P. 1
mikrobiologi

mikrobiologi

|Views: 484|Likes:

More info:

Published by: Nur Qurratul Aini Talaka-ta on Dec 06, 2010
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

03/17/2013

pdf

text

original

Sections

  • 1.AMALAN DAN PERATURAN DALAM MAKMAL MIKROBIOLOGI
  • 1.2.BANTUAN PEMULA KECEMASAN DI DALAM MAKMAL
  • 3.1.PENGAMATAN BAKTERIA
  • 3.2.PENGAMATAN FUNGUS
  • 3.3.PENGAMATAN VIRUS DENGAN MIKROSKOP ELEKTRON
  • 3.4.REAGEN PEWARNAAN: RUMUSAN DAN PERSEDIAAN
  • 4.2.PENGKULTURAN FUNGUS
  • 4.2.2.PENGKULTURAN FUNGUS
  • 5.1.UJIAN MAKMAL DALAM PENGENALPASTIAN BAKTERIA
  • 6.1.UJIAN RESAPAN DISK

2

Yap Kok Leong Abdul Hamid Abdul Aziz Mohd Salleh Mohd Yasin

PENERBIT UNIVERSITI KEBANGSAAN MALAYSIA BANGI • 1999

3

Cetakan Pertama / First Printing, 1999 Hak cipta / Copyright Universiti Kebangsaan Malaysia, 1999 Hak cipta terpelihara. Tiada bahagian daripada terbitan ini boleh diterbitkan semula, disimpan untuk pengeluaran atau ditukarkan ke dalam sebarang bentuk atau dengan sebarang alat juga pun, sama ada dengan cara elektronik, gambar serta rakaman dan sebagainya tanpa kebenaran bertulis daripada Penerbit UKM terlebih dahulu. All rights reserved. No part of this publication may be reproduced or transmitted in any form or by any means, electronic or mechanical including photocopy, recording, or any information storage and retrieval system, without permission in writing from the Penerbit UKM. Reka bentuk kulit dan ilustrasi olh Hassan Majid Diterbitkan di Malaysia oleh / Published in Malaysia by
PENERBIT UNIVERSITI KEBANGSAAN MALAYSIA 43600 UKM Bangi, Selangor D.E. Malaysia

Penerbit UKM adalah anggota / is a member of the PERSATUAN PENERBIT BUKU MALAYSIA /
MALAYSIAN BOOK PUBLISHERS ASSOCIATION

No. Ahli / Membership No. 8302 Dicetak di Malaysia oleh / Printed in Malaysia by
AMPANG PRESS SDN. BHD.

6 & 8, Jalan 6/91, Taman Shamelin Perkasa, Jalan Cheras, 56100 Kuala Lumpur, MALAYSIA Perpustakaan Negara Malaysia Data Pengkatalogan-dalam-Penerbitan

Yap, Kok Leong Mikrobiologi makmal / Yap Kok Leong, Abdul Hamid Abdul Aziz, Mohd Salleh Mohd Yasin. Mengandungi indeks 1. Microbiological laboratories. I. Abdul Hamid Abdul Aziz. II. Mohd Salleh Mohd Yasin. III. Judul. 579.078 ISBN 967-942-439-1

4

KANDUNGAN

Prakata . . . 7 1. Amalan dan Peraturan dalam Makmal Mikrobiologi . . . 9 1.1. Prosedur Umum di dalam Makmal Mikrobiologi . . . 9 1.2. Bantuan Pemula Kecemasan di dalam Makmal . . . 9 1.3. Disinfektan untuk Kegunaan Makmal . . . 10 1.4. Tatacara Aseptik . . . 11 2. Mikroskop Cahaya dalam Mikrobiologi . . . 14 2.1. Tatacara Mikroskop Cahaya . . . 14 3. Pengamatan Mikrob . . . 17 3.1. Pengamatan Bakteria . . . 17 3.2. Pengamatan Fungus . . . 30 3.3. Pengamatan Virus dengan Mikroskop Elektron . . . 38 3.4. Reagan Pewarnaan: Rumusan dan Persediaan . . . 42 4. Pengkulturan Mikrob . . . 44 4.1. Pengkulturan Bakteria . . . 44 4.2. Pengkulturan Fungus . . . 54 4.3. Pengkulturan Virus . . . 59 5. Pengenalpastian Agen Mikrob . . . 73 5.1. Ujian Makmal dalam Pengenalpastian Bakteria . . . 73 6. Ujian Sensitiviti Antibiotik In Vitro . . . 91 6.1. Ujian Resapan Disk . . . 91 6.2. Ujian Pencairan Tabung . . . 94 7. Ujian Serologi dalam Mikrobiologi . . . 97 7.1. Ujian ELISA . . . 97 Indeks . . . 101

5

Buku ini mengandungi 81 teknik dan maklumat teknikal. Oleh yang demikian. Sungguhpun kaedah yang digunakan dalam mikrobiologi banyak dan berbagai-bagai. Kami menaruh harapan agar buku ini berguna dalam mempertingkatkan lagi kemahiran pelajar mahupun pengamal mikrobiologi. Daripada pengalaman kami dalam mengendalikan sesi amali mikrobiologi terdapat beberapa kesilapan serta amalan yang tidak sewajarnya diulangi oleh setiap kumpulan pelajar baru. Yap Kok Leong Abdul Hamid Abdul Aziz Mohd Salleh Mohd Yasin Jabatan Sains Bioperubatan Fakulti Sains Kesihatan Bersekutu UKM 6 . Menyedari hakikat di atas.PRAKATA Mikrobiologi merupakan suatu sains praktik. terdapat beberapa kaedah seperti pewarnaan bakteria yang boleh dianggap sebagai teknik asas dalam amalan sains ini. Ini dilakukan supaya pelajar dapat memahami teori serta penggunaan teknik-teknik di atas dengan lebih mendalam kerana buku ini menyertakan beberapa petunjuk dan petua bagi mencapai hasil yang baik dan diharapkan. selain mempelajari dan mengumpul fakta serta konsep adalah penting bagi pelajar dan pengamal mikrobiologi mahir dan cekap dalam mengendalikan kaedah-kaedah makmal mikrobiologi. Oleh itu. sebuah buku yang menyentuh tentang teknik-teknik dasar makmal dan tradisional mikrobiologi amat diperlukan. kami menulis buku ini yang bukan sahaja memaparkan kaedah serta pelaksanaan yang sempurna. tetapi juga merangkumi pengenalan ringkas dan tepat mengenai teknik-teknik tersebut. Penggunaan setiap teknik ini sengaja diolah berdasarkan konsep yang dimaksudkan di atas. Sering juga terdapat soalan serta kemusykilan yang sama yang diajukan oleh mereka. di samping menambahkan sebuah lagi judul teks ke dalam senarai buku-buku teknikal dalam Bahasa Melayu yang tercinta. Teknik asas ini biasanya diajarkan kepada pelajar mikrobiologi dalam sesi amali yang terancang.

.

12. Bekalan Bantuan Pemula Kecemasan 1. BANTUAN PEMULA KECEMASAN DI DALAM MAKMAL Oleh kerana kemalangan boleh berlaku di dalam makmal. 14. Tutup gas dan paip air dengan rapat dan bersihkan meja setelah anda selesai bekerja dan bersiap sedia untuk meninggalkan makmal. Untuk mencapai matlamat ini sentiasalah mengingati dan mematuhi peraturan-peraturan umum makmal berikut: 1. Gantikan tiubnya jika perlu. Jangan membawa bahan-bahan makmal yang rosak. 1. 2. 3. Jangan makan. 5. Periksa penunu Bunsen dari semasa ke semasa untuk memastikan tidak berlaku kebocoran gas. 4. Basuh tangan dengan sabun dan air atau dengan disinfektan kulit sebelum anda memulakan sebarang pekerjaan di makmal. Jangan memasukkan pensil. Oleh itu adalah penting bagi kita menyedari dan mengawasi prosedur dan perilaku dengan betul serta penuh tanggungjawab semasa bekerja dengannya. 10. 4.1. 11.2. 5. Tumpuan khusus perlu diberikan kepada aspek-aspek keselamatan dan ketelitian di dalam makmal mikrobiologi demi kepentingan diri sendiri mahupun pekerja-pekerja lain. 6. Jangan nyalakan mancis semasa bekerja dengan/atau berdekatan dengan reagen meruap seperti alkohol dan eter. Buangkan semua bahan dan kultur yang tercemar ke dalam bekas khusus yang disediakan. 8. pekerja makmal haruslah mempunyai sedikit sebanyak pengetahuan mengenai bantuan pemula dan tindakan yang perlu diambil serta sedar akan keperluan ini.1. Gunakan penyedut getah atau alat penyedut khas untuk tujuan ini. 2. Jangan menyedut sebarang cairan ke dalam pipet dengan mulut. Mikrobiologi adalah mengenai mikroorganisma atau jasad renik yang mempunyai saiz kecil seperti fungus (kulat). Basuh tangan anda semula dengan sabun dan air atau dengan disinfektan kulit sebelum meninggalkan makmal. Antiseptik ringan untuk luka dan luka terbakar Kain kasa (gauz) atau pembalut steril Larutan asid asetik 2% Natrium bikarbonat Jeli petroleum/vaselin 9 . 9. Panggillah instruktor dengan segera jika berlaku sebarang KEMALANGAN terutama yang berkaitan dengan kultur mikroorganisma. misalnya bikar yang berisi disinfektan atau bekas yang disediakan khas. PROSEDUR UMUM DI DALAM MAKMAL MIKROBIOLOGI Mikroorganisma boleh menyebabkan penyakit pada manusia. 7. minum atau merokok di dalam makmal pada setiap waktu. Jangan membawa keluar dari makmal sebarang kultur atau bahan-bahan dalam kelas amali. AMALAN DAN PERATURAN DALAM MAKMAL MIKROBIOLOGI 1. Kot makmal janganlah dipakai di luar makmal. khususnya dalam kes-kes kecederaan ringan. Jangan menyentuh kawasan muka atau mulut anda semasa bekerja. pecah atau tercemar kepada instruktor. 3. bakteria dan virus. jari atau sebarang objek ke dalam mulut atau membasahkan pelekat dengan menggunakan lidah. Pakai kot makmal dan kasut pada setiap waktu anda bekerja di dalam makmal. 13. Simpan buku dan catatan berjauhan daripada tempat bekerja anda di dalam makmal untuk menghindari daripada tercemar.

pastikan mata dicuci dengan air yang banyak dengan air paip. balang pipet terpakai dan untuk mendisinfeksi permukaan. hematologi dan patologi kimia di dalam balang buangan sisa makmal. Aktiviti antimikrobnya tidak banyak dikurangkan oleh bahan organik dan tidak bertindak terhadap logam. bahan tuberkulosis dan bahan bakteriologi umum. jumpalah doktor. Disinfektan adalah bahan kimia yang dimaksudkan di atas yang digunakan untuk memusnahkan mikrob patogenik pada sesuatu objek tak bernyawa (inanimate). Jika keradangan pada mata tersebut masih berterusan. Gunakan hipoklorit untuk bahan yang mengandungi hanya sedikit bahan organik atau sedikit darah. pipet dan slaid mikroskop juga sering tercemar. balang buangan sisa makmal. 1. Boleh digunakan dalam bidang virologi. 2. Bahan antimikrob ini menyerang logam. Luka bakar asid. Bilas bersungguh-sungguh dengan asid asetik 2%. Jika luka kelihatan parah. tahap pemusnahan di peringkat ini tidaklah perlu mencapai tahap pensterilan. Untuk luka bakar kulit yang ringan (kulit kemerahan tetapi tidak sampai mengelupas). Untuk mengelakkan penyebaran patogen. DISINFEKTAN UNTUK KEGUNAAN MAKMAL Pekerja di makmal mikrobiologi sentiasa berhadapan dengan bahan-bahan berbahaya terutamanya yang mengandungi mikrob patogenik. iaitu pemusnahan semua bentuk hidupan. Aktiviti antimikrobnya dikurangkan oleh bahan organik. jangan berikan sebarang rawatan tetapi bawalah mangsa ke hospital. jangan menggunakan antiseptik. spesimen dan bahan terpakai terlebih dahulu disimpan buat sementara di dalam bahan kimia tertentu sehingga pekerjaan di makmal tersebut selesai. objek di dalam makmal seperti tempat kerja. Contoh: Clearsol. Luka bakar api. 10 . Luka. Bilas dengan alkohol 70% atau dengan antiseptik. Hipoklorit sesuai digunakan dengan detergen anionik dan bukan ionik tetapi tidak sesuai 3. Segera simbah dengan sabun dan air dan sapukan dengan natrium bikarbonat. Di samping ini. 4. sesuai untuk menginaktivasi virus. Sudol. cuci luka dan teliti sama ada terdapat bendasing (kaca) di dalam luka. objek seperti spesimen klinikal dan pipet dikumpulkan di dalam bekas yang sesuai sebelum disterilkan dan dibuang. Umumnya. tidak digunakan untuk darah dan virus. sapukan lapisan tipis jeli petroleum di kawasan berkenaan. Luka bakar alkali. Digunakan pada pencairan seperti yang ditetapkan oleh pengeluar disinfektan. Elak daripada menggunakan air kerana boleh menyebarkan alkali berkenaan. Disinfektan Jenis Hipoklorit 1. 2. Jika formalin atau mana-mana cairan tersimbah ke dalam mata. 2.Tatacara Rawatan Bantuan Pemula 1. Bagi luka bakar yang lebih serius. 3. Balut dengan kain pembalut berperekat atau dengan balutan longgar.3. Sebatian kimia halogen dan fenol adalah di antara agen yang penting sebagai disinfektan. Untuk luka ringan dan cakaran. Namun demikian. 5. 3. Digunakan untuk kebanyakan bahan organik. 4. Sesuai untuk kerja mikrobiologi umum. Segera berjumpa doktor. tetapi tidak digunakan untuk bahan tuberkulosis atau yang diperbuat daripada logam. Disinfektan Jenis Fenolik Jernih 1. 4.

Dengan perkataan lain. P E R H AT I A N 1. Penggunaan umum: 1000 ppm klorin bebas. Keluarkan dawai. Pastikan gelung dawai yang steril ini tidak tersentuh sebarang objek sebelum digunakan. Elakkan daripada meletakkannya langsung di atas meja. Letakkan ia di atas rak khas atau pegang sahaja sementara menunggu dingin. gelung dawai ini terlebih dahulu dibakar supaya semua mikrooganisma yang terdapat pada permukaannya musnah dan terhapus serta tidak akan tercampur atau mencemari kultur bakteria murni yang akan diambil dengannya nanti. Masukkan gelung dawai ke dalam api penunu Bunsen seperti yang ditunjukkan pada Rajah 1. 3. Presept. Adalah penting juga dalam mengamalkan teknik aseptik. Balang pipet: 2500 ppm klorin bebas. gelung dawai ini disterilkan setiap kali selepas digunakan. Biarkan ia supaya dingin semula (sama ada dengan memegang atau meletakkannya di atas rak khas) sebelum digunakan. Lakukan pembakaran sehingga peringkat keseluruhan dawai menjadi merah membara. dengan detergen kationik. TATACARA ASEPTIK Teknik aseptik bukan sahaja bertujuan untuk menjamin kesterilan bahan yang anda sedang kendalikan (iaitu tanpa berlakunya sebarang pencemaran ke atas bahan berkenaan) tetapi juga merangkumi tindakan menghindari daripada berlakunya pencemaran mikroorganisma yang sedang dikaji ke atas diri anda sendiri (tangan. Gelung dawai ini merupakan alat utama di makmal bakteriologi yang digunakan untuk memindahkan bakteria daripada suatu kultur ke tempat-tempat lain.5 mm yang dibentuk melingkar seperti gelung pada salah satu penghujungnya. Penghujung lainnya dicantumkan kepada sebatang pemegang dawai. Gelung dawai haruslah sentiasa disterilkan melalui pembakaran merah membara seperti di atas sebelum dan sesudah digunakan. Tatacara Pensterilan Gelung Dawai dengan Api BAHAN 1. 7. Pensterilan Gelung Dawai dengan Api Gelung dawai adalah sejenis dawai yang umumnya terdiri daripada nichrome atau platinum dengan garis pusat berukuran 0. 3.5.4. gelung dawai ini disterilkan. 1. 11 . Sebelum digunakan. Nyalakan penunu Bunsen dan buka sepenuhnya liang kemasukan udaranya. 2. 4.1. Contoh: Chloros. 2. Gelung dawai Rak gelung dawai Penunu Bunsen TATA C A R A 1. pakaian mahupun tempat anda bekerja di makmal) dan juga ke atas pekerja-pekerja lain. 2. 6.

2. Celup objek atau bahagian yang akan disterilkan ke dalam balang alkohol. seperti bahagian memotong gunting ialah dengan mencelupkan objek atau bahagian daripada objek berkenaan ke dalam alkohol dan kemudian membakar objek beralkohol tersebut. Sentuhkan objek beralkohol kepada api penunu Bunsen supaya alkohol terbakar. misalnya. Balang alkohol (mengandungi etanol 70%) Penunu Bunsen TATACARA 1. mikroorganisma yang terdapat pada permukaan objek tersebut juga turut terbakar dan akhirnya dihapuskan. Seterusnya bakar keseluruhan dawai sehingga menjadi merah sebelum dikeluar dan didinginkan di udara.1 Cara membakar gelung dawai Pensterilan Alat dengan Alkohol yang Membakar Suatu tatacara cepat untuk mensterilkan objek kecil atau sebahagian daripada sesuatu objek. Sungguhpun ini merupakan suatu kaedah pensterilan yang boleh digunakan dalam keadaan-keadaan tertentu. Singkirkan alkohol yang berlebihan. RAJAH 1. 3. Dalam tempoh alkohol pada permukaan objek tersebut terbakar. 12 . ia kurang meyakinkan dibandingkan dengan pensterilan yang diperolehi dengan menggunakan autoklaf. Pegang objek kecil seperti slaid mikroskop atau penutup slaid dengan forseps dan objek yang lebih besar pada pemegangnya. Tatacara Pensterilan Alat dengan Alkohol yang Membakar BAHAN 1. 2. Naikkan gelung perlahan-lahan sehingga bahagian gelung keluar dari kemuncak api biru dan biarkan terbakar sehingga merah membara.Mulakan dengan memasukkan gelung dawai langsung ke dalam api (biru) di bahagian gas tak terbakar. 4.

PERINGATAN Amalkan prosedur ini setiap kali anda melakukan penginokulasian supaya pencemaran khususnya dari udara di sekitar kita dapat dihindari. segera lalukan mulut botol/tabung ke dalam api beberapa kali dan kemudian masukkan sesuatu yang diambil dengan gelung dawai atau pipet steril dengan tangan kanan. Peganglah botol/tabung di bahagian dasarnya (iaitu agak berjauhan daripada mulut botol/ tabung) dengan tangan kiri. iaitu mensterilkan mulut botol/tabung sambil menghindari daripada berlakunya pencemaran udara dan mengambil inokulum daripada sejenis media kultur ataupun memasukkan inokulum ke dalam media. Tanggalkan penutup botol/tabung tersebut dengan jari kelengkeng kanan dan pegang terus penutup ini dengan jari berkenaan. Jadi udara di persekitaran api akan terbawa arus ini ke atas dan akan mencegah partikel kecil seperti debu dan sebagainya daripada mendap di kawasan persekitaran ini. 3. Pada prinsipnya. 2. NOTA 1. Jauhkan objek daripada api penunu Bunsen dan biarkan sehingga api pembakaran alkohol tersebut padam dengan sendirinya. Lalukan semula mulut botol/tabung ke dalam api beberapa kali sebelum botol/tabung tersebut ditutup. 2. iaitu arus udara yang bergerak ke atas disebabkan haba dari api tersebut. Longgarkan dahulu penutup botol/tabung yang ketat dengan tangan kanan. Oleh itu. bekerja berdekatan dengan api ini amat digalakkan dan seharusnyalah menjadi amalan di bidang mikrobiologi. Letakkan balang berisi alkohol berjauhan daripada api penunu Bunsen untuk mengelak daripada disambar api tersebut. Berdasarkan konsep ini. Bahan kaca seperti slaid atau penutupnya akan pecah sekiranya dibiarkan dalam api pembakar terlalu lama. Sentiasalah memegang objek supaya parasnya lebih rendah daripada paras tangan untuk mengelak daripada alkohol yang sedang terbakar mengalir ke tangan dan mengakibatkan kebakaran pada diri sendiri. dipercayai bahawa bekerja berdekatan dengan sesuatu sumber api umumnya boleh mengurangkan kadar pencemaran dari udara. ia dapat mengelak daripada berlakunya pencemaran dari udara disebabkan partikel-partikel yang kecil apatah lagi spora fungus dan bakteria yang biasanya terapung atau berterbangan akan bergerak ke atas menurut arus dan tidak akan terjatuh ke dalam mana-mana media yang terdedah di bawahnya berdekatan dengan api. ATAU dengan peralatan yang sama keluarkan sesuatu bahan (misalnya kultur) daripada botol/tabung berkenaan. 5. api penunu Bunsen menghasilkan arus perolakan. Kaedah ini hanya boleh digunakan untuk objek kaca dan logam sahaja. NOTA 1. Dengan tangan kiri. Dengan demikian. tanpa meletakkannya (lakukan prosedur ini berdekatan dengan api penunu Bunsen). Mata gunting mestilah dalam keadaan terbuka semasa proses pensterilan supaya bahagian tajamnya terdedah kepada alkohol dan pembakaran. 3. PERHATIAN 1. Teknik ini membolehkan anda melakukan dua perkara secara serentak dengan kedua-dua tangan. 4. Tatacara Mengeluarkan dan Memasukkan Bahan daripada Botol yang Tertutup 1. 13 . 2.5. 2. untuk melaksanakan pengambilan inokulum dari spesimen tertentu atau penginokulasian sesuatu media.

8. cahaya yang dibiaskan pasti tidak akan masuk ke dalam kanta. kuasa sederhana (40-45X) dan kuasa tinggi (100X) atau rendaman minyak (kuasa yang paling tinggi). 2. Amatilah apusan melalui kanta okular. 10.1). Pusingkan tombol pengatur fokus halus perlahan-lahan supaya objektif bergerak ke atas sehingga dapat memfokus sesuatu objek pada slaid. Ulangi prosedur di atas dengan kanta objektif rendaman minyak (100X). 2. 3. 4. Sebenarnya. kuasa resolusi 200 nm ini adalah dalam keadaan optimum dan sungguhpun objek boleh ‘diamati’. Letakkan slaid di atas pentas/dataran mikroskop dengan apusan di sebelah atas. Sungguhpun kini terdapat pelbagai jenis mikroskop. Pusingkan tombol pengatur fokus kasar perlahan-lahan supaya objektif bergerak ke atas sehingga anda dapat melihat dan memfokus sesuatu pada slaid.1. Amatilah apusan melalui kanta okular (mata). Keadaan ini memberikan imej yang lebih terang kerana cahaya yang melalui slaid mikroskop dan terkena pada spesimen yang sedang diamati tidak dibiaskan dan oleh yang demikian disalurkan ke dalam kanta rendaman minyak sebab indeks refraktif kaca dan minyak rendaman adalah hampir sama. Putarkan objektif (40X) supaya berada tepat di atas apusan. struktur dan saiznya amat sukar dipastikan.2. jika ruang antara spesimen dan kanta adalah udara.2 mikron (µm) atau 200 nm kerana ini adalah had yang ditentukan oleh gelombang cahaya yang dapat dilihat. letakkan satu titis minyak rendaman di dalam lingkaran apusan pada slaid. TATACARA MIKROSKOP CAHAYA Tatacara Menggunakan Mikroskop Cahaya Biasa BAHAN 1. yang lazim dan paling sering digunakan ialah mikroskop cahaya jenis kompaun iaitu mempunyai dua set kanta (Rajah 2. resolusi mikroskop cahaya biasa ialah 300 nm. Sebelum memulakannya terlebih dahulu naikkan kanta objektif (100X) sehingga ke had maksimum. Jumlah kuasa pembesaran adalah kuasa pembesaran objektif darab kuasa pembesaran kanta okula. MIKROSKOP CAHAYA DALAM MIKROBIOLOGI Antara teknik asas makmal yang seharusnya diketahui oleh seseorang penuntut mikrobiologi ialah pengamatan ke atas mikrooganisma serta sel-sel yang terinfeksi mikroorganisma dengan menggunakan mikroskop. Oleh yang demikian. 4. Kanta okular (mata) biasanya mempunyai kuasa pembesaran 10X. 3. Kemudian. 7. 14 . Mikroskop cahaya Slaid apusan bakteria yang telah diwarnai Minyak rendaman Kertas/tisu kanta TATACARA 1. Putarkan pula tombol pengatur fokus halus untuk mendapatkan imej objek yang tajam dan terang. Turunkan objektif dengan memutarkan tombol pengatur fokus kasar sehingga jarak objektif berada kira-kira 1 mm di atas slaid. sebahagian besar daripada cahaya akan dibiaskan disebabkan perbezaan indeks refraktif yang besar antara kaca dan udara. Spesimen dihubungkan secara fizikal dengan kanta rendaman minyak melalui minyak rendaman. Sebaliknya. 5. 9. Walau bagaimanapun. Tukarkan kepada kanta objektif (100X) dan turunkannya sehingga hampir-hampir menyentuh permukaan slaid. 2. Cahaya menjadi tertumpu dengan intensiti yang meningkat dan akan memberikan resolusi yang tinggi. Dengan menggunakan cahaya biasa untuk memancarkan imej objek. 6. Mikroskop makmal yang biasa mempunyai sekurang-kurangnya tiga kanta objektif: objektif kuasa rendah (pembesaran 10X). peringkat yang paling halus sekali yang boleh kita lihat (kuasa resolusi) adalah 0.

13. yang digerakkan adalah objektif mikroskop daripada permukaan slaid ke arah atas dan bukan sebaliknya. 14. atau mungkin juga slaid dalam keadaan terbalik dan apusan berada di sebelah bawah. Jika spesimen masih tidak kelihatan dengan kanta rendaman minyak ada kemungkinan spesimen tidak dapat difokus kerana tombol pengatur objektif mikroskop diputarkan terlalu cepat. Adalah suatu amalan yang baik jika dalam melaksanakan pemfokusan ke atas sesuatu objek.1 Komponen-komponen mikroskop cahaya 15 . atau slaid melekat kepada kanta objektif dan turut bergerak ke atas semasa kanta digerakkan (masalah ini boleh diatasi dengan menekan slaid dengan satu jari semasa objektif digerakkan). Sebelum melakukan pengamatan. Tiub binokular Bahagian mata (eye piece) Bahagian mercu yang berputar Objektif Pentas Kondenser Tombol pengatur fokus Lampu Pentas mikroskop RAJAH 2. 3. putarkan tombol fokus halus perlahan-lahan supaya objektif bergerak ke atas sehingga anda dapat memfokus dan meneliti morfologi sel bakteria dengan jelas.11. Sambil mengamati melalui kanta okular. NOTA 1. objektif dapat diturunkan sehingga boleh melampaui paras pentas mikroskop dan apabila ini berlaku semasa pemfokusan besar kemungkinan penghujung objektif akan menekan ke atas slaid dan boleh menyebabkan slaid pecah. atau minyak rendaman yang diletakkan di atas apusan tidak mencukupi. Lapkan minyak rendaman daripada objektif dengan kertas kanta kering atau dibasahi dengan sedikit xilena diikuti dengan kertas kanta kering yang bersih lainnya sejurus selepas setiap kali anda selesai melakukan pengamatan minyak rendaman. gerakkan objektif ke atas menjauhi slaid. pastikan terlebih dahulu apusan pada permukaan slaid berada di sebelah atas atau slaid tidak diletakkan dalam keadaan terbalik. 2. 12. Turunkan objektif semula sehingga terendam di dalam minyak rendaman dan hampir-hampir menyentuh slaid. Ini kerana dalam sesetengah jenis/jenama mikroskop. Setelah selesai pengamatan.

Terdapat jenama mikroskop yang kantanya dilapisi dengan bahan kimia untuk mencegah masalah ini. dipercayai tidak berkekalan. Cara yang mudah dan baik untuk mengatasi hal ini adalah dengan menyimpan mikroskop di dalam bilik atau ruangan tertutup yang dilengkapi dengan alat penyahlembap (dehumidifier) yang akan mempastikan suasana udara di dalam bilik atau ruangan tersebut sentiasa kering. Ia perlu dirawat secara berterusan khususnya dengan menyalutkan semula bahan kimia berkenaan pada waktu tertentu. Jika minyak rendaman pada kanta rendaman minyak tidak dilap dengan baik. Tatacara Penjagaan Mikroskop Cahaya Iklim di Malaysia adalah lembap dan keadaan ini menggalakkan pertumbuhan fungus pada permukaan kanta mikroskop. atau tisu tandas atau sapu tangan untuk membersihkan permukaan kanta hanya akan mengakibatkan calar ke atas kanta dan ini akan mempersulitkan pengamatan seterusnya. 16 . lambat-laun debu akan melekat dan menutupi kanta tersebut dan akan menyebabkan pengamatan kabur serta menimbulkan kesulitan. tetapi perlindungan ini. 5. Penggunaan kertas tisu lain seperti kertas tisu muka.4.

PENGAMATAN PERGERAKAN BAKTERIA DI DALAM SUSPENSI CAIRAN Bakteria dalam keadaan semulajadi susah untuk diamati dengan mikroskop cahaya kerana bersifat transparen atau tidak mempunyai warna.1. Kultur bakteria (dalam botol media broth atau plat kultur) Slaid mikroskop Penutup slaid Plastisin Botol larutan salin (steril) TATACARA 1. 3. Buatkan suspensi bakteria dari gelung dawai di dalam titisan salin di atas. 2. 5. pengamatan dalam keadaan seperti ini terpaksa dilakukan juga.3. 3.1. Sterilkan gelung dawai melalui kaedah pembakaran dan biarkannya sehingga sejuk. Buatkan 1 lingkaran/cincin plastisin berukuran tidak melebihi luas penutup slaid. Tatacara Pelekapan Basah Bakteria BAHAN 1. Amati pergerakan bakteria dengan kanta objektif 40X. 4. Pengamatan motiliti bakteria di dalam suspensi cairan digunakan khusus untuk bakteria yang dikulturkan dalam media broth kerana tidak dapat tumbuh dengan baik pada media padat (agar). 4b. Dalam hal ini terdapat dua tatacara yang boleh digunakan. Letakkan setitis kecil salin steril di atas sekeping slaid mikroskop bersih. 2. Letakkan 1 gelung penuh kultur cecair bakteria (yang agak keruh atau tebal) ke atas slaid mikroskop. 3. iaitu pelekapan basah dan titisan tergantung. 4. Sentuhkan gelung dawai steril kepada 1 koloni bakteria pada plat kultar. Tatacara Pelekapan Titisan Tergantung BAHAN 1. Sterilkan gelung dawai melalui kaedah pembakaran dan biarkannya sehingga sejuk.1. 6. 3.1. Walau bagaimanapun. Sekiranya menggunakan kultur broth tukarkan langkah 4 kepada berikut: 4a. 17 . 2. Letakkan lingkaran tersebut di atas penutup slaid supaya titisan suspensi berada tepat di tengahtengah lingkaran plastisin dan tekan sedikit supaya lingkaran ini melekat kepada penutup slaid. misalnya untuk menentukan pergerakannya (motiliti). 4. Letakkan sekeping penutup slaid di atas suspensi bakteria seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3. 2. 5. Kultur bakteria (dalam botol media broth atau plat kultur) Slaid mikroskop Penutup slaid Botol larutan salin (steril) TATACARA 1. Sediakan 1 titis suspensi bakteria di tengah-tengah sebuah penutup slaid mengikut tatacara pelekapan basah. PENGAMATAN MIKROB PENGAMATAN BAKTERIA 3. 3.

1. partikel (termasuk bakteria) bergerak perlahan-lahan secara bolak-balik (to and fro) tanpa arah tertentu. Kadangkala kesemua partikel bergerak ke satu arah menurut aliran cecair.Letakkan setitis larutan salin di atas slaid mikroskop bersih dan sentuh 1 koloni bakteria dengan gelung dawai dan buatkan suspensi. Intensiti cahaya perlu dikurangkan dengan menurunkan kondenser dan mengecilkan diafragma untuk memberikan kontras yang secukupnya. 6. atau disebabkan mikroskop tergoncang. RAJAH 3. Ini membolehkan sel bakteria kelihatan lebih jelas dan pergerakannya dapat diamati dengan mudah. Letakkan sebuah penutup slaid mikroskop dan dengan berhati-hati lekapkan di atas suspensi bakteria (usahakan supaya tidak terbentuk gelembung udara). 2. atau berlakunya 18 .1 Tatacara melakukan pelekapan basah Rajah muka surat 18 4. NOTA Letakkan sebuah slaid mikroskop yang bersih di atas lingkaran plastisin dan tekan sedikit supaya ia melekat kepada plastisin. Dalam pergerakan Brown. Amatilah pelekapan basah ini di bawah kanta objektif pembesaran 40X. Ini adalah untuk mengelak daripada suspensi bakteria mengalami gegaran goncangan yang akan menyulitkan pengamatan. Amati pergerakan bakteria dengan kanta objektif 40X. Angkat dan terbalikkan slaid mikroskop dengan cepat supaya penutup slaid berada di atas dan suspensi bakteria menjadi tergantung. 5. Semasa melakukan pengamatan jangan letakkan tangan di atas meja ataupun menekan meja di mana mikroskop berada. 3.

Kemudian letakkan sebuah slaid mikroskop yang bersih di atas plastisin dan tekan sedikit supaya melekat kepada plastisin. atau partikel individu bergerak dengan pantas menuju ke sesuatu arah tertentu. RAJAH 3. Dengan hati-hati letakkan cincin plastisin melingkari suspensi tanpa menyentuhnya. yakni 22°C atau 25°C. adalah kira-kira 2 jam dan bagi kebanyakan bakteria. 5. untuk melakukan ujian motiliti. atau buatkan suspensi bakteria di atasnya. Kebanyakan spesies yang diambil daripada kultur padat sering memberikan hasil yang negatif untuk motiliti (memperlihatkan tidak motil). Letakkan kaca penutup slaid di atas permukaan yang bersih dan titiskan. Oleh yang demikian.4. dalam hal ini.2 Tatacara melakukan pelekapan titisan tergantung 19 . Motiliti sebenarnya ditunjukkan dengan gerakan yang aktif bercorak putaran. Dengan berhati-hati sekali angkat dan terbalikkan slaid mikroskop dengan cepat. suhu pengeramannya adalah di bawah 37°C. Dengan demikian suatu suspensi bakteria yang tergantung akan dihasilkan. penyejatan dari sisi kaca penutup. disarankan agar kultur cecair digunakan. Pengeraman optimum yang biasanya digunakan. Kelebihan tatacara ini daripada tatacara pelekapan basah adalah perubahan rupa bentuk (distortion) bakteria dikurangkan kerana tidak ditindih oleh penutup kaca.

3. Campurkan 5 ml asid hidroklorik pekat kepada 1 liter etanol 70%. Hapuskan alkohol dengan membakarnya dengan api penunu Bunsen. PERHATIAN Pastikan balang slaid tidak diletak berhampiran penunu Bunsen atau sebarang sumber api kerana alkohol mudah terbakar. TATACARA 1. 4. 3. 3. 20 . PERHATIAN 1. 6. Cuci dengan air suling. 2.85% (steril) TATACARA 1.2. Jangan pegang slaid yang dibakar dengan forseps secara tegak untuk mengelak kemungkinan alkohol mengalir ke atas tangan dan menyebabkan kebakaran. 4. 4. 8. 2. Keluarkan slaid mikroskop yang disimpan di dalam bekas yang mengandungi alkohol dengan menggunakan sebuah forseps bersih. Rendam slaid kaca di dalam alkohol asid semalaman. 5. 2. 7. Slaid mikroskop Etanol 70% Metanol 95% Asid hidroklorik pekat PERSEDIAAN REAGEN Alkohol asid 0. 3. Jauhkan bekas slaid yang mengandungi alkohol daripada api.5%. Lakukan di dalam kabinet asap. Letakkan slaid di atas kertas penyerap dan biarkan sehingga sejuk. Simpan di dalam balang tertutup yang mengandungi metanol 95%. Pegang slaid supaya aras tangan berada lebih tinggi daripada slaid. 2. Slaid mikroskop yang disimpan di dalam metanol 95% di dalam bekas yang tertutup Forseps Kertas turas Penunu Bunsen Gelung dawai Pensil gris/pena tanda (marker) kalis air Kultur bakteria Larutan salin 0. Tatacara Membuat Apusan Bakteria BAHAN 1.3. 2.1. PENYEDIAAN UNTUK PEWARNAAN BAKTERIA Tatacara Membersihkan dan Menyimpan Slaid Mikroskop BAHAN 1.

2. Pada apusan yang terlalu tebal. 3. Tandakan sudut kiri atas slaid dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. Kultur bakteria dari media padat (agar) 1.000 g selama 10 minit pada suhu bilik. Terbalikkan slaid dan buatkan lingkaran di sekeliling kawasan apusan dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. 3. Tandakan sudut kiri atas slaid dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. Kacau. 4. 3. Letakkan 1 gelung penuh kultur cecair di atas sebuah slaid bersih. Sentuh 1 koloni bakteria yang terasing dengan gelung dawai. Swab yang mengandungi spesimen klinikal Letakkan setitis kecil salin steril di atas sebuah slaid dan emulsifikasikan spesimen dari swab di dalam titisan salin ini. Tuangkan supernatan dan masukkan beberapa titis salin steril ke dalam tiub emparan ini. Nanah dan eksudat Ambil 1 gelung penuh spesimen dan sebarkannya di atas slaid supaya mencapai seluas 1.5 x 2. 3. Buat apusan dengan suspensi bakteria yang diperolehi. Sterilkan gelung dawai. 7. NOTA Emparkan urin dan cecair serebrospina pada tekanan emparan 10. 2. 4.5 x 2. 6. sel-sel bakteria akan kelihatan tersusun terlalu rapat dan padat sehingga sukar untuk menentukan morfologinya. Sebarkan suspensi bakteria sehingga membentuk bulatan seluas kira-kira 1 – 2 cm garis pusat. Urin dan cecair serebrospina 1. Biarkan supaya kering di udara. 6. Gunakan sedikit kultur bakteria supaya apusan yang disediakan membentuk filem yang agak tipis. Letakkan setitis kecil salin steril di atas sebuah slaid. Sebarkan sehingga membentuk bulatan seluas kira-kira 1 cm garis pusat. 2.5 cm.Kultur bakteria dari broth 1. Sterilkan gelung dawai. sel bakteria berada dalam keadaan berkelompok dan kemungkinan pewarnaan yang didapati juga tidak sama rata dan morfologi sel individu sukar untuk ditentukan. Suspensi bakteria harus disebarkan dengan baik supaya menghasilkan apusan yang sama rata. Terbalikkan slaid dan buatkan lingkaran di sekeliling kawasan apusan dengan pensil gris atau pena tanda kalis air.5 cm. 5. Jika tidak. 21 . Letakkan setitis kecil salin steril di atas sebuah slaid bersih. Buatkan suspensi bakteria daripada gelung dawai di dalam titisan salin. 8. Gunakan setitis suspensi sahaja supaya apusan cepat kering. Kahak (sputum) Pindahkan sedikit kahak dari bekas spesimen dengan swab steril ke atas sebuah slaid bersih dan sebarkan seluas 1. 5. 2. Biarkan sehingga kering di udara. 4. 1.

Biarkan slaid dingin di udara. pastikan bahawa permukaan slaid mikroskop yang mengandungi apusan berada di sebelah atas menghadap kanta objektif. pembunuhan bakteria adalah penting dalam pewarnaan kerana pada umumnya bakteria yang masih hidup sering bersifat kurang telap terhadap kebanyakan pewarna yang digunakan. tetapi juga untuk mengekalkan (mengawet) struktur sel bakteria tersebut serta meningkatkan daya penglihatan ke atasnya. NOTA Pegang salah satu penghujung slaid dengan ibu jari dan jari telunjuk dengan apusan di sebelah atas. Fiksasi Bakteria dengan Haba Sebarang proses yang membeku serta memejalkan sel bakteria dan strukturnya dikenali sebagai fiksasi. Tatacara Memfiksasi Bakteria dengan Haba BAHAN 1. Ini selain mempastikan slaid tidak terlalu panas. Di samping kebaikan dari segi kesihatan. Lalukan slaid sekali dengan cepat ke dalam api penunu Bunsen. Cara yang popular memfiksasi bakteria adalah dengan menggunakan haba dari suatu sumber api. biarkan apusan sehingga benar-benar kering sebelum melakukan fiksasi. juga akan menghilangkan haba dari slaid.4. di sekeliling kawasan apusan (di sebelah bawah slaid) dilingkari dengan pensil gris atau pena tanda kalis air supaya tapak di mana terdapatnya apusan mudah dikesan untuk diletak tepat di bawah kanta objektif serta untuk meletakkan titisan minyak rendaman. 5. 3. ia terlebih dahulu difiksasi. Dalam pengamatan ke atas sesuatu apusan dengan mikroskop. Proses ini tidaklah semata-mata bertujuan untuk melekatkan sel bakteria kepada slaid. 5. Lazimnya. Amalan ini tidak digalakkan kerana dengan cara demikian adalah sukar untuk menentukan sama ada fiksasi tercapai atau apusan telah terdedah kepada haba terlalu lama. 4. Permukaan slaid di mana terdapatnya apusan ini dapat dipastikan dengan tanda pensil gris yang dapat dikikis atau pena tanda kalis air pada permukaan bawah slaid. 1. Pemanasan yang berlebihan akan menyebabkan perubahan besar dalam bentuk sel bakteria atau sel bakteria menjadi pecah dan mengalami kerosakan. Sebaik-baiknya. dehidrasi) dan cara kimia. Ulangi prosedur ini sebanyak 3 kali (kesemuanya). Slaid disentuhkan ke atas tapak tangan selepas setiap kali pemanasan. Akibatnya pewarnaan yang diusahakan akan sia-sia sahaja. 2. 2. Pemanasan ke atas apusan yang basah dipercayai boleh mengakibatkan perubahan rupa (distortion) morfologi bakteria yang ketara. Adalah lumrah jika di dalam kelas amali terdapat pelajar yang memegang slaid dengan forseps dan memasukkannya ke dalam api penunu Bunsen dengan tujuan untuk mengeringkan dan sekaligus memfiksasi apusan. Apusan bakteria ke atas slaid mikroskop Penunu Bunsen TATACARA 1. Sekiranya slaid dirasakan terlalu panas pada tapak tangan maka besar kemungkinan sel bakteria pada apusan telah mengalami kehancuran atau telah berlaku artifak. 3. Justeru. Sebelum bakteria diwarnai. 22 . 2. sebab tidak akan memberikan hasil seperti yang diharapkan dan sebaliknya apa yang diperoleh ialah suatu keadaan yang dikenal sebagai artifak. Fiksasi boleh dilakukan dengan cara fizikal (haba. Dengan cepat sentuhkan slaid ke atas tapak tangan. Melalukan slaid dengan cepat ke dalam api penunu Bunsen sebanyak 3 kali adalah mencukupi bagi tujuan pemfiksasian. fiksasi juga boleh membunuh bakteria.

Untuk menunjukkan perbezaan yang wujud di kalangan sel bakteria tertentu. perbezaan indeks biasan yang kecil antara komponen-komponen sel bakteria juga menyulitkan substruktur bakteria untuk dilihat. Pewarnaan Gram Pewarnaan Gram adalah tatacara pewarnaan utama di bidang bakteriologi. pewarnaan ini juga digunakan untuk menggolongkan bakteria. tatacara pewarnaan perbezaan yang menggunakan dua atau lebih pewarna digunakan. Pewarnaan yang diterangkan setakat ini dikenal sebagai pewarnaan positif kerana yang diwarnakan ialah bakteria. keseluruhan sel bakteria diwarnakan secara sama rata dan substruktur atau komponen-komponen selnya tidak dibezakan.3. iaitu sama ada berasal daripada spesimen klinikal atau dari kultur pertumbuhan. Apabila sel bakteria diwarnakan dengan satu jenis pewarna sahaja. Intensiti pewarnaan boleh dipertingkatkan (ataupun supaya sasaran dapat diwarnakan) dengan menggunakan haba dalam keadaan tertentu atau menggunakan bahan kimia (aksentuator) seperti asid asetik.3. Pewarnaan juga digunakan untuk menunjukkan taburan dan jenis kimia berbagai-bagai komponen sel serta membezakan antara golongan-golongan bakteria. metilena biru. atau mordan mempertingkatkan afiniti ataupun kecenderungan pewarna terhadap struktur tertentu. Sebaliknya cas negatif ini akan menolak pewarna asid. Di samping membolehkan bakteria dilihat dengan lebih mudah. kristal ungu) kerana protoplasma bakteria mempunyai kandungan asid nukleik bercas negatif yang tinggi. pewarnaan ini disebut pewarnaan sederhana (simple staining). Mordan adalah bahan kimia yang membolehkan sesuatu pewarna mewarnakan sesuatu bahan. Dalam pewarnaan negatif. ciri pewarnaan adalah bergantung kepada anion (ion negatif) dan pada pewarna bes. Perlu disedari bahawa ciri-ciri pewarnaan bakteria (serta morfologi) dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti umur kultur dan sumber bakteria. Tambahan pula. cas yang negatif ini akan bertindak dengan ion positif pewarna bes. fenol atau anilin. Bakteria menunjukkan kecenderungan atau afiniti yang kuat terhadap pewarna bes (contoh: safranin. umumnya. satu filem pewarna gelap meliputi ruang dan celah di antara bakteria-bakteria (latar belakang) dan bakteria tidak diwarnakan. maka jurang perbezaan optikalnya juga adalah sedemikian. Pada pewarna asid. Apabila diwarnakan dengan pewarna bes. Dalam tatacara pewarnaan Gram. Keadaan ini mengakibatkan sel bakteria sukar untuk diamati. Pada umumnya dalam pewarnaan ini. Tindakan aksentuator ini tidak melibatkan pergabungannya dengan pewarna seperti yang berlaku pada mordan. PEWARNAAN BAKTERIA Oleh kerana perbezaan indeks biasan antara bakteria dan kawasan sekelilingnya tidak besar. mampu menyusup masuk ke dalam sel dengan lebih baik dan pewarnaannya lebih kekal. ciri pewarnaan bergantung kepada kationnya (ion positif). Pewarna yang digunakan. dengan demikian hanya latar belakang (kawasan di luar bakteria) sahaja yang diwarnai. pewarna digunakan secara berlebihan dan kemudian agen penghapus warna atau pembeza digunakan untuk 23 .1. Pewarna dan Jenis Pewarnaan Bahan pewarna boleh dibahagikan kepada dua golongan: pewarna asid dan pewarna bes. Sebagai langkah untuk mengatasi masalah ini perbezaan warna digunakan untuk memudahkan melihat keseluruhan sel bakteria dan juga untuk mempamerkan substruktur bakteria dan segala-galanya mengenai bakteria dengan lebih terperinci. berasal daripada terbitan garam asid bebas kerana bentuk ini lebih larut.

6. 4. kemudian buangkan. manakala yang kehilangan pewarna ini dan diwarnai dengan pewarna kedua dinyatakan sebagai Gram-negatif. 24 . 2. 5. kemudian singkirkan keseluruhan air tersebut. 8 = cuci & keringkan Pengamatan dan Pentafsiran Sel bakteria berwarna biru: Gram-positif. reaksi Gram berubah dengan umur kultur. 4. Segera cuci dengan air. 8. Ada juga bakteria Gram-positif seperti Corynebacterium yang mudah kehilangan warna pertamanya dan seringkali kelihatan sebagai Gram-negatif. NOTA 1. Kultur bakteria Kristal ungu Iodin Lugol Aseton-alkohol Safranin/karbol fuksin Kertas turas Tatacara 1. Tatacara Pewarnaan Gram BAHAN 1. Buat apusan bakteria pada slaid mikroskop. 3. Dalam kebanyakan spesies bakteria. Pewarna yang digunakan untuk menggantikan pewarna pertama yang dihilangkan oleh pembeza disebut pewarna balas (counter stain). Pada beberapa spesies basilus aerobik yang menghasilkan spora (contoh. Cuci dengan air. Protoplasma bakteria. Nota: peringkat No. masukkan slaid ke dalam lipatan dan tekan kertas dari luar sehingga semua air terserap daripada slaid tanpa menggosok permukaan slaid atau apusan). Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas penyerap (lipat kertas turas/penyerap. 7. Liputi apusan dengan kristal ungu selama 1 minit. Larutan iodin Lugol yang digunakan berfungsi sebagai mordan dan pelarut organik seperti alkohol dan aseton digunakan sebagai pembeza atau pengnyahwarna. Pegang slaid di dalam sinki secara condong dan titiskan dengan cepat aseton-alkohol ke atas apusan sehingga tiada warna biru (kristal ungu) terlihat keluar dari apusan (lebih kurang 3-10 saat bergantung kepada ketebalan apusan). sentiasa memberikan tindak balas Gram-negatif. Bacillus subtilis). dalam hal ini. 2. 5. 2.menghilangkan pewarna berkenaan. 3. sel vegetatifnya akan terwarna Gram-negatif atau granul-granul di dalam sel diwarnakan Grampositif selama beberapa generasi selepas spora bergerminasi. Sel bakteria berwarna merah/merah jambu: Gram-negatif. Kemudian liputi apusan dengan safranin atau karbol fuksin cair selama 30 saat. keringkan di udara dan fiksasi apusan tersebut. Kultur tua bakteria Gram-positif memberikan reaksi Gram tak tetap (Gram variable) – ada sel yang terwarna biru dan ada yang terwarna merah bercampur di antara satu dengan lainnya. Hasil tindak balas pewarnaan Gram adalah bergantung kepada komposisi dinding sel bakteria yang berkemampuan untuk mengikat pewarna pertama atau tidak. Bakteria yang mengekalkan pewarna pertama (kristal ungu) disebut sebagai Gram-positif. 6. Liputi pula apusan dengan iodin Lugol selama 1 minit.

Liputi pula apusan dengan metilena biru selama 30 saat. Pada bakteria tahan asid. Tatacara Pewarnaan Ziehl-Neelsen BAHAN 1. Lakukan ini sehingga keluar wap dari apusan selama 5-10 minit. dalam tatacara ini slaid perlu dipanaskan sehingga wap keluar kerana. Kultur bakteria Karbol fuksin Ziehl-Neelsen Alkohol asid Metilena biru Alkohol Sebatang kaca yang satu penghujungnya dibalut kain kasa (gauz) Kertas turas Penunu Bunsen TATACARA 1. Sifat tahan asid ini merupakan ciri yang berfaedah dan penting dalam membezakan mikobakteria dengan bakteria lain. bakteria golongan pertama ini disebut sebagai bakteria tahan asid. keringkan di udara dan fiksasikan apusan tersebut. Tambahkan alkohol-asid (penghilang warna) selama 25-30 saat. Oleh yang demikian. Sel bakteria berwarna biru kehijauan: bakteria tak tahan asid. 6. 5. 7. Sebaliknya boleh juga dengan menggunakan sebatang kaca yang salah satu penghujungnya 25 . Pemanasan dilakukan dari bahagian bawah slaid (apusan di permukaan atas) yang diletakkan di atas rak pewarnaan iaitu dengan menggunakan api kecil penunu Bunsen. kadar resap pewarna pada sel yang tahan asid adalah rendah berbanding dengan sel tak tahan asid. alkohol dan asid lemak (seperti asid mikolik) yang tersendiri. Buat apusan bakteria pada slaid mikroskop. apabila bakteria yang telah diwarnakan didedahkan kepada penghilang warna. Panaskan slaid dengan api pembakaran kain gauz yang dibasahi dengan alkohol. 8. 4. 3. Oleh yang demikian. 2. 8.Pewarnaan Ziehl-Neelsen (Pewarnaan Tahan Asid) Mikobakteria yang diwarnakan dengan pewarna fenilmetana (contoh: fuksin bes) dalam larutan anilin atau fenol akan mengekalkan warna tersebut meskipun telah didedahkan kepada asid yang kuat berbanding dengan bakteria jenis lain. Cuci dengan air. dalam hal ini. Ciri-ciri ini disebabkan oleh perbezaan komposisi kimia (secara kuantitatif dan kualitatif) bakteria tahan asid dan bakteria tak tahan asid. pewarna berkenaan kekal di dalam sel. (Beberapa spesies aktinomiset juga tahan asid). Cuci dan keringkan dengan kertas penyerap. NOTA 1. manakala pada bakteria tak tahan asid pewarna tersebut akan hanya masuk ke dalam sel dan kemudian disingkirkan daripada sel oleh penghilang warna. pewarna fenol mempunyai kelarutan yang tinggi di dalam sel dibandingkan dengan pembeza (penghilang warna). 7. haba digunakan untuk membolehkan pewarnaan terlaksana dalam jangka masa yang munasabah. 6. Di samping ciri-ciri ini. Oleh yang demikian. 3. Biarkan sejuk dan cuci dengan air. 5. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Sel bakteria berwarna merah: bakteria tahan asid. (Pastikan pewarna tidak mendidih atau menjadi kering). Banjirkan apusan dengan pewarna karbol fuksin Ziehl-Neelsen. 4. Mikobakteria yang tahan asid mempunyai karbohidrat. 2.

sel pesakit akan berwarna biru-kehijauan. 3. 2. Pemanasan meningkatkan ketelapan dinding spora sehingga pewarna malakit hijau dapat dengan mudah masuk dan mewarnai struktur ini. Cuci dengan air dan keringkan.2. Pewarnaan Albert (Pewarna Granul Metakromatik) Volutin bakteria (granul metakromatik) adalah bahan basofilik yang refraktif. granul volutin akan kelihatan merah dan bukan biru. Toluidina biru adalah pewarna metakromatik: apabila pewarna ini masuk ke dalam kompleks granul volutin yang besar. Jika diwarnai dengan toluidina biru. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Butir-butir berwarna biru kehitaman di dalam sitoplasma bakteria yang berwarna hijau: Kehadiran granul metakromatik. Dalam keadaan ini. Liputi apusan dengan pewarna Albert selama 5 minit. Jika spesimen klinikal digunakan. Buat apusan pada slaid mikroskop. Tatacara Pewarnaan Albert BAHAN 1. 4. Liputi pula apusan dengan iodin Gram selama 1 minit. Tetapi jika metilena biru digunakan. Cuci dengan air. Kadangkala sel mikobakteria tidak terwarna sama rata dan kelihatan berjalur merah berselang-seli dengan bahagian tanpa warna atau kelihatan berbutir. Spora bakteria hanya dapat diwarnakan jika mordan atau haba digunakan. daya kelarutan fenol di dalam air dan kehadiran elektrolit di dalam larutan pewarna. 3. Elakkan daripada memanaskan slaid dan pewarna dengan memegang slaid dengan forseps dan memasukkannya langsung ke dalam api penunu Bunsen. 4. 5. 3. Volutin ini terdiri daripada polimetafosfat yang mempunyai berat molekul tinggi dan dihubungkaitkan dengan bakteria genus Corynebacterium. Sitoplasma bakteria yang berwarna hijau tanpa butir-butir berwarna biru kehitaman di dalamnya: Tiada granul metakromatik. komponen ini akan kelihatan berwarna biru kehitaman dan bukan biru. Pewarnaan Schaeffer-Fulton (Pewarnaan Spora) Bakteria Genus Bacillus dan Clostridium dicirikan dengan kehadiran struktur bulat atau bujur yang dinamakan spora (atau endospora). volutin ini mengubahkan spektrum serapan (absorption) toluidina biru supaya pada mata kasar pewarna ini kelihatan telah berubah warnanya dari biru kepada biru kehitaman. keadaan ini sebenarnya bukanlah merupakan fenomena metakromasi sungguhpun di dalam bidang bakteriologi ia dinyatakan demikian. sedangkan pada sel 26 . Semasa pendinginan/pencucian pewarna terperangkap di dalamnya. dibalut dengan kain yang dicelup di dalam alkohol dan kemudian dinyalakan. Tapak atau kedudukan spora di dalam sel serta saiz spora berbanding dengan sel yang mengandunginya mempunyai kepentingan taksonomi. Ini adalah suatu artifak yang disebabkan oleh beberapa faktor seperti kemurnian pewarna karbol fuksin. 2. keringkan dan fiksasikannya. Walau bagaimanapun. Apusan kultur bakteria Pewarna Albert Iodin Gram Kertas turas TATACARA 1. pendedahan metilena biru kepada udara menyebabkan sebahagian kecil daripada pewarna ini dioksidasi menjadi metilena ungu pada pH tinggi dan metilena ungu secara selektif mewarnakan volutin tersebut. Keadaan ini disebabkan oleh fenomena metakromasi yang melibatkan perubahan di dalam warna sesuatu bahan.

Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas turas. Cuci dengan air. Buat apusan pada slaid mikroskop. 2. tetapi granulgranul halus dakwat India hanya menghasilkan latar belakang yang gelap dalam bidang penglihatan. Oleh kerana sebahagian daripada sel telah mengalami lisis. Butir berwarna hijau adalah spora bakteria. 27 . Disebabkan ketumpatan kapsul lebih rendah daripada sel. di dalam apusan akan kelihatan spora yang bebas. Teknik ini sebenarnya tidak mewarnai sebarang struktur pada mikroorganisma. Biarkan selama 1 hingga 3 minit. Walau bagaimanapun. Apusan kultur bakteria Malakit hijau 5% Safranin Batang kaca yang dibalut kain kasa pada salah satu penghujungnya Kertas turas Alkohol TATACARA 1. keringkan dan fiksasikannya. Panaskan sehingga wap keluar beberapa kali tetapi jangan sampai mendidih (tambah pewarna jika akan mengalami kekeringan). Pewarna balas memberikan warna yang kontras supaya spora dapat dikesan dengan mudah. Liputi pula apusan dengan safranin selama 30 saat. 6. 4. 2.vegetatif. iaitu suatu struktur yang menyelubungi keseluruhan sel bakteria dan sukar untuk diwarnai. 3. 2. 4. Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India (Pewarnaan Kapsul) Pewarnaan negatif dengan dakwat India membolehkan bakteria diamati dalam keadaan masih utuh dan tanpa perubahan rupa bentuk yang disebabkan oleh agen kimia (contoh: pewarna) dan agen fisikal (contoh: haba) serta membolehkan morfologinya ditentukan dengan cepat. 5. 6. Jika apusan bakteria tidak dipanaskan secukupnya. Tatacara Pewarnaan Schaeffer-Fulton (Pewarnaan Spora) BAHAN 1. ia tercuci bersih. Liputi apusan dengan malakit hijau 5%. Pewarna malakit hijau nampaknya merupakan pewarna terbaik untuk pewarnaan spora bakteria. manakala bahagian sel vegetatif bakteria berwarna merah. 7. maka ia kelihatan lebih terang (di sekeliling sel). 5. NOTA 1. 3. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Butir-butir berwarna hijau di dalam sel bakteria yang berwarna merah ATAU butir-butir berwarna hijau bertaburan di luar sel bakteria. spora akan kelihatan tanpa warna atau berwarna pudar. tatacara ini jarang digunakan kecuali untuk mengamati kapsul.

5.5 Kepingan kertas turas gred Whatman No. tatacara pewarnaan flagela yang hasilnya kemudian diamati dengan mikroskop cahaya adalah sukar dilakukan. 4. 3. Sebagai pilihan lain. 9. Tatacara Pewarnaan Negatif Flagela dengan Asid Fosfotungstik BAHAN 1.85% (steril) Penutup slaid Slaid mikroskop Dakwat India (PelicanTM atau PilotTM) TATACARA 1. 7. 4. Kultur bakteria Larutan salin 0. ia mempunyai nilai diagnostik. 10. Kurangkan cahaya mikroskop dengan menurunkan kondensernya dan amati kultur dengan objektif 40X (untuk fungus) atau objektif minyak rendaman (untuk bakteria). ia melibatkan penggunaan logam berat yang akan menyumbang kepada pencemaran alam sekitar. NOTA 1. Letakkan setitis kecil kultur cecair ke atas slaid mikroskop atau buatkan suspensi organisma dari sedikit pertumbuhan kultur muda mikroorganisma pada media padat di dalam setitis salin dengan menggunakan dawai inokulasi. Tambahan pula. Dalam hal ini. pH 6. Pewarnaan Negatif Flagela dengan Asid Fosfotungstik Pengamatan flagela bakteria dapat dilihat dengan mikroskop cahaya selepas berlakunya pewarnaan seperti pewarnaan tatacara Gray. 3. bengkok No. 1 Larutan salin 0.85% (steril) Tabung yang steril Gelung dawai Penunu Bunsen Alat penyimpan grid atau piring Petri yang dialas dengan kertas turas 28 . 3. 2. Klebsiella pneumoniae dan fungus Cryptococcus neoformans. Tutup campuran dengan penutup slaid. Campurkan dengan baik satu gelung kecil dakwat India ke dalam suspensi mikroorganisma yang telah disediakan. struktur flagela serta tapaknya lebih mudah dipastikan dengan mikroskop elektron melalui pewarnaan negatif dengan asid fosfotungstik. 2. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Kapsul kelihatan sebagai suatu lapisan cincin lutcahaya atau bersinar melingkari keseluruhan sel di atas latar belakang yang gelap. 4. 2. 2. Ia merupakan tatacara yang paling mudah untuk mengesan kehadiran kapsul dan sering digunakan ke atas spesies bakteria seperti Streptococcus pneumoniae. 6.7 Grid mikroskop elektron yang disaluti filem Formvar Asid fosfotungstik 1.Tatacara Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India (Pewarnaan Kapsul) BAHAN 1.5%. Intensiti cahaya perlu dikurangkan untuk memberikan kontras yang lebih baik. Namun demikian. 8. Jika terlalu banyak dakwat digunakan bakteria mungkin tidak dapat dilihat kerana transmisi cahaya terhalang. 5. 3. Kultur bakteria Forseps jenis tukang jam tangan.

2. 6.4. Tatacara Pengamatan Grid yang Disaluti Spesimen Bakteria Selepas Pewarnaan Negatif Tatacaranya adalah seperti pengamatan partikel virus (lihat muka surat 41-42). Biarkan 1 minit sebelum cairan diserap oleh kepingan kertas turas. 3. 3. PENGKELASAN BENTUK DAN SUSUNAN SEL VEGETATIF BAKTERIA Bentuk Kokus Basilus Vibrio Spirilla Spiroket Berfilamen Susunan Bakteria yang membiak secara aktif mempunyai kecenderungan untuk mengekalkan susunan selnya yang menjadi ciri bakteria tersebut. Pindahkan 1 titis larutan asid fosfotungstik ke atas grid berkenaan dan biarkan 1 minit. kuasa pembesaran yang digunakan adalah di antara 5000 – 10 000 kali ganda sahaja. Berbagai-bagai susunan sel bakteria dikenali dan telah ditentukan berdasarkan perbezaan dari segi pertumbuhan serta strukturnya. Sterilkan gelung dawai dan pindahkan 1 koloni bakteria ke dalam tabung. Simpan grid di atas alat penyimpan grid atau di dalam piring Petri yang dialas dengan kertas turas. 4. oleh kerana saiz bakteria lebih besar daripada virus.TATACARA 1. 5. Serapkan larutan asid fosfotungstik dengan menyentuhkan pinggir grid dengan kepingan kertas turas. 7.1. Susunan sel-sel basilus: Sel tunggal Berpasangan Berantai Palisad Tak teratur 29 . Ini merupakan suatu kriteria yang berfaedah dalam pengenalpastian bakteria. Pindahkan 1 titis suspensi bakteria ke atas grid pada permukaan yang disaluti Formvar. Walau bagaimanapun. Pindahkan 1 ml salin ke dalam tabung.

PENGAMATAN FUNGUS DI DALAM SUSPENSI CAIRAN Pelekapan basah fungus di dalam salin dilakukan dalam pengamatan secara langsung fungus. 2. PENGAMATAN FUNGUS Seperti juga bakteria. Pengamatan ke atasnya boleh dilakukan dalam bentuk pelekapan basah atau terhadap apusan fungus yang telah diwarnai. PERHATIAN 1. dan jika perlu. pengamatan fungus boleh dilakukan sama ada melalui pemeriksaan secara langsung ke atas spesimen yang diambil. Amati dengan objektif 10X (jumlah kuasa 100X) dan kemudian 40X (jumlah kuasa 400X). berkilat atau hijau pudar. 4.85% Kaca penutup slaid TATACARA 1.1. ataupun ke atas kultur dari sesuatu spesimen klinikal. 2. keutuhan sel dan organisma tersebut dapat dikekalkan. 3. Beberapa pewarnaan yang digunakan dalam bidang bakteriologi juga digunakan dalam bidang mikologi sungguhpun prosedurnya disesuaikan untuk fungus. di mana pelekapan basahnya hanya terhad kepada ujian motiliti. 3.2. Di dalam salin. pelekapan basah fungus berperanan penting dalam pengenalpastian fungus serta diagnosis penyakit yang disebabkan olehnya. Letakkan 1 titis salin ke atas slaid mikroskop. Tatacara Pelekapan Basah Salin BAHAN 1. Tambahkan 1 titis spesimen. 3. Spesimen yang disyaki mengandungi fungus Larutan salin 0. Berbeza dengan bakteria. Tutup dengan kaca penutup slaid. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Fungus akan kelihatan refraktil.2. Perbezaan di antara yis dengan gelembung udara dan sel darah merah: Sel yis mengandungi badan inklusi.Susunan sel-sel kokus: Kokus tunggal Diplokokus Tetrad (berempat) Berantai Berkelompok 3. perhitungan jumlah sel epitelium dan sel darah putih dapat dilakukan. 30 .

2. Tekan kaca penutup slaid. Pelekapan Basah Kalium Hidroksida (KOH) Spesimen kikisan kulit dan rambut diamati secara langsung untuk pengesanan fungus dalam pelekapan basah yang terdiri daripada larutan penjernih. Panaskan dengan api pilot penunu Bunsen sehingga pelekapan basah ini menjadi jernih tanpa pendidihan (5-20 minit). Perbezaan hifa dengan kristal panjang: Penghujung kristal tidak bersambung atau terputus-putus. yang mengandungi keratin. rambut dan kuku. 3. Gliserin yang ditambah mengakibatkan pelekapan menjadi lambat kering dan menghalang presipitasi KOH. 4. Tatacara Pelekapan Basah Kalium Hidroksida (KOH) BAHAN 1. Jenis larutan kalium hidroksida penjernih termasuklah natrium lauryl 5% di dalam air suling. Pelekapan ini tidak dipanaskan dan diamati dalam masa 20 minit. 2. KOH (20%) melarutkan keratin dan memudahkan pengamatan ke atas hifa fungus. adalah legap dan latar belakang ini boleh menyelubungi fungus. Mosaik fungus (artifak): Jaringan jisim yang mempunyai bentuk yang berbeza-beza dan tidak teratur. Amati dengan objektif 10X dan kemudian 40X (jumlah kuasa. Perbezaan di antara hifa dengan benang kapas: Pinggiran atau lebar (kaliber) benang kapas tidak teratur dan serat benang sering berpilin atau kelihatan melingkari sesuatu paksi dan penghujungnya berumbai. 4. Proses penjernihan dapat dipercepatkan melalui pemanasan. 3. Masukkan spesimen ke dalam titisan KOH. natrium sulfida 10% di dalam alkohol 20% dan larutan kalium hidroksida (KOH) atau natrium hidroksida (NaOH). 4. 2. PERHATIAN Pelekapan KOH juga boleh digunakan untuk spesimen kahak (sputum) atau spesimen daripada vagina yang banyak mengandungi bahan mukoid. Penjernihan biasanya dilakukan dengan KOH mungkin kerana bahan kimia ini mudah didapati di dalam makmal. Kulit. 6. 3. masing-masing 100X dan 400X). Tutup spesimen dengan kaca penutup perlahan-lahan. Untuk kuku dan kikisan kulit yang keras. tatacara ini dapat diubahsuai dengan penambahan dimetil sulfoksida (DMSO) 40%. dengan kondenser mikroskop diturunkan untuk memberikan kontras yang secukupnya. bentuk kristal berbeza-beza dan larut air. 31 . NOTA Intensiti cahaya dikurangkan. Spesimen 10-20% Kaca penutup slaid Penunu Bunsen KOH TATACARA 1. Letakkan 1 titis larutan KOH di tengah slaid mikroskop. 5. Masalah ini boleh diatasi dengan menggunakan beberapa persediaan yang boleh menghancurkan serta melarutkan keratin supaya latar belakang menjadi jernih. biasanya terletak di penghujung atau perbatasan sel.

Penutup slaid ditekan untuk memperoleh sediaan yang tipis dan untuk mengeluarkan KOH yang berlebihan. fungus lebih mudah dapat diamati jika dibiarkan 1 hingga 2 jam. Dalam hal ini. gliserol mengelak pelekapan basah menjadi kering dan pewarna cotton blue diserap oleh struktur kitin fungus dan mewarnainya. Asid laktik mengekalkan struktur fungus serta menjernihkan latar belakang. Amati dengan objektif pembesaran 10X dan 40X. Titiskan 1 titis kecil LCB di tengah-tengah slaid mikroskop. 2. 4. 32 . 6. 4. 5. jangan tersalah anggapan bahawa bahagian tepi sel (dinding sel) adalah hifa. Dalam pengamatan ke atas fungus. 3. NOTA 1. maka memudahkan fungus diamati. 3. 2.PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Hifa adalah dalam bentuk filamen kurus dengan bahagian tepinya sejajar dan disusun secara rawak berbanding dengan sel. fenol membunuh fungus. 7. Pelekapan Basah Lactophenol Cotton Blue (LCB) Pelekapan basah yang juga mengandungi sejenis pewarna akan memudahkan pengamatan fungus. Ambil sebahagian kecil bahan fungus dari kultur dengan menggunakan jarum atau dawai bengkok di atas. persediaan lactophenol cotton blue digunakan untuk membuat pelekapan basah fungus sama ada dari spesimen ataupun dari kultur untuk pengamatan mikroskop. 5. Pelekapan yang tidak jernih mungkin mengandungi artifak yang mirip dengan struktur fungus. 2. Persediaan menjadi lebih jernih dan oleh yang demikian. Jangan panaskan pelekapan KOH terlalu lama atau dengan suhu yang terlalu tinggi kerana akan terbentuk hablur KOH. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Miselium (dinding dan septum sel) serta struktur spora (fruiting structures) kelihatan biru tua di atas latar belakang yang berwarna pudar (muda). Intensiti cahaya dikurangkan untuk memberikan kontras yang secukupnya. Masukkan spesimen ke dalam titisan LCB. Bakar jarum atau dawai apabila sudah selesai. 5. 4. Leraikan bahan fungus ini dengan menggunakan 2 dawai. 6. 3. Tutup spesimen dengan kaca penutup dengan perlahan tanpa menekan spesimen. Spesimen fungus Slaid mikroskop Kaca penutup slaid Jarum atau dawai dengan penghujungnya dibengkokkan Lactophenol cotton blue (LCB) TATACARA 1. Tatacara Pelekapan Basah Lactophenol Cotton Blue (LCB) BAHAN 1.

2. Aktinomiset adalah golongan bakteria yang hampir menyerupai fungus dan secara tradisional dirangkumkan ke dalam bidang mikologi. kultur yang diuji) Karbol fuksin Kinyoun Etanol 50% Asid sulfurik 1% Metilena biru 2. Oleh yang demikian. suatu pengubahsuaian pewarnaan tahan asid perlu dilakukan khususnya untuk Nocardia. negatif.5% di dalam etanol 95% Kertas turas Penunu Bunsen TATACARA 1. Fiksasi apusan dengan haba. Hilangkan pewarna dengan asid sulfurik 1% sehingga tiada lagi pewarna yang keluar. 5. 4. 8. Pada kultur fungus. 7. Kultur fungus (kontrol kultur positif. 3. Kapsul Cryptococcus neoformans lazimnya menghalang sel yis ini daripada diwarnai dengan sempurna dan seringkali mengakibatkan ia kelihatan seperti bahan lemak Gram-negatif berwarna merah jambu pucat (lavender) dengan badan inklusi yang bergranul berwarna ungu (Gram-positif). 7. 3.2. kontrol kultur positif dan negatif dan biarkan kering di udara. Banjiri dengan etanol 50% sehingga tiada lagi pewarna yang keluar (biasanya sejurus selepas alkohol ditambah). Pewarnaan Tahan Asid Diubahsuai Kinyoun Tatacara ini tidak menggunakan haba untuk memudahkan pewarna memasuki sel. ambillah spesimen daripada bahagian koloni yang terletak di antara tepi dan tengahnya: bahagian tepi dan tengah koloni biasanya terdiri daripada struktur yang sama ada terlalu muda atau terlalu tua dari segi pembentukan spora dan berkemungkinan akan memberikan hasil pengamatan yang kurang memuaskan. PEWARNAAN FUNGUS 3.2. 5. Cuci dengan air. Cuci dengan air yang mengalir. muka surat 23-24). Pewarna tahan asid yang digunakan untuk mikobakteria mungkin menyahwarnakan pewarna secara berlebihan ke atas spesies ini dan memberikan hasil yang negatif palsu. 2. 6. Cuci dengan air. 2. Struktur fungus lebih mudah dilihat jika pelekapan ini dibiarkan selama kira-kira 10 minit.NOTA 1. Nocardia adalah aktinomiset yang bersifat separuh tahan asid. 33 . Buatkan 3 apusan tipis. 4. Tatacara Pewarnaan Tahan Asid Diubahsuai Kinyoun BAHAN 1. Pewarnaan Gram Semua fungus adalah Gram-positif. Sebaliknya fungsi haba diambil alih oleh sejenis detergen (Tergitol) yang bertindak di atas permukaan sel. Masing-masing daripada kultur yang diuji. Banjiri slaid dengan karbol fuksin Kinyoun dan biarkan selama 5 minit. Tatacara Pewarnaan Gram Tatacara tersebut adalah seperti yang dilakukan untuk bakteria (lihat pewarnaan Gram. 6.

Aktinomiset tidak diwarnakan dengan baik atau langsung tidak diwarnakan dengan tatacara ini. Bilas seketika dengan air suling. 5. nukleus kelihatan biru dan latar belakang adalah hijau. asid periodik mengoksidasi gugusan 1. 6. 34 . PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Fungus (dan juga komponen tisu) yang mempunyai polisakarida di dalam strukturnya kelihatan merah ungu. Grup aldehid yang reaktif ini bergabung dengan reagen Schiff-leuko-fuksin untuk menghasilkan warna fuksin merah ungu. 7. 4. ia tidak boleh digunakan lagi jika tiada warna yang muncul atau warnanya ungubiru. Titiskan reagen Schiff selama 20 minit. Pewarnaan Metenamin-Argentum Gomori Pewarnaan metenamin-argentum Gomori dianggap sebagai pewarnaan yang amat berguna dalam penyaringan spesimen klinikal bagi fungus. Pewarnaan ini amat berguna untuk mengesan fungus pada keratan tisu serta apusan seperti kikisan kulit. Fiksasikan apusan dengan metanol mutlak selama 5 – 15 minit. 3.9. Apusan spesimen pada slaid mikroskop Metanol mutlak Asid periodik 1% Reagen Schiff Metil hijau 2% Air suling TATACARA 1. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Nocardia kelihatan merah manakala bakteria lain dan fungus kelihatan biru. Cuci dengan air dan keringkan. Pewarnaan ini memberi kontras yang lebih ketara dan biasanya mewarnakan elemen fungus yang tidak ditunjukkan oleh pewarnaan lain. Sebaliknya.2-glikol daripada polisakarid fungus ke gugusan aldehid. 2. 2. Balas warna dengan metil hijau selama 5 – 10 minit. Pewarnaan Asid Periodik-Schiff Dalam pewarnaan asid periodik-Schiff (periodic acid-Schiff – PAS). Tatacara Pewarnaan Asid Periodik-Schiff BAHAN 1. Reagen ini masih boleh digunakan jika ia cepat berubah menjadi ungu-merah. Cuci dengan air paip selama 10 minit sehingga warna merah jambu muncul. Keberkesanan tindakan pewarna Schiff boleh diuji dengan menitiskannya ke dalam formalin 40%. Askus yis kelihatan merah manakala blastokonidia berwarna biru. 5. Cuci dengan air suling selama 15 minit dan keringkan. 4. 3. Titiskan larutan asid periodik selama 10 minit. NOTA 1. 6. Liputi dengan larutan metilena biru selama 1 minit. 10. 2.

35 . Bilas 6 kali dengan air suling apabila kontrol menunjukkan pewarnaan yang optimum telah dicapai. Cryptococcus neoformans diwarnai merah muda gelap atau merah. Letakkan slaid di dalam bekas yang mengandungi larutan metenamin-argentum nitrat dan eramkan bekas berkenaan di dalam ketuhar pada suhu 58-60°C.1% Natrium thiosulfat 2% Larutan light green 0. Oleh yang demikian semua yang diwarnakan kelabu tua tidak semestinya fungus. 11. Gunakan forseps yang diselaputi dengan parafin untuk mengeluarkan slaid dari larutan metenamin-argentum nitrat dan celupkannya ke dalam air suling. Cuci dengan air paip selama 15 saat. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Dinding sel fungus (serta fiber retikulum dan fiber elastik tisu) terwarna hitam. 12. 2. 7. Hilangkan argentum yang tidak tereduksi dengan natrium thiosulfat selama 2 hingga 5 minit. 9. Sesetengah bakteria (termasuk Nocardia spp) serta sesetengah komponen tisu juga diwarnakan. 6. Bilas dengan natrium bisulfit selama 1 minit. 13.Tatacara Metenamin-Argentum Gomori BAHAN 1. 8.04% Alkohol mutlak. Cuci dengan air. Cuci dengan air paip selama 5 – 10 minit. Cuci 3 kali dengan air suling. 15. 4. 6. 10. Keringkan dengan 2 pertukaran masing-masing alkohol 70%. 95% dan mutlak. Jernihkan spesimen dengan 2 hingga 3 kali pertukaran xilena. 17. 4. Bilas dengan air suling. 14. manakala bahagian di dalam miselium dan hifa diwarnakan kelabu tua dan latar belakang adalah hijau muda. 12. 2. Balas warna dengan pewarna light green selama 30-45 saat. 7. 3. 11. Komponen tisu sebagai latar belakang diwarnai kuning dengan nukleus berwarna hitam.1% selama 2 hingga 5 minit. 2. Lekapkan dengan media pelekap PermountTM. Letakkan slaid yang mengandungi apusan di dalam larutan asid kromik selama 1 jam. alkohol 95%. Presipitasi putih yang muncul berikutan penyimpanan boleh dihilangkan dengan menggoncangnya. Apusan spesimen pada slaid mikroskop Ketuhar Asid kromik 5% Natrium bisulfit 1% Larutan metenamin-argentum nitrat (pewarna Gomori) Aurum (emas) klorid 0. 5. 8. 9. Larutan stok metenamin-argentum nitrat adalah stabil jika disimpan di dalam peti beku. 10. Periksa apusan dengan mikroskop untuk menentukan sama ada fungus telah terwarna perang tua atau memerlukan pengeraman yang lebih lama. alkohol 70% Xilena Forseps yang disaluti parafin PermountTM TATACARA 1. 5. NOTA 1. 16. 3. Liputi apusan dengan larutan emas klorid 0.

2. Bercabang Tak bercabang Membengkak 36 . Morfologi mikroskopik Morfologi fungus bermiselium Hifa: Saiz: garis pusat yang berbeza Pigmentasi: tanpa warna atau berwarna Berseptum atau tak berseptum Bercabang atau tak bercabang Spora aseksual: Blastokonidia (blastospora) Klamidokonidia (klamidospora) Artrokonidia (artrospora) Bentuk spora yang dihasilkan secara langsung dari miselium vegetatif. Dengan spesimen jenis ini. 5. Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India Pewarnaan ini digunakan untuk menunjukkan kehadiran kapsul yis.3.3. 4. Nocardia serta fungus tua dan yang telah mati mungkin memerlukan masa pengeraman yang lebih lama (sehingga 90 minit) dengan larutan metenamin-argentum nitrat untuk diwarnai. Pastikan pewarnaan tidak menjadi telalu gelap hingga struktur morfologi halus tidak dapat diamati. Tatacara ini boleh juga digunakan untuk keratan tisu dari ketulan parafin. Spora asekual (konidia) yang dihasilkan daripada hifa khas yang disebut konidiofor. Tatacara Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India Tatacara tersebut adalah seperti yang dilakukan ke atas bakteria (Rujuk tatacara yang sama bagi bakteria) 3. khususnya bagi Cryptococcus neoformans di dalam mendapan cairan serebrospina dalam diagnosis kes meningitis. alkohol 95% dan air suling. keratan tisu terlebih dahulu dihilangkan parafinnya dengan 2 pertukaran rendaman di dalam xilena dan kemudian dihidrasikan melalui suatu urutan rendaman di dalam alkohol mutlak. BENTUK DAN STRUKTUR FUNGUS DALAM KULTUR 1.

Bulut/sfera Bujur (ovoid) Ala buah pear (piriform) Gada Bentuk: Tunggal Bertunas Multipel 37 .Bentuk konidiofor: Konidia Makrokonidia (konidia bersaiz besar pada fungus yang menghasilkan konidia yang besar dan kecil) Septum: Berseptum atau tanpa septum Bujur Raket Berbentuk gada (clavate) Bernodul Sabit Sigar Bengkok dan berkeadaan tidak sempurna (distorted) Bentuk: Berasingan Berkelompok Berantai Susunan dari konidiofor: Mikrokonidia (konidia bersaiz kecil pada fungus yang menghasilkan konidia yang besar dan kecil).

Pengamatan ke atasnya boleh dilakukan dengan teknik mikroskopi elektron langsung ataupun dalam bentuk teknik pengubahsuaian mikroskopi elektron imun – yang dapat meningkatkan kesensitifan dalam pengesanan virus melalui mikroskopi elektron tersebut. Formvar E larutan 0. Spesimen virus diletakkan di atas lapisan filem ini. Isikan bekas air dengan air suling sehingga penuh. 3. Penyalutan Grid dengan Lapisan Formvar Virus perlu diletak di atas filem sokongan sebelum partikel virus dapat “diwarnakan” dan diamati. 3. karbon murni. Komponen asas mikroskop elektron adalah sumber elektron. diwarnakan secara negatif dan kemudian diamati dengan mikroskop elektron.5% di dalam kloroform Grid kuprum 400 mesh. 38 . 7. aliran elektron yang digunakan sebagai sumber radiasi diarahkan ke atas spesimen. Dalam mikroskopi elektron. Dua elektromagnet mempunyai fungsi seperti kondenser mikroskop cahaya untuk memfokuskan aliran elektron ini ke atas spesimen tersebut. 4. Bahan-bahan yang berfungsi sebagai filem sokongan adalah plastik nitroselulos (contoh Parlodion TM). 6. 2. Dalam elektron mikroskop jenis transmisi. Mikroskop elektron transmisi mempunyai julat kuasa pembesaran di antara 1500 hingga 500000 kali dan had kuasa resolusi 0. dan kedua-dua jenis plastik tersebut yang distabilkan oleh karbon. dan satu siri kanta magnetik yang digunakan untuk membelok dan memfokuskan aliran elektron. 2. pengamatan terhadap virus boleh dilakukan secara langsung. 4. Slaid dicelupkan ke dalam larutan formvar selama 15 – 20 saat. spesimen diletakkan di atas satu lapisan tipis plastik atau karbon yang disebut filem sokongan.3. Filem sokongan ini diletakkan di atas grid kuprum berbentuk jaringan halus. plastik formal polivinil (Formvar TM). Slaid berkenaan kemudian dikeluarkan dan permukaan slaid dipegang secara tegak dengan paksi panjangnya agak disendengkan dan biarkan sehingga kering. Fokus yang halus boleh didapati dengan binokular berkuasa rendah. PENGAMATAN VIRUS DENGAN MIKROSKOP ELEKTRON Dalam pengamatan bakteria dan fungus dengan mikroskop cahaya.3. Potong filem di bahagian yang berhampiran dengan tepi slaid supaya terdapat filem berbentuk segi empat. 5. Seperti juga bakteria dan fungus. sama ada ke atas spesimen yang diambil ataupun ke atas kultur daripada sesuatu spesimen klinikal. Filem yang nipis serta lembut ini diletak ke atas suatu jaringan halus berbentuk bulat yang dinamakan grid. Tunggu sehingga semua gelembung udara bergerak ke permukaan air. Penaburan elektron oleh spesimen menghasilkan imej yang diperbesar di atas layar pendaflour. Tatacara Penyalutan Grid dengan Lapisan Formvar BAHAN 1.5 nm berbanding dengan kuasa pembesar mikroskop cahaya yang hanya berkisar di antara 30 sehingga 1500 kali dan had resolusi 200 nm. spesimen yang akan diamati diletakkan pada sebuah slaid kaca yang kemudian diletak di atas pentas mikroskop. garis pusatnya bergantung kepada jenis mikroskop elektron Slaid mikroskop Pisau cukur Mangkuk kaca ~ 10 cm isipadu Forseps Air suling TATACARA 1.

Letakkan sekeping kertas turas di atas filem dan apabila kertas ini tenggelam ia dikeluarkan dan filem dibiarkan sehingga menjadi kering. jumlah elektron yang sampai ke layar dari kawasan yang mempunyai lebih “pewarna” adalah lebih rendah dan menyebabkan kawasan ini kelihatan lebih gelap daripada kawasan lainnya. NOTA 1. pH 6. Tekan grid perlahan-lahan dengan forseps untuk mencapai sentuhan yang baik di antara filem dan grid. 3. Oleh yang demikian. 39 . Terdapat beberapa pewarna negatif seperti natrium fosfotungstat.5%. Tetapi natrium fosfotungstat merupakan pewarna negatif yang utama. Penyalutan Virus Ke atas Grid dan Pewarnaan Negatif: Teknik Mikroskop Elektron Secara Langsung Spesimen diletakkan di atas filem sokongan melalui kaedah pemindahan titisan tunggal sebelum pewarnaan dilakukan. Slaid yang dicuci dengan teliti (dengan asid alkohol) akan melekatkan filem dengan kuat sehingga membuatkannya sukar untuk ditanggalkan daripada slaid. proses yang berikutnya. 6. natrium tungstat dan garam uranium seperti uranil asetat. seperti pewarnaan virus. 5. Letakkan setitis (~ 20 µl) suspensi virus. Tatacara Pewarnaan Negatif dengan Asid Fosfotungstik BAHAN 1. Dengan forseps halus keluar dan sentuhkan tepi grid dengan sekeping kertas turas supaya dapat menghilangkan cairan yang berlebihan. Pewarnaan negatif melibatkan penanaman (embedding) bahan kecil yang berpartikel. Proses perlekatan bahan protein ke atas filem memerlukan beberapa saat sahaja dan selepas itu. Keadaan ini wujud kerana kawasan yang mempunyai lebih “pewarna” seperti kawasan di sekeliling virus dan celah-celah permukaan virus akan menaburkan lebih elektron berbanding dengan kawasan yang kurang “pewarna”. 3. Sampel virus Forseps halus jenis tukang jam yang bengkok No. seperti virus. Masukkan slaid ke dalam air pada sudut 30 darjah supaya filem terapung bebas pada permukaan air.5 TATACARA 1. Apungkan 1 grid dengan permukaan filem sokongannya bersentuhan dengan titis suspensi virus selama 3 minit. ia tidak akan tanggal lagi kecuali jika dilarutkan atau dihadamkan. Pegang slaid berdekatan dengan mulut dan keluarkan nafas dengan kuat supaya permukaan filem diliputi dengan wap yang terkondensasi dari mulut. 7. 4. Pastikan air yang digunakan bersih. Letakkan grid dalam 2 barisan di atas filem yang terapung-apung di atas air tersebut. 9. 2. 2. ke dalam suatu lapisan bahan berketumpatan tinggi supaya spesimen dapat diamati sebagai objek yang cerah di atas latar belakang gelap. Gunakan slaid mikroskop baru yang sengaja dilap dengan kertas pengering tangan.7 Grid mikroskop elektron yang disaluti filem Formvar Kepingan kertas turas gred Whatman No. 1 Kertas lilin Asid fosfotungstik 1. dapat dilakukan tanpa kehilangan virus. air suling dan pewarna dalam 1 barisan di atas sekeping kertas gris. 2. 8. 6. Oleh yang demikian.5.

4. 5. 3. 4. Apungkan grid dengan permukaan yang didedahkan kepada virus di atas titisan air suling selama 30 saat. 5. Apungkan grid dengan permukaan yang didedahkan kepada virus ke atas titis pewarna selama 30 saat. Teknik Mikroskopi Elektron Imun Kesensitifan mikroskopi elektron ( ME) boleh dipertingkatkan iaitu dengan menggunakan antibodi yang spesifik untuk mengelompokkan partikel-partikel virus. Keluar serta hilangkan cairan yang berlebihan. 8. Kertas turas yang dikoyak adalah lebih berkesan daripada yang digunting. Eramkan campuran virus/antiserum di dalam bekas ini selama satu jam pada 37°C. Cecair yang berlebihan disingkirkan dengan menyentuhkan bahagian tepi grid sambil dipegang dengan penghujung forseps. Permukaan grid yang disaluti dengan filem yang digunakan untuk melekatkan virus adalah permukaan di sebelah atas kertas turas. 40 . pH 6. 1 Kertas lilin Antiserum yang spesifik terhadap virus berkenaan Larutan salin ditampan fosfat TATACARA 1. 5. Cara ini juga digunakan untuk menentukan identiti virus yang tidak mempunyai morfologi permukaan yang khusus. Campurkan 15 µl virus dengan 15 µl tiap larutan antiserum ke atas sekeping kertas lilin. Tatacara Mikroskopi Elektron Imun BAHAN 1. Ia diagihagihkan dalam jumlah kecil ke dalam botol dan disimpan beku kecuali satu botol untuk kegunaan semasa yang seharusnya disimpan di dalam peti beku. 6.4. NOTA Letakkan grid tersebut di atas kertas gris dan biarkan sehingga kering. Sampel virus Forseps halus jenis tukang jam tangan Grid mikroskop elektron yang disaluti filem Formvar Asid fosfotungstik 1. Letakkan kertas lilin dengan campuran virus/antiserum di dalam piring Petri yang dialas dengan kertas turas lembap. 2. 3. 8. Asid fosfotungstik seharusnya disediakan dengan menggunakan air suling steril. elakkan daripada berlakunya pencemaran silang dengan menggunakan forseps yang berbeza atau mencelupkan forseps yang telah digunakan di dalam air mendidih setiap kali sebelum digunakan semula. 6. 2. 1. 9.5 Kepingan kertas turas gred Whatman No. 7. 2. 7. Letakkan campuran ke atas grid dan warnakan mengikut bahagian “tatacara menyaluti grid dengan virus & tatacara pewarnaan negatif dengan asid fosfotungstik” di muka surat 39-40. 4. Buang sediaan ini apabila didapati berubah kepada warna kebiruan. Bagi spesimen multipel. Larutkan antiserum dalam larutan salin ditampan fosfat (nisbah antiserum: larutan salin yang digunakan bergantung kepada sediaan antiserum). Pegang grid dengan kemas dengan menggunakan forseps kerana grid-grid ini amat ringan dan mudah terlepas daripada forseps akibat tarikan tegangan permukaan titisan cecair. 5.5%. Keluar dan hilangkan cairan yang berlebihan. Pindahkan grid ke sekeping kertas turas yang terletak di dalam sebuah piring Petri. 3.

tidak semestinya IgG atau IgM yang murni digunakan. Kurangkan kuasa pembesaran kepada 80 kali dan pilih satu kawasan (segi empat sama) untuk diamati. iaitu sebagai isyarat bahawa ruang hampas udara telah pun dicapai di dalam ruang spesimen.000 kali ganda dan dalam masa yang sama pusatkan semula pancaran elektron serta tingkatkan intensitinya. Serum haruslah didedahkan kepada suhu tinggi (56°C) sebelum digunakan untuk menghapuskan komplemen yang boleh melisiskan sampul (envelop) virus. janganlah memilih segi empat yang kelihatan terlalu “bersih” kerana ia tidak dapat memberikan kontras yang baik di antara virus dengan latar belakangnya. Grid yang diliputi dengan spesimen yang diwarnakan Mikroskop elektron jenis transmisi TATACARA 1. Putarkan batang pemegang ke arah lawan pusingan jam. Dalam tatacara ini. Apa yang akan dibentangkan dalam bahagian ini adalah cara untuk memasukkan spesimen ke dalam mikroskop dan beberapa petua untuk mengamati virus. 3. Campuran virus dan antiserum daripada satu siri pencairan dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi antibodi yang optimum untuk menghasilkan pengelompokan virus. Oleh yang demikian. Untuk mengamati sesuatu objek dengan lebih teliti dan mendalam. 41 . gunakan binokular. 1. 2. adalah amat penting sekali. Serum biasa pun sudah mencukupi. Juga. 8. 3. Suspensi virus murni boleh menyebabkan partikel virus dikelompokkan secara spontan. 2. supaya spesimen mencapai tempat yang ditetapkan. partikel virus akan disaluti dengan suatu lapisan protein yang tebal dan ini akan menyukarkan pengamatan ke atas struktur virus serta menyebabkan perubahan bentuk vitus berkenaan. Putarkan tombol fokus sehingga memperolehi imej yang paling jelas. Skan secara teratur kawasan di dalam segi empat tepat yang dipilih supaya seluruh kawasan diamati. 6. 4. 4. Naikkan kuasa pembesaran kepada 60. Dalam memilih segi empat tepat untuk diamati. 7. Pengamatan Spesimen Virus Terletak di atas Grid Mikroskop Elektron Persediaan penggunaan mikroskop memerlukan seseorang yang terlatih di dalam bidang ini. Amati layar melalui tingkap pengamatan. Tatacara Pengamatan Spesimen Virus dengan Mikroskop Elektron BAHAN 1. jika teknik ini dilakukan dengan menggunakan spesimen tanpa campuran antibodi sebagai kontrol. jika diketahui. akan banyak membantu dalam proses pencarian virus berkenaan. NOTA Letakkan spesimen dengan menggunakan forseps di dalam ruang khas pemegang spesimen (berhati-hati supaya tidak tersentuh bahagian pemegang spesimen yang akan diletakkan di dalam ruang hampas udara). 2. janganlah mendapatkan kawasan yang gelap kerana virus akan terlindung/tersembunyi dan susah untuk diamati. Saiz serta bentuk virus. 5. Letakkan batang pemegang spesimen ke dalam tapak yang ditetapkan dan tunggu sehingga lampu merah padam. 2. Dalam keadaan antibodi yang berlebihan. dalam hal ini.NOTA 1.

075 g cotton blue. Larutkan pewarna cotton blue dengan meletakkan bekas di dalam penganggas air.3 g metilena biru di dalam 30 ml etanol dan tambahkan 100 ml air suling. 7. Campurkan 1 ml asid asetik dan tambahkan 100 ml air suling.3%) Larutkan 0. 4. SF yellowish di dalam 100 ml air suling dan tambah 0. 8. Iodin Gram Larutkan 1 g kalium iodid di dalam 70 ml air suling. Aseton-alkohol Campurkan aseton dan etil alkohol 95% dalam nisbah isipadu yang sama. Malakit hijau (5. REAGEN PEWARNAAN: RUMUSAN DAN PERSEDIAAN 1. Campurkan kedua-dua sediaan ini. Saring larutan ini dengan kertas turas. Karbol fuksin Kinyoun Larutkan 2 g fuksin bes di dalam 10 ml etanol 95%. Tambahkan 0.4. 3.5 g iodin dan tambah air sehingga mencapai 100 ml. Larutan pewarna Larutkan 0. Lactophenol cotton blue Campurkan 20 ml asid laktik dengan 40 ml gliserol dan 40 ml air suling.15 g toluidina biru dan 0. atas serta kiri dan kanan grid sebelum spesimen tersebut dapat dianggap sebagai tidak mengandungi virus (iaitu pada tahap kesensitifan mikroskop elektron dalam mengesan virus). Oleh kerana terdapat kemungkinan bahawa taburan virus di atas filem grid tidak rata. Alkohol asid Campurkan 5 ml asid hidroklorik dengan 95 ml etanol 95%. 9. Kemudian tambahkan 0. larutan pewarna Albert Larutkan 0. 2. Lakukan di dalam almari asap.05%) Larutan 0.3. Asid sulfurik Campurkan 1 ml asid sulfurik pekat ke dalam 100 ml air suling. 5. 13. Kristal ungu Larutkan 1 g kristal ungu di dalam 100 ml air suling. 12. amatilah 5 segi empat tepat.2 ml asid asetik glacial. 10. Karbol fuksin (0.2 g malakit hijau di dalam 2 ml etanol 95%. Albert. 42 . Larutkan 8 g fenol di dalam 100 ml air suling.0%) Larutkan 5 g pewarna di dalam 100 ml air suling. 3. 6. Goncang sehingga keseluruhan iodin tersebut larut. Light green. Karbol fuksin Ziehl-Neelsen Larutkan 4 g fuksin bes di dalam 20 ml etanol 95%. Campurkan kedua-dua sediaan ini. iaitu yang berada di tengah. Larutkan 5 g fenol di dalam 100 ml air suling.2 g Light Green. Tambahkan 20 g kristal fenol dan larutkan dengan air panas di dalam penganggas air pada suhu 70°C. bawah. Campurkan 1 bahagian larutan stok ini dengan 5 bahagian air suling untuk digunakan dalam pewarnaan.05g fuksin bes di dalam 100 ml air suling. 11. Metilena biru (0.

16.5 g arang kayu yang teraktivasi dan goncang sekali-sekala dalam tempoh 1 jam. larutan stok Campurkan 50 ml larutan argentum nitrat 5% yang disediakan di dalam air suling dengan 100 ml metenamin (heksa-metilena-tetra-amin) 3% yang disediakan di dalam air suling. 43 . 17. Safranin (0. Metenamin-argentum nitrat.5 g safranin di dalam 100 ml air suling. 15. Tambahkan 0.14.5%) Larutkan 0. Saring dengan kertas turas dan simpan larutan reagen Schiff ini di dalam botol gelap di dalam peti beku. Kemudian kurangkan suhu kepada 50°C dan saringkan dengan kertas turas. Tambahkan 20 ml 1N HCl dan 1g kalium metabisulfit bentuk kontang. Reagan Schiff-leuko-fuksin Larutkan 1g fuksin bes di dalam 200 ml air suling yang mendidih. Biarkan di tempat gelap selama 2 hari. Metenamin-argentum nitrat. larutan pewarnaan Larutkan 2 ml boraks (borax) 5% di dalam 25 ml air dan kemudian campurkan larutan ini dengan 25 ml larutan stok metenamin-argentum nitrat.

vitamin tertentu. Infusi – Pepton – Ekstraks daging. Hasil daripada penghadaman enzim ke atas bahan organik. Media boleh dibahagikan kepada media sintetik (media yang diketahui kandungannya) dan media tiruan atau kompleks. Contoh: Agar nutrien. separuh pepejal dan cecair. 44 . otak atau hati).4. broth infusi (otak-jantung. misalnya bakteria ataupun virus. serum). mikrob merupakan salah satu komponen yang harus diperolehi bagi penghasilan sesuatu produk. misalnya vaksin. Kadangkala keadaan yang berbeza ini wujud walaupun di kalangan mikrob daripada golongan yang sama. protein atau sebarang nutrien yang memiliki ciri yang khas dan tepat. ujian motiliti dan menentukan ciri-ciri metabolik dan fisiologi bakteria. Dari segi penggunaan. pepton. Media pengaya (enrichment media) digunakan untuk pertumbuhan bakteria yang tidak tumbuh baik pada media dasar atau kerana pertumbuhannya pada media ini lebih baik dan cepat berbanding dengan bakteria yang lazimnya tumbuh dengan pesat dan seringkali mengatasi kecepatan pertumbuhannya dalam media dasar. melalui pengkulturan dapatlah diwujudkan satu sumber atau bekalan kultur agen berkenaan supaya kajian boleh dijalankan untuk menentukan ciri-cirinya. Dalam bidang perindustrian dan bioteknologi. garam dan air. 4. Jika mikrob ini merupakan suatu agen “baru” yang mungkin belum dikenali. PENGKULTURAN MIKROB Mikroorganisma dan virus dikulturkan untuk beberapa tujuan. Contoh. manakala media tiruan adalah media yang mengandungi bahan-bahan kompleks seperti ekstrak daging lembu. jantung. Pepton soya disediakan daripada tindakan enzim terhadap kacang soya. pepton P adalah penghadaman daging oleh pepsin. Media sintetik adalah media yang semua komponennya merupakan bahan kimia yang nyata dan spesifik daripada segi kandungannya. broth nutrien. Keadaan pengkulturan mikrob adalah berbeza-beza bergantung kepada jenis mikrob. Dalam mikrobiologi diagnostik. asid amino. yis atau darah di mana kandungannya kurang jelas atau tidak dapat dipastikan. media kultur dibahagikan kepada beberapa golongan: Media dasar (juga dipanggil media nutrien atau media basal) yang mengandungi infusi. Media diperkaya (enriched media) adalah media dasar yang dicampurkan dengan bahan yang boleh menggalakkan pertumbuhan seperti cecair tubuh (contohnya darah. ujian yang dijalankan ke atas kultur sesuatu mikrob tertentu dapat membantu mengenal pasti atau menentukan identiti mikrob berkenaan. JENIS MEDIA KULTUR Media kultur digunakan terutama untuk pertumbuhan bakteria (dan mikroorganisma lain) dan terdapat dalam bentuk pepejal.1. Di samping pertumbuhan.1. media juga digunakan untuk pemencilan. PENGKULTURAN BAKTERIA 4.1.

Penghasilan H2S akan menukar ferik ammonium sitrat kepada ferik sulfida dan pembentukan warna hitam pada koloni bakteria. triptos Kanji Sumber darah: kambing biri-biri. Contoh media diperkaya Nama media Agar darah Agar coklat Broth (atau agar) serum Agar darah triptos Agar Mueller-Hinton Bahan campuran khas Darah utuh Darah yang dipanaskan Serum Darah.0 adalah toksik terhadap bakteria koliform dan dengan demikian.1. Media ini juga meningkatkan peluang untuk memencilkan bakteria tertentu di dalam sesuatu kultur campuran. Fermentasi manitol menghasilkan koloni bakteria berwarna kuning. media pengaya boleh juga disifatkan sebagai media pemilih. Media pemilih (selective) adalah media dasar atau media diperkaya yang dicampurkan dengan bahan yang menghalang pertumbuhan majoriti jenis bakteria dan memberikan kelebihan kepada segolongan kecil bakteria lain yang diinginkan untuk tumbuh. Dari segi fungsi. arnab atau kuda. Contoh media yang mempunyai ciri pemilih dan pembeza Nama media Bahan pemilih Ciri MacConkey Potassium telurit Deoksikolat sitrat Hempedu Kalium telurit Natrium deoksikolat Fermentasi laktosa Reduksi telurit Fermentasi laktosa Kesan penghasilan H2S Fermentasi manitol – Ciri pembezaan Indikator Neutral red Kalium telurit Neutral red Ferik ammonium Sitrat Fenol merah Garam manitol Lowenstein-Jensen Natrium klorida Malakit hijau Fermentasi laktosa akan menyebabkan koloni menjadi merah atau merah jambu. dalam broth selenit F natrium selenit pada pH 7. ia memberi peluang kepada Salmonella dan/atau Shigella untuk membiak dengan lebih baik kerana kekurangan atau ketiadaan persaingan pertumbuhan spesies koliform lainnya. Reduksi telurit akan menghasilkan koloni berwarna hitam. 2. misalnya dalam bentuk perubahan warna koloni (fermentasi) ataupun perubahan kepada media itu sendiri (hemolisis). 45 . ia juga dianggap sebagai media pemilih. Media pembeza (differential) adalah media dasar atau media diperkaya yang mengandungi bahan kimia khusus yang akan bertindak ke atas sesetengah jenis bakteria melalui cara yang membolehkan bakteria berkenaan dikenali. Media pengaya (enrichment) digunakan untuk pemencilan (misalnya patogen usus) dengan merencat atau menekan pertumbuhan saprofit dan/atau flora normal tubuh. Pada hakikatnya. Sebagai contoh. kebanyakan media pembeza juga mempunyai reagen yang dapat menghalang pertumbuhan bakteria tertentu dan dalam hal ini.

besar kemungkinan bahan pelengkap (supplement) ini tidak akan bercampur dengan baik dan merata di dalam media. Pada agar yang tidak mengandungi bahan protein seperti darah. 4. Koloni-koloni bakteria yang seharusnya telah terasing. Pada umumnya. bakteria dikulturkan ke atas plat media agar melalui teknik plat garisan untuk mendapatkan koloni bakteria yang terpencil. segera hilangkan dengan mengarahkan/ melalukan api penunu Bunsen ke atas gelembung-gelembung tersebut sehingga semuanya terhapus/ tersingkir sebelum media menjadi beku. suhu tersebut mestilah diturunkan kepada 48°C sebelum darah dan bahan lain yang tidak tahan panas dicampurkan. Letakkan larutan media agar ke dalam penganggas air bersuhu 50°C. manakala pengkulturan pada cerun agar digunakan untuk ujian biokimia atau sebagai kultur simpanan. Tindakan menggoncang ini hanya akan menyebabkan pembentukan gelembung udara di dalam media dan mengakibatkan media plat yang tidak rata apabila membeku kelak. sebagai satu lapisan rata di dalam plat Petri (juga dipanggil ‘plat agar’/‘piring agar’) dan dalam bentuk cerun (agar cerun/ condong) di dalam tabung atau botol. Media agar Bikar air yang mendidih Penganggas air Piring Petri TATACARA 1.1. misalnya Proteus spp. 7. Sungguhpun suhu yang tinggi diperlukan untuk mencairkan agar. Tatacara Menyediakan Plat Media Agar BAHAN 1. akan saling bersentuhan dan bercantum semula di antara satu dengan lain. Jika didapati demikian. 8. media tersebut perlulah dikeringkan terlebih dahulu kerana penginokulasian di atas media yang berkeadaan sedemikian hanya akan menyulitkan pemencilan mikroorganisma nantinya. 3. Tutup plat dan simpan pada suhu 4 – 8°C jika tidak digunakan. Semasa media agar digunakan. Biarkan sehingga beku. pastikan permukaannya tidak basah. apatah lagi jika di kalangan bakteria yang ingin dipencilkan terdapat spesies yang dapat bergerak atau menunjukkan kemampuan untuk menyebar (swarming).4. apabila keseluruhan agar menjadi cair. NOTA Larutkan media agar berisipadu kecil di dalam bikar air mendidih dan media agar berisipadu besar di dalam penganggas air atau autoklaf. 4. 1. Jika setelah penuangan media. BENTUK MEDIA AGAR Media kultur dipadatkan dengan agar dan disediakan dalam 2 bentuk. 5. 2. Eramkan secara terbalik dengan penutup dalam keadaan terbuka pada suhu 37°C selama semalaman. 2. 46 . 4. Pada keesokan harinya pastikan tiada pertumbuhan (bakteria/fungus) atau kontaminasi berlaku ke atas media. Elakkan daripada menggoncang media agar sebelum dituangkan ke dalam plat. 6. Tiap-tiap bentuk agar mempunyai fungsi tersendiri. Tuangkan 15 – 20 ml agar ke dalam setiap piring Petri bergaris pusat 90 cm. 3. 3. Putarkan plat supaya agar tersebar sama rata. 2. masih terdapat gelembung udara pada permukaan media plat. Sebaliknya jika agar dibiarkan sehingga terlalu sejuk.2. ada baiknya juga jika media agar dituangkan selepas suhu diturunkan kerana ini akan mengurangkan pemeluapan.

1. misalnya ciri morfologi koloni. 2.3. Media agar untuk tujuan persiapan media agar cerun disediakan dan dibahagi-bahagikan ke dalam tabung atau botol dan kemudian disterilkan. Teknik plat garisan merupakan teknik yang paling mudah untuk mendapatkan koloni terpisah dan terasing. Tutup tabung atau botol tersebut dan sterilkan. Kemudian tambahkan bahan berkenaan yang steril dan campurkan dengan baik dan merata. bahagi-bahagikan media berkenaan dalam isipadu yang ditetapkan ke dalam tabung atau botol yang terlebih dahulu disterilkan. Media agar Bikar air yang mendidih Penganggas air Tabung/botol TATACARA 1. sama ada melalui teknik plat garisan atau teknik plat tuangan (pour plate). Tatacara Plat Garisan BAHAN 1. 2. sungguhpun teknik aseptik diamalkan. Kultur murni penting kerana ia diperlukan dalam kajian-kajian mengenai pelbagai ciri sesejenis bakteria. Sebaliknya. 2. 4. Setelah pensterilan. NOTA Tuangkan 10 hingga 15 ml media agar yang telah dicairkan ke dalam setiap tabung atau botol. Simpan media cerun agar pada 4° – 8°C jika tidak digunakan. biokimia. kultur murni diperolehi dengan menggunakan media padat. dinginkan sehingga mencapai suhu sekitar 48°C. jika sesuatu bahan yang ingin dicampurkan ke dalam media adalah daripada jenis yang tidak tahan panas. Umumnya. reaksi pewarnaan. letakkan tabung atau botol dalam keadaan condong dan biarkan membeku pada suhu bilik. Selepas pensterilan. Kultur yang sedemikian ini dikenali sebagai kultur murni dan menunjukkan pertumbuhan koloni yang morfologinya kelihatan serupa di antara satu dengan lain. maka media dalam isipadu yang besar tersebut perlu disterilkan terlebih dahulu. Berdasarkan teori bahawa satu koloni bakteria merupakan hasil daripada pertumbuhan yang berasal daripada satu sel bakteria. KULTUR MURNI 4. 3. dengan teknik aseptik. Plat Garisan Kultur murni adalah kultur yang mengandungi satu jenis atau spesies bakteria sahaja. 1. Kemudian. Bakteria daripada koloni ini kemudian boleh ditumbuhkan semula supaya semua koloni di dalam sesuatu plat terdiri daripada jenis bakteria yang sama. maka satu koloni akan hanya terdiri daripada satu jenis atau spesies sahaja. 4. morfologi sel. 3. Kultur bakteria Piring Petri yang mengandungi media agar 47 . reaksi imunologi dan kepekaannya terhadap berbagai agen antimikrob. Ini boleh mengelakkan daripada tercemar semasa membahagikan media yang telah disterilkan terlebih dahulu ke dalam tabung atau botol.Tatacara Menyediakan Media Agar Condong/Cerun BAHAN 1. 2.

Sterilkan gelung dawai melalui pembakaran api penunu Bunsen dan setelah sejuk. 1. Piring Petri yang telah diinokulasi dieramkan pada suhu tertentu dalam keadaan terbalik. Terbalikkan plat Petri yang me-ngandungi media dengan bahagian dasarnya di sebelah atas. 7. 10. 4. 5. Piring Petri yang telah diinokulasi dieramkan secara terbalik supaya sebarang pemeluapan yang berlaku pada penutupnya tidak akan menitis ke atas kultur. Gelung dawai Penunu Bunsen TATACARA 1. NOTA Labelkan plat Petri yang mengandungi media pertumbuhan yang steril (pada bahagian dasar atau bawahnya dan bukan di atas penutupnya). usahakan menggaris perlahan-lahan supaya anda tidak sampai mencungkil atau merobek media sehingga mengakibatkan media menjadi pecah-pecah. 6. Gelung dawai dibakar semula selepas garisan dibuat pada bahagian pertama piring Petri supaya inokulum (jumlah bakteria) dikurangkan. Gunakan penghujung gelung dawai sahaja untuk menyentuh permukaan media supaya mendapatkan garisan yang halus dan tipis. Bakar semula gelung dawai dan biarkan sejuk. Garisan seterusnya bermula daripada kawasan di sekitar penghujung garisan-garisan pertama. 4. Letakkan plat Petri tersebut dengan bahagian dasarnya di sebelah atas. Sebarkan inokulum seluas 1 cm garis pusat. Pastikan juga garisan yang dibuat tersebut rapi. Bermula daripada sebaran di atas gariskan inokulum dengan menggerakkan gelung bolakbalik supaya garisan meliputi satu kawasan seluas kira-kira sepertiga daripada plat.3. 8. 4. 48 . Letakkan gelung yang mengandungi spesimen di atas permukaan media agar kira-kira 1 cm daripada dinding plat Petri tersebut. 2. berterusan tetapi terpisah serta tidak saling memotong atau bersilang di antara garisan atas dengan yang di bawahnya supaya mendapatkan koloni bakteria yang berasingan. 3. yang penting ialah menyentuh gelung pada permukaan media dan menggariskannya. 2. 11. 3. maka koloni bakteria yang terpisah akan didapati. 5. Pastikan garisan yang terakhir tidak menyentuh sebaran inokulum yang pertama. Dengan gelung dawai steril pindahkan kultur/spesimen ke atas media plat dan inokulum seluas 1 cm garis pusat. ambil spesimen dengannya. 6. Dalam membuat garisan. 9. Jangan bercakap semasa melakukan prosedur ini untuk mengelakkan semburan air liur terjatuh ke atas permukaan media agar. Pegang dan angkat bahagian dasar plat sehingga permukaan media yang terdedah menghadap anda. Putarkan plat ~ 90 darjah dan buatkan pula beberapa garisan mengulangi prosedur di atas sehingga garisan meliputi keseluruhan kawasan permukaan media. Bekerjalah berdekatan dengan sumber api.

CIRI-CIRI KOLONI BAKTERIA Kajian mengenai koloni bakteria adalah penting kerana ia boleh memberikan maklumat lanjut mengenai identiti. RAJAH 4.1.1 Cara melakukan plat garisan 4.4. ciri genetik dan antigenik bakteria berkenaan. ciri-ciri koloni bakteria dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti jenis media.Gariskan inokulum secara bolek-balik bermula daripada sebarannya sehingga meliputi kira-kira sepertiga kawasan plat. Ulangi kaedah ini sehingga garisan meliputi keseluruhan kawasan permukaan media. Seperti juga ciri-ciri morfologi sel bakteria. umur kultur. Pinggiran/konfigurasi (ditentukan dengan mikroskop): Menyeluruh Beralun Lobate Erose 49 . suhu pertumbuhan. strain bakteria dan semua keadaan ini biasanya diambil kira dan dinyatakan semasa menghurai sesuatu koloni bakteria. Bentuk: Bulat Tidak teratur Berfilamen Berserabut Bertitik bujur 2. Putarkan plat 60-90 darjah dan buatkan pula beberapa garisan. Koloni bakteria biasanya diamati berdasarkan pertumbuhannya di atas media padat. aktiviti biokimia. 1.

Permukaan: Elevasi Datar Menaik Cembung Umbonat Pulvinat Cembung papilat Cembung berkerut 4. Permukaan: Konsistensi Kelihatan kering & rapuh. 7. Pertumbuhan yang nipis seperti membran. Ciri optik: Luster Legap Lutsinar Opalesens : Iridesens Pudar Berkilat Fotogenik – memancar di dalam gelap. Struktur dalam (ditentukan dengan mikroskop): Seperti warna baiduri (warna putih-kebiruan atau warna susu dengan ciri warna yangkekilatan berubah-ubah) : Warna yang berubah dengan sudut (posisi) koloni dipandang. Likat: Pertumbuhan mengikut bekas garisan dawai inolukasi.3. Batasan secara radial : permukaan berbatas-batas yang terpancar dari tengah-tengah koloni. 6. Berkerut 5. Pendaflour – satu warna dengan cahaya transmisi dan warna lain (yang cerah dan terserlah) dengan cahaya pantulan (berpendafluor). Seperti mentega atau lekit. Permukaan: Tekstur Licin Kasar Berkontour : permukaan licin dan undulat (beralun) secara tak teratur. Bergelung Berfilamen Bergranul 50 .

Sebaliknya. apabila ditumbuhkan dalam kehadiran udara (oksigen). tenaga yang digunakan untuk menjalankan proses biosintesis berpunca daripada tindakan oksidatif ke atas bahan organik. air.8.1. metabolismenya akan berubah kepada keadaan aerobik dan 51 . osmolariti media dan kepekatan ion hidrogen (pH). maka bakteria dari lingkungan yang berbeza memerlukan keadaan sekeliling yang berbeza pula untuk pertumbuhan yang optimum. Perubahan kepada media Hemolisis (pada agar darah) Penghasilan pigmen Perubahan kepada media pembeza Penghasilan bau atau aroma Istilah Bahasa Malaysia dan Istilah Bahasa Inggeris dalam pencirian koloni bakteria tidak teratur berserabut bertitik menyeluruh beralun keriting datar menaik cembung imbonat pulvinat cembung papilat cembung berkerut batasan secara radial berkerut rapuh seperti mentega/lekit pudar berkilat 4. Bakteria jenis ini boleh tumbuh secara anaerobik dan dalam keadaan ini akan memfermentasi karbohidrat dengan menghasilkan produk fermentasi seperti berbagai-bagai jenis asid. Walau bagaimanapun. Sekumpulan besar bakteria mempunyai sistem enzim yang boleh menggunakan oksigen atau terbitan organik sebagai penerima akhir hidrogen (aerob fakultatif atau anaerob fakultatif). terdapat juga bakteria yang sama sekali tidak dapat menggunakan oksigen sebagai penerima akhir hidrogen (anaerob obligat). Justeru itu ia tidak dapat tumbuh dalam keadaan kehadiran oksigen dan kemungkinan akan mengalami kematian apabila terdedah kepada gas berkenaan. Faktor ini termasuk suhu pengeraman. beberapa faktor lain di alam sekeliling juga mempengaruhi pertumbuhan dan tumbesarannya. pengkulturan bakteria di dalam makmal hanya dapat dicapai jika keadaan alam persekitarannya dapat diwujudkan.5. Oleh yang demikian. Terdapat pula segolongan bakteria yang dinamakan aerotoleran kerana berkeupayaan untuk tumbuh di dalam udara. Bakteria golongan ini melakukan fermentasi meskipun dalam kehadiran oksigen. Di samping pengaruh kandungan media ke atas pertumbuhan bakteria. Ada bakteria yang hanya boleh menggunakan oksigen bebas sebagai penerima akhir hidrogen (aerob obligat). Oleh yang demikian ia hanya dapat tumbuh dalam kehadiran oksigen. irregular rhizoid punctiform entire indulate curled flat raised convex imbonate pulvinate convex papillate convex rugose radially ridged rugose brittle butyrous dull glistening. aras oksigen. Pengeraman Bakteria dalam Keadaan Anaerobik Pada bakteria heterotrof. glossy KEADAAN PERTUMBUHAN BAKTERIA DI DALAM MAKMAL Oleh kerana penyesuaian bakteria kepada alam sekelilingnya. sungguhpun ia tidak menjalankan metabolisme oksidatif.

3. Balang anaerobik (plastik atau logam)/bekas berbentuk silinder Tangki silinder gas campuran (N285%. 2. 5. 2.karbohirat umumnya akan dioksidasi kepada air dan CO2. Indikator redoks metilena biru digunakan untuk memastikan keadaan anaerobik dicapai. Masukkan media plat yang telah diinokulasi ke dalam balang. 7. 8. Kemudian lekapkan penutup tepat pada kedudukannya menutupi mulut balang. Masukkan 10 ml air paip ke dalam GasPak dengan pipet. 4. H2 10%) 52 . pastikan proses ini dilakukan jauh dari gas yang boleh meletup. Potong salah satu sudut atas paket GasPak dan letakkan sampul GasPak secara menegak di sebelah susunan plat. Letakkan indikator redoks (oksidasi-reduksi) di sebelah susunan plat. Gunakan balang anaerobik yang sedia dilengkapi dengan 1 pek mangkin aktif yang dilekatkan kepada penutupnya. 2. Pasang alat pencengkam penutup supaya balang tertutup dengan rapi dan rapat sehingga tidak dapat ditembusi udara. 2. 4. 6. 3. Terdapat segolongan bakteria lagi yang menunjukkan pertumbuhan optimum pada kadar oksigen yang rendah dan bakteria ini dikenal sebagai mikroaerofilik. Pada balang anaerobik yang menggunakan mangkin yang perlu dipanaskan dengan arus elektrik atau api. Katalis – biji-biji aluminium disaluti paladium GasPakTM – kit penjana/pembebas hidrogen NOTA 1. Mangkin ini kemudian disimpan di dalam tempat kering atau balang pengering (desikator). Butir-butir mangkin yang terpakai dipulihkan kepada aktiviti penuh dengan dipanaskan di dalam ketuhar pada suhu 160-170°C selama 2 jam. Eramkan keseluruhan balang bersama isi kandungannya di dalam inkubator 37°C semalaman. 5. 6. Balang anaerobik (jenama GasPak) Satu paket GasPak Pipet Air Penunu Bunsen Satu pek katalis Indikator redoks TATACARA 1. 3. Tatacara Mewujudkan Keadaan Anaerobik di dalam Balang Anaerobik dengan GasPaktm BAHAN 1. Balang jenama GasPak menggunakan katalis atau mangkin ‘sejuk’ yang tidak perlukan dipanaskan sejurus sebelum GasPak digunakan. Tatacara Mewujudkan Keadaan Anaerobik dengan Pengisian Gas Nitrogen ke dalam Balang Anaerobik BAHAN 1. Tetapi masa kehilangan warnanya dicapai lebih lewat daripada pencapaian keadaan anaerobik di dalam balang. Dalam keadaan tanpa oksigen metilena biru akan menghilangkan warnanya. 7. CO2 5%.

7. Bekas logam dengan penutup berbentuk bulat (tin susu tepung) Sebatang lilin Slaid mikroskop TATACARA 1. Tutup tin dengan rapat dan biarkan sebentar sebelum tin dieramkan supaya lilin terpadam dengan sendirinya. 2. Tanggalkan semua tiub penyambung pada balang dan tutup lubang kepala salur gas dengan pita selofan. Gunakan tin dengan penutup berbentuk bulat supaya tin dapat ditutup dengan rapat. 2. NOTA Gunakan balang anaerobik yang terpakai (atau bekas plastik berbentuk silinder yang mempunyai dua lubang kecil pada penutupnya). Lekatkan sebatang lilin kepada sebuah slaid kaca mikroskop. Masukkan media plat yang telah diinokulasi ke dalam bekas ini dan kemudian tutup rapat dengan bantuan pencengkam penutup tersebut. 2.TA TACARA 1. Tempatkan lilin berjauhan dengan piring Petri yang mengandungi media yang telah diinokulasi. NOTA 1. Buka kepala salur gas kedua ini dan salurkan gas ke dalam balang sehingga terisi penuh kemudian tutup dengan rapat. Penutup bekas yang digunakan mesti berbentuk bulat kerana bentuk ini mempastikan ia tidak ditembusi udara. Eramkan balang bersama isi kandungannya di dalam inkubator 37°C selama semalaman. Prosedur ini akan mengelakkan kemungkinan lilin yang sedang menyala daripada terjatuh dari tempatnya semasa tin dipindahkan. Nyalakan lilin tersebut dan masukkannya ke dalam bekas. Tatacara Menggunakan Inkubator Karbon Dioksida dalam Pengeraman Kultur dalam Keadaan Atmosfera Karbon Dioksida Inkubator CO2 merupakan suatu alat yang lumrah didapati di makmal mikrobiologi. Keadaan atmosfera yang dicapai di dalam balang lilin adalah CO2 5%. 4. 3. Tatacara Balang Lilin dalam Pengeraman Kultur dalam Keadaan Atmosfera Karbon Dioksida BAHAN 1. 2. Pastikan saiz tin yang digunakan tidak terlalu kecil supaya terdapat sedikit ruangan untuk menempatkan lilin yang menyala pada jarak yang agak berjauhan dengan piring Petri. Dengan adanya alat ini pengeraman kultur bakteria (ataupun kultur sel) di dalam atmosfera CO2 adalah lebih mudah dilakukan di samping kehadiran ruang yang boleh memuatkan lebih banyak kultur. 3. 6. 5. Tutup rapat kepala salur gas pertama ini dan sambungkan sebuah tiub pada kepala kedua yang menghubungkannya dengan tangki silinder gas campuran. 4. Buka salah satu kepala salur gas dan hubungkan dengan tiub ke sebuah pam vakum dan kemudian sedut keluar udara di dalam balang sehingga terbentuk ruang hampa gas sepenuhnya. Instrumentasi adalah di luar skop buku ini dan haruslah mengikuti arahan dengan teliti di dalam buku operasi (manual) yang dibekalkan 53 . 3. 3.

Alat inkubator CO 2 yang mempunyai sensor jenis inframerah membolehkan paras CO2 di dalam inkubator kembali ke paras asalnya dengan lebih cepat berbanding dengan sensor jenis konduktiviti termal (haba).05% dan Chloramphenicol 0.2. Media ini biasanya digunakan untuk pengkulturan dermatofit dan Candida albicans kerana spesies-spesies ini tidak sensitif terhadap kedua-dua jenis agen antimikrob tersebut. Alat inkubator CO2 yang lebih moden mempunyai mekanisme yang menghentikan bekalan gas ini secara automatik semasa pintu dibuka dan menyambungnya semula hanya apabila pintu ditutup semula. Media agar ini boleh dibekukan di dalam piring Petri atau tabung uji. 6. Keadaan pH asid dan tanpa bahan yang kaya menghalang pertumbuhan kebanyakan jenis bakteria tetapi membenarkan pertumbuhan fungus. 2. pepton 1% yang sesuai untuk fungus dan agar 1. Sistem ini mengelakkan pembaziran gas. Pengkulturan Candida albicans di dalam serum lembu misalnya boleh menunjukkan penghasilan tiub germa oleh yis berkenaan. MEDIA KULTUR Media kultur utama yang digunakan untuk kultur primer fungus (pengkulturan daripada spesimen klinikal) adalah agar dekstrosa Sabouraud (SDA ) yang merupakan sejenis media dasar seperti juga agar nutrien.bersama-sama dengan alat ini. 7. Apa yang akan dibentangkan di sini hanyalah beberapa nota mengenai jenis inkubator CO2 dan penggunaan alat ini. 4. ia lebih sesuai bagi inkubator yang kerapkali dibuka. Agar infusi otak dan jantung dicampur 5% darah kambing biri-biri merupakan sejenis media yang diperkaya dan digunakan untuk pemencilan Histoplasma dan Nocardia. apa yang akan disimpan atau dikeluarkan daripada inkubator CO 2 ini supaya dapat mengelak daripada terlalu kerap membukanya. Rancangkan terlebih dahulu dalam tempoh masa kerja. sama ada kontaminan (fungus saprofitik daripada alam sekitar) atau fungus patogenik. Media padat ini terdiri daripada dekstrosa 4%. pengamatan kultur secara in situ dapat dilakukan dengan teknik kultur slaid. 4.5-2% dan mempunyai pH asid 5.2. PENGKULTURAN FUNGUS Fungus wujud dalam dua bentuk: yis dan hifa atau miselium. sungguhpun terdapat banyak juga fungus patogenik yang terhalang pertumbuhannya. PENGKULTURAN FUNGUS 4. Agar dekstrosa Sabouraud yang dicampurkan dengan cycloheximide 0. kecuali Histoplasma capsulatum dan beberapa strain aktinomiset seperti Nocardia asteriodes. Pastikan juga terlebih dahulu apa yang akan dikeluarkan daripada inkubator CO2 atau dimasukkan supaya dapat mengurangkan lamanya ia dibuka. Pada kultur bakteria.2.2. 54 . Ini memberi peluang yang lebih baik kepada fungus patogenik untuk tumbuh. 3. Oleh yang demikian. 5.1. manakala koloni berhifa atau miselium seperti kapas atau permaidani pada permukaan media. Ini merupakan suatu ujian diagnostik.005% mengurangkan pencemaran oleh bakteria dan fungus bukan patogenik. Jangan gunakan inkubator CO2 yang sama untuk kultur bakteriologi dan kultur sel untuk mengelakkan pencemaran bersilang. 4. Pada fungus berfilamen. Pengkulturan fungus ke atas plat agar boleh menonjolkan dua bentuk ini iaitu koloni yis kelihatan bulat dan agak lekit. Alat inkubator CO2 yang mempunyai jaket air adalah lebih cekap dalam menstabilkan suhu dan melambatkan penurunan suhu jika bekalan elektrik terputus. aras CO2 ditetapkan pada 7% dan kultur sel 5%.6. NOTA 1.

Cungkilkan sedikit kultur dan letakkan inokulum ini di tengah-tengah plat agar atau tabung cerun agar. 3. 4.3) NOTA Kultur fungus dalam bentuk yis dieramkan pada suhu 37°C. Untuk mengelakkan pencemaran oleh fungus khususnya dari udara. manakala di bahagian pertengahannya pula mungkin sudah agak tua dan ‘steril’. 1.1. 7. kerana koloni yang di tepi mungkin terlalu muda dan belum bersporulasi atau membentuk spora. Tatacara Membuat Kultur Slaid BAHAN 1. 5. 8. Kultur koloni fungus Plat agar/cerun agar Jarum inokulasi Penunu Bunsen TATACARA 1. 3. 3. penginokulasian kultur disarankan dilakukan di dalam kabinet “biohazard” kelas 2 yang memberi perlindungan kepada pengguna. 11. pertumbuhan fungus adalah lebih lambat. Tatacara Penginokulasian Plat Agar dengan Kultur Berfilamen BAHAN 1. 3. fungus yang dikulturkan serta alam sekeliling. Sungguhpun suhu bilik (25°C) digunakan sebagai suhu pengeraman oleh beberapa makmal.Tatacara Penginokulasian Plat Agar dengan Kultur Yis Tatacaranya adalah seperti yang dilakukan dengan bakteria iaitu melalui teknik garisan ke atas plat (sila rujuk bahagian 4. Eramkan pada suhu 30°C dan/atau 37°C selama 4 minggu. 2. 4. 2. 6. atau tidak mengandungi spora atau badan pembuahan (fruiting body) lagi. 10. perlulah diingat bahawa dalam hal ini. Kultur fungus Agar dekstrosa atau agar dekstrosa kentang Piring Petri Balang alkohol Penunu Bunsen Sebatang kaca berukuran 6 cm Penutup slaid Slaid mikroskop Air suling (steril) Pisau pembedahan (steril) Dawai inokulasi lurus 55 . Inokulum daripada tapak di antara pertengahan dan tepi koloni yang diambil. NOTA Sterilkan jarum inokulasi dengan pembakaran api penunu Bunsen. 4. Masukkan jarum ke dalam koloni fungus pada tapak di antara tengah dan tepi koloni fungus. 2. 9. 2.

Bengkokkan batang kaca itu sehingga mencapai bentuk ‘V’ dan biarkan sehingga sejuk di udara. agar dekstrosa kentang) berukuran 1 cm persegi dan letakkan di atas slaid. Sterilkan sekeping kaca penutup slaid dengan pembakaran alkohol dan letakkan di atas permukaan ketulan agar. 13. 2. Potong seketul agar (agar dekstrosa. 2. 10. 6. 4. 5. Masukkan 0. Dalam tatacara ini. 3. 56 . Semasa pengambilan inokulum. 3. 7. 3. 4.5 ml serum lembu (steril) ke dalam satu tabung uji. Tekan kaca penutup slaid supaya terdapat kontak yang baik di antara permukaan agar dan penutup tersebut. 7. jangan tekan penutup slaid kerana ini boleh mengakibatkan struktur konidia terpisah daripada hifa. Tutup plat Petri dan eramkan pada suhu bilik. 9. 8.TATACARA 1. 5. pastikan jarum dimasukkan tepat ke dalam koloni supaya inokulum mengandungi bahagian vegetatif fungus bersama bahagian aerialnya (yang mengandungi spora). Pastikan air di dalam piring Petri yang memberikan kelembapan kepada atmosfera ruangan kultur slaid sentiasa ada dan tidak sampai kering dan tambah jika perlu. Tuangkan sekitar 5 ml air suling steril ke dalam piring Petri ini untuk memberikan kelembapan yang berterusan semasa pengeraman kultur. 14. penutup slaid dan jarum inokulasi disterilkan dengan pembakaran api atau alkohol. NOTA 1. Sterilkan batang kaca ini dengan pembakaran alkohol. Amati juga fungus yang tumbuh pada permukaan slaid dengan pelekapan basah lactophenol cotton blue. lepaskan penutup kaca (yang mempunyai pertumbuhan fungus pada permukaannya) daripada ketulan agar dan amati dengan sediaan pelekapan basah lactophenol cotton blue. Apabila struktur reproduktif mulai terlihat. 11. Sterilkan sekeping slaid mikroskop dengan pembakaran alkohol dan letakkannya di atas batang kaca berbentuk ‘V’. slaid mikroskop. Letakkan piring Petri di atas pentas mikroskop dan amati pertumbuhan fungus dari masa ke masa. 2. Dalam penyediaan pelekapan basah. 4. Tunggu sehingga objek yang disterilkan menjadi sejuk sebelum meneruskan dengan prosedur selanjutnya. 6. Kultur yis Tabung uji Penganggas air Jarum inokulasi Slaid mikroskop Penutup slaid Serum lembu (steril) TATACARA 1. Bakarkan sebatang kaca berukuran 6 cm di bahagian tengahnya sehingga menjadi lembut. 12. Masukkan 1 koloni yis ke dalam serum dan leraikan sel-sel dari koloni dengan menggoncanggoncangkan jarum inokulasi di dalam serum. Biarkannya sejuk dan letakkan di dalam sebuah piring Petri. 2. 4 objek iaitu batang kaca berbentuk ‘V’. Inokulasi fungus dengan menyentuh keempat-empat sudut ketulan agar. Tatacara Kultur yang Merangsang Penghasilan Tiub Germa BAHAN 1.

manakala pigmentasi pada bahagian dasar koloni ditentukan melalui pigmen hifa vegetatif dan pigmen larut yang meresap ke dalam agar. di dalam struktur itu sendiri. Dengan penyempitan Tanda penyempitan NOTA 1. tetapi juga mereka yang berada di dalam ruangan yang sama. CIRI-CIRI KOLONI FUNGUS 4. kerana ini akan menyebabkan terjadinya aerosol yang mengandungi spora fungus yang akan bertebaran di udara dan boleh tersedut oleh bukan sahaja orang yang sedang mengkajinya. Morfologi Keseluruhan Koloni Fungus 1. Bagi sesetengah individu ini boleh menimbulkan alahan yang serius. Tofografi: Mendatar dan berlipat secara terpencar Mendatar dan tepian bulat menyeluruh 57 . PERHA TIAN Dalam pengamatan fungus pada kultur plat agar. Walau bagaimanapun. 2 jam dan 3 jam.3. 4. Buat pelekapan basah selepas 1 jam. adalah penting jenis media pertumbuhannya juga disebutkan kerana fungus boleh mempamerkan ciri yang berbeza-beza menurut jenis media yang digunakan. beberapa faktor lain seperti suhu pengeraman dan umur koloni juga mempengaruhi tekstur koloni fungus. Eramkan pada suhu 37°C selama 3 jam di dalam penganggas air. Di samping jenis media. dan amati penghasilan tiub germa di bawah mikroskop. seboleh-bolehnya elakkan daripada membuka penutup Petri/botol. Pastikan ampaian yis yang disediakan tidak tebal kerana inokulum yang besar akan mengurangkan bilangan sel yang menunjukkan tiub germa (105 – 106 sel/ml adalah kepekatan optimum). Pigmentasi pada permukaan fungus biasanya dihasilkan oleh spora dan hifa. Serum yang digunakan kali pertama harus diuji dengan suatu strain Candida albicans yang telah dipastikan boleh mengeluarkan tiub germa. sekalipun daripada strain yang sama. Dalam catatan mengenai morfologi koloni fungus. pigmentasi pada fungus sering kali tidak digunakan sebagai ciri pengesahan utama spesies-spesiesnya kerana ciri ini umumnya tidak stabil atau berubah. 2.3. PERHATIAN Tiub germa akan kelihatan sebagai filamen yang muncul daripada blastospora tanpa adanya penyempitan mahupun pembengkakan pada bahagian-bahagian tertentu di sepanjang filamen tersebut.2.

Pigmentasi: (permukaan dan dasar koloni) Berbeza bergantung kepada umur dan jenis fungus Istilah Bahasa Malaysia – Bahasa Inggeris tepian bulat menyeluruh tepian bergerigi berlipat tak teratur tengahnya tertekan ala-tombol ala-butang menaik ala-tekstur lilin ala-baldu entire edge fringed edge irregular folding depressed center knob-like button-like raised glabrous velvety 58 .Mendatar dan berlipat tak teratur Mendatar dan tepian bergerigi Bertimbun dan ala-tombol Bertimbun dan bahagian tengahnya tertekan Menaik ala-butang Kraterforme hingga ke bentuk plikatil Berkerut Serebriforme (serupa otak) 2. Tekstur: Krim (seperti rupa koloni yis) seperti tekstur lilin Berserbuk Berkapas Bergranul (berpasir/berbutir) seperti baldu 3.

KULTUR SEL DALAM VIROLOGI Media Kultur Sel Semua media yang digunakan dalam kultur sel atau tisu pada asasnya mengandungi suatu campuran tiruan yang terdiri daripada garam-garam tak organik yang disebut larutan garam seimbang atau larutan garam fisiologik. Agih-agihkan media ini dalam isipadu 10 atau 20 ml di dalam botol universal dan simpan beku. Eramkan serum lembu di dalam penganggas air pada suhu 50°C selama 30 minit untuk menghapuskan bahan atau faktor-faktor yang terdapat di dalamnya yang boleh menghalang pertumbuhan sel apabila digunakan nanti. Media mesti disterilkan melalui penyaringan dengan penyaring membran berukuran liang 0. Jika media berbentuk serbuk. Simpan beku.3. terutama disebabkan ia bebas daripada antibodi yang mungkin dapat menghalang pengkulturan virus dalam kultur sel. Oleh demikian. Serum (biasanya serum lembu) diperlukan untuk pengkulturan sel dan sistem fisiologik ini memerlukan suatu sistem pengawalan pH iaitu sejenis larutan tampan. seharusnya pada suhu – 20°C. Oleh itu kita perlu menumbuhkan sel-sel tertentu terlebih dahulu untuk dijadikan kultur bagi pembiakan virus. sel yang dapat ditumbuhi dan dibiakkan in vitro boleh merupakan suatu sumber ‘media’ untuk pembiakan virus. Dalam kebanyakan kultur sel. Gunakan serum fetus lembu kerana serum ini berbeza dengan serum lembu dewasa atau anak lembu. 1. Media Maklumat tentang kesesuaian sesuatu media untuk sesejenis kultur sel boleh didapati dari buku maklumat yang dikeluarkan oleh syarikat yang memasarkan media kultur berkenaan atau dari artikel jurnal. Pastikan sampel dari sesuatu botol itu steril dan dapat menampung pertumbuhan kultur sel dengan baik dengan membandingkannya dengan serum yang diketahui memberikan hasil yang baik. Agihkan ke dalam isipadu 10 atau 20 ml.1. tekanan osmotik dan membekalkan tenaga. serum lembu yang menjadi pilihan. virus hanya boleh beraplikasi di dalam sel hidup. Media yang pekat boleh disimpan di dalam bekas-bekas yang lebih kecil. 2. pada suhu – 20°C jika boleh. Labelkan nombor pengeluaran (batch number). Serum Jenis serum yang diperlukan bergantung kepada jenis kultur sel. dan tarikh diagihkan. Pastikan serum fetus lembu yang diperolehi mempunyai jangka hayat simpanan yang panjang. 59 . Pastikan semua media serbuk dilarutkan sehingga kelihatan betul-betul jernih. Apabila hendak digunakan media dikeluarkan dari simpanan dan biarkannya pada suhu bilik buat seketika dan kemudian buatkan suatu pencairan berkepekatan 1X dan campurkan bahan-bahan yang diperlukan untuk pertumbuhan. Larutan ini dicampurkan dengan asid amino dan vitamin serta glukosa sebagai sumber tenaga.3. Media ini mengekalkan pH. Media ini umumnya didapati dalam bentuk serbuk atau cecair dan dalam kepekatan 1X atau 10X. Jika sesuatu jenis media yang berkepekatan 10X didapati dalam bentuk cecair. Antibiotik juga dicampurkan ke media untuk mengawal daripada pencemaran serta pertumbuhan mikrob. 4. Aspek-aspek mengenai pertumbuhan sel secara in vitro ini dikenal se-bagai kultur sel. PENGKULTURAN VIRUS Berbeza dengan bakteria dan fungus.2 µm. maka ia dipilih dan diutamakan daripada bentuk lainnya.4. ia terlebih dahulu dilarutkan di dalam air suling supaya mencapai kepekatan 5X atau 10X. Fenol merah digunakan sebagai penunjuk pH.

Jangan masukkan ke dalam penganggas air untuk mengelakkan pencemaran. Antibiotik yang sesuai adalah Gentamicin dan Amphotericin B (Fungizone). 3. 4. Sistem Penampan pH yang Digunakan di dalam Media Kultur Sel Pertumbuhan sel haiwan di dalam media kultur sel yang lengkap biasanya adalah optimum apabila media ditampan dalam julat pH 7. Larutan natrium bikarbonat disterilkan melalui penyaringan ataupun diautoklaf. 2. Kepekatan natrium bikarbonat yang digunakan adalah bergantung kepada jenis media. diagih-agihkan dalam isipadu 1. Larutan penampan pH yang sering kali digunakan di dalam media kultur sel adalah natrium bikarbonat. Persediaan Natrium Bikarbonat Larutkan 5. 5. Biarkan reagen yang disimpan beku seperti media. Adalah sesuai jika ia disediakan dalam kepekatan 10X yang seterusnya hanya perlu dicairkan menjadi 1X apabila hendak digunakan nantinya di dalam media lengkap. 7. Simpan pada suhu bilik.5 ml fenol merah 0.5 ml air suling dan campurkan 0. Saringkan dengan menggunakan penyaring membran berukuran liang 0. Larutan tampan HEPES (asid N-2-Hidroksietilpiperazin-N’-2-etanasulfonik) yang berfungsi sebagai zwitterion juga boleh digunakan sebagai larutan penampan menggantikan natrium bikarbonat dalam sistem terbuka dan ia digunakan pada kepekatan mutlak 20 mM. serum dan antibiotik mencair pada suhu bilik di atas meja.6g NaHCO 3 di dalam 95. 6.2 µm atau diautoklaf pada 20 tekanan paun setiap inci (pound per square inch: psi). Gentamicin adalah agen antibakteria berspektrum luas (aktif terhadap bakteria Gram-positif dan Gram-negatif) dan berkesan terhadap mikoplasma. 2. Amphotericin B adalah agen antifungus. Antibiotik Antibiotik dicampurkan ke media kultur untuk menghalang pertumbuhan mikrob. Untuk kedua-dua jenis antibiotik ini.2 hingga 7. 3. Larutan penampan ini digunakan dalam sistem tertutup (bekas kultur ditutup rapat) yang diseimbangkan dengan udara atau sistem terbuka (seperti piring Petri) yang diseimbangkan dengan atmosfera yang mengandungi kadar CO 2 yang tinggi seperti di dalam inkubator CO2. Jika natrium bikarbonat diperlukan juga sebagai nutrien maka kepekatannya seharusnya tidak melebihi 10 mM (0.85 g/l). Larutan antibiotik dicairkan 1:100 di dalam media. 4. Tuangkan media ke dalam 1 botol steril jika kesemua kandungannya diperlukan (jika hanya sebahagian sahaja media yang diperlukan. disaring melalui penyaring dengan saiz liang 0.4. Gaskan dengan CO 2 sehingga warna media menjadi oren.0 ml dan disimpan beku. 5. Lapkan permukaan luar setiap bekas dengan tuala kertas sehingga kering. Kepekatan yang sesuai digunakan adalah Gentamicin 30 µg/ml dan Amphotericin B 5 µg/ml. Tatacara dalam Persediaan Media Kultur Sel BAHAN 1. Media kultur sel Serum fetus lembu Antibiotik (Gentamicin dan Amphotericin B) NaHCO3 Air suling (steril) Bekas (steril) Pipet bersukat (steril) TATACARA 1. Kedua-dua agen antimikrob ini disediakan dalam kepekatan 100X di dalam air suling steril (jika dibekalkan dalam bentuk serbuk). gunakan pipet steril untuk memindahkannya). gunakan gred yang ditentukan khusus untuk kultur sel.3. Agih-agihkannya ke dalam botol yang kemudian ditutup rapat.2 µm. 60 .4%.

TRIPSINISASI Tripsinisasi adalah proses peleraian tisu atau sel selapisan kepada sel-sel individu menggunakan enzim tripsin. N OTA 1. 3. 2. 12. 2. adalah tidak stabil dalam bentuk cecair. Biasanya media pertumbuhan memerlukan 5 – 10% serum dan media pengekal 0 – 2%. asid amino ini perlulah ditambahkan ke dalamnya jika media tersebut disimpan lebih daripada 2 minggu. 5. Campurkan serum supaya mencapai peratus kepekatan yang diperlukan. Tempoh simpanan media yang mengandungi serum adalah 4 minggu.2 µm. PERHATIAN Persediaan ini dilakukan dengan menggunakan kabinet aliran udara laminar kelas 1 atau kelas 2. Tatacara untuk Tripsinisasi Tisu Seluruh BAHAN 1.4% versena di dalam PBS.0 % tripsin dan 0. 8. Oleh yang demikian. Larutan tripsin dan versena Larutkan 1. Seluruh haiwan atau tisu Gunting 2 pasang Gunting bengkok dan tajam Alat pengaduk magnet Magnet disaluti silikon/teflon Kelalang kon Larutan tripsin-versena Etanol 70% Larutan salin ditampan fosfat (phosphate buffered saline: Gentamicin dan Fungizone 5 µg/ml Penyaring kasar (steril) Mikroskop cahaya jenis terbalik Bekas kultur sel PBS) yang mengandungi 30 µg/ml PERSEDIAAN 1. salah satu komponen sesetengah media. 4. 5. 6. Serum yang dibeku dan dicairkan kadangkala mengandungi serpihan-serpihan yang mendap di dasar botol.4. 11. Simpan pada suhu 4°C. Sterilkan dengan menggunakan penyaringan membran dengan liang 0. Campurkan kedua-dua jenis larutan ini dalam isipadu yang sama. 9. Sebelum media digunakan. bagi media yang seharusnya mengandungi L-glutamina. Campurkan isipadu air suling yang diperlukan diikuti dengan larutan penampan dan antibiotik. Ini bukanlah suatu pencemaran. goncangkannya terlebih dahulu untuk menentukan kehadiran pencemaran yang berat yang ditandai dengan kekeruhan pada media tersebut. 7. tetapi seboleh-bolehnya elakkan daripada menggunakannya. 10. 61 . Simpan media pertumbuhan atau pengekal pada suhu 4°C. 7. L-glutamina. 6.

Bunuh haiwan yang berkenaan dan letakkan menelentang supaya bahagian tubuh atau tapak di mana pembedahan akan dijalankan terdedah. 2. Sebelum sel ini boleh dipindahkan ke tempat lain atau separuh daripadanya dikeluarkan untuk mengelak kesesakan yang akan menghalang pertumbuhan dan menjejaskan keupayaannya untuk hidup (viabilitinya). Saring suspensi sel melalui penyaring kasar untuk memisahkan sel-sel dari serpihan tisu-tisu besar. Tatacara untuk Tripsinisasi Sel Selapisan dan Pengeraman Kultur Sel BAHAN 1. Suhu 37°C dapat dicapai dengan melakukan proses peleraian di dalam bilik panas atau dengan menggunakan alat pengaduk magnet yang juga berfungsi sebagai plat pemanas. N OTA 1. Aturkan nilai pH larutan kepada 7. 1. Tripsinisasi Sel Selapisan dan Pengeraman Kultur Sel Sesetengah jenis kultur sel wujud sebagai suspensi di dalam bekas kultur.2g KCl. Pindahkan potongan tisu ke dalam sebuah kelalang kon yang mengandungi magnet yang disaluti teflon atau silikon. 11. Tuangkan larutan tripsin 10 minit selepas proses ini bermula. Lap kulit bahagian yang terdedah ini dengan etanol 70% dan bedah/potong untuk mendapatkan organ yang diperlukan.25% dan versena 0. Tambahkan air suling sehingga mencapai satu liter. Tambahkan tripsin baru dan aduk semula. 3.2% PBS tanpa kalsium dan magnesium (steril) 62 . Tambahkan tripsin baru setiap kali ini dilakukan.2g KH2PO4 di dalam 950 ml air suling.3. sel mestilah ditanggalkan dari permukaan bekas kultur. 7. Keluarkan organ dan letakkan di dalam piring Petri di mana ia dipotong menjadi serpihanserpihan kecil berukuran 2 mm3.PBS tanpa kalsium dan magnesium 2. 2. TATACARA 1. kelalang tidak diletakkan secara langsung di atas plat pemanas tetapi dimasukkan ke dalam sebuah bikar berisi air yang ditempatkan di atas plat pemanas tersebut. Emparkan suspensi sel pada 400 g selama 15-30 minit dan leraikan mendapan sel di dalam media yang sesuai dan lakukan perhitungan hidup. Larutkan 8. Dalam pilihan kedua. manakala majoriti akan melekat pada permukaan bekas kultur dan tumbuh membentuk satu lapisan sel. Aduk kandungan kelalang dengan pengaduk magnet pada suhu 37°C. Semua alat dan reagen yang digunakan disterilkan terlebih dahulu. Simpan pada suhu bilik. 9. 4. 5. 2. 3. Dari masa ke masa tuangkan sel yang telah dileraikan daripada tisu dan simpan pada 4°C. 8. 0.15g Na2HPO4. Masukkan larutan tripsin-versena (lebih kurang 20 ml setiap 1g tisu). 6. 10. Tatacara berikut dilakukan dalam keadaan aseptik dengan menggunakan peralatan yang steril. Campuran tripsin 0. Elakkan daripada terjadinya pembentukan buih (frothing) semasa tisu diaduk. Agih-agihkan larutan ini ke dalam botol dan sterilkan dengan autoklaf pada 10 psi (suhu mencapai aras 115°C) selama 15 minit. Goyang piring Petri perlahanlahan untuk membersihkan potongan-potongan tisu. 0.0g NaCl. Masukkan PBS yang mengandungi antibiotik dan antifungus. Ubah kepekatan sel menjadi 2 x 10 5 sel/ml media pertumbuhan dan kulturkan di dalam bekas kultur.

Eramkan pada suhu 37°C selama 1 hingga 5 minit. Campurkan 2 jenis larutan ini dalam isipadu yang sama. 8. N OTA 1. 5. 3. Goncangkan bekas kultur sel sebelum diletakkan di dalam inkubator supaya sel-sel bertaburan sama rata. 6. 5. 10% O2. Keluarkan media secara aseptik dengan pipet bersukat. Pada jenis kultur sel yang tumbuh dengan lambat atau perlahan. kultur sel ini dieramkan di dalam inkubator CO 2 yang mengandungi CO2 pada kadar 5%. Masukkan sedikit campuran tripsin dan versena dan goncangkan botol untuk meliputi ke seluruh monolapisan sel. Aturkan kepekatan suspensi sel supaya mencapai 1 x 105 sel/ml media pertumbuhan. Pipet bersukat (steril) Mikroskop cahaya jenis terbalik Kabinet aliran udara laminar kelas 1 atau 2 PERSEDIAAN 1. Sel akan mengalami kerosakan atau mati jika didedahkan terlalu lama. 9. sel tidak perlu dicuci melalui emparan dan supernatannya dituang keluar untuk menghilangkan campuran tripsin dan versena tersebut. 0. 1. Simpan pada suhu 4°C. amati sel dengan mikroskop untuk menentukan sama ada sel telah menjadi bulat dan/atau telah tanggal. Pipet media pertumbuhan (isipadunya bergantung kepada saiz bekas) ke dalam bekas dan cuci sel daripada permukaan bekas dengan memancutkan media daripada pipet yang dipasang dengan bal penyedut getah untuk meleraikan kelompok sel. 2. media yang mengandungi serum digunakan dalam mensuspensikan sel selepas sel-sel ditanggalkan. 4. Biarkan botol berdiri tegak selama 1 hingga 2 minit sebelum cecair yang mengalir ke dasar bekas dipipet keluar.0g NaCl.2g KCl.4% di dalam PBS .5% N 2) ke dalam bekas kultur menggantikan udara di dalam ruang bekas sebelum penutupnya ditutup dengan rapat. Pada sistem terbuka. Larutan tripsin dan versena Larutkan tripsin 0. Aturkan nilai pH larutan kepada 7. Amatilah selalu dengan mikroskop untuk menentukan sama ada sel telah berbentuk bulat. 7. Agihagihkan ke dalam botol dan sterilkan dengan autoklaf pada 10 psi (115°C) selama 15 minit. 4. 10. Tambahkan air suling sehingga mencapai 1 liter.2g KH2PO4 di dalam 950 ml air suling. goncangkan bekas kultur supaya PBS meliputi sel monolapisan. sel-sel akan mati. Pada jenis kultur sel yang tumbuh dengan pesat. Dalam masa ini. Peganglah kultur sel hampir tegak lurus dan ketuk permukaan bekas kultur untuk menentukan sama ada sel boleh ditanggalkan (dilepaskan) daripada permukaan atau belum.15g Na 2HPO4 dan 0. Cuci 2 kali dengan PBS : pipet PBS ke dalam bekas. 63 . Hitunglah suspensi sel dengan hemositometer. untuk menghalang aktiviti tripsin tersebut.3. Sterilkan dengan menggunakan penyaring membran dengan liang 0-2 µm. 81. Masa yang diambil untuk penanggalan sel daripada permukaan dalam bekas bergantung kepada jenis kultur yang terlibat. 3.3. Pencairan dengan media pertumbuhan boleh mengurangkan kepekatan tripsin dan versena kepada suatu aras yang tidak akan menjejaskan pertumbuhan sel. Jika campuran tripsin dan versena yang digunakan sedikit sahaja. 2. TATACARA 1. Simpan pada suhu bilik. 11. Jika didedahkan terlalu lama kepada tripsin. PBS tanpa kalsium dan magnesium Larutkan 8. pipet keluar PBS. Oleh itu.5% dan versena 0. 2. alirkan campuran gas (9% CO2. Aktiviti tripsin ini boleh dihapuskan oleh serum. tutup penutup bekas kultur dengan rapat.

4. atau ia mengalami kematian kerana keadaan pertumbuhan yang tidak sesuai. 3. kultur sel dari satu bekas kultur dibahagikan (dibelah) kepada dua hingga empat bahagian (bergantung kepada jenis kultur sel) dan setiap bahagian dikulturkan secara berasingan di dalam bekas kultur yang mempunyai isipadu yang sama dengan bekas induk. tenaga dan masa boleh dicapai jika kultur sel ini disimpan sewaktu tidak digunakan. Tetapi jika suspensi mengandungi banyak sel maka perhitungan sel-sel di dalam kesemua SES kecil tidak perlu dilakukan lagi. dalam keadaan yang telah menjadi kebiasaan seperti pertumbuhan sel di dalam bekas kultur yang sama ukurannya. tatacara nisbah perpisahan (split ratio) boleh digunakan. maka sel-sel di dalam kesemua 25 SES kecil dihitung. 2.1% tripan biru di dalam 10 ml air suling. Dalam keadaan tertentu. Larutkan 1/10 dengan 10X PBS sebelum digunakan. 2. 4. Sebab kedua kenapa penyimpanan sel ini diperlukan adalah kerana sesuatu kultur sel itu hanya digunakan pada masa-masa tertentu sahaja. peganglah bekas supaya permukaan di mana terdapatnya sel adalah di atas. Tatacara Menghitung Sel dengan Menggunakan Hemositometer BAHAN 1. Hitunglah sekurang-kurangnya 100 sel (ini bermakna bahawa pada suspensi tidak mengandungi banyak sel.1% tripan biru di dalam PBS Hemositometer jenis Neubauer Mikroskop cahaya PERSEDIAAN Tripan biru 0. Satu sebab lain yang penting dalam hal penyimpanan kultur sel ini. Saringkan melalui kertas turas. Bilangan sel ml-1 = jumlah sel yang dihitung x 25 x 10 4 x faktor pencairan jumlah SES yang digunakan 6. Tetapi. Suspensi sel 0. Hemositometer Neubauer mempunyai sembilan segi empat sama (SES) yang besar terletak di tengah. 4. Hitung sel di dalam SES yang kecil ini. Kriopengawetan Sel yang Hidup Oleh kerana kultur sel adalah suatu hidupan. 5. 5. Semasa mencuci sel-sel daripada permukaan bekas kultur. walaupun tidak 64 . Pada posisi ini lapisan sel lebih mudah diamati dan sel-sel ditanggalkan dengan lebih mudah kerana tidak diselaputi oleh lapisan media semasa dicuci. SES ini dibahagikan pula kepada 25 SES yang dipisahkan oleh tiga garis. Dalam cara ini. Simpan di dalam peti beku. manakala yang menyentuh atau melintang garis bawah dan kanan SES tidak dihitung atau diabaikan. TATACARA 1. ada kemungkinan kultur sel ini boleh terhapus disebabkan kemusnahan akibat pencemaran oleh bakteria atau fungus. sel yang menyentuh atau melintang garis sebelah kiri dan atas setiap segi SES dihitung atau diambil kira. penjimatan kos. 3. Sebagai panduan. Untuk mengelakkan daripada kehilangan sel-sel ini sebahagian dari-pada kultur sel berkenaan haruslah disimpan dalam keadaan yang boleh mengekalkan viabilitinya tanpa pertumbuhan.1% di dalam PBS Larutkan 0. Dalam hal ini. kepekatan sel mestilah ditentukan terlebih dahulu supaya jenis sel dengan kepekatan yang diperlukan boleh ditetapkan. Apa yang perlu hanyalah menghitung sel-sel di dalam SES kecil yang terletak di tengah dan di keempat-empat sudut hemositometer tersebut sahaja).

5. 7. 8. kultur ini boleh digantikan dengan kultur sel lain yang disimpan. 9. Atursuaikan supaya kepekatan sel adalah 2 x 106 sel setiap ml. Dalam hal ini. Balutkan dengan kapas. 9. ialah untuk mengekalkan ciri-ciri kultur sel tertentu. iaitu dalam fasa tumbesaran logaritmanya dan hampir mencapai lapisan sel yang meliputi keseluruh permukaan bekas kultur. Pindahkan ke dalam 1 tabung atau botol steril dan tambahkan media jika perlu. Campurkan dan hitung jumlah sel untuk menentukan kadar sel hidup. Emparkan pada 200 g selama 15 minit. 14. 2. kemudian balut dengan kertas timah dan masukkan ke dalam satu kotak polistirena (5-10 cm tebal). 3. Keluarkan supernatan dan masukkan media pertumbuhan yang mengandungi DMSO 10%.begitu ketara. 3. nombor pindahan sel (cell passage no. 10. Apabila sesuatu sel dikulturkan untuk jangka masa yang berlarutan terdapat kemungkinan ciri-cirinya akan berubah: yang paling sering dikesan ialah sensitivitinya terhadap virus menjadi berkurangan. pensterilan ke atas bahan adalah tidak perlu kerana DMSO dianggap steril. 4.5%) dan versena (0. Jika perubahan yang tidak sesuai berlaku dalam kultur sel yang sedang digunakan. TATACARA 1. Jangan tambah DMSO kepada suspensi sel secara langsung ke dalam media pertumbuhan. ms 62-64). tukarkan media kultur sekitar 24 jam sebelum sel diproses. Pindahkan 1 ml ke dalam setiap kriovial. 12. Pilih kultur sel yang sihat. N OTA 1. 65 . 10. 5. 11. Kultur simpanan ini lazimnya masih mempunyai ciri-ciri yang dikehendaki kerana ia merupakan kultur sel yang mempun-yai riwayat pensubkulturan yang awal. 2. jika ada. Labelkan kriovial dengan nama sel. 3. 6. 7. Tatacara Kriopengawetan Sel yang Hidup BAHAN 1. Simpan pada lantai peti bek – 70°C semalaman dan segera pindahkan ke dalam bekas yang mengandungi nitrogen cecair.02%) Media pertumbuhan PBS (steril) Tripan biru Dimetil sulfoksida (DMSO) Kriovial Peti beku suhu – 70°C Tangki nitrogen cair untuk menyimpan spesimen Alat emparan Mikroskop cahaya Mikroskop cahaya terbalik Kapas Kertas timah nipis PERSEDIAAN Dimetil sulfoksida (DMSO) 10% v/v di dalam media pertumbuhan Tambahkan 1 ml DMSO ke dalam 9 ml media yang mengandungi serum 10% pada hari kultur sel akan disimpan. Sediakan suspensi sel di dalam media yang mengandungi serum 10% (lihat tatacara tripsinisasi sel. 8. 6.) dan tarikh. 4. Kultur sel Campuran larutan tripsin (0. 2. 15. Jika sel mengambil masa yang lama untuk mencapai keadaan di atas.

Ini dicapai dengan kriovial dibalut dengan kapas serta kertas timah dan disimpan di dalam kotak polistirena. 66 . Sebelum sesuatu kumpulan kultur sel yang disimpan dianggap sempurna. 8. Tatacara Mengkulturkan Semula Sel yang Dikrioawetkan BAHAN 1. 3. 6. Pegang kriovial di dalam penganggas air sehingga semua pembekuan menjadi cair. 3. Lagipun. Jika ampul kaca digunakan. Tambahkan media pertumbuhan yang mengandungi DMSO yang tersedia kepada sel-sel selepas diemparkan. kadangkala ampul yang dimasukkan ke dalam air untuk pencairan boleh meletup jika penaupan tidak dilakukan dengan sempurna. Kriovial kultur sel Media pertumbuhan Penganggas air 37°C Bekas kultur sel Pipet steril Inkubator suhu 37°C TATACARA 1. pastikan salah satu bekas kultur sel daripada kumpulan ini boleh dihidupkan semula tanpa terjadinya sebarang pencemaran mikrob. Adukkan suspensi sel sejurus sebelum diagihkan ke dalam botol kriovial untuk memperoleh suspensi sel yang sama rata. Eramkan pada 37°C. 4. pastikan aras air tidak mencapai penutupnya untuk mengelak kemungkinan air menyentuh bahagian mulut kriovial dan berlakunya pencemaran. adalah lebih selamat jika sel disimpan di dalam nitrogen cair. Pindahkan kandungan kriovial atau ampul ke dalam sebuah bekas kultur dan campurkan media pertumbuhan ke dalamnya. 6. 6. Keluarkan kriovial/ampul sejurus selepas suspensi sel menjadi cair. 2. Adalah penting suhu kultur sel yang disimpan dikurangkan secara beransur-ansur. Semasa kandungan kriovial dicairkan. 2. Walaupun ampul kaca atau polipropilen boleh digunakan sebagai bekas untuk simpanan. manakala ampul biasanya harus ditutup melalui penaupan dengan pembakaran api. bekas nitrogen cair disimpan di dalam bilik sejuk dan dipastikan nitrogen cair ditambahkan semula dalam tempoh masa yang sesuai mengikut kekerapan bekas tersebut dibuka. selepas sel telah melekat pada permukaan bekas kultur pipet keluar media dan gantikan dengan media baru. 5. kriovial lebih mudah dikendalikan kerana dilengkapi dengan penutup. 7. Keringkan permukaan luar ampul dan lap dengan alkohol. Amalan ini dipraktikkan kerana sel haiwan yang disimpan pada suhu – 70°C tidak boleh mengekalkan viabilitinya dalam masa yang begitu lama. Kita juga harus menyedari bahawa ada kemungkinan suhu – 70°C tersebut tidak dicapai di seluruh ruangan simpanan di dalam peti beku. 4. Untuk mengelakkan penyejatan. N OTA 1. 7. Selepas beberapa jam hingga semalaman.4. tudung ampul dengan sehelai kain dan pakai kaca mata pelindung kerana ampul yang tidak ditaup dengan sempurna boleh meletup. Kultur sel yang disimpan pada – 70°C harus dikulturkan selepas 6 bulan sebelum disimpan semula. 8. 9. Keluarkan sebuah kriovial dari tempat simpanan dan serta-merta pindahkannya ke dalam penganggas air. 5. 5. Oleh kerana amat sukar untuk mengekalkan suhu peti beku pada – 70°C.

Pilih suhu pengeraman yang optimum untuk sesejenis virus yang dikulturkan. Jika m. Bekas kultur sel digoncang bukan sahaja untuk menyebarkan virus tetapi juga untuk mempastikan seluruh sel monolapisan sentiasa diliputi cecair untuk mengelak daripada kekeringan. Tatacara Inokulasi Kultur Sel dengan Virus BAHAN 1.) yang sesuai. atau udara di dalam ruangan bekas kultur digantikan dengan campuran gas yang mengandungi CO 2 5%. 3. Suspensi virus Larutan garam seimbang Hank dengan antibiotik (pencair virus) Kultur sel dalam bentuk monolapisan penuh PBS (steril) TATACARA 1. Masukkan media pertumbuhan dan eramkan pada suhu yang sesuai.i. Penjerapan boleh dilakukan pada suhu bilik atau pada suhu pengeraman kultur. 7. Keluarkan media dari bekas kultur.o. 1. Untuk memperoleh pemulihan kultur sel yang lebih cepat. 4. 3. Permukaan bekas kaca dibakar sebelum dan sesudah cecair dituang. 2. Sama ada inokulum virus dikeluarkan selepas tempoh penjerapan atau tidak bergantung kepada keperluan. 6. Jika kultur berada di dalam bekas kaca.2. 3. Amati kehadiran kesan sitopatik (untuk virus sitopatik) setiap hari atau selang sehari. Jika banyak kultur sel perlu diinokulasi dalam masa yang sama. Goncangkan bekas setiap 10-15 minit untuk menyebarkan semula suspensi virus ke seluruh monolapisan. 2. Persediaan ini dilakukan dengan menggunakan kabinet biohazard kelas 2. 5. eramkan kultur di dalam inkubator CO 2. 4. 5. Media kultur dibuang dan digantikan dengan yang baru secepat boleh supaya DMSO dan selsel yang mati yang boleh menjejaskan pertambahan sel-sel yang hidup disingkirkan. Penjerapan virus dilakukan dalam isipadu cecair yang kecil untuk memudahkan kontak di antara virus dan sel. Sama ada kriovial digoncang untuk menggalakkan pembekuan suspensi sel supaya lebih cepat mencair atau tidak bergantung kepada jenis sel tertentu kerana terdapat jenis sel yang viabilitinya terjejas akibat goncangan dengan kuat.i yang terlalu tinggi digunakan ada kemungkinan sebahagian besar virus yang tak lengkap dihasilkan. kandungannya bolehlah dituang. Eramkan pada suhu yang sesuai (biasanya pada suhu 37°C) selama 30-60 minit. 6. suhu pengeraman adalah 37°C sungguhpun pada virus respiratori suhu yang lebih rendah. Cuci 2 kali dengan PBS. 4. 3. media boleh dikeluarkan dengan pipet yang dihubungkan kepada sebuah pam udara. 7. 8. 4. N OTA Lakukan pencairan virus supaya mencapai pergandaan infektiviti (multiplicity of infection. Pada kebanyakan virus haiwan. atau di dalam bekas khas yang mengandungi CO 2 5%.o. Lap keseluruhan bahagian luar bekas dengan alkohol untuk mengelakkan pencemaran. yakni 35°C merupakan suhu yang optimum. 2. Pergandaan infektiviti. Masukkan suspensi virus ke dalam bekas kultur dan sebarkan ke seluruh lapisan sel. 67 . 9. m. Amati kultur sel dan pilih kultur yang hampir atau baru mencapai monolapisan yang lengkap atau penuh (seluruh permukaan bekas kultur sel diliputi dengan sel). 5. adalah nisbah partikel virus berinfeksi dan sel. pada peringkat awal tempoh pertumbuhan sel.

Sebelum inokulasi dilakukan adalah penting untuk menentukan terlebih dahulu sama ada telur yang akan digunakan tersebut mempunyai embrio yang masih hidup dan kedua. Semua ini adalah tanda yang menunjukkan bahawa embrio tersebut masih hidup. Tekan lubang terowong lampu suluh kepada cangkerang telur. 4. bentuk embrio juga jelas kelihatan. 5. PENGKULTURAN VIRUS DENGAN MENGGUNAKAN TELUR BEREMBRIO Telur ayam berembrio hidup merupakan suatu sistem yang digunakan untuk pengkulturan beberapa jenis virus. N OTA Pilih telur yang bersih dan mempunyai cangkerang yang berwarna putih pudar untuk memudahkan pengamatan bahagian dalamnya. Gunakan pita selofan untuk melekatkannya dan mengekalkan bentuk ini. 3. 2. Pasangkan penghujung kon yang besar kepada kepala lampu suluh.2. 2. tapak yang sesuai untuk suntikan. Gunting kedua-dua penghujung kon ini supaya tepinya menjadi sama rata dan garis pusat bahagian yang lebih besar adalah sama dengan ukuran kepala lampu dan bahagian kecil adalah lebih kurang sama dengan ukuran penghujung telur yang lebih bulat. 68 . Dengan ini cahaya lampu akan ditujukan ke luar melalui lubang yang lebih kecil. khususnya mata embrio yang besar dan kehadiran ruang udara. 3. Pengamatan Telur Melalui Transiluminasi (Penyuluhan) Embrio telur dipastikan hidup dengan cara transiluminasi yang diberi istilah candling dalam bahasa Inggeris kerana pada zaman dahulu cahaya lilin digunakan untuk tujuan ini. Pastikan salur darah korioalantoik telur berembrio kelihatan jelas sekali dan embrio bergerak-gerak. membran alantoik dan membran korioalantoik – boleh digunakan bergantung kepada jenis virus yang terlibat. Tiga jenis tapak pada telur – membran amnion. Telur berembrio Lampu suluh Kertas manila Pita selofan Gunting Pena penanda PERSEDIAAN Alat untuk penyuluhan Gulungkan sekeping kertas manila supaya berbentuk kon.4. Nyalakan lampu dan amatilah bahagian dalam telur. TATACARA 1. 6. 4. Tatacara Penyuluhan Telur BAHAN 1. Pada masa ini.3. Perkukuhkan kontak ini dengan menambahkan pita selofan. yang digunakan ialah kotak cahaya atau lampu suluh yang telah diubahsuai. Pilih tempat yang gelap.

Terbalikkan telur untuk membersihkan membran cangkerang daripada cebisan-cebisan cangkerang. Tatacara Penyuntikan Virus di dalam Ruang Amniotik BAHAN 1. Telur berembrio berumur 10 hingga 12 hari Jarum (28 gauge) dan picagari Etanol 70% Penggerudi berputar yang dipasang dengan cakera pemotong Pita selofan TATACARA 1. 3. 69 . Tandakan dengan pena penanda tapak ruang udara. Suluh telur untuk menentukan embrio masih hidup. Suntikkan 0. 3. 7. Gerudi satu lubang atau celah yang kecil pada cangkerang pada tapak yang ditandakan untuk mendedahkan membran cangkerang. 5. 5. Lapkan membran cangkerang dengan parafin cecair supaya membran cangkerang menjadi jernih.Suntikan Virus ke dalam Ruang Alantoik Pertumbuhan virus di dalam membran alantoik digunakan untuk virus influenza dan paramiksovirus yang telah disesuaikan beraplikasi dalam keadaan makmal. 5. 6. 3.1 ml inokulum ke dalam celah ini dengan jarum yang dimasukkan beberapa mm ke dalam celah. 5. Eramkan dengan tapak yang diinokulasi virus di sebelah atas selama 1 hingga 3 hari mengikut keperluan. 2. 3. Telur berembrio berumur 10-12 hari atau 12-14 hari Jarum panjang (11/4) dan picagari berisipadu 1 ml Etanol 70% Penggerudi berputar yang dipasang dengan cakera pemotong Pita selofan Parafin cair Gunting kecil dengan penghujungnya bengkok Swab steril TATACARA 1. Suluh telur untuk menentukan embrio masih hidup. 2. 2. 4. 7. 8. Lap tapak celah tersebut dengan etanol. 4. Tatacara Penyuntikan Virus ke dalam Ruang Alantoik BAHAN 1. Tutup celah dengan pita selofan. 2. 6. Tandakan dengan pena tanda satu tapak yang agak berjauhan dengan sebarang salur darah. Suntikan Virus ke dalam Ruang Amniotik Cara ini digunakan untuk pemencilan primer (kali pertama virus ditumbuh dalam keadaan makmal) virus influenza dan mumps. Ketuk dan pecahkan cangkerang tepat di atas ruang udara berkenaan dengan pemegang gunting dan guntingkan satu lubang besar sehingga mencapai pinggir ruang udara. 4. 4.

3. Lap tapak celah dengan etanol. 4. Letakkan setitis larutan salin yang steril di atas celah. Eramkan dengan tapak yang diinokulasi di sebelah atas selama 1 hingga 3 hari mengikut keperluan. 8. 8. Gerudikan satu lubang kecil di kawasan ruang udara. 5. 8. 11. Tekan bal penyedut getah besar dengan sepenuhnya dan lekapkan penghujungnya pada lubang di ruang udara. supaya membran korioalantoik di bawah celah tersedut dan kelihatan terjatuh atau terlepas daripada cangkerang dan suatu pundi udara terbentuk. 2. 3. 10.1 ml inokulum ke dalam celah ini dengan jarum yang dimasukkan beberapa mm ke dalam celah. 9. 4.85% (steril) TATACARA 1. Suntikkan 0. 4. 7. 5. 2. 2. 7. 6. Suluh telur untuk menentukan embrio masih hidup. Gerudikan satu celah cangkerang yang kecil pada tapak yang ditandakan tersebut untuk mendedahkan membran cangkerang sahaja. Tatacara Penyuntikan Virus ke atas Membran Korioalantik BAHAN 1. 3. Eramkan dengan tapak yang diinokulasi di sebelah atas selama dua hingga tiga hari pada suhu 37°C. Tutup lubang dengan pita selofan. Tatacara Mengumpulkan Cecair Alantoik BAHAN 1. Telur berembrio selepas penyuntikan virus dan pengeraman Gunting Pipet Pasteur Botol (steril) Etanol 70% 70 . Lepaskan tekanan bal getah. 5.1 ml inokulum ke pundi amniotik dengan menusukkan jarum ke tapak yang berhampiran dengan kepala embrio. Tandakan dengan pena penanda satu tapak yang tidak mendekati mana-mana salur darah.6. 6. Tutup celah dengan pita selofan. 7. Telur berembrio berumur 10 sehingga 12 hari Jarum (28 gauge) dan picagari Etanol 70% Penggerudi berputar yang dipasang dengan cakera pemotong Pita selofan Pena penanda Bal penyedut getah besar Larutan salin 0. Suntikkan 0. Penyuntikan Virus ke atas Membran Korioalantoik Pengkulturan virus di atas membran korioalantoik membolehkan perbezaan di antara poksvirus jenis variola dengan vaksinia dan di antara virus herpes simplex taip 1 dengan taip 2 berdasarkan morfologi poks yang dihasilkan.

4. 3.5 ml larutan salin yang steril. Tanggalkan pita selofan yang menutupi ruang udara. Letakkan telur di dalam peti sejuk selama beberapa jam atau di dalam peti beku suhu – 20°C selama 1 jam. 2. Pecahkan cangkerang di atas ruang udara dan guntingkan satu lubang besar. Letakkan telur di dalam peti sejuk selama beberapa jam atau di dalam peti beku suhu – 20°C selama 1 jam. 3. 71 . Telur berembrio selepas penyuntikan virus dan pengeraman Forseps Pipet Pasteur Botol (steril) Larutan salin 0. 2. 3. N OTA Jika cecair amniotik didapati kurang. 2. 5. 4. Letakkan telur di dalam peti sejuk selama beberapa jam atau di dalam peti beku suhu – 20°C selama 1 jam. Lap tapak suntikan dengan alkohol. 3. 4. Gunakan pipet Pasteur untuk menolak embrio dan pundi kuning telur ke tepi dan kumpulkan cecair alantoik dengan menggunakan pipet Pasteur lain. Tatacara Mengumpulkan Cecair Amniotik BAHAN 1. Sedut dan keluarkan cecair daripada pipet beberapa kali sebelum dikumpulkan. Lap cangkerang di bahagian atas ruang udara telur dengan etanol. 6. tambahkan 0. Tatacara Pengambilan Membran Korioalantoik BAHAN 1. 5. 2. N OTA Telur disejukkan untuk membunuh embrio serta mengecutkan salur darah supaya pengumpulan cecair yang mengandungi virus dilakukan tanpa pencemaran dengan sel darah merah.TATACARA 1. Pegang pundi amniotik dengan forseps dan tembusinya dengan pipet Pasteur untuk mengeluarkan cecair amniotik daripada ruang amniotik.85% (steril) Etanol 70% TATACARA 1. Tanggalkan pita selofan yang menutupi tapak suntikan pada permukaan telur.85% (steril) TATACARA 1. Telur berembrio selepas penyuntikan virus dan pengeraman Gunting Piring Petri Forseps Larutan salin 0. 3. 2.

Cuci membran korioalantoik yang dikeluarkan di dalam larutan salin steril dan rentangkannya di dalam piring Petri. Pegang membran korioalantoik ini dan gunting di sekelilingnya sehingga semuanya terlepas daripada cangkerang. Pecahkan cangkerang di atas celah dengan bahagian pemegang gunting dan potong cangkerang sehingga ke pinggir ruang udara palsu. 6.4. 72 . 5.

asid – merah. Dalam ujian bakteriologi. sesuatu aktiviti biokimia ditentukan oleh enzim-enzim yang dihasilkan oleh bakteria. 2. Bakteria berbeza dalam jenis karbohidrat yang boleh digunakan sebagai sumber tenaga melalui proses fermentasi. kehadiran rekahan atau celah-celah di dalam agar atau melalui tindakan kimia yang menghasilkan terbitan yang berwarna dan tidak larut (misalnya H 2S). Oleh yang demikian. Dalam pengenalpastian bakteria. yang merangkumi proses kemusnahan dan proses pembinaan (atau sintesis). 3. jenis dan kuantiti asid campuran (mixed acids) – pelbagai jenis asid organik yang berasal dari asid piruvik yang dihasilkan serta kemampuan menghasilkan gas. beberapa kumpulan bakteria tertentu menghasilkan bahan pertengahan metabolisme yang spesifik seperti asetil-metil-karbinol berikutan fermentasi glukos yang boleh digunakan untuk membezakan kumpulan bakteria yang menghasilkannya daripada yang tidak. Misalnya. Ujian Fermentasi Gula: Penghasilan Asid dan Gas Fermentasi adalah suatu proses kimia yang melibatkan oksidasi-reduksi. Enzim juga boleh ditunjukkan dalam tindakan serologi yang menghasilkan kompleks enzim (sebagai antigen) – antibodi yang muncul sebagai presipitasi. Gas yang dihasilkan dikesan secara langsung melalui pengamatan penghasilan gelembung gas atau secara tidak langsung melalui penggantian cecair di dalam tiub Durham dengan gas. fermentasi dipastikan secara tidak langsung melalui pengamatan perubahan warna indikator pH akibat penghasilan asid. tidak semua ujian yang digunakan untuk menguji kebolehan sesejenis bakteria mendegradasikan secara enzimatik ‘gula’ menjadi produk asid merupakan proses fermentatif. Tatacara Ujian Fermentasi Gula: Penghasilan Asid dan Gas BAHAN 1. Hasilan bukan gas ditunjukkan oleh tindakan kimia yang menghasilkan terbitan yang berwarna. 4. dan substrat organik merupakan penerima terakhir elektron.1. PENGENALPASTIAN AGEN MIKROB UJIAN MAKMAL DALAM PENGENALPASTIAN BAKTERIA Bakteria mempunyai kisaran aktiviti biokimia yang amat luas. ataupun dari menggunakan substrat bukan karbohidrat. misalnya manitol adalah sejenis alkohol. Oleh yang demikian. Andrade: neutral – kuning pucat. faktor ini dengan spesifisiti sesejenis enzim terhadap substrat tertentu membolehkan bakteria dikenal pasti dalam keadaan sekeliling yang terkawal seperti di makmal.5. Walau bagaimana pun. 5. iaitu bukan fermentasi. Dalam hal ini sungguhpun tidak semua substrat yang digunakan dalam ujian fermentasi adalah gula. Kehadiran sesejenis enzim dikenal pasti secara tidak langsung melalui tindakannya terhadap sesuatu substrat. perbezaan ini merupakan salah satu ciri penting dalam pengenalpastian spesis bakteria. asid – kuning. istilah ‘fermentasi’ digunakan secara longgar dalam konteks ujian bakteriologi diagnostik. istilah gula meliputi senarai substrat berkenaan. bromthymol blue: neutral – hijau. Akan tetapi penurunan pH boleh dicapai melalui proses penggunaan karbohidrat yang bukan anaerobik. Aktiviti yang luas ini dikawal oleh faktor genetik serta alam sekelilingnya. alkalin – tanpa warna. Proses in berlaku dalam keadaan anaerobik. Dalam fermentasi karbohidrat beberapa produk dihasilkan termasuk pelbagai jenis asid dan gas. iaitu tanpa oksigen bebas. alkali – biru). Penghasilan asid ditunjukkan oleh perubahan warna indikator pH (sesuatu jenis pewarna) yang bergantung kepada jenis indikator yang digunakan (contoh. Daripada segi genetik. Hasilan aktiviti enzim ini boleh berupa gas atau terbitan bukan gas. Kultur bakteria pada plat agar Media cecair gula di dalam tabung reaksi atau botol Bijou Gelung dawai Penunu Bunsen 73 .

Eramkan pada 37°C selama semalaman. Gula yang digunakan adalah glukosa (0. 5. 4. 6.Media cecair gula: (media dasar yang mengandungi jenis-jenis gula atau karbohidrat tertentu dan indikator pH. Ulangkan inokulasi ke dalam media yang mengandungi gula lain. Sentuhkan pada 1 koloni bakteria pada media plat. Penghasilan gas Ujian positif: Ruang kosong di dalam tiub Durham Ujian negatif: Tiub Durham masih dipenuhi media Pentafsiran hasil positif: Bakteria menghasilkan gas semasa menfermentasi gula Ujian Tiga Gula-Besi Media tiga gula-besi atau Triple Sugar Iron ( TSI ) merupakan sejenis media campuran yang digunakan untuk membezakan spesies bakteria dalam famili Enterobacteriaceae dengan berdasarkan kepada kemampuan spesies-spesies ini untuk memfermentasi gula dekstros. Bahagian permukaan agar (agar condong) (slant) adalah terdedah kepada udara maka wujud dalam keadaan aerobik. Media TSI disediakan dalam agar condong. Tutup rapat media yang telah diinokulasi dan tunggangkan sekali supaya keseluruhan tiub Durham dipenuhi media dan sama sekali tidak mengandungi gelembung udara di dalamnya. 7. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN 1.8 (keadaan asid). Jika pada mulanya tiub ini hanya dipenuhi dengan media. setelah penghasilan gas oleh mikroorganisma. Sterilkan gelung dawai melalui pembakaran api penunu Bunsen dan biarkan sehingga dingin. penghasilan gas dan penghasilan hidrogen sulfid. 2.4 iaitu pH alkali maka warna agar kelihatan oren-kemerahan atau merah. adalah fenol merah yang akan menjadi kuning pada pH 6. 3. Biasanya media ini juga disertakan sejenis indikator pH. Sebaliknya. serta dilengkapi dengan tiub Durham) TATACARA 1.1%) . N OTA 1. Indikator pH. Penghasilan asid Ujian positif: Media berwarna merah Ujian negatif: Tanpa perubahan warna media Pentafsiran hasil positif: Bakteria dapat menfermentasikan gula berkenaan 2. Inokulasikan kultur ini ke dalam media cecair yang mengandungi sejenis gula. gas ini akan mengganti media yang dimaksudkan dan akan terperangkap di dalam tiub maka kehadiran ruang tanpa media menunjukkan kehadiran gas.0%) dan sukrosa (1. Tegakkan semula botol media. bahagian puntung agar (di bahagian dasar tabung) (butt) dilindungi dari udara dan wujud dalam keadaan anaerobik (walaupun bukan 100%). Tiub Durham adalah sebuah tabung/tiub kecil yang boleh dimuatkan di dalam botol Bijou dan diletakkan terbalik (dengan mulutnya di bawah). 2. Media cecair terdiri daripada gula 1% di dalam air pepton 1%. laktosa (1. Catatkan hasil selepas 24 jam pengeraman dan seterusnya pengeraman dilanjutkan selama beberapa hari sebelum hasilnya dinyatakan sebagai negatif. Amati perubahan warna media dan penghasilan gas (yang terperangkap di dalam tiub Durham). laktos atau sukros atau kombinasi daripada ketiga-tiga gula tersebut. Media TSI ditampan pada pH 7.0%). 3. sebagai penunjuk fermentasi. 74 .

Jika bakteria hanya boleh menfermentasi glukosa.1 75 . Eramkan semalaman dan teruskan selama 48 jam (jika perlu). Sukrosa dicampurkan untuk menyaringkan spesies Salmonella dan Shigella kerana kedua-dua bakteria ini tidak menfermentasi sukrosa atau laktosa. Penunu Bunsen (Reagen TSI: Dari sumber komersial) TATACARA 1. 2. Kultur bakteria 2. Cerun agar TSI di dalam tabung uji 3. Sentuhkan penghujung dawai kepada koloni bakteria. atau kedua-duanya difermentasi kuantiti asid yang dihasilkan daripada salah satu di antara kedua gula ini adalah besar kerana konsentrasi kedua-dua gula ini adalah tinggi iaitu masing-masing 1%. Jika laktosa atau sukrosa.Peptid dan asid amino yang berasal dari pepton di dalam media TSI didegradasikan melalui proses dekarboksilasi oksidatif kepada amina. 3. Dawai inokulasi lurus (dawai lurus) 4. Hidrogen sulfid yang dihasilkan akan bertindakbalas dengan ferrous sulfat dan suatu presipitasi hitam (ferik sulfid) akan terbentuk di dalam media. oksigen di dalam udara tidak dapat sampai maka proses dekarboksilasi oksidatif adalah pada tahap minimum. sejenis terbitan alkali. Tetapi di permukaan agar yang terdedah kepada oksigen udara. Sterilkan keseluruhan dawai lurus melalui pembakaran dan biarkan supaya sejuk. walaupun amina dihasilkan kuantiti asid yang dihasilkan terlalu besar untuk perubahan pH kembali kepada keadaan alkali maka bahagian condong mahupun bahagian puntung agar akan tetap berkeadaan asid (kuning). kuantiti asid yang dihasilkan adalah terhad kerana kuantiti glukosa yang digunakan adalah rendah (0.1%). kuantiti ini mencukupi untuk bahagian permukaan dan puntung agar menjadi kuning. 4. 5. Tatacara Ujian Tiga Gula Besi BAHAN 1. asid tidak dihasilkan dan warna merah akan kekal di seluruh media. Di bahagian puntung. pH asid di bahagian permukaan agar akan berubah semula menjadi alkali (ungu-merah) manakala bahagian puntung agar (bahagian dasar tabung) akan kekal asid (kuning) kerana di situ amina yang dihasilkan tidak mencukupi untuk mengatasi kesan asid. amina dihasilkan dan lama kelamaan (18-24 jam selepas pengeraman) kuantitinya mencapai aras yang mampu mengatasi kesan kuantiti rendah asid yang dihasilkan. Jadi. Tarik semula dawai dan gariskan organisma di atas permukaan agar yang condong. Penghasilan gas ditunjukkan dengan kehadiran gelembung gas atau bahagian puntung agar akan kelihatan pecah-pecah. Walau bagaimanapun. Tusukkan inokulum menembusi cerun agar TSI di dalam tabung sehingga ke dasarnya. Proses in dipercepatkan oleh bakteria yang tumbuh di bahagian permukaan agar. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Rujuk kepada Jadual 5. Jika bakteria yang diinokulasi tidak menfermentasi karbohidrat.

E.Arizona. Morganella morganii. Serratia Rupa Agar Tafsiran Condong Merah* Ungu-kemerahan Puntung Merah Kuning Tiada fermentasi gula Fermentasi glukosa Gas – – H 2S – – Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa + – Salmonella cholera-suis. Ujian Indol Bakteria menghasilkan indol (benzopyrrole) daripada asid amino triptofan akibat tindakan enzim triptofanase. mirabilis.JADUAL 5. Proteus rettgeri. Serratia Kuning . P. Providencia. Sungguhpun tindak balas kimia asas dalam pengesanan indol adalah sama. morganii.Klebsiella. Citrobacter. Kultur bakteria Air pepton di dalam tabung uji Broth triptofan di dalam tabung uji 76 .M.Ed-wardsiella Kuning Kuning Fermentasi glukosa & laktosa atau sukrosa – – Hafnia. enter itidis. Proteus mirabilis. Arizona. Klebsiella. S.1 Pola Hasil Tindakan Bakteria ke atas TSI Penghasilan Kemungkinan Bakteria (Jenis) Alcaligenes. cloacae. sonnei.Staphylococcus. Proteus rettgeri. Arizona * Atau tiada perubahan dan warna agar seperti warna sebelum diinokulasi N OTA 1. (Salmonella dan Shigella adalah urease-negatif. coli. 2. terdapat beberapa jenis reagen untuk mengesannya. 2.Providencia Kuning Kuning Fermentasi glukosa & laktosa atau sukrosa + + Proteus vulgaris.P. P. Oleh kerana sesetengah spesies Proteus dan beberapa spesies lainnya boleh memberikan reaksi pada TSI yang serupa dengan Salmonella ataupun Shigella. Citrobacter. S. Walau bagaimanapun. Indol bertindak dengan para-dimetil-aminobenzaldehid dan menghasilkan pewarna rosindole (warna merah tua). Edwardsiella Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa + + Salmonella typhimurium.S. urease-positif).vulgaris.enteritidis paratyphi. manakala Proteus. A. Streptococcus. reagen Kovac merupakan yang paling popular digunakan di masa kini. maka untuk membezakan spesies-spesies ini ujian urease dilakukan. proteus rettgeri. Mimae Shigella dysenteriae. Shigella Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa _ + Salmonella typhosa. Tabung TSI harus ditutup secara longgar sahaja selepas diinokulasi supaya udara dapat masuk ke dalam tiub kultur untuk membolehkan berlakunya oksidasi dan perubahan balik condong agar daripada asid (kuning) ke alkali (ungu-kemerahan). Proteus mira bilis. vulgaris.Citrobacter. schottmuelleri.S. Tatacara Ujian Indol BAHAN 1. 3. Pseudomonas.Providencia. Kuning Fermentasi glukosa & laktosa atau sukrosa + – Aerobacter aerogenes.

4. TATACARA 1. Dalam penciptaan ujian metil-merah. media diuji biasanya dicampurkan kloroform sejenis bahan kimia yang toksik. 5. Kultur bakteria 2. 2. Eramkan selama 24 – 48 jam. 4. Reagen ini stabil selama beberapa tahun. Broth MR-VP di dalam tabung uji 4. Amatilah pembentukan lapisan warna (cincin) pada permukaan suspensi. Air pepton 3. N OTA Di samping reagen Kovac. 3. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Merah tua Ujian negatif: Kuning Pentafsiran hasil positif: Penghasilan indol akibat degradasi protein triptofan oleh bakteria. Pipet Pasteur (steril) Reagen Kovac PERSEDIAAN Reagen Kovac Masukkan 10 g p-dimetilaminobenzaldehid ke dalam 150 ml alkohol jenis amilalkohol. Goncang dan biarkan selama 10 minit. dalam ujian yang menggunakan reagen Ehrlich.4. Ciri ini digunakan untuk membezakan di antara spesies bakteria yang menghasilkan asid ‘kuat’ (strong acids) dalam kuantiti besar dan spesies bakteria yang tidak berbuat demikian. Metil-merah (Media MR-VP: Dari sumber komersial) 77 . Masukkan 2 titis suspensi ini ke dalam broth triptofan. Ujian Metil-Merah Metil-merah pada pH neutral dan asid sederhana (nilai 7-6) berwarna kuning tetapi menjadi merah pada pH yang agak rendah iaitu di bawah nilai 4.4 manakala bakteria yang menggunakan tapak jalan fermentasi butilena glikol tidak menghasilkan asid. Ujian indol yang dilakukan dengan reagen Kovac tidak memerlukan kloroform. 6. Tatacara Ujian Metil-Merah BAHAN 1. asetik. Simpan di dalam botol gelap dengan penutup kaca di dalam peti beku.5 ml) reagen Kovac (berwarna kuning). Dengan perlahan dan hati-hati campurkan 50 ml HCl pekat (Lakukan di dalam kabinet asap). 5. reagen Ehrlich juga boleh digunakan dalam ujian Indol. Reagen ini berwarna kuning muda. laktik) yang mencukupi untuk menurunkan pH media di bawah nilai 4. kepekatan komponen media yang sesuai untuk ujian metilmerah serta ujian Voges Proskauer telah ditentukan dan media untuk kedua-dua ujian ini kemudian dipasarkan sebagai media MR-VP (Methyl Red – Voges Proskauer). Masukkan 5 titis (~ 0. Walau bagaimanapun. Bakteria yang menggunakan tapak jalan fermentasi asid campuran dalam katabolisme glukosa biasanya menghasilkan kuantiti pelbagai jenis asid organik (formik. Panaskan di dalam penganggas air pada 56°C sehingga larut. Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. isoamilalkohol atau butilalkohol. Biarkan sehingga dingin.

0 ml broth MR-VP. 7. warna pertengahan di antara kuning dan merah tidak dianggap positif. 2. Tatacara Ujian Voges-Proskauer BAHAN 1. Eramkan pada 37°C selama 24 – 48 jam. Amati pembentukan warna. 4. Goncang dengan baik dan biarkan selama 5 – 20 minit. 6.PERSEDIAAN Reagen metil-merah Larutkan 0. Goncang dan biarkan seketika. N OTA 1. 2. Inokulum yang tebal adalah penting supaya kuantiti asid yang besar dapat dihasilkan untuk membolehkan ujian dibaca berikutan pengeraman selama 18-24 jam. Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. 3. 3. 6. 78 . 5. 3. ujian diulangi ke atas kultur dengan pengeraman yang lebih lama. Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. 4. Ujian Voges-Proskauer Asetil-metil karbinol (atau asetoin) adalah metabolit pertengahan/perantaraan dalam proses penghasilan butilena glikol pada fermentasi glukosa. Pentafsiran hasil positif: Menunjukkan penghasilan asid dalam kuantiti tinggi hasil fermentasiglukosa oleh bakteria. Warna oren. Tambahkan 0.2 ml larutan KOH. Amatilah pembentukan warna di permukaan media PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Warna merah jambu sehingga merah. 5. Masukkan 2 titis metil-merah ke dalam setiap 0. Dalam kehadiran KOH dan oksigen (dari udara) asetoin secara spontan (tidak melibatkan enzim) dioksidasi menjadi metabolit pertengahan. 2.5 ml kultur. Penghasilan asetoin merupakan salah satu kriteria dalam fermentasi glukosa oleh bakteria yang digunakan dalam pengenalpastian.6 ml larutan a -naftol. TATACARA 1. 2. Masukkan 2 titis suspensi ini ke dalam 0.5% kreatin) TATACARA 1. Sensitiviti ujian ini dipertingkatkan dengan penambahan a -naftol. diasetil. 4. Masukkan dua titis suspensi ini ke dalam 1.5 ml) di dalam tabung uji a -naftol 5% dalam alkohol pekat 95% KOH (40% yang mengandungi 0. 3. Jika hasil yang kurang pasti didapati. Ujian negatif: Warna kuning. Campurkan air suling sehingga 500 ml. Kultur bakteria Air pepton Broth MR-VP (0.1 g metil-merah di dalam 300 ml etanol 95%.5 ml broth MR-VP. Eramkan selama 24 jam pada 37°C. 5. Diasetil kemudian bertindak dengan kumpulan NH2 bebas daripada kumpulan guanidina (kreatin adalah sumber kumpulan guanidina) untuk menghasilkan kompleks berwarna merah. Masukkan pula 0.

Streptococcus pyogenes (atau streptokokus kumpulan A Lancefield) sensitif terhadap Bacitracin. Kadangkala tindak balas mengambil masa yang lama (~ 2 jam) sebelum kemunculan warna yang dimaksudkan. sejenis antibiotik.PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Merah. N OTA Oleh kerana suatu perubahan warna akan berlaku di antara permukaan campuran kultur dan reagen. Ujian negatif: Tiada perubahan atau kuning. Ujian ini menunjukkan korelasi yang rapat dengan ujian kelarutan hempedu. Agar darah 3. Kesimpulannya. Gelung dawai 5. Pentafsiran hasil positif: Kehadiran asetil-metil-karbinol (asetoin). Sensitiviti terhadap Optochin (ethylhydrocuprein hydrochloride) pula digunakan untuk membezakan Streptococcus pneumoniae daripada streptokokus a -hemolitik lainnya. 79 . Ujian Sensitiviti Terhadap Bacitracin dan Optochin Sensitiviti terhadap Bacitracin. Kajian yang telah dilakukan menunjukkan bahawa kebanyakan streptokokus kumpulan A (93-98%) sensitif terhadap konsentrasi rendah Bacitracin dan sebaliknya streptokokus bukan kumpulan A amnya resistan. Pneumokokus (Streptococcus pneumoniae) selain larut di dalam hempedu. maka elakkan daripada menggerak-gerakkan tabung sehingga membolehkan warna tersebut muncul segera selepas reagen dicampurkan dan tabung digoncang supaya sebati. Tatacara Ujian Sensitiviti Terhadap Bacitracin dan Optochin BAHAN 1. Ambil 1 koloni bakteria streptokokus b-hemolitik dan buat garisan-garisan pada permukaan agar darah. suatu hasil pertengahan dalam proses fermentasi glukosa oleh sesetengah bakteria. Letakkan secara aseptik dengan menggunakan jarum atau forseps steril 1 disk Bacitracin ke atas agar sejurus sebelum pengeraman kultur. Disk Bacitracin dan disk Optochin (Reagen Bacitracin dan Optochin: Dari sumber komersial) TATACARA 1. adalah sensitif terhadap Optochin dan menghasilkan zon rencatan pertumbuhan di sekeliling disk tersebut. Kultur bakteria 2. Swab (steril) 4. streptokokus selain daripada kedua spesies ini menunjukkan keresistanan sama ada terhadap Bacitracin bagi kumpulan b-hemolitik atau terhadap Optochin bagi kumpulan a -hemolitik menurut ujian yang dilakukan di atas. manakala Streptococcus pneumoniae sensitif terhadap Optochin. Streptokokus a -hemolitik yang lainnya pula tumbuh sehingga mencapai ke pinggir disk atau kadangkala hanya menghasilkan zon rencatan pertumbuhan yang biasanya dibaca sebagai resistan. Sebaliknya. 2. Sapukan permukaan agar dengan menggunakan swab steril pada arah 90° daripada arah garisan pertama bakteria untuk mendapatkan lapisan bakteria yang tersebar dan sama rata di atas permukaan media. digunakan untuk membezakan streptokokus kumpulan A Lancefield daripada streptokokus b-hemolitik lainnya. 3. Jarum/forseps steril 6.

Agar nutrien 3. Ujian Keperluan Faktor Tumbesaran X dan V Disk kertas yang diserap dengan faktor tumbesaran digunakan untuk membezakan antara spesies bakteria genus Haemophilus. Inokulasi seluruh permukaan plat agar nutrien dengan bakteria berkenaan dengan menggaris-gariskannya menggunakan gelung dawai. Disk Optochin jenama Oxoid. code DD1: 5 mm atau lebih zon perencatan yang diukur dari tepi disk. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif Bacitracin: Ujian positif Optochin: Pentafsiran hasil positif: Zon perencatan pertumbuhan. tepat pada jam 8. saiz yang bergantung kepada kepekatan reagen yang digunakan. disk faktor V : tepat pada jam 4.4. jika perlu dalam atmosfera CO2 5-10%. Swab (steril) 5. Disk dengan 15 mg Optochin: 18 mm atau lebih dari tepi disk. Kultur bakteria 2. dan X bersama V tertentu menandakan ia memerlukan faktor tersebut dan sebaliknya. 3. Bakteria sensitif terhadap Bacitracin/Optochin. ia tidak mempunyai kemampuan untuk mensintesis faktor berkenaan dalam kuantiti yang optimum. 5. XV (Disk faktor X. 80 . 6. manakala disk XV. 5. Ulangi kaedah di atas dengan menggunakan kultur streptokokus a -hemolitik dan disk Optochin. Gelung dawai 6. Tekan disk pada permukaan agar dengan forseps atau jarum steril supaya tidak tanggal. V. juga dinamakan koenzim I) supaya pertumbuhan bakteria dapat berlaku. Air pepton 4. Jarum/forseps (steril) 7. 4. Koloni spesies bakteria yang menunjukkan pertumbuhan di sekeliling disk yang mengandungi faktor tumbesaran X. Eramkan pada suhu 37°C selama 18 dan teruskan sehingga 48 jam. Letakkan disk-disk yang mengandungi faktor tumbesaran secara aseptik di atas agar kirakira 1 atau 2 cm daripada pinggir media dalam pola sebagai berikut: misalnya disk Faktor X : tepat pada titik jam tangan yang menunjukkan jam 12. Buat suspensi murni bakteria di dalam air pepton. Tatacara Ujian Keperluan Faktor Tumbesaran X dan V BAHAN 1. Spesies Haemophilus dan Bordetella boleh dikenal pasti berdasarkan sama ada media dasar memerlukan penambahan faktor tumbesaran X (hemin) dan faktor V (NAD. Amati zon perencatan pertumbuhan bakteria. Disk faktor X. Disk dengan dua unit Bacitracin: 15 – 20 mm garis pusat (termasuk garis pusat disk). V. Pengeraman seharusnya dilakukan dalam CO 2 5-10% untuk mencapai pertumbuhan optimum. Amati kehadiran atau tidaknya pertumbuhan di sekeliling disk. Eramkan pada 37°C selama 18 sehingga 24 jam. V dan XV : Dari sumber komersial) TATACARA 1. 7. 2.

Perhatikan bahawa media yang digunakan berupa media minimum. dan hasil ujian dinyatakan sebagai positif untuk sitrat. H. Pengubahsuaian ini membolehkan pertumbuhan bakteria dikesan dengan lebih mudah kerana dalam metabolisme karbon pada sitrat (pertumbuhan positif). dan natrium sitrat sebagai sumber tunggal karbon. Kadangkala bacaan hasil ujian tidak semata-mata berdasarkan kepada perubahan warna. Perubahan warna. pertussis. JADUAL 5. B. H. suatu tindak balas alkali berlaku dan ini ditunjukkan dengan perubahan pada warna media daripada hijau kepada biru tua. H. yang kelihatan hijau pada pH 6. mempermudahkan lagi pembacaan hasil ujian. Elakkan daripada menggunakan agar darah. manakala yang tidak memerlukan faktor X atau V adalah B. Bakteria golongan aerogen boleh menggunakan sitrat sebagai sumber karbon. Seterusnya. 2. apatah lagi agar coklat dalam melakukan ujian ini. tetapi sama ada terdapat atau tidaknya pertumbuhan bakteria pada garis inokulasi di atas media. bromthymol blue. hasilnya ditafsir berdasarkan berlakunya kekeruhan pada media broth akibat pertumbuhan bakteria. iaitu agar nutrien yang mana spesies-spesies yang diuji tidak mungkin tumbuh padanya tanpa penambahan faktor tumbesaran tertentu. Simpan disk pada suhu 4°C dan bukan pada 0°C. dalam hal ini.1 Keperluan bakteria untuk faktor X dan V Pertumbuhan Berlaku Dengan Faktor: Spesies – H. manakala golongan koliform tidak.6.PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Pertumbuhan di sekeliling disk dengan: Faktor X dan XV – memerlukan faktor X sahaja Faktor V dan XV – memerlukan faktor V sahaja Faktor XV sahaja – memerlukan faktor X mahupun faktor V Bakteria yang memerlukan faktor X dan V atau salah satu di antaranya adalah spesies Haemophilus. H. influenzae parainfluenzae aegyptius ducreyi hemolyticus parahemolyticus pertussis – – – – – – + X – – – + + – + V – + – – + + + XV + + + + + + + N OTA 1. H. Penggunaan Sitrat Koser mencipta sejenis media broth asas yang mengandungi natrium ammonium fosfat sebagai sumber tunggal nitrogen. Dalam ujian yang menggunakan media Koser.8 dan biru pada pH lebih 7. 81 . Kehadiran pertumbuhan bererti kemampuan bakteria mengurai sitrat sebagai sumber karbon. Simmons mengubahsuai media Koser tersebut dengan menambahkan agar dan indikator.

Ujian Penggunaan Sitrat
BAHAN

1. Kultur bakteria 2. Dawai lurus 3. Cerun agar sitrat Simmons di dalam botol Bijou (Agar sitrat Simmons: Dari sumber komersial)
TATACARA

1. 2. 3. 4. 5.

Sterilkan keseluruhan dawai lurus dan biarkan sehingga sejuk. Sentuhkan pada koloni bakteria dengan penghujung dawai. Buatkan 1 garisan tipis bakteria pada permukaan agar. Eramkan pada 37°C selama semalaman atau 48 jam, jika perlu. Amatilah perubahan warna pada media.

PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN

Ujian positif: Pertumbuhan dengan/tanpa media menjadi biru. Ujian negatif: Tiada pertumbuhan atau media tetap hijau. Pentafsiran ujian positif: Kemampuan menggunakan sitrat sebagai sumber tunggal karbon.
N OTA

1.

2. 3.

Gunakan sedikit sahaja inokulum supaya semasa penginokulasian inokulum ini tidak kelihatan sama sekali pada garis inokulasi dan untuk mengelakkan reaksi positif palsu akibat bakteria yang mati membebaskan karbon dan nitrogen dalam kuantiti yang boleh menampung pertumbuhan. Elakkan daripada mengambil sebarang bahan nutrien daripada media kultur di mana inokulum diambil. Kultur yang menunjukkan pertumbuhan tanpa perubahan pH (perubahan warna) juga dianggap positif kerana pada sesetengah bakteria yang lambat tumbuh keadaan tindak balas alkali tidak dapat dicapai dalam tempoh pengeraman yang ditetapkan. Pengeraman selama 48 jam mungkin diperlukan untuk bakteria yang lambat tumbuh supaya warna biru dapat muncul.

Ujian Urease Urea adalah substrat spesifik yang dihidrolisis oleh enzim urease kepada ammonia dan karbon dioksida. Ammonia menyebabkan campuran tindak balas menjadi alkali. Tanda kehadiran urease dapat dikesan melalui indikator pH yang menunjukkan perubahan warna media daripada oren (pH 6.8) kepada merah jambu (pH 8.1) Ujian untuk mengesan penghasilan enzim urease oleh bakteria biasanya digunakan dalam pengenalpastian bakteria genus Proteus. Walau bagaimanapun, bakteria-bakteria lain yang juga penting dalam perubatan mempunyai kemampuan untuk menghasilkan urease. Terdapat beberapa jenis ujian urease dengan sensitiviti yang berbeza-beza. Tahap sensitiviti ini ditentukan terutamanya oleh kandungan larutan penampan. Pemilihan dari segi jenis ujian ini adalah bergantung kepada kegunaannya. Oleh kerana pH media boleh ditingkatkan melalui sesuatu tindak balas lain, maka hasil positif palsu untuk urease memang terdapat. Untuk mengesan keadaan seperti ini ujian kawalan terhadap media yang tidak mengandungi urea diperlukan.

82

Tatacara Ujian Urease
BAHAN

1. 2. 3. 4. 5.

Kultur bakteria Air pepton Broth urea di dalam botol Bijou Gelung dawai Pipet Pasteur steril

TATACARA

1. 2. 3. 4.

Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. Masukkan 2 titis suspensi ini ke dalam broth urea. Eramkan selama 24 jam. Amati warna broth urea.

PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN

Positif: Merah. Negatif: Kuning. Pentafsiran hasil positif: Kehadiran enzim urease yang menghidrolisis urea kepada ammonia. Ujian Oksidase Ujian oksidase menentukan kehadiran sitokrom C, sejenis enzim respiratori. Oleh yang demikian, ujian ini hanya positif untuk bakteria yang memiliki sitokrom C. Sitokrom adalah protein yang mengandungi heme dan merupakan enzim oksidatif dalam kitaran respiratori yang terlibat dalam fosforilasi oksidatif. Dalam ujian oksidase tatacara Kovacs, reagen oksidase adalah tetrametil-pfenilena-diamina dihidroklorida 1%. Enzim oksidase sitokrom tidak bertindak secara langsung dengan reagen oksidase, tetapi menyebabkan oksidasi sitokrom C yang kemudian menyebabkan oksidasi tetrametil-p-fenilena-diamina dihidroklorida sehingga membentuk sejenis bahan kimia berwarna biru yang disebut biru Wunster. Sitokrom C yang direduksi (ditambah elektron) dalam tindakan ini diubah secara tidak langsung kepada bentuk yang teroksidasi oleh oksidase sitokrom yang menerima elektronnya. Enzim oksidase sitokrom kemudian menggantikan elektron tersebut kepada oksigen untuk menghasilkan air dengan ion hidrogen. Ujian ini digunakan untuk membezakan streptokokus (oksidase-negatif) daripada neisseria (oksidase-positif). Tatacara Ujian Oksidase
BAHAN

1. 2. 3. 4. 5.

Kultur bakteria Slaid mikroskop Kepingan kecil kertas turas Whatman No. 1 Reagen oksidase (tetrametil-p-fenilena-diamina dihidroklorida 1%) Kayu aplikator

TATACARA

1. 2.

Letakkan sekeping kertas turas kecil di atas slaid mikroskop bersih. Titiskan 2 hingga 3 titis reagen oksidase ke atas kertas turas.

83

3. 4.

Ambil koloni bakteria dengan kayu aplikator dan goreskan ke atas kertas turas pada bahagian yang menyerap reagen oksidase. Amati kemunculan warna dalam beberapa saat.

PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN

Kemunculan warna lavender (ungu pudar) yang cepat (dalam beberapa saat) menjadi biru/ungu. Ujian negatif: Tiada perubahan warna atau warna muncul hanya setelah beberapa minit. Pentafsiran hasil positif: Perubahan segera ke warna biru/ungu menunjukkan bakteria memilikim sitokrom C.
N OTA

Ujian positif:

1.

2. 3.

4. 5.

Reagen ini mesti disediakan segar kerana sifatnya yang tidak stabil. Auto-oksidasi oleh oksigen bebas dari udara boleh berlaku dan oleh yang demikian reagen ini dengan sendirinya akan berubah menjadi biru atau ungu jika dibiarkan di udara agak lama. Reagen yang baru disediakan perlu dibiarkan selama 15 minit untuk menjadi “masak” sebelum digunakan. Pastikan dan patuhi tempoh masa yang ditetapkan untuk mentafsirkan hasil ujian ini kerana pada ujian yang disimpan lama sebelum dibaca hasil positif palsu boleh berlaku kerana warna biru atau ungu boleh muncul akibat auto-oksidasi yang berlaku ke atas reagen. Gunakan kayu aplikator atau dawai platinum untuk mengambil koloni. Dawai nikrom juga boleh mempengaruhi hasil ujian dan memberikan hasil positif palsu. Tatacara alternatif ujian oksidase ini adalah dengan membanjiri kultur pada piring Petri dengan reagen dan kemudian segera menyingkirkan bahan yang berlebihan ini dengan pipet. Hasilnya ditunjukkan dengan perubahan warna koloni bakteria kepada warna ungu (oksidase-positif) atau tiada perubahan warna (oksidase-negatif).

Ujian Koagulase Ujian untuk menentukan penghasilan enzim koagulase oleh stafilokokus adalah suatu ujian penting dalam mikrobiologi diagnostik. Ia membezakan stafilokokus patogenik kerana berkemampuan untuk menghasilkan enzim ini, daripada yang tidak menghasilkannya atau tidak patogenik. Terdapat dua jenis koagulase; yang satu terikat pada dinding sel bakteria (koagulase terikat) dan tidak bebas, dan yang satu jenis lagi dirembeskan oleh sel ke dalam media atau cairan (koagulase bebas). Ujian slaid di mana penggumpalan atau pengelompokan bakteria dihasilkan dipercayai disebabkan oleh koagulase terikat yang terdapat pada dinding sel. Enzim bentuk ini bertindak secara langsung ke atas fibrinogen haiwan-haiwan tertentu dan menghasilkan fibrin yang memerangkap bakteria sehingga berlakunya penggumpalan/pengelompokan tersebut. Sebaliknya, koagulase yang dihasilkan secara bebas bertindak dengan protrombin untuk menghasilkan trombin, yang seterusnya bertindak ke atas fibrinogen untuk menghasilkan fibrin (pembekuan). Tatacara Ujian Koagulase Slaid
BAHAN

1. 2. 3. 4. 5.

Kultur bakteria Larutan salin 0.85% Slaid mikroskop Gelung dawai Plasma arnab

84

supaya hasil ujian boleh dipercayai dan diterima tanpa ragu-ragu. Pentafsiran hasil positif: Bakteria memiliki enzim koagulase. Tambahkan setitis plasma arnab kepada suspensi dan campurkan dengan gelung dawai. 6. 6.TATACARA 1. Plasma perlulah diuji terlebih dahulu dengan strain kawalan positif dan negatif sebelum digunakan. N OTA 1. Seterusnya. Sediakan 1:9 pencairan plasma arnab atau manusia di dalam larutan salin. adalah amat penting untuk mempastikan bahawa bakteria yang diuji adalah benar-benar kultur murni stafilokokus. 2. Tatacara Ujian Koagulase Tabung BAHAN 1. aureus yang menghasilkan hanya koagulase bebas yang tidak bertindak dalam ujian koagulase slaid. 4. 2. Sediakan suspensi stafilokokus di dalam larutan salin (atau gunakan kultur broth). 5. 2. 3. Kultur bakteria Larutan salin 0. Ujian negatif: Tiada penggumpalan dan suspensi bakteria kelihatan homogen. 5. 3. Oleh yang demikian. positif lemah dan kawalan negatif. 3. Pastikan koloni bakteria boleh diemulsifikasi di dalam salin supaya tidak menimbulkan masalah dalam pembacaan hasilnya nanti. Mana-mana bakteria yang boleh menggunakan sitrat sebagai sumber tenaga boleh membebaskan kalsium yang akan mengakibatkan pembekuan plasma jika plasma tersebut diambil daripada darah yang bercampur sitrat. Gunakan plasma arnab atau manusia dan bukan spesies mamalia lain kerana kebanyakan plasma daripada spesies lain tidak bertindak dengan koagulase stafilokokus. Campurkan 1 isipadu suspensi bakteria dengan 5 isipadu larutan plasma. Hasil positif yang berlaku lewat atau negatif diuji semula dengan ujian koagulase tabung kerana terdapat strain S. 2. Buatkan suspensi bakteria ini di dalam titisan salin. Ambil beberapa koloni bakteria dengan gelung dawai steril. 4. 85 . Letakkan setitis larutan salin steril di atas sebuah slaid mikroskop yang bersih dan kering. Ujian positif palsu boleh berlaku jika penggumpalan yang berlaku lewat diambil kira. Goncangkan slaid dan amatilah penggumpalan (clumping) bakteria yang akan kelihatan sebagai kelompak-kelompak putih dalam masa 15 saat. ujian haruslah dilakukan juga ke atas beberapa jenis bakteria kawalan yang memberikan hasil positif kuat. 3. dan ujian ini digunakan semata-mata untuk membezakan antara strain yang menghasilkan koagulase daripada yang tidak. Perlu juga diperhatikan bahawa kadangkala plasma manusia yang digunakan mengandungi bahan perencat yang akan memberikan hasil negatif palsu. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pembentukan gumpalan bakteria.85% Tabung uji steril Gelung dawai Plasma arnab Penganggas air pada 37°C TATACARA 1. 5. 4.

3 dan 6 jam dan selepas semalaman. aureus yang kadar penghasilan koagulasenya adalah rendah maka masa yang panjang diperlukan untuk koagulase mencapai aras yang memberi hasil yang positif (hasil positif yang lewat) Ujian Katalase Katalase adalah enzim dengan bahagian (moieti) yang mengandungi besi. Jangan campur dengan goncangan. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pembentukan pembekuan. Sesetengah strain stafilokokus menghasilkan enzim fibrinolisin yang akan melisis semula pembekuan plasma yang dihasilkan. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Penghasilan dan pembebasan gas dengan cepat dicirikan dengan gelembunggelembung gas yang dibebaskan dengan rancak. Kultur bakteria Slaid mikroskop Kayu aplikator Hidrogen peroksida 3% TATACARA 1. Untuk mengelakkan daripada memperolehi hasil yang negatif palsu. 4. 5. Tindak balas kimia yang berlaku dalam ujian katalase adalah : 2H 2O 2 Æ 2H 2O + O2 • Penghasilan gelembung gas . Tatacara Ujian Katalase BAHAN 1. Letakkan setitis larutan hidrogen peroksida di atas sebuah slaid kaca bersih dan kering. jika masih negatif. Masukkan organisma ke dalam titisan reagen di atas slaid. 2. tabung haruslah diamati beberapa kali di sepanjang tempoh pengeraman. Pembekuan jika hadir. tabung uji dicondongkan. Ujian negatif: Campuran tetap cair. Untuk memudahkan pembekuan diamati.4. rancak dan berterusan. Amatilah kehadiran gelembung-gelembung gas yang dihasilkan dengan cepat. Spesimen yang memberi hasil negatif pada masa pengeraman 6 jam dieramkan semula semalaman kerana terdapat strain S. akan kekal di dasar tabung uji. 3. 2. 86 . Ujian katalase digunakan khususnya untuk membezakan antara stafilokokus (katalase positif) dengan streptokokus (katalase negatif) dan juga kadangkala digunakan dalam pengenalpastian pelbagai jenis bakteria. 2. Eramkan pada suhu 37°C di dalam penganggas air dan amati selepas 1. 4. Pastikan tabung tidak digoncang semasa mengamati dan membaca hasil ujian (penghasilan pembekuan) kerana ini akan mengakibatkan pembekuan menjadi terlerai dan tidak dapat dikesan. 3. 3. (oksigen) adalah tanda bagi ujian yang positif. Sentuhkan penghujung kayu aplikator kepada koloni bakteria. Campurkan dengan memutarkan tabung uji di antara kedua dua tapak tangan. Pentafsiran hasil positif: Bakteria memiliki enzim koagulase N OTA 1.

Sesetengah bakteria yang menghasilkan H2S tidak dapat tumbuh pada media yang mengandungi terbitan ferum (besi). 2. Serapkan sekeping kertas turas dengan plumbum asetat 5% dan biarkan sehingga kering. 5. Gas H 2S yang dibebaskan akan dikesan melalui perubahan warna kertas putih kepada warna hitam akibat pembentukan plumbum sulfida. Gunakan H 2 O 2 pada kepekatan 3% untuk mendapatkan hasil ujian yang terbaik atau optimum. 2. Kultur bakteria Cerun agar nutrien di dalam tabung Dawai lurus Kertas turas Plumbum asetat 5% TATACARA 1. Penghasilan segelintir gelembung kecil selepas 20-30 saat tidak dianggap positif. Larutan H2O2 disimpan di dalam botol gelap di dalam peti beku. 2. 3. 87 . Ujikan juga se-bahagian daripada plat agar yang belum diinokulasi dengan bakteria dengan menuangkan sedikit reagen di atasnya sebelum meneruskan dengan ujian katalase plat ini untuk mengelak-kan hasil positif palsu. Seboleh-bolehnya elakkan daripada mengambil koloni yang tumbuh pada permukaan media agar darah. Kertas ini hanya diletakkan pada sisi mulut tabung di atas kultur bakteria pada agar condong. 5. Penghasilan H2S oleh sesejenis bakteria menandakan keupayaan bakteria tersebut untuk mereduksi sulfur kepada sulfida. Jangan gunakan kultur yang berusia lebih daripada 24 jam untuk mengelak daripada memperolehi hasil negatif palsu kerana enzim ini hanya dapat dikesan pada kultur hidup yang masih segar dan mungkin tiada lagi pada kultur tua. Gariskan bakteria ke atas cerun agar di dalam tabung uji. Ujian katalase plat: Ujian ini boleh dilakukan ke atas koloni di atas plat kultur dengan me-nuangkan reagen ke atas koloni berkenaan KECUALI jika media kultur tersebut adalah agar darah kerana ia boleh memberikan hasil positif palsu. Oleh yang demikian. dedahkan kultur kepada udara selama setengah jam sebelum ujian dilakukan untuk membolehkan oksidasi aerobik ke atas katalase yang tereduksi berlaku. Ini untuk mengelakkan daripada terambil bersama sel darah dan mendapatkan hasil yang positif palsu seperti di atas. 6. 4. sekiranya hal ini tidak dapat dielakkan. Ini adalah kerana sesetengah media mungkin mengandungi sedikit katalase yang boleh memberikan tindak balas yang lemah dan lambat serta boleh menyulitkan pembacaan hasil. Tatacara Ujian Penghasilan Hidrogen Sulfida BAHAN 1. 4. Pada kultur anaerobik. Tetapi. NOTA 1. Penghasilan Hidrogen Sulfida Bakteria boleh menghasilkan H 2S daripada terbitan sulfur organik yang didapati di dalam pepton yang digunakan atau daripada terbitan sulfur tak organik yang dicampurkan dengan media kultur. Perlu ditekankan di sini bahawa darah juga mengandungi enzim katalase yang dapat bertindak balas dengan reagen. tanpa menyentuh permukaan agar tersebut kerana plumbum asetat boleh menghalang pertumbuhan sesetengah bakteria. 3. berhati-hatilah dalam pengambilan tersebut untuk mempastikan hasil yang tepat dan betul.Ujian negatif: Tiada sebarang tindak balas. Jangan gunakan dawai gelung kerana positif palsu boleh berlaku. H2S yang dihasilkan oleh bakteria golongan ini dikesan dengan kertas yang diserapkan dengan larutan plumbum asetat 5%. Pentafsiran hasil positif: Bakteria memiliki enzim katalase.

Pentafsiran hasil positif: Bakteria boleh menghasilkan H2S daripada sulfur. Antitoksin Clostridium perfringens (Cl. Sebarkan antitoksin ini sama rata ke atas permukaan setengah plat agar dan biarkan ia meresap dan kering. Gelung dawai (Reagen agar Nagler dan kuning telur : Dari sumber komersial) TATACARA 1. welchii) (antibodi anti-lesitinase) 8. Enzim lesitinase C menghidrolisis lesitin (lecithin-phosphatidyl choline) kepada fosforilkolin dan sejenis digliserid. vitellenin) daripada kuning telur yang mempresipitasikan lemak bebas. Campurkan emulsi “kuning telur pekat” (Difco: SR47) untuk mencapai kepekatan 5% dan tuangkan agar campuran ini ke dalam sebuah piring Petri. Eramkan secara anaerobik. 4. perfringens pada setengah bahagian daripada media plat. Agar nutrien 3. 2. Ekstrak Fildes 5. 6. Cairkan 20 ml agar nutrien yang steril (Difco: Blood Agar Base CM55). Emulsi kuning telur pekat 6. Gantung kertas ini pada sisi mulut tabung uji dan pastikan kertas ini tidak menyentuh permukaan agar. Piring Petri 7. Titiskan 2 titis antitoksin (antilesitinase) Cl. Enzim ini juga bertindak ke atas fosfolipid lainnya. Eramkan pada 37°C semalaman. Kultur bakteria 2. Penganggas air pada 50°C 4. Biarkan kering. welchii) sungguhpun terdapat laporan yang menyatakan bahawa bakteria lain seperti Pseudomonas aeruginosa juga boleh menghasilkan enzim ini. 3. hasilnya menunjukkan kehadiran suatu zon opalesens (antibodi anti-lesitinase) di sekeliling koloni yang menandakan penghasilan lesitinase oleh bakteria.3. Swab (steril) 9. dan lesitinase A. Selepas pengeraman. Ujian hasil negatif: Tiada perubahan warna pada kertas. Turunkan suhu kepada 50°C dengan membiarkan media di dalam penganggas air selama 15 minit. 7. Ujian Nagler Penentuan penghasilan enzim lesitinase oleh bakteria adalah berfaedah dalam pengenalpastian bakteria genus Clostridium khususnya Clostridium perfringens (Clost. B dan D juga bertindak ke atas lesitin tetapi terhadap terbitan-terbitan lain yang dihasilkan. 88 . Campurkan 1 ml ekstrak Fildes. Fenomena ini kali pertama dilaporkan oleh Nagler yang pada waktu itu menggunakan serum sebagai sumber lesitin. Buatkan 1 garisan bakteria melintasi kedua-dua bahagian setengah plat agar ini (bahagian yang disapu antitoksin dan yang tidak). 8. 5. Ujian Nagler pada mulanya dilakukan dengan menumbuhkan bakteria pada media agar kuning telur. Mekanisme penghasilan opalesens dipercayai disebabkan oleh tiga faktor iaitu lemak digliserid yang dihasilkan. lemak bebas daripada kuning telur selepas lesitin dihancurkan dan protein tak larut air (vitellin. Tatacara Ujian Nagler BAHAN 1. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian hasil positif: Kertas menjadi hitam. 4.

89 . secara tradisi ujian ini dimasukkan ke bahagian ujian biokimia. Penganggas air 50°C 6. 8. Serum lembu 7. Walau bagaimanapun. Turunkan suhu kepada 50°C dengan membiarkan di dalam penganggas air selama 15 minit. Ujian negatif: Tidak terbentuk zon opalesens di sekeliling koloni pada keseluruhannya (pada kedua-dua kawasan disapu antitoksin dan tidak). Pentafsiran hasil positif: Bakteria menghasilkan serta merembeskan enzim lesitinase yang dikenal pasti kerana aktivitinya menghasilkan zon opalesens dihalang oleh antibodi anti-lesitinase (antitoksin). Tatacara Ujian Elek BAHAN 1. Kultur bakteria yang diuji 2. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Garis presipitasi kelihatan muncul daripada sudut pertumbuhan bakteria yang diuji dan bakteria kawalan positif. Letakkan kertas yang mengandungi antitoksin di tengah piring agar sejurus selepas agar mem-beku. Kertas turas 8. manakala pada bahagian setengah plat agar yang disapu dengan antitoksin tidak terbentuk zon opalesens. Inokulasi permukaan agar dengan bakteria (kawalan positif. 2. Ujian Elek Strain Corynebacteria diphtheriae yang menghasilkan toksin dapat dikesan secara in vitro melalui penghasilan presipitasi apabila toksin ini bertindak dengan antitoksin. 5. Biarkan agar menjadi kering. Kultur bakteria kawalan positif (disahkan menghasilkan toksin difteria) 3.PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Lesitinase dihasilkan jika zon opalesens hanya kelihatan di sekeliling koloni di bahagian setengah plat agar tanpa antitoksin. Antitoksin difteria 10. 9. 4. Tuangkan agar campur serum ke dalam piring Petri. Letakkan sekeping kertas turas ke dalam 1 piring Petri kosong yang steril. Inkubator (Reagen agar dasar jenis Elek: Dari sumber komersial) TATACARA 1. Pentafsiran ujian positif: Bakteria menghasilkan toksin difteria. Ujian negatif: Tiada garis presipitasi. Cairkan 10 ml agar dasar Elek. Titiskan 1 ml antitoksin difteria (1000 unit) ke atas jalur kertas supaya diserap dan biarkan kering. Campurkan 2 ml serum lembu. Penghasilan garis presipitasi adalah hasil suatu tindak balas serologi yang melibatkan antigen (toksin) dan antibodi (antitoksin). kawalan negatif dan yang diuji) secara tegak lurus (90°) melintasi jalur kertas antitoksin. 6. Eramkan dan amati selepas 24 jam dan 48 jam. 7. 10. Agar dasar Elek 5. 3. Piring Petri yang steril 9. Kultur bakteria kawalan negatif (disahkan tidak menghasilkan toksin difteria) 4.

3. N OTA 1. Garam tetrazolium digunakan dalam ujian motiliti ini kerana ia memudahkan pengesanan pertumbuhan serta penyebaran bakteria secara visual di dalam media. Sterilkan keseluruhan dawai lurus. 2. Ujian negatif: Pertumbuhan bakteria terhad kepada garis tusukan. 2. 2. 3.4% atau <) merupakan suatu media separuh pejal yang membolehkan bakteria bergerak dan menyebar ke pelbagai arah di dalamnya. kompleks tak larut berwarna merah hasil pereduksian oleh bakteria yang tumbuh.4% atau <) yang mengandungi indikator (garam tetrazolium) di dalam tabung uji Dawai lurus Inkubator TATACARA 1. kemungkinan garis presipitin juga dihasilkan oleh strain kawalan negatif (dan juga Corynebacterium akibat antigen yang umum kepada semua korinebakteria). Pentafsiran ujian: Ujian positif – bakteria motif.N OTA 1. 2. Plat harus disediakan pada hari ujian dilakukan. Gunakan inokulum yang tebal. Beberapa bakteria seperti Pseudomonas adalah aerobik dan akan hanya menunjukkan motiliti pada bahagian atas media ini. Ujian Motiliti dengan Menggunakan Agar Separuh Pejal Media pertumbuhan dengan kepekatan agar yang rendah (0. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pertumbuhan bakteria (merah) tersebar daripada garis tusukan dawai lurus. Kultur bakteria Agar nutrien (0. Jika plat dieramkan lebih 48 jam. Pertumbuhan beberapa jenis bakteria tertentu mungkin dihalang oleh garam tetrazolium. Bakteria yang tak motil akan tetap pada garis inokulasi dan sama sekali tidak akan tersebar. 4. 90 . Sentuh koloni bakteria dengan penghujung dawai. 4. Amati pola pertumbuhan bakteria. Eramkan semalaman. ujian negatif – bakteria tak motil. 4. 3. 5. Tatacara Ujian Motiliti (Pergerakan) pada Agar Separuh Pejal BAHAN 1. 4. Oleh kerana keseluruhan dawai lurus akan ditusuk ke dalam agar maka pastikan keseluruhan dawai ini dibakar untuk mensterilkannya. Pastikan strain kawalan negatif dan strain kawalan positif diikut sertakan. Garam tetrazolium adalah tanpa warna dan akan diubah kepada formazan. 3. Dawai yang ditusuk ke dalam media dikeluarkan seboleh-bolehnya bertepatan dengan garis kemasukannya. Elakkan daripada menggerakkan dawai ke kiri atau ke kanan semasa dikeluarkan (dan juga semasa dawai ditusuk) kerana ini akan menyebabkan pertumbuhan yang kelihatan tersebar dan memberi tafsiran positif palsu mengenai mobiliti. Jika bakteria mempunyai kemampuan untuk bergerak atau bersifat motil ia akan menunjukkan penyebaran yang bermula dari garis inokulasi. Tusukkan hujung dawai ke dalam agar separuh pejal sehingga ke dasar tabung.

organisma yang diuji digariskan (atau diinokulasi dan kemudian disebarkan) memenuhi permukaan media agar di dalam piring Petri. Sebaliknya. 2. Kemudian disk diletakkan di atas inokulum yang telah disebarkan pada permukaan agar atau pada permukaan media agar yang telah dicampur organisma sebelum pengeraman.6. namun demikian kebanyakannya tidak mempunyai nilai perubatan kerana sesetengahnya mungkin terlalu toksik terhadap pengguna atau sukar diperolehi. UJIAN RESAPAN DISK Dalam ujian resapan disk. atau bersama bakteria kawalan. 6. Biasanya larutan antibiotik ini tidak terus diletakkan ke atas agar. 3. Agen kemoterapi yang dihasilkan berikutan aktiviti metabolik bakteria atau fungus disebut antibiotik. 4. Suspensi bakteria yang diuji di dalam air pepton Swab (steril) Plat agar darah Mueller-Hinton TATACARA 1. suatu zon rencatan pertumbuhan akan terbentuk di sekeliling disk yang mengandungi antibiotik tersebut. iaitu tatacara Stoke dan tatacara perbandingan. Pendekatan ini disebut sebagai ujian resapan disk dan terdapat dua tatacara yang umum. Seseorang doktor haruslah mengetahui mengenai tahap kerentanan (susceptibility) sesuatu mikroorganisma terhadap antibiotik tertentu supaya memudahkannya membuat keputusan yang sesuai dalam rawatan serta pengurusan seseorang pesakit. Celupkan swab steril ke dalam suspensi bakteria yang berada di dalam tabung uji. Tatacara Membuat Inokulasi Bakteria pada Keseluruhan Permukaan Media Plat Agar BAHAN 1. Dalam ujian resapan disk. 2. Sapukan swab sambil memutarkannya pada permukaan media agar untuk penginokulasian mengikut corak seperti diterangkan di bawah: Sapukan swab mula-mula ke satu arah sehingga memenuhi keseluruhan permukaan media dan kemudian sapukan pula menurut arah kira-kira 90 darjah daripada arah sapuan semula. Maklumat ini boleh diperolehi di makmal umumnya melalui dua teknik atau pendekatan iaitu ujian resapan disk dan asai pencairan tiub. pada keseluruhan permukaan media plat agar. Antibiotik tersebut akan merembes keluar daripada disk dan meresap ke dalam media. tetapi terlebih dahulu diserapkan ke dalam disk-disk kertas (satu disk satu jenis antibiotik dengan satu unit pencairan). prosedur pertama (awal) adalah penginokulasian hanya bakteria yang diuji. Buangkan swab ke dalam bekas khas yang mengandungi disinfektan. Jika kultur bakteria sensitif terhadap sesuatu antibiotik. 91 . 3. UJIAN SENSITIVITI ANTIBIOTIK IN VITRO Rawatan penyakit dengan sesuatu bahan atau sebatian kimia dinamakan kemoterapi. Cara lain ialah organisma dicampurkan dengan media agar yang masih cecair dan kemudian dituangkan ke dalam piring. bahkan kadangkala boleh tumbuh di bawah disk. Putarkan swab pada dinding sebelah dalam tabung untuk menyingkirkan suspensi yang berlebihan. Senarai antibiotik yang dipencilkan dan dikenal pasti sememangnya cukup panjang.1. Pada masa ini kebanyakan antibiotik dan terbitannya yang digunakan dalam rawatan dihasilkan secara sintetik atau buatan. jika ia resistan. pertumbuhan akan berlaku sehinggalah mencapai ke pinggir disk.

9. Putarkan swab pada dinding sebelah dalam tabung uji berkenaan untuk menyingkirkan suspensi yang berlebihan. 6. 3. 93). Suspensi bakteria yang diuji di dalam air pepton Suspensi bakteria kawalan Swab (steril) Plat agar darah Mueller-Hinton Alat pemutar plat Petri TATACARA 1. 4. Letakkan plat agar di atas pentas pemutar plat Petri. 4. 4. Celupkan swab yang steril ke dalam suspensi bakteria kawalan. 3. Buka penutup plat Petri dan inokulasi media dengan mula-mula menyentuh bahagian tengah plat dengan swab yang mengandungi bakteria kawalan sehinggalah penginokulasian ini memenuhi suatu kawasan bulatan kira-kira 5 cm garis pusat. 2. 5. 3. 8. Sterilkan gelung dawai. 2. 7. Lakukan kaedah 2 dan 3 untuk bakteria yang akan diuji. Goncangkan untuk mendapatkan suspensi yang homogenus. 2. Suatu garis perbatasan antara kedua-dua jenis bakteria kawalan dan ujian akan diperolehi di mana disk-disk antibiotik akan diletakkan nanti. Kultur bakteria (masing-masing untuk ujian dan kawalan) Gelung dawai Penunu Bunsen Tabung air pepton Swab (steril) Jarum atau forseps (steril) Disk antibiotik Inkubator Pembaris TATACARA Hari pertama 1. Pindahkan 3 koloni bakteria (garis pusat 1-2 mm) ke dalam 1 tabung air pepton. 5. Ujian Resapan Disk: Tatacara Perbandingan BAHAN 1. 6. Sentuhkan dengan swab yang mengandungi bakteria yang diuji bahagian tepi plat dan liputi kawasan permukaan agar ini dengan inokulum ini sehingga hampir menyentuh pinggir kawasan inokulum pertama. 2. Inokulasi strain bakteria ini pada keseluruhan permukaan media agar dengan swab steril (rujuk kepada tatacara di ms. 5.Tatacara Membuat Inokulasi 2 Jenis Bakteria di Bahagian yang Berasingan pada Permukaan Media Plat Agar BAHAN 1. Kaedah ini dilaksanakan sejajar dengan pergerakan alat pemutar plat. N OTA Pastikan swab tidak terlalu basah atau meninggalkan kesan yang tidak diingini pada permukaan agar. 4. 92 . 3.

3.5 cm antara satu disk dengan yang lain dan juga disk dengan dinding plat. 10. Balikkan plat dan ukurlah garis pusat zon tanpa pertumbuhan bakteria (zon rencatan). Seseorang hanya perlu merujuk kepada carta tersebut untuk menentukan pola sensitiviti strain bakteria yang diuji menurut senarai yang ditetapkan di dalam carta berkenaan. Bandingkan hasil sensitiviti kedua-dua strain terhadap antibiotik dan tentukan sama ada strain yang diuji sensitif. Pastikan terdapat jarak sekurang-kurangnya 1. 94). 9. 4. Hari kedua 8. 5. 3. Eramkan plat pada 37°C semalaman.5 cm antara 1 dengan lain mahupun antara disk dengan dinding plat. 8. Jika suatu carta rujukan piawai diperolehi atau sudah tersedia. 6. Tatacara perbandingan berdasarkan carta atau suatu piawai yang tersedia dikenali sebagai Tatacara Kirby-Bauer. Pastikan pertumbuhan bakteria yang diuji dan bakteria kawalan adalah secara kuantitatif hampir sama. 2.5. separuh sensitif. 7. Eramkan plat pada 37°C semalaman. 2. 7. Biarkan supaya permukaan media menjadi kering dan kemudian letakkan disk-disk antibiotik di atas media dengan menggunakan jarum atau forseps steril dan tekan disk ke atas permukaan agar. 9. Kultur bakteria (masing-masing untuk ujian dan kawalan) Gelung dawai Penunu Bunsen Tabung air pepton Swab (steril) Alat pemutar plat Petri Jarum atau forseps (steril) Disk antibiotik Inkubator Pembaris TATACARA Hari pertama 1. ujian ke atas strain kawalan tidak perlu dijalankan. Pastikan terdapat jarak yang sekurang-kurangnya 1. 2. 93 . 6. Letak dan tekan disk antibiotik tepat di atas garis perbatasan antara kedua-dua kultur supaya sebelah disk berada di kawasan kultur kawalan dan sebelah lagi di kawasan kultur yang diuji.s. Ini bagi menyatakan sama ada bakteria tersebut sensitif. N OTA 1. 10. Inokulasi bakteria yang diuji dan bakteria kawalan di atas plat yang sama di bahagian yang berasingan (rujuk kepada bahagian tatacara di m. Ulangi kaedah 1 hingga 5 untuk strain kawalan pada plat lain yang mengandungi media yang sama. atau resistan. separuh sensitif (intermediate) atau resistan. Ujian Resapan Disk: Tatacara Stoke BAHAN 1.

Balikkan plat dan ukurlah jejari zon tanpa pertumbuhan bakteria (zon rencatan. antibiotik disediakan dalam pencairan dua kali ganda di dalam suatu siri tabung media pertumbuhan. 6. Fenomena ini mungkin ditemui di kalangan stafilokokus penghasil enzim betalaktamase yang diuji dengan disk antibiotik yang mengandungi penisilin dan terbitannya. Bagi bakteria yang sukar tumbuh pada media ini bolehlah dicampurkan darah 5% sebagai nutrien tambahan. Kemudian setiap tiub diinokulasi dengan organisma berkenaan dan kepekatan perencatan minimum (minimum inhibitory concentration: MIC ) ditentukan. 5. Ia memakan masa lebih lama. Buat perbandingan antara zon tanpa pertumbuhan yang dihasilkan terhadap strain ujian dengan zon yang dihasilkan terhadap strain kawalan untuk menentukan keresistanan bakteria kepada sesuatu antibiotik. Gunakan isipadu agar yang sama setiap kali supaya ketebalan agar dalam piring Petri sentiasa sama.Hari kedua 4. 4. Kepekatan terendah untuk antibiotik yang menunjukkan hasil “tiada pertumbuhan bakteria” pada subkultur dianggap sebagai kepekatan antibiotik terendah yang berupaya membunuh bakteria tersebut – kepekatan bakterisidal minimum (minimum bactericidal concentration: MBC). Stafilokokus yang menghasilkan zon rencatan yang jelas. Dalam keadaan ini. oleh itu tidak disyorkan sebagai tatacara rutin. ukuran garis pusat atau jejari yang terkecil yang diambil kira. 7. Kelewatan meletakkan disk menyebabkan bakteria tumbuh sebelum antibiotik dapat meresap ke dalam media dan bertindak ke atas bakteria. tetapi memperlihatkan juga pertumbuhan bakteria yang berbonjol di sekitar pinggir zon harus dilaporkan sebagai resistan. 8. Disk antibiotik harus diletakkan sejurus selepas inokulasi dilakukan. 2. Kultur plat harus dieramkan sejurus selepas disk diletakkan. Dalam keadaan ini. Agar Mueller-Hinton merupakan media yang paling sesuai untuk ujian sensitiviti resapan disk.2. Ini menghasilkan pembacaan yang kurang tepat. Sama ada antibiotik berkenaan bersifat bakterisiadal (membunuh bakteria) atau bakteriostatik (merencat pertumbuhan bakteria) dapat dipastikan dengan melakukan pensubkulturan daripada tiub yang tidak menunjukkan pertumbuhan tersebut ke atas media agar tanpa antibiotik. Zon rencatan yang berbentuk bujur boleh disebabkan oleh disk yang tergeser di atas permukaan media atau disk diletakkan terlalu rapat dengan pinggir piring. UJIAN PENCAIRAN TABUNG Pendekatan yang lebih kuantitatif untuk menguji sensitiviti bakteria terhadap sesuatu antibiotik adalah tatacara pencairan tabung. 94 . bermula daripada titik pusat disk). 5. Dalam prosedur ini. Jangan gunakan disk antibiotik yang telah tamat tempoh penggunaannya atau melebihi tarikh pelupusannya. 6. 3. Jika ini tidak dipatuhi. Pastikan pertumbuhan bakteria yang diuji dan kawalan hampir sama secara kuantitatif untuk memberikan perbandingan yang tepat di antara kedua-duanya. Ini dilakukan dengan mengamati tiub berkepekatan antibiotik terendah atau paling minimum dalam siri pencairan yang menghalang pertumbuhan bakteria (tiub yang jernih tepat disebelah tiub yang mula menunjukkan kekeruhan). kepekatan antibiotik yang meresap ke dalam media agar juga akan sentiasa sama. besar kemungkinan zon rencatan pertumbuhan yang lebih besar akan dihasilkan kerana resapan antibiotik terlebih dahulu berlaku sebelum pertumbuhan bakteria bermula. N OTA 1.

2. Tatacara Ujian MBC (Kepekatan Bakterisidal Minimum) BAHAN 1. 4.5 ml ke dalam setiap tabung. N OTA 1. 3. Bakteria kawalan adalah bakteria yang sensitif terhadap antibiotik yang digunakan dalam ujian ini dan mesti beri hasil yang positif sebelum hasil bakteria yang diuji boleh diterima. 95 . Mulakan penitisan dari separuh tabung dengan kepekatan antibiotik yang tertinggi hinggalah kepada tabung dengan kepekatan yang paling rendah. Siri tabung ujian Plat-plat agar Pipet Pasteur MIC TATACARA 1. 6. 2. Pastikan terdapat juga 1 tabung yang mengandungi antibiotik dengan broth yang tidak mengandungi bakteria (tabung kawalan negatif). 2. Pastikan tabung yang steril digunakan dan pencairan dibuat secara teknik aseptik. negatif . Pastikan permukaan agar betul-betul kering. Goncang dan amatilah setiap tabung daripada kedua-dua siri tabung ini untuk menentukan pertumbuhan bakteria (positif . Eramkan pada 37°C semalaman. 4. Kultur broth bakteria yang diuji Kultur broth bakteria kawalan Tabung-tabung uji (steril) Pipet bersukat Antibiotik Inkubator bersuhu 37°C TATACARA 1. termasuk satu tabung yang mengandungi broth tanpa antibiotik (tabung kawalan positif). 5. 5. Sediakan 2 siri tabung yang mengandungi siri pencairan 2 kali ganda antibiotik yang diuji di dalam broth dengan kepekatan tertinggi antibiotik 200 µg atau 200 unit setiap ml (tabung bersaiz 13 mm x 100 mm.keruh.Tatacara Ujian MIC (Kepekatan Perencatan Minimum) BAHAN 1. Gunakan pena penanda untuk membahagikan permukaan dasar setiap plat media kepada 2 bahagian sama besar untuk mendapatkan 2 ‘separuh plat’ bagi setiap plat media. 3. Lakukan pencairan kultur broth semalaman bakteria yang diuji dan bakteria kawalan sebanyak 1:1000 di dalam broth baru untuk memperoleh ~ 10 5 bakteria hidup setiap ml. Biarkan titisan larutan mengering sebelum mengeramkan plat pada 37°C semalaman. Tuliskan nombor siri tabung (atau kepekatan antibiotik) pada setiap separuh plat. 3.jernih). cara yang mudahnya adalah dengan merujuk kepada tabung kawalan positif yang mengandungi bakteria tanpa antibiotik (keruh). Untuk memastikan sama ada berlaku pertumbuhan atau tidak. titiskan (secara terpisah) 3 titis kandungan setiap tabung yang didapati jernih sahaja dalam siri tabung ujian MIC ke atas separuh plat. dan tabung kawalan negatif yang mengandungi antibiotik sahaja (jernih). Dengan menggunakan pipet yang sama. 3. Kultur tabung harus dieramkan sejurus selepas bakteria dicampurkan.5 ml). 2. isipadu larutan 0. 4. 2. Masukkan 0. 5. 4. 3.

96 . Amati pertumbuhan koloni di atas plat bagi setiap pencairan.6. Tentu dan pastikan pencairan yang terendah di mana tidak terdapat pertumbuhan bakteria lagi. Ini merupakan kepekatan bakterisidal minimum. 7.

Oleh kerana mikrob merupakan antigen yang baik. Jika percantuman adalah dengan fluorokrom. kebanyakan mikrob seperti bakteria memiliki morfologi kasar yang sama. UJIAN SEROLOGI DALAM MIKROBIOLOGI Suatu aspek yang penting dalam bidang mikrobiologi adalah pengesanan jenis mikrob yang merupakan agen etiologi sesuatu penyakit. ELISA terdiri daripada beberapa jenis asai: tatacara persaingan. tatacara dwilapisan antibodi yang diubahsuai. ELISA boleh merupakan asai kuantitatif atau kualitatif. Oleh yang demikian. Ikuti arahan dengan tepat mengenai tatacara yang dinyatakan oleh pengeluar ujian. sungguhpun kebanyakan ELISA untuk kegunaan dalam mikrobiologi adalah termasuk dalam golongan kedua ini. tatacara perencatan. 2. 97 . Ada juga ujian yang merupakan ujian rekaan makmal sendiri (in-house) di samping ujian komersial. Asai ini merupakan imunoasai heterogenus kerana ia mempunyai suatu peringkat di mana komponen yang dilabelkan (gabungkan) enzim yang telah bertindak dengan ligannya dipisahkan daripada komponen yang sama yang tidak bertindak. tindakan sesuatu mikrob dengan antibodi yang spesifik terhadapnya adalah suatu pendekatan yang digunakan dalam pengenalan identiti sesuatu mikrob. Di bidang mikrobiologi. terdapat banyak ujian serologi dan banyak variasi sesuatu ujian. Tindakan antigen mikrob dengan antibodi dapat dikenal pasti dengan beberapa cara seperti mewujudkan presipitasi atau aglutinasi. maka kit daripada pengeluar yang berbeza mempunyai tatacara tersendiri. Sungguhpun mikroskop boleh digunakan. Dalam bahagian ini hanya tiga ujian mikrobiologi. Percantuman antibodi dengan enzim membolehkan antibodi yang melekat kepada antigen dikesan apabila tindakan enzim menukar warna substratnya. 3. manik) yang disaluti antigen atau antibodi juga digunakan kerana sampel kawalan positif dan negatif turut diasaikan dengan sampel ujian setiap kali ujian dijalankan. mikologi dan virologi. Walau bagaimanapun. aspek umum kedua-dua ujian berkenaan akan dibentangkan. Oleh yang demikian. iaitu ELISA. Rancangkan kekerapan ujian yang akan dijalankan untuk mengoptimumkan penggunaan sesuatu kit kerana reagen dan fasa pepejal (telaga. tatacara dwilapisan antibodi. N OTA 1. Jangan gunakan reagen selepas tarikh pelupusan bagi mengelakkan kemungkinan hasil negatif palsu. fasa pepejal anti-IgM dan tatacara secara tidak langsung (asai untuk pengesanan antibodi).1 ELISA Asai imunosorben bergabung enzim (enzyme-linked immunosorbent assay) atau lebih terkenal dengan singkatan ELISA adalah sejenis imunoasai yang antigen atau antibodi larut dilekatkan kepada suatu permukaan pepejal seperti permukaan manik atau telaga tanpa menghilangkan reaktiviti komponen imunologiknya. pengesanan identiti sesejenis mikrob adalah sukar kerana ia mempunyai saiz yang amat kecil dan tidak dapat dilihat dengan mata kasar. aglutinasi lateks dan imunopendafluor.7. Dalam hal ini. pancaran cahaya berwarna tertentu – seperti warna hijau-kuning oleh fluorokrom FITC adalah tanda kehadiran kompleks antigenantibodi. diterangkan kerana ketiga-tiga ujian berkenaan mempunyai aplikasi dalam bidang bakteriologi. maka adalah sukar untuk menentukan identiti kebanyakan mikrob berdasarkan pengamatan secara langsung. mikrob berkemampuan menghasilkan antibodi yang bertindak secara spesifik dengannya. 7. Pemisahan ini dilakukan melalui pencucian. rasanya tidaklah sesuai untuk dibahaskan tentang tatacara masing-masing. ELISA dan aglutinasi lateks biasanya dilakukan dengan reagen komersial.

jika ia dilakukan dengan menggunakan alat pembaca ELISA. Amalan ini seharusnya jangan dilakukan kerana mengurangkan isipadu reagen boleh menimbulkan hasil negatif palsu. sungguhpun tindak balas enzim ke atas substratnya telah dihentikan dengan bahan kimia yang sesuai. umpamanya semalaman sungguhpun pada suhu peti beku.4. Dalam sesetengah sistem enzim-indikator. khususnya. 98 . Reagen komersial biasanya mempunyai sensitiviti yang amat tinggi dan ini boleh menimbulkan hasil positif palsu jika pencucian antara peringkat pengeraman dengan reagen tidak dilakukan dengan sempurna. Titisan dengan isipadu yang sama boleh dicapai dengan menggunakan mikropipet. ujian ini tidak membazirkan reagen jika dilakukan ke atas sebilangan sampel yang kecil. 5. 3. Ujian ini adalah cepat serta mudah dilakukan dan tidak memerlukan alat radas yang mahal atau canggih. Oleh kerana ujian direka dengan sensitiviti yang tinggi. Pergabungan antigen dengan antibodi akan menyebabkan kelompok-kelompok besar partikel lateks yang dapat diamati dengan mata kasar. 7. Titisan besar reagen daripada botol reagen mungkin menggalakkan para pengguna berusaha untuk mengurangkan isipadu reagen bagi mengurangkan kos. Goncang botol-botol reagen supaya memperolehi suspensi reagen lateks yang sama rata sebelum reagen lateks digunakan. 5. atau pun hasil negatif palsu. Tambahan pula. Di pasaran. Para pengguna harus mempastikan sesuatu ujian itu bermutu tinggi dan sesuai untuk tujuan mereka. Ikut arahan dengan tepat mengenai tatacara yang dinyatakan oleh pengeluar ujian. 6. Jangan tunggu terlalu lama selepas hasil asai dibaca. beberapa peraturan harus dipatuhi supaya hasil yang didapati boleh diyakini. Biarkan reagen mencapai suhu bilik sebelum ujian dilakukan kerana penggunaan kit sejurus selepas dikeluarkan dari peti beku mungkin memberikan hasil yang kurang memuaskan. Titisan reagen lateks yang dititiskan daripada botol reagen adalah berbeza-beza. 7. ada kemungkinan hasil negatif palsu didapati jika sampel diuji lebih daripada masa yang ditetapkan. akan menukar warna hasil ujian daripada apa yang didapati sejurus selepas asai tamat. 8. Sungguhpun ujian aglutinasi lateks slaid mudah dilakukan. 6. N OTA 1. 2. Pastikan sisa daripada asai seperti cucian dimasukkan di dalam bekas disinfektan yang sesuai untuk mengelakkan berlakunya infeksi ke atas pengguna makmal. Tidak semuanya boleh dianggap memuaskan dari segi spesifisiti dan sensitiviti. 4. penyimpanan lama. Jangan lakukan ujian dengan menggunakan reagen daripada beberapa kit yang mempunyai nombor pengeluaran yang berbeza. Pastikan sisa asai seperti cucian dimasukkan di dalam bekas disinfektan yang sesuai untuk mengelakkan berlakunya infeksi ke atas pengguna makmal. Baca hasil ujian pada masa yang ditetapkan selepas ujian dimulakan. Ujian Aglutinasi Lateks Slaid Antibodi atau antigen boleh digabungkan dengan partikel polistirin (digelarkan ‘lateks’ kerana warna putihnya menyerupai lateks tumbuhan) bagi mengesan antigen atau antibodi masing-masing. Jangan gunakan reagen selepas tarikh pelupusan supaya mengelakkan kemungkinan hasil positif palsu. 9. Jangan lakukan ujian dengan menggunakan reagen daripada beberapa kit yang mempunyai nombor pengeluaran yang berbeza. terdapat berbagai-bagai jenama ujian aglutinasi lateks untuk pengesanan berbagai-bagai antigen/antibodi. sama ada daripada segi masa cucian mahupun bilangan cucian yang dilakukan.

5. 2. 3. 10. Nisbah amaun tenaga yang dikeluarkan kepada tenaga yang diserap adalah amat tinggi (~85%) maka ia memberi sensitiviti yang baik. 4. Dalam lain perkataan. Fluorokrom adalah sebatian semula jadi atau sintetik yang boleh menyerap cahaya gelombang tertentu dan sejurus selepas itu mengeluarkan tenaga sebagai cahaya dengan gelombang yang lebih panjang.Ujian Imunopendafluor Tidak Langsung Kehadiran sejenis antigen (misalnya. Sebarkan sehingga meliputi kawasan bulat seluas 1 cm garis pusat slaid mikroskop atau memenuhi seluruh telaga. Slaid mikroskop atau slaid khas untuk ujian imunopendafluor Piring Petri Kertas turas Kayu aplikator Varnis kuku Antiserum Konjugat antibodi terhadap antiserum dan FITC (‘konjugat’) Larutan salin yang ditampankan fosfat (PBS) Metanol Air suling Larutan PBS 90% dan gliserol 10% Inkubator bersuhu 37°C Mikroskop imunopendafluor TATACARA Penyediaan spesimen sel yang diuji ke atas slaid mikroskop 1. 3. Autopendafluor berwarna hijau-kuning jarang berlaku. 9. Dalam pendekatan lain. 4. Fiksasi spesimen (spesimen yang dititiskan kepada slaid mikroskop atau sel yang ditumbuhkan di atas slaid penutup dan diinfeksi dengan virus) 99 . 3. komponen mikrob) dapat dikenal pasti secara tidak langsung melalui pengamatan mikroskop apabila antigen berkenaan digabung secara spesifik dengan antibodi yang secara langsung tercantum fluorokrom (ujian langsung). Titiskan suspensi sampel (sel diinfeksi mikrob dan ditanggalkan dari permukaan bekas kultur. 2. maka ia meningkatkan spesifisiti. 6. 7. Pancaran cahayanya pada gelombang 520 mµ adalah di kawasan sensitiviti pengamatan yang paling baik maka ia memberi sensitiviti yang baik. Fluoresein digunakan dalam bentuk fluorescein isothiocyanate ( FITC) kerana kehadiran kumpulan sianat yang mempunyai afiniti untuk protein membolehkan antibodi dicantum dengannya. atau sel dari spesimen klinikal) ke atas sekeping slaid mikroskop atau di dalam telaga cetak slaid mikroskop khas untuk ujian imunopendafluor. 12. Biarkan kering. 11. cahaya suatu warna diserap dan cahaya warna lain dikeluarkan oleh fluorokrom. Tatacara Ujian Imunopendafluor Tidak Langsung BAHAN 1. Sungguhpun terdapat berbagai jenis fluorokrom seperti rodamin dan Texas Red. 8. fluoresein adalah fluorokrom yang paling umum digunakan kerana ia mempunyai beberapa kelebihan: 1. Jenis warna (gelombang cahaya) yang dikeluarkan adalah khas untuk sejenis fluorokrom. 13. 2. gabungan secara spesifik antibodi dengan sesuatu antigen dikenal pasti melalui gabungan antibodi berkenaan dengan antibodi terhadapnya yang tercantum fluorkrom (ujian tak langsung).

spesimen masih boleh dibaca selepas disimpan semalaman. Oleh yang demikian. Spesimen di atas penutup slaid dilekapkan di atas setitis kecil larutan PBS gliserol. Untuk mengelakkan kehilangan aktiviti biologinya akibat reagen selalu dicairkan dan dibeku. Bilas dengan air suling. Letakkan spesimen yang berada pada penutup slaid di atas slaid yang diletakkan di atas kayu aplikator. Pencucian yang dilakukan selepas pengeraman boleh dipendekkan serta lebih berkesan jika PBS dalam bekas yang mengandungi slaid spesimen dikacau dengan alat magnet yang berputar. Kelilingi spesimen dengan 1 bulatan varnis kuku. Patahkan sebatang kayu aplikator di bahagian tengahnya dan letakkan dalam bentuk ‘V’ di atas kertas turas di dalam piring Petri (Ini merupakan bekas lembap). penutup slaid berkenaan ditekan. Biarkan lampu raksa mikroskop bernyala kira-kira 15 minit bagi menstabilkan pancaran cahayanya sebelum spesimen diamati. 5. Masukkan di dalam bekas lembap. 19. N OTA Alas satu piring Petri dengan sekeping kertas turas dan basahkan dengan air. 24. 3. amaun yang kecil digunakan setiap kali. Spesimen harus dibaca (diamati dengan mikroskop pendafluor) secepat mungkin kerana intensiti cahaya pendafluor akan berkurang. 9. 1. 6. 23. 6. biasanya digunakan dalam pencairan yang amat tinggi. 10.4. Fiksasi spesimen yang terlalu lama mungkin menimbulkan pendafluor yang tak spesifik. Keluarkan dan biarkan kering. pastikan ia berfungsi dengan baik sebelum amaun yang lebih besar dibeli. Letakkan slaid di atas kayu aplikator supaya slaid berada lebih tinggi daripada aras kertas turas. Bilas spesimen ke atas slaid (atau penutup slaid) dengan PBS . dan lebih-lebih lagi antiserum. reagen berkenaan boleh disimpan pada suhu – 20°C tanpa dibeku jika ia dicampurkan dengan isipadu sama gliserol. 4. Reagen konjugat antibodi-fluorokrom biasanya diperolehi daripada sumber komersial. 7. 22. 18. 100 . Celup di dalam metanol pada suhu 4°C selama 2 minit. 16. Reagen konjugat. Cuci semula 2 kali. 8. Tutup piring Petri dan eramkan dalam alat inkubator bersuhu 37°C selama 30-60 minit. 8. Tindak balas dengan reagen antibodi 7. 12. 11. Bilas spesimen yang ada di atas slaid (atau penutup slaid) dengan PBS. Jika reagen bermutu tinggi dan ujian dilakukan dengan sempurna. Oleh yang demikian. 2. 21. Rendam dalam PBS selama 3 minit di dalam piring Petri (cuci). Tutup piring Petri dan eramkan di dalam inkubator bersuhu 37°C selama 30-60 minit. Titiskan persediaan konjugat ke atas spesimen dan sebarkan supaya meliputi ke seluruh spesimen. 20. Sinaran pendafluor latar belakang boleh ditindaskan dengan spesimen dieramkan dengan metilin biru selepas tindakan dengan konjugat antibodi-fluorokrom. 15. Titiskan persediaan antiserum (sumber antibodi terhadap virus) ke atas spesimen dan sebarkan supaya meliputi seluruh spesimen. Pastikan mikroskop imunopendafluor dinyalakan sekurang-kurangnya 20 minit sebelum ia dipadamkan supaya jangka hayat lampu raksa dapat dikekalkan lama. 17. Penyimpanan spesimen di dalam tempat yang gelap akan melambatkan proses ini. 14. Cuci 3 kali dengan PBS. Biarkan kering di dalam tempat gelap seperti laci yang tertutup. Amati dengan mikroskop pendafluor. 5. 13.

23 Pewarnaan Gram untuk fungus. 80-81 Ujian Koagulase. 56-57 Media agar-menyediakan di dalam plat Petri. 90 Ujian Resapan disk: Tatacara perbandingan. 16 Mikroskop cahaya-pembersihan kanta. 11 Pensterilan menggunakan alkohol yang membakar. 97-98 Ujian Elek. 34-35 Pewarnaan negatif dengan dakwat India. 99-100 Ujian Katalase. 84-86 Ujian Oksidase. 23 Mikroskop elektron-pengamatan spesimen virus. 95 Ujian Motiliti bakteria di dalam agar separuh pepejal. 92 Inkubator CO2 . 89 Ujian Fermentasi gula dan penghasilan gas. 60-61 Kultur sel-tripsinisasi seluruh tisu. 30 Pelekapan titisan tergantung untuk bakteria. 52 Inokulasi plat agar dengan kultur yis. 52 Balang lilin-mewujudkan atmosfera karbon dioksida. 12-13 Pewarnaan Albert (pewarnaan granul metakromatik). 91 Inokulasi plat agar dengan 2 jenis bakteria untuk ujian sensitiviti antibiotik. 70-71 Telur-mengumpulkan cecair amniotik. 14-15 Pensterilan gelung dawai dengan api. 47 Media bakteria-jenis. 68 Telur-membuat inokulasi membran korioalantoik. 93-94 Ujian Sensitiviti: Bacitracin. 53 Bantuan pemula-rawatan. 27 Pewarnaan Kinyoun (terubahsuai) untuk fungus. 47-49 Prosedur umum makmal mikrobiologi. 10 Disinfektan-penggunaan. 71-72 Ujian aglutinasi lateks slaid. 69 Telur-membuat inokulasi ruang alantoik. 74-76 Ujian Urease. 25 Pelekapan basah bakteria. 82-83 Ujian Voges-Proskauer. 69 Telur-mengumpulkan cecair alantoik. 13 Balang anaerobik-penggunaan. 16 Mikroskop cahaya-penggunaan.INDEKS Apusan bakteria-membuat. 79 Ujian Sensitiviti: Optochin.penggunaan. 36 Pewarnaan Schaeffer-Fulton. 20-21 Asepsis-pemindahan benda dari botol yang tertutup. 95 Ujian MBC (Kepekatan Bakterisidal Minimum). 78 101 . 26 Pewarnaan asid periodik-Schiff. 39-40 Mikroskop elektron-tatacara imun. 44-45 Mikroskop elektron-menyaluti grid dengan Formvar. 92-93 Ujian Resapan disk: Tatacara Stokes. 31 Pelekapan basah lactophenol coton blue untuk fungus. 9 Slaid mikroskop-membersihkan dan simpanan. 64-65 Kultur sel-penghitungan dengan menggunakan hemosiometer. 27 Pewarnaan tahan asid (rujuk kepada pewarnaan ZiehlNeelsen). 73-74 Ujian Indol. 76-77 Ujian Imunopendafluor. 67 Kultur sel-kriopengawetan kultur sel yang hidup. 46 Media agar-menyediakan sebagai cerun. 64 Kultur sel-pengkulturan semula sel yang dikrioawetkan. 26-27 Pewarnaan spora (rujuk kepada pewarnaan Schaeffer Fulton). 47-49 Inokulasi plat agar dengan 1 jenis bakteria untuk ujian sensitiviti antibiotik. 32 Pelekapan basah salin untuk fungus. 83-84 Ujian Metil-merah. 55-56 Kultur yis-merangsang penghasilan tiub germa. 33 Pewarnaan kapsul (rujuk kepada pewarnaan negatif dengan dakwat India). 77-78 Ujian MIC (Kepekatan Perencatan Minimum) tabung. 22 GasPak-mewujudkan keadaan anaerobik. 17-19 Plat garisan-teknik. 10 Fiksasi bakteria dengan haba-membuat. 86-87 Ujian keperluan faktor pertumbuhan X dan V. 71 Telur-mengambil membran korioalantoik. 40 Mikroskop cahaya-mengelakkan pertumbuhan fungus. 53-54 Kultur sel-inokulasi dengan virus. 41 Mikroskop elektron-pewarnaan negatif. 98 Ujian ELISA. 70 Telur-membuat inokulasi ruang amniotik. 79 Ujian Tiga gula besi. 20 Telur-melakukan penyuluhan. 38-39 Mikroskop elektron-pengamatan spesimen bakteria. 62-63 Kultur slaid fungus-membuat. 66 Kultur sel-persediaan media. 61-62 Kultur sel-tripsinisasi sel selapisan dan pengermaan kultur sel. 33 Pewarnaan metenamina-argentum Gomori. 17 Pelekapan basah KOH untuk fungus. 25 Pewarnaan Ziehl-Neelsen. 34 Pewarnaan Gram untuk bakteria.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->