kira 1 – 2 cm garis pusat. 2. Sentuh 1 koloni bakteria yang terasing dengan gelung dawai.5 x 2. Biarkan supaya kering di udara. Sterilkan gelung dawai. 3. 2. 5. Urin dan cecair serebrospina 1. Swab yang mengandungi spesimen klinikal Letakkan setitis kecil salin steril di atas sebuah slaid dan emulsifikasikan spesimen dari swab di dalam titisan salin ini. Tuangkan supernatan dan masukkan beberapa titis salin steril ke dalam tiub emparan ini. 4. 8. 2. 6.5 cm. Letakkan setitis kecil salin steril di atas sebuah slaid.5 x 2. 5. 3.Kultur bakteria dari broth 1. Sebarkan sehingga membentuk bulatan seluas kira-kira 1 cm garis pusat. Buat apusan dengan suspensi bakteria yang diperolehi. 4. 3. 7. Nanah dan eksudat Ambil 1 gelung penuh spesimen dan sebarkannya di atas slaid supaya mencapai seluas 1. Kahak (sputum) Pindahkan sedikit kahak dari bekas spesimen dengan swab steril ke atas sebuah slaid bersih dan sebarkan seluas 1. Gunakan setitis suspensi sahaja supaya apusan cepat kering. Jika tidak. Buatkan suspensi bakteria daripada gelung dawai di dalam titisan salin. Tandakan sudut kiri atas slaid dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. Terbalikkan slaid dan buatkan lingkaran di sekeliling kawasan apusan dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. 1. Kultur bakteria dari media padat (agar) 1. Suspensi bakteria harus disebarkan dengan baik supaya menghasilkan apusan yang sama rata. Sterilkan gelung dawai. Letakkan setitis kecil salin steril di atas sebuah slaid bersih.5 cm. sel-sel bakteria akan kelihatan tersusun terlalu rapat dan padat sehingga sukar untuk menentukan morfologinya. 2. Kacau. Gunakan sedikit kultur bakteria supaya apusan yang disediakan membentuk filem yang agak tipis. sel bakteria berada dalam keadaan berkelompok dan kemungkinan pewarnaan yang didapati juga tidak sama rata dan morfologi sel individu sukar untuk ditentukan.000 g selama 10 minit pada suhu bilik. Letakkan 1 gelung penuh kultur cecair di atas sebuah slaid bersih. Pada apusan yang terlalu tebal. Terbalikkan slaid dan buatkan lingkaran di sekeliling kawasan apusan dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. 4. Tandakan sudut kiri atas slaid dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. Biarkan sehingga kering di udara. 21 . 3. 6. NOTA Emparkan urin dan cecair serebrospina pada tekanan emparan 10.

di sekeliling kawasan apusan (di sebelah bawah slaid) dilingkari dengan pensil gris atau pena tanda kalis air supaya tapak di mana terdapatnya apusan mudah dikesan untuk diletak tepat di bawah kanta objektif serta untuk meletakkan titisan minyak rendaman. Dengan cepat sentuhkan slaid ke atas tapak tangan. Sebelum bakteria diwarnai. 5. Melalukan slaid dengan cepat ke dalam api penunu Bunsen sebanyak 3 kali adalah mencukupi bagi tujuan pemfiksasian. Ini selain mempastikan slaid tidak terlalu panas. 22 . juga akan menghilangkan haba dari slaid. 4. ia terlebih dahulu difiksasi. Adalah lumrah jika di dalam kelas amali terdapat pelajar yang memegang slaid dengan forseps dan memasukkannya ke dalam api penunu Bunsen dengan tujuan untuk mengeringkan dan sekaligus memfiksasi apusan.4. fiksasi juga boleh membunuh bakteria. pastikan bahawa permukaan slaid mikroskop yang mengandungi apusan berada di sebelah atas menghadap kanta objektif. Dalam pengamatan ke atas sesuatu apusan dengan mikroskop. Akibatnya pewarnaan yang diusahakan akan sia-sia sahaja. Ulangi prosedur ini sebanyak 3 kali (kesemuanya). tetapi juga untuk mengekalkan (mengawet) struktur sel bakteria tersebut serta meningkatkan daya penglihatan ke atasnya. Fiksasi boleh dilakukan dengan cara fizikal (haba. 3. Pemanasan yang berlebihan akan menyebabkan perubahan besar dalam bentuk sel bakteria atau sel bakteria menjadi pecah dan mengalami kerosakan. sebab tidak akan memberikan hasil seperti yang diharapkan dan sebaliknya apa yang diperoleh ialah suatu keadaan yang dikenal sebagai artifak. Lalukan slaid sekali dengan cepat ke dalam api penunu Bunsen. Fiksasi Bakteria dengan Haba Sebarang proses yang membeku serta memejalkan sel bakteria dan strukturnya dikenali sebagai fiksasi. 2. 5. NOTA Pegang salah satu penghujung slaid dengan ibu jari dan jari telunjuk dengan apusan di sebelah atas. 2. Proses ini tidaklah semata-mata bertujuan untuk melekatkan sel bakteria kepada slaid. pembunuhan bakteria adalah penting dalam pewarnaan kerana pada umumnya bakteria yang masih hidup sering bersifat kurang telap terhadap kebanyakan pewarna yang digunakan. Lazimnya. Justeru. Amalan ini tidak digalakkan kerana dengan cara demikian adalah sukar untuk menentukan sama ada fiksasi tercapai atau apusan telah terdedah kepada haba terlalu lama. Permukaan slaid di mana terdapatnya apusan ini dapat dipastikan dengan tanda pensil gris yang dapat dikikis atau pena tanda kalis air pada permukaan bawah slaid. Tatacara Memfiksasi Bakteria dengan Haba BAHAN 1. Cara yang popular memfiksasi bakteria adalah dengan menggunakan haba dari suatu sumber api. Biarkan slaid dingin di udara. biarkan apusan sehingga benar-benar kering sebelum melakukan fiksasi. Pemanasan ke atas apusan yang basah dipercayai boleh mengakibatkan perubahan rupa (distortion) morfologi bakteria yang ketara. Sebaik-baiknya. 3. Sekiranya slaid dirasakan terlalu panas pada tapak tangan maka besar kemungkinan sel bakteria pada apusan telah mengalami kehancuran atau telah berlaku artifak. Slaid disentuhkan ke atas tapak tangan selepas setiap kali pemanasan. 2. 1. dehidrasi) dan cara kimia. Di samping kebaikan dari segi kesihatan. Apusan bakteria ke atas slaid mikroskop Penunu Bunsen TATACARA 1.

tatacara pewarnaan perbezaan yang menggunakan dua atau lebih pewarna digunakan. Pewarna yang digunakan. berasal daripada terbitan garam asid bebas kerana bentuk ini lebih larut.3. Pada umumnya dalam pewarnaan ini. cas yang negatif ini akan bertindak dengan ion positif pewarna bes. Apabila sel bakteria diwarnakan dengan satu jenis pewarna sahaja. Tindakan aksentuator ini tidak melibatkan pergabungannya dengan pewarna seperti yang berlaku pada mordan. Apabila diwarnakan dengan pewarna bes. ciri pewarnaan bergantung kepada kationnya (ion positif).1. Dalam tatacara pewarnaan Gram. perbezaan indeks biasan yang kecil antara komponen-komponen sel bakteria juga menyulitkan substruktur bakteria untuk dilihat. Sebagai langkah untuk mengatasi masalah ini perbezaan warna digunakan untuk memudahkan melihat keseluruhan sel bakteria dan juga untuk mempamerkan substruktur bakteria dan segala-galanya mengenai bakteria dengan lebih terperinci. Pada pewarna asid. Mordan adalah bahan kimia yang membolehkan sesuatu pewarna mewarnakan sesuatu bahan. kristal ungu) kerana protoplasma bakteria mempunyai kandungan asid nukleik bercas negatif yang tinggi. Dalam pewarnaan negatif. Di samping membolehkan bakteria dilihat dengan lebih mudah. satu filem pewarna gelap meliputi ruang dan celah di antara bakteria-bakteria (latar belakang) dan bakteria tidak diwarnakan. pewarnaan ini disebut pewarnaan sederhana (simple staining). Sebaliknya cas negatif ini akan menolak pewarna asid. maka jurang perbezaan optikalnya juga adalah sedemikian. ciri pewarnaan adalah bergantung kepada anion (ion negatif) dan pada pewarna bes. Keadaan ini mengakibatkan sel bakteria sukar untuk diamati. Pewarnaan yang diterangkan setakat ini dikenal sebagai pewarnaan positif kerana yang diwarnakan ialah bakteria. pewarnaan ini juga digunakan untuk menggolongkan bakteria. Tambahan pula. pewarna digunakan secara berlebihan dan kemudian agen penghapus warna atau pembeza digunakan untuk 23 . Intensiti pewarnaan boleh dipertingkatkan (ataupun supaya sasaran dapat diwarnakan) dengan menggunakan haba dalam keadaan tertentu atau menggunakan bahan kimia (aksentuator) seperti asid asetik. Pewarna dan Jenis Pewarnaan Bahan pewarna boleh dibahagikan kepada dua golongan: pewarna asid dan pewarna bes. Perlu disedari bahawa ciri-ciri pewarnaan bakteria (serta morfologi) dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti umur kultur dan sumber bakteria.3. Untuk menunjukkan perbezaan yang wujud di kalangan sel bakteria tertentu. Pewarnaan juga digunakan untuk menunjukkan taburan dan jenis kimia berbagai-bagai komponen sel serta membezakan antara golongan-golongan bakteria. dengan demikian hanya latar belakang (kawasan di luar bakteria) sahaja yang diwarnai. Pewarnaan Gram Pewarnaan Gram adalah tatacara pewarnaan utama di bidang bakteriologi. PEWARNAAN BAKTERIA Oleh kerana perbezaan indeks biasan antara bakteria dan kawasan sekelilingnya tidak besar. umumnya. atau mordan mempertingkatkan afiniti ataupun kecenderungan pewarna terhadap struktur tertentu. metilena biru. iaitu sama ada berasal daripada spesimen klinikal atau dari kultur pertumbuhan. Bakteria menunjukkan kecenderungan atau afiniti yang kuat terhadap pewarna bes (contoh: safranin. mampu menyusup masuk ke dalam sel dengan lebih baik dan pewarnaannya lebih kekal. fenol atau anilin. keseluruhan sel bakteria diwarnakan secara sama rata dan substruktur atau komponen-komponen selnya tidak dibezakan.

Kemudian liputi apusan dengan safranin atau karbol fuksin cair selama 30 saat. keringkan di udara dan fiksasi apusan tersebut. Sel bakteria berwarna merah/merah jambu: Gram-negatif. 8. Hasil tindak balas pewarnaan Gram adalah bergantung kepada komposisi dinding sel bakteria yang berkemampuan untuk mengikat pewarna pertama atau tidak. Liputi apusan dengan kristal ungu selama 1 minit. Tatacara Pewarnaan Gram BAHAN 1. Dalam kebanyakan spesies bakteria. NOTA 1. Bacillus subtilis). Kultur tua bakteria Gram-positif memberikan reaksi Gram tak tetap (Gram variable) – ada sel yang terwarna biru dan ada yang terwarna merah bercampur di antara satu dengan lainnya. 3. Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas penyerap (lipat kertas turas/penyerap. Protoplasma bakteria. 4. Ada juga bakteria Gram-positif seperti Corynebacterium yang mudah kehilangan warna pertamanya dan seringkali kelihatan sebagai Gram-negatif.menghilangkan pewarna berkenaan. Bakteria yang mengekalkan pewarna pertama (kristal ungu) disebut sebagai Gram-positif. Pada beberapa spesies basilus aerobik yang menghasilkan spora (contoh. Kultur bakteria Kristal ungu Iodin Lugol Aseton-alkohol Safranin/karbol fuksin Kertas turas Tatacara 1. Buat apusan bakteria pada slaid mikroskop. Cuci dengan air. Nota: peringkat No. Segera cuci dengan air. 2. 3. 5. kemudian singkirkan keseluruhan air tersebut. dalam hal ini. 8 = cuci & keringkan Pengamatan dan Pentafsiran Sel bakteria berwarna biru: Gram-positif. 6. Larutan iodin Lugol yang digunakan berfungsi sebagai mordan dan pelarut organik seperti alkohol dan aseton digunakan sebagai pembeza atau pengnyahwarna. 2. kemudian buangkan. 4. 5. 7. Pewarna yang digunakan untuk menggantikan pewarna pertama yang dihilangkan oleh pembeza disebut pewarna balas (counter stain). Liputi pula apusan dengan iodin Lugol selama 1 minit. 2. 6. sentiasa memberikan tindak balas Gram-negatif. Pegang slaid di dalam sinki secara condong dan titiskan dengan cepat aseton-alkohol ke atas apusan sehingga tiada warna biru (kristal ungu) terlihat keluar dari apusan (lebih kurang 3-10 saat bergantung kepada ketebalan apusan). 24 . masukkan slaid ke dalam lipatan dan tekan kertas dari luar sehingga semua air terserap daripada slaid tanpa menggosok permukaan slaid atau apusan). sel vegetatifnya akan terwarna Gram-negatif atau granul-granul di dalam sel diwarnakan Grampositif selama beberapa generasi selepas spora bergerminasi. manakala yang kehilangan pewarna ini dan diwarnai dengan pewarna kedua dinyatakan sebagai Gram-negatif. reaksi Gram berubah dengan umur kultur.

Sel bakteria berwarna biru kehijauan: bakteria tak tahan asid. Cuci dengan air. pewarna berkenaan kekal di dalam sel. Biarkan sejuk dan cuci dengan air. 8. pewarna fenol mempunyai kelarutan yang tinggi di dalam sel dibandingkan dengan pembeza (penghilang warna). kadar resap pewarna pada sel yang tahan asid adalah rendah berbanding dengan sel tak tahan asid. apabila bakteria yang telah diwarnakan didedahkan kepada penghilang warna. Liputi pula apusan dengan metilena biru selama 30 saat. Sebaliknya boleh juga dengan menggunakan sebatang kaca yang salah satu penghujungnya 25 . Oleh yang demikian. Sifat tahan asid ini merupakan ciri yang berfaedah dan penting dalam membezakan mikobakteria dengan bakteria lain. 7. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Sel bakteria berwarna merah: bakteria tahan asid. 5. 6. Panaskan slaid dengan api pembakaran kain gauz yang dibasahi dengan alkohol. NOTA 1. Buat apusan bakteria pada slaid mikroskop.Pewarnaan Ziehl-Neelsen (Pewarnaan Tahan Asid) Mikobakteria yang diwarnakan dengan pewarna fenilmetana (contoh: fuksin bes) dalam larutan anilin atau fenol akan mengekalkan warna tersebut meskipun telah didedahkan kepada asid yang kuat berbanding dengan bakteria jenis lain. Cuci dan keringkan dengan kertas penyerap. (Beberapa spesies aktinomiset juga tahan asid). alkohol dan asid lemak (seperti asid mikolik) yang tersendiri. Oleh yang demikian. manakala pada bakteria tak tahan asid pewarna tersebut akan hanya masuk ke dalam sel dan kemudian disingkirkan daripada sel oleh penghilang warna. 3. (Pastikan pewarna tidak mendidih atau menjadi kering). Kultur bakteria Karbol fuksin Ziehl-Neelsen Alkohol asid Metilena biru Alkohol Sebatang kaca yang satu penghujungnya dibalut kain kasa (gauz) Kertas turas Penunu Bunsen TATACARA 1. 4. 2. Di samping ciri-ciri ini. dalam tatacara ini slaid perlu dipanaskan sehingga wap keluar kerana. Tatacara Pewarnaan Ziehl-Neelsen BAHAN 1. Pemanasan dilakukan dari bahagian bawah slaid (apusan di permukaan atas) yang diletakkan di atas rak pewarnaan iaitu dengan menggunakan api kecil penunu Bunsen. keringkan di udara dan fiksasikan apusan tersebut. haba digunakan untuk membolehkan pewarnaan terlaksana dalam jangka masa yang munasabah. Pada bakteria tahan asid. Tambahkan alkohol-asid (penghilang warna) selama 25-30 saat. 5. 4. Oleh yang demikian. bakteria golongan pertama ini disebut sebagai bakteria tahan asid. 6. 3. Banjirkan apusan dengan pewarna karbol fuksin Ziehl-Neelsen. 8. 2. Ciri-ciri ini disebabkan oleh perbezaan komposisi kimia (secara kuantitatif dan kualitatif) bakteria tahan asid dan bakteria tak tahan asid. 7. dalam hal ini. Mikobakteria yang tahan asid mempunyai karbohidrat. Lakukan ini sehingga keluar wap dari apusan selama 5-10 minit.

dibalut dengan kain yang dicelup di dalam alkohol dan kemudian dinyalakan. Dalam keadaan ini. Pewarnaan Schaeffer-Fulton (Pewarnaan Spora) Bakteria Genus Bacillus dan Clostridium dicirikan dengan kehadiran struktur bulat atau bujur yang dinamakan spora (atau endospora). 3. 4. Toluidina biru adalah pewarna metakromatik: apabila pewarna ini masuk ke dalam kompleks granul volutin yang besar. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Butir-butir berwarna biru kehitaman di dalam sitoplasma bakteria yang berwarna hijau: Kehadiran granul metakromatik. Pemanasan meningkatkan ketelapan dinding spora sehingga pewarna malakit hijau dapat dengan mudah masuk dan mewarnai struktur ini. Tetapi jika metilena biru digunakan. keringkan dan fiksasikannya. 3. pendedahan metilena biru kepada udara menyebabkan sebahagian kecil daripada pewarna ini dioksidasi menjadi metilena ungu pada pH tinggi dan metilena ungu secara selektif mewarnakan volutin tersebut. 2. Jika spesimen klinikal digunakan. volutin ini mengubahkan spektrum serapan (absorption) toluidina biru supaya pada mata kasar pewarna ini kelihatan telah berubah warnanya dari biru kepada biru kehitaman. Elakkan daripada memanaskan slaid dan pewarna dengan memegang slaid dengan forseps dan memasukkannya langsung ke dalam api penunu Bunsen. Semasa pendinginan/pencucian pewarna terperangkap di dalamnya. sedangkan pada sel 26 . Volutin ini terdiri daripada polimetafosfat yang mempunyai berat molekul tinggi dan dihubungkaitkan dengan bakteria genus Corynebacterium. 3. Ini adalah suatu artifak yang disebabkan oleh beberapa faktor seperti kemurnian pewarna karbol fuksin. Tapak atau kedudukan spora di dalam sel serta saiz spora berbanding dengan sel yang mengandunginya mempunyai kepentingan taksonomi. keadaan ini sebenarnya bukanlah merupakan fenomena metakromasi sungguhpun di dalam bidang bakteriologi ia dinyatakan demikian. Liputi apusan dengan pewarna Albert selama 5 minit. Keadaan ini disebabkan oleh fenomena metakromasi yang melibatkan perubahan di dalam warna sesuatu bahan. Liputi pula apusan dengan iodin Gram selama 1 minit. sel pesakit akan berwarna biru-kehijauan. komponen ini akan kelihatan berwarna biru kehitaman dan bukan biru. daya kelarutan fenol di dalam air dan kehadiran elektrolit di dalam larutan pewarna. 2. Apusan kultur bakteria Pewarna Albert Iodin Gram Kertas turas TATACARA 1. Jika diwarnai dengan toluidina biru. Buat apusan pada slaid mikroskop. Pewarnaan Albert (Pewarna Granul Metakromatik) Volutin bakteria (granul metakromatik) adalah bahan basofilik yang refraktif. granul volutin akan kelihatan merah dan bukan biru. Sitoplasma bakteria yang berwarna hijau tanpa butir-butir berwarna biru kehitaman di dalamnya: Tiada granul metakromatik.2. Kadangkala sel mikobakteria tidak terwarna sama rata dan kelihatan berjalur merah berselang-seli dengan bahagian tanpa warna atau kelihatan berbutir. Cuci dengan air. Walau bagaimanapun. Tatacara Pewarnaan Albert BAHAN 1. 5. Cuci dengan air dan keringkan. Spora bakteria hanya dapat diwarnakan jika mordan atau haba digunakan. 4.

spora akan kelihatan tanpa warna atau berwarna pudar. Butir berwarna hijau adalah spora bakteria. 2. 6. maka ia kelihatan lebih terang (di sekeliling sel). 5. iaitu suatu struktur yang menyelubungi keseluruhan sel bakteria dan sukar untuk diwarnai. Walau bagaimanapun. keringkan dan fiksasikannya. 2. 3. Cuci dengan air. 3. manakala bahagian sel vegetatif bakteria berwarna merah. Disebabkan ketumpatan kapsul lebih rendah daripada sel. Teknik ini sebenarnya tidak mewarnai sebarang struktur pada mikroorganisma. 7. Apusan kultur bakteria Malakit hijau 5% Safranin Batang kaca yang dibalut kain kasa pada salah satu penghujungnya Kertas turas Alkohol TATACARA 1. di dalam apusan akan kelihatan spora yang bebas. 27 . tatacara ini jarang digunakan kecuali untuk mengamati kapsul. tetapi granulgranul halus dakwat India hanya menghasilkan latar belakang yang gelap dalam bidang penglihatan. Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India (Pewarnaan Kapsul) Pewarnaan negatif dengan dakwat India membolehkan bakteria diamati dalam keadaan masih utuh dan tanpa perubahan rupa bentuk yang disebabkan oleh agen kimia (contoh: pewarna) dan agen fisikal (contoh: haba) serta membolehkan morfologinya ditentukan dengan cepat. Liputi apusan dengan malakit hijau 5%.vegetatif. Liputi pula apusan dengan safranin selama 30 saat. Pewarna balas memberikan warna yang kontras supaya spora dapat dikesan dengan mudah. Tatacara Pewarnaan Schaeffer-Fulton (Pewarnaan Spora) BAHAN 1. Panaskan sehingga wap keluar beberapa kali tetapi jangan sampai mendidih (tambah pewarna jika akan mengalami kekeringan). 5. Oleh kerana sebahagian daripada sel telah mengalami lisis. Biarkan selama 1 hingga 3 minit. Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas turas. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Butir-butir berwarna hijau di dalam sel bakteria yang berwarna merah ATAU butir-butir berwarna hijau bertaburan di luar sel bakteria. Jika apusan bakteria tidak dipanaskan secukupnya. 4. Buat apusan pada slaid mikroskop. 4. ia tercuci bersih. NOTA 1. Pewarna malakit hijau nampaknya merupakan pewarna terbaik untuk pewarnaan spora bakteria. 2. 6.

NOTA 1. Jika terlalu banyak dakwat digunakan bakteria mungkin tidak dapat dilihat kerana transmisi cahaya terhalang.Tatacara Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India (Pewarnaan Kapsul) BAHAN 1. Ia merupakan tatacara yang paling mudah untuk mengesan kehadiran kapsul dan sering digunakan ke atas spesies bakteria seperti Streptococcus pneumoniae. Namun demikian. 1 Larutan salin 0. Letakkan setitis kecil kultur cecair ke atas slaid mikroskop atau buatkan suspensi organisma dari sedikit pertumbuhan kultur muda mikroorganisma pada media padat di dalam setitis salin dengan menggunakan dawai inokulasi. Kurangkan cahaya mikroskop dengan menurunkan kondensernya dan amati kultur dengan objektif 40X (untuk fungus) atau objektif minyak rendaman (untuk bakteria).5 Kepingan kertas turas gred Whatman No. Sebagai pilihan lain. 5. Campurkan dengan baik satu gelung kecil dakwat India ke dalam suspensi mikroorganisma yang telah disediakan. 4. 3. 2. 6. struktur flagela serta tapaknya lebih mudah dipastikan dengan mikroskop elektron melalui pewarnaan negatif dengan asid fosfotungstik. bengkok No. ia mempunyai nilai diagnostik. 2. Kultur bakteria Forseps jenis tukang jam tangan.7 Grid mikroskop elektron yang disaluti filem Formvar Asid fosfotungstik 1.85% (steril) Tabung yang steril Gelung dawai Penunu Bunsen Alat penyimpan grid atau piring Petri yang dialas dengan kertas turas 28 .5%. 10. Kultur bakteria Larutan salin 0. 2. 5. 3. Dalam hal ini. tatacara pewarnaan flagela yang hasilnya kemudian diamati dengan mikroskop cahaya adalah sukar dilakukan. Tambahan pula. Klebsiella pneumoniae dan fungus Cryptococcus neoformans. Tutup campuran dengan penutup slaid. Tatacara Pewarnaan Negatif Flagela dengan Asid Fosfotungstik BAHAN 1.85% (steril) Penutup slaid Slaid mikroskop Dakwat India (PelicanTM atau PilotTM) TATACARA 1. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Kapsul kelihatan sebagai suatu lapisan cincin lutcahaya atau bersinar melingkari keseluruhan sel di atas latar belakang yang gelap. 8. 4. 7. 4. 2. Intensiti cahaya perlu dikurangkan untuk memberikan kontras yang lebih baik. pH 6. ia melibatkan penggunaan logam berat yang akan menyumbang kepada pencemaran alam sekitar. 3. Pewarnaan Negatif Flagela dengan Asid Fosfotungstik Pengamatan flagela bakteria dapat dilihat dengan mikroskop cahaya selepas berlakunya pewarnaan seperti pewarnaan tatacara Gray. 9. 3.

Pindahkan 1 titis suspensi bakteria ke atas grid pada permukaan yang disaluti Formvar. Sterilkan gelung dawai dan pindahkan 1 koloni bakteria ke dalam tabung. 4. Susunan sel-sel basilus: Sel tunggal Berpasangan Berantai Palisad Tak teratur 29 . 6. PENGKELASAN BENTUK DAN SUSUNAN SEL VEGETATIF BAKTERIA Bentuk Kokus Basilus Vibrio Spirilla Spiroket Berfilamen Susunan Bakteria yang membiak secara aktif mempunyai kecenderungan untuk mengekalkan susunan selnya yang menjadi ciri bakteria tersebut. 7. oleh kerana saiz bakteria lebih besar daripada virus. kuasa pembesaran yang digunakan adalah di antara 5000 – 10 000 kali ganda sahaja. 3. Ini merupakan suatu kriteria yang berfaedah dalam pengenalpastian bakteria.1.TATACARA 1. Serapkan larutan asid fosfotungstik dengan menyentuhkan pinggir grid dengan kepingan kertas turas. Biarkan 1 minit sebelum cairan diserap oleh kepingan kertas turas. 5. Pindahkan 1 ml salin ke dalam tabung. 2.4. Simpan grid di atas alat penyimpan grid atau di dalam piring Petri yang dialas dengan kertas turas. Tatacara Pengamatan Grid yang Disaluti Spesimen Bakteria Selepas Pewarnaan Negatif Tatacaranya adalah seperti pengamatan partikel virus (lihat muka surat 41-42). Berbagai-bagai susunan sel bakteria dikenali dan telah ditentukan berdasarkan perbezaan dari segi pertumbuhan serta strukturnya. Pindahkan 1 titis larutan asid fosfotungstik ke atas grid berkenaan dan biarkan 1 minit. Walau bagaimanapun. 3.

3. pengamatan fungus boleh dilakukan sama ada melalui pemeriksaan secara langsung ke atas spesimen yang diambil. 2. dan jika perlu.Susunan sel-sel kokus: Kokus tunggal Diplokokus Tetrad (berempat) Berantai Berkelompok 3. di mana pelekapan basahnya hanya terhad kepada ujian motiliti. 3. 3. Tutup dengan kaca penutup slaid. berkilat atau hijau pudar. perhitungan jumlah sel epitelium dan sel darah putih dapat dilakukan. Amati dengan objektif 10X (jumlah kuasa 100X) dan kemudian 40X (jumlah kuasa 400X). Di dalam salin. ataupun ke atas kultur dari sesuatu spesimen klinikal. Perbezaan di antara yis dengan gelembung udara dan sel darah merah: Sel yis mengandungi badan inklusi.85% Kaca penutup slaid TATACARA 1. pelekapan basah fungus berperanan penting dalam pengenalpastian fungus serta diagnosis penyakit yang disebabkan olehnya.2. Tambahkan 1 titis spesimen. 30 . 4.1. PENGAMATAN FUNGUS DI DALAM SUSPENSI CAIRAN Pelekapan basah fungus di dalam salin dilakukan dalam pengamatan secara langsung fungus. Pengamatan ke atasnya boleh dilakukan dalam bentuk pelekapan basah atau terhadap apusan fungus yang telah diwarnai.2. Beberapa pewarnaan yang digunakan dalam bidang bakteriologi juga digunakan dalam bidang mikologi sungguhpun prosedurnya disesuaikan untuk fungus. Tatacara Pelekapan Basah Salin BAHAN 1. keutuhan sel dan organisma tersebut dapat dikekalkan. PENGAMATAN FUNGUS Seperti juga bakteria. Berbeza dengan bakteria. 2. Spesimen yang disyaki mengandungi fungus Larutan salin 0. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Fungus akan kelihatan refraktil. Letakkan 1 titis salin ke atas slaid mikroskop. PERHATIAN 1.

4. 6. adalah legap dan latar belakang ini boleh menyelubungi fungus. 2. masing-masing 100X dan 400X). 3. biasanya terletak di penghujung atau perbatasan sel. 5. Untuk kuku dan kikisan kulit yang keras. Letakkan 1 titis larutan KOH di tengah slaid mikroskop. NOTA Intensiti cahaya dikurangkan. natrium sulfida 10% di dalam alkohol 20% dan larutan kalium hidroksida (KOH) atau natrium hidroksida (NaOH). Jenis larutan kalium hidroksida penjernih termasuklah natrium lauryl 5% di dalam air suling. Tatacara Pelekapan Basah Kalium Hidroksida (KOH) BAHAN 1. Perbezaan hifa dengan kristal panjang: Penghujung kristal tidak bersambung atau terputus-putus. dengan kondenser mikroskop diturunkan untuk memberikan kontras yang secukupnya. Perbezaan di antara hifa dengan benang kapas: Pinggiran atau lebar (kaliber) benang kapas tidak teratur dan serat benang sering berpilin atau kelihatan melingkari sesuatu paksi dan penghujungnya berumbai. KOH (20%) melarutkan keratin dan memudahkan pengamatan ke atas hifa fungus. Penjernihan biasanya dilakukan dengan KOH mungkin kerana bahan kimia ini mudah didapati di dalam makmal. yang mengandungi keratin. Kulit.2. Pelekapan ini tidak dipanaskan dan diamati dalam masa 20 minit. 31 . Spesimen 10-20% Kaca penutup slaid Penunu Bunsen KOH TATACARA 1. Tutup spesimen dengan kaca penutup perlahan-lahan. PERHATIAN Pelekapan KOH juga boleh digunakan untuk spesimen kahak (sputum) atau spesimen daripada vagina yang banyak mengandungi bahan mukoid. Masalah ini boleh diatasi dengan menggunakan beberapa persediaan yang boleh menghancurkan serta melarutkan keratin supaya latar belakang menjadi jernih. 3. Gliserin yang ditambah mengakibatkan pelekapan menjadi lambat kering dan menghalang presipitasi KOH. Proses penjernihan dapat dipercepatkan melalui pemanasan. 3. Mosaik fungus (artifak): Jaringan jisim yang mempunyai bentuk yang berbeza-beza dan tidak teratur. Amati dengan objektif 10X dan kemudian 40X (jumlah kuasa. 4. Tekan kaca penutup slaid. 2. Panaskan dengan api pilot penunu Bunsen sehingga pelekapan basah ini menjadi jernih tanpa pendidihan (5-20 minit). tatacara ini dapat diubahsuai dengan penambahan dimetil sulfoksida (DMSO) 40%. Pelekapan Basah Kalium Hidroksida (KOH) Spesimen kikisan kulit dan rambut diamati secara langsung untuk pengesanan fungus dalam pelekapan basah yang terdiri daripada larutan penjernih. rambut dan kuku. bentuk kristal berbeza-beza dan larut air. 4. Masukkan spesimen ke dalam titisan KOH.

jangan tersalah anggapan bahawa bahagian tepi sel (dinding sel) adalah hifa. 2. fungus lebih mudah dapat diamati jika dibiarkan 1 hingga 2 jam. Bakar jarum atau dawai apabila sudah selesai. Masukkan spesimen ke dalam titisan LCB.PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Hifa adalah dalam bentuk filamen kurus dengan bahagian tepinya sejajar dan disusun secara rawak berbanding dengan sel. 4. persediaan lactophenol cotton blue digunakan untuk membuat pelekapan basah fungus sama ada dari spesimen ataupun dari kultur untuk pengamatan mikroskop. Intensiti cahaya dikurangkan untuk memberikan kontras yang secukupnya. 7. 5. 2. 32 . 3. fenol membunuh fungus. Dalam pengamatan ke atas fungus. Tutup spesimen dengan kaca penutup dengan perlahan tanpa menekan spesimen. Dalam hal ini. Tatacara Pelekapan Basah Lactophenol Cotton Blue (LCB) BAHAN 1. 6. Penutup slaid ditekan untuk memperoleh sediaan yang tipis dan untuk mengeluarkan KOH yang berlebihan. Pelekapan Basah Lactophenol Cotton Blue (LCB) Pelekapan basah yang juga mengandungi sejenis pewarna akan memudahkan pengamatan fungus. Leraikan bahan fungus ini dengan menggunakan 2 dawai. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Miselium (dinding dan septum sel) serta struktur spora (fruiting structures) kelihatan biru tua di atas latar belakang yang berwarna pudar (muda). 6. Persediaan menjadi lebih jernih dan oleh yang demikian. gliserol mengelak pelekapan basah menjadi kering dan pewarna cotton blue diserap oleh struktur kitin fungus dan mewarnainya. Ambil sebahagian kecil bahan fungus dari kultur dengan menggunakan jarum atau dawai bengkok di atas. Titiskan 1 titis kecil LCB di tengah-tengah slaid mikroskop. 5. maka memudahkan fungus diamati. 5. 4. NOTA 1. 2. Pelekapan yang tidak jernih mungkin mengandungi artifak yang mirip dengan struktur fungus. 3. 4. 3. Spesimen fungus Slaid mikroskop Kaca penutup slaid Jarum atau dawai dengan penghujungnya dibengkokkan Lactophenol cotton blue (LCB) TATACARA 1. Jangan panaskan pelekapan KOH terlalu lama atau dengan suhu yang terlalu tinggi kerana akan terbentuk hablur KOH. Amati dengan objektif pembesaran 10X dan 40X. Asid laktik mengekalkan struktur fungus serta menjernihkan latar belakang.

Fiksasi apusan dengan haba. Oleh yang demikian. Struktur fungus lebih mudah dilihat jika pelekapan ini dibiarkan selama kira-kira 10 minit. 7.2. muka surat 23-24). 4. Aktinomiset adalah golongan bakteria yang hampir menyerupai fungus dan secara tradisional dirangkumkan ke dalam bidang mikologi. 4. Pewarna tahan asid yang digunakan untuk mikobakteria mungkin menyahwarnakan pewarna secara berlebihan ke atas spesies ini dan memberikan hasil yang negatif palsu. 5. 7. Hilangkan pewarna dengan asid sulfurik 1% sehingga tiada lagi pewarna yang keluar. negatif. 2. PEWARNAAN FUNGUS 3. 3. Cuci dengan air. Kultur fungus (kontrol kultur positif. 2. 2.2. 3. kultur yang diuji) Karbol fuksin Kinyoun Etanol 50% Asid sulfurik 1% Metilena biru 2. 6.5% di dalam etanol 95% Kertas turas Penunu Bunsen TATACARA 1. Tatacara Pewarnaan Gram Tatacara tersebut adalah seperti yang dilakukan untuk bakteria (lihat pewarnaan Gram. Banjiri dengan etanol 50% sehingga tiada lagi pewarna yang keluar (biasanya sejurus selepas alkohol ditambah). Sebaliknya fungsi haba diambil alih oleh sejenis detergen (Tergitol) yang bertindak di atas permukaan sel. ambillah spesimen daripada bahagian koloni yang terletak di antara tepi dan tengahnya: bahagian tepi dan tengah koloni biasanya terdiri daripada struktur yang sama ada terlalu muda atau terlalu tua dari segi pembentukan spora dan berkemungkinan akan memberikan hasil pengamatan yang kurang memuaskan. Cuci dengan air. Pewarnaan Gram Semua fungus adalah Gram-positif. Banjiri slaid dengan karbol fuksin Kinyoun dan biarkan selama 5 minit. kontrol kultur positif dan negatif dan biarkan kering di udara. Tatacara Pewarnaan Tahan Asid Diubahsuai Kinyoun BAHAN 1. Nocardia adalah aktinomiset yang bersifat separuh tahan asid. 6. Buatkan 3 apusan tipis. Pewarnaan Tahan Asid Diubahsuai Kinyoun Tatacara ini tidak menggunakan haba untuk memudahkan pewarna memasuki sel. Cuci dengan air yang mengalir. Pada kultur fungus. Kapsul Cryptococcus neoformans lazimnya menghalang sel yis ini daripada diwarnai dengan sempurna dan seringkali mengakibatkan ia kelihatan seperti bahan lemak Gram-negatif berwarna merah jambu pucat (lavender) dengan badan inklusi yang bergranul berwarna ungu (Gram-positif). 33 . 5. suatu pengubahsuaian pewarnaan tahan asid perlu dilakukan khususnya untuk Nocardia.NOTA 1. Masing-masing daripada kultur yang diuji. 8.

2. Tatacara Pewarnaan Asid Periodik-Schiff BAHAN 1. 5. Fiksasikan apusan dengan metanol mutlak selama 5 – 15 minit. Cuci dengan air paip selama 10 minit sehingga warna merah jambu muncul. NOTA 1. Pewarnaan ini memberi kontras yang lebih ketara dan biasanya mewarnakan elemen fungus yang tidak ditunjukkan oleh pewarnaan lain. 6.9. Pewarnaan ini amat berguna untuk mengesan fungus pada keratan tisu serta apusan seperti kikisan kulit. Cuci dengan air dan keringkan. 34 . 6. Keberkesanan tindakan pewarna Schiff boleh diuji dengan menitiskannya ke dalam formalin 40%.2-glikol daripada polisakarid fungus ke gugusan aldehid. 2. Reagen ini masih boleh digunakan jika ia cepat berubah menjadi ungu-merah. ia tidak boleh digunakan lagi jika tiada warna yang muncul atau warnanya ungubiru. Pewarnaan Asid Periodik-Schiff Dalam pewarnaan asid periodik-Schiff (periodic acid-Schiff – PAS). 7. Titiskan larutan asid periodik selama 10 minit. nukleus kelihatan biru dan latar belakang adalah hijau. 5. 10. asid periodik mengoksidasi gugusan 1. Liputi dengan larutan metilena biru selama 1 minit. Bilas seketika dengan air suling. Balas warna dengan metil hijau selama 5 – 10 minit. Pewarnaan Metenamin-Argentum Gomori Pewarnaan metenamin-argentum Gomori dianggap sebagai pewarnaan yang amat berguna dalam penyaringan spesimen klinikal bagi fungus. Cuci dengan air suling selama 15 minit dan keringkan. 4. 3. Sebaliknya. Aktinomiset tidak diwarnakan dengan baik atau langsung tidak diwarnakan dengan tatacara ini. Askus yis kelihatan merah manakala blastokonidia berwarna biru. Apusan spesimen pada slaid mikroskop Metanol mutlak Asid periodik 1% Reagen Schiff Metil hijau 2% Air suling TATACARA 1. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Fungus (dan juga komponen tisu) yang mempunyai polisakarida di dalam strukturnya kelihatan merah ungu. Grup aldehid yang reaktif ini bergabung dengan reagen Schiff-leuko-fuksin untuk menghasilkan warna fuksin merah ungu. 4. 2. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Nocardia kelihatan merah manakala bakteria lain dan fungus kelihatan biru. 3. Titiskan reagen Schiff selama 20 minit.

6. 12. 10. 12. 8.1% Natrium thiosulfat 2% Larutan light green 0. Komponen tisu sebagai latar belakang diwarnai kuning dengan nukleus berwarna hitam. 4. 9. Cuci dengan air paip selama 15 saat. Presipitasi putih yang muncul berikutan penyimpanan boleh dihilangkan dengan menggoncangnya. 6. 11. 5. Cuci dengan air paip selama 5 – 10 minit. 14. 2. Letakkan slaid yang mengandungi apusan di dalam larutan asid kromik selama 1 jam. 9. Apusan spesimen pada slaid mikroskop Ketuhar Asid kromik 5% Natrium bisulfit 1% Larutan metenamin-argentum nitrat (pewarna Gomori) Aurum (emas) klorid 0. Cryptococcus neoformans diwarnai merah muda gelap atau merah. Balas warna dengan pewarna light green selama 30-45 saat. Bilas 6 kali dengan air suling apabila kontrol menunjukkan pewarnaan yang optimum telah dicapai. Larutan stok metenamin-argentum nitrat adalah stabil jika disimpan di dalam peti beku. 7. Keringkan dengan 2 pertukaran masing-masing alkohol 70%. NOTA 1.Tatacara Metenamin-Argentum Gomori BAHAN 1. 5. 8. 2. 4. 3. 15. 16. Sesetengah bakteria (termasuk Nocardia spp) serta sesetengah komponen tisu juga diwarnakan. Cuci dengan air. 95% dan mutlak. Cuci 3 kali dengan air suling. 3. 11. Bilas dengan air suling. 17. Letakkan slaid di dalam bekas yang mengandungi larutan metenamin-argentum nitrat dan eramkan bekas berkenaan di dalam ketuhar pada suhu 58-60°C.04% Alkohol mutlak. Liputi apusan dengan larutan emas klorid 0.1% selama 2 hingga 5 minit. alkohol 95%. 35 . Hilangkan argentum yang tidak tereduksi dengan natrium thiosulfat selama 2 hingga 5 minit. 10. Oleh yang demikian semua yang diwarnakan kelabu tua tidak semestinya fungus. alkohol 70% Xilena Forseps yang disaluti parafin PermountTM TATACARA 1. Lekapkan dengan media pelekap PermountTM. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Dinding sel fungus (serta fiber retikulum dan fiber elastik tisu) terwarna hitam. Jernihkan spesimen dengan 2 hingga 3 kali pertukaran xilena. Periksa apusan dengan mikroskop untuk menentukan sama ada fungus telah terwarna perang tua atau memerlukan pengeraman yang lebih lama. 13. Gunakan forseps yang diselaputi dengan parafin untuk mengeluarkan slaid dari larutan metenamin-argentum nitrat dan celupkannya ke dalam air suling. 2. 7. manakala bahagian di dalam miselium dan hifa diwarnakan kelabu tua dan latar belakang adalah hijau muda. Bilas dengan natrium bisulfit selama 1 minit.

Nocardia serta fungus tua dan yang telah mati mungkin memerlukan masa pengeraman yang lebih lama (sehingga 90 minit) dengan larutan metenamin-argentum nitrat untuk diwarnai.2. BENTUK DAN STRUKTUR FUNGUS DALAM KULTUR 1. Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India Pewarnaan ini digunakan untuk menunjukkan kehadiran kapsul yis. 4. Bercabang Tak bercabang Membengkak 36 . 5. Morfologi mikroskopik Morfologi fungus bermiselium Hifa: Saiz: garis pusat yang berbeza Pigmentasi: tanpa warna atau berwarna Berseptum atau tak berseptum Bercabang atau tak bercabang Spora aseksual: Blastokonidia (blastospora) Klamidokonidia (klamidospora) Artrokonidia (artrospora) Bentuk spora yang dihasilkan secara langsung dari miselium vegetatif. Tatacara ini boleh juga digunakan untuk keratan tisu dari ketulan parafin. alkohol 95% dan air suling. keratan tisu terlebih dahulu dihilangkan parafinnya dengan 2 pertukaran rendaman di dalam xilena dan kemudian dihidrasikan melalui suatu urutan rendaman di dalam alkohol mutlak. Tatacara Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India Tatacara tersebut adalah seperti yang dilakukan ke atas bakteria (Rujuk tatacara yang sama bagi bakteria) 3. khususnya bagi Cryptococcus neoformans di dalam mendapan cairan serebrospina dalam diagnosis kes meningitis.3. Spora asekual (konidia) yang dihasilkan daripada hifa khas yang disebut konidiofor.3. Dengan spesimen jenis ini. Pastikan pewarnaan tidak menjadi telalu gelap hingga struktur morfologi halus tidak dapat diamati.

Bulut/sfera Bujur (ovoid) Ala buah pear (piriform) Gada Bentuk: Tunggal Bertunas Multipel 37 .Bentuk konidiofor: Konidia Makrokonidia (konidia bersaiz besar pada fungus yang menghasilkan konidia yang besar dan kecil) Septum: Berseptum atau tanpa septum Bujur Raket Berbentuk gada (clavate) Bernodul Sabit Sigar Bengkok dan berkeadaan tidak sempurna (distorted) Bentuk: Berasingan Berkelompok Berantai Susunan dari konidiofor: Mikrokonidia (konidia bersaiz kecil pada fungus yang menghasilkan konidia yang besar dan kecil).

plastik formal polivinil (Formvar TM). Slaid berkenaan kemudian dikeluarkan dan permukaan slaid dipegang secara tegak dengan paksi panjangnya agak disendengkan dan biarkan sehingga kering. Filem sokongan ini diletakkan di atas grid kuprum berbentuk jaringan halus. 6. Penyalutan Grid dengan Lapisan Formvar Virus perlu diletak di atas filem sokongan sebelum partikel virus dapat “diwarnakan” dan diamati.3. PENGAMATAN VIRUS DENGAN MIKROSKOP ELEKTRON Dalam pengamatan bakteria dan fungus dengan mikroskop cahaya. 4. 5. dan satu siri kanta magnetik yang digunakan untuk membelok dan memfokuskan aliran elektron. Komponen asas mikroskop elektron adalah sumber elektron.5% di dalam kloroform Grid kuprum 400 mesh. karbon murni. Dalam elektron mikroskop jenis transmisi. spesimen yang akan diamati diletakkan pada sebuah slaid kaca yang kemudian diletak di atas pentas mikroskop.5 nm berbanding dengan kuasa pembesar mikroskop cahaya yang hanya berkisar di antara 30 sehingga 1500 kali dan had resolusi 200 nm. 2. Tatacara Penyalutan Grid dengan Lapisan Formvar BAHAN 1. sama ada ke atas spesimen yang diambil ataupun ke atas kultur daripada sesuatu spesimen klinikal. 7. Seperti juga bakteria dan fungus. Spesimen virus diletakkan di atas lapisan filem ini. 3. diwarnakan secara negatif dan kemudian diamati dengan mikroskop elektron. spesimen diletakkan di atas satu lapisan tipis plastik atau karbon yang disebut filem sokongan. pengamatan terhadap virus boleh dilakukan secara langsung. Mikroskop elektron transmisi mempunyai julat kuasa pembesaran di antara 1500 hingga 500000 kali dan had kuasa resolusi 0. 3. Slaid dicelupkan ke dalam larutan formvar selama 15 – 20 saat. Isikan bekas air dengan air suling sehingga penuh. Formvar E larutan 0. Potong filem di bahagian yang berhampiran dengan tepi slaid supaya terdapat filem berbentuk segi empat.3. Tunggu sehingga semua gelembung udara bergerak ke permukaan air. Penaburan elektron oleh spesimen menghasilkan imej yang diperbesar di atas layar pendaflour. 38 . Dua elektromagnet mempunyai fungsi seperti kondenser mikroskop cahaya untuk memfokuskan aliran elektron ini ke atas spesimen tersebut. Pengamatan ke atasnya boleh dilakukan dengan teknik mikroskopi elektron langsung ataupun dalam bentuk teknik pengubahsuaian mikroskopi elektron imun – yang dapat meningkatkan kesensitifan dalam pengesanan virus melalui mikroskopi elektron tersebut. Filem yang nipis serta lembut ini diletak ke atas suatu jaringan halus berbentuk bulat yang dinamakan grid. aliran elektron yang digunakan sebagai sumber radiasi diarahkan ke atas spesimen. 4. Fokus yang halus boleh didapati dengan binokular berkuasa rendah. 2. Bahan-bahan yang berfungsi sebagai filem sokongan adalah plastik nitroselulos (contoh Parlodion TM). garis pusatnya bergantung kepada jenis mikroskop elektron Slaid mikroskop Pisau cukur Mangkuk kaca ~ 10 cm isipadu Forseps Air suling TATACARA 1. dan kedua-dua jenis plastik tersebut yang distabilkan oleh karbon. Dalam mikroskopi elektron.

Tetapi natrium fosfotungstat merupakan pewarna negatif yang utama. 1 Kertas lilin Asid fosfotungstik 1. ia tidak akan tanggal lagi kecuali jika dilarutkan atau dihadamkan. 6. 5. Tatacara Pewarnaan Negatif dengan Asid Fosfotungstik BAHAN 1. Gunakan slaid mikroskop baru yang sengaja dilap dengan kertas pengering tangan. Letakkan setitis (~ 20 µl) suspensi virus. natrium tungstat dan garam uranium seperti uranil asetat. 6. 7. Proses perlekatan bahan protein ke atas filem memerlukan beberapa saat sahaja dan selepas itu. Dengan forseps halus keluar dan sentuhkan tepi grid dengan sekeping kertas turas supaya dapat menghilangkan cairan yang berlebihan. seperti virus. ke dalam suatu lapisan bahan berketumpatan tinggi supaya spesimen dapat diamati sebagai objek yang cerah di atas latar belakang gelap. Pastikan air yang digunakan bersih.5 TATACARA 1. air suling dan pewarna dalam 1 barisan di atas sekeping kertas gris. 2. Oleh yang demikian. pH 6. 39 . proses yang berikutnya. Penyalutan Virus Ke atas Grid dan Pewarnaan Negatif: Teknik Mikroskop Elektron Secara Langsung Spesimen diletakkan di atas filem sokongan melalui kaedah pemindahan titisan tunggal sebelum pewarnaan dilakukan.7 Grid mikroskop elektron yang disaluti filem Formvar Kepingan kertas turas gred Whatman No. NOTA 1. Slaid yang dicuci dengan teliti (dengan asid alkohol) akan melekatkan filem dengan kuat sehingga membuatkannya sukar untuk ditanggalkan daripada slaid. Keadaan ini wujud kerana kawasan yang mempunyai lebih “pewarna” seperti kawasan di sekeliling virus dan celah-celah permukaan virus akan menaburkan lebih elektron berbanding dengan kawasan yang kurang “pewarna”. Oleh yang demikian. Pewarnaan negatif melibatkan penanaman (embedding) bahan kecil yang berpartikel. Sampel virus Forseps halus jenis tukang jam yang bengkok No. Letakkan grid dalam 2 barisan di atas filem yang terapung-apung di atas air tersebut. jumlah elektron yang sampai ke layar dari kawasan yang mempunyai lebih “pewarna” adalah lebih rendah dan menyebabkan kawasan ini kelihatan lebih gelap daripada kawasan lainnya.5. 8. dapat dilakukan tanpa kehilangan virus. Terdapat beberapa pewarna negatif seperti natrium fosfotungstat. 4. 2. Apungkan 1 grid dengan permukaan filem sokongannya bersentuhan dengan titis suspensi virus selama 3 minit. seperti pewarnaan virus. Pegang slaid berdekatan dengan mulut dan keluarkan nafas dengan kuat supaya permukaan filem diliputi dengan wap yang terkondensasi dari mulut. 3. Tekan grid perlahan-lahan dengan forseps untuk mencapai sentuhan yang baik di antara filem dan grid. 2.5%. 3. Letakkan sekeping kertas turas di atas filem dan apabila kertas ini tenggelam ia dikeluarkan dan filem dibiarkan sehingga menjadi kering. 9. Masukkan slaid ke dalam air pada sudut 30 darjah supaya filem terapung bebas pada permukaan air.

Keluar serta hilangkan cairan yang berlebihan. 5. elakkan daripada berlakunya pencemaran silang dengan menggunakan forseps yang berbeza atau mencelupkan forseps yang telah digunakan di dalam air mendidih setiap kali sebelum digunakan semula. 5. 9. Campurkan 15 µl virus dengan 15 µl tiap larutan antiserum ke atas sekeping kertas lilin. 4.5 Kepingan kertas turas gred Whatman No. 7. 4. 6. Letakkan campuran ke atas grid dan warnakan mengikut bahagian “tatacara menyaluti grid dengan virus & tatacara pewarnaan negatif dengan asid fosfotungstik” di muka surat 39-40. Bagi spesimen multipel. Apungkan grid dengan permukaan yang didedahkan kepada virus ke atas titis pewarna selama 30 saat. Kertas turas yang dikoyak adalah lebih berkesan daripada yang digunting. 3. 6. 8. 8. Keluar dan hilangkan cairan yang berlebihan. Asid fosfotungstik seharusnya disediakan dengan menggunakan air suling steril. Sampel virus Forseps halus jenis tukang jam tangan Grid mikroskop elektron yang disaluti filem Formvar Asid fosfotungstik 1. Cecair yang berlebihan disingkirkan dengan menyentuhkan bahagian tepi grid sambil dipegang dengan penghujung forseps. 1 Kertas lilin Antiserum yang spesifik terhadap virus berkenaan Larutan salin ditampan fosfat TATACARA 1. Eramkan campuran virus/antiserum di dalam bekas ini selama satu jam pada 37°C. 3. 7.4. Apungkan grid dengan permukaan yang didedahkan kepada virus di atas titisan air suling selama 30 saat. Ia diagihagihkan dalam jumlah kecil ke dalam botol dan disimpan beku kecuali satu botol untuk kegunaan semasa yang seharusnya disimpan di dalam peti beku. NOTA Letakkan grid tersebut di atas kertas gris dan biarkan sehingga kering. 5. Teknik Mikroskopi Elektron Imun Kesensitifan mikroskopi elektron ( ME) boleh dipertingkatkan iaitu dengan menggunakan antibodi yang spesifik untuk mengelompokkan partikel-partikel virus. Letakkan kertas lilin dengan campuran virus/antiserum di dalam piring Petri yang dialas dengan kertas turas lembap. Permukaan grid yang disaluti dengan filem yang digunakan untuk melekatkan virus adalah permukaan di sebelah atas kertas turas.5%. Pegang grid dengan kemas dengan menggunakan forseps kerana grid-grid ini amat ringan dan mudah terlepas daripada forseps akibat tarikan tegangan permukaan titisan cecair. 2. 4. 5. Buang sediaan ini apabila didapati berubah kepada warna kebiruan. Pindahkan grid ke sekeping kertas turas yang terletak di dalam sebuah piring Petri. pH 6. 1. Tatacara Mikroskopi Elektron Imun BAHAN 1. Larutkan antiserum dalam larutan salin ditampan fosfat (nisbah antiserum: larutan salin yang digunakan bergantung kepada sediaan antiserum). 3. 2. 40 . 2. Cara ini juga digunakan untuk menentukan identiti virus yang tidak mempunyai morfologi permukaan yang khusus.

Kurangkan kuasa pembesaran kepada 80 kali dan pilih satu kawasan (segi empat sama) untuk diamati. partikel virus akan disaluti dengan suatu lapisan protein yang tebal dan ini akan menyukarkan pengamatan ke atas struktur virus serta menyebabkan perubahan bentuk vitus berkenaan. 2. gunakan binokular. 6. janganlah memilih segi empat yang kelihatan terlalu “bersih” kerana ia tidak dapat memberikan kontras yang baik di antara virus dengan latar belakangnya. akan banyak membantu dalam proses pencarian virus berkenaan. Untuk mengamati sesuatu objek dengan lebih teliti dan mendalam. 8. 3. 5. Apa yang akan dibentangkan dalam bahagian ini adalah cara untuk memasukkan spesimen ke dalam mikroskop dan beberapa petua untuk mengamati virus. 2. Serum haruslah didedahkan kepada suhu tinggi (56°C) sebelum digunakan untuk menghapuskan komplemen yang boleh melisiskan sampul (envelop) virus. janganlah mendapatkan kawasan yang gelap kerana virus akan terlindung/tersembunyi dan susah untuk diamati. 2.NOTA 1. NOTA Letakkan spesimen dengan menggunakan forseps di dalam ruang khas pemegang spesimen (berhati-hati supaya tidak tersentuh bahagian pemegang spesimen yang akan diletakkan di dalam ruang hampas udara). Oleh yang demikian. Skan secara teratur kawasan di dalam segi empat tepat yang dipilih supaya seluruh kawasan diamati. Suspensi virus murni boleh menyebabkan partikel virus dikelompokkan secara spontan. jika teknik ini dilakukan dengan menggunakan spesimen tanpa campuran antibodi sebagai kontrol.000 kali ganda dan dalam masa yang sama pusatkan semula pancaran elektron serta tingkatkan intensitinya. Amati layar melalui tingkap pengamatan. Tatacara Pengamatan Spesimen Virus dengan Mikroskop Elektron BAHAN 1. 3. Saiz serta bentuk virus. Putarkan tombol fokus sehingga memperolehi imej yang paling jelas. 1. Naikkan kuasa pembesaran kepada 60. Letakkan batang pemegang spesimen ke dalam tapak yang ditetapkan dan tunggu sehingga lampu merah padam. 4. adalah amat penting sekali. 2. Campuran virus dan antiserum daripada satu siri pencairan dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi antibodi yang optimum untuk menghasilkan pengelompokan virus. iaitu sebagai isyarat bahawa ruang hampas udara telah pun dicapai di dalam ruang spesimen. Dalam keadaan antibodi yang berlebihan. Dalam tatacara ini. Putarkan batang pemegang ke arah lawan pusingan jam. supaya spesimen mencapai tempat yang ditetapkan. 4. jika diketahui. 7. tidak semestinya IgG atau IgM yang murni digunakan. 41 . Pengamatan Spesimen Virus Terletak di atas Grid Mikroskop Elektron Persediaan penggunaan mikroskop memerlukan seseorang yang terlatih di dalam bidang ini. Dalam memilih segi empat tepat untuk diamati. Juga. Grid yang diliputi dengan spesimen yang diwarnakan Mikroskop elektron jenis transmisi TATACARA 1. dalam hal ini. Serum biasa pun sudah mencukupi.

Asid sulfurik Campurkan 1 ml asid sulfurik pekat ke dalam 100 ml air suling.05g fuksin bes di dalam 100 ml air suling. 9. 7. Malakit hijau (5. iaitu yang berada di tengah. Lakukan di dalam almari asap. Larutkan pewarna cotton blue dengan meletakkan bekas di dalam penganggas air. Larutan pewarna Larutkan 0. Kemudian tambahkan 0. Campurkan kedua-dua sediaan ini. Kristal ungu Larutkan 1 g kristal ungu di dalam 100 ml air suling. 13. Goncang sehingga keseluruhan iodin tersebut larut. REAGEN PEWARNAAN: RUMUSAN DAN PERSEDIAAN 1.2 ml asid asetik glacial. 5. 2. larutan pewarna Albert Larutkan 0. Karbol fuksin Ziehl-Neelsen Larutkan 4 g fuksin bes di dalam 20 ml etanol 95%.15 g toluidina biru dan 0. Light green.5 g iodin dan tambah air sehingga mencapai 100 ml. amatilah 5 segi empat tepat. Larutkan 5 g fenol di dalam 100 ml air suling.075 g cotton blue. 4. Tambahkan 0. Oleh kerana terdapat kemungkinan bahawa taburan virus di atas filem grid tidak rata. bawah. 12. Albert. 42 . Tambahkan 20 g kristal fenol dan larutkan dengan air panas di dalam penganggas air pada suhu 70°C. atas serta kiri dan kanan grid sebelum spesimen tersebut dapat dianggap sebagai tidak mengandungi virus (iaitu pada tahap kesensitifan mikroskop elektron dalam mengesan virus). 3. Larutkan 8 g fenol di dalam 100 ml air suling.2 g malakit hijau di dalam 2 ml etanol 95%. Iodin Gram Larutkan 1 g kalium iodid di dalam 70 ml air suling. Campurkan 1 bahagian larutan stok ini dengan 5 bahagian air suling untuk digunakan dalam pewarnaan. Alkohol asid Campurkan 5 ml asid hidroklorik dengan 95 ml etanol 95%. 6. 10. Metilena biru (0. 3. Aseton-alkohol Campurkan aseton dan etil alkohol 95% dalam nisbah isipadu yang sama.3.2 g Light Green. 8. Karbol fuksin Kinyoun Larutkan 2 g fuksin bes di dalam 10 ml etanol 95%. Campurkan kedua-dua sediaan ini.3 g metilena biru di dalam 30 ml etanol dan tambahkan 100 ml air suling. Lactophenol cotton blue Campurkan 20 ml asid laktik dengan 40 ml gliserol dan 40 ml air suling.4.05%) Larutan 0. Campurkan 1 ml asid asetik dan tambahkan 100 ml air suling. SF yellowish di dalam 100 ml air suling dan tambah 0. Saring larutan ini dengan kertas turas.0%) Larutkan 5 g pewarna di dalam 100 ml air suling. Karbol fuksin (0.3%) Larutkan 0. 11.

15. Saring dengan kertas turas dan simpan larutan reagen Schiff ini di dalam botol gelap di dalam peti beku.5 g arang kayu yang teraktivasi dan goncang sekali-sekala dalam tempoh 1 jam. larutan stok Campurkan 50 ml larutan argentum nitrat 5% yang disediakan di dalam air suling dengan 100 ml metenamin (heksa-metilena-tetra-amin) 3% yang disediakan di dalam air suling. Metenamin-argentum nitrat. larutan pewarnaan Larutkan 2 ml boraks (borax) 5% di dalam 25 ml air dan kemudian campurkan larutan ini dengan 25 ml larutan stok metenamin-argentum nitrat. Metenamin-argentum nitrat. Tambahkan 0. 17.14. Kemudian kurangkan suhu kepada 50°C dan saringkan dengan kertas turas. Biarkan di tempat gelap selama 2 hari. Reagan Schiff-leuko-fuksin Larutkan 1g fuksin bes di dalam 200 ml air suling yang mendidih.5%) Larutkan 0. 43 . Safranin (0. 16. Tambahkan 20 ml 1N HCl dan 1g kalium metabisulfit bentuk kontang.5 g safranin di dalam 100 ml air suling.

garam dan air. broth nutrien. Media diperkaya (enriched media) adalah media dasar yang dicampurkan dengan bahan yang boleh menggalakkan pertumbuhan seperti cecair tubuh (contohnya darah. mikrob merupakan salah satu komponen yang harus diperolehi bagi penghasilan sesuatu produk. Media pengaya (enrichment media) digunakan untuk pertumbuhan bakteria yang tidak tumbuh baik pada media dasar atau kerana pertumbuhannya pada media ini lebih baik dan cepat berbanding dengan bakteria yang lazimnya tumbuh dengan pesat dan seringkali mengatasi kecepatan pertumbuhannya dalam media dasar. Keadaan pengkulturan mikrob adalah berbeza-beza bergantung kepada jenis mikrob. pepton. media juga digunakan untuk pemencilan. Kadangkala keadaan yang berbeza ini wujud walaupun di kalangan mikrob daripada golongan yang sama. Pepton soya disediakan daripada tindakan enzim terhadap kacang soya. serum).1.1. Dalam mikrobiologi diagnostik. asid amino. misalnya bakteria ataupun virus. Dalam bidang perindustrian dan bioteknologi. ujian motiliti dan menentukan ciri-ciri metabolik dan fisiologi bakteria. Jika mikrob ini merupakan suatu agen “baru” yang mungkin belum dikenali. separuh pepejal dan cecair. otak atau hati).1. 44 . Dari segi penggunaan. ujian yang dijalankan ke atas kultur sesuatu mikrob tertentu dapat membantu mengenal pasti atau menentukan identiti mikrob berkenaan. PENGKULTURAN MIKROB Mikroorganisma dan virus dikulturkan untuk beberapa tujuan. manakala media tiruan adalah media yang mengandungi bahan-bahan kompleks seperti ekstrak daging lembu. Media boleh dibahagikan kepada media sintetik (media yang diketahui kandungannya) dan media tiruan atau kompleks. Media sintetik adalah media yang semua komponennya merupakan bahan kimia yang nyata dan spesifik daripada segi kandungannya.4. Contoh: Agar nutrien. PENGKULTURAN BAKTERIA 4. Infusi – Pepton – Ekstraks daging. jantung. protein atau sebarang nutrien yang memiliki ciri yang khas dan tepat. 4. melalui pengkulturan dapatlah diwujudkan satu sumber atau bekalan kultur agen berkenaan supaya kajian boleh dijalankan untuk menentukan ciri-cirinya. media kultur dibahagikan kepada beberapa golongan: Media dasar (juga dipanggil media nutrien atau media basal) yang mengandungi infusi. pepton P adalah penghadaman daging oleh pepsin. misalnya vaksin. vitamin tertentu. Di samping pertumbuhan. Hasil daripada penghadaman enzim ke atas bahan organik. broth infusi (otak-jantung. yis atau darah di mana kandungannya kurang jelas atau tidak dapat dipastikan. Contoh. JENIS MEDIA KULTUR Media kultur digunakan terutama untuk pertumbuhan bakteria (dan mikroorganisma lain) dan terdapat dalam bentuk pepejal.

kebanyakan media pembeza juga mempunyai reagen yang dapat menghalang pertumbuhan bakteria tertentu dan dalam hal ini. Sebagai contoh. 2.0 adalah toksik terhadap bakteria koliform dan dengan demikian. Media pengaya (enrichment) digunakan untuk pemencilan (misalnya patogen usus) dengan merencat atau menekan pertumbuhan saprofit dan/atau flora normal tubuh. misalnya dalam bentuk perubahan warna koloni (fermentasi) ataupun perubahan kepada media itu sendiri (hemolisis). 45 . media pengaya boleh juga disifatkan sebagai media pemilih. Dari segi fungsi. Fermentasi manitol menghasilkan koloni bakteria berwarna kuning. ia memberi peluang kepada Salmonella dan/atau Shigella untuk membiak dengan lebih baik kerana kekurangan atau ketiadaan persaingan pertumbuhan spesies koliform lainnya. Media pemilih (selective) adalah media dasar atau media diperkaya yang dicampurkan dengan bahan yang menghalang pertumbuhan majoriti jenis bakteria dan memberikan kelebihan kepada segolongan kecil bakteria lain yang diinginkan untuk tumbuh. Media ini juga meningkatkan peluang untuk memencilkan bakteria tertentu di dalam sesuatu kultur campuran. ia juga dianggap sebagai media pemilih. triptos Kanji Sumber darah: kambing biri-biri. Pada hakikatnya. Media pembeza (differential) adalah media dasar atau media diperkaya yang mengandungi bahan kimia khusus yang akan bertindak ke atas sesetengah jenis bakteria melalui cara yang membolehkan bakteria berkenaan dikenali. Reduksi telurit akan menghasilkan koloni berwarna hitam.1. Contoh media yang mempunyai ciri pemilih dan pembeza Nama media Bahan pemilih Ciri MacConkey Potassium telurit Deoksikolat sitrat Hempedu Kalium telurit Natrium deoksikolat Fermentasi laktosa Reduksi telurit Fermentasi laktosa Kesan penghasilan H2S Fermentasi manitol – Ciri pembezaan Indikator Neutral red Kalium telurit Neutral red Ferik ammonium Sitrat Fenol merah Garam manitol Lowenstein-Jensen Natrium klorida Malakit hijau Fermentasi laktosa akan menyebabkan koloni menjadi merah atau merah jambu. arnab atau kuda. Penghasilan H2S akan menukar ferik ammonium sitrat kepada ferik sulfida dan pembentukan warna hitam pada koloni bakteria. Contoh media diperkaya Nama media Agar darah Agar coklat Broth (atau agar) serum Agar darah triptos Agar Mueller-Hinton Bahan campuran khas Darah utuh Darah yang dipanaskan Serum Darah. dalam broth selenit F natrium selenit pada pH 7.

apatah lagi jika di kalangan bakteria yang ingin dipencilkan terdapat spesies yang dapat bergerak atau menunjukkan kemampuan untuk menyebar (swarming). 3. 8. Jika didapati demikian. Eramkan secara terbalik dengan penutup dalam keadaan terbuka pada suhu 37°C selama semalaman. Tindakan menggoncang ini hanya akan menyebabkan pembentukan gelembung udara di dalam media dan mengakibatkan media plat yang tidak rata apabila membeku kelak. 3. 6. suhu tersebut mestilah diturunkan kepada 48°C sebelum darah dan bahan lain yang tidak tahan panas dicampurkan. ada baiknya juga jika media agar dituangkan selepas suhu diturunkan kerana ini akan mengurangkan pemeluapan. Tiap-tiap bentuk agar mempunyai fungsi tersendiri. 7. 4. Putarkan plat supaya agar tersebar sama rata. Sungguhpun suhu yang tinggi diperlukan untuk mencairkan agar. 2. NOTA Larutkan media agar berisipadu kecil di dalam bikar air mendidih dan media agar berisipadu besar di dalam penganggas air atau autoklaf. segera hilangkan dengan mengarahkan/ melalukan api penunu Bunsen ke atas gelembung-gelembung tersebut sehingga semuanya terhapus/ tersingkir sebelum media menjadi beku. Koloni-koloni bakteria yang seharusnya telah terasing. Pada agar yang tidak mengandungi bahan protein seperti darah. Tatacara Menyediakan Plat Media Agar BAHAN 1. besar kemungkinan bahan pelengkap (supplement) ini tidak akan bercampur dengan baik dan merata di dalam media. Pada umumnya. 46 . Jika setelah penuangan media. Sebaliknya jika agar dibiarkan sehingga terlalu sejuk. 4. BENTUK MEDIA AGAR Media kultur dipadatkan dengan agar dan disediakan dalam 2 bentuk. media tersebut perlulah dikeringkan terlebih dahulu kerana penginokulasian di atas media yang berkeadaan sedemikian hanya akan menyulitkan pemencilan mikroorganisma nantinya. 4. apabila keseluruhan agar menjadi cair. bakteria dikulturkan ke atas plat media agar melalui teknik plat garisan untuk mendapatkan koloni bakteria yang terpencil. 2. misalnya Proteus spp. 2. 3. akan saling bersentuhan dan bercantum semula di antara satu dengan lain. Elakkan daripada menggoncang media agar sebelum dituangkan ke dalam plat.4. masih terdapat gelembung udara pada permukaan media plat. Tuangkan 15 – 20 ml agar ke dalam setiap piring Petri bergaris pusat 90 cm. Biarkan sehingga beku.2.1. pastikan permukaannya tidak basah. Media agar Bikar air yang mendidih Penganggas air Piring Petri TATACARA 1. Letakkan larutan media agar ke dalam penganggas air bersuhu 50°C. 1. manakala pengkulturan pada cerun agar digunakan untuk ujian biokimia atau sebagai kultur simpanan. 5. sebagai satu lapisan rata di dalam plat Petri (juga dipanggil ‘plat agar’/‘piring agar’) dan dalam bentuk cerun (agar cerun/ condong) di dalam tabung atau botol. Pada keesokan harinya pastikan tiada pertumbuhan (bakteria/fungus) atau kontaminasi berlaku ke atas media. Tutup plat dan simpan pada suhu 4 – 8°C jika tidak digunakan. Semasa media agar digunakan.

1.Tatacara Menyediakan Media Agar Condong/Cerun BAHAN 1. misalnya ciri morfologi koloni. sungguhpun teknik aseptik diamalkan. 2. Kemudian tambahkan bahan berkenaan yang steril dan campurkan dengan baik dan merata. 4. reaksi pewarnaan. dinginkan sehingga mencapai suhu sekitar 48°C. 3. Plat Garisan Kultur murni adalah kultur yang mengandungi satu jenis atau spesies bakteria sahaja. Kultur yang sedemikian ini dikenali sebagai kultur murni dan menunjukkan pertumbuhan koloni yang morfologinya kelihatan serupa di antara satu dengan lain. Simpan media cerun agar pada 4° – 8°C jika tidak digunakan. Setelah pensterilan. KULTUR MURNI 4. letakkan tabung atau botol dalam keadaan condong dan biarkan membeku pada suhu bilik. morfologi sel. dengan teknik aseptik. Selepas pensterilan. bahagi-bahagikan media berkenaan dalam isipadu yang ditetapkan ke dalam tabung atau botol yang terlebih dahulu disterilkan. Tutup tabung atau botol tersebut dan sterilkan. Kultur bakteria Piring Petri yang mengandungi media agar 47 . reaksi imunologi dan kepekaannya terhadap berbagai agen antimikrob. 2. kultur murni diperolehi dengan menggunakan media padat. Kultur murni penting kerana ia diperlukan dalam kajian-kajian mengenai pelbagai ciri sesejenis bakteria. Ini boleh mengelakkan daripada tercemar semasa membahagikan media yang telah disterilkan terlebih dahulu ke dalam tabung atau botol. Media agar Bikar air yang mendidih Penganggas air Tabung/botol TATACARA 1. jika sesuatu bahan yang ingin dicampurkan ke dalam media adalah daripada jenis yang tidak tahan panas.3. 3. 2. NOTA Tuangkan 10 hingga 15 ml media agar yang telah dicairkan ke dalam setiap tabung atau botol. Umumnya. 2. 1. maka media dalam isipadu yang besar tersebut perlu disterilkan terlebih dahulu. Tatacara Plat Garisan BAHAN 1. Bakteria daripada koloni ini kemudian boleh ditumbuhkan semula supaya semua koloni di dalam sesuatu plat terdiri daripada jenis bakteria yang sama. Kemudian. Sebaliknya. maka satu koloni akan hanya terdiri daripada satu jenis atau spesies sahaja. biokimia. Teknik plat garisan merupakan teknik yang paling mudah untuk mendapatkan koloni terpisah dan terasing. Berdasarkan teori bahawa satu koloni bakteria merupakan hasil daripada pertumbuhan yang berasal daripada satu sel bakteria. sama ada melalui teknik plat garisan atau teknik plat tuangan (pour plate). Media agar untuk tujuan persiapan media agar cerun disediakan dan dibahagi-bahagikan ke dalam tabung atau botol dan kemudian disterilkan. 4.

6. Bekerjalah berdekatan dengan sumber api. 6. 5. Pastikan garisan yang terakhir tidak menyentuh sebaran inokulum yang pertama. 48 . 10. ambil spesimen dengannya. Dengan gelung dawai steril pindahkan kultur/spesimen ke atas media plat dan inokulum seluas 1 cm garis pusat.3. Terbalikkan plat Petri yang me-ngandungi media dengan bahagian dasarnya di sebelah atas. 4. 3. Bakar semula gelung dawai dan biarkan sejuk. 7. Letakkan plat Petri tersebut dengan bahagian dasarnya di sebelah atas. Gelung dawai Penunu Bunsen TATACARA 1. berterusan tetapi terpisah serta tidak saling memotong atau bersilang di antara garisan atas dengan yang di bawahnya supaya mendapatkan koloni bakteria yang berasingan. maka koloni bakteria yang terpisah akan didapati. Piring Petri yang telah diinokulasi dieramkan pada suhu tertentu dalam keadaan terbalik. Sterilkan gelung dawai melalui pembakaran api penunu Bunsen dan setelah sejuk. Sebarkan inokulum seluas 1 cm garis pusat. usahakan menggaris perlahan-lahan supaya anda tidak sampai mencungkil atau merobek media sehingga mengakibatkan media menjadi pecah-pecah. 8. Letakkan gelung yang mengandungi spesimen di atas permukaan media agar kira-kira 1 cm daripada dinding plat Petri tersebut. NOTA Labelkan plat Petri yang mengandungi media pertumbuhan yang steril (pada bahagian dasar atau bawahnya dan bukan di atas penutupnya). Garisan seterusnya bermula daripada kawasan di sekitar penghujung garisan-garisan pertama. yang penting ialah menyentuh gelung pada permukaan media dan menggariskannya. 4. 1. 3. Bermula daripada sebaran di atas gariskan inokulum dengan menggerakkan gelung bolakbalik supaya garisan meliputi satu kawasan seluas kira-kira sepertiga daripada plat. 5. Putarkan plat ~ 90 darjah dan buatkan pula beberapa garisan mengulangi prosedur di atas sehingga garisan meliputi keseluruhan kawasan permukaan media. Piring Petri yang telah diinokulasi dieramkan secara terbalik supaya sebarang pemeluapan yang berlaku pada penutupnya tidak akan menitis ke atas kultur. Gunakan penghujung gelung dawai sahaja untuk menyentuh permukaan media supaya mendapatkan garisan yang halus dan tipis. Dalam membuat garisan. 11. Pegang dan angkat bahagian dasar plat sehingga permukaan media yang terdedah menghadap anda. 9. 2. 4. Pastikan juga garisan yang dibuat tersebut rapi. Jangan bercakap semasa melakukan prosedur ini untuk mengelakkan semburan air liur terjatuh ke atas permukaan media agar. 2. Gelung dawai dibakar semula selepas garisan dibuat pada bahagian pertama piring Petri supaya inokulum (jumlah bakteria) dikurangkan.

1.1 Cara melakukan plat garisan 4. 1. Putarkan plat 60-90 darjah dan buatkan pula beberapa garisan.Gariskan inokulum secara bolek-balik bermula daripada sebarannya sehingga meliputi kira-kira sepertiga kawasan plat. Pinggiran/konfigurasi (ditentukan dengan mikroskop): Menyeluruh Beralun Lobate Erose 49 . Seperti juga ciri-ciri morfologi sel bakteria. ciri genetik dan antigenik bakteria berkenaan. aktiviti biokimia. umur kultur. Koloni bakteria biasanya diamati berdasarkan pertumbuhannya di atas media padat. RAJAH 4. Bentuk: Bulat Tidak teratur Berfilamen Berserabut Bertitik bujur 2.4. strain bakteria dan semua keadaan ini biasanya diambil kira dan dinyatakan semasa menghurai sesuatu koloni bakteria. CIRI-CIRI KOLONI BAKTERIA Kajian mengenai koloni bakteria adalah penting kerana ia boleh memberikan maklumat lanjut mengenai identiti. ciri-ciri koloni bakteria dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti jenis media. suhu pertumbuhan. Ulangi kaedah ini sehingga garisan meliputi keseluruhan kawasan permukaan media.

Bergelung Berfilamen Bergranul 50 . Pendaflour – satu warna dengan cahaya transmisi dan warna lain (yang cerah dan terserlah) dengan cahaya pantulan (berpendafluor). Struktur dalam (ditentukan dengan mikroskop): Seperti warna baiduri (warna putih-kebiruan atau warna susu dengan ciri warna yangkekilatan berubah-ubah) : Warna yang berubah dengan sudut (posisi) koloni dipandang. Pertumbuhan yang nipis seperti membran. Seperti mentega atau lekit. Ciri optik: Luster Legap Lutsinar Opalesens : Iridesens Pudar Berkilat Fotogenik – memancar di dalam gelap. Likat: Pertumbuhan mengikut bekas garisan dawai inolukasi. 7. 6. Berkerut 5.3. Permukaan: Elevasi Datar Menaik Cembung Umbonat Pulvinat Cembung papilat Cembung berkerut 4. Permukaan: Konsistensi Kelihatan kering & rapuh. Batasan secara radial : permukaan berbatas-batas yang terpancar dari tengah-tengah koloni. Permukaan: Tekstur Licin Kasar Berkontour : permukaan licin dan undulat (beralun) secara tak teratur.

5. sungguhpun ia tidak menjalankan metabolisme oksidatif. tenaga yang digunakan untuk menjalankan proses biosintesis berpunca daripada tindakan oksidatif ke atas bahan organik. Sekumpulan besar bakteria mempunyai sistem enzim yang boleh menggunakan oksigen atau terbitan organik sebagai penerima akhir hidrogen (aerob fakultatif atau anaerob fakultatif). Walau bagaimanapun.1.8. Di samping pengaruh kandungan media ke atas pertumbuhan bakteria. terdapat juga bakteria yang sama sekali tidak dapat menggunakan oksigen sebagai penerima akhir hidrogen (anaerob obligat). beberapa faktor lain di alam sekeliling juga mempengaruhi pertumbuhan dan tumbesarannya. Perubahan kepada media Hemolisis (pada agar darah) Penghasilan pigmen Perubahan kepada media pembeza Penghasilan bau atau aroma Istilah Bahasa Malaysia dan Istilah Bahasa Inggeris dalam pencirian koloni bakteria tidak teratur berserabut bertitik menyeluruh beralun keriting datar menaik cembung imbonat pulvinat cembung papilat cembung berkerut batasan secara radial berkerut rapuh seperti mentega/lekit pudar berkilat 4. Pengeraman Bakteria dalam Keadaan Anaerobik Pada bakteria heterotrof. glossy KEADAAN PERTUMBUHAN BAKTERIA DI DALAM MAKMAL Oleh kerana penyesuaian bakteria kepada alam sekelilingnya. osmolariti media dan kepekatan ion hidrogen (pH). Faktor ini termasuk suhu pengeraman. Oleh yang demikian ia hanya dapat tumbuh dalam kehadiran oksigen. aras oksigen. Oleh yang demikian. irregular rhizoid punctiform entire indulate curled flat raised convex imbonate pulvinate convex papillate convex rugose radially ridged rugose brittle butyrous dull glistening. Terdapat pula segolongan bakteria yang dinamakan aerotoleran kerana berkeupayaan untuk tumbuh di dalam udara. air. Sebaliknya. metabolismenya akan berubah kepada keadaan aerobik dan 51 . Justeru itu ia tidak dapat tumbuh dalam keadaan kehadiran oksigen dan kemungkinan akan mengalami kematian apabila terdedah kepada gas berkenaan. Ada bakteria yang hanya boleh menggunakan oksigen bebas sebagai penerima akhir hidrogen (aerob obligat). Bakteria golongan ini melakukan fermentasi meskipun dalam kehadiran oksigen. Bakteria jenis ini boleh tumbuh secara anaerobik dan dalam keadaan ini akan memfermentasi karbohidrat dengan menghasilkan produk fermentasi seperti berbagai-bagai jenis asid. apabila ditumbuhkan dalam kehadiran udara (oksigen). pengkulturan bakteria di dalam makmal hanya dapat dicapai jika keadaan alam persekitarannya dapat diwujudkan. maka bakteria dari lingkungan yang berbeza memerlukan keadaan sekeliling yang berbeza pula untuk pertumbuhan yang optimum.

6.karbohirat umumnya akan dioksidasi kepada air dan CO2. Kemudian lekapkan penutup tepat pada kedudukannya menutupi mulut balang. pastikan proses ini dilakukan jauh dari gas yang boleh meletup. H2 10%) 52 . 2. 3. 3. 3. Indikator redoks metilena biru digunakan untuk memastikan keadaan anaerobik dicapai. Tatacara Mewujudkan Keadaan Anaerobik di dalam Balang Anaerobik dengan GasPaktm BAHAN 1. 7. 5. Pasang alat pencengkam penutup supaya balang tertutup dengan rapi dan rapat sehingga tidak dapat ditembusi udara. Balang anaerobik (jenama GasPak) Satu paket GasPak Pipet Air Penunu Bunsen Satu pek katalis Indikator redoks TATACARA 1. Gunakan balang anaerobik yang sedia dilengkapi dengan 1 pek mangkin aktif yang dilekatkan kepada penutupnya. Tatacara Mewujudkan Keadaan Anaerobik dengan Pengisian Gas Nitrogen ke dalam Balang Anaerobik BAHAN 1. CO2 5%. Dalam keadaan tanpa oksigen metilena biru akan menghilangkan warnanya. 4. 2. Letakkan indikator redoks (oksidasi-reduksi) di sebelah susunan plat. Masukkan 10 ml air paip ke dalam GasPak dengan pipet. Butir-butir mangkin yang terpakai dipulihkan kepada aktiviti penuh dengan dipanaskan di dalam ketuhar pada suhu 160-170°C selama 2 jam. Terdapat segolongan bakteria lagi yang menunjukkan pertumbuhan optimum pada kadar oksigen yang rendah dan bakteria ini dikenal sebagai mikroaerofilik. 8. Katalis – biji-biji aluminium disaluti paladium GasPakTM – kit penjana/pembebas hidrogen NOTA 1. Balang jenama GasPak menggunakan katalis atau mangkin ‘sejuk’ yang tidak perlukan dipanaskan sejurus sebelum GasPak digunakan. Masukkan media plat yang telah diinokulasi ke dalam balang. Eramkan keseluruhan balang bersama isi kandungannya di dalam inkubator 37°C semalaman. 4. Balang anaerobik (plastik atau logam)/bekas berbentuk silinder Tangki silinder gas campuran (N285%. 2. 6. Mangkin ini kemudian disimpan di dalam tempat kering atau balang pengering (desikator). 5. Pada balang anaerobik yang menggunakan mangkin yang perlu dipanaskan dengan arus elektrik atau api. Potong salah satu sudut atas paket GasPak dan letakkan sampul GasPak secara menegak di sebelah susunan plat. 2. Tetapi masa kehilangan warnanya dicapai lebih lewat daripada pencapaian keadaan anaerobik di dalam balang. 7.

2. Gunakan tin dengan penutup berbentuk bulat supaya tin dapat ditutup dengan rapat. 3. Pastikan saiz tin yang digunakan tidak terlalu kecil supaya terdapat sedikit ruangan untuk menempatkan lilin yang menyala pada jarak yang agak berjauhan dengan piring Petri. 2. 4. Lekatkan sebatang lilin kepada sebuah slaid kaca mikroskop. Tanggalkan semua tiub penyambung pada balang dan tutup lubang kepala salur gas dengan pita selofan. Prosedur ini akan mengelakkan kemungkinan lilin yang sedang menyala daripada terjatuh dari tempatnya semasa tin dipindahkan. 6.TA TACARA 1. 5. Dengan adanya alat ini pengeraman kultur bakteria (ataupun kultur sel) di dalam atmosfera CO2 adalah lebih mudah dilakukan di samping kehadiran ruang yang boleh memuatkan lebih banyak kultur. 3. Keadaan atmosfera yang dicapai di dalam balang lilin adalah CO2 5%. Instrumentasi adalah di luar skop buku ini dan haruslah mengikuti arahan dengan teliti di dalam buku operasi (manual) yang dibekalkan 53 . 3. Eramkan balang bersama isi kandungannya di dalam inkubator 37°C selama semalaman. 2. Buka kepala salur gas kedua ini dan salurkan gas ke dalam balang sehingga terisi penuh kemudian tutup dengan rapat. Tutup tin dengan rapat dan biarkan sebentar sebelum tin dieramkan supaya lilin terpadam dengan sendirinya. 3. Tutup rapat kepala salur gas pertama ini dan sambungkan sebuah tiub pada kepala kedua yang menghubungkannya dengan tangki silinder gas campuran. Tatacara Menggunakan Inkubator Karbon Dioksida dalam Pengeraman Kultur dalam Keadaan Atmosfera Karbon Dioksida Inkubator CO2 merupakan suatu alat yang lumrah didapati di makmal mikrobiologi. Buka salah satu kepala salur gas dan hubungkan dengan tiub ke sebuah pam vakum dan kemudian sedut keluar udara di dalam balang sehingga terbentuk ruang hampa gas sepenuhnya. Masukkan media plat yang telah diinokulasi ke dalam bekas ini dan kemudian tutup rapat dengan bantuan pencengkam penutup tersebut. Tempatkan lilin berjauhan dengan piring Petri yang mengandungi media yang telah diinokulasi. 7. NOTA Gunakan balang anaerobik yang terpakai (atau bekas plastik berbentuk silinder yang mempunyai dua lubang kecil pada penutupnya). Bekas logam dengan penutup berbentuk bulat (tin susu tepung) Sebatang lilin Slaid mikroskop TATACARA 1. 2. Tatacara Balang Lilin dalam Pengeraman Kultur dalam Keadaan Atmosfera Karbon Dioksida BAHAN 1. NOTA 1. Nyalakan lilin tersebut dan masukkannya ke dalam bekas. Penutup bekas yang digunakan mesti berbentuk bulat kerana bentuk ini mempastikan ia tidak ditembusi udara. 4.

2.1. 3. sama ada kontaminan (fungus saprofitik daripada alam sekitar) atau fungus patogenik. aras CO2 ditetapkan pada 7% dan kultur sel 5%. ia lebih sesuai bagi inkubator yang kerapkali dibuka. 6. Media padat ini terdiri daripada dekstrosa 4%.bersama-sama dengan alat ini.2. Pada kultur bakteria. Rancangkan terlebih dahulu dalam tempoh masa kerja. MEDIA KULTUR Media kultur utama yang digunakan untuk kultur primer fungus (pengkulturan daripada spesimen klinikal) adalah agar dekstrosa Sabouraud (SDA ) yang merupakan sejenis media dasar seperti juga agar nutrien.6.5-2% dan mempunyai pH asid 5. Media agar ini boleh dibekukan di dalam piring Petri atau tabung uji. Apa yang akan dibentangkan di sini hanyalah beberapa nota mengenai jenis inkubator CO2 dan penggunaan alat ini. Pada fungus berfilamen. 5. 4.2. PENGKULTURAN FUNGUS Fungus wujud dalam dua bentuk: yis dan hifa atau miselium. manakala koloni berhifa atau miselium seperti kapas atau permaidani pada permukaan media. 4. PENGKULTURAN FUNGUS 4. Pengkulturan fungus ke atas plat agar boleh menonjolkan dua bentuk ini iaitu koloni yis kelihatan bulat dan agak lekit. Jangan gunakan inkubator CO2 yang sama untuk kultur bakteriologi dan kultur sel untuk mengelakkan pencemaran bersilang. 4. pepton 1% yang sesuai untuk fungus dan agar 1. Sistem ini mengelakkan pembaziran gas. NOTA 1. pengamatan kultur secara in situ dapat dilakukan dengan teknik kultur slaid. 54 . Media ini biasanya digunakan untuk pengkulturan dermatofit dan Candida albicans kerana spesies-spesies ini tidak sensitif terhadap kedua-dua jenis agen antimikrob tersebut. Ini memberi peluang yang lebih baik kepada fungus patogenik untuk tumbuh. Oleh yang demikian.005% mengurangkan pencemaran oleh bakteria dan fungus bukan patogenik. Agar infusi otak dan jantung dicampur 5% darah kambing biri-biri merupakan sejenis media yang diperkaya dan digunakan untuk pemencilan Histoplasma dan Nocardia. Alat inkubator CO2 yang mempunyai jaket air adalah lebih cekap dalam menstabilkan suhu dan melambatkan penurunan suhu jika bekalan elektrik terputus. sungguhpun terdapat banyak juga fungus patogenik yang terhalang pertumbuhannya. Agar dekstrosa Sabouraud yang dicampurkan dengan cycloheximide 0. Alat inkubator CO 2 yang mempunyai sensor jenis inframerah membolehkan paras CO2 di dalam inkubator kembali ke paras asalnya dengan lebih cepat berbanding dengan sensor jenis konduktiviti termal (haba). 7. 2. Alat inkubator CO2 yang lebih moden mempunyai mekanisme yang menghentikan bekalan gas ini secara automatik semasa pintu dibuka dan menyambungnya semula hanya apabila pintu ditutup semula. apa yang akan disimpan atau dikeluarkan daripada inkubator CO 2 ini supaya dapat mengelak daripada terlalu kerap membukanya.05% dan Chloramphenicol 0. Pengkulturan Candida albicans di dalam serum lembu misalnya boleh menunjukkan penghasilan tiub germa oleh yis berkenaan. Ini merupakan suatu ujian diagnostik.2. Keadaan pH asid dan tanpa bahan yang kaya menghalang pertumbuhan kebanyakan jenis bakteria tetapi membenarkan pertumbuhan fungus. Pastikan juga terlebih dahulu apa yang akan dikeluarkan daripada inkubator CO2 atau dimasukkan supaya dapat mengurangkan lamanya ia dibuka. kecuali Histoplasma capsulatum dan beberapa strain aktinomiset seperti Nocardia asteriodes.

Inokulum daripada tapak di antara pertengahan dan tepi koloni yang diambil. NOTA Sterilkan jarum inokulasi dengan pembakaran api penunu Bunsen. manakala di bahagian pertengahannya pula mungkin sudah agak tua dan ‘steril’. 4. 8. 3. 1. Tatacara Penginokulasian Plat Agar dengan Kultur Berfilamen BAHAN 1. 2. 4. Tatacara Membuat Kultur Slaid BAHAN 1. 7. 5.1. pertumbuhan fungus adalah lebih lambat. Cungkilkan sedikit kultur dan letakkan inokulum ini di tengah-tengah plat agar atau tabung cerun agar. 3. 10. 2. Eramkan pada suhu 30°C dan/atau 37°C selama 4 minggu. 11. Kultur koloni fungus Plat agar/cerun agar Jarum inokulasi Penunu Bunsen TATACARA 1. 3. Kultur fungus Agar dekstrosa atau agar dekstrosa kentang Piring Petri Balang alkohol Penunu Bunsen Sebatang kaca berukuran 6 cm Penutup slaid Slaid mikroskop Air suling (steril) Pisau pembedahan (steril) Dawai inokulasi lurus 55 . Masukkan jarum ke dalam koloni fungus pada tapak di antara tengah dan tepi koloni fungus. perlulah diingat bahawa dalam hal ini. 3. 4. penginokulasian kultur disarankan dilakukan di dalam kabinet “biohazard” kelas 2 yang memberi perlindungan kepada pengguna. atau tidak mengandungi spora atau badan pembuahan (fruiting body) lagi. 2.3) NOTA Kultur fungus dalam bentuk yis dieramkan pada suhu 37°C. Untuk mengelakkan pencemaran oleh fungus khususnya dari udara. Sungguhpun suhu bilik (25°C) digunakan sebagai suhu pengeraman oleh beberapa makmal. 9. 2. 6. kerana koloni yang di tepi mungkin terlalu muda dan belum bersporulasi atau membentuk spora. fungus yang dikulturkan serta alam sekeliling.Tatacara Penginokulasian Plat Agar dengan Kultur Yis Tatacaranya adalah seperti yang dilakukan dengan bakteria iaitu melalui teknik garisan ke atas plat (sila rujuk bahagian 4.

Sterilkan batang kaca ini dengan pembakaran alkohol. Biarkannya sejuk dan letakkan di dalam sebuah piring Petri. Masukkan 0. 4 objek iaitu batang kaca berbentuk ‘V’. pastikan jarum dimasukkan tepat ke dalam koloni supaya inokulum mengandungi bahagian vegetatif fungus bersama bahagian aerialnya (yang mengandungi spora).TATACARA 1. 2. 11. 4. 2. 7. 3. Sterilkan sekeping kaca penutup slaid dengan pembakaran alkohol dan letakkan di atas permukaan ketulan agar. 7. Kultur yis Tabung uji Penganggas air Jarum inokulasi Slaid mikroskop Penutup slaid Serum lembu (steril) TATACARA 1. NOTA 1.5 ml serum lembu (steril) ke dalam satu tabung uji. 8. 6. Bakarkan sebatang kaca berukuran 6 cm di bahagian tengahnya sehingga menjadi lembut. 5. Sterilkan sekeping slaid mikroskop dengan pembakaran alkohol dan letakkannya di atas batang kaca berbentuk ‘V’. 4. 13. 2. penutup slaid dan jarum inokulasi disterilkan dengan pembakaran api atau alkohol. Tuangkan sekitar 5 ml air suling steril ke dalam piring Petri ini untuk memberikan kelembapan yang berterusan semasa pengeraman kultur. Tekan kaca penutup slaid supaya terdapat kontak yang baik di antara permukaan agar dan penutup tersebut. 10. Tunggu sehingga objek yang disterilkan menjadi sejuk sebelum meneruskan dengan prosedur selanjutnya. 4. Tutup plat Petri dan eramkan pada suhu bilik. 6. 9. slaid mikroskop. agar dekstrosa kentang) berukuran 1 cm persegi dan letakkan di atas slaid. Dalam tatacara ini. Apabila struktur reproduktif mulai terlihat. Masukkan 1 koloni yis ke dalam serum dan leraikan sel-sel dari koloni dengan menggoncanggoncangkan jarum inokulasi di dalam serum. 56 . Bengkokkan batang kaca itu sehingga mencapai bentuk ‘V’ dan biarkan sehingga sejuk di udara. jangan tekan penutup slaid kerana ini boleh mengakibatkan struktur konidia terpisah daripada hifa. Amati juga fungus yang tumbuh pada permukaan slaid dengan pelekapan basah lactophenol cotton blue. lepaskan penutup kaca (yang mempunyai pertumbuhan fungus pada permukaannya) daripada ketulan agar dan amati dengan sediaan pelekapan basah lactophenol cotton blue. Semasa pengambilan inokulum. Letakkan piring Petri di atas pentas mikroskop dan amati pertumbuhan fungus dari masa ke masa. Pastikan air di dalam piring Petri yang memberikan kelembapan kepada atmosfera ruangan kultur slaid sentiasa ada dan tidak sampai kering dan tambah jika perlu. 5. 2. 12. 14. Tatacara Kultur yang Merangsang Penghasilan Tiub Germa BAHAN 1. Potong seketul agar (agar dekstrosa. 3. Dalam penyediaan pelekapan basah. Inokulasi fungus dengan menyentuh keempat-empat sudut ketulan agar. 3.

2 jam dan 3 jam. Pastikan ampaian yis yang disediakan tidak tebal kerana inokulum yang besar akan mengurangkan bilangan sel yang menunjukkan tiub germa (105 – 106 sel/ml adalah kepekatan optimum). Eramkan pada suhu 37°C selama 3 jam di dalam penganggas air. 4. PERHA TIAN Dalam pengamatan fungus pada kultur plat agar.3. di dalam struktur itu sendiri. Di samping jenis media. PERHATIAN Tiub germa akan kelihatan sebagai filamen yang muncul daripada blastospora tanpa adanya penyempitan mahupun pembengkakan pada bahagian-bahagian tertentu di sepanjang filamen tersebut. Tofografi: Mendatar dan berlipat secara terpencar Mendatar dan tepian bulat menyeluruh 57 . Morfologi Keseluruhan Koloni Fungus 1. Walau bagaimanapun.2. 2. beberapa faktor lain seperti suhu pengeraman dan umur koloni juga mempengaruhi tekstur koloni fungus. seboleh-bolehnya elakkan daripada membuka penutup Petri/botol. Buat pelekapan basah selepas 1 jam. CIRI-CIRI KOLONI FUNGUS 4. adalah penting jenis media pertumbuhannya juga disebutkan kerana fungus boleh mempamerkan ciri yang berbeza-beza menurut jenis media yang digunakan. sekalipun daripada strain yang sama. Dengan penyempitan Tanda penyempitan NOTA 1. pigmentasi pada fungus sering kali tidak digunakan sebagai ciri pengesahan utama spesies-spesiesnya kerana ciri ini umumnya tidak stabil atau berubah. tetapi juga mereka yang berada di dalam ruangan yang sama. kerana ini akan menyebabkan terjadinya aerosol yang mengandungi spora fungus yang akan bertebaran di udara dan boleh tersedut oleh bukan sahaja orang yang sedang mengkajinya. Dalam catatan mengenai morfologi koloni fungus. Serum yang digunakan kali pertama harus diuji dengan suatu strain Candida albicans yang telah dipastikan boleh mengeluarkan tiub germa. dan amati penghasilan tiub germa di bawah mikroskop.3. Pigmentasi pada permukaan fungus biasanya dihasilkan oleh spora dan hifa. Bagi sesetengah individu ini boleh menimbulkan alahan yang serius. manakala pigmentasi pada bahagian dasar koloni ditentukan melalui pigmen hifa vegetatif dan pigmen larut yang meresap ke dalam agar.

Mendatar dan berlipat tak teratur Mendatar dan tepian bergerigi Bertimbun dan ala-tombol Bertimbun dan bahagian tengahnya tertekan Menaik ala-butang Kraterforme hingga ke bentuk plikatil Berkerut Serebriforme (serupa otak) 2. Tekstur: Krim (seperti rupa koloni yis) seperti tekstur lilin Berserbuk Berkapas Bergranul (berpasir/berbutir) seperti baldu 3. Pigmentasi: (permukaan dan dasar koloni) Berbeza bergantung kepada umur dan jenis fungus Istilah Bahasa Malaysia – Bahasa Inggeris tepian bulat menyeluruh tepian bergerigi berlipat tak teratur tengahnya tertekan ala-tombol ala-butang menaik ala-tekstur lilin ala-baldu entire edge fringed edge irregular folding depressed center knob-like button-like raised glabrous velvety 58 .

serum lembu yang menjadi pilihan. Larutan ini dicampurkan dengan asid amino dan vitamin serta glukosa sebagai sumber tenaga. Jika media berbentuk serbuk. Fenol merah digunakan sebagai penunjuk pH. PENGKULTURAN VIRUS Berbeza dengan bakteria dan fungus. Serum (biasanya serum lembu) diperlukan untuk pengkulturan sel dan sistem fisiologik ini memerlukan suatu sistem pengawalan pH iaitu sejenis larutan tampan.3. Apabila hendak digunakan media dikeluarkan dari simpanan dan biarkannya pada suhu bilik buat seketika dan kemudian buatkan suatu pencairan berkepekatan 1X dan campurkan bahan-bahan yang diperlukan untuk pertumbuhan.2 µm. Media ini mengekalkan pH. virus hanya boleh beraplikasi di dalam sel hidup. Media yang pekat boleh disimpan di dalam bekas-bekas yang lebih kecil. Media ini umumnya didapati dalam bentuk serbuk atau cecair dan dalam kepekatan 1X atau 10X.4. Serum Jenis serum yang diperlukan bergantung kepada jenis kultur sel. pada suhu – 20°C jika boleh.3. 2. maka ia dipilih dan diutamakan daripada bentuk lainnya. Antibiotik juga dicampurkan ke media untuk mengawal daripada pencemaran serta pertumbuhan mikrob.1. Media mesti disterilkan melalui penyaringan dengan penyaring membran berukuran liang 0. Agihkan ke dalam isipadu 10 atau 20 ml. ia terlebih dahulu dilarutkan di dalam air suling supaya mencapai kepekatan 5X atau 10X. Oleh demikian. sel yang dapat ditumbuhi dan dibiakkan in vitro boleh merupakan suatu sumber ‘media’ untuk pembiakan virus. Gunakan serum fetus lembu kerana serum ini berbeza dengan serum lembu dewasa atau anak lembu. Jika sesuatu jenis media yang berkepekatan 10X didapati dalam bentuk cecair. Oleh itu kita perlu menumbuhkan sel-sel tertentu terlebih dahulu untuk dijadikan kultur bagi pembiakan virus. Aspek-aspek mengenai pertumbuhan sel secara in vitro ini dikenal se-bagai kultur sel. Pastikan semua media serbuk dilarutkan sehingga kelihatan betul-betul jernih. 59 . tekanan osmotik dan membekalkan tenaga. Pastikan serum fetus lembu yang diperolehi mempunyai jangka hayat simpanan yang panjang. Media Maklumat tentang kesesuaian sesuatu media untuk sesejenis kultur sel boleh didapati dari buku maklumat yang dikeluarkan oleh syarikat yang memasarkan media kultur berkenaan atau dari artikel jurnal. Agih-agihkan media ini dalam isipadu 10 atau 20 ml di dalam botol universal dan simpan beku. KULTUR SEL DALAM VIROLOGI Media Kultur Sel Semua media yang digunakan dalam kultur sel atau tisu pada asasnya mengandungi suatu campuran tiruan yang terdiri daripada garam-garam tak organik yang disebut larutan garam seimbang atau larutan garam fisiologik. Eramkan serum lembu di dalam penganggas air pada suhu 50°C selama 30 minit untuk menghapuskan bahan atau faktor-faktor yang terdapat di dalamnya yang boleh menghalang pertumbuhan sel apabila digunakan nanti. Simpan beku. 1. seharusnya pada suhu – 20°C. terutama disebabkan ia bebas daripada antibodi yang mungkin dapat menghalang pengkulturan virus dalam kultur sel. Dalam kebanyakan kultur sel. dan tarikh diagihkan. Labelkan nombor pengeluaran (batch number). 4. Pastikan sampel dari sesuatu botol itu steril dan dapat menampung pertumbuhan kultur sel dengan baik dengan membandingkannya dengan serum yang diketahui memberikan hasil yang baik.

Jika natrium bikarbonat diperlukan juga sebagai nutrien maka kepekatannya seharusnya tidak melebihi 10 mM (0. Kepekatan natrium bikarbonat yang digunakan adalah bergantung kepada jenis media. Media kultur sel Serum fetus lembu Antibiotik (Gentamicin dan Amphotericin B) NaHCO3 Air suling (steril) Bekas (steril) Pipet bersukat (steril) TATACARA 1. Simpan pada suhu bilik.2 µm. Sistem Penampan pH yang Digunakan di dalam Media Kultur Sel Pertumbuhan sel haiwan di dalam media kultur sel yang lengkap biasanya adalah optimum apabila media ditampan dalam julat pH 7. Persediaan Natrium Bikarbonat Larutkan 5. Agih-agihkannya ke dalam botol yang kemudian ditutup rapat. gunakan pipet steril untuk memindahkannya). Gaskan dengan CO 2 sehingga warna media menjadi oren. 4. serum dan antibiotik mencair pada suhu bilik di atas meja. Larutan penampan ini digunakan dalam sistem tertutup (bekas kultur ditutup rapat) yang diseimbangkan dengan udara atau sistem terbuka (seperti piring Petri) yang diseimbangkan dengan atmosfera yang mengandungi kadar CO 2 yang tinggi seperti di dalam inkubator CO2. Larutan antibiotik dicairkan 1:100 di dalam media. 7.4. 2. Saringkan dengan menggunakan penyaring membran berukuran liang 0. 60 .2 µm atau diautoklaf pada 20 tekanan paun setiap inci (pound per square inch: psi). Tuangkan media ke dalam 1 botol steril jika kesemua kandungannya diperlukan (jika hanya sebahagian sahaja media yang diperlukan. Lapkan permukaan luar setiap bekas dengan tuala kertas sehingga kering. Jangan masukkan ke dalam penganggas air untuk mengelakkan pencemaran. Kepekatan yang sesuai digunakan adalah Gentamicin 30 µg/ml dan Amphotericin B 5 µg/ml. 4.5 ml fenol merah 0. Antibiotik Antibiotik dicampurkan ke media kultur untuk menghalang pertumbuhan mikrob. Untuk kedua-dua jenis antibiotik ini. gunakan gred yang ditentukan khusus untuk kultur sel. disaring melalui penyaring dengan saiz liang 0. 3. Tatacara dalam Persediaan Media Kultur Sel BAHAN 1. Adalah sesuai jika ia disediakan dalam kepekatan 10X yang seterusnya hanya perlu dicairkan menjadi 1X apabila hendak digunakan nantinya di dalam media lengkap.2 hingga 7. diagih-agihkan dalam isipadu 1.0 ml dan disimpan beku.4%. Kedua-dua agen antimikrob ini disediakan dalam kepekatan 100X di dalam air suling steril (jika dibekalkan dalam bentuk serbuk). Amphotericin B adalah agen antifungus.3. Larutan natrium bikarbonat disterilkan melalui penyaringan ataupun diautoklaf. Larutan penampan pH yang sering kali digunakan di dalam media kultur sel adalah natrium bikarbonat.5 ml air suling dan campurkan 0.6g NaHCO 3 di dalam 95. Gentamicin adalah agen antibakteria berspektrum luas (aktif terhadap bakteria Gram-positif dan Gram-negatif) dan berkesan terhadap mikoplasma. Antibiotik yang sesuai adalah Gentamicin dan Amphotericin B (Fungizone). 6.85 g/l). Larutan tampan HEPES (asid N-2-Hidroksietilpiperazin-N’-2-etanasulfonik) yang berfungsi sebagai zwitterion juga boleh digunakan sebagai larutan penampan menggantikan natrium bikarbonat dalam sistem terbuka dan ia digunakan pada kepekatan mutlak 20 mM. Biarkan reagen yang disimpan beku seperti media. 5. 2. 3. 5.

5. 6. Tempoh simpanan media yang mengandungi serum adalah 4 minggu.0 % tripsin dan 0. 7. 7.4. Simpan media pertumbuhan atau pengekal pada suhu 4°C. 11. goncangkannya terlebih dahulu untuk menentukan kehadiran pencemaran yang berat yang ditandai dengan kekeruhan pada media tersebut. PERHATIAN Persediaan ini dilakukan dengan menggunakan kabinet aliran udara laminar kelas 1 atau kelas 2. N OTA 1. 8. L-glutamina. Larutan tripsin dan versena Larutkan 1. 12. 2. 10. Tatacara untuk Tripsinisasi Tisu Seluruh BAHAN 1. salah satu komponen sesetengah media. adalah tidak stabil dalam bentuk cecair. bagi media yang seharusnya mengandungi L-glutamina. Sterilkan dengan menggunakan penyaringan membran dengan liang 0. Biasanya media pertumbuhan memerlukan 5 – 10% serum dan media pengekal 0 – 2%. 4.4% versena di dalam PBS. 61 . Campurkan isipadu air suling yang diperlukan diikuti dengan larutan penampan dan antibiotik. asid amino ini perlulah ditambahkan ke dalamnya jika media tersebut disimpan lebih daripada 2 minggu. Campurkan serum supaya mencapai peratus kepekatan yang diperlukan. Ini bukanlah suatu pencemaran. Sebelum media digunakan.2 µm. tetapi seboleh-bolehnya elakkan daripada menggunakannya. TRIPSINISASI Tripsinisasi adalah proses peleraian tisu atau sel selapisan kepada sel-sel individu menggunakan enzim tripsin. Serum yang dibeku dan dicairkan kadangkala mengandungi serpihan-serpihan yang mendap di dasar botol. 5. 3. Oleh yang demikian. 9. 6. 2. Campurkan kedua-dua jenis larutan ini dalam isipadu yang sama. Seluruh haiwan atau tisu Gunting 2 pasang Gunting bengkok dan tajam Alat pengaduk magnet Magnet disaluti silikon/teflon Kelalang kon Larutan tripsin-versena Etanol 70% Larutan salin ditampan fosfat (phosphate buffered saline: Gentamicin dan Fungizone 5 µg/ml Penyaring kasar (steril) Mikroskop cahaya jenis terbalik Bekas kultur sel PBS) yang mengandungi 30 µg/ml PERSEDIAAN 1. Simpan pada suhu 4°C.

25% dan versena 0. Sebelum sel ini boleh dipindahkan ke tempat lain atau separuh daripadanya dikeluarkan untuk mengelak kesesakan yang akan menghalang pertumbuhan dan menjejaskan keupayaannya untuk hidup (viabilitinya). Dari masa ke masa tuangkan sel yang telah dileraikan daripada tisu dan simpan pada 4°C. kelalang tidak diletakkan secara langsung di atas plat pemanas tetapi dimasukkan ke dalam sebuah bikar berisi air yang ditempatkan di atas plat pemanas tersebut. Aturkan nilai pH larutan kepada 7. Masukkan PBS yang mengandungi antibiotik dan antifungus. Tambahkan air suling sehingga mencapai satu liter.2g KH2PO4 di dalam 950 ml air suling. manakala majoriti akan melekat pada permukaan bekas kultur dan tumbuh membentuk satu lapisan sel. Dalam pilihan kedua. Tambahkan tripsin baru dan aduk semula. 5. Tripsinisasi Sel Selapisan dan Pengeraman Kultur Sel Sesetengah jenis kultur sel wujud sebagai suspensi di dalam bekas kultur. 2.3.0g NaCl. Campuran tripsin 0. Suhu 37°C dapat dicapai dengan melakukan proses peleraian di dalam bilik panas atau dengan menggunakan alat pengaduk magnet yang juga berfungsi sebagai plat pemanas. Tatacara berikut dilakukan dalam keadaan aseptik dengan menggunakan peralatan yang steril. Larutkan 8. 0. Goyang piring Petri perlahanlahan untuk membersihkan potongan-potongan tisu. Semua alat dan reagen yang digunakan disterilkan terlebih dahulu. Ubah kepekatan sel menjadi 2 x 10 5 sel/ml media pertumbuhan dan kulturkan di dalam bekas kultur. 3. Agih-agihkan larutan ini ke dalam botol dan sterilkan dengan autoklaf pada 10 psi (suhu mencapai aras 115°C) selama 15 minit. Lap kulit bahagian yang terdedah ini dengan etanol 70% dan bedah/potong untuk mendapatkan organ yang diperlukan. Elakkan daripada terjadinya pembentukan buih (frothing) semasa tisu diaduk. Masukkan larutan tripsin-versena (lebih kurang 20 ml setiap 1g tisu). 4.15g Na2HPO4. 6. Tatacara untuk Tripsinisasi Sel Selapisan dan Pengeraman Kultur Sel BAHAN 1. Tambahkan tripsin baru setiap kali ini dilakukan. 1. sel mestilah ditanggalkan dari permukaan bekas kultur. 10. 2.2% PBS tanpa kalsium dan magnesium (steril) 62 . Simpan pada suhu bilik. 3. 7. Bunuh haiwan yang berkenaan dan letakkan menelentang supaya bahagian tubuh atau tapak di mana pembedahan akan dijalankan terdedah. TATACARA 1. Keluarkan organ dan letakkan di dalam piring Petri di mana ia dipotong menjadi serpihanserpihan kecil berukuran 2 mm3. 9.2g KCl. Saring suspensi sel melalui penyaring kasar untuk memisahkan sel-sel dari serpihan tisu-tisu besar.PBS tanpa kalsium dan magnesium 2. Aduk kandungan kelalang dengan pengaduk magnet pada suhu 37°C. 0. 11. 2. N OTA 1. Tuangkan larutan tripsin 10 minit selepas proses ini bermula. 8. Emparkan suspensi sel pada 400 g selama 15-30 minit dan leraikan mendapan sel di dalam media yang sesuai dan lakukan perhitungan hidup. Pindahkan potongan tisu ke dalam sebuah kelalang kon yang mengandungi magnet yang disaluti teflon atau silikon.

1.5% dan versena 0. Jika didedahkan terlalu lama kepada tripsin. 4. tutup penutup bekas kultur dengan rapat. Oleh itu. media yang mengandungi serum digunakan dalam mensuspensikan sel selepas sel-sel ditanggalkan. Campurkan 2 jenis larutan ini dalam isipadu yang sama. sel tidak perlu dicuci melalui emparan dan supernatannya dituang keluar untuk menghilangkan campuran tripsin dan versena tersebut. Aturkan kepekatan suspensi sel supaya mencapai 1 x 105 sel/ml media pertumbuhan. 6. Cuci 2 kali dengan PBS : pipet PBS ke dalam bekas. 11. 8. Goncangkan bekas kultur sel sebelum diletakkan di dalam inkubator supaya sel-sel bertaburan sama rata. Pada jenis kultur sel yang tumbuh dengan pesat. 10% O2. sel-sel akan mati. Pipet bersukat (steril) Mikroskop cahaya jenis terbalik Kabinet aliran udara laminar kelas 1 atau 2 PERSEDIAAN 1. 10. 2. pipet keluar PBS. Keluarkan media secara aseptik dengan pipet bersukat. kultur sel ini dieramkan di dalam inkubator CO 2 yang mengandungi CO2 pada kadar 5%. Masa yang diambil untuk penanggalan sel daripada permukaan dalam bekas bergantung kepada jenis kultur yang terlibat. N OTA 1. untuk menghalang aktiviti tripsin tersebut. TATACARA 1. 2.5% N 2) ke dalam bekas kultur menggantikan udara di dalam ruang bekas sebelum penutupnya ditutup dengan rapat. Sel akan mengalami kerosakan atau mati jika didedahkan terlalu lama. Simpan pada suhu 4°C. Masukkan sedikit campuran tripsin dan versena dan goncangkan botol untuk meliputi ke seluruh monolapisan sel. alirkan campuran gas (9% CO2.2g KH2PO4 di dalam 950 ml air suling. 81. Larutan tripsin dan versena Larutkan tripsin 0. Pipet media pertumbuhan (isipadunya bergantung kepada saiz bekas) ke dalam bekas dan cuci sel daripada permukaan bekas dengan memancutkan media daripada pipet yang dipasang dengan bal penyedut getah untuk meleraikan kelompok sel.4% di dalam PBS . Eramkan pada suhu 37°C selama 1 hingga 5 minit. Pencairan dengan media pertumbuhan boleh mengurangkan kepekatan tripsin dan versena kepada suatu aras yang tidak akan menjejaskan pertumbuhan sel. 3. 63 . Jika campuran tripsin dan versena yang digunakan sedikit sahaja.3. 9. Agihagihkan ke dalam botol dan sterilkan dengan autoklaf pada 10 psi (115°C) selama 15 minit. 7. Sterilkan dengan menggunakan penyaring membran dengan liang 0-2 µm. amati sel dengan mikroskop untuk menentukan sama ada sel telah menjadi bulat dan/atau telah tanggal. 5. Biarkan botol berdiri tegak selama 1 hingga 2 minit sebelum cecair yang mengalir ke dasar bekas dipipet keluar. Dalam masa ini.15g Na 2HPO4 dan 0. Aturkan nilai pH larutan kepada 7.0g NaCl. Peganglah kultur sel hampir tegak lurus dan ketuk permukaan bekas kultur untuk menentukan sama ada sel boleh ditanggalkan (dilepaskan) daripada permukaan atau belum. PBS tanpa kalsium dan magnesium Larutkan 8. Pada sistem terbuka. Amatilah selalu dengan mikroskop untuk menentukan sama ada sel telah berbentuk bulat. 3. 2.2g KCl. 5. 4. goncangkan bekas kultur supaya PBS meliputi sel monolapisan. Hitunglah suspensi sel dengan hemositometer. Aktiviti tripsin ini boleh dihapuskan oleh serum. Tambahkan air suling sehingga mencapai 1 liter. Simpan pada suhu bilik.3. Pada jenis kultur sel yang tumbuh dengan lambat atau perlahan. 0.

sel yang menyentuh atau melintang garis sebelah kiri dan atas setiap segi SES dihitung atau diambil kira. Kriopengawetan Sel yang Hidup Oleh kerana kultur sel adalah suatu hidupan. manakala yang menyentuh atau melintang garis bawah dan kanan SES tidak dihitung atau diabaikan. maka sel-sel di dalam kesemua 25 SES kecil dihitung. Apa yang perlu hanyalah menghitung sel-sel di dalam SES kecil yang terletak di tengah dan di keempat-empat sudut hemositometer tersebut sahaja). kultur sel dari satu bekas kultur dibahagikan (dibelah) kepada dua hingga empat bahagian (bergantung kepada jenis kultur sel) dan setiap bahagian dikulturkan secara berasingan di dalam bekas kultur yang mempunyai isipadu yang sama dengan bekas induk. Sebab kedua kenapa penyimpanan sel ini diperlukan adalah kerana sesuatu kultur sel itu hanya digunakan pada masa-masa tertentu sahaja. penjimatan kos. dalam keadaan yang telah menjadi kebiasaan seperti pertumbuhan sel di dalam bekas kultur yang sama ukurannya. Dalam keadaan tertentu. TATACARA 1. 5. Sebagai panduan.1% tripan biru di dalam PBS Hemositometer jenis Neubauer Mikroskop cahaya PERSEDIAAN Tripan biru 0. kepekatan sel mestilah ditentukan terlebih dahulu supaya jenis sel dengan kepekatan yang diperlukan boleh ditetapkan.1% di dalam PBS Larutkan 0. 5. Simpan di dalam peti beku. Pada posisi ini lapisan sel lebih mudah diamati dan sel-sel ditanggalkan dengan lebih mudah kerana tidak diselaputi oleh lapisan media semasa dicuci. Semasa mencuci sel-sel daripada permukaan bekas kultur. Hemositometer Neubauer mempunyai sembilan segi empat sama (SES) yang besar terletak di tengah. Larutkan 1/10 dengan 10X PBS sebelum digunakan. Bilangan sel ml-1 = jumlah sel yang dihitung x 25 x 10 4 x faktor pencairan jumlah SES yang digunakan 6. peganglah bekas supaya permukaan di mana terdapatnya sel adalah di atas. ada kemungkinan kultur sel ini boleh terhapus disebabkan kemusnahan akibat pencemaran oleh bakteria atau fungus. Hitung sel di dalam SES yang kecil ini. Saringkan melalui kertas turas. 3. SES ini dibahagikan pula kepada 25 SES yang dipisahkan oleh tiga garis. Tatacara Menghitung Sel dengan Menggunakan Hemositometer BAHAN 1. tenaga dan masa boleh dicapai jika kultur sel ini disimpan sewaktu tidak digunakan. atau ia mengalami kematian kerana keadaan pertumbuhan yang tidak sesuai. Suspensi sel 0. Tetapi jika suspensi mengandungi banyak sel maka perhitungan sel-sel di dalam kesemua SES kecil tidak perlu dilakukan lagi. Dalam hal ini. Satu sebab lain yang penting dalam hal penyimpanan kultur sel ini. 2. tatacara nisbah perpisahan (split ratio) boleh digunakan. Dalam cara ini. 2. 4.1% tripan biru di dalam 10 ml air suling.4. walaupun tidak 64 . 3. Untuk mengelakkan daripada kehilangan sel-sel ini sebahagian dari-pada kultur sel berkenaan haruslah disimpan dalam keadaan yang boleh mengekalkan viabilitinya tanpa pertumbuhan. 4. Hitunglah sekurang-kurangnya 100 sel (ini bermakna bahawa pada suspensi tidak mengandungi banyak sel. Tetapi.

Tatacara Kriopengawetan Sel yang Hidup BAHAN 1. Balutkan dengan kapas. Pindahkan 1 ml ke dalam setiap kriovial. 2. Keluarkan supernatan dan masukkan media pertumbuhan yang mengandungi DMSO 10%. 65 . kemudian balut dengan kertas timah dan masukkan ke dalam satu kotak polistirena (5-10 cm tebal). 9. 5. 4. 2. tukarkan media kultur sekitar 24 jam sebelum sel diproses. Emparkan pada 200 g selama 15 minit. iaitu dalam fasa tumbesaran logaritmanya dan hampir mencapai lapisan sel yang meliputi keseluruh permukaan bekas kultur. 10. kultur ini boleh digantikan dengan kultur sel lain yang disimpan. 6.5%) dan versena (0. Sediakan suspensi sel di dalam media yang mengandungi serum 10% (lihat tatacara tripsinisasi sel. pensterilan ke atas bahan adalah tidak perlu kerana DMSO dianggap steril. Jangan tambah DMSO kepada suspensi sel secara langsung ke dalam media pertumbuhan. ialah untuk mengekalkan ciri-ciri kultur sel tertentu. Jika sel mengambil masa yang lama untuk mencapai keadaan di atas. 5. Simpan pada lantai peti bek – 70°C semalaman dan segera pindahkan ke dalam bekas yang mengandungi nitrogen cecair.02%) Media pertumbuhan PBS (steril) Tripan biru Dimetil sulfoksida (DMSO) Kriovial Peti beku suhu – 70°C Tangki nitrogen cair untuk menyimpan spesimen Alat emparan Mikroskop cahaya Mikroskop cahaya terbalik Kapas Kertas timah nipis PERSEDIAAN Dimetil sulfoksida (DMSO) 10% v/v di dalam media pertumbuhan Tambahkan 1 ml DMSO ke dalam 9 ml media yang mengandungi serum 10% pada hari kultur sel akan disimpan. Dalam hal ini. Atursuaikan supaya kepekatan sel adalah 2 x 106 sel setiap ml. 8. Pilih kultur sel yang sihat. 7. 15.) dan tarikh. nombor pindahan sel (cell passage no. 12. 3. Kultur simpanan ini lazimnya masih mempunyai ciri-ciri yang dikehendaki kerana ia merupakan kultur sel yang mempun-yai riwayat pensubkulturan yang awal. Apabila sesuatu sel dikulturkan untuk jangka masa yang berlarutan terdapat kemungkinan ciri-cirinya akan berubah: yang paling sering dikesan ialah sensitivitinya terhadap virus menjadi berkurangan. 3. Jika perubahan yang tidak sesuai berlaku dalam kultur sel yang sedang digunakan. 10. Kultur sel Campuran larutan tripsin (0. jika ada.begitu ketara. 2. Labelkan kriovial dengan nama sel. 11. N OTA 1. Campurkan dan hitung jumlah sel untuk menentukan kadar sel hidup. 14. 3. 6. 9. 8. 4. TATACARA 1. 7. Pindahkan ke dalam 1 tabung atau botol steril dan tambahkan media jika perlu. ms 62-64).

8. Amalan ini dipraktikkan kerana sel haiwan yang disimpan pada suhu – 70°C tidak boleh mengekalkan viabilitinya dalam masa yang begitu lama. kriovial lebih mudah dikendalikan kerana dilengkapi dengan penutup. 7. Keluarkan kriovial/ampul sejurus selepas suspensi sel menjadi cair. Keringkan permukaan luar ampul dan lap dengan alkohol. 3. adalah lebih selamat jika sel disimpan di dalam nitrogen cair. 6. Selepas beberapa jam hingga semalaman. 5. Adalah penting suhu kultur sel yang disimpan dikurangkan secara beransur-ansur. 2. selepas sel telah melekat pada permukaan bekas kultur pipet keluar media dan gantikan dengan media baru. Untuk mengelakkan penyejatan. 6. 2. Kriovial kultur sel Media pertumbuhan Penganggas air 37°C Bekas kultur sel Pipet steril Inkubator suhu 37°C TATACARA 1. tudung ampul dengan sehelai kain dan pakai kaca mata pelindung kerana ampul yang tidak ditaup dengan sempurna boleh meletup. 3. Jika ampul kaca digunakan. 5. Tatacara Mengkulturkan Semula Sel yang Dikrioawetkan BAHAN 1. Ini dicapai dengan kriovial dibalut dengan kapas serta kertas timah dan disimpan di dalam kotak polistirena. 4. 7. Adukkan suspensi sel sejurus sebelum diagihkan ke dalam botol kriovial untuk memperoleh suspensi sel yang sama rata. pastikan aras air tidak mencapai penutupnya untuk mengelak kemungkinan air menyentuh bahagian mulut kriovial dan berlakunya pencemaran. 66 . 5. pastikan salah satu bekas kultur sel daripada kumpulan ini boleh dihidupkan semula tanpa terjadinya sebarang pencemaran mikrob. 8. Tambahkan media pertumbuhan yang mengandungi DMSO yang tersedia kepada sel-sel selepas diemparkan.4. Pindahkan kandungan kriovial atau ampul ke dalam sebuah bekas kultur dan campurkan media pertumbuhan ke dalamnya. manakala ampul biasanya harus ditutup melalui penaupan dengan pembakaran api. N OTA 1. Eramkan pada 37°C. Keluarkan sebuah kriovial dari tempat simpanan dan serta-merta pindahkannya ke dalam penganggas air. Semasa kandungan kriovial dicairkan. Pegang kriovial di dalam penganggas air sehingga semua pembekuan menjadi cair. Lagipun. Oleh kerana amat sukar untuk mengekalkan suhu peti beku pada – 70°C. bekas nitrogen cair disimpan di dalam bilik sejuk dan dipastikan nitrogen cair ditambahkan semula dalam tempoh masa yang sesuai mengikut kekerapan bekas tersebut dibuka. Sebelum sesuatu kumpulan kultur sel yang disimpan dianggap sempurna. 4. 6. kadangkala ampul yang dimasukkan ke dalam air untuk pencairan boleh meletup jika penaupan tidak dilakukan dengan sempurna. 9. Kita juga harus menyedari bahawa ada kemungkinan suhu – 70°C tersebut tidak dicapai di seluruh ruangan simpanan di dalam peti beku. Kultur sel yang disimpan pada – 70°C harus dikulturkan selepas 6 bulan sebelum disimpan semula. Walaupun ampul kaca atau polipropilen boleh digunakan sebagai bekas untuk simpanan.

Jika kultur berada di dalam bekas kaca. Tatacara Inokulasi Kultur Sel dengan Virus BAHAN 1. media boleh dikeluarkan dengan pipet yang dihubungkan kepada sebuah pam udara. Untuk memperoleh pemulihan kultur sel yang lebih cepat. 1. Pergandaan infektiviti. eramkan kultur di dalam inkubator CO 2.2. 3. Permukaan bekas kaca dibakar sebelum dan sesudah cecair dituang. 7. 5. Pilih suhu pengeraman yang optimum untuk sesejenis virus yang dikulturkan. 8. 2. Penjerapan boleh dilakukan pada suhu bilik atau pada suhu pengeraman kultur. 6. Persediaan ini dilakukan dengan menggunakan kabinet biohazard kelas 2. Bekas kultur sel digoncang bukan sahaja untuk menyebarkan virus tetapi juga untuk mempastikan seluruh sel monolapisan sentiasa diliputi cecair untuk mengelak daripada kekeringan. 2. Lap keseluruhan bahagian luar bekas dengan alkohol untuk mengelakkan pencemaran. Jika banyak kultur sel perlu diinokulasi dalam masa yang sama. 67 . Cuci 2 kali dengan PBS.o. 4. 3. 4. atau udara di dalam ruangan bekas kultur digantikan dengan campuran gas yang mengandungi CO 2 5%. Media kultur dibuang dan digantikan dengan yang baru secepat boleh supaya DMSO dan selsel yang mati yang boleh menjejaskan pertambahan sel-sel yang hidup disingkirkan. 9. 5. 3. N OTA Lakukan pencairan virus supaya mencapai pergandaan infektiviti (multiplicity of infection. Suspensi virus Larutan garam seimbang Hank dengan antibiotik (pencair virus) Kultur sel dalam bentuk monolapisan penuh PBS (steril) TATACARA 1. atau di dalam bekas khas yang mengandungi CO 2 5%. Amati kultur sel dan pilih kultur yang hampir atau baru mencapai monolapisan yang lengkap atau penuh (seluruh permukaan bekas kultur sel diliputi dengan sel). 3.) yang sesuai. m. suhu pengeraman adalah 37°C sungguhpun pada virus respiratori suhu yang lebih rendah. yakni 35°C merupakan suhu yang optimum. Amati kehadiran kesan sitopatik (untuk virus sitopatik) setiap hari atau selang sehari. Sama ada inokulum virus dikeluarkan selepas tempoh penjerapan atau tidak bergantung kepada keperluan. Masukkan media pertumbuhan dan eramkan pada suhu yang sesuai. Penjerapan virus dilakukan dalam isipadu cecair yang kecil untuk memudahkan kontak di antara virus dan sel. Keluarkan media dari bekas kultur. 7. pada peringkat awal tempoh pertumbuhan sel. 5.o.i. kandungannya bolehlah dituang. 4. 6. 4.i yang terlalu tinggi digunakan ada kemungkinan sebahagian besar virus yang tak lengkap dihasilkan. 2. Eramkan pada suhu yang sesuai (biasanya pada suhu 37°C) selama 30-60 minit. Jika m. adalah nisbah partikel virus berinfeksi dan sel. Masukkan suspensi virus ke dalam bekas kultur dan sebarkan ke seluruh lapisan sel. Pada kebanyakan virus haiwan. Goncangkan bekas setiap 10-15 minit untuk menyebarkan semula suspensi virus ke seluruh monolapisan. Sama ada kriovial digoncang untuk menggalakkan pembekuan suspensi sel supaya lebih cepat mencair atau tidak bergantung kepada jenis sel tertentu kerana terdapat jenis sel yang viabilitinya terjejas akibat goncangan dengan kuat.

Gunakan pita selofan untuk melekatkannya dan mengekalkan bentuk ini. 3. Semua ini adalah tanda yang menunjukkan bahawa embrio tersebut masih hidup. N OTA Pilih telur yang bersih dan mempunyai cangkerang yang berwarna putih pudar untuk memudahkan pengamatan bahagian dalamnya.4. Gunting kedua-dua penghujung kon ini supaya tepinya menjadi sama rata dan garis pusat bahagian yang lebih besar adalah sama dengan ukuran kepala lampu dan bahagian kecil adalah lebih kurang sama dengan ukuran penghujung telur yang lebih bulat. 4. Tatacara Penyuluhan Telur BAHAN 1. TATACARA 1. yang digunakan ialah kotak cahaya atau lampu suluh yang telah diubahsuai. 4. Pilih tempat yang gelap. khususnya mata embrio yang besar dan kehadiran ruang udara. PENGKULTURAN VIRUS DENGAN MENGGUNAKAN TELUR BEREMBRIO Telur ayam berembrio hidup merupakan suatu sistem yang digunakan untuk pengkulturan beberapa jenis virus. 3. tapak yang sesuai untuk suntikan. membran alantoik dan membran korioalantoik – boleh digunakan bergantung kepada jenis virus yang terlibat. Pengamatan Telur Melalui Transiluminasi (Penyuluhan) Embrio telur dipastikan hidup dengan cara transiluminasi yang diberi istilah candling dalam bahasa Inggeris kerana pada zaman dahulu cahaya lilin digunakan untuk tujuan ini.2.3. 2. 6. 68 . Dengan ini cahaya lampu akan ditujukan ke luar melalui lubang yang lebih kecil. 2. Tiga jenis tapak pada telur – membran amnion. Telur berembrio Lampu suluh Kertas manila Pita selofan Gunting Pena penanda PERSEDIAAN Alat untuk penyuluhan Gulungkan sekeping kertas manila supaya berbentuk kon. Tekan lubang terowong lampu suluh kepada cangkerang telur. bentuk embrio juga jelas kelihatan. Pastikan salur darah korioalantoik telur berembrio kelihatan jelas sekali dan embrio bergerak-gerak. Nyalakan lampu dan amatilah bahagian dalam telur. Pada masa ini. Sebelum inokulasi dilakukan adalah penting untuk menentukan terlebih dahulu sama ada telur yang akan digunakan tersebut mempunyai embrio yang masih hidup dan kedua. Perkukuhkan kontak ini dengan menambahkan pita selofan. 5. Pasangkan penghujung kon yang besar kepada kepala lampu suluh.

4. 7. Tandakan dengan pena tanda satu tapak yang agak berjauhan dengan sebarang salur darah. 4. 3. 6. 2. Tatacara Penyuntikan Virus di dalam Ruang Amniotik BAHAN 1. Tandakan dengan pena penanda tapak ruang udara. Suntikan Virus ke dalam Ruang Amniotik Cara ini digunakan untuk pemencilan primer (kali pertama virus ditumbuh dalam keadaan makmal) virus influenza dan mumps. 5.Suntikan Virus ke dalam Ruang Alantoik Pertumbuhan virus di dalam membran alantoik digunakan untuk virus influenza dan paramiksovirus yang telah disesuaikan beraplikasi dalam keadaan makmal. 3. 5. 3. Ketuk dan pecahkan cangkerang tepat di atas ruang udara berkenaan dengan pemegang gunting dan guntingkan satu lubang besar sehingga mencapai pinggir ruang udara. 3. Suluh telur untuk menentukan embrio masih hidup. Lap tapak celah tersebut dengan etanol. 2. Telur berembrio berumur 10 hingga 12 hari Jarum (28 gauge) dan picagari Etanol 70% Penggerudi berputar yang dipasang dengan cakera pemotong Pita selofan TATACARA 1. Lapkan membran cangkerang dengan parafin cecair supaya membran cangkerang menjadi jernih. 7. 2. 6. 4. 5. Suntikkan 0. Tatacara Penyuntikan Virus ke dalam Ruang Alantoik BAHAN 1. Tutup celah dengan pita selofan.1 ml inokulum ke dalam celah ini dengan jarum yang dimasukkan beberapa mm ke dalam celah. Telur berembrio berumur 10-12 hari atau 12-14 hari Jarum panjang (11/4) dan picagari berisipadu 1 ml Etanol 70% Penggerudi berputar yang dipasang dengan cakera pemotong Pita selofan Parafin cair Gunting kecil dengan penghujungnya bengkok Swab steril TATACARA 1. Terbalikkan telur untuk membersihkan membran cangkerang daripada cebisan-cebisan cangkerang. Gerudi satu lubang atau celah yang kecil pada cangkerang pada tapak yang ditandakan untuk mendedahkan membran cangkerang. Eramkan dengan tapak yang diinokulasi virus di sebelah atas selama 1 hingga 3 hari mengikut keperluan. 69 . 4. Suluh telur untuk menentukan embrio masih hidup. 5. 2. 8.

1 ml inokulum ke dalam celah ini dengan jarum yang dimasukkan beberapa mm ke dalam celah. 3. Tutup celah dengan pita selofan. Telur berembrio selepas penyuntikan virus dan pengeraman Gunting Pipet Pasteur Botol (steril) Etanol 70% 70 .6. Penyuntikan Virus ke atas Membran Korioalantoik Pengkulturan virus di atas membran korioalantoik membolehkan perbezaan di antara poksvirus jenis variola dengan vaksinia dan di antara virus herpes simplex taip 1 dengan taip 2 berdasarkan morfologi poks yang dihasilkan. Eramkan dengan tapak yang diinokulasi di sebelah atas selama 1 hingga 3 hari mengikut keperluan. Suntikkan 0. Tatacara Penyuntikan Virus ke atas Membran Korioalantik BAHAN 1. Eramkan dengan tapak yang diinokulasi di sebelah atas selama dua hingga tiga hari pada suhu 37°C. Suluh telur untuk menentukan embrio masih hidup. 3. 5. Telur berembrio berumur 10 sehingga 12 hari Jarum (28 gauge) dan picagari Etanol 70% Penggerudi berputar yang dipasang dengan cakera pemotong Pita selofan Pena penanda Bal penyedut getah besar Larutan salin 0. 2. 3.85% (steril) TATACARA 1. 11. Gerudikan satu lubang kecil di kawasan ruang udara. 4. 8.1 ml inokulum ke pundi amniotik dengan menusukkan jarum ke tapak yang berhampiran dengan kepala embrio. 6. 5. 7. 8. 7. 7. 5. Lepaskan tekanan bal getah. 4. 2. 9. Suntikkan 0. Letakkan setitis larutan salin yang steril di atas celah. Tandakan dengan pena penanda satu tapak yang tidak mendekati mana-mana salur darah. 6. 8. Tutup lubang dengan pita selofan. Lap tapak celah dengan etanol. Tatacara Mengumpulkan Cecair Alantoik BAHAN 1. 4. supaya membran korioalantoik di bawah celah tersedut dan kelihatan terjatuh atau terlepas daripada cangkerang dan suatu pundi udara terbentuk. 10. 2. Gerudikan satu celah cangkerang yang kecil pada tapak yang ditandakan tersebut untuk mendedahkan membran cangkerang sahaja. Tekan bal penyedut getah besar dengan sepenuhnya dan lekapkan penghujungnya pada lubang di ruang udara.

5. 3. Tatacara Mengumpulkan Cecair Amniotik BAHAN 1.TATACARA 1. Pecahkan cangkerang di atas ruang udara dan guntingkan satu lubang besar. 2. 2. N OTA Jika cecair amniotik didapati kurang. Telur berembrio selepas penyuntikan virus dan pengeraman Gunting Piring Petri Forseps Larutan salin 0. Tanggalkan pita selofan yang menutupi tapak suntikan pada permukaan telur. 6.5 ml larutan salin yang steril. Telur berembrio selepas penyuntikan virus dan pengeraman Forseps Pipet Pasteur Botol (steril) Larutan salin 0.85% (steril) TATACARA 1. 5. 3. Tatacara Pengambilan Membran Korioalantoik BAHAN 1. N OTA Telur disejukkan untuk membunuh embrio serta mengecutkan salur darah supaya pengumpulan cecair yang mengandungi virus dilakukan tanpa pencemaran dengan sel darah merah. 3. Letakkan telur di dalam peti sejuk selama beberapa jam atau di dalam peti beku suhu – 20°C selama 1 jam. Letakkan telur di dalam peti sejuk selama beberapa jam atau di dalam peti beku suhu – 20°C selama 1 jam. 3. 2. Tanggalkan pita selofan yang menutupi ruang udara. Lap cangkerang di bahagian atas ruang udara telur dengan etanol. 3. Gunakan pipet Pasteur untuk menolak embrio dan pundi kuning telur ke tepi dan kumpulkan cecair alantoik dengan menggunakan pipet Pasteur lain. Lap tapak suntikan dengan alkohol.85% (steril) Etanol 70% TATACARA 1. Letakkan telur di dalam peti sejuk selama beberapa jam atau di dalam peti beku suhu – 20°C selama 1 jam. Sedut dan keluarkan cecair daripada pipet beberapa kali sebelum dikumpulkan. 2. 4. 4. 71 . Pegang pundi amniotik dengan forseps dan tembusinya dengan pipet Pasteur untuk mengeluarkan cecair amniotik daripada ruang amniotik. 4. 2. tambahkan 0.

6. Pegang membran korioalantoik ini dan gunting di sekelilingnya sehingga semuanya terlepas daripada cangkerang. Cuci membran korioalantoik yang dikeluarkan di dalam larutan salin steril dan rentangkannya di dalam piring Petri. Pecahkan cangkerang di atas celah dengan bahagian pemegang gunting dan potong cangkerang sehingga ke pinggir ruang udara palsu. 72 . 5.4.

Tatacara Ujian Fermentasi Gula: Penghasilan Asid dan Gas BAHAN 1. iaitu tanpa oksigen bebas. Dalam fermentasi karbohidrat beberapa produk dihasilkan termasuk pelbagai jenis asid dan gas. tidak semua ujian yang digunakan untuk menguji kebolehan sesejenis bakteria mendegradasikan secara enzimatik ‘gula’ menjadi produk asid merupakan proses fermentatif. ataupun dari menggunakan substrat bukan karbohidrat. Kultur bakteria pada plat agar Media cecair gula di dalam tabung reaksi atau botol Bijou Gelung dawai Penunu Bunsen 73 . Dalam hal ini sungguhpun tidak semua substrat yang digunakan dalam ujian fermentasi adalah gula. 5. perbezaan ini merupakan salah satu ciri penting dalam pengenalpastian spesis bakteria. Dalam pengenalpastian bakteria. Hasilan bukan gas ditunjukkan oleh tindakan kimia yang menghasilkan terbitan yang berwarna. beberapa kumpulan bakteria tertentu menghasilkan bahan pertengahan metabolisme yang spesifik seperti asetil-metil-karbinol berikutan fermentasi glukos yang boleh digunakan untuk membezakan kumpulan bakteria yang menghasilkannya daripada yang tidak. Misalnya. alkalin – tanpa warna. asid – merah.5. Oleh yang demikian. PENGENALPASTIAN AGEN MIKROB UJIAN MAKMAL DALAM PENGENALPASTIAN BAKTERIA Bakteria mempunyai kisaran aktiviti biokimia yang amat luas. faktor ini dengan spesifisiti sesejenis enzim terhadap substrat tertentu membolehkan bakteria dikenal pasti dalam keadaan sekeliling yang terkawal seperti di makmal. yang merangkumi proses kemusnahan dan proses pembinaan (atau sintesis). jenis dan kuantiti asid campuran (mixed acids) – pelbagai jenis asid organik yang berasal dari asid piruvik yang dihasilkan serta kemampuan menghasilkan gas. fermentasi dipastikan secara tidak langsung melalui pengamatan perubahan warna indikator pH akibat penghasilan asid.1. Enzim juga boleh ditunjukkan dalam tindakan serologi yang menghasilkan kompleks enzim (sebagai antigen) – antibodi yang muncul sebagai presipitasi. Dalam ujian bakteriologi. Gas yang dihasilkan dikesan secara langsung melalui pengamatan penghasilan gelembung gas atau secara tidak langsung melalui penggantian cecair di dalam tiub Durham dengan gas. Walau bagaimana pun. Akan tetapi penurunan pH boleh dicapai melalui proses penggunaan karbohidrat yang bukan anaerobik. kehadiran rekahan atau celah-celah di dalam agar atau melalui tindakan kimia yang menghasilkan terbitan yang berwarna dan tidak larut (misalnya H 2S). sesuatu aktiviti biokimia ditentukan oleh enzim-enzim yang dihasilkan oleh bakteria. Daripada segi genetik. Andrade: neutral – kuning pucat. istilah ‘fermentasi’ digunakan secara longgar dalam konteks ujian bakteriologi diagnostik. asid – kuning. Ujian Fermentasi Gula: Penghasilan Asid dan Gas Fermentasi adalah suatu proses kimia yang melibatkan oksidasi-reduksi. 4. Penghasilan asid ditunjukkan oleh perubahan warna indikator pH (sesuatu jenis pewarna) yang bergantung kepada jenis indikator yang digunakan (contoh. Aktiviti yang luas ini dikawal oleh faktor genetik serta alam sekelilingnya. Bakteria berbeza dalam jenis karbohidrat yang boleh digunakan sebagai sumber tenaga melalui proses fermentasi. iaitu bukan fermentasi. alkali – biru). 3. misalnya manitol adalah sejenis alkohol. dan substrat organik merupakan penerima terakhir elektron. Proses in berlaku dalam keadaan anaerobik. istilah gula meliputi senarai substrat berkenaan. Kehadiran sesejenis enzim dikenal pasti secara tidak langsung melalui tindakannya terhadap sesuatu substrat. bromthymol blue: neutral – hijau. 2. Oleh yang demikian. Hasilan aktiviti enzim ini boleh berupa gas atau terbitan bukan gas.

3. Sebaliknya. Bahagian permukaan agar (agar condong) (slant) adalah terdedah kepada udara maka wujud dalam keadaan aerobik. Amati perubahan warna media dan penghasilan gas (yang terperangkap di dalam tiub Durham).4 iaitu pH alkali maka warna agar kelihatan oren-kemerahan atau merah. setelah penghasilan gas oleh mikroorganisma. 6.0%). Penghasilan asid Ujian positif: Media berwarna merah Ujian negatif: Tanpa perubahan warna media Pentafsiran hasil positif: Bakteria dapat menfermentasikan gula berkenaan 2. Jika pada mulanya tiub ini hanya dipenuhi dengan media. Eramkan pada 37°C selama semalaman. 3. Media TSI ditampan pada pH 7.0%) dan sukrosa (1. 74 . Inokulasikan kultur ini ke dalam media cecair yang mengandungi sejenis gula. sebagai penunjuk fermentasi.1%) . laktos atau sukros atau kombinasi daripada ketiga-tiga gula tersebut. Tutup rapat media yang telah diinokulasi dan tunggangkan sekali supaya keseluruhan tiub Durham dipenuhi media dan sama sekali tidak mengandungi gelembung udara di dalamnya. Catatkan hasil selepas 24 jam pengeraman dan seterusnya pengeraman dilanjutkan selama beberapa hari sebelum hasilnya dinyatakan sebagai negatif. Tegakkan semula botol media. 2. Media cecair terdiri daripada gula 1% di dalam air pepton 1%. Indikator pH. 4. Ulangkan inokulasi ke dalam media yang mengandungi gula lain. penghasilan gas dan penghasilan hidrogen sulfid. bahagian puntung agar (di bahagian dasar tabung) (butt) dilindungi dari udara dan wujud dalam keadaan anaerobik (walaupun bukan 100%). Sentuhkan pada 1 koloni bakteria pada media plat. N OTA 1. Sterilkan gelung dawai melalui pembakaran api penunu Bunsen dan biarkan sehingga dingin. Gula yang digunakan adalah glukosa (0. 7. 2. 5. laktosa (1. Penghasilan gas Ujian positif: Ruang kosong di dalam tiub Durham Ujian negatif: Tiub Durham masih dipenuhi media Pentafsiran hasil positif: Bakteria menghasilkan gas semasa menfermentasi gula Ujian Tiga Gula-Besi Media tiga gula-besi atau Triple Sugar Iron ( TSI ) merupakan sejenis media campuran yang digunakan untuk membezakan spesies bakteria dalam famili Enterobacteriaceae dengan berdasarkan kepada kemampuan spesies-spesies ini untuk memfermentasi gula dekstros. Media TSI disediakan dalam agar condong.Media cecair gula: (media dasar yang mengandungi jenis-jenis gula atau karbohidrat tertentu dan indikator pH. serta dilengkapi dengan tiub Durham) TATACARA 1. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN 1. Tiub Durham adalah sebuah tabung/tiub kecil yang boleh dimuatkan di dalam botol Bijou dan diletakkan terbalik (dengan mulutnya di bawah). Biasanya media ini juga disertakan sejenis indikator pH. gas ini akan mengganti media yang dimaksudkan dan akan terperangkap di dalam tiub maka kehadiran ruang tanpa media menunjukkan kehadiran gas. adalah fenol merah yang akan menjadi kuning pada pH 6.8 (keadaan asid).

Jika laktosa atau sukrosa. Jika bakteria hanya boleh menfermentasi glukosa. Eramkan semalaman dan teruskan selama 48 jam (jika perlu). 2. Tarik semula dawai dan gariskan organisma di atas permukaan agar yang condong. oksigen di dalam udara tidak dapat sampai maka proses dekarboksilasi oksidatif adalah pada tahap minimum.1%). walaupun amina dihasilkan kuantiti asid yang dihasilkan terlalu besar untuk perubahan pH kembali kepada keadaan alkali maka bahagian condong mahupun bahagian puntung agar akan tetap berkeadaan asid (kuning).Peptid dan asid amino yang berasal dari pepton di dalam media TSI didegradasikan melalui proses dekarboksilasi oksidatif kepada amina. Penghasilan gas ditunjukkan dengan kehadiran gelembung gas atau bahagian puntung agar akan kelihatan pecah-pecah.1 75 . atau kedua-duanya difermentasi kuantiti asid yang dihasilkan daripada salah satu di antara kedua gula ini adalah besar kerana konsentrasi kedua-dua gula ini adalah tinggi iaitu masing-masing 1%. Di bahagian puntung. Tatacara Ujian Tiga Gula Besi BAHAN 1. Proses in dipercepatkan oleh bakteria yang tumbuh di bahagian permukaan agar. Walau bagaimanapun. pH asid di bahagian permukaan agar akan berubah semula menjadi alkali (ungu-merah) manakala bahagian puntung agar (bahagian dasar tabung) akan kekal asid (kuning) kerana di situ amina yang dihasilkan tidak mencukupi untuk mengatasi kesan asid. 4. Penunu Bunsen (Reagen TSI: Dari sumber komersial) TATACARA 1. Cerun agar TSI di dalam tabung uji 3. sejenis terbitan alkali. Jadi. Sentuhkan penghujung dawai kepada koloni bakteria. Kultur bakteria 2. Tetapi di permukaan agar yang terdedah kepada oksigen udara. Tusukkan inokulum menembusi cerun agar TSI di dalam tabung sehingga ke dasarnya. 5. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Rujuk kepada Jadual 5. Sukrosa dicampurkan untuk menyaringkan spesies Salmonella dan Shigella kerana kedua-dua bakteria ini tidak menfermentasi sukrosa atau laktosa. Sterilkan keseluruhan dawai lurus melalui pembakaran dan biarkan supaya sejuk. Hidrogen sulfid yang dihasilkan akan bertindakbalas dengan ferrous sulfat dan suatu presipitasi hitam (ferik sulfid) akan terbentuk di dalam media. asid tidak dihasilkan dan warna merah akan kekal di seluruh media. Jika bakteria yang diinokulasi tidak menfermentasi karbohidrat. kuantiti ini mencukupi untuk bahagian permukaan dan puntung agar menjadi kuning. amina dihasilkan dan lama kelamaan (18-24 jam selepas pengeraman) kuantitinya mencapai aras yang mampu mengatasi kesan kuantiti rendah asid yang dihasilkan. 3. Dawai inokulasi lurus (dawai lurus) 4. kuantiti asid yang dihasilkan adalah terhad kerana kuantiti glukosa yang digunakan adalah rendah (0.

Citrobacter.Citrobacter. Walau bagaimanapun. Klebsiella.Klebsiella. Proteus mirabilis. Mimae Shigella dysenteriae. maka untuk membezakan spesies-spesies ini ujian urease dilakukan. Pseudomonas. Kuning Fermentasi glukosa & laktosa atau sukrosa + – Aerobacter aerogenes. P. morganii. cloacae. Ujian Indol Bakteria menghasilkan indol (benzopyrrole) daripada asid amino triptofan akibat tindakan enzim triptofanase. sonnei. Citrobacter.S.Arizona. manakala Proteus. Morganella morganii.P. Edwardsiella Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa + + Salmonella typhimurium.M.vulgaris. A. 3. Streptococcus. P. S. Arizona * Atau tiada perubahan dan warna agar seperti warna sebelum diinokulasi N OTA 1. 2. Oleh kerana sesetengah spesies Proteus dan beberapa spesies lainnya boleh memberikan reaksi pada TSI yang serupa dengan Salmonella ataupun Shigella. Sungguhpun tindak balas kimia asas dalam pengesanan indol adalah sama. terdapat beberapa jenis reagen untuk mengesannya. Providencia. urease-positif).1 Pola Hasil Tindakan Bakteria ke atas TSI Penghasilan Kemungkinan Bakteria (Jenis) Alcaligenes. enter itidis. (Salmonella dan Shigella adalah urease-negatif. Tatacara Ujian Indol BAHAN 1. Arizona.JADUAL 5.Staphylococcus. Proteus rettgeri.Ed-wardsiella Kuning Kuning Fermentasi glukosa & laktosa atau sukrosa – – Hafnia.Providencia. Proteus mira bilis. Serratia Kuning . vulgaris. 2. Proteus rettgeri. E. Shigella Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa _ + Salmonella typhosa. proteus rettgeri. reagen Kovac merupakan yang paling popular digunakan di masa kini.Providencia Kuning Kuning Fermentasi glukosa & laktosa atau sukrosa + + Proteus vulgaris. Tabung TSI harus ditutup secara longgar sahaja selepas diinokulasi supaya udara dapat masuk ke dalam tiub kultur untuk membolehkan berlakunya oksidasi dan perubahan balik condong agar daripada asid (kuning) ke alkali (ungu-kemerahan). Indol bertindak dengan para-dimetil-aminobenzaldehid dan menghasilkan pewarna rosindole (warna merah tua). Serratia Rupa Agar Tafsiran Condong Merah* Ungu-kemerahan Puntung Merah Kuning Tiada fermentasi gula Fermentasi glukosa Gas – – H 2S – – Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa + – Salmonella cholera-suis. schottmuelleri. S. mirabilis.S. Kultur bakteria Air pepton di dalam tabung uji Broth triptofan di dalam tabung uji 76 . coli.enteritidis paratyphi.

4 manakala bakteria yang menggunakan tapak jalan fermentasi butilena glikol tidak menghasilkan asid. 4. laktik) yang mencukupi untuk menurunkan pH media di bawah nilai 4. Tatacara Ujian Metil-Merah BAHAN 1. Reagen ini stabil selama beberapa tahun. Dalam penciptaan ujian metil-merah. Ujian Metil-Merah Metil-merah pada pH neutral dan asid sederhana (nilai 7-6) berwarna kuning tetapi menjadi merah pada pH yang agak rendah iaitu di bawah nilai 4. 5. Simpan di dalam botol gelap dengan penutup kaca di dalam peti beku. Walau bagaimanapun. asetik. Dengan perlahan dan hati-hati campurkan 50 ml HCl pekat (Lakukan di dalam kabinet asap). 6. Goncang dan biarkan selama 10 minit. Pipet Pasteur (steril) Reagen Kovac PERSEDIAAN Reagen Kovac Masukkan 10 g p-dimetilaminobenzaldehid ke dalam 150 ml alkohol jenis amilalkohol. isoamilalkohol atau butilalkohol. Masukkan 2 titis suspensi ini ke dalam broth triptofan. Broth MR-VP di dalam tabung uji 4. Panaskan di dalam penganggas air pada 56°C sehingga larut. 5. N OTA Di samping reagen Kovac.5 ml) reagen Kovac (berwarna kuning). Amatilah pembentukan lapisan warna (cincin) pada permukaan suspensi. reagen Ehrlich juga boleh digunakan dalam ujian Indol. Bakteria yang menggunakan tapak jalan fermentasi asid campuran dalam katabolisme glukosa biasanya menghasilkan kuantiti pelbagai jenis asid organik (formik. Kultur bakteria 2. Reagen ini berwarna kuning muda. media diuji biasanya dicampurkan kloroform sejenis bahan kimia yang toksik. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Merah tua Ujian negatif: Kuning Pentafsiran hasil positif: Penghasilan indol akibat degradasi protein triptofan oleh bakteria. 3. dalam ujian yang menggunakan reagen Ehrlich. Masukkan 5 titis (~ 0. Eramkan selama 24 – 48 jam. Metil-merah (Media MR-VP: Dari sumber komersial) 77 . Ciri ini digunakan untuk membezakan di antara spesies bakteria yang menghasilkan asid ‘kuat’ (strong acids) dalam kuantiti besar dan spesies bakteria yang tidak berbuat demikian. TATACARA 1. Ujian indol yang dilakukan dengan reagen Kovac tidak memerlukan kloroform. 2.4. Biarkan sehingga dingin. Air pepton 3.4. Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. kepekatan komponen media yang sesuai untuk ujian metilmerah serta ujian Voges Proskauer telah ditentukan dan media untuk kedua-dua ujian ini kemudian dipasarkan sebagai media MR-VP (Methyl Red – Voges Proskauer).

Amatilah pembentukan warna di permukaan media PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Warna merah jambu sehingga merah. Amati pembentukan warna. ujian diulangi ke atas kultur dengan pengeraman yang lebih lama. Eramkan selama 24 jam pada 37°C.5% kreatin) TATACARA 1. Tambahkan 0. Inokulum yang tebal adalah penting supaya kuantiti asid yang besar dapat dihasilkan untuk membolehkan ujian dibaca berikutan pengeraman selama 18-24 jam. TATACARA 1.2 ml larutan KOH. Masukkan pula 0. 6.0 ml broth MR-VP. Kultur bakteria Air pepton Broth MR-VP (0. 4. Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. 4. 3. Campurkan air suling sehingga 500 ml. 2. Jika hasil yang kurang pasti didapati. Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. 2. N OTA 1. 3. 3. 5. Goncang dan biarkan seketika. 4. diasetil. Dalam kehadiran KOH dan oksigen (dari udara) asetoin secara spontan (tidak melibatkan enzim) dioksidasi menjadi metabolit pertengahan.5 ml broth MR-VP. 5. 2. Diasetil kemudian bertindak dengan kumpulan NH2 bebas daripada kumpulan guanidina (kreatin adalah sumber kumpulan guanidina) untuk menghasilkan kompleks berwarna merah. Ujian Voges-Proskauer Asetil-metil karbinol (atau asetoin) adalah metabolit pertengahan/perantaraan dalam proses penghasilan butilena glikol pada fermentasi glukosa.1 g metil-merah di dalam 300 ml etanol 95%.PERSEDIAAN Reagen metil-merah Larutkan 0. Masukkan 2 titis suspensi ini ke dalam 0. Ujian negatif: Warna kuning.6 ml larutan a -naftol.5 ml kultur. Penghasilan asetoin merupakan salah satu kriteria dalam fermentasi glukosa oleh bakteria yang digunakan dalam pengenalpastian. Tatacara Ujian Voges-Proskauer BAHAN 1. warna pertengahan di antara kuning dan merah tidak dianggap positif. 6. 2. 3. 7. Masukkan dua titis suspensi ini ke dalam 1. Sensitiviti ujian ini dipertingkatkan dengan penambahan a -naftol. Masukkan 2 titis metil-merah ke dalam setiap 0. Eramkan pada 37°C selama 24 – 48 jam. 78 . 5. Goncang dengan baik dan biarkan selama 5 – 20 minit.5 ml) di dalam tabung uji a -naftol 5% dalam alkohol pekat 95% KOH (40% yang mengandungi 0. Pentafsiran hasil positif: Menunjukkan penghasilan asid dalam kuantiti tinggi hasil fermentasiglukosa oleh bakteria. Warna oren.

Kultur bakteria 2. Ujian Sensitiviti Terhadap Bacitracin dan Optochin Sensitiviti terhadap Bacitracin. adalah sensitif terhadap Optochin dan menghasilkan zon rencatan pertumbuhan di sekeliling disk tersebut. sejenis antibiotik. Ambil 1 koloni bakteria streptokokus b-hemolitik dan buat garisan-garisan pada permukaan agar darah. Agar darah 3. Streptokokus a -hemolitik yang lainnya pula tumbuh sehingga mencapai ke pinggir disk atau kadangkala hanya menghasilkan zon rencatan pertumbuhan yang biasanya dibaca sebagai resistan. Streptococcus pyogenes (atau streptokokus kumpulan A Lancefield) sensitif terhadap Bacitracin. Swab (steril) 4. Sapukan permukaan agar dengan menggunakan swab steril pada arah 90° daripada arah garisan pertama bakteria untuk mendapatkan lapisan bakteria yang tersebar dan sama rata di atas permukaan media. Kajian yang telah dilakukan menunjukkan bahawa kebanyakan streptokokus kumpulan A (93-98%) sensitif terhadap konsentrasi rendah Bacitracin dan sebaliknya streptokokus bukan kumpulan A amnya resistan. Kadangkala tindak balas mengambil masa yang lama (~ 2 jam) sebelum kemunculan warna yang dimaksudkan. suatu hasil pertengahan dalam proses fermentasi glukosa oleh sesetengah bakteria. Pentafsiran hasil positif: Kehadiran asetil-metil-karbinol (asetoin). Disk Bacitracin dan disk Optochin (Reagen Bacitracin dan Optochin: Dari sumber komersial) TATACARA 1. Ujian ini menunjukkan korelasi yang rapat dengan ujian kelarutan hempedu. Tatacara Ujian Sensitiviti Terhadap Bacitracin dan Optochin BAHAN 1. Pneumokokus (Streptococcus pneumoniae) selain larut di dalam hempedu. Sebaliknya. N OTA Oleh kerana suatu perubahan warna akan berlaku di antara permukaan campuran kultur dan reagen. 3.PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Merah. Letakkan secara aseptik dengan menggunakan jarum atau forseps steril 1 disk Bacitracin ke atas agar sejurus sebelum pengeraman kultur. Gelung dawai 5. 2. Jarum/forseps steril 6. digunakan untuk membezakan streptokokus kumpulan A Lancefield daripada streptokokus b-hemolitik lainnya. maka elakkan daripada menggerak-gerakkan tabung sehingga membolehkan warna tersebut muncul segera selepas reagen dicampurkan dan tabung digoncang supaya sebati. Kesimpulannya. Sensitiviti terhadap Optochin (ethylhydrocuprein hydrochloride) pula digunakan untuk membezakan Streptococcus pneumoniae daripada streptokokus a -hemolitik lainnya. Ujian negatif: Tiada perubahan atau kuning. 79 . streptokokus selain daripada kedua spesies ini menunjukkan keresistanan sama ada terhadap Bacitracin bagi kumpulan b-hemolitik atau terhadap Optochin bagi kumpulan a -hemolitik menurut ujian yang dilakukan di atas. manakala Streptococcus pneumoniae sensitif terhadap Optochin.

Disk faktor X. 3. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif Bacitracin: Ujian positif Optochin: Pentafsiran hasil positif: Zon perencatan pertumbuhan. Jarum/forseps (steril) 7. Air pepton 4. Ulangi kaedah di atas dengan menggunakan kultur streptokokus a -hemolitik dan disk Optochin. Amati kehadiran atau tidaknya pertumbuhan di sekeliling disk. Swab (steril) 5. 5. Disk dengan dua unit Bacitracin: 15 – 20 mm garis pusat (termasuk garis pusat disk). manakala disk XV. 80 . Pengeraman seharusnya dilakukan dalam CO 2 5-10% untuk mencapai pertumbuhan optimum. Bakteria sensitif terhadap Bacitracin/Optochin. Kultur bakteria 2. Tatacara Ujian Keperluan Faktor Tumbesaran X dan V BAHAN 1. XV (Disk faktor X. Gelung dawai 6. saiz yang bergantung kepada kepekatan reagen yang digunakan. Letakkan disk-disk yang mengandungi faktor tumbesaran secara aseptik di atas agar kirakira 1 atau 2 cm daripada pinggir media dalam pola sebagai berikut: misalnya disk Faktor X : tepat pada titik jam tangan yang menunjukkan jam 12. Eramkan pada suhu 37°C selama 18 dan teruskan sehingga 48 jam. V. jika perlu dalam atmosfera CO2 5-10%. 4. Disk Optochin jenama Oxoid. Koloni spesies bakteria yang menunjukkan pertumbuhan di sekeliling disk yang mengandungi faktor tumbesaran X. Buat suspensi murni bakteria di dalam air pepton. ia tidak mempunyai kemampuan untuk mensintesis faktor berkenaan dalam kuantiti yang optimum. Spesies Haemophilus dan Bordetella boleh dikenal pasti berdasarkan sama ada media dasar memerlukan penambahan faktor tumbesaran X (hemin) dan faktor V (NAD.4. Amati zon perencatan pertumbuhan bakteria. Tekan disk pada permukaan agar dengan forseps atau jarum steril supaya tidak tanggal. dan X bersama V tertentu menandakan ia memerlukan faktor tersebut dan sebaliknya. code DD1: 5 mm atau lebih zon perencatan yang diukur dari tepi disk. tepat pada jam 8. juga dinamakan koenzim I) supaya pertumbuhan bakteria dapat berlaku. 2. 5. Disk dengan 15 mg Optochin: 18 mm atau lebih dari tepi disk. 7. 6. Ujian Keperluan Faktor Tumbesaran X dan V Disk kertas yang diserap dengan faktor tumbesaran digunakan untuk membezakan antara spesies bakteria genus Haemophilus. disk faktor V : tepat pada jam 4. V dan XV : Dari sumber komersial) TATACARA 1. Eramkan pada 37°C selama 18 sehingga 24 jam. V. Inokulasi seluruh permukaan plat agar nutrien dengan bakteria berkenaan dengan menggaris-gariskannya menggunakan gelung dawai. Agar nutrien 3.

B.PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Pertumbuhan di sekeliling disk dengan: Faktor X dan XV – memerlukan faktor X sahaja Faktor V dan XV – memerlukan faktor V sahaja Faktor XV sahaja – memerlukan faktor X mahupun faktor V Bakteria yang memerlukan faktor X dan V atau salah satu di antaranya adalah spesies Haemophilus. influenzae parainfluenzae aegyptius ducreyi hemolyticus parahemolyticus pertussis – – – – – – + X – – – + + – + V – + – – + + + XV + + + + + + + N OTA 1. Perhatikan bahawa media yang digunakan berupa media minimum.8 dan biru pada pH lebih 7. manakala golongan koliform tidak. hasilnya ditafsir berdasarkan berlakunya kekeruhan pada media broth akibat pertumbuhan bakteria. H. Dalam ujian yang menggunakan media Koser. H. iaitu agar nutrien yang mana spesies-spesies yang diuji tidak mungkin tumbuh padanya tanpa penambahan faktor tumbesaran tertentu. Seterusnya. suatu tindak balas alkali berlaku dan ini ditunjukkan dengan perubahan pada warna media daripada hijau kepada biru tua. Bakteria golongan aerogen boleh menggunakan sitrat sebagai sumber karbon. tetapi sama ada terdapat atau tidaknya pertumbuhan bakteria pada garis inokulasi di atas media. Perubahan warna. manakala yang tidak memerlukan faktor X atau V adalah B. Simmons mengubahsuai media Koser tersebut dengan menambahkan agar dan indikator. Penggunaan Sitrat Koser mencipta sejenis media broth asas yang mengandungi natrium ammonium fosfat sebagai sumber tunggal nitrogen. JADUAL 5. Pengubahsuaian ini membolehkan pertumbuhan bakteria dikesan dengan lebih mudah kerana dalam metabolisme karbon pada sitrat (pertumbuhan positif). mempermudahkan lagi pembacaan hasil ujian. pertussis. dalam hal ini. yang kelihatan hijau pada pH 6. Kehadiran pertumbuhan bererti kemampuan bakteria mengurai sitrat sebagai sumber karbon. H. H.1 Keperluan bakteria untuk faktor X dan V Pertumbuhan Berlaku Dengan Faktor: Spesies – H. Simpan disk pada suhu 4°C dan bukan pada 0°C. H. dan natrium sitrat sebagai sumber tunggal karbon. 81 . dan hasil ujian dinyatakan sebagai positif untuk sitrat. Kadangkala bacaan hasil ujian tidak semata-mata berdasarkan kepada perubahan warna. apatah lagi agar coklat dalam melakukan ujian ini. Elakkan daripada menggunakan agar darah.6. 2. bromthymol blue.

Ujian Penggunaan Sitrat
BAHAN

1. Kultur bakteria 2. Dawai lurus 3. Cerun agar sitrat Simmons di dalam botol Bijou (Agar sitrat Simmons: Dari sumber komersial)
TATACARA

1. 2. 3. 4. 5.

Sterilkan keseluruhan dawai lurus dan biarkan sehingga sejuk. Sentuhkan pada koloni bakteria dengan penghujung dawai. Buatkan 1 garisan tipis bakteria pada permukaan agar. Eramkan pada 37°C selama semalaman atau 48 jam, jika perlu. Amatilah perubahan warna pada media.

PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN

Ujian positif: Pertumbuhan dengan/tanpa media menjadi biru. Ujian negatif: Tiada pertumbuhan atau media tetap hijau. Pentafsiran ujian positif: Kemampuan menggunakan sitrat sebagai sumber tunggal karbon.
N OTA

1.

2. 3.

Gunakan sedikit sahaja inokulum supaya semasa penginokulasian inokulum ini tidak kelihatan sama sekali pada garis inokulasi dan untuk mengelakkan reaksi positif palsu akibat bakteria yang mati membebaskan karbon dan nitrogen dalam kuantiti yang boleh menampung pertumbuhan. Elakkan daripada mengambil sebarang bahan nutrien daripada media kultur di mana inokulum diambil. Kultur yang menunjukkan pertumbuhan tanpa perubahan pH (perubahan warna) juga dianggap positif kerana pada sesetengah bakteria yang lambat tumbuh keadaan tindak balas alkali tidak dapat dicapai dalam tempoh pengeraman yang ditetapkan. Pengeraman selama 48 jam mungkin diperlukan untuk bakteria yang lambat tumbuh supaya warna biru dapat muncul.

Ujian Urease Urea adalah substrat spesifik yang dihidrolisis oleh enzim urease kepada ammonia dan karbon dioksida. Ammonia menyebabkan campuran tindak balas menjadi alkali. Tanda kehadiran urease dapat dikesan melalui indikator pH yang menunjukkan perubahan warna media daripada oren (pH 6.8) kepada merah jambu (pH 8.1) Ujian untuk mengesan penghasilan enzim urease oleh bakteria biasanya digunakan dalam pengenalpastian bakteria genus Proteus. Walau bagaimanapun, bakteria-bakteria lain yang juga penting dalam perubatan mempunyai kemampuan untuk menghasilkan urease. Terdapat beberapa jenis ujian urease dengan sensitiviti yang berbeza-beza. Tahap sensitiviti ini ditentukan terutamanya oleh kandungan larutan penampan. Pemilihan dari segi jenis ujian ini adalah bergantung kepada kegunaannya. Oleh kerana pH media boleh ditingkatkan melalui sesuatu tindak balas lain, maka hasil positif palsu untuk urease memang terdapat. Untuk mengesan keadaan seperti ini ujian kawalan terhadap media yang tidak mengandungi urea diperlukan.

82

Tatacara Ujian Urease
BAHAN

1. 2. 3. 4. 5.

Kultur bakteria Air pepton Broth urea di dalam botol Bijou Gelung dawai Pipet Pasteur steril

TATACARA

1. 2. 3. 4.

Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. Masukkan 2 titis suspensi ini ke dalam broth urea. Eramkan selama 24 jam. Amati warna broth urea.

PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN

Positif: Merah. Negatif: Kuning. Pentafsiran hasil positif: Kehadiran enzim urease yang menghidrolisis urea kepada ammonia. Ujian Oksidase Ujian oksidase menentukan kehadiran sitokrom C, sejenis enzim respiratori. Oleh yang demikian, ujian ini hanya positif untuk bakteria yang memiliki sitokrom C. Sitokrom adalah protein yang mengandungi heme dan merupakan enzim oksidatif dalam kitaran respiratori yang terlibat dalam fosforilasi oksidatif. Dalam ujian oksidase tatacara Kovacs, reagen oksidase adalah tetrametil-pfenilena-diamina dihidroklorida 1%. Enzim oksidase sitokrom tidak bertindak secara langsung dengan reagen oksidase, tetapi menyebabkan oksidasi sitokrom C yang kemudian menyebabkan oksidasi tetrametil-p-fenilena-diamina dihidroklorida sehingga membentuk sejenis bahan kimia berwarna biru yang disebut biru Wunster. Sitokrom C yang direduksi (ditambah elektron) dalam tindakan ini diubah secara tidak langsung kepada bentuk yang teroksidasi oleh oksidase sitokrom yang menerima elektronnya. Enzim oksidase sitokrom kemudian menggantikan elektron tersebut kepada oksigen untuk menghasilkan air dengan ion hidrogen. Ujian ini digunakan untuk membezakan streptokokus (oksidase-negatif) daripada neisseria (oksidase-positif). Tatacara Ujian Oksidase
BAHAN

1. 2. 3. 4. 5.

Kultur bakteria Slaid mikroskop Kepingan kecil kertas turas Whatman No. 1 Reagen oksidase (tetrametil-p-fenilena-diamina dihidroklorida 1%) Kayu aplikator

TATACARA

1. 2.

Letakkan sekeping kertas turas kecil di atas slaid mikroskop bersih. Titiskan 2 hingga 3 titis reagen oksidase ke atas kertas turas.

83

3. 4.

Ambil koloni bakteria dengan kayu aplikator dan goreskan ke atas kertas turas pada bahagian yang menyerap reagen oksidase. Amati kemunculan warna dalam beberapa saat.

PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN

Kemunculan warna lavender (ungu pudar) yang cepat (dalam beberapa saat) menjadi biru/ungu. Ujian negatif: Tiada perubahan warna atau warna muncul hanya setelah beberapa minit. Pentafsiran hasil positif: Perubahan segera ke warna biru/ungu menunjukkan bakteria memilikim sitokrom C.
N OTA

Ujian positif:

1.

2. 3.

4. 5.

Reagen ini mesti disediakan segar kerana sifatnya yang tidak stabil. Auto-oksidasi oleh oksigen bebas dari udara boleh berlaku dan oleh yang demikian reagen ini dengan sendirinya akan berubah menjadi biru atau ungu jika dibiarkan di udara agak lama. Reagen yang baru disediakan perlu dibiarkan selama 15 minit untuk menjadi “masak” sebelum digunakan. Pastikan dan patuhi tempoh masa yang ditetapkan untuk mentafsirkan hasil ujian ini kerana pada ujian yang disimpan lama sebelum dibaca hasil positif palsu boleh berlaku kerana warna biru atau ungu boleh muncul akibat auto-oksidasi yang berlaku ke atas reagen. Gunakan kayu aplikator atau dawai platinum untuk mengambil koloni. Dawai nikrom juga boleh mempengaruhi hasil ujian dan memberikan hasil positif palsu. Tatacara alternatif ujian oksidase ini adalah dengan membanjiri kultur pada piring Petri dengan reagen dan kemudian segera menyingkirkan bahan yang berlebihan ini dengan pipet. Hasilnya ditunjukkan dengan perubahan warna koloni bakteria kepada warna ungu (oksidase-positif) atau tiada perubahan warna (oksidase-negatif).

Ujian Koagulase Ujian untuk menentukan penghasilan enzim koagulase oleh stafilokokus adalah suatu ujian penting dalam mikrobiologi diagnostik. Ia membezakan stafilokokus patogenik kerana berkemampuan untuk menghasilkan enzim ini, daripada yang tidak menghasilkannya atau tidak patogenik. Terdapat dua jenis koagulase; yang satu terikat pada dinding sel bakteria (koagulase terikat) dan tidak bebas, dan yang satu jenis lagi dirembeskan oleh sel ke dalam media atau cairan (koagulase bebas). Ujian slaid di mana penggumpalan atau pengelompokan bakteria dihasilkan dipercayai disebabkan oleh koagulase terikat yang terdapat pada dinding sel. Enzim bentuk ini bertindak secara langsung ke atas fibrinogen haiwan-haiwan tertentu dan menghasilkan fibrin yang memerangkap bakteria sehingga berlakunya penggumpalan/pengelompokan tersebut. Sebaliknya, koagulase yang dihasilkan secara bebas bertindak dengan protrombin untuk menghasilkan trombin, yang seterusnya bertindak ke atas fibrinogen untuk menghasilkan fibrin (pembekuan). Tatacara Ujian Koagulase Slaid
BAHAN

1. 2. 3. 4. 5.

Kultur bakteria Larutan salin 0.85% Slaid mikroskop Gelung dawai Plasma arnab

84

6. 3. adalah amat penting untuk mempastikan bahawa bakteria yang diuji adalah benar-benar kultur murni stafilokokus. Tatacara Ujian Koagulase Tabung BAHAN 1.TATACARA 1. Pastikan koloni bakteria boleh diemulsifikasi di dalam salin supaya tidak menimbulkan masalah dalam pembacaan hasilnya nanti. 3. 3. 4. aureus yang menghasilkan hanya koagulase bebas yang tidak bertindak dalam ujian koagulase slaid. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pembentukan gumpalan bakteria. Goncangkan slaid dan amatilah penggumpalan (clumping) bakteria yang akan kelihatan sebagai kelompak-kelompak putih dalam masa 15 saat. Campurkan 1 isipadu suspensi bakteria dengan 5 isipadu larutan plasma. 2. Pentafsiran hasil positif: Bakteria memiliki enzim koagulase.85% Tabung uji steril Gelung dawai Plasma arnab Penganggas air pada 37°C TATACARA 1. Sediakan 1:9 pencairan plasma arnab atau manusia di dalam larutan salin. ujian haruslah dilakukan juga ke atas beberapa jenis bakteria kawalan yang memberikan hasil positif kuat. 6. Perlu juga diperhatikan bahawa kadangkala plasma manusia yang digunakan mengandungi bahan perencat yang akan memberikan hasil negatif palsu. Hasil positif yang berlaku lewat atau negatif diuji semula dengan ujian koagulase tabung kerana terdapat strain S. Tambahkan setitis plasma arnab kepada suspensi dan campurkan dengan gelung dawai. Plasma perlulah diuji terlebih dahulu dengan strain kawalan positif dan negatif sebelum digunakan. Mana-mana bakteria yang boleh menggunakan sitrat sebagai sumber tenaga boleh membebaskan kalsium yang akan mengakibatkan pembekuan plasma jika plasma tersebut diambil daripada darah yang bercampur sitrat. 5. Seterusnya. Ujian positif palsu boleh berlaku jika penggumpalan yang berlaku lewat diambil kira. 5. Ambil beberapa koloni bakteria dengan gelung dawai steril. Letakkan setitis larutan salin steril di atas sebuah slaid mikroskop yang bersih dan kering. N OTA 1. Buatkan suspensi bakteria ini di dalam titisan salin. 4. 2. 5. Gunakan plasma arnab atau manusia dan bukan spesies mamalia lain kerana kebanyakan plasma daripada spesies lain tidak bertindak dengan koagulase stafilokokus. positif lemah dan kawalan negatif. 3. 2. 2. Oleh yang demikian. dan ujian ini digunakan semata-mata untuk membezakan antara strain yang menghasilkan koagulase daripada yang tidak. 85 . Ujian negatif: Tiada penggumpalan dan suspensi bakteria kelihatan homogen. supaya hasil ujian boleh dipercayai dan diterima tanpa ragu-ragu. Kultur bakteria Larutan salin 0. 4. Sediakan suspensi stafilokokus di dalam larutan salin (atau gunakan kultur broth).

Spesimen yang memberi hasil negatif pada masa pengeraman 6 jam dieramkan semula semalaman kerana terdapat strain S. 3.4. Kultur bakteria Slaid mikroskop Kayu aplikator Hidrogen peroksida 3% TATACARA 1. Jangan campur dengan goncangan. Tatacara Ujian Katalase BAHAN 1. Pembekuan jika hadir. Sentuhkan penghujung kayu aplikator kepada koloni bakteria. 2. 4. akan kekal di dasar tabung uji. Amatilah kehadiran gelembung-gelembung gas yang dihasilkan dengan cepat. Pentafsiran hasil positif: Bakteria memiliki enzim koagulase N OTA 1. Untuk mengelakkan daripada memperolehi hasil yang negatif palsu. Masukkan organisma ke dalam titisan reagen di atas slaid. Campurkan dengan memutarkan tabung uji di antara kedua dua tapak tangan. 86 . aureus yang kadar penghasilan koagulasenya adalah rendah maka masa yang panjang diperlukan untuk koagulase mencapai aras yang memberi hasil yang positif (hasil positif yang lewat) Ujian Katalase Katalase adalah enzim dengan bahagian (moieti) yang mengandungi besi. Letakkan setitis larutan hidrogen peroksida di atas sebuah slaid kaca bersih dan kering. Ujian negatif: Campuran tetap cair. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Penghasilan dan pembebasan gas dengan cepat dicirikan dengan gelembunggelembung gas yang dibebaskan dengan rancak. (oksigen) adalah tanda bagi ujian yang positif. 2. 3 dan 6 jam dan selepas semalaman. Eramkan pada suhu 37°C di dalam penganggas air dan amati selepas 1. 3. 5. Tindak balas kimia yang berlaku dalam ujian katalase adalah : 2H 2O 2 Æ 2H 2O + O2 • Penghasilan gelembung gas . rancak dan berterusan. jika masih negatif. 4. 3. 2. Ujian katalase digunakan khususnya untuk membezakan antara stafilokokus (katalase positif) dengan streptokokus (katalase negatif) dan juga kadangkala digunakan dalam pengenalpastian pelbagai jenis bakteria. tabung haruslah diamati beberapa kali di sepanjang tempoh pengeraman. Pastikan tabung tidak digoncang semasa mengamati dan membaca hasil ujian (penghasilan pembekuan) kerana ini akan mengakibatkan pembekuan menjadi terlerai dan tidak dapat dikesan. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pembentukan pembekuan. tabung uji dicondongkan. Untuk memudahkan pembekuan diamati. Sesetengah strain stafilokokus menghasilkan enzim fibrinolisin yang akan melisis semula pembekuan plasma yang dihasilkan.

Seboleh-bolehnya elakkan daripada mengambil koloni yang tumbuh pada permukaan media agar darah. Tetapi. Gariskan bakteria ke atas cerun agar di dalam tabung uji. 4. Kultur bakteria Cerun agar nutrien di dalam tabung Dawai lurus Kertas turas Plumbum asetat 5% TATACARA 1. 5. Sesetengah bakteria yang menghasilkan H2S tidak dapat tumbuh pada media yang mengandungi terbitan ferum (besi). Penghasilan H2S oleh sesejenis bakteria menandakan keupayaan bakteria tersebut untuk mereduksi sulfur kepada sulfida. Pentafsiran hasil positif: Bakteria memiliki enzim katalase. Oleh yang demikian. Serapkan sekeping kertas turas dengan plumbum asetat 5% dan biarkan sehingga kering. Tatacara Ujian Penghasilan Hidrogen Sulfida BAHAN 1. Penghasilan segelintir gelembung kecil selepas 20-30 saat tidak dianggap positif. Jangan gunakan dawai gelung kerana positif palsu boleh berlaku. Larutan H2O2 disimpan di dalam botol gelap di dalam peti beku. NOTA 1. Pada kultur anaerobik. 6. Gunakan H 2 O 2 pada kepekatan 3% untuk mendapatkan hasil ujian yang terbaik atau optimum. Perlu ditekankan di sini bahawa darah juga mengandungi enzim katalase yang dapat bertindak balas dengan reagen. Ujian katalase plat: Ujian ini boleh dilakukan ke atas koloni di atas plat kultur dengan me-nuangkan reagen ke atas koloni berkenaan KECUALI jika media kultur tersebut adalah agar darah kerana ia boleh memberikan hasil positif palsu. 3. dedahkan kultur kepada udara selama setengah jam sebelum ujian dilakukan untuk membolehkan oksidasi aerobik ke atas katalase yang tereduksi berlaku. 2. 5. Jangan gunakan kultur yang berusia lebih daripada 24 jam untuk mengelak daripada memperolehi hasil negatif palsu kerana enzim ini hanya dapat dikesan pada kultur hidup yang masih segar dan mungkin tiada lagi pada kultur tua.Ujian negatif: Tiada sebarang tindak balas. Penghasilan Hidrogen Sulfida Bakteria boleh menghasilkan H 2S daripada terbitan sulfur organik yang didapati di dalam pepton yang digunakan atau daripada terbitan sulfur tak organik yang dicampurkan dengan media kultur. Ujikan juga se-bahagian daripada plat agar yang belum diinokulasi dengan bakteria dengan menuangkan sedikit reagen di atasnya sebelum meneruskan dengan ujian katalase plat ini untuk mengelak-kan hasil positif palsu. Gas H 2S yang dibebaskan akan dikesan melalui perubahan warna kertas putih kepada warna hitam akibat pembentukan plumbum sulfida. tanpa menyentuh permukaan agar tersebut kerana plumbum asetat boleh menghalang pertumbuhan sesetengah bakteria. 2. 2. 3. Ini adalah kerana sesetengah media mungkin mengandungi sedikit katalase yang boleh memberikan tindak balas yang lemah dan lambat serta boleh menyulitkan pembacaan hasil. berhati-hatilah dalam pengambilan tersebut untuk mempastikan hasil yang tepat dan betul. Kertas ini hanya diletakkan pada sisi mulut tabung di atas kultur bakteria pada agar condong. Ini untuk mengelakkan daripada terambil bersama sel darah dan mendapatkan hasil yang positif palsu seperti di atas. 87 . 4. sekiranya hal ini tidak dapat dielakkan. H2S yang dihasilkan oleh bakteria golongan ini dikesan dengan kertas yang diserapkan dengan larutan plumbum asetat 5%.

Tatacara Ujian Nagler BAHAN 1. 2. vitellenin) daripada kuning telur yang mempresipitasikan lemak bebas. Gelung dawai (Reagen agar Nagler dan kuning telur : Dari sumber komersial) TATACARA 1. Emulsi kuning telur pekat 6. Biarkan kering. 6. Enzim lesitinase C menghidrolisis lesitin (lecithin-phosphatidyl choline) kepada fosforilkolin dan sejenis digliserid. Antitoksin Clostridium perfringens (Cl. Ujian Nagler pada mulanya dilakukan dengan menumbuhkan bakteria pada media agar kuning telur. Eramkan secara anaerobik. Swab (steril) 9. 5. Campurkan emulsi “kuning telur pekat” (Difco: SR47) untuk mencapai kepekatan 5% dan tuangkan agar campuran ini ke dalam sebuah piring Petri. Fenomena ini kali pertama dilaporkan oleh Nagler yang pada waktu itu menggunakan serum sebagai sumber lesitin. Pentafsiran hasil positif: Bakteria boleh menghasilkan H2S daripada sulfur. perfringens pada setengah bahagian daripada media plat. Sebarkan antitoksin ini sama rata ke atas permukaan setengah plat agar dan biarkan ia meresap dan kering.3. Kultur bakteria 2. Ekstrak Fildes 5. Piring Petri 7. lemak bebas daripada kuning telur selepas lesitin dihancurkan dan protein tak larut air (vitellin. Campurkan 1 ml ekstrak Fildes. Ujian Nagler Penentuan penghasilan enzim lesitinase oleh bakteria adalah berfaedah dalam pengenalpastian bakteria genus Clostridium khususnya Clostridium perfringens (Clost. Cairkan 20 ml agar nutrien yang steril (Difco: Blood Agar Base CM55). 7. Gantung kertas ini pada sisi mulut tabung uji dan pastikan kertas ini tidak menyentuh permukaan agar. Eramkan pada 37°C semalaman. Agar nutrien 3. 3. Enzim ini juga bertindak ke atas fosfolipid lainnya. 8. dan lesitinase A. B dan D juga bertindak ke atas lesitin tetapi terhadap terbitan-terbitan lain yang dihasilkan. 88 . Mekanisme penghasilan opalesens dipercayai disebabkan oleh tiga faktor iaitu lemak digliserid yang dihasilkan. Penganggas air pada 50°C 4. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian hasil positif: Kertas menjadi hitam. 4. 4. hasilnya menunjukkan kehadiran suatu zon opalesens (antibodi anti-lesitinase) di sekeliling koloni yang menandakan penghasilan lesitinase oleh bakteria. Buatkan 1 garisan bakteria melintasi kedua-dua bahagian setengah plat agar ini (bahagian yang disapu antitoksin dan yang tidak). Selepas pengeraman. welchii) (antibodi anti-lesitinase) 8. Ujian hasil negatif: Tiada perubahan warna pada kertas. welchii) sungguhpun terdapat laporan yang menyatakan bahawa bakteria lain seperti Pseudomonas aeruginosa juga boleh menghasilkan enzim ini. Turunkan suhu kepada 50°C dengan membiarkan media di dalam penganggas air selama 15 minit. Titiskan 2 titis antitoksin (antilesitinase) Cl.

Ujian negatif: Tidak terbentuk zon opalesens di sekeliling koloni pada keseluruhannya (pada kedua-dua kawasan disapu antitoksin dan tidak). Eramkan dan amati selepas 24 jam dan 48 jam. Tatacara Ujian Elek BAHAN 1. Ujian negatif: Tiada garis presipitasi. Cairkan 10 ml agar dasar Elek. 89 . Tuangkan agar campur serum ke dalam piring Petri. Titiskan 1 ml antitoksin difteria (1000 unit) ke atas jalur kertas supaya diserap dan biarkan kering. 10. Letakkan sekeping kertas turas ke dalam 1 piring Petri kosong yang steril. Penganggas air 50°C 6. Penghasilan garis presipitasi adalah hasil suatu tindak balas serologi yang melibatkan antigen (toksin) dan antibodi (antitoksin). Kultur bakteria yang diuji 2. Ujian Elek Strain Corynebacteria diphtheriae yang menghasilkan toksin dapat dikesan secara in vitro melalui penghasilan presipitasi apabila toksin ini bertindak dengan antitoksin. Inkubator (Reagen agar dasar jenis Elek: Dari sumber komersial) TATACARA 1. 2. Piring Petri yang steril 9. manakala pada bahagian setengah plat agar yang disapu dengan antitoksin tidak terbentuk zon opalesens.PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Lesitinase dihasilkan jika zon opalesens hanya kelihatan di sekeliling koloni di bahagian setengah plat agar tanpa antitoksin. Turunkan suhu kepada 50°C dengan membiarkan di dalam penganggas air selama 15 minit. 6. Biarkan agar menjadi kering. 7. Serum lembu 7. Inokulasi permukaan agar dengan bakteria (kawalan positif. 3. 9. Kultur bakteria kawalan positif (disahkan menghasilkan toksin difteria) 3. Kultur bakteria kawalan negatif (disahkan tidak menghasilkan toksin difteria) 4. 8. Pentafsiran hasil positif: Bakteria menghasilkan serta merembeskan enzim lesitinase yang dikenal pasti kerana aktivitinya menghasilkan zon opalesens dihalang oleh antibodi anti-lesitinase (antitoksin). Campurkan 2 ml serum lembu. kawalan negatif dan yang diuji) secara tegak lurus (90°) melintasi jalur kertas antitoksin. Antitoksin difteria 10. 4. Agar dasar Elek 5. 5. Walau bagaimanapun. secara tradisi ujian ini dimasukkan ke bahagian ujian biokimia. Pentafsiran ujian positif: Bakteria menghasilkan toksin difteria. Letakkan kertas yang mengandungi antitoksin di tengah piring agar sejurus selepas agar mem-beku. Kertas turas 8. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Garis presipitasi kelihatan muncul daripada sudut pertumbuhan bakteria yang diuji dan bakteria kawalan positif.

Jika bakteria mempunyai kemampuan untuk bergerak atau bersifat motil ia akan menunjukkan penyebaran yang bermula dari garis inokulasi. 3. Ujian Motiliti dengan Menggunakan Agar Separuh Pejal Media pertumbuhan dengan kepekatan agar yang rendah (0. kompleks tak larut berwarna merah hasil pereduksian oleh bakteria yang tumbuh. Elakkan daripada menggerakkan dawai ke kiri atau ke kanan semasa dikeluarkan (dan juga semasa dawai ditusuk) kerana ini akan menyebabkan pertumbuhan yang kelihatan tersebar dan memberi tafsiran positif palsu mengenai mobiliti. Kultur bakteria Agar nutrien (0. 3. Bakteria yang tak motil akan tetap pada garis inokulasi dan sama sekali tidak akan tersebar.4% atau <) merupakan suatu media separuh pejal yang membolehkan bakteria bergerak dan menyebar ke pelbagai arah di dalamnya. Pertumbuhan beberapa jenis bakteria tertentu mungkin dihalang oleh garam tetrazolium. 2. 2. 4. N OTA 1. Plat harus disediakan pada hari ujian dilakukan. Pentafsiran ujian: Ujian positif – bakteria motif. Sterilkan keseluruhan dawai lurus. Dawai yang ditusuk ke dalam media dikeluarkan seboleh-bolehnya bertepatan dengan garis kemasukannya. Amati pola pertumbuhan bakteria. Garam tetrazolium adalah tanpa warna dan akan diubah kepada formazan. Ujian negatif: Pertumbuhan bakteria terhad kepada garis tusukan. 3. 4. ujian negatif – bakteria tak motil. Tatacara Ujian Motiliti (Pergerakan) pada Agar Separuh Pejal BAHAN 1. Tusukkan hujung dawai ke dalam agar separuh pejal sehingga ke dasar tabung. 2.N OTA 1. 2. kemungkinan garis presipitin juga dihasilkan oleh strain kawalan negatif (dan juga Corynebacterium akibat antigen yang umum kepada semua korinebakteria). PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pertumbuhan bakteria (merah) tersebar daripada garis tusukan dawai lurus. Sentuh koloni bakteria dengan penghujung dawai. 4. 90 . Eramkan semalaman. Garam tetrazolium digunakan dalam ujian motiliti ini kerana ia memudahkan pengesanan pertumbuhan serta penyebaran bakteria secara visual di dalam media. Pastikan strain kawalan negatif dan strain kawalan positif diikut sertakan. 4. Jika plat dieramkan lebih 48 jam.4% atau <) yang mengandungi indikator (garam tetrazolium) di dalam tabung uji Dawai lurus Inkubator TATACARA 1. 3. Oleh kerana keseluruhan dawai lurus akan ditusuk ke dalam agar maka pastikan keseluruhan dawai ini dibakar untuk mensterilkannya. Gunakan inokulum yang tebal. 5. Beberapa bakteria seperti Pseudomonas adalah aerobik dan akan hanya menunjukkan motiliti pada bahagian atas media ini.

suatu zon rencatan pertumbuhan akan terbentuk di sekeliling disk yang mengandungi antibiotik tersebut. Seseorang doktor haruslah mengetahui mengenai tahap kerentanan (susceptibility) sesuatu mikroorganisma terhadap antibiotik tertentu supaya memudahkannya membuat keputusan yang sesuai dalam rawatan serta pengurusan seseorang pesakit. Pada masa ini kebanyakan antibiotik dan terbitannya yang digunakan dalam rawatan dihasilkan secara sintetik atau buatan.6. atau bersama bakteria kawalan. bahkan kadangkala boleh tumbuh di bawah disk. Jika kultur bakteria sensitif terhadap sesuatu antibiotik. Pendekatan ini disebut sebagai ujian resapan disk dan terdapat dua tatacara yang umum. Kemudian disk diletakkan di atas inokulum yang telah disebarkan pada permukaan agar atau pada permukaan media agar yang telah dicampur organisma sebelum pengeraman. jika ia resistan. prosedur pertama (awal) adalah penginokulasian hanya bakteria yang diuji. organisma yang diuji digariskan (atau diinokulasi dan kemudian disebarkan) memenuhi permukaan media agar di dalam piring Petri.1. 6. 3. UJIAN SENSITIVITI ANTIBIOTIK IN VITRO Rawatan penyakit dengan sesuatu bahan atau sebatian kimia dinamakan kemoterapi. Sebaliknya. Senarai antibiotik yang dipencilkan dan dikenal pasti sememangnya cukup panjang. UJIAN RESAPAN DISK Dalam ujian resapan disk. Antibiotik tersebut akan merembes keluar daripada disk dan meresap ke dalam media. iaitu tatacara Stoke dan tatacara perbandingan. tetapi terlebih dahulu diserapkan ke dalam disk-disk kertas (satu disk satu jenis antibiotik dengan satu unit pencairan). 3. Agen kemoterapi yang dihasilkan berikutan aktiviti metabolik bakteria atau fungus disebut antibiotik. 91 . Buangkan swab ke dalam bekas khas yang mengandungi disinfektan. Celupkan swab steril ke dalam suspensi bakteria yang berada di dalam tabung uji. Putarkan swab pada dinding sebelah dalam tabung untuk menyingkirkan suspensi yang berlebihan. Suspensi bakteria yang diuji di dalam air pepton Swab (steril) Plat agar darah Mueller-Hinton TATACARA 1. Sapukan swab sambil memutarkannya pada permukaan media agar untuk penginokulasian mengikut corak seperti diterangkan di bawah: Sapukan swab mula-mula ke satu arah sehingga memenuhi keseluruhan permukaan media dan kemudian sapukan pula menurut arah kira-kira 90 darjah daripada arah sapuan semula. pada keseluruhan permukaan media plat agar. Cara lain ialah organisma dicampurkan dengan media agar yang masih cecair dan kemudian dituangkan ke dalam piring. 2. 4. pertumbuhan akan berlaku sehinggalah mencapai ke pinggir disk. Maklumat ini boleh diperolehi di makmal umumnya melalui dua teknik atau pendekatan iaitu ujian resapan disk dan asai pencairan tiub. Tatacara Membuat Inokulasi Bakteria pada Keseluruhan Permukaan Media Plat Agar BAHAN 1. namun demikian kebanyakannya tidak mempunyai nilai perubatan kerana sesetengahnya mungkin terlalu toksik terhadap pengguna atau sukar diperolehi. Biasanya larutan antibiotik ini tidak terus diletakkan ke atas agar. 2. Dalam ujian resapan disk.

Sterilkan gelung dawai. 4. Suspensi bakteria yang diuji di dalam air pepton Suspensi bakteria kawalan Swab (steril) Plat agar darah Mueller-Hinton Alat pemutar plat Petri TATACARA 1. 5. 4. 5. 8. 2.Tatacara Membuat Inokulasi 2 Jenis Bakteria di Bahagian yang Berasingan pada Permukaan Media Plat Agar BAHAN 1. Letakkan plat agar di atas pentas pemutar plat Petri. Putarkan swab pada dinding sebelah dalam tabung uji berkenaan untuk menyingkirkan suspensi yang berlebihan. Suatu garis perbatasan antara kedua-dua jenis bakteria kawalan dan ujian akan diperolehi di mana disk-disk antibiotik akan diletakkan nanti. 5. Goncangkan untuk mendapatkan suspensi yang homogenus. 93). 3. Celupkan swab yang steril ke dalam suspensi bakteria kawalan. 3. Kultur bakteria (masing-masing untuk ujian dan kawalan) Gelung dawai Penunu Bunsen Tabung air pepton Swab (steril) Jarum atau forseps (steril) Disk antibiotik Inkubator Pembaris TATACARA Hari pertama 1. 3. 4. 6. Inokulasi strain bakteria ini pada keseluruhan permukaan media agar dengan swab steril (rujuk kepada tatacara di ms. Ujian Resapan Disk: Tatacara Perbandingan BAHAN 1. 9. 6. 2. Pindahkan 3 koloni bakteria (garis pusat 1-2 mm) ke dalam 1 tabung air pepton. 3. Lakukan kaedah 2 dan 3 untuk bakteria yang akan diuji. Sentuhkan dengan swab yang mengandungi bakteria yang diuji bahagian tepi plat dan liputi kawasan permukaan agar ini dengan inokulum ini sehingga hampir menyentuh pinggir kawasan inokulum pertama. 7. 2. 92 . 2. 4. Buka penutup plat Petri dan inokulasi media dengan mula-mula menyentuh bahagian tengah plat dengan swab yang mengandungi bakteria kawalan sehinggalah penginokulasian ini memenuhi suatu kawasan bulatan kira-kira 5 cm garis pusat. Kaedah ini dilaksanakan sejajar dengan pergerakan alat pemutar plat. N OTA Pastikan swab tidak terlalu basah atau meninggalkan kesan yang tidak diingini pada permukaan agar.

10.5 cm antara 1 dengan lain mahupun antara disk dengan dinding plat. 5. Pastikan terdapat jarak sekurang-kurangnya 1. atau resistan. 7. 9. 2. Bandingkan hasil sensitiviti kedua-dua strain terhadap antibiotik dan tentukan sama ada strain yang diuji sensitif. 3. Kultur bakteria (masing-masing untuk ujian dan kawalan) Gelung dawai Penunu Bunsen Tabung air pepton Swab (steril) Alat pemutar plat Petri Jarum atau forseps (steril) Disk antibiotik Inkubator Pembaris TATACARA Hari pertama 1. Ujian Resapan Disk: Tatacara Stoke BAHAN 1. 2. 2. Ulangi kaedah 1 hingga 5 untuk strain kawalan pada plat lain yang mengandungi media yang sama. Pastikan pertumbuhan bakteria yang diuji dan bakteria kawalan adalah secara kuantitatif hampir sama. Seseorang hanya perlu merujuk kepada carta tersebut untuk menentukan pola sensitiviti strain bakteria yang diuji menurut senarai yang ditetapkan di dalam carta berkenaan. Tatacara perbandingan berdasarkan carta atau suatu piawai yang tersedia dikenali sebagai Tatacara Kirby-Bauer.s. N OTA 1. 7. Eramkan plat pada 37°C semalaman. Jika suatu carta rujukan piawai diperolehi atau sudah tersedia. 9. 8. Balikkan plat dan ukurlah garis pusat zon tanpa pertumbuhan bakteria (zon rencatan). 10. Pastikan terdapat jarak yang sekurang-kurangnya 1. Biarkan supaya permukaan media menjadi kering dan kemudian letakkan disk-disk antibiotik di atas media dengan menggunakan jarum atau forseps steril dan tekan disk ke atas permukaan agar. separuh sensitif (intermediate) atau resistan. 94). 4.5 cm antara satu disk dengan yang lain dan juga disk dengan dinding plat. Ini bagi menyatakan sama ada bakteria tersebut sensitif. 6.5. Inokulasi bakteria yang diuji dan bakteria kawalan di atas plat yang sama di bahagian yang berasingan (rujuk kepada bahagian tatacara di m. Letak dan tekan disk antibiotik tepat di atas garis perbatasan antara kedua-dua kultur supaya sebelah disk berada di kawasan kultur kawalan dan sebelah lagi di kawasan kultur yang diuji. ujian ke atas strain kawalan tidak perlu dijalankan. Hari kedua 8. Eramkan plat pada 37°C semalaman. separuh sensitif. 3. 6. 93 .

Kultur plat harus dieramkan sejurus selepas disk diletakkan. Jika ini tidak dipatuhi. kepekatan antibiotik yang meresap ke dalam media agar juga akan sentiasa sama. Zon rencatan yang berbentuk bujur boleh disebabkan oleh disk yang tergeser di atas permukaan media atau disk diletakkan terlalu rapat dengan pinggir piring. Ini dilakukan dengan mengamati tiub berkepekatan antibiotik terendah atau paling minimum dalam siri pencairan yang menghalang pertumbuhan bakteria (tiub yang jernih tepat disebelah tiub yang mula menunjukkan kekeruhan).2. 6. UJIAN PENCAIRAN TABUNG Pendekatan yang lebih kuantitatif untuk menguji sensitiviti bakteria terhadap sesuatu antibiotik adalah tatacara pencairan tabung. Dalam keadaan ini. Stafilokokus yang menghasilkan zon rencatan yang jelas. Pastikan pertumbuhan bakteria yang diuji dan kawalan hampir sama secara kuantitatif untuk memberikan perbandingan yang tepat di antara kedua-duanya. Agar Mueller-Hinton merupakan media yang paling sesuai untuk ujian sensitiviti resapan disk. N OTA 1. Kemudian setiap tiub diinokulasi dengan organisma berkenaan dan kepekatan perencatan minimum (minimum inhibitory concentration: MIC ) ditentukan. Kelewatan meletakkan disk menyebabkan bakteria tumbuh sebelum antibiotik dapat meresap ke dalam media dan bertindak ke atas bakteria. 7. Dalam prosedur ini. Jangan gunakan disk antibiotik yang telah tamat tempoh penggunaannya atau melebihi tarikh pelupusannya. Disk antibiotik harus diletakkan sejurus selepas inokulasi dilakukan. Buat perbandingan antara zon tanpa pertumbuhan yang dihasilkan terhadap strain ujian dengan zon yang dihasilkan terhadap strain kawalan untuk menentukan keresistanan bakteria kepada sesuatu antibiotik. 5. bermula daripada titik pusat disk). antibiotik disediakan dalam pencairan dua kali ganda di dalam suatu siri tabung media pertumbuhan. Gunakan isipadu agar yang sama setiap kali supaya ketebalan agar dalam piring Petri sentiasa sama.Hari kedua 4. 5. 2. tetapi memperlihatkan juga pertumbuhan bakteria yang berbonjol di sekitar pinggir zon harus dilaporkan sebagai resistan. Ia memakan masa lebih lama. Ini menghasilkan pembacaan yang kurang tepat. Bagi bakteria yang sukar tumbuh pada media ini bolehlah dicampurkan darah 5% sebagai nutrien tambahan. 8. 6. besar kemungkinan zon rencatan pertumbuhan yang lebih besar akan dihasilkan kerana resapan antibiotik terlebih dahulu berlaku sebelum pertumbuhan bakteria bermula. ukuran garis pusat atau jejari yang terkecil yang diambil kira. 4. Sama ada antibiotik berkenaan bersifat bakterisiadal (membunuh bakteria) atau bakteriostatik (merencat pertumbuhan bakteria) dapat dipastikan dengan melakukan pensubkulturan daripada tiub yang tidak menunjukkan pertumbuhan tersebut ke atas media agar tanpa antibiotik. 94 . oleh itu tidak disyorkan sebagai tatacara rutin. 3. Dalam keadaan ini. Fenomena ini mungkin ditemui di kalangan stafilokokus penghasil enzim betalaktamase yang diuji dengan disk antibiotik yang mengandungi penisilin dan terbitannya. Balikkan plat dan ukurlah jejari zon tanpa pertumbuhan bakteria (zon rencatan. Kepekatan terendah untuk antibiotik yang menunjukkan hasil “tiada pertumbuhan bakteria” pada subkultur dianggap sebagai kepekatan antibiotik terendah yang berupaya membunuh bakteria tersebut – kepekatan bakterisidal minimum (minimum bactericidal concentration: MBC).

3. 4. Sediakan 2 siri tabung yang mengandungi siri pencairan 2 kali ganda antibiotik yang diuji di dalam broth dengan kepekatan tertinggi antibiotik 200 µg atau 200 unit setiap ml (tabung bersaiz 13 mm x 100 mm. 3. 6. 2. Pastikan permukaan agar betul-betul kering. cara yang mudahnya adalah dengan merujuk kepada tabung kawalan positif yang mengandungi bakteria tanpa antibiotik (keruh). isipadu larutan 0. 4. 4. N OTA 1. 3. 4. Mulakan penitisan dari separuh tabung dengan kepekatan antibiotik yang tertinggi hinggalah kepada tabung dengan kepekatan yang paling rendah.Tatacara Ujian MIC (Kepekatan Perencatan Minimum) BAHAN 1.5 ml). Tatacara Ujian MBC (Kepekatan Bakterisidal Minimum) BAHAN 1. Bakteria kawalan adalah bakteria yang sensitif terhadap antibiotik yang digunakan dalam ujian ini dan mesti beri hasil yang positif sebelum hasil bakteria yang diuji boleh diterima. 5. Masukkan 0. titiskan (secara terpisah) 3 titis kandungan setiap tabung yang didapati jernih sahaja dalam siri tabung ujian MIC ke atas separuh plat. 5.jernih). 3.5 ml ke dalam setiap tabung. Pastikan terdapat juga 1 tabung yang mengandungi antibiotik dengan broth yang tidak mengandungi bakteria (tabung kawalan negatif). Siri tabung ujian Plat-plat agar Pipet Pasteur MIC TATACARA 1. 2. dan tabung kawalan negatif yang mengandungi antibiotik sahaja (jernih). Kultur broth bakteria yang diuji Kultur broth bakteria kawalan Tabung-tabung uji (steril) Pipet bersukat Antibiotik Inkubator bersuhu 37°C TATACARA 1. Goncang dan amatilah setiap tabung daripada kedua-dua siri tabung ini untuk menentukan pertumbuhan bakteria (positif . Untuk memastikan sama ada berlaku pertumbuhan atau tidak. Biarkan titisan larutan mengering sebelum mengeramkan plat pada 37°C semalaman. Tuliskan nombor siri tabung (atau kepekatan antibiotik) pada setiap separuh plat. 2. Pastikan tabung yang steril digunakan dan pencairan dibuat secara teknik aseptik. 5.keruh. 95 . 2. negatif . Kultur tabung harus dieramkan sejurus selepas bakteria dicampurkan. Dengan menggunakan pipet yang sama. termasuk satu tabung yang mengandungi broth tanpa antibiotik (tabung kawalan positif). 2. Lakukan pencairan kultur broth semalaman bakteria yang diuji dan bakteria kawalan sebanyak 1:1000 di dalam broth baru untuk memperoleh ~ 10 5 bakteria hidup setiap ml. Eramkan pada 37°C semalaman. 3. Gunakan pena penanda untuk membahagikan permukaan dasar setiap plat media kepada 2 bahagian sama besar untuk mendapatkan 2 ‘separuh plat’ bagi setiap plat media.

96 . Ini merupakan kepekatan bakterisidal minimum. Tentu dan pastikan pencairan yang terendah di mana tidak terdapat pertumbuhan bakteria lagi.6. Amati pertumbuhan koloni di atas plat bagi setiap pencairan. 7.

97 . terdapat banyak ujian serologi dan banyak variasi sesuatu ujian. Tindakan antigen mikrob dengan antibodi dapat dikenal pasti dengan beberapa cara seperti mewujudkan presipitasi atau aglutinasi. Dalam hal ini. sungguhpun kebanyakan ELISA untuk kegunaan dalam mikrobiologi adalah termasuk dalam golongan kedua ini. Percantuman antibodi dengan enzim membolehkan antibodi yang melekat kepada antigen dikesan apabila tindakan enzim menukar warna substratnya. N OTA 1. pengesanan identiti sesejenis mikrob adalah sukar kerana ia mempunyai saiz yang amat kecil dan tidak dapat dilihat dengan mata kasar. mikrob berkemampuan menghasilkan antibodi yang bertindak secara spesifik dengannya. aglutinasi lateks dan imunopendafluor. Oleh yang demikian. ELISA boleh merupakan asai kuantitatif atau kualitatif. Sungguhpun mikroskop boleh digunakan. Pemisahan ini dilakukan melalui pencucian. aspek umum kedua-dua ujian berkenaan akan dibentangkan. tatacara dwilapisan antibodi yang diubahsuai. iaitu ELISA. Asai ini merupakan imunoasai heterogenus kerana ia mempunyai suatu peringkat di mana komponen yang dilabelkan (gabungkan) enzim yang telah bertindak dengan ligannya dipisahkan daripada komponen yang sama yang tidak bertindak. mikologi dan virologi. tindakan sesuatu mikrob dengan antibodi yang spesifik terhadapnya adalah suatu pendekatan yang digunakan dalam pengenalan identiti sesuatu mikrob. Di bidang mikrobiologi. 2. tatacara perencatan. fasa pepejal anti-IgM dan tatacara secara tidak langsung (asai untuk pengesanan antibodi). ELISA terdiri daripada beberapa jenis asai: tatacara persaingan. manik) yang disaluti antigen atau antibodi juga digunakan kerana sampel kawalan positif dan negatif turut diasaikan dengan sampel ujian setiap kali ujian dijalankan. Ikuti arahan dengan tepat mengenai tatacara yang dinyatakan oleh pengeluar ujian. Rancangkan kekerapan ujian yang akan dijalankan untuk mengoptimumkan penggunaan sesuatu kit kerana reagen dan fasa pepejal (telaga. Oleh kerana mikrob merupakan antigen yang baik. diterangkan kerana ketiga-tiga ujian berkenaan mempunyai aplikasi dalam bidang bakteriologi. 7. Jika percantuman adalah dengan fluorokrom.1 ELISA Asai imunosorben bergabung enzim (enzyme-linked immunosorbent assay) atau lebih terkenal dengan singkatan ELISA adalah sejenis imunoasai yang antigen atau antibodi larut dilekatkan kepada suatu permukaan pepejal seperti permukaan manik atau telaga tanpa menghilangkan reaktiviti komponen imunologiknya. Jangan gunakan reagen selepas tarikh pelupusan bagi mengelakkan kemungkinan hasil negatif palsu. Ada juga ujian yang merupakan ujian rekaan makmal sendiri (in-house) di samping ujian komersial. tatacara dwilapisan antibodi. kebanyakan mikrob seperti bakteria memiliki morfologi kasar yang sama. Oleh yang demikian. 3. maka adalah sukar untuk menentukan identiti kebanyakan mikrob berdasarkan pengamatan secara langsung. pancaran cahaya berwarna tertentu – seperti warna hijau-kuning oleh fluorokrom FITC adalah tanda kehadiran kompleks antigenantibodi. rasanya tidaklah sesuai untuk dibahaskan tentang tatacara masing-masing.7. Dalam bahagian ini hanya tiga ujian mikrobiologi. UJIAN SEROLOGI DALAM MIKROBIOLOGI Suatu aspek yang penting dalam bidang mikrobiologi adalah pengesanan jenis mikrob yang merupakan agen etiologi sesuatu penyakit. Walau bagaimanapun. maka kit daripada pengeluar yang berbeza mempunyai tatacara tersendiri. ELISA dan aglutinasi lateks biasanya dilakukan dengan reagen komersial.

Ikut arahan dengan tepat mengenai tatacara yang dinyatakan oleh pengeluar ujian. Tambahan pula. 5. ujian ini tidak membazirkan reagen jika dilakukan ke atas sebilangan sampel yang kecil. Dalam sesetengah sistem enzim-indikator. Reagen komersial biasanya mempunyai sensitiviti yang amat tinggi dan ini boleh menimbulkan hasil positif palsu jika pencucian antara peringkat pengeraman dengan reagen tidak dilakukan dengan sempurna. Pergabungan antigen dengan antibodi akan menyebabkan kelompok-kelompok besar partikel lateks yang dapat diamati dengan mata kasar. 3. 4. Titisan dengan isipadu yang sama boleh dicapai dengan menggunakan mikropipet. 2. Sungguhpun ujian aglutinasi lateks slaid mudah dilakukan. 98 .4. Pastikan sisa daripada asai seperti cucian dimasukkan di dalam bekas disinfektan yang sesuai untuk mengelakkan berlakunya infeksi ke atas pengguna makmal. atau pun hasil negatif palsu. Baca hasil ujian pada masa yang ditetapkan selepas ujian dimulakan. Jangan lakukan ujian dengan menggunakan reagen daripada beberapa kit yang mempunyai nombor pengeluaran yang berbeza. sungguhpun tindak balas enzim ke atas substratnya telah dihentikan dengan bahan kimia yang sesuai. beberapa peraturan harus dipatuhi supaya hasil yang didapati boleh diyakini. Amalan ini seharusnya jangan dilakukan kerana mengurangkan isipadu reagen boleh menimbulkan hasil negatif palsu. 7. jika ia dilakukan dengan menggunakan alat pembaca ELISA. Jangan lakukan ujian dengan menggunakan reagen daripada beberapa kit yang mempunyai nombor pengeluaran yang berbeza. Para pengguna harus mempastikan sesuatu ujian itu bermutu tinggi dan sesuai untuk tujuan mereka. Ujian Aglutinasi Lateks Slaid Antibodi atau antigen boleh digabungkan dengan partikel polistirin (digelarkan ‘lateks’ kerana warna putihnya menyerupai lateks tumbuhan) bagi mengesan antigen atau antibodi masing-masing. 6. Goncang botol-botol reagen supaya memperolehi suspensi reagen lateks yang sama rata sebelum reagen lateks digunakan. umpamanya semalaman sungguhpun pada suhu peti beku. 7. sama ada daripada segi masa cucian mahupun bilangan cucian yang dilakukan. N OTA 1. khususnya. Titisan reagen lateks yang dititiskan daripada botol reagen adalah berbeza-beza. 5. Biarkan reagen mencapai suhu bilik sebelum ujian dilakukan kerana penggunaan kit sejurus selepas dikeluarkan dari peti beku mungkin memberikan hasil yang kurang memuaskan. 6. penyimpanan lama. Jangan tunggu terlalu lama selepas hasil asai dibaca. Jangan gunakan reagen selepas tarikh pelupusan supaya mengelakkan kemungkinan hasil positif palsu. Pastikan sisa asai seperti cucian dimasukkan di dalam bekas disinfektan yang sesuai untuk mengelakkan berlakunya infeksi ke atas pengguna makmal. 8. Titisan besar reagen daripada botol reagen mungkin menggalakkan para pengguna berusaha untuk mengurangkan isipadu reagen bagi mengurangkan kos. Di pasaran. Ujian ini adalah cepat serta mudah dilakukan dan tidak memerlukan alat radas yang mahal atau canggih. terdapat berbagai-bagai jenama ujian aglutinasi lateks untuk pengesanan berbagai-bagai antigen/antibodi. akan menukar warna hasil ujian daripada apa yang didapati sejurus selepas asai tamat. Oleh kerana ujian direka dengan sensitiviti yang tinggi. ada kemungkinan hasil negatif palsu didapati jika sampel diuji lebih daripada masa yang ditetapkan. Tidak semuanya boleh dianggap memuaskan dari segi spesifisiti dan sensitiviti. 9.

11. Sebarkan sehingga meliputi kawasan bulat seluas 1 cm garis pusat slaid mikroskop atau memenuhi seluruh telaga. 4.Ujian Imunopendafluor Tidak Langsung Kehadiran sejenis antigen (misalnya. Nisbah amaun tenaga yang dikeluarkan kepada tenaga yang diserap adalah amat tinggi (~85%) maka ia memberi sensitiviti yang baik. Dalam lain perkataan. Pancaran cahayanya pada gelombang 520 mµ adalah di kawasan sensitiviti pengamatan yang paling baik maka ia memberi sensitiviti yang baik. Tatacara Ujian Imunopendafluor Tidak Langsung BAHAN 1. gabungan secara spesifik antibodi dengan sesuatu antigen dikenal pasti melalui gabungan antibodi berkenaan dengan antibodi terhadapnya yang tercantum fluorkrom (ujian tak langsung). 13. atau sel dari spesimen klinikal) ke atas sekeping slaid mikroskop atau di dalam telaga cetak slaid mikroskop khas untuk ujian imunopendafluor. Titiskan suspensi sampel (sel diinfeksi mikrob dan ditanggalkan dari permukaan bekas kultur. 12. 2. 9. 3. Sungguhpun terdapat berbagai jenis fluorokrom seperti rodamin dan Texas Red. Biarkan kering. Fluoresein digunakan dalam bentuk fluorescein isothiocyanate ( FITC) kerana kehadiran kumpulan sianat yang mempunyai afiniti untuk protein membolehkan antibodi dicantum dengannya. 2. Autopendafluor berwarna hijau-kuning jarang berlaku. 10. Jenis warna (gelombang cahaya) yang dikeluarkan adalah khas untuk sejenis fluorokrom. Dalam pendekatan lain. 3. 4. 8. komponen mikrob) dapat dikenal pasti secara tidak langsung melalui pengamatan mikroskop apabila antigen berkenaan digabung secara spesifik dengan antibodi yang secara langsung tercantum fluorokrom (ujian langsung). 2. Fluorokrom adalah sebatian semula jadi atau sintetik yang boleh menyerap cahaya gelombang tertentu dan sejurus selepas itu mengeluarkan tenaga sebagai cahaya dengan gelombang yang lebih panjang. 7. Fiksasi spesimen (spesimen yang dititiskan kepada slaid mikroskop atau sel yang ditumbuhkan di atas slaid penutup dan diinfeksi dengan virus) 99 . cahaya suatu warna diserap dan cahaya warna lain dikeluarkan oleh fluorokrom. 5. fluoresein adalah fluorokrom yang paling umum digunakan kerana ia mempunyai beberapa kelebihan: 1. maka ia meningkatkan spesifisiti. Slaid mikroskop atau slaid khas untuk ujian imunopendafluor Piring Petri Kertas turas Kayu aplikator Varnis kuku Antiserum Konjugat antibodi terhadap antiserum dan FITC (‘konjugat’) Larutan salin yang ditampankan fosfat (PBS) Metanol Air suling Larutan PBS 90% dan gliserol 10% Inkubator bersuhu 37°C Mikroskop imunopendafluor TATACARA Penyediaan spesimen sel yang diuji ke atas slaid mikroskop 1. 6. 3.

7. Biarkan kering di dalam tempat gelap seperti laci yang tertutup. 9. Spesimen di atas penutup slaid dilekapkan di atas setitis kecil larutan PBS gliserol. Oleh yang demikian. Bilas spesimen ke atas slaid (atau penutup slaid) dengan PBS . Rendam dalam PBS selama 3 minit di dalam piring Petri (cuci). 15. Patahkan sebatang kayu aplikator di bahagian tengahnya dan letakkan dalam bentuk ‘V’ di atas kertas turas di dalam piring Petri (Ini merupakan bekas lembap). Oleh yang demikian. Spesimen harus dibaca (diamati dengan mikroskop pendafluor) secepat mungkin kerana intensiti cahaya pendafluor akan berkurang. Cuci semula 2 kali. Bilas spesimen yang ada di atas slaid (atau penutup slaid) dengan PBS. Keluarkan dan biarkan kering. Bilas dengan air suling. pastikan ia berfungsi dengan baik sebelum amaun yang lebih besar dibeli. 5. 20. 16. 17. Fiksasi spesimen yang terlalu lama mungkin menimbulkan pendafluor yang tak spesifik. Tutup piring Petri dan eramkan di dalam inkubator bersuhu 37°C selama 30-60 minit. Cuci 3 kali dengan PBS. biasanya digunakan dalam pencairan yang amat tinggi. Penyimpanan spesimen di dalam tempat yang gelap akan melambatkan proses ini. Sinaran pendafluor latar belakang boleh ditindaskan dengan spesimen dieramkan dengan metilin biru selepas tindakan dengan konjugat antibodi-fluorokrom. penutup slaid berkenaan ditekan. 3. 6. 1. 8. Reagen konjugat antibodi-fluorokrom biasanya diperolehi daripada sumber komersial. Titiskan persediaan konjugat ke atas spesimen dan sebarkan supaya meliputi ke seluruh spesimen. Letakkan slaid di atas kayu aplikator supaya slaid berada lebih tinggi daripada aras kertas turas. 19. Reagen konjugat. Tutup piring Petri dan eramkan dalam alat inkubator bersuhu 37°C selama 30-60 minit.4. 8. 2. 5. 100 . 11. Celup di dalam metanol pada suhu 4°C selama 2 minit. 23. 13. reagen berkenaan boleh disimpan pada suhu – 20°C tanpa dibeku jika ia dicampurkan dengan isipadu sama gliserol. 21. Letakkan spesimen yang berada pada penutup slaid di atas slaid yang diletakkan di atas kayu aplikator. Titiskan persediaan antiserum (sumber antibodi terhadap virus) ke atas spesimen dan sebarkan supaya meliputi seluruh spesimen. 18. dan lebih-lebih lagi antiserum. Jika reagen bermutu tinggi dan ujian dilakukan dengan sempurna. Pencucian yang dilakukan selepas pengeraman boleh dipendekkan serta lebih berkesan jika PBS dalam bekas yang mengandungi slaid spesimen dikacau dengan alat magnet yang berputar. 10. Amati dengan mikroskop pendafluor. Tindak balas dengan reagen antibodi 7. amaun yang kecil digunakan setiap kali. 6. spesimen masih boleh dibaca selepas disimpan semalaman. 12. 14. Untuk mengelakkan kehilangan aktiviti biologinya akibat reagen selalu dicairkan dan dibeku. 4. Kelilingi spesimen dengan 1 bulatan varnis kuku. Masukkan di dalam bekas lembap. 24. Biarkan lampu raksa mikroskop bernyala kira-kira 15 minit bagi menstabilkan pancaran cahayanya sebelum spesimen diamati. Pastikan mikroskop imunopendafluor dinyalakan sekurang-kurangnya 20 minit sebelum ia dipadamkan supaya jangka hayat lampu raksa dapat dikekalkan lama. N OTA Alas satu piring Petri dengan sekeping kertas turas dan basahkan dengan air. 22.

71-72 Ujian aglutinasi lateks slaid. 20 Telur-melakukan penyuluhan. 70-71 Telur-mengumpulkan cecair amniotik. 71 Telur-mengambil membran korioalantoik. 78 101 . 68 Telur-membuat inokulasi membran korioalantoik. 14-15 Pensterilan gelung dawai dengan api. 86-87 Ujian keperluan faktor pertumbuhan X dan V. 47 Media bakteria-jenis. 93-94 Ujian Sensitiviti: Bacitracin. 44-45 Mikroskop elektron-menyaluti grid dengan Formvar. 11 Pensterilan menggunakan alkohol yang membakar. 16 Mikroskop cahaya-penggunaan. 22 GasPak-mewujudkan keadaan anaerobik. 90 Ujian Resapan disk: Tatacara perbandingan. 82-83 Ujian Voges-Proskauer. 89 Ujian Fermentasi gula dan penghasilan gas. 80-81 Ujian Koagulase. 39-40 Mikroskop elektron-tatacara imun. 64 Kultur sel-pengkulturan semula sel yang dikrioawetkan. 23 Mikroskop elektron-pengamatan spesimen virus. 25 Pelekapan basah bakteria. 53-54 Kultur sel-inokulasi dengan virus. 61-62 Kultur sel-tripsinisasi sel selapisan dan pengermaan kultur sel. 76-77 Ujian Imunopendafluor. 12-13 Pewarnaan Albert (pewarnaan granul metakromatik). 69 Telur-mengumpulkan cecair alantoik. 83-84 Ujian Metil-merah. 92-93 Ujian Resapan disk: Tatacara Stokes. 74-76 Ujian Urease. 77-78 Ujian MIC (Kepekatan Perencatan Minimum) tabung. 53 Bantuan pemula-rawatan. 67 Kultur sel-kriopengawetan kultur sel yang hidup. 62-63 Kultur slaid fungus-membuat. 33 Pewarnaan kapsul (rujuk kepada pewarnaan negatif dengan dakwat India). 79 Ujian Sensitiviti: Optochin. 55-56 Kultur yis-merangsang penghasilan tiub germa. 30 Pelekapan titisan tergantung untuk bakteria. 13 Balang anaerobik-penggunaan. 41 Mikroskop elektron-pewarnaan negatif. 52 Balang lilin-mewujudkan atmosfera karbon dioksida. 36 Pewarnaan Schaeffer-Fulton. 26-27 Pewarnaan spora (rujuk kepada pewarnaan Schaeffer Fulton). 33 Pewarnaan metenamina-argentum Gomori. 99-100 Ujian Katalase. 27 Pewarnaan tahan asid (rujuk kepada pewarnaan ZiehlNeelsen). 46 Media agar-menyediakan sebagai cerun.penggunaan. 23 Pewarnaan Gram untuk fungus. 26 Pewarnaan asid periodik-Schiff. 34-35 Pewarnaan negatif dengan dakwat India. 47-49 Prosedur umum makmal mikrobiologi. 64-65 Kultur sel-penghitungan dengan menggunakan hemosiometer. 32 Pelekapan basah salin untuk fungus. 95 Ujian Motiliti bakteria di dalam agar separuh pepejal. 17 Pelekapan basah KOH untuk fungus. 10 Disinfektan-penggunaan. 66 Kultur sel-persediaan media. 31 Pelekapan basah lactophenol coton blue untuk fungus. 10 Fiksasi bakteria dengan haba-membuat. 40 Mikroskop cahaya-mengelakkan pertumbuhan fungus. 98 Ujian ELISA. 38-39 Mikroskop elektron-pengamatan spesimen bakteria. 16 Mikroskop cahaya-pembersihan kanta. 92 Inkubator CO2 . 20-21 Asepsis-pemindahan benda dari botol yang tertutup.INDEKS Apusan bakteria-membuat. 91 Inokulasi plat agar dengan 2 jenis bakteria untuk ujian sensitiviti antibiotik. 97-98 Ujian Elek. 9 Slaid mikroskop-membersihkan dan simpanan. 27 Pewarnaan Kinyoun (terubahsuai) untuk fungus. 34 Pewarnaan Gram untuk bakteria. 70 Telur-membuat inokulasi ruang amniotik. 79 Ujian Tiga gula besi. 84-86 Ujian Oksidase. 17-19 Plat garisan-teknik. 25 Pewarnaan Ziehl-Neelsen. 56-57 Media agar-menyediakan di dalam plat Petri. 60-61 Kultur sel-tripsinisasi seluruh tisu. 73-74 Ujian Indol. 47-49 Inokulasi plat agar dengan 1 jenis bakteria untuk ujian sensitiviti antibiotik. 52 Inokulasi plat agar dengan kultur yis. 95 Ujian MBC (Kepekatan Bakterisidal Minimum). 69 Telur-membuat inokulasi ruang alantoik.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful