2

Yap Kok Leong Abdul Hamid Abdul Aziz Mohd Salleh Mohd Yasin

PENERBIT UNIVERSITI KEBANGSAAN MALAYSIA BANGI • 1999

3

Cetakan Pertama / First Printing, 1999 Hak cipta / Copyright Universiti Kebangsaan Malaysia, 1999 Hak cipta terpelihara. Tiada bahagian daripada terbitan ini boleh diterbitkan semula, disimpan untuk pengeluaran atau ditukarkan ke dalam sebarang bentuk atau dengan sebarang alat juga pun, sama ada dengan cara elektronik, gambar serta rakaman dan sebagainya tanpa kebenaran bertulis daripada Penerbit UKM terlebih dahulu. All rights reserved. No part of this publication may be reproduced or transmitted in any form or by any means, electronic or mechanical including photocopy, recording, or any information storage and retrieval system, without permission in writing from the Penerbit UKM. Reka bentuk kulit dan ilustrasi olh Hassan Majid Diterbitkan di Malaysia oleh / Published in Malaysia by
PENERBIT UNIVERSITI KEBANGSAAN MALAYSIA 43600 UKM Bangi, Selangor D.E. Malaysia

Penerbit UKM adalah anggota / is a member of the PERSATUAN PENERBIT BUKU MALAYSIA /
MALAYSIAN BOOK PUBLISHERS ASSOCIATION

No. Ahli / Membership No. 8302 Dicetak di Malaysia oleh / Printed in Malaysia by
AMPANG PRESS SDN. BHD.

6 & 8, Jalan 6/91, Taman Shamelin Perkasa, Jalan Cheras, 56100 Kuala Lumpur, MALAYSIA Perpustakaan Negara Malaysia Data Pengkatalogan-dalam-Penerbitan

Yap, Kok Leong Mikrobiologi makmal / Yap Kok Leong, Abdul Hamid Abdul Aziz, Mohd Salleh Mohd Yasin. Mengandungi indeks 1. Microbiological laboratories. I. Abdul Hamid Abdul Aziz. II. Mohd Salleh Mohd Yasin. III. Judul. 579.078 ISBN 967-942-439-1

4

KANDUNGAN

Prakata . . . 7 1. Amalan dan Peraturan dalam Makmal Mikrobiologi . . . 9 1.1. Prosedur Umum di dalam Makmal Mikrobiologi . . . 9 1.2. Bantuan Pemula Kecemasan di dalam Makmal . . . 9 1.3. Disinfektan untuk Kegunaan Makmal . . . 10 1.4. Tatacara Aseptik . . . 11 2. Mikroskop Cahaya dalam Mikrobiologi . . . 14 2.1. Tatacara Mikroskop Cahaya . . . 14 3. Pengamatan Mikrob . . . 17 3.1. Pengamatan Bakteria . . . 17 3.2. Pengamatan Fungus . . . 30 3.3. Pengamatan Virus dengan Mikroskop Elektron . . . 38 3.4. Reagan Pewarnaan: Rumusan dan Persediaan . . . 42 4. Pengkulturan Mikrob . . . 44 4.1. Pengkulturan Bakteria . . . 44 4.2. Pengkulturan Fungus . . . 54 4.3. Pengkulturan Virus . . . 59 5. Pengenalpastian Agen Mikrob . . . 73 5.1. Ujian Makmal dalam Pengenalpastian Bakteria . . . 73 6. Ujian Sensitiviti Antibiotik In Vitro . . . 91 6.1. Ujian Resapan Disk . . . 91 6.2. Ujian Pencairan Tabung . . . 94 7. Ujian Serologi dalam Mikrobiologi . . . 97 7.1. Ujian ELISA . . . 97 Indeks . . . 101

5

Yap Kok Leong Abdul Hamid Abdul Aziz Mohd Salleh Mohd Yasin Jabatan Sains Bioperubatan Fakulti Sains Kesihatan Bersekutu UKM 6 . Sungguhpun kaedah yang digunakan dalam mikrobiologi banyak dan berbagai-bagai. Ini dilakukan supaya pelajar dapat memahami teori serta penggunaan teknik-teknik di atas dengan lebih mendalam kerana buku ini menyertakan beberapa petunjuk dan petua bagi mencapai hasil yang baik dan diharapkan. Teknik asas ini biasanya diajarkan kepada pelajar mikrobiologi dalam sesi amali yang terancang. Sering juga terdapat soalan serta kemusykilan yang sama yang diajukan oleh mereka. Kami menaruh harapan agar buku ini berguna dalam mempertingkatkan lagi kemahiran pelajar mahupun pengamal mikrobiologi. Penggunaan setiap teknik ini sengaja diolah berdasarkan konsep yang dimaksudkan di atas. Buku ini mengandungi 81 teknik dan maklumat teknikal. sebuah buku yang menyentuh tentang teknik-teknik dasar makmal dan tradisional mikrobiologi amat diperlukan. Daripada pengalaman kami dalam mengendalikan sesi amali mikrobiologi terdapat beberapa kesilapan serta amalan yang tidak sewajarnya diulangi oleh setiap kumpulan pelajar baru. tetapi juga merangkumi pengenalan ringkas dan tepat mengenai teknik-teknik tersebut. Menyedari hakikat di atas. di samping menambahkan sebuah lagi judul teks ke dalam senarai buku-buku teknikal dalam Bahasa Melayu yang tercinta. selain mempelajari dan mengumpul fakta serta konsep adalah penting bagi pelajar dan pengamal mikrobiologi mahir dan cekap dalam mengendalikan kaedah-kaedah makmal mikrobiologi.PRAKATA Mikrobiologi merupakan suatu sains praktik. kami menulis buku ini yang bukan sahaja memaparkan kaedah serta pelaksanaan yang sempurna. Oleh yang demikian. Oleh itu. terdapat beberapa kaedah seperti pewarnaan bakteria yang boleh dianggap sebagai teknik asas dalam amalan sains ini.

.

Simpan buku dan catatan berjauhan daripada tempat bekerja anda di dalam makmal untuk menghindari daripada tercemar. jari atau sebarang objek ke dalam mulut atau membasahkan pelekat dengan menggunakan lidah. minum atau merokok di dalam makmal pada setiap waktu. PROSEDUR UMUM DI DALAM MAKMAL MIKROBIOLOGI Mikroorganisma boleh menyebabkan penyakit pada manusia. Gunakan penyedut getah atau alat penyedut khas untuk tujuan ini. Jangan menyentuh kawasan muka atau mulut anda semasa bekerja. Gantikan tiubnya jika perlu. BANTUAN PEMULA KECEMASAN DI DALAM MAKMAL Oleh kerana kemalangan boleh berlaku di dalam makmal. pekerja makmal haruslah mempunyai sedikit sebanyak pengetahuan mengenai bantuan pemula dan tindakan yang perlu diambil serta sedar akan keperluan ini. Tumpuan khusus perlu diberikan kepada aspek-aspek keselamatan dan ketelitian di dalam makmal mikrobiologi demi kepentingan diri sendiri mahupun pekerja-pekerja lain. 2. 8. pecah atau tercemar kepada instruktor. Pakai kot makmal dan kasut pada setiap waktu anda bekerja di dalam makmal. Bekalan Bantuan Pemula Kecemasan 1. 10. 5.1. Jangan makan. Untuk mencapai matlamat ini sentiasalah mengingati dan mematuhi peraturan-peraturan umum makmal berikut: 1. bakteria dan virus. 7. misalnya bikar yang berisi disinfektan atau bekas yang disediakan khas. 13.2. 2. Jangan menyedut sebarang cairan ke dalam pipet dengan mulut. Jangan membawa bahan-bahan makmal yang rosak. Jangan membawa keluar dari makmal sebarang kultur atau bahan-bahan dalam kelas amali. AMALAN DAN PERATURAN DALAM MAKMAL MIKROBIOLOGI 1. Tutup gas dan paip air dengan rapat dan bersihkan meja setelah anda selesai bekerja dan bersiap sedia untuk meninggalkan makmal. 5. Oleh itu adalah penting bagi kita menyedari dan mengawasi prosedur dan perilaku dengan betul serta penuh tanggungjawab semasa bekerja dengannya. 11. 4. 1. Mikrobiologi adalah mengenai mikroorganisma atau jasad renik yang mempunyai saiz kecil seperti fungus (kulat). Buangkan semua bahan dan kultur yang tercemar ke dalam bekas khusus yang disediakan. Panggillah instruktor dengan segera jika berlaku sebarang KEMALANGAN terutama yang berkaitan dengan kultur mikroorganisma. 14.1. 12. Kot makmal janganlah dipakai di luar makmal. Periksa penunu Bunsen dari semasa ke semasa untuk memastikan tidak berlaku kebocoran gas. khususnya dalam kes-kes kecederaan ringan. Jangan memasukkan pensil. 9. Basuh tangan dengan sabun dan air atau dengan disinfektan kulit sebelum anda memulakan sebarang pekerjaan di makmal. 3. 4. 3. 6. Jangan nyalakan mancis semasa bekerja dengan/atau berdekatan dengan reagen meruap seperti alkohol dan eter. Antiseptik ringan untuk luka dan luka terbakar Kain kasa (gauz) atau pembalut steril Larutan asid asetik 2% Natrium bikarbonat Jeli petroleum/vaselin 9 . Basuh tangan anda semula dengan sabun dan air atau dengan disinfektan kulit sebelum meninggalkan makmal.

spesimen dan bahan terpakai terlebih dahulu disimpan buat sementara di dalam bahan kimia tertentu sehingga pekerjaan di makmal tersebut selesai. 10 . Untuk luka ringan dan cakaran. Jika keradangan pada mata tersebut masih berterusan. Aktiviti antimikrobnya tidak banyak dikurangkan oleh bahan organik dan tidak bertindak terhadap logam. Segera berjumpa doktor. Luka bakar asid. jumpalah doktor. pastikan mata dicuci dengan air yang banyak dengan air paip. sesuai untuk menginaktivasi virus. Disinfektan adalah bahan kimia yang dimaksudkan di atas yang digunakan untuk memusnahkan mikrob patogenik pada sesuatu objek tak bernyawa (inanimate). bahan tuberkulosis dan bahan bakteriologi umum. Sudol. jangan menggunakan antiseptik. pipet dan slaid mikroskop juga sering tercemar. Disinfektan Jenis Fenolik Jernih 1.3. sapukan lapisan tipis jeli petroleum di kawasan berkenaan. Bagi luka bakar yang lebih serius. balang buangan sisa makmal. Bilas dengan alkohol 70% atau dengan antiseptik. hematologi dan patologi kimia di dalam balang buangan sisa makmal. Sesuai untuk kerja mikrobiologi umum. Luka bakar alkali. Elak daripada menggunakan air kerana boleh menyebarkan alkali berkenaan. Digunakan untuk kebanyakan bahan organik. Jika luka kelihatan parah. Hipoklorit sesuai digunakan dengan detergen anionik dan bukan ionik tetapi tidak sesuai 3. Luka bakar api. Umumnya. objek di dalam makmal seperti tempat kerja. Jika formalin atau mana-mana cairan tersimbah ke dalam mata. Boleh digunakan dalam bidang virologi. Segera simbah dengan sabun dan air dan sapukan dengan natrium bikarbonat. Aktiviti antimikrobnya dikurangkan oleh bahan organik. 3. tetapi tidak digunakan untuk bahan tuberkulosis atau yang diperbuat daripada logam. balang pipet terpakai dan untuk mendisinfeksi permukaan. jangan berikan sebarang rawatan tetapi bawalah mangsa ke hospital. Bilas bersungguh-sungguh dengan asid asetik 2%. Namun demikian. tidak digunakan untuk darah dan virus. 2. 4. Di samping ini. 5. 2.Tatacara Rawatan Bantuan Pemula 1. Sebatian kimia halogen dan fenol adalah di antara agen yang penting sebagai disinfektan. 4. cuci luka dan teliti sama ada terdapat bendasing (kaca) di dalam luka. 3. tahap pemusnahan di peringkat ini tidaklah perlu mencapai tahap pensterilan. Gunakan hipoklorit untuk bahan yang mengandungi hanya sedikit bahan organik atau sedikit darah. Balut dengan kain pembalut berperekat atau dengan balutan longgar. iaitu pemusnahan semua bentuk hidupan. Luka. Untuk mengelakkan penyebaran patogen. 4. objek seperti spesimen klinikal dan pipet dikumpulkan di dalam bekas yang sesuai sebelum disterilkan dan dibuang. DISINFEKTAN UNTUK KEGUNAAN MAKMAL Pekerja di makmal mikrobiologi sentiasa berhadapan dengan bahan-bahan berbahaya terutamanya yang mengandungi mikrob patogenik. Digunakan pada pencairan seperti yang ditetapkan oleh pengeluar disinfektan. Contoh: Clearsol. Disinfektan Jenis Hipoklorit 1. Bahan antimikrob ini menyerang logam. Untuk luka bakar kulit yang ringan (kulit kemerahan tetapi tidak sampai mengelupas). 1. 2.

Dengan perkataan lain. Lakukan pembakaran sehingga peringkat keseluruhan dawai menjadi merah membara. 2. Penggunaan umum: 1000 ppm klorin bebas. Keluarkan dawai. Adalah penting juga dalam mengamalkan teknik aseptik. Gelung dawai Rak gelung dawai Penunu Bunsen TATA C A R A 1. 2. Biarkan ia supaya dingin semula (sama ada dengan memegang atau meletakkannya di atas rak khas) sebelum digunakan. Pensterilan Gelung Dawai dengan Api Gelung dawai adalah sejenis dawai yang umumnya terdiri daripada nichrome atau platinum dengan garis pusat berukuran 0. gelung dawai ini disterilkan setiap kali selepas digunakan. Presept.5 mm yang dibentuk melingkar seperti gelung pada salah satu penghujungnya. 7. 3. Gelung dawai ini merupakan alat utama di makmal bakteriologi yang digunakan untuk memindahkan bakteria daripada suatu kultur ke tempat-tempat lain. pakaian mahupun tempat anda bekerja di makmal) dan juga ke atas pekerja-pekerja lain.1. Penghujung lainnya dicantumkan kepada sebatang pemegang dawai.4. Tatacara Pensterilan Gelung Dawai dengan Api BAHAN 1. gelung dawai ini disterilkan.5. 2. gelung dawai ini terlebih dahulu dibakar supaya semua mikrooganisma yang terdapat pada permukaannya musnah dan terhapus serta tidak akan tercampur atau mencemari kultur bakteria murni yang akan diambil dengannya nanti. Gelung dawai haruslah sentiasa disterilkan melalui pembakaran merah membara seperti di atas sebelum dan sesudah digunakan. 1. 11 . 3. 4. Letakkan ia di atas rak khas atau pegang sahaja sementara menunggu dingin. dengan detergen kationik. Elakkan daripada meletakkannya langsung di atas meja. Balang pipet: 2500 ppm klorin bebas. Sebelum digunakan. Nyalakan penunu Bunsen dan buka sepenuhnya liang kemasukan udaranya. Masukkan gelung dawai ke dalam api penunu Bunsen seperti yang ditunjukkan pada Rajah 1. Contoh: Chloros. TATACARA ASEPTIK Teknik aseptik bukan sahaja bertujuan untuk menjamin kesterilan bahan yang anda sedang kendalikan (iaitu tanpa berlakunya sebarang pencemaran ke atas bahan berkenaan) tetapi juga merangkumi tindakan menghindari daripada berlakunya pencemaran mikroorganisma yang sedang dikaji ke atas diri anda sendiri (tangan. 6. P E R H AT I A N 1. Pastikan gelung dawai yang steril ini tidak tersentuh sebarang objek sebelum digunakan.

Mulakan dengan memasukkan gelung dawai langsung ke dalam api (biru) di bahagian gas tak terbakar. 2. Tatacara Pensterilan Alat dengan Alkohol yang Membakar BAHAN 1. Sentuhkan objek beralkohol kepada api penunu Bunsen supaya alkohol terbakar. Dalam tempoh alkohol pada permukaan objek tersebut terbakar. 2. Pegang objek kecil seperti slaid mikroskop atau penutup slaid dengan forseps dan objek yang lebih besar pada pemegangnya. Balang alkohol (mengandungi etanol 70%) Penunu Bunsen TATACARA 1. misalnya. Naikkan gelung perlahan-lahan sehingga bahagian gelung keluar dari kemuncak api biru dan biarkan terbakar sehingga merah membara. 4. Celup objek atau bahagian yang akan disterilkan ke dalam balang alkohol. mikroorganisma yang terdapat pada permukaan objek tersebut juga turut terbakar dan akhirnya dihapuskan. seperti bahagian memotong gunting ialah dengan mencelupkan objek atau bahagian daripada objek berkenaan ke dalam alkohol dan kemudian membakar objek beralkohol tersebut. ia kurang meyakinkan dibandingkan dengan pensterilan yang diperolehi dengan menggunakan autoklaf. Seterusnya bakar keseluruhan dawai sehingga menjadi merah sebelum dikeluar dan didinginkan di udara. 3. 12 . RAJAH 1. Sungguhpun ini merupakan suatu kaedah pensterilan yang boleh digunakan dalam keadaan-keadaan tertentu.1 Cara membakar gelung dawai Pensterilan Alat dengan Alkohol yang Membakar Suatu tatacara cepat untuk mensterilkan objek kecil atau sebahagian daripada sesuatu objek. Singkirkan alkohol yang berlebihan.

ia dapat mengelak daripada berlakunya pencemaran dari udara disebabkan partikel-partikel yang kecil apatah lagi spora fungus dan bakteria yang biasanya terapung atau berterbangan akan bergerak ke atas menurut arus dan tidak akan terjatuh ke dalam mana-mana media yang terdedah di bawahnya berdekatan dengan api. Letakkan balang berisi alkohol berjauhan daripada api penunu Bunsen untuk mengelak daripada disambar api tersebut. ATAU dengan peralatan yang sama keluarkan sesuatu bahan (misalnya kultur) daripada botol/tabung berkenaan. Tanggalkan penutup botol/tabung tersebut dengan jari kelengkeng kanan dan pegang terus penutup ini dengan jari berkenaan.5. Jadi udara di persekitaran api akan terbawa arus ini ke atas dan akan mencegah partikel kecil seperti debu dan sebagainya daripada mendap di kawasan persekitaran ini. api penunu Bunsen menghasilkan arus perolakan. 3. Longgarkan dahulu penutup botol/tabung yang ketat dengan tangan kanan. Oleh itu. Dengan tangan kiri. Lalukan semula mulut botol/tabung ke dalam api beberapa kali sebelum botol/tabung tersebut ditutup. PERHATIAN 1. Teknik ini membolehkan anda melakukan dua perkara secara serentak dengan kedua-dua tangan. Kaedah ini hanya boleh digunakan untuk objek kaca dan logam sahaja. Pada prinsipnya. 2. iaitu arus udara yang bergerak ke atas disebabkan haba dari api tersebut. tanpa meletakkannya (lakukan prosedur ini berdekatan dengan api penunu Bunsen). NOTA 1. dipercayai bahawa bekerja berdekatan dengan sesuatu sumber api umumnya boleh mengurangkan kadar pencemaran dari udara. Dengan demikian. 2. NOTA 1. 3. Mata gunting mestilah dalam keadaan terbuka semasa proses pensterilan supaya bahagian tajamnya terdedah kepada alkohol dan pembakaran. Peganglah botol/tabung di bahagian dasarnya (iaitu agak berjauhan daripada mulut botol/ tabung) dengan tangan kiri. untuk melaksanakan pengambilan inokulum dari spesimen tertentu atau penginokulasian sesuatu media. Jauhkan objek daripada api penunu Bunsen dan biarkan sehingga api pembakaran alkohol tersebut padam dengan sendirinya. 4. bekerja berdekatan dengan api ini amat digalakkan dan seharusnyalah menjadi amalan di bidang mikrobiologi. iaitu mensterilkan mulut botol/tabung sambil menghindari daripada berlakunya pencemaran udara dan mengambil inokulum daripada sejenis media kultur ataupun memasukkan inokulum ke dalam media. 2. 5. PERINGATAN Amalkan prosedur ini setiap kali anda melakukan penginokulasian supaya pencemaran khususnya dari udara di sekitar kita dapat dihindari. Berdasarkan konsep ini. Bahan kaca seperti slaid atau penutupnya akan pecah sekiranya dibiarkan dalam api pembakar terlalu lama. 2. 13 . Sentiasalah memegang objek supaya parasnya lebih rendah daripada paras tangan untuk mengelak daripada alkohol yang sedang terbakar mengalir ke tangan dan mengakibatkan kebakaran pada diri sendiri. Tatacara Mengeluarkan dan Memasukkan Bahan daripada Botol yang Tertutup 1. segera lalukan mulut botol/tabung ke dalam api beberapa kali dan kemudian masukkan sesuatu yang diambil dengan gelung dawai atau pipet steril dengan tangan kanan.

Amatilah apusan melalui kanta okular (mata). 7. Putarkan pula tombol pengatur fokus halus untuk mendapatkan imej objek yang tajam dan terang. Pusingkan tombol pengatur fokus halus perlahan-lahan supaya objektif bergerak ke atas sehingga dapat memfokus sesuatu objek pada slaid. 14 . Pusingkan tombol pengatur fokus kasar perlahan-lahan supaya objektif bergerak ke atas sehingga anda dapat melihat dan memfokus sesuatu pada slaid. Sungguhpun kini terdapat pelbagai jenis mikroskop. Mikroskop makmal yang biasa mempunyai sekurang-kurangnya tiga kanta objektif: objektif kuasa rendah (pembesaran 10X). Sebelum memulakannya terlebih dahulu naikkan kanta objektif (100X) sehingga ke had maksimum. peringkat yang paling halus sekali yang boleh kita lihat (kuasa resolusi) adalah 0. Letakkan slaid di atas pentas/dataran mikroskop dengan apusan di sebelah atas. 3.1). 4. yang lazim dan paling sering digunakan ialah mikroskop cahaya jenis kompaun iaitu mempunyai dua set kanta (Rajah 2. Dengan menggunakan cahaya biasa untuk memancarkan imej objek. letakkan satu titis minyak rendaman di dalam lingkaran apusan pada slaid. resolusi mikroskop cahaya biasa ialah 300 nm. 2. struktur dan saiznya amat sukar dipastikan. Tukarkan kepada kanta objektif (100X) dan turunkannya sehingga hampir-hampir menyentuh permukaan slaid. 6. Turunkan objektif dengan memutarkan tombol pengatur fokus kasar sehingga jarak objektif berada kira-kira 1 mm di atas slaid.2 mikron (µm) atau 200 nm kerana ini adalah had yang ditentukan oleh gelombang cahaya yang dapat dilihat. 2. 2. 4. kuasa resolusi 200 nm ini adalah dalam keadaan optimum dan sungguhpun objek boleh ‘diamati’. Jumlah kuasa pembesaran adalah kuasa pembesaran objektif darab kuasa pembesaran kanta okula. Cahaya menjadi tertumpu dengan intensiti yang meningkat dan akan memberikan resolusi yang tinggi. Kanta okular (mata) biasanya mempunyai kuasa pembesaran 10X. jika ruang antara spesimen dan kanta adalah udara. Oleh yang demikian.2. MIKROSKOP CAHAYA DALAM MIKROBIOLOGI Antara teknik asas makmal yang seharusnya diketahui oleh seseorang penuntut mikrobiologi ialah pengamatan ke atas mikrooganisma serta sel-sel yang terinfeksi mikroorganisma dengan menggunakan mikroskop. Ulangi prosedur di atas dengan kanta objektif rendaman minyak (100X). cahaya yang dibiaskan pasti tidak akan masuk ke dalam kanta. TATACARA MIKROSKOP CAHAYA Tatacara Menggunakan Mikroskop Cahaya Biasa BAHAN 1. Keadaan ini memberikan imej yang lebih terang kerana cahaya yang melalui slaid mikroskop dan terkena pada spesimen yang sedang diamati tidak dibiaskan dan oleh yang demikian disalurkan ke dalam kanta rendaman minyak sebab indeks refraktif kaca dan minyak rendaman adalah hampir sama. Amatilah apusan melalui kanta okular. Mikroskop cahaya Slaid apusan bakteria yang telah diwarnai Minyak rendaman Kertas/tisu kanta TATACARA 1. 8. Putarkan objektif (40X) supaya berada tepat di atas apusan. sebahagian besar daripada cahaya akan dibiaskan disebabkan perbezaan indeks refraktif yang besar antara kaca dan udara. kuasa sederhana (40-45X) dan kuasa tinggi (100X) atau rendaman minyak (kuasa yang paling tinggi).1. Walau bagaimanapun. Sebaliknya. 5. Sebenarnya. Kemudian. 9. 10. Spesimen dihubungkan secara fizikal dengan kanta rendaman minyak melalui minyak rendaman. 3.

Sebelum melakukan pengamatan. Lapkan minyak rendaman daripada objektif dengan kertas kanta kering atau dibasahi dengan sedikit xilena diikuti dengan kertas kanta kering yang bersih lainnya sejurus selepas setiap kali anda selesai melakukan pengamatan minyak rendaman. pastikan terlebih dahulu apusan pada permukaan slaid berada di sebelah atas atau slaid tidak diletakkan dalam keadaan terbalik. putarkan tombol fokus halus perlahan-lahan supaya objektif bergerak ke atas sehingga anda dapat memfokus dan meneliti morfologi sel bakteria dengan jelas. 12. Sambil mengamati melalui kanta okular.1 Komponen-komponen mikroskop cahaya 15 . Setelah selesai pengamatan. 14. 13. Adalah suatu amalan yang baik jika dalam melaksanakan pemfokusan ke atas sesuatu objek.11. objektif dapat diturunkan sehingga boleh melampaui paras pentas mikroskop dan apabila ini berlaku semasa pemfokusan besar kemungkinan penghujung objektif akan menekan ke atas slaid dan boleh menyebabkan slaid pecah. atau mungkin juga slaid dalam keadaan terbalik dan apusan berada di sebelah bawah. atau slaid melekat kepada kanta objektif dan turut bergerak ke atas semasa kanta digerakkan (masalah ini boleh diatasi dengan menekan slaid dengan satu jari semasa objektif digerakkan). 2. 3. Turunkan objektif semula sehingga terendam di dalam minyak rendaman dan hampir-hampir menyentuh slaid. Ini kerana dalam sesetengah jenis/jenama mikroskop. atau minyak rendaman yang diletakkan di atas apusan tidak mencukupi. Jika spesimen masih tidak kelihatan dengan kanta rendaman minyak ada kemungkinan spesimen tidak dapat difokus kerana tombol pengatur objektif mikroskop diputarkan terlalu cepat. Tiub binokular Bahagian mata (eye piece) Bahagian mercu yang berputar Objektif Pentas Kondenser Tombol pengatur fokus Lampu Pentas mikroskop RAJAH 2. gerakkan objektif ke atas menjauhi slaid. NOTA 1. yang digerakkan adalah objektif mikroskop daripada permukaan slaid ke arah atas dan bukan sebaliknya.

lambat-laun debu akan melekat dan menutupi kanta tersebut dan akan menyebabkan pengamatan kabur serta menimbulkan kesulitan. Jika minyak rendaman pada kanta rendaman minyak tidak dilap dengan baik. 16 .4. Terdapat jenama mikroskop yang kantanya dilapisi dengan bahan kimia untuk mencegah masalah ini. Tatacara Penjagaan Mikroskop Cahaya Iklim di Malaysia adalah lembap dan keadaan ini menggalakkan pertumbuhan fungus pada permukaan kanta mikroskop. Cara yang mudah dan baik untuk mengatasi hal ini adalah dengan menyimpan mikroskop di dalam bilik atau ruangan tertutup yang dilengkapi dengan alat penyahlembap (dehumidifier) yang akan mempastikan suasana udara di dalam bilik atau ruangan tersebut sentiasa kering. atau tisu tandas atau sapu tangan untuk membersihkan permukaan kanta hanya akan mengakibatkan calar ke atas kanta dan ini akan mempersulitkan pengamatan seterusnya. dipercayai tidak berkekalan. Penggunaan kertas tisu lain seperti kertas tisu muka. 5. tetapi perlindungan ini. Ia perlu dirawat secara berterusan khususnya dengan menyalutkan semula bahan kimia berkenaan pada waktu tertentu.

3. Buatkan 1 lingkaran/cincin plastisin berukuran tidak melebihi luas penutup slaid. 5. misalnya untuk menentukan pergerakannya (motiliti). 3. 2. 4. PENGAMATAN PERGERAKAN BAKTERIA DI DALAM SUSPENSI CAIRAN Bakteria dalam keadaan semulajadi susah untuk diamati dengan mikroskop cahaya kerana bersifat transparen atau tidak mempunyai warna. Sterilkan gelung dawai melalui kaedah pembakaran dan biarkannya sehingga sejuk. Sekiranya menggunakan kultur broth tukarkan langkah 4 kepada berikut: 4a. 5.1. 4b. Kultur bakteria (dalam botol media broth atau plat kultur) Slaid mikroskop Penutup slaid Botol larutan salin (steril) TATACARA 1. Walau bagaimanapun. Tatacara Pelekapan Titisan Tergantung BAHAN 1. 3. Letakkan lingkaran tersebut di atas penutup slaid supaya titisan suspensi berada tepat di tengahtengah lingkaran plastisin dan tekan sedikit supaya lingkaran ini melekat kepada penutup slaid. Letakkan sekeping penutup slaid di atas suspensi bakteria seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3. 2.1. Sterilkan gelung dawai melalui kaedah pembakaran dan biarkannya sehingga sejuk. Sentuhkan gelung dawai steril kepada 1 koloni bakteria pada plat kultar. Pengamatan motiliti bakteria di dalam suspensi cairan digunakan khusus untuk bakteria yang dikulturkan dalam media broth kerana tidak dapat tumbuh dengan baik pada media padat (agar).1. Letakkan setitis kecil salin steril di atas sekeping slaid mikroskop bersih. pengamatan dalam keadaan seperti ini terpaksa dilakukan juga. Tatacara Pelekapan Basah Bakteria BAHAN 1. Letakkan 1 gelung penuh kultur cecair bakteria (yang agak keruh atau tebal) ke atas slaid mikroskop. 3. 6. 2. PENGAMATAN MIKROB PENGAMATAN BAKTERIA 3.1.3. Amati pergerakan bakteria dengan kanta objektif 40X. Sediakan 1 titis suspensi bakteria di tengah-tengah sebuah penutup slaid mengikut tatacara pelekapan basah. Kultur bakteria (dalam botol media broth atau plat kultur) Slaid mikroskop Penutup slaid Plastisin Botol larutan salin (steril) TATACARA 1. 17 . 4. 2. Dalam hal ini terdapat dua tatacara yang boleh digunakan. Buatkan suspensi bakteria dari gelung dawai di dalam titisan salin di atas. 4. iaitu pelekapan basah dan titisan tergantung. 3.

atau disebabkan mikroskop tergoncang. Kadangkala kesemua partikel bergerak ke satu arah menurut aliran cecair. Dalam pergerakan Brown. Intensiti cahaya perlu dikurangkan dengan menurunkan kondenser dan mengecilkan diafragma untuk memberikan kontras yang secukupnya.1 Tatacara melakukan pelekapan basah Rajah muka surat 18 4. 1. Letakkan sebuah penutup slaid mikroskop dan dengan berhati-hati lekapkan di atas suspensi bakteria (usahakan supaya tidak terbentuk gelembung udara). 3. Semasa melakukan pengamatan jangan letakkan tangan di atas meja ataupun menekan meja di mana mikroskop berada. 2. RAJAH 3. Amati pergerakan bakteria dengan kanta objektif 40X. Ini membolehkan sel bakteria kelihatan lebih jelas dan pergerakannya dapat diamati dengan mudah. Amatilah pelekapan basah ini di bawah kanta objektif pembesaran 40X. 6. Ini adalah untuk mengelak daripada suspensi bakteria mengalami gegaran goncangan yang akan menyulitkan pengamatan. 5.Letakkan setitis larutan salin di atas slaid mikroskop bersih dan sentuh 1 koloni bakteria dengan gelung dawai dan buatkan suspensi. NOTA Letakkan sebuah slaid mikroskop yang bersih di atas lingkaran plastisin dan tekan sedikit supaya ia melekat kepada plastisin. atau berlakunya 18 . Angkat dan terbalikkan slaid mikroskop dengan cepat supaya penutup slaid berada di atas dan suspensi bakteria menjadi tergantung. partikel (termasuk bakteria) bergerak perlahan-lahan secara bolak-balik (to and fro) tanpa arah tertentu.

Oleh yang demikian. Dengan berhati-hati sekali angkat dan terbalikkan slaid mikroskop dengan cepat.4. Motiliti sebenarnya ditunjukkan dengan gerakan yang aktif bercorak putaran. Dengan demikian suatu suspensi bakteria yang tergantung akan dihasilkan. penyejatan dari sisi kaca penutup. atau buatkan suspensi bakteria di atasnya. RAJAH 3. yakni 22°C atau 25°C. suhu pengeramannya adalah di bawah 37°C. disarankan agar kultur cecair digunakan. Kelebihan tatacara ini daripada tatacara pelekapan basah adalah perubahan rupa bentuk (distortion) bakteria dikurangkan kerana tidak ditindih oleh penutup kaca. Pengeraman optimum yang biasanya digunakan. Kemudian letakkan sebuah slaid mikroskop yang bersih di atas plastisin dan tekan sedikit supaya melekat kepada plastisin. Kebanyakan spesies yang diambil daripada kultur padat sering memberikan hasil yang negatif untuk motiliti (memperlihatkan tidak motil). untuk melakukan ujian motiliti. dalam hal ini. Dengan hati-hati letakkan cincin plastisin melingkari suspensi tanpa menyentuhnya. Letakkan kaca penutup slaid di atas permukaan yang bersih dan titiskan. 5. atau partikel individu bergerak dengan pantas menuju ke sesuatu arah tertentu. adalah kira-kira 2 jam dan bagi kebanyakan bakteria.2 Tatacara melakukan pelekapan titisan tergantung 19 .

2. 4. Tatacara Membuat Apusan Bakteria BAHAN 1. 2. 3. 2. Rendam slaid kaca di dalam alkohol asid semalaman. 3. Letakkan slaid di atas kertas penyerap dan biarkan sehingga sejuk. 4. Simpan di dalam balang tertutup yang mengandungi metanol 95%. 2. Hapuskan alkohol dengan membakarnya dengan api penunu Bunsen. 20 . Keluarkan slaid mikroskop yang disimpan di dalam bekas yang mengandungi alkohol dengan menggunakan sebuah forseps bersih. 2.5%.85% (steril) TATACARA 1. Lakukan di dalam kabinet asap. 3. Campurkan 5 ml asid hidroklorik pekat kepada 1 liter etanol 70%.3. Slaid mikroskop Etanol 70% Metanol 95% Asid hidroklorik pekat PERSEDIAAN REAGEN Alkohol asid 0. Cuci dengan air suling. 6. PENYEDIAAN UNTUK PEWARNAAN BAKTERIA Tatacara Membersihkan dan Menyimpan Slaid Mikroskop BAHAN 1. Jauhkan bekas slaid yang mengandungi alkohol daripada api. PERHATIAN Pastikan balang slaid tidak diletak berhampiran penunu Bunsen atau sebarang sumber api kerana alkohol mudah terbakar. TATACARA 1. 8. 3. 7.1. PERHATIAN 1. Pegang slaid supaya aras tangan berada lebih tinggi daripada slaid.2. Slaid mikroskop yang disimpan di dalam metanol 95% di dalam bekas yang tertutup Forseps Kertas turas Penunu Bunsen Gelung dawai Pensil gris/pena tanda (marker) kalis air Kultur bakteria Larutan salin 0. Jangan pegang slaid yang dibakar dengan forseps secara tegak untuk mengelak kemungkinan alkohol mengalir ke atas tangan dan menyebabkan kebakaran. 4. 5.

Nanah dan eksudat Ambil 1 gelung penuh spesimen dan sebarkannya di atas slaid supaya mencapai seluas 1. 6. Tandakan sudut kiri atas slaid dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. 4. Sterilkan gelung dawai. Letakkan setitis kecil salin steril di atas sebuah slaid. Letakkan 1 gelung penuh kultur cecair di atas sebuah slaid bersih. 6. 2. 3. Sebarkan sehingga membentuk bulatan seluas kira-kira 1 cm garis pusat. 4. Swab yang mengandungi spesimen klinikal Letakkan setitis kecil salin steril di atas sebuah slaid dan emulsifikasikan spesimen dari swab di dalam titisan salin ini. 2. Sterilkan gelung dawai. 4. 1. 5. Sebarkan suspensi bakteria sehingga membentuk bulatan seluas kira-kira 1 – 2 cm garis pusat. Terbalikkan slaid dan buatkan lingkaran di sekeliling kawasan apusan dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. Urin dan cecair serebrospina 1. Tuangkan supernatan dan masukkan beberapa titis salin steril ke dalam tiub emparan ini. sel bakteria berada dalam keadaan berkelompok dan kemungkinan pewarnaan yang didapati juga tidak sama rata dan morfologi sel individu sukar untuk ditentukan.5 x 2. 2. Gunakan sedikit kultur bakteria supaya apusan yang disediakan membentuk filem yang agak tipis. Buatkan suspensi bakteria daripada gelung dawai di dalam titisan salin.5 cm.000 g selama 10 minit pada suhu bilik. Kacau.5 x 2. NOTA Emparkan urin dan cecair serebrospina pada tekanan emparan 10. 8. Kahak (sputum) Pindahkan sedikit kahak dari bekas spesimen dengan swab steril ke atas sebuah slaid bersih dan sebarkan seluas 1. 7. Jika tidak. 3. sel-sel bakteria akan kelihatan tersusun terlalu rapat dan padat sehingga sukar untuk menentukan morfologinya. 5. Letakkan setitis kecil salin steril di atas sebuah slaid bersih.Kultur bakteria dari broth 1. Biarkan supaya kering di udara. 3. Tandakan sudut kiri atas slaid dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. 21 . Pada apusan yang terlalu tebal. Biarkan sehingga kering di udara. Sentuh 1 koloni bakteria yang terasing dengan gelung dawai. 2. Kultur bakteria dari media padat (agar) 1. Suspensi bakteria harus disebarkan dengan baik supaya menghasilkan apusan yang sama rata. Buat apusan dengan suspensi bakteria yang diperolehi. Terbalikkan slaid dan buatkan lingkaran di sekeliling kawasan apusan dengan pensil gris atau pena tanda kalis air.5 cm. Gunakan setitis suspensi sahaja supaya apusan cepat kering. 3.

Dengan cepat sentuhkan slaid ke atas tapak tangan. ia terlebih dahulu difiksasi. 4. 1. Di samping kebaikan dari segi kesihatan. Adalah lumrah jika di dalam kelas amali terdapat pelajar yang memegang slaid dengan forseps dan memasukkannya ke dalam api penunu Bunsen dengan tujuan untuk mengeringkan dan sekaligus memfiksasi apusan. Fiksasi Bakteria dengan Haba Sebarang proses yang membeku serta memejalkan sel bakteria dan strukturnya dikenali sebagai fiksasi. 22 . Cara yang popular memfiksasi bakteria adalah dengan menggunakan haba dari suatu sumber api. sebab tidak akan memberikan hasil seperti yang diharapkan dan sebaliknya apa yang diperoleh ialah suatu keadaan yang dikenal sebagai artifak. Dalam pengamatan ke atas sesuatu apusan dengan mikroskop. fiksasi juga boleh membunuh bakteria. 3. Sebelum bakteria diwarnai. Lazimnya. 2. Melalukan slaid dengan cepat ke dalam api penunu Bunsen sebanyak 3 kali adalah mencukupi bagi tujuan pemfiksasian. Tatacara Memfiksasi Bakteria dengan Haba BAHAN 1. juga akan menghilangkan haba dari slaid. Apusan bakteria ke atas slaid mikroskop Penunu Bunsen TATACARA 1. Pemanasan yang berlebihan akan menyebabkan perubahan besar dalam bentuk sel bakteria atau sel bakteria menjadi pecah dan mengalami kerosakan. di sekeliling kawasan apusan (di sebelah bawah slaid) dilingkari dengan pensil gris atau pena tanda kalis air supaya tapak di mana terdapatnya apusan mudah dikesan untuk diletak tepat di bawah kanta objektif serta untuk meletakkan titisan minyak rendaman. Lalukan slaid sekali dengan cepat ke dalam api penunu Bunsen. Fiksasi boleh dilakukan dengan cara fizikal (haba. biarkan apusan sehingga benar-benar kering sebelum melakukan fiksasi. dehidrasi) dan cara kimia. Biarkan slaid dingin di udara. Sekiranya slaid dirasakan terlalu panas pada tapak tangan maka besar kemungkinan sel bakteria pada apusan telah mengalami kehancuran atau telah berlaku artifak. 5. pastikan bahawa permukaan slaid mikroskop yang mengandungi apusan berada di sebelah atas menghadap kanta objektif. 5. Amalan ini tidak digalakkan kerana dengan cara demikian adalah sukar untuk menentukan sama ada fiksasi tercapai atau apusan telah terdedah kepada haba terlalu lama. NOTA Pegang salah satu penghujung slaid dengan ibu jari dan jari telunjuk dengan apusan di sebelah atas. 3. 2. Akibatnya pewarnaan yang diusahakan akan sia-sia sahaja. Pemanasan ke atas apusan yang basah dipercayai boleh mengakibatkan perubahan rupa (distortion) morfologi bakteria yang ketara. Proses ini tidaklah semata-mata bertujuan untuk melekatkan sel bakteria kepada slaid. 2. tetapi juga untuk mengekalkan (mengawet) struktur sel bakteria tersebut serta meningkatkan daya penglihatan ke atasnya.4. Ini selain mempastikan slaid tidak terlalu panas. Justeru. Slaid disentuhkan ke atas tapak tangan selepas setiap kali pemanasan. Permukaan slaid di mana terdapatnya apusan ini dapat dipastikan dengan tanda pensil gris yang dapat dikikis atau pena tanda kalis air pada permukaan bawah slaid. Ulangi prosedur ini sebanyak 3 kali (kesemuanya). Sebaik-baiknya. pembunuhan bakteria adalah penting dalam pewarnaan kerana pada umumnya bakteria yang masih hidup sering bersifat kurang telap terhadap kebanyakan pewarna yang digunakan.

3. Apabila diwarnakan dengan pewarna bes. perbezaan indeks biasan yang kecil antara komponen-komponen sel bakteria juga menyulitkan substruktur bakteria untuk dilihat. ciri pewarnaan bergantung kepada kationnya (ion positif). dengan demikian hanya latar belakang (kawasan di luar bakteria) sahaja yang diwarnai.3. pewarnaan ini juga digunakan untuk menggolongkan bakteria. Sebagai langkah untuk mengatasi masalah ini perbezaan warna digunakan untuk memudahkan melihat keseluruhan sel bakteria dan juga untuk mempamerkan substruktur bakteria dan segala-galanya mengenai bakteria dengan lebih terperinci. Pada pewarna asid. iaitu sama ada berasal daripada spesimen klinikal atau dari kultur pertumbuhan. Pewarnaan yang diterangkan setakat ini dikenal sebagai pewarnaan positif kerana yang diwarnakan ialah bakteria. Pewarna yang digunakan. berasal daripada terbitan garam asid bebas kerana bentuk ini lebih larut. pewarnaan ini disebut pewarnaan sederhana (simple staining). atau mordan mempertingkatkan afiniti ataupun kecenderungan pewarna terhadap struktur tertentu. tatacara pewarnaan perbezaan yang menggunakan dua atau lebih pewarna digunakan. fenol atau anilin. Apabila sel bakteria diwarnakan dengan satu jenis pewarna sahaja. Dalam tatacara pewarnaan Gram. Sebaliknya cas negatif ini akan menolak pewarna asid. Di samping membolehkan bakteria dilihat dengan lebih mudah. kristal ungu) kerana protoplasma bakteria mempunyai kandungan asid nukleik bercas negatif yang tinggi. maka jurang perbezaan optikalnya juga adalah sedemikian. Perlu disedari bahawa ciri-ciri pewarnaan bakteria (serta morfologi) dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti umur kultur dan sumber bakteria. mampu menyusup masuk ke dalam sel dengan lebih baik dan pewarnaannya lebih kekal. Tambahan pula. Tindakan aksentuator ini tidak melibatkan pergabungannya dengan pewarna seperti yang berlaku pada mordan. Untuk menunjukkan perbezaan yang wujud di kalangan sel bakteria tertentu. Mordan adalah bahan kimia yang membolehkan sesuatu pewarna mewarnakan sesuatu bahan. cas yang negatif ini akan bertindak dengan ion positif pewarna bes. Bakteria menunjukkan kecenderungan atau afiniti yang kuat terhadap pewarna bes (contoh: safranin. metilena biru. Pewarna dan Jenis Pewarnaan Bahan pewarna boleh dibahagikan kepada dua golongan: pewarna asid dan pewarna bes. Keadaan ini mengakibatkan sel bakteria sukar untuk diamati.1. Pewarnaan Gram Pewarnaan Gram adalah tatacara pewarnaan utama di bidang bakteriologi. Pewarnaan juga digunakan untuk menunjukkan taburan dan jenis kimia berbagai-bagai komponen sel serta membezakan antara golongan-golongan bakteria. keseluruhan sel bakteria diwarnakan secara sama rata dan substruktur atau komponen-komponen selnya tidak dibezakan. umumnya. PEWARNAAN BAKTERIA Oleh kerana perbezaan indeks biasan antara bakteria dan kawasan sekelilingnya tidak besar. Intensiti pewarnaan boleh dipertingkatkan (ataupun supaya sasaran dapat diwarnakan) dengan menggunakan haba dalam keadaan tertentu atau menggunakan bahan kimia (aksentuator) seperti asid asetik. Dalam pewarnaan negatif. Pada umumnya dalam pewarnaan ini. pewarna digunakan secara berlebihan dan kemudian agen penghapus warna atau pembeza digunakan untuk 23 . satu filem pewarna gelap meliputi ruang dan celah di antara bakteria-bakteria (latar belakang) dan bakteria tidak diwarnakan. ciri pewarnaan adalah bergantung kepada anion (ion negatif) dan pada pewarna bes.

2. Liputi apusan dengan kristal ungu selama 1 minit. 6. 8. Sel bakteria berwarna merah/merah jambu: Gram-negatif. Pewarna yang digunakan untuk menggantikan pewarna pertama yang dihilangkan oleh pembeza disebut pewarna balas (counter stain). kemudian buangkan. Nota: peringkat No. kemudian singkirkan keseluruhan air tersebut. Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas penyerap (lipat kertas turas/penyerap. Bacillus subtilis). Segera cuci dengan air. Kultur bakteria Kristal ungu Iodin Lugol Aseton-alkohol Safranin/karbol fuksin Kertas turas Tatacara 1.menghilangkan pewarna berkenaan. reaksi Gram berubah dengan umur kultur. Buat apusan bakteria pada slaid mikroskop. Larutan iodin Lugol yang digunakan berfungsi sebagai mordan dan pelarut organik seperti alkohol dan aseton digunakan sebagai pembeza atau pengnyahwarna. 5. 24 . 5. sentiasa memberikan tindak balas Gram-negatif. keringkan di udara dan fiksasi apusan tersebut. 8 = cuci & keringkan Pengamatan dan Pentafsiran Sel bakteria berwarna biru: Gram-positif. NOTA 1. dalam hal ini. Tatacara Pewarnaan Gram BAHAN 1. 3. Ada juga bakteria Gram-positif seperti Corynebacterium yang mudah kehilangan warna pertamanya dan seringkali kelihatan sebagai Gram-negatif. Liputi pula apusan dengan iodin Lugol selama 1 minit. Bakteria yang mengekalkan pewarna pertama (kristal ungu) disebut sebagai Gram-positif. 3. 6. manakala yang kehilangan pewarna ini dan diwarnai dengan pewarna kedua dinyatakan sebagai Gram-negatif. Hasil tindak balas pewarnaan Gram adalah bergantung kepada komposisi dinding sel bakteria yang berkemampuan untuk mengikat pewarna pertama atau tidak. 2. masukkan slaid ke dalam lipatan dan tekan kertas dari luar sehingga semua air terserap daripada slaid tanpa menggosok permukaan slaid atau apusan). Kultur tua bakteria Gram-positif memberikan reaksi Gram tak tetap (Gram variable) – ada sel yang terwarna biru dan ada yang terwarna merah bercampur di antara satu dengan lainnya. Cuci dengan air. 2. sel vegetatifnya akan terwarna Gram-negatif atau granul-granul di dalam sel diwarnakan Grampositif selama beberapa generasi selepas spora bergerminasi. Pada beberapa spesies basilus aerobik yang menghasilkan spora (contoh. Kemudian liputi apusan dengan safranin atau karbol fuksin cair selama 30 saat. 4. 4. Dalam kebanyakan spesies bakteria. Pegang slaid di dalam sinki secara condong dan titiskan dengan cepat aseton-alkohol ke atas apusan sehingga tiada warna biru (kristal ungu) terlihat keluar dari apusan (lebih kurang 3-10 saat bergantung kepada ketebalan apusan). 7. Protoplasma bakteria.

Buat apusan bakteria pada slaid mikroskop. Oleh yang demikian. 8. Kultur bakteria Karbol fuksin Ziehl-Neelsen Alkohol asid Metilena biru Alkohol Sebatang kaca yang satu penghujungnya dibalut kain kasa (gauz) Kertas turas Penunu Bunsen TATACARA 1. keringkan di udara dan fiksasikan apusan tersebut. Pada bakteria tahan asid. Banjirkan apusan dengan pewarna karbol fuksin Ziehl-Neelsen. 3. Biarkan sejuk dan cuci dengan air. alkohol dan asid lemak (seperti asid mikolik) yang tersendiri. Sifat tahan asid ini merupakan ciri yang berfaedah dan penting dalam membezakan mikobakteria dengan bakteria lain. (Beberapa spesies aktinomiset juga tahan asid). manakala pada bakteria tak tahan asid pewarna tersebut akan hanya masuk ke dalam sel dan kemudian disingkirkan daripada sel oleh penghilang warna. Ciri-ciri ini disebabkan oleh perbezaan komposisi kimia (secara kuantitatif dan kualitatif) bakteria tahan asid dan bakteria tak tahan asid. 3. Di samping ciri-ciri ini.Pewarnaan Ziehl-Neelsen (Pewarnaan Tahan Asid) Mikobakteria yang diwarnakan dengan pewarna fenilmetana (contoh: fuksin bes) dalam larutan anilin atau fenol akan mengekalkan warna tersebut meskipun telah didedahkan kepada asid yang kuat berbanding dengan bakteria jenis lain. dalam tatacara ini slaid perlu dipanaskan sehingga wap keluar kerana. (Pastikan pewarna tidak mendidih atau menjadi kering). 7. 2. 6. kadar resap pewarna pada sel yang tahan asid adalah rendah berbanding dengan sel tak tahan asid. Liputi pula apusan dengan metilena biru selama 30 saat. Lakukan ini sehingga keluar wap dari apusan selama 5-10 minit. Oleh yang demikian. 4. dalam hal ini. Cuci dengan air. Oleh yang demikian. Cuci dan keringkan dengan kertas penyerap. 2. apabila bakteria yang telah diwarnakan didedahkan kepada penghilang warna. Sebaliknya boleh juga dengan menggunakan sebatang kaca yang salah satu penghujungnya 25 . 5. 4. 7. Pemanasan dilakukan dari bahagian bawah slaid (apusan di permukaan atas) yang diletakkan di atas rak pewarnaan iaitu dengan menggunakan api kecil penunu Bunsen. Sel bakteria berwarna biru kehijauan: bakteria tak tahan asid. Panaskan slaid dengan api pembakaran kain gauz yang dibasahi dengan alkohol. 6. 8. Tambahkan alkohol-asid (penghilang warna) selama 25-30 saat. 5. Mikobakteria yang tahan asid mempunyai karbohidrat. bakteria golongan pertama ini disebut sebagai bakteria tahan asid. Tatacara Pewarnaan Ziehl-Neelsen BAHAN 1. NOTA 1. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Sel bakteria berwarna merah: bakteria tahan asid. pewarna fenol mempunyai kelarutan yang tinggi di dalam sel dibandingkan dengan pembeza (penghilang warna). haba digunakan untuk membolehkan pewarnaan terlaksana dalam jangka masa yang munasabah. pewarna berkenaan kekal di dalam sel.

Pewarnaan Schaeffer-Fulton (Pewarnaan Spora) Bakteria Genus Bacillus dan Clostridium dicirikan dengan kehadiran struktur bulat atau bujur yang dinamakan spora (atau endospora). 2. Volutin ini terdiri daripada polimetafosfat yang mempunyai berat molekul tinggi dan dihubungkaitkan dengan bakteria genus Corynebacterium. Buat apusan pada slaid mikroskop. dibalut dengan kain yang dicelup di dalam alkohol dan kemudian dinyalakan. granul volutin akan kelihatan merah dan bukan biru. 4. komponen ini akan kelihatan berwarna biru kehitaman dan bukan biru. Elakkan daripada memanaskan slaid dan pewarna dengan memegang slaid dengan forseps dan memasukkannya langsung ke dalam api penunu Bunsen. 5. Kadangkala sel mikobakteria tidak terwarna sama rata dan kelihatan berjalur merah berselang-seli dengan bahagian tanpa warna atau kelihatan berbutir. Dalam keadaan ini. Ini adalah suatu artifak yang disebabkan oleh beberapa faktor seperti kemurnian pewarna karbol fuksin. sedangkan pada sel 26 . Apusan kultur bakteria Pewarna Albert Iodin Gram Kertas turas TATACARA 1. Toluidina biru adalah pewarna metakromatik: apabila pewarna ini masuk ke dalam kompleks granul volutin yang besar. 4. Liputi apusan dengan pewarna Albert selama 5 minit. Tatacara Pewarnaan Albert BAHAN 1. Tapak atau kedudukan spora di dalam sel serta saiz spora berbanding dengan sel yang mengandunginya mempunyai kepentingan taksonomi. Pewarnaan Albert (Pewarna Granul Metakromatik) Volutin bakteria (granul metakromatik) adalah bahan basofilik yang refraktif. 3. Walau bagaimanapun. pendedahan metilena biru kepada udara menyebabkan sebahagian kecil daripada pewarna ini dioksidasi menjadi metilena ungu pada pH tinggi dan metilena ungu secara selektif mewarnakan volutin tersebut. 2. Spora bakteria hanya dapat diwarnakan jika mordan atau haba digunakan. daya kelarutan fenol di dalam air dan kehadiran elektrolit di dalam larutan pewarna. Jika diwarnai dengan toluidina biru. Cuci dengan air dan keringkan. sel pesakit akan berwarna biru-kehijauan. Semasa pendinginan/pencucian pewarna terperangkap di dalamnya. Sitoplasma bakteria yang berwarna hijau tanpa butir-butir berwarna biru kehitaman di dalamnya: Tiada granul metakromatik. Cuci dengan air. Tetapi jika metilena biru digunakan. Pemanasan meningkatkan ketelapan dinding spora sehingga pewarna malakit hijau dapat dengan mudah masuk dan mewarnai struktur ini. volutin ini mengubahkan spektrum serapan (absorption) toluidina biru supaya pada mata kasar pewarna ini kelihatan telah berubah warnanya dari biru kepada biru kehitaman. 3. 3. keringkan dan fiksasikannya.2. Keadaan ini disebabkan oleh fenomena metakromasi yang melibatkan perubahan di dalam warna sesuatu bahan. Liputi pula apusan dengan iodin Gram selama 1 minit. keadaan ini sebenarnya bukanlah merupakan fenomena metakromasi sungguhpun di dalam bidang bakteriologi ia dinyatakan demikian. Jika spesimen klinikal digunakan. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Butir-butir berwarna biru kehitaman di dalam sitoplasma bakteria yang berwarna hijau: Kehadiran granul metakromatik.

NOTA 1. Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas turas. 6. Panaskan sehingga wap keluar beberapa kali tetapi jangan sampai mendidih (tambah pewarna jika akan mengalami kekeringan). Butir berwarna hijau adalah spora bakteria. 2. iaitu suatu struktur yang menyelubungi keseluruhan sel bakteria dan sukar untuk diwarnai. keringkan dan fiksasikannya. 4. Liputi apusan dengan malakit hijau 5%. manakala bahagian sel vegetatif bakteria berwarna merah. tatacara ini jarang digunakan kecuali untuk mengamati kapsul. maka ia kelihatan lebih terang (di sekeliling sel). 5. Biarkan selama 1 hingga 3 minit. Oleh kerana sebahagian daripada sel telah mengalami lisis. Jika apusan bakteria tidak dipanaskan secukupnya. Cuci dengan air. Liputi pula apusan dengan safranin selama 30 saat. tetapi granulgranul halus dakwat India hanya menghasilkan latar belakang yang gelap dalam bidang penglihatan. Walau bagaimanapun. Apusan kultur bakteria Malakit hijau 5% Safranin Batang kaca yang dibalut kain kasa pada salah satu penghujungnya Kertas turas Alkohol TATACARA 1. 27 . Teknik ini sebenarnya tidak mewarnai sebarang struktur pada mikroorganisma. Disebabkan ketumpatan kapsul lebih rendah daripada sel. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Butir-butir berwarna hijau di dalam sel bakteria yang berwarna merah ATAU butir-butir berwarna hijau bertaburan di luar sel bakteria. di dalam apusan akan kelihatan spora yang bebas. Tatacara Pewarnaan Schaeffer-Fulton (Pewarnaan Spora) BAHAN 1. Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India (Pewarnaan Kapsul) Pewarnaan negatif dengan dakwat India membolehkan bakteria diamati dalam keadaan masih utuh dan tanpa perubahan rupa bentuk yang disebabkan oleh agen kimia (contoh: pewarna) dan agen fisikal (contoh: haba) serta membolehkan morfologinya ditentukan dengan cepat. Buat apusan pada slaid mikroskop. 2. 7. 6. ia tercuci bersih. spora akan kelihatan tanpa warna atau berwarna pudar. Pewarna malakit hijau nampaknya merupakan pewarna terbaik untuk pewarnaan spora bakteria. 3.vegetatif. 4. 2. 3. Pewarna balas memberikan warna yang kontras supaya spora dapat dikesan dengan mudah. 5.

Jika terlalu banyak dakwat digunakan bakteria mungkin tidak dapat dilihat kerana transmisi cahaya terhalang. 3.85% (steril) Tabung yang steril Gelung dawai Penunu Bunsen Alat penyimpan grid atau piring Petri yang dialas dengan kertas turas 28 . Tambahan pula. NOTA 1. ia mempunyai nilai diagnostik. struktur flagela serta tapaknya lebih mudah dipastikan dengan mikroskop elektron melalui pewarnaan negatif dengan asid fosfotungstik. 2. Tutup campuran dengan penutup slaid. Campurkan dengan baik satu gelung kecil dakwat India ke dalam suspensi mikroorganisma yang telah disediakan. Kultur bakteria Larutan salin 0. 3. 3. 2. 5. bengkok No. Klebsiella pneumoniae dan fungus Cryptococcus neoformans. Pewarnaan Negatif Flagela dengan Asid Fosfotungstik Pengamatan flagela bakteria dapat dilihat dengan mikroskop cahaya selepas berlakunya pewarnaan seperti pewarnaan tatacara Gray. 3. 10. 9. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Kapsul kelihatan sebagai suatu lapisan cincin lutcahaya atau bersinar melingkari keseluruhan sel di atas latar belakang yang gelap. Dalam hal ini. 4.7 Grid mikroskop elektron yang disaluti filem Formvar Asid fosfotungstik 1. 2.5 Kepingan kertas turas gred Whatman No.5%. 4. Ia merupakan tatacara yang paling mudah untuk mengesan kehadiran kapsul dan sering digunakan ke atas spesies bakteria seperti Streptococcus pneumoniae. Kultur bakteria Forseps jenis tukang jam tangan. Tatacara Pewarnaan Negatif Flagela dengan Asid Fosfotungstik BAHAN 1. tatacara pewarnaan flagela yang hasilnya kemudian diamati dengan mikroskop cahaya adalah sukar dilakukan. 7. Namun demikian. 5. Sebagai pilihan lain. 4. 6. 8. Intensiti cahaya perlu dikurangkan untuk memberikan kontras yang lebih baik.Tatacara Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India (Pewarnaan Kapsul) BAHAN 1. ia melibatkan penggunaan logam berat yang akan menyumbang kepada pencemaran alam sekitar.85% (steril) Penutup slaid Slaid mikroskop Dakwat India (PelicanTM atau PilotTM) TATACARA 1. pH 6. 2. Letakkan setitis kecil kultur cecair ke atas slaid mikroskop atau buatkan suspensi organisma dari sedikit pertumbuhan kultur muda mikroorganisma pada media padat di dalam setitis salin dengan menggunakan dawai inokulasi. Kurangkan cahaya mikroskop dengan menurunkan kondensernya dan amati kultur dengan objektif 40X (untuk fungus) atau objektif minyak rendaman (untuk bakteria). 1 Larutan salin 0.

Ini merupakan suatu kriteria yang berfaedah dalam pengenalpastian bakteria. PENGKELASAN BENTUK DAN SUSUNAN SEL VEGETATIF BAKTERIA Bentuk Kokus Basilus Vibrio Spirilla Spiroket Berfilamen Susunan Bakteria yang membiak secara aktif mempunyai kecenderungan untuk mengekalkan susunan selnya yang menjadi ciri bakteria tersebut. oleh kerana saiz bakteria lebih besar daripada virus. 5. 3. 4. Berbagai-bagai susunan sel bakteria dikenali dan telah ditentukan berdasarkan perbezaan dari segi pertumbuhan serta strukturnya. Pindahkan 1 ml salin ke dalam tabung. Tatacara Pengamatan Grid yang Disaluti Spesimen Bakteria Selepas Pewarnaan Negatif Tatacaranya adalah seperti pengamatan partikel virus (lihat muka surat 41-42).1. Simpan grid di atas alat penyimpan grid atau di dalam piring Petri yang dialas dengan kertas turas. kuasa pembesaran yang digunakan adalah di antara 5000 – 10 000 kali ganda sahaja. Sterilkan gelung dawai dan pindahkan 1 koloni bakteria ke dalam tabung. 2. Biarkan 1 minit sebelum cairan diserap oleh kepingan kertas turas. Serapkan larutan asid fosfotungstik dengan menyentuhkan pinggir grid dengan kepingan kertas turas. 3. 6. Susunan sel-sel basilus: Sel tunggal Berpasangan Berantai Palisad Tak teratur 29 .4.TATACARA 1. Pindahkan 1 titis suspensi bakteria ke atas grid pada permukaan yang disaluti Formvar. Walau bagaimanapun. Pindahkan 1 titis larutan asid fosfotungstik ke atas grid berkenaan dan biarkan 1 minit. 7.

2.85% Kaca penutup slaid TATACARA 1. Beberapa pewarnaan yang digunakan dalam bidang bakteriologi juga digunakan dalam bidang mikologi sungguhpun prosedurnya disesuaikan untuk fungus. 4.1. ataupun ke atas kultur dari sesuatu spesimen klinikal. PENGAMATAN FUNGUS DI DALAM SUSPENSI CAIRAN Pelekapan basah fungus di dalam salin dilakukan dalam pengamatan secara langsung fungus. 3. PERHATIAN 1. Di dalam salin. berkilat atau hijau pudar. di mana pelekapan basahnya hanya terhad kepada ujian motiliti.2. Tatacara Pelekapan Basah Salin BAHAN 1. dan jika perlu. 2.2. Tutup dengan kaca penutup slaid. Perbezaan di antara yis dengan gelembung udara dan sel darah merah: Sel yis mengandungi badan inklusi. 3. Berbeza dengan bakteria. 3. Pengamatan ke atasnya boleh dilakukan dalam bentuk pelekapan basah atau terhadap apusan fungus yang telah diwarnai.Susunan sel-sel kokus: Kokus tunggal Diplokokus Tetrad (berempat) Berantai Berkelompok 3. pengamatan fungus boleh dilakukan sama ada melalui pemeriksaan secara langsung ke atas spesimen yang diambil. Spesimen yang disyaki mengandungi fungus Larutan salin 0. keutuhan sel dan organisma tersebut dapat dikekalkan. PENGAMATAN FUNGUS Seperti juga bakteria. perhitungan jumlah sel epitelium dan sel darah putih dapat dilakukan. 30 . Letakkan 1 titis salin ke atas slaid mikroskop. Amati dengan objektif 10X (jumlah kuasa 100X) dan kemudian 40X (jumlah kuasa 400X). pelekapan basah fungus berperanan penting dalam pengenalpastian fungus serta diagnosis penyakit yang disebabkan olehnya. Tambahkan 1 titis spesimen. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Fungus akan kelihatan refraktil.

masing-masing 100X dan 400X). Letakkan 1 titis larutan KOH di tengah slaid mikroskop. dengan kondenser mikroskop diturunkan untuk memberikan kontras yang secukupnya. 5. NOTA Intensiti cahaya dikurangkan. Tutup spesimen dengan kaca penutup perlahan-lahan. 4. Pelekapan ini tidak dipanaskan dan diamati dalam masa 20 minit. 4. Penjernihan biasanya dilakukan dengan KOH mungkin kerana bahan kimia ini mudah didapati di dalam makmal. Spesimen 10-20% Kaca penutup slaid Penunu Bunsen KOH TATACARA 1. Pelekapan Basah Kalium Hidroksida (KOH) Spesimen kikisan kulit dan rambut diamati secara langsung untuk pengesanan fungus dalam pelekapan basah yang terdiri daripada larutan penjernih. Tatacara Pelekapan Basah Kalium Hidroksida (KOH) BAHAN 1. Gliserin yang ditambah mengakibatkan pelekapan menjadi lambat kering dan menghalang presipitasi KOH. Perbezaan hifa dengan kristal panjang: Penghujung kristal tidak bersambung atau terputus-putus. 3. 2. Jenis larutan kalium hidroksida penjernih termasuklah natrium lauryl 5% di dalam air suling. KOH (20%) melarutkan keratin dan memudahkan pengamatan ke atas hifa fungus. adalah legap dan latar belakang ini boleh menyelubungi fungus. Proses penjernihan dapat dipercepatkan melalui pemanasan. 4.2. Masukkan spesimen ke dalam titisan KOH. Untuk kuku dan kikisan kulit yang keras. 2. yang mengandungi keratin. 3. Kulit. rambut dan kuku. PERHATIAN Pelekapan KOH juga boleh digunakan untuk spesimen kahak (sputum) atau spesimen daripada vagina yang banyak mengandungi bahan mukoid. biasanya terletak di penghujung atau perbatasan sel. Amati dengan objektif 10X dan kemudian 40X (jumlah kuasa. Mosaik fungus (artifak): Jaringan jisim yang mempunyai bentuk yang berbeza-beza dan tidak teratur. Perbezaan di antara hifa dengan benang kapas: Pinggiran atau lebar (kaliber) benang kapas tidak teratur dan serat benang sering berpilin atau kelihatan melingkari sesuatu paksi dan penghujungnya berumbai. Panaskan dengan api pilot penunu Bunsen sehingga pelekapan basah ini menjadi jernih tanpa pendidihan (5-20 minit). tatacara ini dapat diubahsuai dengan penambahan dimetil sulfoksida (DMSO) 40%. bentuk kristal berbeza-beza dan larut air. Tekan kaca penutup slaid. 3. Masalah ini boleh diatasi dengan menggunakan beberapa persediaan yang boleh menghancurkan serta melarutkan keratin supaya latar belakang menjadi jernih. 6. natrium sulfida 10% di dalam alkohol 20% dan larutan kalium hidroksida (KOH) atau natrium hidroksida (NaOH). 31 .

Ambil sebahagian kecil bahan fungus dari kultur dengan menggunakan jarum atau dawai bengkok di atas. 32 . 3. Bakar jarum atau dawai apabila sudah selesai. 5. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Miselium (dinding dan septum sel) serta struktur spora (fruiting structures) kelihatan biru tua di atas latar belakang yang berwarna pudar (muda). Jangan panaskan pelekapan KOH terlalu lama atau dengan suhu yang terlalu tinggi kerana akan terbentuk hablur KOH. Penutup slaid ditekan untuk memperoleh sediaan yang tipis dan untuk mengeluarkan KOH yang berlebihan. Leraikan bahan fungus ini dengan menggunakan 2 dawai. Pelekapan yang tidak jernih mungkin mengandungi artifak yang mirip dengan struktur fungus. Masukkan spesimen ke dalam titisan LCB. 6. Intensiti cahaya dikurangkan untuk memberikan kontras yang secukupnya. 2. 3. Persediaan menjadi lebih jernih dan oleh yang demikian. 2. 2. maka memudahkan fungus diamati. Dalam hal ini. NOTA 1. Tutup spesimen dengan kaca penutup dengan perlahan tanpa menekan spesimen. 7. Amati dengan objektif pembesaran 10X dan 40X. Dalam pengamatan ke atas fungus. jangan tersalah anggapan bahawa bahagian tepi sel (dinding sel) adalah hifa. Titiskan 1 titis kecil LCB di tengah-tengah slaid mikroskop. fungus lebih mudah dapat diamati jika dibiarkan 1 hingga 2 jam.PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Hifa adalah dalam bentuk filamen kurus dengan bahagian tepinya sejajar dan disusun secara rawak berbanding dengan sel. 3. 5. gliserol mengelak pelekapan basah menjadi kering dan pewarna cotton blue diserap oleh struktur kitin fungus dan mewarnainya. fenol membunuh fungus. 5. 4. persediaan lactophenol cotton blue digunakan untuk membuat pelekapan basah fungus sama ada dari spesimen ataupun dari kultur untuk pengamatan mikroskop. 4. Asid laktik mengekalkan struktur fungus serta menjernihkan latar belakang. Spesimen fungus Slaid mikroskop Kaca penutup slaid Jarum atau dawai dengan penghujungnya dibengkokkan Lactophenol cotton blue (LCB) TATACARA 1. 4. 6. Tatacara Pelekapan Basah Lactophenol Cotton Blue (LCB) BAHAN 1. Pelekapan Basah Lactophenol Cotton Blue (LCB) Pelekapan basah yang juga mengandungi sejenis pewarna akan memudahkan pengamatan fungus.

Masing-masing daripada kultur yang diuji. 7. Hilangkan pewarna dengan asid sulfurik 1% sehingga tiada lagi pewarna yang keluar. 2. Sebaliknya fungsi haba diambil alih oleh sejenis detergen (Tergitol) yang bertindak di atas permukaan sel. kultur yang diuji) Karbol fuksin Kinyoun Etanol 50% Asid sulfurik 1% Metilena biru 2. ambillah spesimen daripada bahagian koloni yang terletak di antara tepi dan tengahnya: bahagian tepi dan tengah koloni biasanya terdiri daripada struktur yang sama ada terlalu muda atau terlalu tua dari segi pembentukan spora dan berkemungkinan akan memberikan hasil pengamatan yang kurang memuaskan. PEWARNAAN FUNGUS 3. suatu pengubahsuaian pewarnaan tahan asid perlu dilakukan khususnya untuk Nocardia. 2. Cuci dengan air yang mengalir. Kultur fungus (kontrol kultur positif. 4. Pewarnaan Gram Semua fungus adalah Gram-positif. Pada kultur fungus.NOTA 1.5% di dalam etanol 95% Kertas turas Penunu Bunsen TATACARA 1.2. Fiksasi apusan dengan haba. 5. 8. Buatkan 3 apusan tipis. muka surat 23-24). 2. 6. 5. Cuci dengan air. Tatacara Pewarnaan Gram Tatacara tersebut adalah seperti yang dilakukan untuk bakteria (lihat pewarnaan Gram. kontrol kultur positif dan negatif dan biarkan kering di udara. 7. 6. Pewarna tahan asid yang digunakan untuk mikobakteria mungkin menyahwarnakan pewarna secara berlebihan ke atas spesies ini dan memberikan hasil yang negatif palsu. 33 . Cuci dengan air. 3. 3. 4.2. Tatacara Pewarnaan Tahan Asid Diubahsuai Kinyoun BAHAN 1. Oleh yang demikian. Kapsul Cryptococcus neoformans lazimnya menghalang sel yis ini daripada diwarnai dengan sempurna dan seringkali mengakibatkan ia kelihatan seperti bahan lemak Gram-negatif berwarna merah jambu pucat (lavender) dengan badan inklusi yang bergranul berwarna ungu (Gram-positif). negatif. Pewarnaan Tahan Asid Diubahsuai Kinyoun Tatacara ini tidak menggunakan haba untuk memudahkan pewarna memasuki sel. Banjiri dengan etanol 50% sehingga tiada lagi pewarna yang keluar (biasanya sejurus selepas alkohol ditambah). Struktur fungus lebih mudah dilihat jika pelekapan ini dibiarkan selama kira-kira 10 minit. Nocardia adalah aktinomiset yang bersifat separuh tahan asid. Aktinomiset adalah golongan bakteria yang hampir menyerupai fungus dan secara tradisional dirangkumkan ke dalam bidang mikologi. Banjiri slaid dengan karbol fuksin Kinyoun dan biarkan selama 5 minit.

nukleus kelihatan biru dan latar belakang adalah hijau. Pewarnaan Metenamin-Argentum Gomori Pewarnaan metenamin-argentum Gomori dianggap sebagai pewarnaan yang amat berguna dalam penyaringan spesimen klinikal bagi fungus. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Fungus (dan juga komponen tisu) yang mempunyai polisakarida di dalam strukturnya kelihatan merah ungu. 2. ia tidak boleh digunakan lagi jika tiada warna yang muncul atau warnanya ungubiru. Cuci dengan air dan keringkan. Fiksasikan apusan dengan metanol mutlak selama 5 – 15 minit. 3. Aktinomiset tidak diwarnakan dengan baik atau langsung tidak diwarnakan dengan tatacara ini.9. Titiskan reagen Schiff selama 20 minit. 6. Tatacara Pewarnaan Asid Periodik-Schiff BAHAN 1. Cuci dengan air suling selama 15 minit dan keringkan. 5. 6. Pewarnaan ini amat berguna untuk mengesan fungus pada keratan tisu serta apusan seperti kikisan kulit. 34 . Balas warna dengan metil hijau selama 5 – 10 minit. 10. Keberkesanan tindakan pewarna Schiff boleh diuji dengan menitiskannya ke dalam formalin 40%. Bilas seketika dengan air suling. 2. Sebaliknya.2-glikol daripada polisakarid fungus ke gugusan aldehid. Liputi dengan larutan metilena biru selama 1 minit. NOTA 1. 5. 4. Cuci dengan air paip selama 10 minit sehingga warna merah jambu muncul. Reagen ini masih boleh digunakan jika ia cepat berubah menjadi ungu-merah. 7. 4. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Nocardia kelihatan merah manakala bakteria lain dan fungus kelihatan biru. 3. Pewarnaan ini memberi kontras yang lebih ketara dan biasanya mewarnakan elemen fungus yang tidak ditunjukkan oleh pewarnaan lain. Grup aldehid yang reaktif ini bergabung dengan reagen Schiff-leuko-fuksin untuk menghasilkan warna fuksin merah ungu. 2. Pewarnaan Asid Periodik-Schiff Dalam pewarnaan asid periodik-Schiff (periodic acid-Schiff – PAS). Askus yis kelihatan merah manakala blastokonidia berwarna biru. Apusan spesimen pada slaid mikroskop Metanol mutlak Asid periodik 1% Reagen Schiff Metil hijau 2% Air suling TATACARA 1. asid periodik mengoksidasi gugusan 1. Titiskan larutan asid periodik selama 10 minit.

14. NOTA 1. 11. 95% dan mutlak. Apusan spesimen pada slaid mikroskop Ketuhar Asid kromik 5% Natrium bisulfit 1% Larutan metenamin-argentum nitrat (pewarna Gomori) Aurum (emas) klorid 0. Oleh yang demikian semua yang diwarnakan kelabu tua tidak semestinya fungus. 3. Cuci dengan air paip selama 5 – 10 minit. 2. Cuci dengan air. 2. alkohol 95%. 3. 8. 5. 4. Hilangkan argentum yang tidak tereduksi dengan natrium thiosulfat selama 2 hingga 5 minit.1% selama 2 hingga 5 minit. 7. Letakkan slaid yang mengandungi apusan di dalam larutan asid kromik selama 1 jam. 7. 11. 17.Tatacara Metenamin-Argentum Gomori BAHAN 1. manakala bahagian di dalam miselium dan hifa diwarnakan kelabu tua dan latar belakang adalah hijau muda. 10. 16. Jernihkan spesimen dengan 2 hingga 3 kali pertukaran xilena. alkohol 70% Xilena Forseps yang disaluti parafin PermountTM TATACARA 1. 35 .04% Alkohol mutlak. Liputi apusan dengan larutan emas klorid 0. Larutan stok metenamin-argentum nitrat adalah stabil jika disimpan di dalam peti beku. Periksa apusan dengan mikroskop untuk menentukan sama ada fungus telah terwarna perang tua atau memerlukan pengeraman yang lebih lama. Balas warna dengan pewarna light green selama 30-45 saat. Letakkan slaid di dalam bekas yang mengandungi larutan metenamin-argentum nitrat dan eramkan bekas berkenaan di dalam ketuhar pada suhu 58-60°C. Bilas 6 kali dengan air suling apabila kontrol menunjukkan pewarnaan yang optimum telah dicapai. Bilas dengan air suling. Keringkan dengan 2 pertukaran masing-masing alkohol 70%. 9.1% Natrium thiosulfat 2% Larutan light green 0. Gunakan forseps yang diselaputi dengan parafin untuk mengeluarkan slaid dari larutan metenamin-argentum nitrat dan celupkannya ke dalam air suling. 12. 12. Komponen tisu sebagai latar belakang diwarnai kuning dengan nukleus berwarna hitam. 9. 15. Sesetengah bakteria (termasuk Nocardia spp) serta sesetengah komponen tisu juga diwarnakan. Cuci dengan air paip selama 15 saat. Bilas dengan natrium bisulfit selama 1 minit. 13. Cryptococcus neoformans diwarnai merah muda gelap atau merah. Presipitasi putih yang muncul berikutan penyimpanan boleh dihilangkan dengan menggoncangnya. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Dinding sel fungus (serta fiber retikulum dan fiber elastik tisu) terwarna hitam. 8. 10. 5. Cuci 3 kali dengan air suling. 6. 4. 6. Lekapkan dengan media pelekap PermountTM. 2.

Nocardia serta fungus tua dan yang telah mati mungkin memerlukan masa pengeraman yang lebih lama (sehingga 90 minit) dengan larutan metenamin-argentum nitrat untuk diwarnai. Morfologi mikroskopik Morfologi fungus bermiselium Hifa: Saiz: garis pusat yang berbeza Pigmentasi: tanpa warna atau berwarna Berseptum atau tak berseptum Bercabang atau tak bercabang Spora aseksual: Blastokonidia (blastospora) Klamidokonidia (klamidospora) Artrokonidia (artrospora) Bentuk spora yang dihasilkan secara langsung dari miselium vegetatif. alkohol 95% dan air suling.3. BENTUK DAN STRUKTUR FUNGUS DALAM KULTUR 1. Tatacara Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India Tatacara tersebut adalah seperti yang dilakukan ke atas bakteria (Rujuk tatacara yang sama bagi bakteria) 3. keratan tisu terlebih dahulu dihilangkan parafinnya dengan 2 pertukaran rendaman di dalam xilena dan kemudian dihidrasikan melalui suatu urutan rendaman di dalam alkohol mutlak. Tatacara ini boleh juga digunakan untuk keratan tisu dari ketulan parafin. 5. Bercabang Tak bercabang Membengkak 36 . khususnya bagi Cryptococcus neoformans di dalam mendapan cairan serebrospina dalam diagnosis kes meningitis. Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India Pewarnaan ini digunakan untuk menunjukkan kehadiran kapsul yis. Dengan spesimen jenis ini.2. Spora asekual (konidia) yang dihasilkan daripada hifa khas yang disebut konidiofor.3. Pastikan pewarnaan tidak menjadi telalu gelap hingga struktur morfologi halus tidak dapat diamati. 4.

Bentuk konidiofor: Konidia Makrokonidia (konidia bersaiz besar pada fungus yang menghasilkan konidia yang besar dan kecil) Septum: Berseptum atau tanpa septum Bujur Raket Berbentuk gada (clavate) Bernodul Sabit Sigar Bengkok dan berkeadaan tidak sempurna (distorted) Bentuk: Berasingan Berkelompok Berantai Susunan dari konidiofor: Mikrokonidia (konidia bersaiz kecil pada fungus yang menghasilkan konidia yang besar dan kecil). Bulut/sfera Bujur (ovoid) Ala buah pear (piriform) Gada Bentuk: Tunggal Bertunas Multipel 37 .

Potong filem di bahagian yang berhampiran dengan tepi slaid supaya terdapat filem berbentuk segi empat. sama ada ke atas spesimen yang diambil ataupun ke atas kultur daripada sesuatu spesimen klinikal. 2. Dua elektromagnet mempunyai fungsi seperti kondenser mikroskop cahaya untuk memfokuskan aliran elektron ini ke atas spesimen tersebut. Spesimen virus diletakkan di atas lapisan filem ini. Seperti juga bakteria dan fungus. 4. spesimen diletakkan di atas satu lapisan tipis plastik atau karbon yang disebut filem sokongan. garis pusatnya bergantung kepada jenis mikroskop elektron Slaid mikroskop Pisau cukur Mangkuk kaca ~ 10 cm isipadu Forseps Air suling TATACARA 1. 7. aliran elektron yang digunakan sebagai sumber radiasi diarahkan ke atas spesimen. 38 . Tunggu sehingga semua gelembung udara bergerak ke permukaan air. Dalam mikroskopi elektron. Mikroskop elektron transmisi mempunyai julat kuasa pembesaran di antara 1500 hingga 500000 kali dan had kuasa resolusi 0.3. PENGAMATAN VIRUS DENGAN MIKROSKOP ELEKTRON Dalam pengamatan bakteria dan fungus dengan mikroskop cahaya. 5.3. dan satu siri kanta magnetik yang digunakan untuk membelok dan memfokuskan aliran elektron.5 nm berbanding dengan kuasa pembesar mikroskop cahaya yang hanya berkisar di antara 30 sehingga 1500 kali dan had resolusi 200 nm. Filem yang nipis serta lembut ini diletak ke atas suatu jaringan halus berbentuk bulat yang dinamakan grid. 2. 3. karbon murni. plastik formal polivinil (Formvar TM). Isikan bekas air dengan air suling sehingga penuh. diwarnakan secara negatif dan kemudian diamati dengan mikroskop elektron. Filem sokongan ini diletakkan di atas grid kuprum berbentuk jaringan halus. 6. Slaid berkenaan kemudian dikeluarkan dan permukaan slaid dipegang secara tegak dengan paksi panjangnya agak disendengkan dan biarkan sehingga kering. 4. Komponen asas mikroskop elektron adalah sumber elektron. spesimen yang akan diamati diletakkan pada sebuah slaid kaca yang kemudian diletak di atas pentas mikroskop. Dalam elektron mikroskop jenis transmisi. Pengamatan ke atasnya boleh dilakukan dengan teknik mikroskopi elektron langsung ataupun dalam bentuk teknik pengubahsuaian mikroskopi elektron imun – yang dapat meningkatkan kesensitifan dalam pengesanan virus melalui mikroskopi elektron tersebut. Formvar E larutan 0. Tatacara Penyalutan Grid dengan Lapisan Formvar BAHAN 1. Penyalutan Grid dengan Lapisan Formvar Virus perlu diletak di atas filem sokongan sebelum partikel virus dapat “diwarnakan” dan diamati. Bahan-bahan yang berfungsi sebagai filem sokongan adalah plastik nitroselulos (contoh Parlodion TM). Fokus yang halus boleh didapati dengan binokular berkuasa rendah. dan kedua-dua jenis plastik tersebut yang distabilkan oleh karbon.5% di dalam kloroform Grid kuprum 400 mesh. 3. Slaid dicelupkan ke dalam larutan formvar selama 15 – 20 saat. Penaburan elektron oleh spesimen menghasilkan imej yang diperbesar di atas layar pendaflour. pengamatan terhadap virus boleh dilakukan secara langsung.

Apungkan 1 grid dengan permukaan filem sokongannya bersentuhan dengan titis suspensi virus selama 3 minit.5%. jumlah elektron yang sampai ke layar dari kawasan yang mempunyai lebih “pewarna” adalah lebih rendah dan menyebabkan kawasan ini kelihatan lebih gelap daripada kawasan lainnya. 5. Penyalutan Virus Ke atas Grid dan Pewarnaan Negatif: Teknik Mikroskop Elektron Secara Langsung Spesimen diletakkan di atas filem sokongan melalui kaedah pemindahan titisan tunggal sebelum pewarnaan dilakukan. seperti pewarnaan virus. 39 . 2. 7. proses yang berikutnya. Slaid yang dicuci dengan teliti (dengan asid alkohol) akan melekatkan filem dengan kuat sehingga membuatkannya sukar untuk ditanggalkan daripada slaid. 6. Pewarnaan negatif melibatkan penanaman (embedding) bahan kecil yang berpartikel. seperti virus. 1 Kertas lilin Asid fosfotungstik 1. ke dalam suatu lapisan bahan berketumpatan tinggi supaya spesimen dapat diamati sebagai objek yang cerah di atas latar belakang gelap. Letakkan grid dalam 2 barisan di atas filem yang terapung-apung di atas air tersebut. Pastikan air yang digunakan bersih. NOTA 1. Gunakan slaid mikroskop baru yang sengaja dilap dengan kertas pengering tangan. pH 6. 3. 3.7 Grid mikroskop elektron yang disaluti filem Formvar Kepingan kertas turas gred Whatman No. Letakkan setitis (~ 20 µl) suspensi virus. Dengan forseps halus keluar dan sentuhkan tepi grid dengan sekeping kertas turas supaya dapat menghilangkan cairan yang berlebihan. 8. Tatacara Pewarnaan Negatif dengan Asid Fosfotungstik BAHAN 1. Tetapi natrium fosfotungstat merupakan pewarna negatif yang utama. 4. Keadaan ini wujud kerana kawasan yang mempunyai lebih “pewarna” seperti kawasan di sekeliling virus dan celah-celah permukaan virus akan menaburkan lebih elektron berbanding dengan kawasan yang kurang “pewarna”. dapat dilakukan tanpa kehilangan virus. Pegang slaid berdekatan dengan mulut dan keluarkan nafas dengan kuat supaya permukaan filem diliputi dengan wap yang terkondensasi dari mulut. natrium tungstat dan garam uranium seperti uranil asetat. Proses perlekatan bahan protein ke atas filem memerlukan beberapa saat sahaja dan selepas itu. Oleh yang demikian. Masukkan slaid ke dalam air pada sudut 30 darjah supaya filem terapung bebas pada permukaan air. 6. air suling dan pewarna dalam 1 barisan di atas sekeping kertas gris. Terdapat beberapa pewarna negatif seperti natrium fosfotungstat. 2. ia tidak akan tanggal lagi kecuali jika dilarutkan atau dihadamkan. 2.5. Sampel virus Forseps halus jenis tukang jam yang bengkok No. Letakkan sekeping kertas turas di atas filem dan apabila kertas ini tenggelam ia dikeluarkan dan filem dibiarkan sehingga menjadi kering. Tekan grid perlahan-lahan dengan forseps untuk mencapai sentuhan yang baik di antara filem dan grid.5 TATACARA 1. Oleh yang demikian. 9.

7. Cecair yang berlebihan disingkirkan dengan menyentuhkan bahagian tepi grid sambil dipegang dengan penghujung forseps. 8. Kertas turas yang dikoyak adalah lebih berkesan daripada yang digunting. 40 . Apungkan grid dengan permukaan yang didedahkan kepada virus ke atas titis pewarna selama 30 saat. 3. Pindahkan grid ke sekeping kertas turas yang terletak di dalam sebuah piring Petri. Asid fosfotungstik seharusnya disediakan dengan menggunakan air suling steril. Bagi spesimen multipel. 2. Tatacara Mikroskopi Elektron Imun BAHAN 1. 6. elakkan daripada berlakunya pencemaran silang dengan menggunakan forseps yang berbeza atau mencelupkan forseps yang telah digunakan di dalam air mendidih setiap kali sebelum digunakan semula. Teknik Mikroskopi Elektron Imun Kesensitifan mikroskopi elektron ( ME) boleh dipertingkatkan iaitu dengan menggunakan antibodi yang spesifik untuk mengelompokkan partikel-partikel virus. Pegang grid dengan kemas dengan menggunakan forseps kerana grid-grid ini amat ringan dan mudah terlepas daripada forseps akibat tarikan tegangan permukaan titisan cecair. 2. Keluar dan hilangkan cairan yang berlebihan. Letakkan campuran ke atas grid dan warnakan mengikut bahagian “tatacara menyaluti grid dengan virus & tatacara pewarnaan negatif dengan asid fosfotungstik” di muka surat 39-40. 4. Buang sediaan ini apabila didapati berubah kepada warna kebiruan. Cara ini juga digunakan untuk menentukan identiti virus yang tidak mempunyai morfologi permukaan yang khusus. 2.5 Kepingan kertas turas gred Whatman No. Sampel virus Forseps halus jenis tukang jam tangan Grid mikroskop elektron yang disaluti filem Formvar Asid fosfotungstik 1.5%. Permukaan grid yang disaluti dengan filem yang digunakan untuk melekatkan virus adalah permukaan di sebelah atas kertas turas. Campurkan 15 µl virus dengan 15 µl tiap larutan antiserum ke atas sekeping kertas lilin. 3. 5. 1. pH 6. 4. 8. 9. Ia diagihagihkan dalam jumlah kecil ke dalam botol dan disimpan beku kecuali satu botol untuk kegunaan semasa yang seharusnya disimpan di dalam peti beku. 5. 1 Kertas lilin Antiserum yang spesifik terhadap virus berkenaan Larutan salin ditampan fosfat TATACARA 1. Apungkan grid dengan permukaan yang didedahkan kepada virus di atas titisan air suling selama 30 saat.4. 5. Larutkan antiserum dalam larutan salin ditampan fosfat (nisbah antiserum: larutan salin yang digunakan bergantung kepada sediaan antiserum). 5. Keluar serta hilangkan cairan yang berlebihan. 6. NOTA Letakkan grid tersebut di atas kertas gris dan biarkan sehingga kering. 3. 7. Eramkan campuran virus/antiserum di dalam bekas ini selama satu jam pada 37°C. Letakkan kertas lilin dengan campuran virus/antiserum di dalam piring Petri yang dialas dengan kertas turas lembap. 4.

Grid yang diliputi dengan spesimen yang diwarnakan Mikroskop elektron jenis transmisi TATACARA 1. Saiz serta bentuk virus. supaya spesimen mencapai tempat yang ditetapkan. 3. janganlah mendapatkan kawasan yang gelap kerana virus akan terlindung/tersembunyi dan susah untuk diamati. jika teknik ini dilakukan dengan menggunakan spesimen tanpa campuran antibodi sebagai kontrol. Dalam keadaan antibodi yang berlebihan. 4. Kurangkan kuasa pembesaran kepada 80 kali dan pilih satu kawasan (segi empat sama) untuk diamati. Dalam memilih segi empat tepat untuk diamati.000 kali ganda dan dalam masa yang sama pusatkan semula pancaran elektron serta tingkatkan intensitinya. 4. 41 . adalah amat penting sekali. 2. dalam hal ini. Oleh yang demikian. Skan secara teratur kawasan di dalam segi empat tepat yang dipilih supaya seluruh kawasan diamati. 3. Serum biasa pun sudah mencukupi. Juga. 5. 2. janganlah memilih segi empat yang kelihatan terlalu “bersih” kerana ia tidak dapat memberikan kontras yang baik di antara virus dengan latar belakangnya. 2. Untuk mengamati sesuatu objek dengan lebih teliti dan mendalam. partikel virus akan disaluti dengan suatu lapisan protein yang tebal dan ini akan menyukarkan pengamatan ke atas struktur virus serta menyebabkan perubahan bentuk vitus berkenaan. jika diketahui. Serum haruslah didedahkan kepada suhu tinggi (56°C) sebelum digunakan untuk menghapuskan komplemen yang boleh melisiskan sampul (envelop) virus. Dalam tatacara ini. Putarkan batang pemegang ke arah lawan pusingan jam. 7. Pengamatan Spesimen Virus Terletak di atas Grid Mikroskop Elektron Persediaan penggunaan mikroskop memerlukan seseorang yang terlatih di dalam bidang ini. Putarkan tombol fokus sehingga memperolehi imej yang paling jelas. 8. 2. NOTA Letakkan spesimen dengan menggunakan forseps di dalam ruang khas pemegang spesimen (berhati-hati supaya tidak tersentuh bahagian pemegang spesimen yang akan diletakkan di dalam ruang hampas udara). iaitu sebagai isyarat bahawa ruang hampas udara telah pun dicapai di dalam ruang spesimen. Apa yang akan dibentangkan dalam bahagian ini adalah cara untuk memasukkan spesimen ke dalam mikroskop dan beberapa petua untuk mengamati virus. tidak semestinya IgG atau IgM yang murni digunakan. 6. Tatacara Pengamatan Spesimen Virus dengan Mikroskop Elektron BAHAN 1. Letakkan batang pemegang spesimen ke dalam tapak yang ditetapkan dan tunggu sehingga lampu merah padam. Amati layar melalui tingkap pengamatan. akan banyak membantu dalam proses pencarian virus berkenaan.NOTA 1. Naikkan kuasa pembesaran kepada 60. Campuran virus dan antiserum daripada satu siri pencairan dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi antibodi yang optimum untuk menghasilkan pengelompokan virus. Suspensi virus murni boleh menyebabkan partikel virus dikelompokkan secara spontan. 1. gunakan binokular.

Campurkan 1 bahagian larutan stok ini dengan 5 bahagian air suling untuk digunakan dalam pewarnaan.2 g Light Green. 42 . Kristal ungu Larutkan 1 g kristal ungu di dalam 100 ml air suling. 13. Karbol fuksin Ziehl-Neelsen Larutkan 4 g fuksin bes di dalam 20 ml etanol 95%. Larutan pewarna Larutkan 0. Asid sulfurik Campurkan 1 ml asid sulfurik pekat ke dalam 100 ml air suling. amatilah 5 segi empat tepat.15 g toluidina biru dan 0. 11.3. Malakit hijau (5. Goncang sehingga keseluruhan iodin tersebut larut. Larutkan pewarna cotton blue dengan meletakkan bekas di dalam penganggas air. SF yellowish di dalam 100 ml air suling dan tambah 0. Albert.075 g cotton blue. 10. Alkohol asid Campurkan 5 ml asid hidroklorik dengan 95 ml etanol 95%. Saring larutan ini dengan kertas turas. Oleh kerana terdapat kemungkinan bahawa taburan virus di atas filem grid tidak rata. Campurkan 1 ml asid asetik dan tambahkan 100 ml air suling.2 ml asid asetik glacial. 8.4. 6. 5. Campurkan kedua-dua sediaan ini.3%) Larutkan 0. Tambahkan 0. 3. 4. Larutkan 5 g fenol di dalam 100 ml air suling. REAGEN PEWARNAAN: RUMUSAN DAN PERSEDIAAN 1. atas serta kiri dan kanan grid sebelum spesimen tersebut dapat dianggap sebagai tidak mengandungi virus (iaitu pada tahap kesensitifan mikroskop elektron dalam mengesan virus).0%) Larutkan 5 g pewarna di dalam 100 ml air suling.05%) Larutan 0. larutan pewarna Albert Larutkan 0. 7. Larutkan 8 g fenol di dalam 100 ml air suling. Aseton-alkohol Campurkan aseton dan etil alkohol 95% dalam nisbah isipadu yang sama. 3. Kemudian tambahkan 0. Karbol fuksin (0. 2. Metilena biru (0. bawah. iaitu yang berada di tengah.2 g malakit hijau di dalam 2 ml etanol 95%. 9. 12.05g fuksin bes di dalam 100 ml air suling. Lakukan di dalam almari asap. Tambahkan 20 g kristal fenol dan larutkan dengan air panas di dalam penganggas air pada suhu 70°C. Karbol fuksin Kinyoun Larutkan 2 g fuksin bes di dalam 10 ml etanol 95%. Lactophenol cotton blue Campurkan 20 ml asid laktik dengan 40 ml gliserol dan 40 ml air suling.5 g iodin dan tambah air sehingga mencapai 100 ml. Light green. Campurkan kedua-dua sediaan ini.3 g metilena biru di dalam 30 ml etanol dan tambahkan 100 ml air suling. Iodin Gram Larutkan 1 g kalium iodid di dalam 70 ml air suling.

Tambahkan 0. 16.14. Saring dengan kertas turas dan simpan larutan reagen Schiff ini di dalam botol gelap di dalam peti beku.5%) Larutkan 0. 43 . larutan pewarnaan Larutkan 2 ml boraks (borax) 5% di dalam 25 ml air dan kemudian campurkan larutan ini dengan 25 ml larutan stok metenamin-argentum nitrat.5 g arang kayu yang teraktivasi dan goncang sekali-sekala dalam tempoh 1 jam. Metenamin-argentum nitrat. larutan stok Campurkan 50 ml larutan argentum nitrat 5% yang disediakan di dalam air suling dengan 100 ml metenamin (heksa-metilena-tetra-amin) 3% yang disediakan di dalam air suling. Tambahkan 20 ml 1N HCl dan 1g kalium metabisulfit bentuk kontang. 15. Reagan Schiff-leuko-fuksin Larutkan 1g fuksin bes di dalam 200 ml air suling yang mendidih. Metenamin-argentum nitrat. 17.5 g safranin di dalam 100 ml air suling. Kemudian kurangkan suhu kepada 50°C dan saringkan dengan kertas turas. Safranin (0. Biarkan di tempat gelap selama 2 hari.

media kultur dibahagikan kepada beberapa golongan: Media dasar (juga dipanggil media nutrien atau media basal) yang mengandungi infusi. Keadaan pengkulturan mikrob adalah berbeza-beza bergantung kepada jenis mikrob. broth nutrien.1. Di samping pertumbuhan. misalnya vaksin. Contoh: Agar nutrien. asid amino. separuh pepejal dan cecair. Dalam mikrobiologi diagnostik. Media pengaya (enrichment media) digunakan untuk pertumbuhan bakteria yang tidak tumbuh baik pada media dasar atau kerana pertumbuhannya pada media ini lebih baik dan cepat berbanding dengan bakteria yang lazimnya tumbuh dengan pesat dan seringkali mengatasi kecepatan pertumbuhannya dalam media dasar. Hasil daripada penghadaman enzim ke atas bahan organik. Pepton soya disediakan daripada tindakan enzim terhadap kacang soya. Jika mikrob ini merupakan suatu agen “baru” yang mungkin belum dikenali. melalui pengkulturan dapatlah diwujudkan satu sumber atau bekalan kultur agen berkenaan supaya kajian boleh dijalankan untuk menentukan ciri-cirinya. Dari segi penggunaan. Infusi – Pepton – Ekstraks daging. yis atau darah di mana kandungannya kurang jelas atau tidak dapat dipastikan. ujian motiliti dan menentukan ciri-ciri metabolik dan fisiologi bakteria. broth infusi (otak-jantung. media juga digunakan untuk pemencilan. Media boleh dibahagikan kepada media sintetik (media yang diketahui kandungannya) dan media tiruan atau kompleks. mikrob merupakan salah satu komponen yang harus diperolehi bagi penghasilan sesuatu produk. Kadangkala keadaan yang berbeza ini wujud walaupun di kalangan mikrob daripada golongan yang sama. 4. pepton P adalah penghadaman daging oleh pepsin. Media sintetik adalah media yang semua komponennya merupakan bahan kimia yang nyata dan spesifik daripada segi kandungannya.4. JENIS MEDIA KULTUR Media kultur digunakan terutama untuk pertumbuhan bakteria (dan mikroorganisma lain) dan terdapat dalam bentuk pepejal. Media diperkaya (enriched media) adalah media dasar yang dicampurkan dengan bahan yang boleh menggalakkan pertumbuhan seperti cecair tubuh (contohnya darah. misalnya bakteria ataupun virus. ujian yang dijalankan ke atas kultur sesuatu mikrob tertentu dapat membantu mengenal pasti atau menentukan identiti mikrob berkenaan. garam dan air. manakala media tiruan adalah media yang mengandungi bahan-bahan kompleks seperti ekstrak daging lembu. Dalam bidang perindustrian dan bioteknologi. otak atau hati). PENGKULTURAN MIKROB Mikroorganisma dan virus dikulturkan untuk beberapa tujuan. 44 .1. PENGKULTURAN BAKTERIA 4. jantung. Contoh. serum).1. protein atau sebarang nutrien yang memiliki ciri yang khas dan tepat. vitamin tertentu. pepton.

ia memberi peluang kepada Salmonella dan/atau Shigella untuk membiak dengan lebih baik kerana kekurangan atau ketiadaan persaingan pertumbuhan spesies koliform lainnya. Contoh media diperkaya Nama media Agar darah Agar coklat Broth (atau agar) serum Agar darah triptos Agar Mueller-Hinton Bahan campuran khas Darah utuh Darah yang dipanaskan Serum Darah. 2. Penghasilan H2S akan menukar ferik ammonium sitrat kepada ferik sulfida dan pembentukan warna hitam pada koloni bakteria. ia juga dianggap sebagai media pemilih. 45 . Media pembeza (differential) adalah media dasar atau media diperkaya yang mengandungi bahan kimia khusus yang akan bertindak ke atas sesetengah jenis bakteria melalui cara yang membolehkan bakteria berkenaan dikenali. Fermentasi manitol menghasilkan koloni bakteria berwarna kuning.0 adalah toksik terhadap bakteria koliform dan dengan demikian. Contoh media yang mempunyai ciri pemilih dan pembeza Nama media Bahan pemilih Ciri MacConkey Potassium telurit Deoksikolat sitrat Hempedu Kalium telurit Natrium deoksikolat Fermentasi laktosa Reduksi telurit Fermentasi laktosa Kesan penghasilan H2S Fermentasi manitol – Ciri pembezaan Indikator Neutral red Kalium telurit Neutral red Ferik ammonium Sitrat Fenol merah Garam manitol Lowenstein-Jensen Natrium klorida Malakit hijau Fermentasi laktosa akan menyebabkan koloni menjadi merah atau merah jambu. Reduksi telurit akan menghasilkan koloni berwarna hitam. triptos Kanji Sumber darah: kambing biri-biri. Media pemilih (selective) adalah media dasar atau media diperkaya yang dicampurkan dengan bahan yang menghalang pertumbuhan majoriti jenis bakteria dan memberikan kelebihan kepada segolongan kecil bakteria lain yang diinginkan untuk tumbuh. kebanyakan media pembeza juga mempunyai reagen yang dapat menghalang pertumbuhan bakteria tertentu dan dalam hal ini. Sebagai contoh. dalam broth selenit F natrium selenit pada pH 7. Media pengaya (enrichment) digunakan untuk pemencilan (misalnya patogen usus) dengan merencat atau menekan pertumbuhan saprofit dan/atau flora normal tubuh. arnab atau kuda. Pada hakikatnya.1. Dari segi fungsi. Media ini juga meningkatkan peluang untuk memencilkan bakteria tertentu di dalam sesuatu kultur campuran. misalnya dalam bentuk perubahan warna koloni (fermentasi) ataupun perubahan kepada media itu sendiri (hemolisis). media pengaya boleh juga disifatkan sebagai media pemilih.

6. 2. BENTUK MEDIA AGAR Media kultur dipadatkan dengan agar dan disediakan dalam 2 bentuk. masih terdapat gelembung udara pada permukaan media plat. NOTA Larutkan media agar berisipadu kecil di dalam bikar air mendidih dan media agar berisipadu besar di dalam penganggas air atau autoklaf. 2. akan saling bersentuhan dan bercantum semula di antara satu dengan lain.4. apabila keseluruhan agar menjadi cair. Sungguhpun suhu yang tinggi diperlukan untuk mencairkan agar. 4. Biarkan sehingga beku. 4. 3. ada baiknya juga jika media agar dituangkan selepas suhu diturunkan kerana ini akan mengurangkan pemeluapan. Semasa media agar digunakan. 46 . Jika didapati demikian. 2. 1. Pada keesokan harinya pastikan tiada pertumbuhan (bakteria/fungus) atau kontaminasi berlaku ke atas media. 4. suhu tersebut mestilah diturunkan kepada 48°C sebelum darah dan bahan lain yang tidak tahan panas dicampurkan. Pada agar yang tidak mengandungi bahan protein seperti darah. Pada umumnya. 7. 3. Letakkan larutan media agar ke dalam penganggas air bersuhu 50°C. 8. 3. Media agar Bikar air yang mendidih Penganggas air Piring Petri TATACARA 1. Tatacara Menyediakan Plat Media Agar BAHAN 1.1. Putarkan plat supaya agar tersebar sama rata. manakala pengkulturan pada cerun agar digunakan untuk ujian biokimia atau sebagai kultur simpanan. Sebaliknya jika agar dibiarkan sehingga terlalu sejuk. Elakkan daripada menggoncang media agar sebelum dituangkan ke dalam plat.2. Eramkan secara terbalik dengan penutup dalam keadaan terbuka pada suhu 37°C selama semalaman. Tutup plat dan simpan pada suhu 4 – 8°C jika tidak digunakan. misalnya Proteus spp. apatah lagi jika di kalangan bakteria yang ingin dipencilkan terdapat spesies yang dapat bergerak atau menunjukkan kemampuan untuk menyebar (swarming). Tuangkan 15 – 20 ml agar ke dalam setiap piring Petri bergaris pusat 90 cm. sebagai satu lapisan rata di dalam plat Petri (juga dipanggil ‘plat agar’/‘piring agar’) dan dalam bentuk cerun (agar cerun/ condong) di dalam tabung atau botol. media tersebut perlulah dikeringkan terlebih dahulu kerana penginokulasian di atas media yang berkeadaan sedemikian hanya akan menyulitkan pemencilan mikroorganisma nantinya. Jika setelah penuangan media. pastikan permukaannya tidak basah. Koloni-koloni bakteria yang seharusnya telah terasing. segera hilangkan dengan mengarahkan/ melalukan api penunu Bunsen ke atas gelembung-gelembung tersebut sehingga semuanya terhapus/ tersingkir sebelum media menjadi beku. 5. bakteria dikulturkan ke atas plat media agar melalui teknik plat garisan untuk mendapatkan koloni bakteria yang terpencil. Tindakan menggoncang ini hanya akan menyebabkan pembentukan gelembung udara di dalam media dan mengakibatkan media plat yang tidak rata apabila membeku kelak. besar kemungkinan bahan pelengkap (supplement) ini tidak akan bercampur dengan baik dan merata di dalam media. Tiap-tiap bentuk agar mempunyai fungsi tersendiri.

reaksi pewarnaan. dengan teknik aseptik. Kultur murni penting kerana ia diperlukan dalam kajian-kajian mengenai pelbagai ciri sesejenis bakteria. sungguhpun teknik aseptik diamalkan. Setelah pensterilan. 4. Teknik plat garisan merupakan teknik yang paling mudah untuk mendapatkan koloni terpisah dan terasing. Kemudian. bahagi-bahagikan media berkenaan dalam isipadu yang ditetapkan ke dalam tabung atau botol yang terlebih dahulu disterilkan. maka satu koloni akan hanya terdiri daripada satu jenis atau spesies sahaja. Ini boleh mengelakkan daripada tercemar semasa membahagikan media yang telah disterilkan terlebih dahulu ke dalam tabung atau botol. Tutup tabung atau botol tersebut dan sterilkan. maka media dalam isipadu yang besar tersebut perlu disterilkan terlebih dahulu. Kultur bakteria Piring Petri yang mengandungi media agar 47 .Tatacara Menyediakan Media Agar Condong/Cerun BAHAN 1. KULTUR MURNI 4. 4. Selepas pensterilan. letakkan tabung atau botol dalam keadaan condong dan biarkan membeku pada suhu bilik. jika sesuatu bahan yang ingin dicampurkan ke dalam media adalah daripada jenis yang tidak tahan panas. Sebaliknya.3. 2. Umumnya. Berdasarkan teori bahawa satu koloni bakteria merupakan hasil daripada pertumbuhan yang berasal daripada satu sel bakteria. 1. 2. kultur murni diperolehi dengan menggunakan media padat. Plat Garisan Kultur murni adalah kultur yang mengandungi satu jenis atau spesies bakteria sahaja.1. Kultur yang sedemikian ini dikenali sebagai kultur murni dan menunjukkan pertumbuhan koloni yang morfologinya kelihatan serupa di antara satu dengan lain. 3. misalnya ciri morfologi koloni. Media agar Bikar air yang mendidih Penganggas air Tabung/botol TATACARA 1. Kemudian tambahkan bahan berkenaan yang steril dan campurkan dengan baik dan merata. Tatacara Plat Garisan BAHAN 1. reaksi imunologi dan kepekaannya terhadap berbagai agen antimikrob. morfologi sel. Bakteria daripada koloni ini kemudian boleh ditumbuhkan semula supaya semua koloni di dalam sesuatu plat terdiri daripada jenis bakteria yang sama. Media agar untuk tujuan persiapan media agar cerun disediakan dan dibahagi-bahagikan ke dalam tabung atau botol dan kemudian disterilkan. Simpan media cerun agar pada 4° – 8°C jika tidak digunakan. NOTA Tuangkan 10 hingga 15 ml media agar yang telah dicairkan ke dalam setiap tabung atau botol. biokimia. dinginkan sehingga mencapai suhu sekitar 48°C. sama ada melalui teknik plat garisan atau teknik plat tuangan (pour plate). 2. 2. 3.

7. Gelung dawai dibakar semula selepas garisan dibuat pada bahagian pertama piring Petri supaya inokulum (jumlah bakteria) dikurangkan. 3. Gelung dawai Penunu Bunsen TATACARA 1. Sterilkan gelung dawai melalui pembakaran api penunu Bunsen dan setelah sejuk. Letakkan plat Petri tersebut dengan bahagian dasarnya di sebelah atas. Dalam membuat garisan. 48 . ambil spesimen dengannya. 4. Bekerjalah berdekatan dengan sumber api. 4.3. maka koloni bakteria yang terpisah akan didapati. Sebarkan inokulum seluas 1 cm garis pusat. Dengan gelung dawai steril pindahkan kultur/spesimen ke atas media plat dan inokulum seluas 1 cm garis pusat. Putarkan plat ~ 90 darjah dan buatkan pula beberapa garisan mengulangi prosedur di atas sehingga garisan meliputi keseluruhan kawasan permukaan media. Pegang dan angkat bahagian dasar plat sehingga permukaan media yang terdedah menghadap anda. Jangan bercakap semasa melakukan prosedur ini untuk mengelakkan semburan air liur terjatuh ke atas permukaan media agar. 1. 11. 8. 6. 2. Bakar semula gelung dawai dan biarkan sejuk. 10. NOTA Labelkan plat Petri yang mengandungi media pertumbuhan yang steril (pada bahagian dasar atau bawahnya dan bukan di atas penutupnya). 9. Garisan seterusnya bermula daripada kawasan di sekitar penghujung garisan-garisan pertama. Gunakan penghujung gelung dawai sahaja untuk menyentuh permukaan media supaya mendapatkan garisan yang halus dan tipis. Letakkan gelung yang mengandungi spesimen di atas permukaan media agar kira-kira 1 cm daripada dinding plat Petri tersebut. 6. Piring Petri yang telah diinokulasi dieramkan secara terbalik supaya sebarang pemeluapan yang berlaku pada penutupnya tidak akan menitis ke atas kultur. yang penting ialah menyentuh gelung pada permukaan media dan menggariskannya. 5. 5. 2. Bermula daripada sebaran di atas gariskan inokulum dengan menggerakkan gelung bolakbalik supaya garisan meliputi satu kawasan seluas kira-kira sepertiga daripada plat. Terbalikkan plat Petri yang me-ngandungi media dengan bahagian dasarnya di sebelah atas. 4. Pastikan garisan yang terakhir tidak menyentuh sebaran inokulum yang pertama. berterusan tetapi terpisah serta tidak saling memotong atau bersilang di antara garisan atas dengan yang di bawahnya supaya mendapatkan koloni bakteria yang berasingan. 3. Pastikan juga garisan yang dibuat tersebut rapi. usahakan menggaris perlahan-lahan supaya anda tidak sampai mencungkil atau merobek media sehingga mengakibatkan media menjadi pecah-pecah. Piring Petri yang telah diinokulasi dieramkan pada suhu tertentu dalam keadaan terbalik.

1. aktiviti biokimia.Gariskan inokulum secara bolek-balik bermula daripada sebarannya sehingga meliputi kira-kira sepertiga kawasan plat. CIRI-CIRI KOLONI BAKTERIA Kajian mengenai koloni bakteria adalah penting kerana ia boleh memberikan maklumat lanjut mengenai identiti. Ulangi kaedah ini sehingga garisan meliputi keseluruhan kawasan permukaan media.4. strain bakteria dan semua keadaan ini biasanya diambil kira dan dinyatakan semasa menghurai sesuatu koloni bakteria. umur kultur.1. Pinggiran/konfigurasi (ditentukan dengan mikroskop): Menyeluruh Beralun Lobate Erose 49 . RAJAH 4. Koloni bakteria biasanya diamati berdasarkan pertumbuhannya di atas media padat. ciri-ciri koloni bakteria dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti jenis media. suhu pertumbuhan. Seperti juga ciri-ciri morfologi sel bakteria. Bentuk: Bulat Tidak teratur Berfilamen Berserabut Bertitik bujur 2. Putarkan plat 60-90 darjah dan buatkan pula beberapa garisan.1 Cara melakukan plat garisan 4. ciri genetik dan antigenik bakteria berkenaan.

7. Pendaflour – satu warna dengan cahaya transmisi dan warna lain (yang cerah dan terserlah) dengan cahaya pantulan (berpendafluor). Seperti mentega atau lekit.3. Permukaan: Konsistensi Kelihatan kering & rapuh. Likat: Pertumbuhan mengikut bekas garisan dawai inolukasi. 6. Bergelung Berfilamen Bergranul 50 . Ciri optik: Luster Legap Lutsinar Opalesens : Iridesens Pudar Berkilat Fotogenik – memancar di dalam gelap. Batasan secara radial : permukaan berbatas-batas yang terpancar dari tengah-tengah koloni. Permukaan: Elevasi Datar Menaik Cembung Umbonat Pulvinat Cembung papilat Cembung berkerut 4. Pertumbuhan yang nipis seperti membran. Permukaan: Tekstur Licin Kasar Berkontour : permukaan licin dan undulat (beralun) secara tak teratur. Berkerut 5. Struktur dalam (ditentukan dengan mikroskop): Seperti warna baiduri (warna putih-kebiruan atau warna susu dengan ciri warna yangkekilatan berubah-ubah) : Warna yang berubah dengan sudut (posisi) koloni dipandang.

air.8. Faktor ini termasuk suhu pengeraman. tenaga yang digunakan untuk menjalankan proses biosintesis berpunca daripada tindakan oksidatif ke atas bahan organik. Sebaliknya. pengkulturan bakteria di dalam makmal hanya dapat dicapai jika keadaan alam persekitarannya dapat diwujudkan. Walau bagaimanapun. Di samping pengaruh kandungan media ke atas pertumbuhan bakteria. aras oksigen. beberapa faktor lain di alam sekeliling juga mempengaruhi pertumbuhan dan tumbesarannya. Bakteria jenis ini boleh tumbuh secara anaerobik dan dalam keadaan ini akan memfermentasi karbohidrat dengan menghasilkan produk fermentasi seperti berbagai-bagai jenis asid. Perubahan kepada media Hemolisis (pada agar darah) Penghasilan pigmen Perubahan kepada media pembeza Penghasilan bau atau aroma Istilah Bahasa Malaysia dan Istilah Bahasa Inggeris dalam pencirian koloni bakteria tidak teratur berserabut bertitik menyeluruh beralun keriting datar menaik cembung imbonat pulvinat cembung papilat cembung berkerut batasan secara radial berkerut rapuh seperti mentega/lekit pudar berkilat 4. Pengeraman Bakteria dalam Keadaan Anaerobik Pada bakteria heterotrof. Terdapat pula segolongan bakteria yang dinamakan aerotoleran kerana berkeupayaan untuk tumbuh di dalam udara. Ada bakteria yang hanya boleh menggunakan oksigen bebas sebagai penerima akhir hidrogen (aerob obligat). apabila ditumbuhkan dalam kehadiran udara (oksigen). sungguhpun ia tidak menjalankan metabolisme oksidatif. Oleh yang demikian. Justeru itu ia tidak dapat tumbuh dalam keadaan kehadiran oksigen dan kemungkinan akan mengalami kematian apabila terdedah kepada gas berkenaan. maka bakteria dari lingkungan yang berbeza memerlukan keadaan sekeliling yang berbeza pula untuk pertumbuhan yang optimum. Sekumpulan besar bakteria mempunyai sistem enzim yang boleh menggunakan oksigen atau terbitan organik sebagai penerima akhir hidrogen (aerob fakultatif atau anaerob fakultatif). Oleh yang demikian ia hanya dapat tumbuh dalam kehadiran oksigen. glossy KEADAAN PERTUMBUHAN BAKTERIA DI DALAM MAKMAL Oleh kerana penyesuaian bakteria kepada alam sekelilingnya. Bakteria golongan ini melakukan fermentasi meskipun dalam kehadiran oksigen.1. terdapat juga bakteria yang sama sekali tidak dapat menggunakan oksigen sebagai penerima akhir hidrogen (anaerob obligat). metabolismenya akan berubah kepada keadaan aerobik dan 51 . irregular rhizoid punctiform entire indulate curled flat raised convex imbonate pulvinate convex papillate convex rugose radially ridged rugose brittle butyrous dull glistening.5. osmolariti media dan kepekatan ion hidrogen (pH).

3. Katalis – biji-biji aluminium disaluti paladium GasPakTM – kit penjana/pembebas hidrogen NOTA 1. H2 10%) 52 . Balang anaerobik (plastik atau logam)/bekas berbentuk silinder Tangki silinder gas campuran (N285%. Pasang alat pencengkam penutup supaya balang tertutup dengan rapi dan rapat sehingga tidak dapat ditembusi udara. Butir-butir mangkin yang terpakai dipulihkan kepada aktiviti penuh dengan dipanaskan di dalam ketuhar pada suhu 160-170°C selama 2 jam. 4. Tatacara Mewujudkan Keadaan Anaerobik di dalam Balang Anaerobik dengan GasPaktm BAHAN 1. Terdapat segolongan bakteria lagi yang menunjukkan pertumbuhan optimum pada kadar oksigen yang rendah dan bakteria ini dikenal sebagai mikroaerofilik. CO2 5%. Masukkan media plat yang telah diinokulasi ke dalam balang. 4. Mangkin ini kemudian disimpan di dalam tempat kering atau balang pengering (desikator). 2. 2. 6. Letakkan indikator redoks (oksidasi-reduksi) di sebelah susunan plat. Indikator redoks metilena biru digunakan untuk memastikan keadaan anaerobik dicapai. Tatacara Mewujudkan Keadaan Anaerobik dengan Pengisian Gas Nitrogen ke dalam Balang Anaerobik BAHAN 1.karbohirat umumnya akan dioksidasi kepada air dan CO2. 5. Eramkan keseluruhan balang bersama isi kandungannya di dalam inkubator 37°C semalaman. Balang jenama GasPak menggunakan katalis atau mangkin ‘sejuk’ yang tidak perlukan dipanaskan sejurus sebelum GasPak digunakan. 3. Gunakan balang anaerobik yang sedia dilengkapi dengan 1 pek mangkin aktif yang dilekatkan kepada penutupnya. Pada balang anaerobik yang menggunakan mangkin yang perlu dipanaskan dengan arus elektrik atau api. 7. Kemudian lekapkan penutup tepat pada kedudukannya menutupi mulut balang. 2. Masukkan 10 ml air paip ke dalam GasPak dengan pipet. 6. Potong salah satu sudut atas paket GasPak dan letakkan sampul GasPak secara menegak di sebelah susunan plat. 8. Tetapi masa kehilangan warnanya dicapai lebih lewat daripada pencapaian keadaan anaerobik di dalam balang. 7. 5. pastikan proses ini dilakukan jauh dari gas yang boleh meletup. Dalam keadaan tanpa oksigen metilena biru akan menghilangkan warnanya. 2. 3. Balang anaerobik (jenama GasPak) Satu paket GasPak Pipet Air Penunu Bunsen Satu pek katalis Indikator redoks TATACARA 1.

Tanggalkan semua tiub penyambung pada balang dan tutup lubang kepala salur gas dengan pita selofan. Tatacara Menggunakan Inkubator Karbon Dioksida dalam Pengeraman Kultur dalam Keadaan Atmosfera Karbon Dioksida Inkubator CO2 merupakan suatu alat yang lumrah didapati di makmal mikrobiologi. 3. Buka kepala salur gas kedua ini dan salurkan gas ke dalam balang sehingga terisi penuh kemudian tutup dengan rapat. Eramkan balang bersama isi kandungannya di dalam inkubator 37°C selama semalaman. Keadaan atmosfera yang dicapai di dalam balang lilin adalah CO2 5%. 6. 2. 2. Buka salah satu kepala salur gas dan hubungkan dengan tiub ke sebuah pam vakum dan kemudian sedut keluar udara di dalam balang sehingga terbentuk ruang hampa gas sepenuhnya. Tutup tin dengan rapat dan biarkan sebentar sebelum tin dieramkan supaya lilin terpadam dengan sendirinya. Lekatkan sebatang lilin kepada sebuah slaid kaca mikroskop. 4. 7. Tatacara Balang Lilin dalam Pengeraman Kultur dalam Keadaan Atmosfera Karbon Dioksida BAHAN 1. Masukkan media plat yang telah diinokulasi ke dalam bekas ini dan kemudian tutup rapat dengan bantuan pencengkam penutup tersebut. 5. Gunakan tin dengan penutup berbentuk bulat supaya tin dapat ditutup dengan rapat. Penutup bekas yang digunakan mesti berbentuk bulat kerana bentuk ini mempastikan ia tidak ditembusi udara. 2. Bekas logam dengan penutup berbentuk bulat (tin susu tepung) Sebatang lilin Slaid mikroskop TATACARA 1. 2. Tutup rapat kepala salur gas pertama ini dan sambungkan sebuah tiub pada kepala kedua yang menghubungkannya dengan tangki silinder gas campuran. 4. 3.TA TACARA 1. NOTA Gunakan balang anaerobik yang terpakai (atau bekas plastik berbentuk silinder yang mempunyai dua lubang kecil pada penutupnya). Tempatkan lilin berjauhan dengan piring Petri yang mengandungi media yang telah diinokulasi. 3. Pastikan saiz tin yang digunakan tidak terlalu kecil supaya terdapat sedikit ruangan untuk menempatkan lilin yang menyala pada jarak yang agak berjauhan dengan piring Petri. Dengan adanya alat ini pengeraman kultur bakteria (ataupun kultur sel) di dalam atmosfera CO2 adalah lebih mudah dilakukan di samping kehadiran ruang yang boleh memuatkan lebih banyak kultur. Instrumentasi adalah di luar skop buku ini dan haruslah mengikuti arahan dengan teliti di dalam buku operasi (manual) yang dibekalkan 53 . Prosedur ini akan mengelakkan kemungkinan lilin yang sedang menyala daripada terjatuh dari tempatnya semasa tin dipindahkan. Nyalakan lilin tersebut dan masukkannya ke dalam bekas. NOTA 1. 3.

4. Media agar ini boleh dibekukan di dalam piring Petri atau tabung uji. ia lebih sesuai bagi inkubator yang kerapkali dibuka.2. pepton 1% yang sesuai untuk fungus dan agar 1. Jangan gunakan inkubator CO2 yang sama untuk kultur bakteriologi dan kultur sel untuk mengelakkan pencemaran bersilang.005% mengurangkan pencemaran oleh bakteria dan fungus bukan patogenik. Agar infusi otak dan jantung dicampur 5% darah kambing biri-biri merupakan sejenis media yang diperkaya dan digunakan untuk pemencilan Histoplasma dan Nocardia.2.05% dan Chloramphenicol 0. 6. Alat inkubator CO2 yang lebih moden mempunyai mekanisme yang menghentikan bekalan gas ini secara automatik semasa pintu dibuka dan menyambungnya semula hanya apabila pintu ditutup semula. apa yang akan disimpan atau dikeluarkan daripada inkubator CO 2 ini supaya dapat mengelak daripada terlalu kerap membukanya. Pada kultur bakteria. 5. Alat inkubator CO2 yang mempunyai jaket air adalah lebih cekap dalam menstabilkan suhu dan melambatkan penurunan suhu jika bekalan elektrik terputus. 3. 54 . Agar dekstrosa Sabouraud yang dicampurkan dengan cycloheximide 0. Ini memberi peluang yang lebih baik kepada fungus patogenik untuk tumbuh. manakala koloni berhifa atau miselium seperti kapas atau permaidani pada permukaan media. PENGKULTURAN FUNGUS 4. Rancangkan terlebih dahulu dalam tempoh masa kerja. Keadaan pH asid dan tanpa bahan yang kaya menghalang pertumbuhan kebanyakan jenis bakteria tetapi membenarkan pertumbuhan fungus. Ini merupakan suatu ujian diagnostik. NOTA 1. Oleh yang demikian. Pastikan juga terlebih dahulu apa yang akan dikeluarkan daripada inkubator CO2 atau dimasukkan supaya dapat mengurangkan lamanya ia dibuka. 2. PENGKULTURAN FUNGUS Fungus wujud dalam dua bentuk: yis dan hifa atau miselium. Alat inkubator CO 2 yang mempunyai sensor jenis inframerah membolehkan paras CO2 di dalam inkubator kembali ke paras asalnya dengan lebih cepat berbanding dengan sensor jenis konduktiviti termal (haba). 7. MEDIA KULTUR Media kultur utama yang digunakan untuk kultur primer fungus (pengkulturan daripada spesimen klinikal) adalah agar dekstrosa Sabouraud (SDA ) yang merupakan sejenis media dasar seperti juga agar nutrien. pengamatan kultur secara in situ dapat dilakukan dengan teknik kultur slaid. Media padat ini terdiri daripada dekstrosa 4%.5-2% dan mempunyai pH asid 5. Sistem ini mengelakkan pembaziran gas.1.6. Pada fungus berfilamen. aras CO2 ditetapkan pada 7% dan kultur sel 5%. Media ini biasanya digunakan untuk pengkulturan dermatofit dan Candida albicans kerana spesies-spesies ini tidak sensitif terhadap kedua-dua jenis agen antimikrob tersebut.2.2. kecuali Histoplasma capsulatum dan beberapa strain aktinomiset seperti Nocardia asteriodes. 4. sungguhpun terdapat banyak juga fungus patogenik yang terhalang pertumbuhannya.bersama-sama dengan alat ini. 4. sama ada kontaminan (fungus saprofitik daripada alam sekitar) atau fungus patogenik. Pengkulturan Candida albicans di dalam serum lembu misalnya boleh menunjukkan penghasilan tiub germa oleh yis berkenaan. Pengkulturan fungus ke atas plat agar boleh menonjolkan dua bentuk ini iaitu koloni yis kelihatan bulat dan agak lekit. Apa yang akan dibentangkan di sini hanyalah beberapa nota mengenai jenis inkubator CO2 dan penggunaan alat ini.

8. atau tidak mengandungi spora atau badan pembuahan (fruiting body) lagi. NOTA Sterilkan jarum inokulasi dengan pembakaran api penunu Bunsen. 11. Tatacara Membuat Kultur Slaid BAHAN 1. fungus yang dikulturkan serta alam sekeliling. 3.1. Untuk mengelakkan pencemaran oleh fungus khususnya dari udara. manakala di bahagian pertengahannya pula mungkin sudah agak tua dan ‘steril’. Kultur fungus Agar dekstrosa atau agar dekstrosa kentang Piring Petri Balang alkohol Penunu Bunsen Sebatang kaca berukuran 6 cm Penutup slaid Slaid mikroskop Air suling (steril) Pisau pembedahan (steril) Dawai inokulasi lurus 55 . 3. Kultur koloni fungus Plat agar/cerun agar Jarum inokulasi Penunu Bunsen TATACARA 1. Sungguhpun suhu bilik (25°C) digunakan sebagai suhu pengeraman oleh beberapa makmal. pertumbuhan fungus adalah lebih lambat. Cungkilkan sedikit kultur dan letakkan inokulum ini di tengah-tengah plat agar atau tabung cerun agar. 6. 7. 2. 4. penginokulasian kultur disarankan dilakukan di dalam kabinet “biohazard” kelas 2 yang memberi perlindungan kepada pengguna. Tatacara Penginokulasian Plat Agar dengan Kultur Berfilamen BAHAN 1. 1. Masukkan jarum ke dalam koloni fungus pada tapak di antara tengah dan tepi koloni fungus. 4. 5. perlulah diingat bahawa dalam hal ini. kerana koloni yang di tepi mungkin terlalu muda dan belum bersporulasi atau membentuk spora. 2. 4. 10. 2. 2. 3. Inokulum daripada tapak di antara pertengahan dan tepi koloni yang diambil. 3.Tatacara Penginokulasian Plat Agar dengan Kultur Yis Tatacaranya adalah seperti yang dilakukan dengan bakteria iaitu melalui teknik garisan ke atas plat (sila rujuk bahagian 4. 9. Eramkan pada suhu 30°C dan/atau 37°C selama 4 minggu.3) NOTA Kultur fungus dalam bentuk yis dieramkan pada suhu 37°C.

Dalam tatacara ini. Bengkokkan batang kaca itu sehingga mencapai bentuk ‘V’ dan biarkan sehingga sejuk di udara. Sterilkan sekeping slaid mikroskop dengan pembakaran alkohol dan letakkannya di atas batang kaca berbentuk ‘V’. Bakarkan sebatang kaca berukuran 6 cm di bahagian tengahnya sehingga menjadi lembut. agar dekstrosa kentang) berukuran 1 cm persegi dan letakkan di atas slaid. 6. 7. 13. 12. Apabila struktur reproduktif mulai terlihat. Potong seketul agar (agar dekstrosa. 2. Semasa pengambilan inokulum. 4 objek iaitu batang kaca berbentuk ‘V’. 5. 14. Tuangkan sekitar 5 ml air suling steril ke dalam piring Petri ini untuk memberikan kelembapan yang berterusan semasa pengeraman kultur. 3. Tatacara Kultur yang Merangsang Penghasilan Tiub Germa BAHAN 1. Sterilkan sekeping kaca penutup slaid dengan pembakaran alkohol dan letakkan di atas permukaan ketulan agar. Pastikan air di dalam piring Petri yang memberikan kelembapan kepada atmosfera ruangan kultur slaid sentiasa ada dan tidak sampai kering dan tambah jika perlu. lepaskan penutup kaca (yang mempunyai pertumbuhan fungus pada permukaannya) daripada ketulan agar dan amati dengan sediaan pelekapan basah lactophenol cotton blue. 2. 8. 6. Tunggu sehingga objek yang disterilkan menjadi sejuk sebelum meneruskan dengan prosedur selanjutnya. 4. 11. jangan tekan penutup slaid kerana ini boleh mengakibatkan struktur konidia terpisah daripada hifa.5 ml serum lembu (steril) ke dalam satu tabung uji. 3. Masukkan 1 koloni yis ke dalam serum dan leraikan sel-sel dari koloni dengan menggoncanggoncangkan jarum inokulasi di dalam serum. Masukkan 0. Kultur yis Tabung uji Penganggas air Jarum inokulasi Slaid mikroskop Penutup slaid Serum lembu (steril) TATACARA 1. Letakkan piring Petri di atas pentas mikroskop dan amati pertumbuhan fungus dari masa ke masa. Sterilkan batang kaca ini dengan pembakaran alkohol. pastikan jarum dimasukkan tepat ke dalam koloni supaya inokulum mengandungi bahagian vegetatif fungus bersama bahagian aerialnya (yang mengandungi spora). 3. NOTA 1. 4. Tekan kaca penutup slaid supaya terdapat kontak yang baik di antara permukaan agar dan penutup tersebut. 10. Tutup plat Petri dan eramkan pada suhu bilik. penutup slaid dan jarum inokulasi disterilkan dengan pembakaran api atau alkohol. 7. 2. 2. 4. Dalam penyediaan pelekapan basah. Inokulasi fungus dengan menyentuh keempat-empat sudut ketulan agar. Amati juga fungus yang tumbuh pada permukaan slaid dengan pelekapan basah lactophenol cotton blue. 9. 5.TATACARA 1. Biarkannya sejuk dan letakkan di dalam sebuah piring Petri. 56 . slaid mikroskop.

Pigmentasi pada permukaan fungus biasanya dihasilkan oleh spora dan hifa. di dalam struktur itu sendiri. Bagi sesetengah individu ini boleh menimbulkan alahan yang serius. Dalam catatan mengenai morfologi koloni fungus. Dengan penyempitan Tanda penyempitan NOTA 1. pigmentasi pada fungus sering kali tidak digunakan sebagai ciri pengesahan utama spesies-spesiesnya kerana ciri ini umumnya tidak stabil atau berubah. seboleh-bolehnya elakkan daripada membuka penutup Petri/botol. kerana ini akan menyebabkan terjadinya aerosol yang mengandungi spora fungus yang akan bertebaran di udara dan boleh tersedut oleh bukan sahaja orang yang sedang mengkajinya. Di samping jenis media. sekalipun daripada strain yang sama. beberapa faktor lain seperti suhu pengeraman dan umur koloni juga mempengaruhi tekstur koloni fungus.3.3. 2. tetapi juga mereka yang berada di dalam ruangan yang sama. 2 jam dan 3 jam. Pastikan ampaian yis yang disediakan tidak tebal kerana inokulum yang besar akan mengurangkan bilangan sel yang menunjukkan tiub germa (105 – 106 sel/ml adalah kepekatan optimum).2. adalah penting jenis media pertumbuhannya juga disebutkan kerana fungus boleh mempamerkan ciri yang berbeza-beza menurut jenis media yang digunakan. dan amati penghasilan tiub germa di bawah mikroskop. Buat pelekapan basah selepas 1 jam. Morfologi Keseluruhan Koloni Fungus 1. PERHA TIAN Dalam pengamatan fungus pada kultur plat agar. 4. Eramkan pada suhu 37°C selama 3 jam di dalam penganggas air. Walau bagaimanapun. PERHATIAN Tiub germa akan kelihatan sebagai filamen yang muncul daripada blastospora tanpa adanya penyempitan mahupun pembengkakan pada bahagian-bahagian tertentu di sepanjang filamen tersebut. manakala pigmentasi pada bahagian dasar koloni ditentukan melalui pigmen hifa vegetatif dan pigmen larut yang meresap ke dalam agar. CIRI-CIRI KOLONI FUNGUS 4. Serum yang digunakan kali pertama harus diuji dengan suatu strain Candida albicans yang telah dipastikan boleh mengeluarkan tiub germa. Tofografi: Mendatar dan berlipat secara terpencar Mendatar dan tepian bulat menyeluruh 57 .

Mendatar dan berlipat tak teratur Mendatar dan tepian bergerigi Bertimbun dan ala-tombol Bertimbun dan bahagian tengahnya tertekan Menaik ala-butang Kraterforme hingga ke bentuk plikatil Berkerut Serebriforme (serupa otak) 2. Tekstur: Krim (seperti rupa koloni yis) seperti tekstur lilin Berserbuk Berkapas Bergranul (berpasir/berbutir) seperti baldu 3. Pigmentasi: (permukaan dan dasar koloni) Berbeza bergantung kepada umur dan jenis fungus Istilah Bahasa Malaysia – Bahasa Inggeris tepian bulat menyeluruh tepian bergerigi berlipat tak teratur tengahnya tertekan ala-tombol ala-butang menaik ala-tekstur lilin ala-baldu entire edge fringed edge irregular folding depressed center knob-like button-like raised glabrous velvety 58 .

Eramkan serum lembu di dalam penganggas air pada suhu 50°C selama 30 minit untuk menghapuskan bahan atau faktor-faktor yang terdapat di dalamnya yang boleh menghalang pertumbuhan sel apabila digunakan nanti.3. 2. terutama disebabkan ia bebas daripada antibodi yang mungkin dapat menghalang pengkulturan virus dalam kultur sel. Simpan beku. Apabila hendak digunakan media dikeluarkan dari simpanan dan biarkannya pada suhu bilik buat seketika dan kemudian buatkan suatu pencairan berkepekatan 1X dan campurkan bahan-bahan yang diperlukan untuk pertumbuhan.1. Media Maklumat tentang kesesuaian sesuatu media untuk sesejenis kultur sel boleh didapati dari buku maklumat yang dikeluarkan oleh syarikat yang memasarkan media kultur berkenaan atau dari artikel jurnal. Agih-agihkan media ini dalam isipadu 10 atau 20 ml di dalam botol universal dan simpan beku.2 µm. Media ini umumnya didapati dalam bentuk serbuk atau cecair dan dalam kepekatan 1X atau 10X. 4. tekanan osmotik dan membekalkan tenaga. Media ini mengekalkan pH. Media yang pekat boleh disimpan di dalam bekas-bekas yang lebih kecil. KULTUR SEL DALAM VIROLOGI Media Kultur Sel Semua media yang digunakan dalam kultur sel atau tisu pada asasnya mengandungi suatu campuran tiruan yang terdiri daripada garam-garam tak organik yang disebut larutan garam seimbang atau larutan garam fisiologik. Pastikan semua media serbuk dilarutkan sehingga kelihatan betul-betul jernih. ia terlebih dahulu dilarutkan di dalam air suling supaya mencapai kepekatan 5X atau 10X. Jika sesuatu jenis media yang berkepekatan 10X didapati dalam bentuk cecair. maka ia dipilih dan diutamakan daripada bentuk lainnya. serum lembu yang menjadi pilihan. Antibiotik juga dicampurkan ke media untuk mengawal daripada pencemaran serta pertumbuhan mikrob. Larutan ini dicampurkan dengan asid amino dan vitamin serta glukosa sebagai sumber tenaga. Labelkan nombor pengeluaran (batch number). Oleh itu kita perlu menumbuhkan sel-sel tertentu terlebih dahulu untuk dijadikan kultur bagi pembiakan virus. Jika media berbentuk serbuk. Gunakan serum fetus lembu kerana serum ini berbeza dengan serum lembu dewasa atau anak lembu. pada suhu – 20°C jika boleh. Pastikan serum fetus lembu yang diperolehi mempunyai jangka hayat simpanan yang panjang. PENGKULTURAN VIRUS Berbeza dengan bakteria dan fungus. sel yang dapat ditumbuhi dan dibiakkan in vitro boleh merupakan suatu sumber ‘media’ untuk pembiakan virus. Fenol merah digunakan sebagai penunjuk pH. Oleh demikian. seharusnya pada suhu – 20°C. Dalam kebanyakan kultur sel. Aspek-aspek mengenai pertumbuhan sel secara in vitro ini dikenal se-bagai kultur sel. Agihkan ke dalam isipadu 10 atau 20 ml. 1.4. 59 . Serum (biasanya serum lembu) diperlukan untuk pengkulturan sel dan sistem fisiologik ini memerlukan suatu sistem pengawalan pH iaitu sejenis larutan tampan. Media mesti disterilkan melalui penyaringan dengan penyaring membran berukuran liang 0.3. virus hanya boleh beraplikasi di dalam sel hidup. Serum Jenis serum yang diperlukan bergantung kepada jenis kultur sel. Pastikan sampel dari sesuatu botol itu steril dan dapat menampung pertumbuhan kultur sel dengan baik dengan membandingkannya dengan serum yang diketahui memberikan hasil yang baik. dan tarikh diagihkan.

Persediaan Natrium Bikarbonat Larutkan 5.0 ml dan disimpan beku. Adalah sesuai jika ia disediakan dalam kepekatan 10X yang seterusnya hanya perlu dicairkan menjadi 1X apabila hendak digunakan nantinya di dalam media lengkap. Kedua-dua agen antimikrob ini disediakan dalam kepekatan 100X di dalam air suling steril (jika dibekalkan dalam bentuk serbuk). Jangan masukkan ke dalam penganggas air untuk mengelakkan pencemaran.6g NaHCO 3 di dalam 95.2 µm. Kepekatan natrium bikarbonat yang digunakan adalah bergantung kepada jenis media. Agih-agihkannya ke dalam botol yang kemudian ditutup rapat. disaring melalui penyaring dengan saiz liang 0.4. Media kultur sel Serum fetus lembu Antibiotik (Gentamicin dan Amphotericin B) NaHCO3 Air suling (steril) Bekas (steril) Pipet bersukat (steril) TATACARA 1.85 g/l). 3. 3. diagih-agihkan dalam isipadu 1.2 µm atau diautoklaf pada 20 tekanan paun setiap inci (pound per square inch: psi). 4. Tuangkan media ke dalam 1 botol steril jika kesemua kandungannya diperlukan (jika hanya sebahagian sahaja media yang diperlukan. Larutan antibiotik dicairkan 1:100 di dalam media. Larutan penampan pH yang sering kali digunakan di dalam media kultur sel adalah natrium bikarbonat.3. 5. Tatacara dalam Persediaan Media Kultur Sel BAHAN 1. 2. Antibiotik yang sesuai adalah Gentamicin dan Amphotericin B (Fungizone). 60 . Jika natrium bikarbonat diperlukan juga sebagai nutrien maka kepekatannya seharusnya tidak melebihi 10 mM (0. Untuk kedua-dua jenis antibiotik ini. Larutan penampan ini digunakan dalam sistem tertutup (bekas kultur ditutup rapat) yang diseimbangkan dengan udara atau sistem terbuka (seperti piring Petri) yang diseimbangkan dengan atmosfera yang mengandungi kadar CO 2 yang tinggi seperti di dalam inkubator CO2. Saringkan dengan menggunakan penyaring membran berukuran liang 0. Larutan natrium bikarbonat disterilkan melalui penyaringan ataupun diautoklaf. Gentamicin adalah agen antibakteria berspektrum luas (aktif terhadap bakteria Gram-positif dan Gram-negatif) dan berkesan terhadap mikoplasma. Kepekatan yang sesuai digunakan adalah Gentamicin 30 µg/ml dan Amphotericin B 5 µg/ml. gunakan gred yang ditentukan khusus untuk kultur sel.5 ml fenol merah 0. Gaskan dengan CO 2 sehingga warna media menjadi oren.5 ml air suling dan campurkan 0. Larutan tampan HEPES (asid N-2-Hidroksietilpiperazin-N’-2-etanasulfonik) yang berfungsi sebagai zwitterion juga boleh digunakan sebagai larutan penampan menggantikan natrium bikarbonat dalam sistem terbuka dan ia digunakan pada kepekatan mutlak 20 mM. Amphotericin B adalah agen antifungus. Simpan pada suhu bilik. Lapkan permukaan luar setiap bekas dengan tuala kertas sehingga kering.4%. 6. 2. 5. gunakan pipet steril untuk memindahkannya). 7. Sistem Penampan pH yang Digunakan di dalam Media Kultur Sel Pertumbuhan sel haiwan di dalam media kultur sel yang lengkap biasanya adalah optimum apabila media ditampan dalam julat pH 7. Biarkan reagen yang disimpan beku seperti media.2 hingga 7. 4. Antibiotik Antibiotik dicampurkan ke media kultur untuk menghalang pertumbuhan mikrob. serum dan antibiotik mencair pada suhu bilik di atas meja.

tetapi seboleh-bolehnya elakkan daripada menggunakannya. Campurkan kedua-dua jenis larutan ini dalam isipadu yang sama. PERHATIAN Persediaan ini dilakukan dengan menggunakan kabinet aliran udara laminar kelas 1 atau kelas 2. Campurkan isipadu air suling yang diperlukan diikuti dengan larutan penampan dan antibiotik. 2.0 % tripsin dan 0. Simpan media pertumbuhan atau pengekal pada suhu 4°C. Seluruh haiwan atau tisu Gunting 2 pasang Gunting bengkok dan tajam Alat pengaduk magnet Magnet disaluti silikon/teflon Kelalang kon Larutan tripsin-versena Etanol 70% Larutan salin ditampan fosfat (phosphate buffered saline: Gentamicin dan Fungizone 5 µg/ml Penyaring kasar (steril) Mikroskop cahaya jenis terbalik Bekas kultur sel PBS) yang mengandungi 30 µg/ml PERSEDIAAN 1. 3. 6. Sebelum media digunakan. Sterilkan dengan menggunakan penyaringan membran dengan liang 0. Larutan tripsin dan versena Larutkan 1. 9. 11. L-glutamina. goncangkannya terlebih dahulu untuk menentukan kehadiran pencemaran yang berat yang ditandai dengan kekeruhan pada media tersebut. Tempoh simpanan media yang mengandungi serum adalah 4 minggu. 7. Biasanya media pertumbuhan memerlukan 5 – 10% serum dan media pengekal 0 – 2%. Campurkan serum supaya mencapai peratus kepekatan yang diperlukan.4% versena di dalam PBS. 12. TRIPSINISASI Tripsinisasi adalah proses peleraian tisu atau sel selapisan kepada sel-sel individu menggunakan enzim tripsin. 5. Ini bukanlah suatu pencemaran. 8. Oleh yang demikian. 2. 6. 7. 4.4. Tatacara untuk Tripsinisasi Tisu Seluruh BAHAN 1. 10. 5. bagi media yang seharusnya mengandungi L-glutamina.2 µm. N OTA 1. adalah tidak stabil dalam bentuk cecair. Serum yang dibeku dan dicairkan kadangkala mengandungi serpihan-serpihan yang mendap di dasar botol. salah satu komponen sesetengah media. asid amino ini perlulah ditambahkan ke dalamnya jika media tersebut disimpan lebih daripada 2 minggu. Simpan pada suhu 4°C. 61 .

0. Tambahkan tripsin baru setiap kali ini dilakukan. Keluarkan organ dan letakkan di dalam piring Petri di mana ia dipotong menjadi serpihanserpihan kecil berukuran 2 mm3.0g NaCl. 8. Lap kulit bahagian yang terdedah ini dengan etanol 70% dan bedah/potong untuk mendapatkan organ yang diperlukan. 3. Dalam pilihan kedua. sel mestilah ditanggalkan dari permukaan bekas kultur.PBS tanpa kalsium dan magnesium 2.2g KCl. Campuran tripsin 0. manakala majoriti akan melekat pada permukaan bekas kultur dan tumbuh membentuk satu lapisan sel. Goyang piring Petri perlahanlahan untuk membersihkan potongan-potongan tisu. Emparkan suspensi sel pada 400 g selama 15-30 minit dan leraikan mendapan sel di dalam media yang sesuai dan lakukan perhitungan hidup. 10. kelalang tidak diletakkan secara langsung di atas plat pemanas tetapi dimasukkan ke dalam sebuah bikar berisi air yang ditempatkan di atas plat pemanas tersebut. Masukkan PBS yang mengandungi antibiotik dan antifungus. Tatacara berikut dilakukan dalam keadaan aseptik dengan menggunakan peralatan yang steril. Dari masa ke masa tuangkan sel yang telah dileraikan daripada tisu dan simpan pada 4°C. Aduk kandungan kelalang dengan pengaduk magnet pada suhu 37°C. 5. 2. Tambahkan tripsin baru dan aduk semula. Agih-agihkan larutan ini ke dalam botol dan sterilkan dengan autoklaf pada 10 psi (suhu mencapai aras 115°C) selama 15 minit. Aturkan nilai pH larutan kepada 7.3. 11. Tambahkan air suling sehingga mencapai satu liter. 1. Elakkan daripada terjadinya pembentukan buih (frothing) semasa tisu diaduk. TATACARA 1. Simpan pada suhu bilik. Tripsinisasi Sel Selapisan dan Pengeraman Kultur Sel Sesetengah jenis kultur sel wujud sebagai suspensi di dalam bekas kultur.15g Na2HPO4. Semua alat dan reagen yang digunakan disterilkan terlebih dahulu. Pindahkan potongan tisu ke dalam sebuah kelalang kon yang mengandungi magnet yang disaluti teflon atau silikon. Saring suspensi sel melalui penyaring kasar untuk memisahkan sel-sel dari serpihan tisu-tisu besar. Bunuh haiwan yang berkenaan dan letakkan menelentang supaya bahagian tubuh atau tapak di mana pembedahan akan dijalankan terdedah.2% PBS tanpa kalsium dan magnesium (steril) 62 . Sebelum sel ini boleh dipindahkan ke tempat lain atau separuh daripadanya dikeluarkan untuk mengelak kesesakan yang akan menghalang pertumbuhan dan menjejaskan keupayaannya untuk hidup (viabilitinya). 9. 2. Tatacara untuk Tripsinisasi Sel Selapisan dan Pengeraman Kultur Sel BAHAN 1. 2. 6. Tuangkan larutan tripsin 10 minit selepas proses ini bermula. Ubah kepekatan sel menjadi 2 x 10 5 sel/ml media pertumbuhan dan kulturkan di dalam bekas kultur. 3. Suhu 37°C dapat dicapai dengan melakukan proses peleraian di dalam bilik panas atau dengan menggunakan alat pengaduk magnet yang juga berfungsi sebagai plat pemanas. 7. Masukkan larutan tripsin-versena (lebih kurang 20 ml setiap 1g tisu).25% dan versena 0. 0.2g KH2PO4 di dalam 950 ml air suling. 4. N OTA 1. Larutkan 8.

Campurkan 2 jenis larutan ini dalam isipadu yang sama. 11.3. 5.3. TATACARA 1. Keluarkan media secara aseptik dengan pipet bersukat. Tambahkan air suling sehingga mencapai 1 liter. 63 . Pada jenis kultur sel yang tumbuh dengan lambat atau perlahan. sel-sel akan mati. media yang mengandungi serum digunakan dalam mensuspensikan sel selepas sel-sel ditanggalkan. 2. 7. Simpan pada suhu 4°C. 10% O2. 81.2g KCl. Biarkan botol berdiri tegak selama 1 hingga 2 minit sebelum cecair yang mengalir ke dasar bekas dipipet keluar. Larutan tripsin dan versena Larutkan tripsin 0. pipet keluar PBS.5% N 2) ke dalam bekas kultur menggantikan udara di dalam ruang bekas sebelum penutupnya ditutup dengan rapat. 2. 3. Sel akan mengalami kerosakan atau mati jika didedahkan terlalu lama. Aturkan nilai pH larutan kepada 7. 1. kultur sel ini dieramkan di dalam inkubator CO 2 yang mengandungi CO2 pada kadar 5%. Aturkan kepekatan suspensi sel supaya mencapai 1 x 105 sel/ml media pertumbuhan. 0. Pada sistem terbuka. tutup penutup bekas kultur dengan rapat. Pencairan dengan media pertumbuhan boleh mengurangkan kepekatan tripsin dan versena kepada suatu aras yang tidak akan menjejaskan pertumbuhan sel.15g Na 2HPO4 dan 0.5% dan versena 0.0g NaCl. 2. Jika didedahkan terlalu lama kepada tripsin.4% di dalam PBS . Agihagihkan ke dalam botol dan sterilkan dengan autoklaf pada 10 psi (115°C) selama 15 minit. 4.2g KH2PO4 di dalam 950 ml air suling. N OTA 1. 6. Sterilkan dengan menggunakan penyaring membran dengan liang 0-2 µm. 9. 10. goncangkan bekas kultur supaya PBS meliputi sel monolapisan. 5. 4. Amatilah selalu dengan mikroskop untuk menentukan sama ada sel telah berbentuk bulat. untuk menghalang aktiviti tripsin tersebut. amati sel dengan mikroskop untuk menentukan sama ada sel telah menjadi bulat dan/atau telah tanggal. Jika campuran tripsin dan versena yang digunakan sedikit sahaja. Masukkan sedikit campuran tripsin dan versena dan goncangkan botol untuk meliputi ke seluruh monolapisan sel. Pipet bersukat (steril) Mikroskop cahaya jenis terbalik Kabinet aliran udara laminar kelas 1 atau 2 PERSEDIAAN 1. sel tidak perlu dicuci melalui emparan dan supernatannya dituang keluar untuk menghilangkan campuran tripsin dan versena tersebut. Goncangkan bekas kultur sel sebelum diletakkan di dalam inkubator supaya sel-sel bertaburan sama rata. alirkan campuran gas (9% CO2. Pada jenis kultur sel yang tumbuh dengan pesat. PBS tanpa kalsium dan magnesium Larutkan 8. Eramkan pada suhu 37°C selama 1 hingga 5 minit. Hitunglah suspensi sel dengan hemositometer. 3. 8. Cuci 2 kali dengan PBS : pipet PBS ke dalam bekas. Pipet media pertumbuhan (isipadunya bergantung kepada saiz bekas) ke dalam bekas dan cuci sel daripada permukaan bekas dengan memancutkan media daripada pipet yang dipasang dengan bal penyedut getah untuk meleraikan kelompok sel. Aktiviti tripsin ini boleh dihapuskan oleh serum. Masa yang diambil untuk penanggalan sel daripada permukaan dalam bekas bergantung kepada jenis kultur yang terlibat. Dalam masa ini. Peganglah kultur sel hampir tegak lurus dan ketuk permukaan bekas kultur untuk menentukan sama ada sel boleh ditanggalkan (dilepaskan) daripada permukaan atau belum. Simpan pada suhu bilik. Oleh itu.

maka sel-sel di dalam kesemua 25 SES kecil dihitung. Dalam keadaan tertentu.4. TATACARA 1. Satu sebab lain yang penting dalam hal penyimpanan kultur sel ini. Larutkan 1/10 dengan 10X PBS sebelum digunakan. Bilangan sel ml-1 = jumlah sel yang dihitung x 25 x 10 4 x faktor pencairan jumlah SES yang digunakan 6. manakala yang menyentuh atau melintang garis bawah dan kanan SES tidak dihitung atau diabaikan. peganglah bekas supaya permukaan di mana terdapatnya sel adalah di atas. kepekatan sel mestilah ditentukan terlebih dahulu supaya jenis sel dengan kepekatan yang diperlukan boleh ditetapkan. Untuk mengelakkan daripada kehilangan sel-sel ini sebahagian dari-pada kultur sel berkenaan haruslah disimpan dalam keadaan yang boleh mengekalkan viabilitinya tanpa pertumbuhan. Hitung sel di dalam SES yang kecil ini. Kriopengawetan Sel yang Hidup Oleh kerana kultur sel adalah suatu hidupan. 4. 5. Sebab kedua kenapa penyimpanan sel ini diperlukan adalah kerana sesuatu kultur sel itu hanya digunakan pada masa-masa tertentu sahaja. Dalam hal ini. Sebagai panduan. kultur sel dari satu bekas kultur dibahagikan (dibelah) kepada dua hingga empat bahagian (bergantung kepada jenis kultur sel) dan setiap bahagian dikulturkan secara berasingan di dalam bekas kultur yang mempunyai isipadu yang sama dengan bekas induk. Hitunglah sekurang-kurangnya 100 sel (ini bermakna bahawa pada suspensi tidak mengandungi banyak sel. ada kemungkinan kultur sel ini boleh terhapus disebabkan kemusnahan akibat pencemaran oleh bakteria atau fungus. 5. penjimatan kos. Tetapi jika suspensi mengandungi banyak sel maka perhitungan sel-sel di dalam kesemua SES kecil tidak perlu dilakukan lagi. 4. tatacara nisbah perpisahan (split ratio) boleh digunakan. Simpan di dalam peti beku. tenaga dan masa boleh dicapai jika kultur sel ini disimpan sewaktu tidak digunakan. sel yang menyentuh atau melintang garis sebelah kiri dan atas setiap segi SES dihitung atau diambil kira. Suspensi sel 0. SES ini dibahagikan pula kepada 25 SES yang dipisahkan oleh tiga garis. atau ia mengalami kematian kerana keadaan pertumbuhan yang tidak sesuai. 2. 3. Dalam cara ini. Pada posisi ini lapisan sel lebih mudah diamati dan sel-sel ditanggalkan dengan lebih mudah kerana tidak diselaputi oleh lapisan media semasa dicuci. Tetapi. 3. Saringkan melalui kertas turas.1% tripan biru di dalam PBS Hemositometer jenis Neubauer Mikroskop cahaya PERSEDIAAN Tripan biru 0.1% tripan biru di dalam 10 ml air suling. Apa yang perlu hanyalah menghitung sel-sel di dalam SES kecil yang terletak di tengah dan di keempat-empat sudut hemositometer tersebut sahaja). Tatacara Menghitung Sel dengan Menggunakan Hemositometer BAHAN 1. 2. Hemositometer Neubauer mempunyai sembilan segi empat sama (SES) yang besar terletak di tengah.1% di dalam PBS Larutkan 0. Semasa mencuci sel-sel daripada permukaan bekas kultur. dalam keadaan yang telah menjadi kebiasaan seperti pertumbuhan sel di dalam bekas kultur yang sama ukurannya. walaupun tidak 64 .

7.02%) Media pertumbuhan PBS (steril) Tripan biru Dimetil sulfoksida (DMSO) Kriovial Peti beku suhu – 70°C Tangki nitrogen cair untuk menyimpan spesimen Alat emparan Mikroskop cahaya Mikroskop cahaya terbalik Kapas Kertas timah nipis PERSEDIAAN Dimetil sulfoksida (DMSO) 10% v/v di dalam media pertumbuhan Tambahkan 1 ml DMSO ke dalam 9 ml media yang mengandungi serum 10% pada hari kultur sel akan disimpan. pensterilan ke atas bahan adalah tidak perlu kerana DMSO dianggap steril.5%) dan versena (0. 3. 6. Jika sel mengambil masa yang lama untuk mencapai keadaan di atas. Labelkan kriovial dengan nama sel. Apabila sesuatu sel dikulturkan untuk jangka masa yang berlarutan terdapat kemungkinan ciri-cirinya akan berubah: yang paling sering dikesan ialah sensitivitinya terhadap virus menjadi berkurangan. Pilih kultur sel yang sihat. Sediakan suspensi sel di dalam media yang mengandungi serum 10% (lihat tatacara tripsinisasi sel. 12. 2. TATACARA 1. kultur ini boleh digantikan dengan kultur sel lain yang disimpan.) dan tarikh. ialah untuk mengekalkan ciri-ciri kultur sel tertentu. Pindahkan ke dalam 1 tabung atau botol steril dan tambahkan media jika perlu. N OTA 1. Keluarkan supernatan dan masukkan media pertumbuhan yang mengandungi DMSO 10%. 11. Simpan pada lantai peti bek – 70°C semalaman dan segera pindahkan ke dalam bekas yang mengandungi nitrogen cecair. kemudian balut dengan kertas timah dan masukkan ke dalam satu kotak polistirena (5-10 cm tebal). 2. 10.begitu ketara. 65 . Pindahkan 1 ml ke dalam setiap kriovial. Jangan tambah DMSO kepada suspensi sel secara langsung ke dalam media pertumbuhan. 8. Atursuaikan supaya kepekatan sel adalah 2 x 106 sel setiap ml. Kultur simpanan ini lazimnya masih mempunyai ciri-ciri yang dikehendaki kerana ia merupakan kultur sel yang mempun-yai riwayat pensubkulturan yang awal. 10. 5. 14. 4. Tatacara Kriopengawetan Sel yang Hidup BAHAN 1. Dalam hal ini. Jika perubahan yang tidak sesuai berlaku dalam kultur sel yang sedang digunakan. 7. 3. jika ada. nombor pindahan sel (cell passage no. Campurkan dan hitung jumlah sel untuk menentukan kadar sel hidup. 5. 6. Balutkan dengan kapas. 8. 3. Kultur sel Campuran larutan tripsin (0. ms 62-64). 9. iaitu dalam fasa tumbesaran logaritmanya dan hampir mencapai lapisan sel yang meliputi keseluruh permukaan bekas kultur. 4. tukarkan media kultur sekitar 24 jam sebelum sel diproses. Emparkan pada 200 g selama 15 minit. 9. 2. 15.

7. kadangkala ampul yang dimasukkan ke dalam air untuk pencairan boleh meletup jika penaupan tidak dilakukan dengan sempurna. Keringkan permukaan luar ampul dan lap dengan alkohol. pastikan aras air tidak mencapai penutupnya untuk mengelak kemungkinan air menyentuh bahagian mulut kriovial dan berlakunya pencemaran. 8. kriovial lebih mudah dikendalikan kerana dilengkapi dengan penutup. 6. bekas nitrogen cair disimpan di dalam bilik sejuk dan dipastikan nitrogen cair ditambahkan semula dalam tempoh masa yang sesuai mengikut kekerapan bekas tersebut dibuka. N OTA 1. 5. Tambahkan media pertumbuhan yang mengandungi DMSO yang tersedia kepada sel-sel selepas diemparkan. Oleh kerana amat sukar untuk mengekalkan suhu peti beku pada – 70°C. Keluarkan kriovial/ampul sejurus selepas suspensi sel menjadi cair. Pindahkan kandungan kriovial atau ampul ke dalam sebuah bekas kultur dan campurkan media pertumbuhan ke dalamnya. pastikan salah satu bekas kultur sel daripada kumpulan ini boleh dihidupkan semula tanpa terjadinya sebarang pencemaran mikrob. Kriovial kultur sel Media pertumbuhan Penganggas air 37°C Bekas kultur sel Pipet steril Inkubator suhu 37°C TATACARA 1. 3. Jika ampul kaca digunakan. Untuk mengelakkan penyejatan. Tatacara Mengkulturkan Semula Sel yang Dikrioawetkan BAHAN 1. 9. 7. 66 . 2. 4. Sebelum sesuatu kumpulan kultur sel yang disimpan dianggap sempurna. 4. 5. Walaupun ampul kaca atau polipropilen boleh digunakan sebagai bekas untuk simpanan. manakala ampul biasanya harus ditutup melalui penaupan dengan pembakaran api. Keluarkan sebuah kriovial dari tempat simpanan dan serta-merta pindahkannya ke dalam penganggas air. 6. Amalan ini dipraktikkan kerana sel haiwan yang disimpan pada suhu – 70°C tidak boleh mengekalkan viabilitinya dalam masa yang begitu lama. tudung ampul dengan sehelai kain dan pakai kaca mata pelindung kerana ampul yang tidak ditaup dengan sempurna boleh meletup.4. Adalah penting suhu kultur sel yang disimpan dikurangkan secara beransur-ansur. Adukkan suspensi sel sejurus sebelum diagihkan ke dalam botol kriovial untuk memperoleh suspensi sel yang sama rata. 8. Semasa kandungan kriovial dicairkan. 2. selepas sel telah melekat pada permukaan bekas kultur pipet keluar media dan gantikan dengan media baru. Kultur sel yang disimpan pada – 70°C harus dikulturkan selepas 6 bulan sebelum disimpan semula. Eramkan pada 37°C. Selepas beberapa jam hingga semalaman. adalah lebih selamat jika sel disimpan di dalam nitrogen cair. Pegang kriovial di dalam penganggas air sehingga semua pembekuan menjadi cair. Kita juga harus menyedari bahawa ada kemungkinan suhu – 70°C tersebut tidak dicapai di seluruh ruangan simpanan di dalam peti beku. 6. 5. 3. Ini dicapai dengan kriovial dibalut dengan kapas serta kertas timah dan disimpan di dalam kotak polistirena. Lagipun.

2. Pergandaan infektiviti. 2. 3.o. Suspensi virus Larutan garam seimbang Hank dengan antibiotik (pencair virus) Kultur sel dalam bentuk monolapisan penuh PBS (steril) TATACARA 1.o. 3. N OTA Lakukan pencairan virus supaya mencapai pergandaan infektiviti (multiplicity of infection. Amati kultur sel dan pilih kultur yang hampir atau baru mencapai monolapisan yang lengkap atau penuh (seluruh permukaan bekas kultur sel diliputi dengan sel). Jika kultur berada di dalam bekas kaca. 2. Permukaan bekas kaca dibakar sebelum dan sesudah cecair dituang. Keluarkan media dari bekas kultur. Bekas kultur sel digoncang bukan sahaja untuk menyebarkan virus tetapi juga untuk mempastikan seluruh sel monolapisan sentiasa diliputi cecair untuk mengelak daripada kekeringan. 5. 5. Jika m. 6.i. eramkan kultur di dalam inkubator CO 2. Amati kehadiran kesan sitopatik (untuk virus sitopatik) setiap hari atau selang sehari. adalah nisbah partikel virus berinfeksi dan sel. Jika banyak kultur sel perlu diinokulasi dalam masa yang sama. 8. suhu pengeraman adalah 37°C sungguhpun pada virus respiratori suhu yang lebih rendah. Lap keseluruhan bahagian luar bekas dengan alkohol untuk mengelakkan pencemaran. yakni 35°C merupakan suhu yang optimum. Sama ada kriovial digoncang untuk menggalakkan pembekuan suspensi sel supaya lebih cepat mencair atau tidak bergantung kepada jenis sel tertentu kerana terdapat jenis sel yang viabilitinya terjejas akibat goncangan dengan kuat. Penjerapan boleh dilakukan pada suhu bilik atau pada suhu pengeraman kultur. kandungannya bolehlah dituang. Eramkan pada suhu yang sesuai (biasanya pada suhu 37°C) selama 30-60 minit. Goncangkan bekas setiap 10-15 minit untuk menyebarkan semula suspensi virus ke seluruh monolapisan. 4.i yang terlalu tinggi digunakan ada kemungkinan sebahagian besar virus yang tak lengkap dihasilkan. Penjerapan virus dilakukan dalam isipadu cecair yang kecil untuk memudahkan kontak di antara virus dan sel. 4. atau di dalam bekas khas yang mengandungi CO 2 5%. 9. Sama ada inokulum virus dikeluarkan selepas tempoh penjerapan atau tidak bergantung kepada keperluan. 6. media boleh dikeluarkan dengan pipet yang dihubungkan kepada sebuah pam udara. Tatacara Inokulasi Kultur Sel dengan Virus BAHAN 1. 3. Masukkan suspensi virus ke dalam bekas kultur dan sebarkan ke seluruh lapisan sel. 7. Pilih suhu pengeraman yang optimum untuk sesejenis virus yang dikulturkan. Persediaan ini dilakukan dengan menggunakan kabinet biohazard kelas 2. Cuci 2 kali dengan PBS. 1. 5. 67 . m. Pada kebanyakan virus haiwan. atau udara di dalam ruangan bekas kultur digantikan dengan campuran gas yang mengandungi CO 2 5%. 7. Masukkan media pertumbuhan dan eramkan pada suhu yang sesuai.) yang sesuai. 4.2. pada peringkat awal tempoh pertumbuhan sel. 4. 3. Untuk memperoleh pemulihan kultur sel yang lebih cepat. Media kultur dibuang dan digantikan dengan yang baru secepat boleh supaya DMSO dan selsel yang mati yang boleh menjejaskan pertambahan sel-sel yang hidup disingkirkan.

Tiga jenis tapak pada telur – membran amnion. khususnya mata embrio yang besar dan kehadiran ruang udara. Pengamatan Telur Melalui Transiluminasi (Penyuluhan) Embrio telur dipastikan hidup dengan cara transiluminasi yang diberi istilah candling dalam bahasa Inggeris kerana pada zaman dahulu cahaya lilin digunakan untuk tujuan ini.4. Pasangkan penghujung kon yang besar kepada kepala lampu suluh. Sebelum inokulasi dilakukan adalah penting untuk menentukan terlebih dahulu sama ada telur yang akan digunakan tersebut mempunyai embrio yang masih hidup dan kedua.2. 4. 68 . 3. Perkukuhkan kontak ini dengan menambahkan pita selofan. Tatacara Penyuluhan Telur BAHAN 1.3. Tekan lubang terowong lampu suluh kepada cangkerang telur. Dengan ini cahaya lampu akan ditujukan ke luar melalui lubang yang lebih kecil. Telur berembrio Lampu suluh Kertas manila Pita selofan Gunting Pena penanda PERSEDIAAN Alat untuk penyuluhan Gulungkan sekeping kertas manila supaya berbentuk kon. 6. Nyalakan lampu dan amatilah bahagian dalam telur. bentuk embrio juga jelas kelihatan. 4. 3. Pilih tempat yang gelap. Gunting kedua-dua penghujung kon ini supaya tepinya menjadi sama rata dan garis pusat bahagian yang lebih besar adalah sama dengan ukuran kepala lampu dan bahagian kecil adalah lebih kurang sama dengan ukuran penghujung telur yang lebih bulat. 2. Gunakan pita selofan untuk melekatkannya dan mengekalkan bentuk ini. N OTA Pilih telur yang bersih dan mempunyai cangkerang yang berwarna putih pudar untuk memudahkan pengamatan bahagian dalamnya. 5. tapak yang sesuai untuk suntikan. Pastikan salur darah korioalantoik telur berembrio kelihatan jelas sekali dan embrio bergerak-gerak. Semua ini adalah tanda yang menunjukkan bahawa embrio tersebut masih hidup. yang digunakan ialah kotak cahaya atau lampu suluh yang telah diubahsuai. Pada masa ini. PENGKULTURAN VIRUS DENGAN MENGGUNAKAN TELUR BEREMBRIO Telur ayam berembrio hidup merupakan suatu sistem yang digunakan untuk pengkulturan beberapa jenis virus. 2. TATACARA 1. membran alantoik dan membran korioalantoik – boleh digunakan bergantung kepada jenis virus yang terlibat.

7. 6. Suntikkan 0.1 ml inokulum ke dalam celah ini dengan jarum yang dimasukkan beberapa mm ke dalam celah. Tandakan dengan pena penanda tapak ruang udara. Gerudi satu lubang atau celah yang kecil pada cangkerang pada tapak yang ditandakan untuk mendedahkan membran cangkerang. 3. Ketuk dan pecahkan cangkerang tepat di atas ruang udara berkenaan dengan pemegang gunting dan guntingkan satu lubang besar sehingga mencapai pinggir ruang udara. 5. 7. 3. 5. Terbalikkan telur untuk membersihkan membran cangkerang daripada cebisan-cebisan cangkerang. 2. Suluh telur untuk menentukan embrio masih hidup. 4. 6. 5. Telur berembrio berumur 10 hingga 12 hari Jarum (28 gauge) dan picagari Etanol 70% Penggerudi berputar yang dipasang dengan cakera pemotong Pita selofan TATACARA 1. 4. Tatacara Penyuntikan Virus ke dalam Ruang Alantoik BAHAN 1. 4. Lapkan membran cangkerang dengan parafin cecair supaya membran cangkerang menjadi jernih. Suluh telur untuk menentukan embrio masih hidup. Telur berembrio berumur 10-12 hari atau 12-14 hari Jarum panjang (11/4) dan picagari berisipadu 1 ml Etanol 70% Penggerudi berputar yang dipasang dengan cakera pemotong Pita selofan Parafin cair Gunting kecil dengan penghujungnya bengkok Swab steril TATACARA 1. Suntikan Virus ke dalam Ruang Amniotik Cara ini digunakan untuk pemencilan primer (kali pertama virus ditumbuh dalam keadaan makmal) virus influenza dan mumps.Suntikan Virus ke dalam Ruang Alantoik Pertumbuhan virus di dalam membran alantoik digunakan untuk virus influenza dan paramiksovirus yang telah disesuaikan beraplikasi dalam keadaan makmal. Tutup celah dengan pita selofan. 4. Eramkan dengan tapak yang diinokulasi virus di sebelah atas selama 1 hingga 3 hari mengikut keperluan. Tandakan dengan pena tanda satu tapak yang agak berjauhan dengan sebarang salur darah. 2. 2. 5. Lap tapak celah tersebut dengan etanol. Tatacara Penyuntikan Virus di dalam Ruang Amniotik BAHAN 1. 69 . 3. 3. 8. 2.

Tutup lubang dengan pita selofan. 8. Tatacara Mengumpulkan Cecair Alantoik BAHAN 1. Eramkan dengan tapak yang diinokulasi di sebelah atas selama dua hingga tiga hari pada suhu 37°C. 2. 7. 6. 10. 3. Tatacara Penyuntikan Virus ke atas Membran Korioalantik BAHAN 1. 7. Lap tapak celah dengan etanol. Suntikkan 0. Suntikkan 0.1 ml inokulum ke dalam celah ini dengan jarum yang dimasukkan beberapa mm ke dalam celah. 4. 4. 3. Eramkan dengan tapak yang diinokulasi di sebelah atas selama 1 hingga 3 hari mengikut keperluan. 2. Telur berembrio berumur 10 sehingga 12 hari Jarum (28 gauge) dan picagari Etanol 70% Penggerudi berputar yang dipasang dengan cakera pemotong Pita selofan Pena penanda Bal penyedut getah besar Larutan salin 0. 5. Gerudikan satu lubang kecil di kawasan ruang udara. 3. Tutup celah dengan pita selofan. Gerudikan satu celah cangkerang yang kecil pada tapak yang ditandakan tersebut untuk mendedahkan membran cangkerang sahaja.6. Suluh telur untuk menentukan embrio masih hidup. 5. Penyuntikan Virus ke atas Membran Korioalantoik Pengkulturan virus di atas membran korioalantoik membolehkan perbezaan di antara poksvirus jenis variola dengan vaksinia dan di antara virus herpes simplex taip 1 dengan taip 2 berdasarkan morfologi poks yang dihasilkan. 9. Tandakan dengan pena penanda satu tapak yang tidak mendekati mana-mana salur darah. 8. 8. 2. 5. Telur berembrio selepas penyuntikan virus dan pengeraman Gunting Pipet Pasteur Botol (steril) Etanol 70% 70 .85% (steril) TATACARA 1.1 ml inokulum ke pundi amniotik dengan menusukkan jarum ke tapak yang berhampiran dengan kepala embrio. Lepaskan tekanan bal getah. 4. 11. 7. Tekan bal penyedut getah besar dengan sepenuhnya dan lekapkan penghujungnya pada lubang di ruang udara. 6. Letakkan setitis larutan salin yang steril di atas celah. supaya membran korioalantoik di bawah celah tersedut dan kelihatan terjatuh atau terlepas daripada cangkerang dan suatu pundi udara terbentuk.

5 ml larutan salin yang steril. Tanggalkan pita selofan yang menutupi ruang udara. 2. Sedut dan keluarkan cecair daripada pipet beberapa kali sebelum dikumpulkan. Lap tapak suntikan dengan alkohol. 3. 3. tambahkan 0. 2. Pecahkan cangkerang di atas ruang udara dan guntingkan satu lubang besar. 6. 4. 2. 3. Tatacara Mengumpulkan Cecair Amniotik BAHAN 1. Pegang pundi amniotik dengan forseps dan tembusinya dengan pipet Pasteur untuk mengeluarkan cecair amniotik daripada ruang amniotik. 5. 2.85% (steril) Etanol 70% TATACARA 1. 4. 3. N OTA Telur disejukkan untuk membunuh embrio serta mengecutkan salur darah supaya pengumpulan cecair yang mengandungi virus dilakukan tanpa pencemaran dengan sel darah merah. Letakkan telur di dalam peti sejuk selama beberapa jam atau di dalam peti beku suhu – 20°C selama 1 jam. Telur berembrio selepas penyuntikan virus dan pengeraman Gunting Piring Petri Forseps Larutan salin 0. Lap cangkerang di bahagian atas ruang udara telur dengan etanol. 2. N OTA Jika cecair amniotik didapati kurang. Gunakan pipet Pasteur untuk menolak embrio dan pundi kuning telur ke tepi dan kumpulkan cecair alantoik dengan menggunakan pipet Pasteur lain. Letakkan telur di dalam peti sejuk selama beberapa jam atau di dalam peti beku suhu – 20°C selama 1 jam. 5. Letakkan telur di dalam peti sejuk selama beberapa jam atau di dalam peti beku suhu – 20°C selama 1 jam. 3. Tatacara Pengambilan Membran Korioalantoik BAHAN 1. Telur berembrio selepas penyuntikan virus dan pengeraman Forseps Pipet Pasteur Botol (steril) Larutan salin 0. 71 . 4. Tanggalkan pita selofan yang menutupi tapak suntikan pada permukaan telur.TATACARA 1.85% (steril) TATACARA 1.

Pegang membran korioalantoik ini dan gunting di sekelilingnya sehingga semuanya terlepas daripada cangkerang.4. 6. Cuci membran korioalantoik yang dikeluarkan di dalam larutan salin steril dan rentangkannya di dalam piring Petri. 72 . 5. Pecahkan cangkerang di atas celah dengan bahagian pemegang gunting dan potong cangkerang sehingga ke pinggir ruang udara palsu.

asid – merah. istilah ‘fermentasi’ digunakan secara longgar dalam konteks ujian bakteriologi diagnostik.5. beberapa kumpulan bakteria tertentu menghasilkan bahan pertengahan metabolisme yang spesifik seperti asetil-metil-karbinol berikutan fermentasi glukos yang boleh digunakan untuk membezakan kumpulan bakteria yang menghasilkannya daripada yang tidak. Hasilan bukan gas ditunjukkan oleh tindakan kimia yang menghasilkan terbitan yang berwarna. asid – kuning. Dalam pengenalpastian bakteria. 5. iaitu tanpa oksigen bebas. ataupun dari menggunakan substrat bukan karbohidrat. Oleh yang demikian.1. Oleh yang demikian. Ujian Fermentasi Gula: Penghasilan Asid dan Gas Fermentasi adalah suatu proses kimia yang melibatkan oksidasi-reduksi. Hasilan aktiviti enzim ini boleh berupa gas atau terbitan bukan gas. bromthymol blue: neutral – hijau. Gas yang dihasilkan dikesan secara langsung melalui pengamatan penghasilan gelembung gas atau secara tidak langsung melalui penggantian cecair di dalam tiub Durham dengan gas. Bakteria berbeza dalam jenis karbohidrat yang boleh digunakan sebagai sumber tenaga melalui proses fermentasi. Tatacara Ujian Fermentasi Gula: Penghasilan Asid dan Gas BAHAN 1. alkali – biru). Dalam hal ini sungguhpun tidak semua substrat yang digunakan dalam ujian fermentasi adalah gula. kehadiran rekahan atau celah-celah di dalam agar atau melalui tindakan kimia yang menghasilkan terbitan yang berwarna dan tidak larut (misalnya H 2S). PENGENALPASTIAN AGEN MIKROB UJIAN MAKMAL DALAM PENGENALPASTIAN BAKTERIA Bakteria mempunyai kisaran aktiviti biokimia yang amat luas. faktor ini dengan spesifisiti sesejenis enzim terhadap substrat tertentu membolehkan bakteria dikenal pasti dalam keadaan sekeliling yang terkawal seperti di makmal. 3. alkalin – tanpa warna. Dalam ujian bakteriologi. dan substrat organik merupakan penerima terakhir elektron. Proses in berlaku dalam keadaan anaerobik. tidak semua ujian yang digunakan untuk menguji kebolehan sesejenis bakteria mendegradasikan secara enzimatik ‘gula’ menjadi produk asid merupakan proses fermentatif. perbezaan ini merupakan salah satu ciri penting dalam pengenalpastian spesis bakteria. Aktiviti yang luas ini dikawal oleh faktor genetik serta alam sekelilingnya. istilah gula meliputi senarai substrat berkenaan. misalnya manitol adalah sejenis alkohol. Misalnya. Dalam fermentasi karbohidrat beberapa produk dihasilkan termasuk pelbagai jenis asid dan gas. Andrade: neutral – kuning pucat. 2. Kultur bakteria pada plat agar Media cecair gula di dalam tabung reaksi atau botol Bijou Gelung dawai Penunu Bunsen 73 . iaitu bukan fermentasi. Penghasilan asid ditunjukkan oleh perubahan warna indikator pH (sesuatu jenis pewarna) yang bergantung kepada jenis indikator yang digunakan (contoh. sesuatu aktiviti biokimia ditentukan oleh enzim-enzim yang dihasilkan oleh bakteria. Akan tetapi penurunan pH boleh dicapai melalui proses penggunaan karbohidrat yang bukan anaerobik. Kehadiran sesejenis enzim dikenal pasti secara tidak langsung melalui tindakannya terhadap sesuatu substrat. yang merangkumi proses kemusnahan dan proses pembinaan (atau sintesis). jenis dan kuantiti asid campuran (mixed acids) – pelbagai jenis asid organik yang berasal dari asid piruvik yang dihasilkan serta kemampuan menghasilkan gas. 4. Daripada segi genetik. Enzim juga boleh ditunjukkan dalam tindakan serologi yang menghasilkan kompleks enzim (sebagai antigen) – antibodi yang muncul sebagai presipitasi. Walau bagaimana pun. fermentasi dipastikan secara tidak langsung melalui pengamatan perubahan warna indikator pH akibat penghasilan asid.

0%) dan sukrosa (1. Media TSI ditampan pada pH 7.0%). Sebaliknya. laktosa (1. Sentuhkan pada 1 koloni bakteria pada media plat. N OTA 1. laktos atau sukros atau kombinasi daripada ketiga-tiga gula tersebut. gas ini akan mengganti media yang dimaksudkan dan akan terperangkap di dalam tiub maka kehadiran ruang tanpa media menunjukkan kehadiran gas. Sterilkan gelung dawai melalui pembakaran api penunu Bunsen dan biarkan sehingga dingin.1%) . 7. penghasilan gas dan penghasilan hidrogen sulfid. Tiub Durham adalah sebuah tabung/tiub kecil yang boleh dimuatkan di dalam botol Bijou dan diletakkan terbalik (dengan mulutnya di bawah).Media cecair gula: (media dasar yang mengandungi jenis-jenis gula atau karbohidrat tertentu dan indikator pH. bahagian puntung agar (di bahagian dasar tabung) (butt) dilindungi dari udara dan wujud dalam keadaan anaerobik (walaupun bukan 100%). Amati perubahan warna media dan penghasilan gas (yang terperangkap di dalam tiub Durham). Media TSI disediakan dalam agar condong. sebagai penunjuk fermentasi. Gula yang digunakan adalah glukosa (0. Tegakkan semula botol media. 2. Penghasilan asid Ujian positif: Media berwarna merah Ujian negatif: Tanpa perubahan warna media Pentafsiran hasil positif: Bakteria dapat menfermentasikan gula berkenaan 2. 3. Jika pada mulanya tiub ini hanya dipenuhi dengan media. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN 1. Tutup rapat media yang telah diinokulasi dan tunggangkan sekali supaya keseluruhan tiub Durham dipenuhi media dan sama sekali tidak mengandungi gelembung udara di dalamnya. 4. adalah fenol merah yang akan menjadi kuning pada pH 6. Inokulasikan kultur ini ke dalam media cecair yang mengandungi sejenis gula. Bahagian permukaan agar (agar condong) (slant) adalah terdedah kepada udara maka wujud dalam keadaan aerobik. Media cecair terdiri daripada gula 1% di dalam air pepton 1%. 2.8 (keadaan asid). 6. setelah penghasilan gas oleh mikroorganisma. 3. 74 . Ulangkan inokulasi ke dalam media yang mengandungi gula lain.4 iaitu pH alkali maka warna agar kelihatan oren-kemerahan atau merah. serta dilengkapi dengan tiub Durham) TATACARA 1. Eramkan pada 37°C selama semalaman. 5. Indikator pH. Biasanya media ini juga disertakan sejenis indikator pH. Catatkan hasil selepas 24 jam pengeraman dan seterusnya pengeraman dilanjutkan selama beberapa hari sebelum hasilnya dinyatakan sebagai negatif. Penghasilan gas Ujian positif: Ruang kosong di dalam tiub Durham Ujian negatif: Tiub Durham masih dipenuhi media Pentafsiran hasil positif: Bakteria menghasilkan gas semasa menfermentasi gula Ujian Tiga Gula-Besi Media tiga gula-besi atau Triple Sugar Iron ( TSI ) merupakan sejenis media campuran yang digunakan untuk membezakan spesies bakteria dalam famili Enterobacteriaceae dengan berdasarkan kepada kemampuan spesies-spesies ini untuk memfermentasi gula dekstros.

Tarik semula dawai dan gariskan organisma di atas permukaan agar yang condong. Dawai inokulasi lurus (dawai lurus) 4. Eramkan semalaman dan teruskan selama 48 jam (jika perlu). Penghasilan gas ditunjukkan dengan kehadiran gelembung gas atau bahagian puntung agar akan kelihatan pecah-pecah.Peptid dan asid amino yang berasal dari pepton di dalam media TSI didegradasikan melalui proses dekarboksilasi oksidatif kepada amina. 5. 3. Cerun agar TSI di dalam tabung uji 3. Sukrosa dicampurkan untuk menyaringkan spesies Salmonella dan Shigella kerana kedua-dua bakteria ini tidak menfermentasi sukrosa atau laktosa.1%). Sterilkan keseluruhan dawai lurus melalui pembakaran dan biarkan supaya sejuk. Walau bagaimanapun. pH asid di bahagian permukaan agar akan berubah semula menjadi alkali (ungu-merah) manakala bahagian puntung agar (bahagian dasar tabung) akan kekal asid (kuning) kerana di situ amina yang dihasilkan tidak mencukupi untuk mengatasi kesan asid. atau kedua-duanya difermentasi kuantiti asid yang dihasilkan daripada salah satu di antara kedua gula ini adalah besar kerana konsentrasi kedua-dua gula ini adalah tinggi iaitu masing-masing 1%. sejenis terbitan alkali. Proses in dipercepatkan oleh bakteria yang tumbuh di bahagian permukaan agar. Jika bakteria yang diinokulasi tidak menfermentasi karbohidrat. kuantiti ini mencukupi untuk bahagian permukaan dan puntung agar menjadi kuning.1 75 . Jika laktosa atau sukrosa. Jika bakteria hanya boleh menfermentasi glukosa. Di bahagian puntung. kuantiti asid yang dihasilkan adalah terhad kerana kuantiti glukosa yang digunakan adalah rendah (0. Kultur bakteria 2. 4. oksigen di dalam udara tidak dapat sampai maka proses dekarboksilasi oksidatif adalah pada tahap minimum. Tatacara Ujian Tiga Gula Besi BAHAN 1. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Rujuk kepada Jadual 5. walaupun amina dihasilkan kuantiti asid yang dihasilkan terlalu besar untuk perubahan pH kembali kepada keadaan alkali maka bahagian condong mahupun bahagian puntung agar akan tetap berkeadaan asid (kuning). asid tidak dihasilkan dan warna merah akan kekal di seluruh media. Tusukkan inokulum menembusi cerun agar TSI di dalam tabung sehingga ke dasarnya. amina dihasilkan dan lama kelamaan (18-24 jam selepas pengeraman) kuantitinya mencapai aras yang mampu mengatasi kesan kuantiti rendah asid yang dihasilkan. Sentuhkan penghujung dawai kepada koloni bakteria. Tetapi di permukaan agar yang terdedah kepada oksigen udara. 2. Jadi. Hidrogen sulfid yang dihasilkan akan bertindakbalas dengan ferrous sulfat dan suatu presipitasi hitam (ferik sulfid) akan terbentuk di dalam media. Penunu Bunsen (Reagen TSI: Dari sumber komersial) TATACARA 1.

Walau bagaimanapun. S.Staphylococcus.M. Morganella morganii. Klebsiella.Klebsiella. enter itidis. terdapat beberapa jenis reagen untuk mengesannya. P. P. Ujian Indol Bakteria menghasilkan indol (benzopyrrole) daripada asid amino triptofan akibat tindakan enzim triptofanase. (Salmonella dan Shigella adalah urease-negatif. Proteus rettgeri.vulgaris.S. 2. A. E. mirabilis. Shigella Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa _ + Salmonella typhosa. Citrobacter. Proteus rettgeri. Oleh kerana sesetengah spesies Proteus dan beberapa spesies lainnya boleh memberikan reaksi pada TSI yang serupa dengan Salmonella ataupun Shigella. Kuning Fermentasi glukosa & laktosa atau sukrosa + – Aerobacter aerogenes. morganii. manakala Proteus. Arizona. Mimae Shigella dysenteriae. Proteus mira bilis. Tatacara Ujian Indol BAHAN 1. Citrobacter.S. schottmuelleri. Serratia Kuning .Ed-wardsiella Kuning Kuning Fermentasi glukosa & laktosa atau sukrosa – – Hafnia. Tabung TSI harus ditutup secara longgar sahaja selepas diinokulasi supaya udara dapat masuk ke dalam tiub kultur untuk membolehkan berlakunya oksidasi dan perubahan balik condong agar daripada asid (kuning) ke alkali (ungu-kemerahan). proteus rettgeri. vulgaris. maka untuk membezakan spesies-spesies ini ujian urease dilakukan. coli. Arizona * Atau tiada perubahan dan warna agar seperti warna sebelum diinokulasi N OTA 1.JADUAL 5. Serratia Rupa Agar Tafsiran Condong Merah* Ungu-kemerahan Puntung Merah Kuning Tiada fermentasi gula Fermentasi glukosa Gas – – H 2S – – Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa + – Salmonella cholera-suis. Providencia. Kultur bakteria Air pepton di dalam tabung uji Broth triptofan di dalam tabung uji 76 . reagen Kovac merupakan yang paling popular digunakan di masa kini. Streptococcus. 2. Indol bertindak dengan para-dimetil-aminobenzaldehid dan menghasilkan pewarna rosindole (warna merah tua).Arizona.Providencia Kuning Kuning Fermentasi glukosa & laktosa atau sukrosa + + Proteus vulgaris.Providencia. S. Edwardsiella Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa + + Salmonella typhimurium. Pseudomonas. 3. sonnei. urease-positif).enteritidis paratyphi.1 Pola Hasil Tindakan Bakteria ke atas TSI Penghasilan Kemungkinan Bakteria (Jenis) Alcaligenes. cloacae.Citrobacter.P. Proteus mirabilis. Sungguhpun tindak balas kimia asas dalam pengesanan indol adalah sama.

Bakteria yang menggunakan tapak jalan fermentasi asid campuran dalam katabolisme glukosa biasanya menghasilkan kuantiti pelbagai jenis asid organik (formik.4.5 ml) reagen Kovac (berwarna kuning). 2. Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. N OTA Di samping reagen Kovac. kepekatan komponen media yang sesuai untuk ujian metilmerah serta ujian Voges Proskauer telah ditentukan dan media untuk kedua-dua ujian ini kemudian dipasarkan sebagai media MR-VP (Methyl Red – Voges Proskauer). PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Merah tua Ujian negatif: Kuning Pentafsiran hasil positif: Penghasilan indol akibat degradasi protein triptofan oleh bakteria. media diuji biasanya dicampurkan kloroform sejenis bahan kimia yang toksik. Simpan di dalam botol gelap dengan penutup kaca di dalam peti beku. Walau bagaimanapun. Panaskan di dalam penganggas air pada 56°C sehingga larut. Pipet Pasteur (steril) Reagen Kovac PERSEDIAAN Reagen Kovac Masukkan 10 g p-dimetilaminobenzaldehid ke dalam 150 ml alkohol jenis amilalkohol. Masukkan 5 titis (~ 0. isoamilalkohol atau butilalkohol. Dalam penciptaan ujian metil-merah. Dengan perlahan dan hati-hati campurkan 50 ml HCl pekat (Lakukan di dalam kabinet asap). dalam ujian yang menggunakan reagen Ehrlich. Eramkan selama 24 – 48 jam. Metil-merah (Media MR-VP: Dari sumber komersial) 77 . Kultur bakteria 2. Goncang dan biarkan selama 10 minit. Air pepton 3. asetik. 5. Reagen ini stabil selama beberapa tahun. Ujian indol yang dilakukan dengan reagen Kovac tidak memerlukan kloroform. Amatilah pembentukan lapisan warna (cincin) pada permukaan suspensi. Biarkan sehingga dingin.4 manakala bakteria yang menggunakan tapak jalan fermentasi butilena glikol tidak menghasilkan asid. Broth MR-VP di dalam tabung uji 4. Reagen ini berwarna kuning muda. Tatacara Ujian Metil-Merah BAHAN 1. Ujian Metil-Merah Metil-merah pada pH neutral dan asid sederhana (nilai 7-6) berwarna kuning tetapi menjadi merah pada pH yang agak rendah iaitu di bawah nilai 4. Ciri ini digunakan untuk membezakan di antara spesies bakteria yang menghasilkan asid ‘kuat’ (strong acids) dalam kuantiti besar dan spesies bakteria yang tidak berbuat demikian.4. TATACARA 1. 4. 6. Masukkan 2 titis suspensi ini ke dalam broth triptofan. laktik) yang mencukupi untuk menurunkan pH media di bawah nilai 4. reagen Ehrlich juga boleh digunakan dalam ujian Indol. 3. 5.

5.5 ml kultur. 3.0 ml broth MR-VP.2 ml larutan KOH. 2. Amatilah pembentukan warna di permukaan media PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Warna merah jambu sehingga merah. Tambahkan 0. Eramkan selama 24 jam pada 37°C. 7. Kultur bakteria Air pepton Broth MR-VP (0.5% kreatin) TATACARA 1. Masukkan dua titis suspensi ini ke dalam 1. warna pertengahan di antara kuning dan merah tidak dianggap positif. Warna oren.6 ml larutan a -naftol. Jika hasil yang kurang pasti didapati.1 g metil-merah di dalam 300 ml etanol 95%. Amati pembentukan warna. 4. Inokulum yang tebal adalah penting supaya kuantiti asid yang besar dapat dihasilkan untuk membolehkan ujian dibaca berikutan pengeraman selama 18-24 jam. Masukkan 2 titis suspensi ini ke dalam 0. 5. Dalam kehadiran KOH dan oksigen (dari udara) asetoin secara spontan (tidak melibatkan enzim) dioksidasi menjadi metabolit pertengahan. Sensitiviti ujian ini dipertingkatkan dengan penambahan a -naftol.PERSEDIAAN Reagen metil-merah Larutkan 0. 2. 2. Pentafsiran hasil positif: Menunjukkan penghasilan asid dalam kuantiti tinggi hasil fermentasiglukosa oleh bakteria. Tatacara Ujian Voges-Proskauer BAHAN 1. N OTA 1. Ujian Voges-Proskauer Asetil-metil karbinol (atau asetoin) adalah metabolit pertengahan/perantaraan dalam proses penghasilan butilena glikol pada fermentasi glukosa. Masukkan 2 titis metil-merah ke dalam setiap 0. 6. Ujian negatif: Warna kuning.5 ml) di dalam tabung uji a -naftol 5% dalam alkohol pekat 95% KOH (40% yang mengandungi 0. ujian diulangi ke atas kultur dengan pengeraman yang lebih lama. TATACARA 1. Diasetil kemudian bertindak dengan kumpulan NH2 bebas daripada kumpulan guanidina (kreatin adalah sumber kumpulan guanidina) untuk menghasilkan kompleks berwarna merah. 4. Goncang dengan baik dan biarkan selama 5 – 20 minit. 5. 4. Penghasilan asetoin merupakan salah satu kriteria dalam fermentasi glukosa oleh bakteria yang digunakan dalam pengenalpastian. diasetil. Masukkan pula 0. Campurkan air suling sehingga 500 ml. 3. 3. 3.5 ml broth MR-VP. Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. 6. 2. Eramkan pada 37°C selama 24 – 48 jam. 78 . Goncang dan biarkan seketika.

maka elakkan daripada menggerak-gerakkan tabung sehingga membolehkan warna tersebut muncul segera selepas reagen dicampurkan dan tabung digoncang supaya sebati. manakala Streptococcus pneumoniae sensitif terhadap Optochin. Ambil 1 koloni bakteria streptokokus b-hemolitik dan buat garisan-garisan pada permukaan agar darah. Letakkan secara aseptik dengan menggunakan jarum atau forseps steril 1 disk Bacitracin ke atas agar sejurus sebelum pengeraman kultur. 2. Jarum/forseps steril 6. Kajian yang telah dilakukan menunjukkan bahawa kebanyakan streptokokus kumpulan A (93-98%) sensitif terhadap konsentrasi rendah Bacitracin dan sebaliknya streptokokus bukan kumpulan A amnya resistan. Pentafsiran hasil positif: Kehadiran asetil-metil-karbinol (asetoin). Ujian Sensitiviti Terhadap Bacitracin dan Optochin Sensitiviti terhadap Bacitracin. Sapukan permukaan agar dengan menggunakan swab steril pada arah 90° daripada arah garisan pertama bakteria untuk mendapatkan lapisan bakteria yang tersebar dan sama rata di atas permukaan media. Ujian ini menunjukkan korelasi yang rapat dengan ujian kelarutan hempedu. Streptokokus a -hemolitik yang lainnya pula tumbuh sehingga mencapai ke pinggir disk atau kadangkala hanya menghasilkan zon rencatan pertumbuhan yang biasanya dibaca sebagai resistan. Streptococcus pyogenes (atau streptokokus kumpulan A Lancefield) sensitif terhadap Bacitracin. sejenis antibiotik. digunakan untuk membezakan streptokokus kumpulan A Lancefield daripada streptokokus b-hemolitik lainnya. 3. 79 . adalah sensitif terhadap Optochin dan menghasilkan zon rencatan pertumbuhan di sekeliling disk tersebut. Tatacara Ujian Sensitiviti Terhadap Bacitracin dan Optochin BAHAN 1. Pneumokokus (Streptococcus pneumoniae) selain larut di dalam hempedu. Swab (steril) 4. Agar darah 3. Ujian negatif: Tiada perubahan atau kuning.PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Merah. Kesimpulannya. Kultur bakteria 2. Sebaliknya. Disk Bacitracin dan disk Optochin (Reagen Bacitracin dan Optochin: Dari sumber komersial) TATACARA 1. Gelung dawai 5. N OTA Oleh kerana suatu perubahan warna akan berlaku di antara permukaan campuran kultur dan reagen. streptokokus selain daripada kedua spesies ini menunjukkan keresistanan sama ada terhadap Bacitracin bagi kumpulan b-hemolitik atau terhadap Optochin bagi kumpulan a -hemolitik menurut ujian yang dilakukan di atas. Sensitiviti terhadap Optochin (ethylhydrocuprein hydrochloride) pula digunakan untuk membezakan Streptococcus pneumoniae daripada streptokokus a -hemolitik lainnya. suatu hasil pertengahan dalam proses fermentasi glukosa oleh sesetengah bakteria. Kadangkala tindak balas mengambil masa yang lama (~ 2 jam) sebelum kemunculan warna yang dimaksudkan.

Jarum/forseps (steril) 7. 3. Disk dengan dua unit Bacitracin: 15 – 20 mm garis pusat (termasuk garis pusat disk). Amati kehadiran atau tidaknya pertumbuhan di sekeliling disk. Amati zon perencatan pertumbuhan bakteria. 2. manakala disk XV. Disk dengan 15 mg Optochin: 18 mm atau lebih dari tepi disk. 5. Koloni spesies bakteria yang menunjukkan pertumbuhan di sekeliling disk yang mengandungi faktor tumbesaran X. dan X bersama V tertentu menandakan ia memerlukan faktor tersebut dan sebaliknya. Bakteria sensitif terhadap Bacitracin/Optochin. Pengeraman seharusnya dilakukan dalam CO 2 5-10% untuk mencapai pertumbuhan optimum. saiz yang bergantung kepada kepekatan reagen yang digunakan. disk faktor V : tepat pada jam 4. Eramkan pada 37°C selama 18 sehingga 24 jam. 5. ia tidak mempunyai kemampuan untuk mensintesis faktor berkenaan dalam kuantiti yang optimum. V. jika perlu dalam atmosfera CO2 5-10%. 6. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif Bacitracin: Ujian positif Optochin: Pentafsiran hasil positif: Zon perencatan pertumbuhan. Swab (steril) 5. juga dinamakan koenzim I) supaya pertumbuhan bakteria dapat berlaku. Letakkan disk-disk yang mengandungi faktor tumbesaran secara aseptik di atas agar kirakira 1 atau 2 cm daripada pinggir media dalam pola sebagai berikut: misalnya disk Faktor X : tepat pada titik jam tangan yang menunjukkan jam 12. Air pepton 4. Tekan disk pada permukaan agar dengan forseps atau jarum steril supaya tidak tanggal. 4. Ulangi kaedah di atas dengan menggunakan kultur streptokokus a -hemolitik dan disk Optochin. Eramkan pada suhu 37°C selama 18 dan teruskan sehingga 48 jam.4. Kultur bakteria 2. Inokulasi seluruh permukaan plat agar nutrien dengan bakteria berkenaan dengan menggaris-gariskannya menggunakan gelung dawai. XV (Disk faktor X. Ujian Keperluan Faktor Tumbesaran X dan V Disk kertas yang diserap dengan faktor tumbesaran digunakan untuk membezakan antara spesies bakteria genus Haemophilus. 7. Disk faktor X. 80 . Spesies Haemophilus dan Bordetella boleh dikenal pasti berdasarkan sama ada media dasar memerlukan penambahan faktor tumbesaran X (hemin) dan faktor V (NAD. Agar nutrien 3. V. code DD1: 5 mm atau lebih zon perencatan yang diukur dari tepi disk. Disk Optochin jenama Oxoid. Buat suspensi murni bakteria di dalam air pepton. Gelung dawai 6. tepat pada jam 8. Tatacara Ujian Keperluan Faktor Tumbesaran X dan V BAHAN 1. V dan XV : Dari sumber komersial) TATACARA 1.

tetapi sama ada terdapat atau tidaknya pertumbuhan bakteria pada garis inokulasi di atas media. H. Dalam ujian yang menggunakan media Koser. hasilnya ditafsir berdasarkan berlakunya kekeruhan pada media broth akibat pertumbuhan bakteria.PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Pertumbuhan di sekeliling disk dengan: Faktor X dan XV – memerlukan faktor X sahaja Faktor V dan XV – memerlukan faktor V sahaja Faktor XV sahaja – memerlukan faktor X mahupun faktor V Bakteria yang memerlukan faktor X dan V atau salah satu di antaranya adalah spesies Haemophilus. 81 . iaitu agar nutrien yang mana spesies-spesies yang diuji tidak mungkin tumbuh padanya tanpa penambahan faktor tumbesaran tertentu. Pengubahsuaian ini membolehkan pertumbuhan bakteria dikesan dengan lebih mudah kerana dalam metabolisme karbon pada sitrat (pertumbuhan positif). Penggunaan Sitrat Koser mencipta sejenis media broth asas yang mengandungi natrium ammonium fosfat sebagai sumber tunggal nitrogen. Perubahan warna. B. mempermudahkan lagi pembacaan hasil ujian. Kadangkala bacaan hasil ujian tidak semata-mata berdasarkan kepada perubahan warna.6. Elakkan daripada menggunakan agar darah. Perhatikan bahawa media yang digunakan berupa media minimum. bromthymol blue. Kehadiran pertumbuhan bererti kemampuan bakteria mengurai sitrat sebagai sumber karbon. manakala yang tidak memerlukan faktor X atau V adalah B. manakala golongan koliform tidak. H. dan natrium sitrat sebagai sumber tunggal karbon. H.8 dan biru pada pH lebih 7. Seterusnya. influenzae parainfluenzae aegyptius ducreyi hemolyticus parahemolyticus pertussis – – – – – – + X – – – + + – + V – + – – + + + XV + + + + + + + N OTA 1. pertussis. H. 2.1 Keperluan bakteria untuk faktor X dan V Pertumbuhan Berlaku Dengan Faktor: Spesies – H. H. dan hasil ujian dinyatakan sebagai positif untuk sitrat. JADUAL 5. Simmons mengubahsuai media Koser tersebut dengan menambahkan agar dan indikator. Simpan disk pada suhu 4°C dan bukan pada 0°C. apatah lagi agar coklat dalam melakukan ujian ini. Bakteria golongan aerogen boleh menggunakan sitrat sebagai sumber karbon. suatu tindak balas alkali berlaku dan ini ditunjukkan dengan perubahan pada warna media daripada hijau kepada biru tua. yang kelihatan hijau pada pH 6. dalam hal ini.

Ujian Penggunaan Sitrat
BAHAN

1. Kultur bakteria 2. Dawai lurus 3. Cerun agar sitrat Simmons di dalam botol Bijou (Agar sitrat Simmons: Dari sumber komersial)
TATACARA

1. 2. 3. 4. 5.

Sterilkan keseluruhan dawai lurus dan biarkan sehingga sejuk. Sentuhkan pada koloni bakteria dengan penghujung dawai. Buatkan 1 garisan tipis bakteria pada permukaan agar. Eramkan pada 37°C selama semalaman atau 48 jam, jika perlu. Amatilah perubahan warna pada media.

PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN

Ujian positif: Pertumbuhan dengan/tanpa media menjadi biru. Ujian negatif: Tiada pertumbuhan atau media tetap hijau. Pentafsiran ujian positif: Kemampuan menggunakan sitrat sebagai sumber tunggal karbon.
N OTA

1.

2. 3.

Gunakan sedikit sahaja inokulum supaya semasa penginokulasian inokulum ini tidak kelihatan sama sekali pada garis inokulasi dan untuk mengelakkan reaksi positif palsu akibat bakteria yang mati membebaskan karbon dan nitrogen dalam kuantiti yang boleh menampung pertumbuhan. Elakkan daripada mengambil sebarang bahan nutrien daripada media kultur di mana inokulum diambil. Kultur yang menunjukkan pertumbuhan tanpa perubahan pH (perubahan warna) juga dianggap positif kerana pada sesetengah bakteria yang lambat tumbuh keadaan tindak balas alkali tidak dapat dicapai dalam tempoh pengeraman yang ditetapkan. Pengeraman selama 48 jam mungkin diperlukan untuk bakteria yang lambat tumbuh supaya warna biru dapat muncul.

Ujian Urease Urea adalah substrat spesifik yang dihidrolisis oleh enzim urease kepada ammonia dan karbon dioksida. Ammonia menyebabkan campuran tindak balas menjadi alkali. Tanda kehadiran urease dapat dikesan melalui indikator pH yang menunjukkan perubahan warna media daripada oren (pH 6.8) kepada merah jambu (pH 8.1) Ujian untuk mengesan penghasilan enzim urease oleh bakteria biasanya digunakan dalam pengenalpastian bakteria genus Proteus. Walau bagaimanapun, bakteria-bakteria lain yang juga penting dalam perubatan mempunyai kemampuan untuk menghasilkan urease. Terdapat beberapa jenis ujian urease dengan sensitiviti yang berbeza-beza. Tahap sensitiviti ini ditentukan terutamanya oleh kandungan larutan penampan. Pemilihan dari segi jenis ujian ini adalah bergantung kepada kegunaannya. Oleh kerana pH media boleh ditingkatkan melalui sesuatu tindak balas lain, maka hasil positif palsu untuk urease memang terdapat. Untuk mengesan keadaan seperti ini ujian kawalan terhadap media yang tidak mengandungi urea diperlukan.

82

Tatacara Ujian Urease
BAHAN

1. 2. 3. 4. 5.

Kultur bakteria Air pepton Broth urea di dalam botol Bijou Gelung dawai Pipet Pasteur steril

TATACARA

1. 2. 3. 4.

Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. Masukkan 2 titis suspensi ini ke dalam broth urea. Eramkan selama 24 jam. Amati warna broth urea.

PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN

Positif: Merah. Negatif: Kuning. Pentafsiran hasil positif: Kehadiran enzim urease yang menghidrolisis urea kepada ammonia. Ujian Oksidase Ujian oksidase menentukan kehadiran sitokrom C, sejenis enzim respiratori. Oleh yang demikian, ujian ini hanya positif untuk bakteria yang memiliki sitokrom C. Sitokrom adalah protein yang mengandungi heme dan merupakan enzim oksidatif dalam kitaran respiratori yang terlibat dalam fosforilasi oksidatif. Dalam ujian oksidase tatacara Kovacs, reagen oksidase adalah tetrametil-pfenilena-diamina dihidroklorida 1%. Enzim oksidase sitokrom tidak bertindak secara langsung dengan reagen oksidase, tetapi menyebabkan oksidasi sitokrom C yang kemudian menyebabkan oksidasi tetrametil-p-fenilena-diamina dihidroklorida sehingga membentuk sejenis bahan kimia berwarna biru yang disebut biru Wunster. Sitokrom C yang direduksi (ditambah elektron) dalam tindakan ini diubah secara tidak langsung kepada bentuk yang teroksidasi oleh oksidase sitokrom yang menerima elektronnya. Enzim oksidase sitokrom kemudian menggantikan elektron tersebut kepada oksigen untuk menghasilkan air dengan ion hidrogen. Ujian ini digunakan untuk membezakan streptokokus (oksidase-negatif) daripada neisseria (oksidase-positif). Tatacara Ujian Oksidase
BAHAN

1. 2. 3. 4. 5.

Kultur bakteria Slaid mikroskop Kepingan kecil kertas turas Whatman No. 1 Reagen oksidase (tetrametil-p-fenilena-diamina dihidroklorida 1%) Kayu aplikator

TATACARA

1. 2.

Letakkan sekeping kertas turas kecil di atas slaid mikroskop bersih. Titiskan 2 hingga 3 titis reagen oksidase ke atas kertas turas.

83

3. 4.

Ambil koloni bakteria dengan kayu aplikator dan goreskan ke atas kertas turas pada bahagian yang menyerap reagen oksidase. Amati kemunculan warna dalam beberapa saat.

PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN

Kemunculan warna lavender (ungu pudar) yang cepat (dalam beberapa saat) menjadi biru/ungu. Ujian negatif: Tiada perubahan warna atau warna muncul hanya setelah beberapa minit. Pentafsiran hasil positif: Perubahan segera ke warna biru/ungu menunjukkan bakteria memilikim sitokrom C.
N OTA

Ujian positif:

1.

2. 3.

4. 5.

Reagen ini mesti disediakan segar kerana sifatnya yang tidak stabil. Auto-oksidasi oleh oksigen bebas dari udara boleh berlaku dan oleh yang demikian reagen ini dengan sendirinya akan berubah menjadi biru atau ungu jika dibiarkan di udara agak lama. Reagen yang baru disediakan perlu dibiarkan selama 15 minit untuk menjadi “masak” sebelum digunakan. Pastikan dan patuhi tempoh masa yang ditetapkan untuk mentafsirkan hasil ujian ini kerana pada ujian yang disimpan lama sebelum dibaca hasil positif palsu boleh berlaku kerana warna biru atau ungu boleh muncul akibat auto-oksidasi yang berlaku ke atas reagen. Gunakan kayu aplikator atau dawai platinum untuk mengambil koloni. Dawai nikrom juga boleh mempengaruhi hasil ujian dan memberikan hasil positif palsu. Tatacara alternatif ujian oksidase ini adalah dengan membanjiri kultur pada piring Petri dengan reagen dan kemudian segera menyingkirkan bahan yang berlebihan ini dengan pipet. Hasilnya ditunjukkan dengan perubahan warna koloni bakteria kepada warna ungu (oksidase-positif) atau tiada perubahan warna (oksidase-negatif).

Ujian Koagulase Ujian untuk menentukan penghasilan enzim koagulase oleh stafilokokus adalah suatu ujian penting dalam mikrobiologi diagnostik. Ia membezakan stafilokokus patogenik kerana berkemampuan untuk menghasilkan enzim ini, daripada yang tidak menghasilkannya atau tidak patogenik. Terdapat dua jenis koagulase; yang satu terikat pada dinding sel bakteria (koagulase terikat) dan tidak bebas, dan yang satu jenis lagi dirembeskan oleh sel ke dalam media atau cairan (koagulase bebas). Ujian slaid di mana penggumpalan atau pengelompokan bakteria dihasilkan dipercayai disebabkan oleh koagulase terikat yang terdapat pada dinding sel. Enzim bentuk ini bertindak secara langsung ke atas fibrinogen haiwan-haiwan tertentu dan menghasilkan fibrin yang memerangkap bakteria sehingga berlakunya penggumpalan/pengelompokan tersebut. Sebaliknya, koagulase yang dihasilkan secara bebas bertindak dengan protrombin untuk menghasilkan trombin, yang seterusnya bertindak ke atas fibrinogen untuk menghasilkan fibrin (pembekuan). Tatacara Ujian Koagulase Slaid
BAHAN

1. 2. 3. 4. 5.

Kultur bakteria Larutan salin 0.85% Slaid mikroskop Gelung dawai Plasma arnab

84

Hasil positif yang berlaku lewat atau negatif diuji semula dengan ujian koagulase tabung kerana terdapat strain S. Campurkan 1 isipadu suspensi bakteria dengan 5 isipadu larutan plasma. Sediakan suspensi stafilokokus di dalam larutan salin (atau gunakan kultur broth). 2. 85 . Ujian negatif: Tiada penggumpalan dan suspensi bakteria kelihatan homogen. adalah amat penting untuk mempastikan bahawa bakteria yang diuji adalah benar-benar kultur murni stafilokokus. positif lemah dan kawalan negatif. aureus yang menghasilkan hanya koagulase bebas yang tidak bertindak dalam ujian koagulase slaid. Perlu juga diperhatikan bahawa kadangkala plasma manusia yang digunakan mengandungi bahan perencat yang akan memberikan hasil negatif palsu. Oleh yang demikian. Plasma perlulah diuji terlebih dahulu dengan strain kawalan positif dan negatif sebelum digunakan. 2.TATACARA 1. 2. 2. ujian haruslah dilakukan juga ke atas beberapa jenis bakteria kawalan yang memberikan hasil positif kuat.85% Tabung uji steril Gelung dawai Plasma arnab Penganggas air pada 37°C TATACARA 1. Gunakan plasma arnab atau manusia dan bukan spesies mamalia lain kerana kebanyakan plasma daripada spesies lain tidak bertindak dengan koagulase stafilokokus. Ujian positif palsu boleh berlaku jika penggumpalan yang berlaku lewat diambil kira. 5. supaya hasil ujian boleh dipercayai dan diterima tanpa ragu-ragu. Seterusnya. dan ujian ini digunakan semata-mata untuk membezakan antara strain yang menghasilkan koagulase daripada yang tidak. N OTA 1. 5. Tambahkan setitis plasma arnab kepada suspensi dan campurkan dengan gelung dawai. 4. 5. 6. Pastikan koloni bakteria boleh diemulsifikasi di dalam salin supaya tidak menimbulkan masalah dalam pembacaan hasilnya nanti. 6. 4. 3. 3. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pembentukan gumpalan bakteria. Pentafsiran hasil positif: Bakteria memiliki enzim koagulase. Mana-mana bakteria yang boleh menggunakan sitrat sebagai sumber tenaga boleh membebaskan kalsium yang akan mengakibatkan pembekuan plasma jika plasma tersebut diambil daripada darah yang bercampur sitrat. Ambil beberapa koloni bakteria dengan gelung dawai steril. Tatacara Ujian Koagulase Tabung BAHAN 1. Buatkan suspensi bakteria ini di dalam titisan salin. Kultur bakteria Larutan salin 0. 3. 3. Goncangkan slaid dan amatilah penggumpalan (clumping) bakteria yang akan kelihatan sebagai kelompak-kelompak putih dalam masa 15 saat. Sediakan 1:9 pencairan plasma arnab atau manusia di dalam larutan salin. Letakkan setitis larutan salin steril di atas sebuah slaid mikroskop yang bersih dan kering. 4.

3. Pembekuan jika hadir. Ujian katalase digunakan khususnya untuk membezakan antara stafilokokus (katalase positif) dengan streptokokus (katalase negatif) dan juga kadangkala digunakan dalam pengenalpastian pelbagai jenis bakteria. Amatilah kehadiran gelembung-gelembung gas yang dihasilkan dengan cepat. 3 dan 6 jam dan selepas semalaman. rancak dan berterusan. 5. tabung haruslah diamati beberapa kali di sepanjang tempoh pengeraman. Ujian negatif: Campuran tetap cair. Untuk mengelakkan daripada memperolehi hasil yang negatif palsu. 4. 86 . Campurkan dengan memutarkan tabung uji di antara kedua dua tapak tangan. Untuk memudahkan pembekuan diamati. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Penghasilan dan pembebasan gas dengan cepat dicirikan dengan gelembunggelembung gas yang dibebaskan dengan rancak. (oksigen) adalah tanda bagi ujian yang positif. 3. Pastikan tabung tidak digoncang semasa mengamati dan membaca hasil ujian (penghasilan pembekuan) kerana ini akan mengakibatkan pembekuan menjadi terlerai dan tidak dapat dikesan. Jangan campur dengan goncangan.4. 2. 4. akan kekal di dasar tabung uji. Kultur bakteria Slaid mikroskop Kayu aplikator Hidrogen peroksida 3% TATACARA 1. aureus yang kadar penghasilan koagulasenya adalah rendah maka masa yang panjang diperlukan untuk koagulase mencapai aras yang memberi hasil yang positif (hasil positif yang lewat) Ujian Katalase Katalase adalah enzim dengan bahagian (moieti) yang mengandungi besi. Sesetengah strain stafilokokus menghasilkan enzim fibrinolisin yang akan melisis semula pembekuan plasma yang dihasilkan. jika masih negatif. Tindak balas kimia yang berlaku dalam ujian katalase adalah : 2H 2O 2 Æ 2H 2O + O2 • Penghasilan gelembung gas . 3. Pentafsiran hasil positif: Bakteria memiliki enzim koagulase N OTA 1. 2. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pembentukan pembekuan. Letakkan setitis larutan hidrogen peroksida di atas sebuah slaid kaca bersih dan kering. Sentuhkan penghujung kayu aplikator kepada koloni bakteria. Tatacara Ujian Katalase BAHAN 1. Spesimen yang memberi hasil negatif pada masa pengeraman 6 jam dieramkan semula semalaman kerana terdapat strain S. Eramkan pada suhu 37°C di dalam penganggas air dan amati selepas 1. tabung uji dicondongkan. 2. Masukkan organisma ke dalam titisan reagen di atas slaid.

4. Ujikan juga se-bahagian daripada plat agar yang belum diinokulasi dengan bakteria dengan menuangkan sedikit reagen di atasnya sebelum meneruskan dengan ujian katalase plat ini untuk mengelak-kan hasil positif palsu. Gunakan H 2 O 2 pada kepekatan 3% untuk mendapatkan hasil ujian yang terbaik atau optimum. 4. Gas H 2S yang dibebaskan akan dikesan melalui perubahan warna kertas putih kepada warna hitam akibat pembentukan plumbum sulfida. 2. Penghasilan Hidrogen Sulfida Bakteria boleh menghasilkan H 2S daripada terbitan sulfur organik yang didapati di dalam pepton yang digunakan atau daripada terbitan sulfur tak organik yang dicampurkan dengan media kultur. Seboleh-bolehnya elakkan daripada mengambil koloni yang tumbuh pada permukaan media agar darah. dedahkan kultur kepada udara selama setengah jam sebelum ujian dilakukan untuk membolehkan oksidasi aerobik ke atas katalase yang tereduksi berlaku. Pada kultur anaerobik. Pentafsiran hasil positif: Bakteria memiliki enzim katalase. 5. Penghasilan H2S oleh sesejenis bakteria menandakan keupayaan bakteria tersebut untuk mereduksi sulfur kepada sulfida. 6. 3. berhati-hatilah dalam pengambilan tersebut untuk mempastikan hasil yang tepat dan betul. Tatacara Ujian Penghasilan Hidrogen Sulfida BAHAN 1. 5. Serapkan sekeping kertas turas dengan plumbum asetat 5% dan biarkan sehingga kering. Perlu ditekankan di sini bahawa darah juga mengandungi enzim katalase yang dapat bertindak balas dengan reagen. 2. Tetapi. Gariskan bakteria ke atas cerun agar di dalam tabung uji. sekiranya hal ini tidak dapat dielakkan. Ini adalah kerana sesetengah media mungkin mengandungi sedikit katalase yang boleh memberikan tindak balas yang lemah dan lambat serta boleh menyulitkan pembacaan hasil. Kertas ini hanya diletakkan pada sisi mulut tabung di atas kultur bakteria pada agar condong. Kultur bakteria Cerun agar nutrien di dalam tabung Dawai lurus Kertas turas Plumbum asetat 5% TATACARA 1. 2. 3. Penghasilan segelintir gelembung kecil selepas 20-30 saat tidak dianggap positif. 87 . Sesetengah bakteria yang menghasilkan H2S tidak dapat tumbuh pada media yang mengandungi terbitan ferum (besi). Jangan gunakan kultur yang berusia lebih daripada 24 jam untuk mengelak daripada memperolehi hasil negatif palsu kerana enzim ini hanya dapat dikesan pada kultur hidup yang masih segar dan mungkin tiada lagi pada kultur tua. NOTA 1.Ujian negatif: Tiada sebarang tindak balas. Larutan H2O2 disimpan di dalam botol gelap di dalam peti beku. Ujian katalase plat: Ujian ini boleh dilakukan ke atas koloni di atas plat kultur dengan me-nuangkan reagen ke atas koloni berkenaan KECUALI jika media kultur tersebut adalah agar darah kerana ia boleh memberikan hasil positif palsu. Ini untuk mengelakkan daripada terambil bersama sel darah dan mendapatkan hasil yang positif palsu seperti di atas. H2S yang dihasilkan oleh bakteria golongan ini dikesan dengan kertas yang diserapkan dengan larutan plumbum asetat 5%. tanpa menyentuh permukaan agar tersebut kerana plumbum asetat boleh menghalang pertumbuhan sesetengah bakteria. Oleh yang demikian. Jangan gunakan dawai gelung kerana positif palsu boleh berlaku.

88 . Ujian Nagler pada mulanya dilakukan dengan menumbuhkan bakteria pada media agar kuning telur. Campurkan emulsi “kuning telur pekat” (Difco: SR47) untuk mencapai kepekatan 5% dan tuangkan agar campuran ini ke dalam sebuah piring Petri. 4. B dan D juga bertindak ke atas lesitin tetapi terhadap terbitan-terbitan lain yang dihasilkan. lemak bebas daripada kuning telur selepas lesitin dihancurkan dan protein tak larut air (vitellin. Eramkan secara anaerobik. Swab (steril) 9. Enzim lesitinase C menghidrolisis lesitin (lecithin-phosphatidyl choline) kepada fosforilkolin dan sejenis digliserid. 4. Gantung kertas ini pada sisi mulut tabung uji dan pastikan kertas ini tidak menyentuh permukaan agar. Cairkan 20 ml agar nutrien yang steril (Difco: Blood Agar Base CM55). 7. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian hasil positif: Kertas menjadi hitam. Buatkan 1 garisan bakteria melintasi kedua-dua bahagian setengah plat agar ini (bahagian yang disapu antitoksin dan yang tidak). Pentafsiran hasil positif: Bakteria boleh menghasilkan H2S daripada sulfur. vitellenin) daripada kuning telur yang mempresipitasikan lemak bebas. 3. Campurkan 1 ml ekstrak Fildes. Enzim ini juga bertindak ke atas fosfolipid lainnya. dan lesitinase A. Turunkan suhu kepada 50°C dengan membiarkan media di dalam penganggas air selama 15 minit. Ekstrak Fildes 5. welchii) (antibodi anti-lesitinase) 8. Penganggas air pada 50°C 4. Piring Petri 7. Kultur bakteria 2. Antitoksin Clostridium perfringens (Cl. hasilnya menunjukkan kehadiran suatu zon opalesens (antibodi anti-lesitinase) di sekeliling koloni yang menandakan penghasilan lesitinase oleh bakteria. 2. 5. 8. Sebarkan antitoksin ini sama rata ke atas permukaan setengah plat agar dan biarkan ia meresap dan kering. Emulsi kuning telur pekat 6. Mekanisme penghasilan opalesens dipercayai disebabkan oleh tiga faktor iaitu lemak digliserid yang dihasilkan. Fenomena ini kali pertama dilaporkan oleh Nagler yang pada waktu itu menggunakan serum sebagai sumber lesitin. Biarkan kering. Agar nutrien 3. 6. Tatacara Ujian Nagler BAHAN 1. Ujian Nagler Penentuan penghasilan enzim lesitinase oleh bakteria adalah berfaedah dalam pengenalpastian bakteria genus Clostridium khususnya Clostridium perfringens (Clost. welchii) sungguhpun terdapat laporan yang menyatakan bahawa bakteria lain seperti Pseudomonas aeruginosa juga boleh menghasilkan enzim ini. Titiskan 2 titis antitoksin (antilesitinase) Cl. perfringens pada setengah bahagian daripada media plat. Ujian hasil negatif: Tiada perubahan warna pada kertas. Selepas pengeraman. Gelung dawai (Reagen agar Nagler dan kuning telur : Dari sumber komersial) TATACARA 1.3. Eramkan pada 37°C semalaman.

9. Cairkan 10 ml agar dasar Elek. Eramkan dan amati selepas 24 jam dan 48 jam. Tatacara Ujian Elek BAHAN 1. Piring Petri yang steril 9. Kultur bakteria yang diuji 2. Walau bagaimanapun. 2. Penghasilan garis presipitasi adalah hasil suatu tindak balas serologi yang melibatkan antigen (toksin) dan antibodi (antitoksin). Kultur bakteria kawalan positif (disahkan menghasilkan toksin difteria) 3. 89 . 10. Letakkan sekeping kertas turas ke dalam 1 piring Petri kosong yang steril. Kultur bakteria kawalan negatif (disahkan tidak menghasilkan toksin difteria) 4. 3. 8. Pentafsiran ujian positif: Bakteria menghasilkan toksin difteria. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Garis presipitasi kelihatan muncul daripada sudut pertumbuhan bakteria yang diuji dan bakteria kawalan positif. 4. Campurkan 2 ml serum lembu.PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Lesitinase dihasilkan jika zon opalesens hanya kelihatan di sekeliling koloni di bahagian setengah plat agar tanpa antitoksin. Agar dasar Elek 5. kawalan negatif dan yang diuji) secara tegak lurus (90°) melintasi jalur kertas antitoksin. manakala pada bahagian setengah plat agar yang disapu dengan antitoksin tidak terbentuk zon opalesens. 7. Ujian negatif: Tidak terbentuk zon opalesens di sekeliling koloni pada keseluruhannya (pada kedua-dua kawasan disapu antitoksin dan tidak). Serum lembu 7. Ujian negatif: Tiada garis presipitasi. Turunkan suhu kepada 50°C dengan membiarkan di dalam penganggas air selama 15 minit. 6. 5. Penganggas air 50°C 6. Biarkan agar menjadi kering. Titiskan 1 ml antitoksin difteria (1000 unit) ke atas jalur kertas supaya diserap dan biarkan kering. Letakkan kertas yang mengandungi antitoksin di tengah piring agar sejurus selepas agar mem-beku. secara tradisi ujian ini dimasukkan ke bahagian ujian biokimia. Tuangkan agar campur serum ke dalam piring Petri. Inokulasi permukaan agar dengan bakteria (kawalan positif. Ujian Elek Strain Corynebacteria diphtheriae yang menghasilkan toksin dapat dikesan secara in vitro melalui penghasilan presipitasi apabila toksin ini bertindak dengan antitoksin. Pentafsiran hasil positif: Bakteria menghasilkan serta merembeskan enzim lesitinase yang dikenal pasti kerana aktivitinya menghasilkan zon opalesens dihalang oleh antibodi anti-lesitinase (antitoksin). Inkubator (Reagen agar dasar jenis Elek: Dari sumber komersial) TATACARA 1. Antitoksin difteria 10. Kertas turas 8.

2. Sentuh koloni bakteria dengan penghujung dawai. N OTA 1. Tusukkan hujung dawai ke dalam agar separuh pejal sehingga ke dasar tabung. ujian negatif – bakteria tak motil. 4. Elakkan daripada menggerakkan dawai ke kiri atau ke kanan semasa dikeluarkan (dan juga semasa dawai ditusuk) kerana ini akan menyebabkan pertumbuhan yang kelihatan tersebar dan memberi tafsiran positif palsu mengenai mobiliti. Sterilkan keseluruhan dawai lurus. Garam tetrazolium adalah tanpa warna dan akan diubah kepada formazan. 2. Oleh kerana keseluruhan dawai lurus akan ditusuk ke dalam agar maka pastikan keseluruhan dawai ini dibakar untuk mensterilkannya. Tatacara Ujian Motiliti (Pergerakan) pada Agar Separuh Pejal BAHAN 1. 4. Gunakan inokulum yang tebal.4% atau <) merupakan suatu media separuh pejal yang membolehkan bakteria bergerak dan menyebar ke pelbagai arah di dalamnya. Bakteria yang tak motil akan tetap pada garis inokulasi dan sama sekali tidak akan tersebar. Jika bakteria mempunyai kemampuan untuk bergerak atau bersifat motil ia akan menunjukkan penyebaran yang bermula dari garis inokulasi.N OTA 1. 4. Kultur bakteria Agar nutrien (0. Pentafsiran ujian: Ujian positif – bakteria motif. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pertumbuhan bakteria (merah) tersebar daripada garis tusukan dawai lurus. Ujian negatif: Pertumbuhan bakteria terhad kepada garis tusukan. 3.4% atau <) yang mengandungi indikator (garam tetrazolium) di dalam tabung uji Dawai lurus Inkubator TATACARA 1. 5. 2. Pastikan strain kawalan negatif dan strain kawalan positif diikut sertakan. 3. 4. Jika plat dieramkan lebih 48 jam. Garam tetrazolium digunakan dalam ujian motiliti ini kerana ia memudahkan pengesanan pertumbuhan serta penyebaran bakteria secara visual di dalam media. Ujian Motiliti dengan Menggunakan Agar Separuh Pejal Media pertumbuhan dengan kepekatan agar yang rendah (0. Eramkan semalaman. Pertumbuhan beberapa jenis bakteria tertentu mungkin dihalang oleh garam tetrazolium. 3. Amati pola pertumbuhan bakteria. 90 . Beberapa bakteria seperti Pseudomonas adalah aerobik dan akan hanya menunjukkan motiliti pada bahagian atas media ini. 3. Dawai yang ditusuk ke dalam media dikeluarkan seboleh-bolehnya bertepatan dengan garis kemasukannya. Plat harus disediakan pada hari ujian dilakukan. 2. kompleks tak larut berwarna merah hasil pereduksian oleh bakteria yang tumbuh. kemungkinan garis presipitin juga dihasilkan oleh strain kawalan negatif (dan juga Corynebacterium akibat antigen yang umum kepada semua korinebakteria).

UJIAN RESAPAN DISK Dalam ujian resapan disk. atau bersama bakteria kawalan. iaitu tatacara Stoke dan tatacara perbandingan. Agen kemoterapi yang dihasilkan berikutan aktiviti metabolik bakteria atau fungus disebut antibiotik. Biasanya larutan antibiotik ini tidak terus diletakkan ke atas agar. namun demikian kebanyakannya tidak mempunyai nilai perubatan kerana sesetengahnya mungkin terlalu toksik terhadap pengguna atau sukar diperolehi. Cara lain ialah organisma dicampurkan dengan media agar yang masih cecair dan kemudian dituangkan ke dalam piring. tetapi terlebih dahulu diserapkan ke dalam disk-disk kertas (satu disk satu jenis antibiotik dengan satu unit pencairan). pada keseluruhan permukaan media plat agar. Pada masa ini kebanyakan antibiotik dan terbitannya yang digunakan dalam rawatan dihasilkan secara sintetik atau buatan. organisma yang diuji digariskan (atau diinokulasi dan kemudian disebarkan) memenuhi permukaan media agar di dalam piring Petri. Buangkan swab ke dalam bekas khas yang mengandungi disinfektan. Seseorang doktor haruslah mengetahui mengenai tahap kerentanan (susceptibility) sesuatu mikroorganisma terhadap antibiotik tertentu supaya memudahkannya membuat keputusan yang sesuai dalam rawatan serta pengurusan seseorang pesakit. prosedur pertama (awal) adalah penginokulasian hanya bakteria yang diuji. 3. 3. 2. 2. Putarkan swab pada dinding sebelah dalam tabung untuk menyingkirkan suspensi yang berlebihan. Kemudian disk diletakkan di atas inokulum yang telah disebarkan pada permukaan agar atau pada permukaan media agar yang telah dicampur organisma sebelum pengeraman. Antibiotik tersebut akan merembes keluar daripada disk dan meresap ke dalam media. bahkan kadangkala boleh tumbuh di bawah disk. Jika kultur bakteria sensitif terhadap sesuatu antibiotik.6. Sapukan swab sambil memutarkannya pada permukaan media agar untuk penginokulasian mengikut corak seperti diterangkan di bawah: Sapukan swab mula-mula ke satu arah sehingga memenuhi keseluruhan permukaan media dan kemudian sapukan pula menurut arah kira-kira 90 darjah daripada arah sapuan semula. 91 . Tatacara Membuat Inokulasi Bakteria pada Keseluruhan Permukaan Media Plat Agar BAHAN 1. 4. Sebaliknya. Pendekatan ini disebut sebagai ujian resapan disk dan terdapat dua tatacara yang umum. UJIAN SENSITIVITI ANTIBIOTIK IN VITRO Rawatan penyakit dengan sesuatu bahan atau sebatian kimia dinamakan kemoterapi. Suspensi bakteria yang diuji di dalam air pepton Swab (steril) Plat agar darah Mueller-Hinton TATACARA 1. suatu zon rencatan pertumbuhan akan terbentuk di sekeliling disk yang mengandungi antibiotik tersebut. Dalam ujian resapan disk. pertumbuhan akan berlaku sehinggalah mencapai ke pinggir disk. Senarai antibiotik yang dipencilkan dan dikenal pasti sememangnya cukup panjang. Maklumat ini boleh diperolehi di makmal umumnya melalui dua teknik atau pendekatan iaitu ujian resapan disk dan asai pencairan tiub. Celupkan swab steril ke dalam suspensi bakteria yang berada di dalam tabung uji. 6. jika ia resistan.1.

Suatu garis perbatasan antara kedua-dua jenis bakteria kawalan dan ujian akan diperolehi di mana disk-disk antibiotik akan diletakkan nanti. N OTA Pastikan swab tidak terlalu basah atau meninggalkan kesan yang tidak diingini pada permukaan agar. Pindahkan 3 koloni bakteria (garis pusat 1-2 mm) ke dalam 1 tabung air pepton. 2. Putarkan swab pada dinding sebelah dalam tabung uji berkenaan untuk menyingkirkan suspensi yang berlebihan. 4. 2. Inokulasi strain bakteria ini pada keseluruhan permukaan media agar dengan swab steril (rujuk kepada tatacara di ms. Kultur bakteria (masing-masing untuk ujian dan kawalan) Gelung dawai Penunu Bunsen Tabung air pepton Swab (steril) Jarum atau forseps (steril) Disk antibiotik Inkubator Pembaris TATACARA Hari pertama 1. 3. 9. 93). 3. 2. 92 . Celupkan swab yang steril ke dalam suspensi bakteria kawalan. 4. Ujian Resapan Disk: Tatacara Perbandingan BAHAN 1. Kaedah ini dilaksanakan sejajar dengan pergerakan alat pemutar plat. 8. Buka penutup plat Petri dan inokulasi media dengan mula-mula menyentuh bahagian tengah plat dengan swab yang mengandungi bakteria kawalan sehinggalah penginokulasian ini memenuhi suatu kawasan bulatan kira-kira 5 cm garis pusat. 5.Tatacara Membuat Inokulasi 2 Jenis Bakteria di Bahagian yang Berasingan pada Permukaan Media Plat Agar BAHAN 1. 6. Letakkan plat agar di atas pentas pemutar plat Petri. 5. 6. Goncangkan untuk mendapatkan suspensi yang homogenus. Suspensi bakteria yang diuji di dalam air pepton Suspensi bakteria kawalan Swab (steril) Plat agar darah Mueller-Hinton Alat pemutar plat Petri TATACARA 1. Lakukan kaedah 2 dan 3 untuk bakteria yang akan diuji. 7. Sentuhkan dengan swab yang mengandungi bakteria yang diuji bahagian tepi plat dan liputi kawasan permukaan agar ini dengan inokulum ini sehingga hampir menyentuh pinggir kawasan inokulum pertama. 3. 2. Sterilkan gelung dawai. 3. 4. 4. 5.

atau resistan. 9. Letak dan tekan disk antibiotik tepat di atas garis perbatasan antara kedua-dua kultur supaya sebelah disk berada di kawasan kultur kawalan dan sebelah lagi di kawasan kultur yang diuji. ujian ke atas strain kawalan tidak perlu dijalankan. 2. Ini bagi menyatakan sama ada bakteria tersebut sensitif. Balikkan plat dan ukurlah garis pusat zon tanpa pertumbuhan bakteria (zon rencatan). 8.5 cm antara 1 dengan lain mahupun antara disk dengan dinding plat. separuh sensitif. 10. Eramkan plat pada 37°C semalaman.5. Pastikan terdapat jarak yang sekurang-kurangnya 1. Jika suatu carta rujukan piawai diperolehi atau sudah tersedia. Pastikan terdapat jarak sekurang-kurangnya 1. Kultur bakteria (masing-masing untuk ujian dan kawalan) Gelung dawai Penunu Bunsen Tabung air pepton Swab (steril) Alat pemutar plat Petri Jarum atau forseps (steril) Disk antibiotik Inkubator Pembaris TATACARA Hari pertama 1. Seseorang hanya perlu merujuk kepada carta tersebut untuk menentukan pola sensitiviti strain bakteria yang diuji menurut senarai yang ditetapkan di dalam carta berkenaan. Inokulasi bakteria yang diuji dan bakteria kawalan di atas plat yang sama di bahagian yang berasingan (rujuk kepada bahagian tatacara di m. 2. Hari kedua 8. 6. Pastikan pertumbuhan bakteria yang diuji dan bakteria kawalan adalah secara kuantitatif hampir sama.5 cm antara satu disk dengan yang lain dan juga disk dengan dinding plat. 6. 9. Biarkan supaya permukaan media menjadi kering dan kemudian letakkan disk-disk antibiotik di atas media dengan menggunakan jarum atau forseps steril dan tekan disk ke atas permukaan agar. Ujian Resapan Disk: Tatacara Stoke BAHAN 1. 7.s. 7. 10. 2. Ulangi kaedah 1 hingga 5 untuk strain kawalan pada plat lain yang mengandungi media yang sama. 5. 4. Tatacara perbandingan berdasarkan carta atau suatu piawai yang tersedia dikenali sebagai Tatacara Kirby-Bauer. Eramkan plat pada 37°C semalaman. 93 . 3. Bandingkan hasil sensitiviti kedua-dua strain terhadap antibiotik dan tentukan sama ada strain yang diuji sensitif. separuh sensitif (intermediate) atau resistan. 3. N OTA 1. 94).

Dalam keadaan ini. 8.Hari kedua 4. 2. Dalam keadaan ini. 7. Buat perbandingan antara zon tanpa pertumbuhan yang dihasilkan terhadap strain ujian dengan zon yang dihasilkan terhadap strain kawalan untuk menentukan keresistanan bakteria kepada sesuatu antibiotik. besar kemungkinan zon rencatan pertumbuhan yang lebih besar akan dihasilkan kerana resapan antibiotik terlebih dahulu berlaku sebelum pertumbuhan bakteria bermula. Agar Mueller-Hinton merupakan media yang paling sesuai untuk ujian sensitiviti resapan disk. 5. tetapi memperlihatkan juga pertumbuhan bakteria yang berbonjol di sekitar pinggir zon harus dilaporkan sebagai resistan. Jangan gunakan disk antibiotik yang telah tamat tempoh penggunaannya atau melebihi tarikh pelupusannya. 3. kepekatan antibiotik yang meresap ke dalam media agar juga akan sentiasa sama. Disk antibiotik harus diletakkan sejurus selepas inokulasi dilakukan. Ini dilakukan dengan mengamati tiub berkepekatan antibiotik terendah atau paling minimum dalam siri pencairan yang menghalang pertumbuhan bakteria (tiub yang jernih tepat disebelah tiub yang mula menunjukkan kekeruhan). ukuran garis pusat atau jejari yang terkecil yang diambil kira. N OTA 1. Stafilokokus yang menghasilkan zon rencatan yang jelas. Kelewatan meletakkan disk menyebabkan bakteria tumbuh sebelum antibiotik dapat meresap ke dalam media dan bertindak ke atas bakteria. 6. UJIAN PENCAIRAN TABUNG Pendekatan yang lebih kuantitatif untuk menguji sensitiviti bakteria terhadap sesuatu antibiotik adalah tatacara pencairan tabung. Bagi bakteria yang sukar tumbuh pada media ini bolehlah dicampurkan darah 5% sebagai nutrien tambahan. Kemudian setiap tiub diinokulasi dengan organisma berkenaan dan kepekatan perencatan minimum (minimum inhibitory concentration: MIC ) ditentukan. 6. Ia memakan masa lebih lama. oleh itu tidak disyorkan sebagai tatacara rutin. Pastikan pertumbuhan bakteria yang diuji dan kawalan hampir sama secara kuantitatif untuk memberikan perbandingan yang tepat di antara kedua-duanya. 5. bermula daripada titik pusat disk).2. Ini menghasilkan pembacaan yang kurang tepat. antibiotik disediakan dalam pencairan dua kali ganda di dalam suatu siri tabung media pertumbuhan. Jika ini tidak dipatuhi. Kepekatan terendah untuk antibiotik yang menunjukkan hasil “tiada pertumbuhan bakteria” pada subkultur dianggap sebagai kepekatan antibiotik terendah yang berupaya membunuh bakteria tersebut – kepekatan bakterisidal minimum (minimum bactericidal concentration: MBC). Dalam prosedur ini. Kultur plat harus dieramkan sejurus selepas disk diletakkan. 94 . Balikkan plat dan ukurlah jejari zon tanpa pertumbuhan bakteria (zon rencatan. 4. Zon rencatan yang berbentuk bujur boleh disebabkan oleh disk yang tergeser di atas permukaan media atau disk diletakkan terlalu rapat dengan pinggir piring. Gunakan isipadu agar yang sama setiap kali supaya ketebalan agar dalam piring Petri sentiasa sama. Fenomena ini mungkin ditemui di kalangan stafilokokus penghasil enzim betalaktamase yang diuji dengan disk antibiotik yang mengandungi penisilin dan terbitannya. Sama ada antibiotik berkenaan bersifat bakterisiadal (membunuh bakteria) atau bakteriostatik (merencat pertumbuhan bakteria) dapat dipastikan dengan melakukan pensubkulturan daripada tiub yang tidak menunjukkan pertumbuhan tersebut ke atas media agar tanpa antibiotik.

4. 5. 5. Kultur tabung harus dieramkan sejurus selepas bakteria dicampurkan. 3. Kultur broth bakteria yang diuji Kultur broth bakteria kawalan Tabung-tabung uji (steril) Pipet bersukat Antibiotik Inkubator bersuhu 37°C TATACARA 1. isipadu larutan 0. 2. 3. negatif . 4. 4. 2. Pastikan permukaan agar betul-betul kering. Sediakan 2 siri tabung yang mengandungi siri pencairan 2 kali ganda antibiotik yang diuji di dalam broth dengan kepekatan tertinggi antibiotik 200 µg atau 200 unit setiap ml (tabung bersaiz 13 mm x 100 mm. Siri tabung ujian Plat-plat agar Pipet Pasteur MIC TATACARA 1. titiskan (secara terpisah) 3 titis kandungan setiap tabung yang didapati jernih sahaja dalam siri tabung ujian MIC ke atas separuh plat. 6. Tuliskan nombor siri tabung (atau kepekatan antibiotik) pada setiap separuh plat. Eramkan pada 37°C semalaman. 2. N OTA 1. Gunakan pena penanda untuk membahagikan permukaan dasar setiap plat media kepada 2 bahagian sama besar untuk mendapatkan 2 ‘separuh plat’ bagi setiap plat media.Tatacara Ujian MIC (Kepekatan Perencatan Minimum) BAHAN 1. 3. termasuk satu tabung yang mengandungi broth tanpa antibiotik (tabung kawalan positif). 3. 95 . Goncang dan amatilah setiap tabung daripada kedua-dua siri tabung ini untuk menentukan pertumbuhan bakteria (positif . Biarkan titisan larutan mengering sebelum mengeramkan plat pada 37°C semalaman. Dengan menggunakan pipet yang sama. Tatacara Ujian MBC (Kepekatan Bakterisidal Minimum) BAHAN 1. Masukkan 0. Pastikan terdapat juga 1 tabung yang mengandungi antibiotik dengan broth yang tidak mengandungi bakteria (tabung kawalan negatif). 2. Untuk memastikan sama ada berlaku pertumbuhan atau tidak. 3. Lakukan pencairan kultur broth semalaman bakteria yang diuji dan bakteria kawalan sebanyak 1:1000 di dalam broth baru untuk memperoleh ~ 10 5 bakteria hidup setiap ml. 5. cara yang mudahnya adalah dengan merujuk kepada tabung kawalan positif yang mengandungi bakteria tanpa antibiotik (keruh).keruh. 4.5 ml).5 ml ke dalam setiap tabung. Pastikan tabung yang steril digunakan dan pencairan dibuat secara teknik aseptik. dan tabung kawalan negatif yang mengandungi antibiotik sahaja (jernih). Mulakan penitisan dari separuh tabung dengan kepekatan antibiotik yang tertinggi hinggalah kepada tabung dengan kepekatan yang paling rendah. 2.jernih). Bakteria kawalan adalah bakteria yang sensitif terhadap antibiotik yang digunakan dalam ujian ini dan mesti beri hasil yang positif sebelum hasil bakteria yang diuji boleh diterima.

6. 7. Amati pertumbuhan koloni di atas plat bagi setiap pencairan. Tentu dan pastikan pencairan yang terendah di mana tidak terdapat pertumbuhan bakteria lagi. 96 . Ini merupakan kepekatan bakterisidal minimum.

rasanya tidaklah sesuai untuk dibahaskan tentang tatacara masing-masing. 2. tatacara dwilapisan antibodi. tatacara dwilapisan antibodi yang diubahsuai. Percantuman antibodi dengan enzim membolehkan antibodi yang melekat kepada antigen dikesan apabila tindakan enzim menukar warna substratnya. Asai ini merupakan imunoasai heterogenus kerana ia mempunyai suatu peringkat di mana komponen yang dilabelkan (gabungkan) enzim yang telah bertindak dengan ligannya dipisahkan daripada komponen yang sama yang tidak bertindak. ELISA terdiri daripada beberapa jenis asai: tatacara persaingan. Jika percantuman adalah dengan fluorokrom. Walau bagaimanapun. maka kit daripada pengeluar yang berbeza mempunyai tatacara tersendiri. mikrob berkemampuan menghasilkan antibodi yang bertindak secara spesifik dengannya. iaitu ELISA. aglutinasi lateks dan imunopendafluor. Di bidang mikrobiologi. Ikuti arahan dengan tepat mengenai tatacara yang dinyatakan oleh pengeluar ujian. aspek umum kedua-dua ujian berkenaan akan dibentangkan. Dalam bahagian ini hanya tiga ujian mikrobiologi. Pemisahan ini dilakukan melalui pencucian. Rancangkan kekerapan ujian yang akan dijalankan untuk mengoptimumkan penggunaan sesuatu kit kerana reagen dan fasa pepejal (telaga. terdapat banyak ujian serologi dan banyak variasi sesuatu ujian. kebanyakan mikrob seperti bakteria memiliki morfologi kasar yang sama. UJIAN SEROLOGI DALAM MIKROBIOLOGI Suatu aspek yang penting dalam bidang mikrobiologi adalah pengesanan jenis mikrob yang merupakan agen etiologi sesuatu penyakit. tatacara perencatan. 97 . ELISA dan aglutinasi lateks biasanya dilakukan dengan reagen komersial. Oleh yang demikian. Sungguhpun mikroskop boleh digunakan. maka adalah sukar untuk menentukan identiti kebanyakan mikrob berdasarkan pengamatan secara langsung. Oleh yang demikian. Oleh kerana mikrob merupakan antigen yang baik. ELISA boleh merupakan asai kuantitatif atau kualitatif. tindakan sesuatu mikrob dengan antibodi yang spesifik terhadapnya adalah suatu pendekatan yang digunakan dalam pengenalan identiti sesuatu mikrob. 7.7. Jangan gunakan reagen selepas tarikh pelupusan bagi mengelakkan kemungkinan hasil negatif palsu. N OTA 1. diterangkan kerana ketiga-tiga ujian berkenaan mempunyai aplikasi dalam bidang bakteriologi. pengesanan identiti sesejenis mikrob adalah sukar kerana ia mempunyai saiz yang amat kecil dan tidak dapat dilihat dengan mata kasar. pancaran cahaya berwarna tertentu – seperti warna hijau-kuning oleh fluorokrom FITC adalah tanda kehadiran kompleks antigenantibodi. fasa pepejal anti-IgM dan tatacara secara tidak langsung (asai untuk pengesanan antibodi). sungguhpun kebanyakan ELISA untuk kegunaan dalam mikrobiologi adalah termasuk dalam golongan kedua ini. manik) yang disaluti antigen atau antibodi juga digunakan kerana sampel kawalan positif dan negatif turut diasaikan dengan sampel ujian setiap kali ujian dijalankan. Dalam hal ini. 3. Ada juga ujian yang merupakan ujian rekaan makmal sendiri (in-house) di samping ujian komersial. Tindakan antigen mikrob dengan antibodi dapat dikenal pasti dengan beberapa cara seperti mewujudkan presipitasi atau aglutinasi.1 ELISA Asai imunosorben bergabung enzim (enzyme-linked immunosorbent assay) atau lebih terkenal dengan singkatan ELISA adalah sejenis imunoasai yang antigen atau antibodi larut dilekatkan kepada suatu permukaan pepejal seperti permukaan manik atau telaga tanpa menghilangkan reaktiviti komponen imunologiknya. mikologi dan virologi.

2. N OTA 1. Pastikan sisa daripada asai seperti cucian dimasukkan di dalam bekas disinfektan yang sesuai untuk mengelakkan berlakunya infeksi ke atas pengguna makmal. ada kemungkinan hasil negatif palsu didapati jika sampel diuji lebih daripada masa yang ditetapkan. Goncang botol-botol reagen supaya memperolehi suspensi reagen lateks yang sama rata sebelum reagen lateks digunakan. Titisan dengan isipadu yang sama boleh dicapai dengan menggunakan mikropipet. Pastikan sisa asai seperti cucian dimasukkan di dalam bekas disinfektan yang sesuai untuk mengelakkan berlakunya infeksi ke atas pengguna makmal. Ikut arahan dengan tepat mengenai tatacara yang dinyatakan oleh pengeluar ujian. Di pasaran. beberapa peraturan harus dipatuhi supaya hasil yang didapati boleh diyakini. Sungguhpun ujian aglutinasi lateks slaid mudah dilakukan. Reagen komersial biasanya mempunyai sensitiviti yang amat tinggi dan ini boleh menimbulkan hasil positif palsu jika pencucian antara peringkat pengeraman dengan reagen tidak dilakukan dengan sempurna. Pergabungan antigen dengan antibodi akan menyebabkan kelompok-kelompok besar partikel lateks yang dapat diamati dengan mata kasar. Jangan tunggu terlalu lama selepas hasil asai dibaca. Titisan besar reagen daripada botol reagen mungkin menggalakkan para pengguna berusaha untuk mengurangkan isipadu reagen bagi mengurangkan kos. sungguhpun tindak balas enzim ke atas substratnya telah dihentikan dengan bahan kimia yang sesuai. atau pun hasil negatif palsu. penyimpanan lama. 6. Amalan ini seharusnya jangan dilakukan kerana mengurangkan isipadu reagen boleh menimbulkan hasil negatif palsu. jika ia dilakukan dengan menggunakan alat pembaca ELISA. Ujian Aglutinasi Lateks Slaid Antibodi atau antigen boleh digabungkan dengan partikel polistirin (digelarkan ‘lateks’ kerana warna putihnya menyerupai lateks tumbuhan) bagi mengesan antigen atau antibodi masing-masing. Para pengguna harus mempastikan sesuatu ujian itu bermutu tinggi dan sesuai untuk tujuan mereka. khususnya. Jangan gunakan reagen selepas tarikh pelupusan supaya mengelakkan kemungkinan hasil positif palsu. 8. Ujian ini adalah cepat serta mudah dilakukan dan tidak memerlukan alat radas yang mahal atau canggih. akan menukar warna hasil ujian daripada apa yang didapati sejurus selepas asai tamat. ujian ini tidak membazirkan reagen jika dilakukan ke atas sebilangan sampel yang kecil. 7. 5. Biarkan reagen mencapai suhu bilik sebelum ujian dilakukan kerana penggunaan kit sejurus selepas dikeluarkan dari peti beku mungkin memberikan hasil yang kurang memuaskan. 98 . Baca hasil ujian pada masa yang ditetapkan selepas ujian dimulakan. Dalam sesetengah sistem enzim-indikator.4. Tambahan pula. Jangan lakukan ujian dengan menggunakan reagen daripada beberapa kit yang mempunyai nombor pengeluaran yang berbeza. terdapat berbagai-bagai jenama ujian aglutinasi lateks untuk pengesanan berbagai-bagai antigen/antibodi. 5. umpamanya semalaman sungguhpun pada suhu peti beku. 9. 3. Jangan lakukan ujian dengan menggunakan reagen daripada beberapa kit yang mempunyai nombor pengeluaran yang berbeza. Titisan reagen lateks yang dititiskan daripada botol reagen adalah berbeza-beza. sama ada daripada segi masa cucian mahupun bilangan cucian yang dilakukan. 6. 4. 7. Oleh kerana ujian direka dengan sensitiviti yang tinggi. Tidak semuanya boleh dianggap memuaskan dari segi spesifisiti dan sensitiviti.

gabungan secara spesifik antibodi dengan sesuatu antigen dikenal pasti melalui gabungan antibodi berkenaan dengan antibodi terhadapnya yang tercantum fluorkrom (ujian tak langsung). Autopendafluor berwarna hijau-kuning jarang berlaku. 2. 5. Slaid mikroskop atau slaid khas untuk ujian imunopendafluor Piring Petri Kertas turas Kayu aplikator Varnis kuku Antiserum Konjugat antibodi terhadap antiserum dan FITC (‘konjugat’) Larutan salin yang ditampankan fosfat (PBS) Metanol Air suling Larutan PBS 90% dan gliserol 10% Inkubator bersuhu 37°C Mikroskop imunopendafluor TATACARA Penyediaan spesimen sel yang diuji ke atas slaid mikroskop 1. Titiskan suspensi sampel (sel diinfeksi mikrob dan ditanggalkan dari permukaan bekas kultur. komponen mikrob) dapat dikenal pasti secara tidak langsung melalui pengamatan mikroskop apabila antigen berkenaan digabung secara spesifik dengan antibodi yang secara langsung tercantum fluorokrom (ujian langsung). 3. Fluoresein digunakan dalam bentuk fluorescein isothiocyanate ( FITC) kerana kehadiran kumpulan sianat yang mempunyai afiniti untuk protein membolehkan antibodi dicantum dengannya. Dalam pendekatan lain. Sungguhpun terdapat berbagai jenis fluorokrom seperti rodamin dan Texas Red. 2. 4. 4. Biarkan kering. 9. atau sel dari spesimen klinikal) ke atas sekeping slaid mikroskop atau di dalam telaga cetak slaid mikroskop khas untuk ujian imunopendafluor. 2. 12. fluoresein adalah fluorokrom yang paling umum digunakan kerana ia mempunyai beberapa kelebihan: 1. Nisbah amaun tenaga yang dikeluarkan kepada tenaga yang diserap adalah amat tinggi (~85%) maka ia memberi sensitiviti yang baik. Tatacara Ujian Imunopendafluor Tidak Langsung BAHAN 1. 6. maka ia meningkatkan spesifisiti. 3. Dalam lain perkataan. 11. 8. Pancaran cahayanya pada gelombang 520 mµ adalah di kawasan sensitiviti pengamatan yang paling baik maka ia memberi sensitiviti yang baik. Sebarkan sehingga meliputi kawasan bulat seluas 1 cm garis pusat slaid mikroskop atau memenuhi seluruh telaga. Fluorokrom adalah sebatian semula jadi atau sintetik yang boleh menyerap cahaya gelombang tertentu dan sejurus selepas itu mengeluarkan tenaga sebagai cahaya dengan gelombang yang lebih panjang. 7. 10. cahaya suatu warna diserap dan cahaya warna lain dikeluarkan oleh fluorokrom.Ujian Imunopendafluor Tidak Langsung Kehadiran sejenis antigen (misalnya. Jenis warna (gelombang cahaya) yang dikeluarkan adalah khas untuk sejenis fluorokrom. 3. Fiksasi spesimen (spesimen yang dititiskan kepada slaid mikroskop atau sel yang ditumbuhkan di atas slaid penutup dan diinfeksi dengan virus) 99 . 13.

16. dan lebih-lebih lagi antiserum. 24. Bilas spesimen ke atas slaid (atau penutup slaid) dengan PBS . Letakkan spesimen yang berada pada penutup slaid di atas slaid yang diletakkan di atas kayu aplikator. Biarkan lampu raksa mikroskop bernyala kira-kira 15 minit bagi menstabilkan pancaran cahayanya sebelum spesimen diamati. reagen berkenaan boleh disimpan pada suhu – 20°C tanpa dibeku jika ia dicampurkan dengan isipadu sama gliserol. Penyimpanan spesimen di dalam tempat yang gelap akan melambatkan proses ini. Letakkan slaid di atas kayu aplikator supaya slaid berada lebih tinggi daripada aras kertas turas. 5.4. N OTA Alas satu piring Petri dengan sekeping kertas turas dan basahkan dengan air. 2. spesimen masih boleh dibaca selepas disimpan semalaman. Untuk mengelakkan kehilangan aktiviti biologinya akibat reagen selalu dicairkan dan dibeku. Keluarkan dan biarkan kering. 18. Bilas spesimen yang ada di atas slaid (atau penutup slaid) dengan PBS. 3. 21. 22. Spesimen harus dibaca (diamati dengan mikroskop pendafluor) secepat mungkin kerana intensiti cahaya pendafluor akan berkurang. Tutup piring Petri dan eramkan di dalam inkubator bersuhu 37°C selama 30-60 minit. 13. 23. Tindak balas dengan reagen antibodi 7. Cuci 3 kali dengan PBS. 4. Titiskan persediaan konjugat ke atas spesimen dan sebarkan supaya meliputi ke seluruh spesimen. 6. biasanya digunakan dalam pencairan yang amat tinggi. Pencucian yang dilakukan selepas pengeraman boleh dipendekkan serta lebih berkesan jika PBS dalam bekas yang mengandungi slaid spesimen dikacau dengan alat magnet yang berputar. 15. Oleh yang demikian. Pastikan mikroskop imunopendafluor dinyalakan sekurang-kurangnya 20 minit sebelum ia dipadamkan supaya jangka hayat lampu raksa dapat dikekalkan lama. Amati dengan mikroskop pendafluor. 14. Biarkan kering di dalam tempat gelap seperti laci yang tertutup. Reagen konjugat. 5. 6. Jika reagen bermutu tinggi dan ujian dilakukan dengan sempurna. Sinaran pendafluor latar belakang boleh ditindaskan dengan spesimen dieramkan dengan metilin biru selepas tindakan dengan konjugat antibodi-fluorokrom. 8. Kelilingi spesimen dengan 1 bulatan varnis kuku. 1. 19. penutup slaid berkenaan ditekan. 10. 20. 11. 17. amaun yang kecil digunakan setiap kali. Fiksasi spesimen yang terlalu lama mungkin menimbulkan pendafluor yang tak spesifik. Spesimen di atas penutup slaid dilekapkan di atas setitis kecil larutan PBS gliserol. Bilas dengan air suling. Rendam dalam PBS selama 3 minit di dalam piring Petri (cuci). 9. 12. Reagen konjugat antibodi-fluorokrom biasanya diperolehi daripada sumber komersial. Celup di dalam metanol pada suhu 4°C selama 2 minit. Masukkan di dalam bekas lembap. 100 . Patahkan sebatang kayu aplikator di bahagian tengahnya dan letakkan dalam bentuk ‘V’ di atas kertas turas di dalam piring Petri (Ini merupakan bekas lembap). Tutup piring Petri dan eramkan dalam alat inkubator bersuhu 37°C selama 30-60 minit. Oleh yang demikian. 7. 8. pastikan ia berfungsi dengan baik sebelum amaun yang lebih besar dibeli. Titiskan persediaan antiserum (sumber antibodi terhadap virus) ke atas spesimen dan sebarkan supaya meliputi seluruh spesimen. Cuci semula 2 kali.

11 Pensterilan menggunakan alkohol yang membakar. 23 Mikroskop elektron-pengamatan spesimen virus. 91 Inokulasi plat agar dengan 2 jenis bakteria untuk ujian sensitiviti antibiotik. 69 Telur-mengumpulkan cecair alantoik. 25 Pewarnaan Ziehl-Neelsen. 47-49 Inokulasi plat agar dengan 1 jenis bakteria untuk ujian sensitiviti antibiotik. 79 Ujian Sensitiviti: Optochin. 86-87 Ujian keperluan faktor pertumbuhan X dan V. 39-40 Mikroskop elektron-tatacara imun. 95 Ujian Motiliti bakteria di dalam agar separuh pepejal. 64-65 Kultur sel-penghitungan dengan menggunakan hemosiometer. 32 Pelekapan basah salin untuk fungus. 60-61 Kultur sel-tripsinisasi seluruh tisu. 20-21 Asepsis-pemindahan benda dari botol yang tertutup. 36 Pewarnaan Schaeffer-Fulton. 83-84 Ujian Metil-merah. 70 Telur-membuat inokulasi ruang amniotik. 69 Telur-membuat inokulasi ruang alantoik. 33 Pewarnaan metenamina-argentum Gomori. 12-13 Pewarnaan Albert (pewarnaan granul metakromatik). 33 Pewarnaan kapsul (rujuk kepada pewarnaan negatif dengan dakwat India). 76-77 Ujian Imunopendafluor. 53 Bantuan pemula-rawatan. 71-72 Ujian aglutinasi lateks slaid. 25 Pelekapan basah bakteria. 73-74 Ujian Indol. 71 Telur-mengambil membran korioalantoik. 80-81 Ujian Koagulase. 90 Ujian Resapan disk: Tatacara perbandingan. 67 Kultur sel-kriopengawetan kultur sel yang hidup. 99-100 Ujian Katalase. 10 Fiksasi bakteria dengan haba-membuat. 97-98 Ujian Elek. 23 Pewarnaan Gram untuk fungus. 17-19 Plat garisan-teknik. 70-71 Telur-mengumpulkan cecair amniotik. 16 Mikroskop cahaya-pembersihan kanta. 52 Balang lilin-mewujudkan atmosfera karbon dioksida.INDEKS Apusan bakteria-membuat. 68 Telur-membuat inokulasi membran korioalantoik. 92 Inkubator CO2 . 78 101 . 20 Telur-melakukan penyuluhan. 53-54 Kultur sel-inokulasi dengan virus. 61-62 Kultur sel-tripsinisasi sel selapisan dan pengermaan kultur sel. 31 Pelekapan basah lactophenol coton blue untuk fungus. 22 GasPak-mewujudkan keadaan anaerobik. 27 Pewarnaan tahan asid (rujuk kepada pewarnaan ZiehlNeelsen). 46 Media agar-menyediakan sebagai cerun.penggunaan. 38-39 Mikroskop elektron-pengamatan spesimen bakteria. 16 Mikroskop cahaya-penggunaan. 52 Inokulasi plat agar dengan kultur yis. 14-15 Pensterilan gelung dawai dengan api. 64 Kultur sel-pengkulturan semula sel yang dikrioawetkan. 47 Media bakteria-jenis. 93-94 Ujian Sensitiviti: Bacitracin. 82-83 Ujian Voges-Proskauer. 9 Slaid mikroskop-membersihkan dan simpanan. 95 Ujian MBC (Kepekatan Bakterisidal Minimum). 10 Disinfektan-penggunaan. 40 Mikroskop cahaya-mengelakkan pertumbuhan fungus. 92-93 Ujian Resapan disk: Tatacara Stokes. 26-27 Pewarnaan spora (rujuk kepada pewarnaan Schaeffer Fulton). 89 Ujian Fermentasi gula dan penghasilan gas. 17 Pelekapan basah KOH untuk fungus. 26 Pewarnaan asid periodik-Schiff. 34 Pewarnaan Gram untuk bakteria. 30 Pelekapan titisan tergantung untuk bakteria. 62-63 Kultur slaid fungus-membuat. 34-35 Pewarnaan negatif dengan dakwat India. 74-76 Ujian Urease. 56-57 Media agar-menyediakan di dalam plat Petri. 55-56 Kultur yis-merangsang penghasilan tiub germa. 98 Ujian ELISA. 77-78 Ujian MIC (Kepekatan Perencatan Minimum) tabung. 47-49 Prosedur umum makmal mikrobiologi. 44-45 Mikroskop elektron-menyaluti grid dengan Formvar. 13 Balang anaerobik-penggunaan. 27 Pewarnaan Kinyoun (terubahsuai) untuk fungus. 66 Kultur sel-persediaan media. 41 Mikroskop elektron-pewarnaan negatif. 79 Ujian Tiga gula besi. 84-86 Ujian Oksidase.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful