2

Yap Kok Leong Abdul Hamid Abdul Aziz Mohd Salleh Mohd Yasin

PENERBIT UNIVERSITI KEBANGSAAN MALAYSIA BANGI • 1999

3

Cetakan Pertama / First Printing, 1999 Hak cipta / Copyright Universiti Kebangsaan Malaysia, 1999 Hak cipta terpelihara. Tiada bahagian daripada terbitan ini boleh diterbitkan semula, disimpan untuk pengeluaran atau ditukarkan ke dalam sebarang bentuk atau dengan sebarang alat juga pun, sama ada dengan cara elektronik, gambar serta rakaman dan sebagainya tanpa kebenaran bertulis daripada Penerbit UKM terlebih dahulu. All rights reserved. No part of this publication may be reproduced or transmitted in any form or by any means, electronic or mechanical including photocopy, recording, or any information storage and retrieval system, without permission in writing from the Penerbit UKM. Reka bentuk kulit dan ilustrasi olh Hassan Majid Diterbitkan di Malaysia oleh / Published in Malaysia by
PENERBIT UNIVERSITI KEBANGSAAN MALAYSIA 43600 UKM Bangi, Selangor D.E. Malaysia

Penerbit UKM adalah anggota / is a member of the PERSATUAN PENERBIT BUKU MALAYSIA /
MALAYSIAN BOOK PUBLISHERS ASSOCIATION

No. Ahli / Membership No. 8302 Dicetak di Malaysia oleh / Printed in Malaysia by
AMPANG PRESS SDN. BHD.

6 & 8, Jalan 6/91, Taman Shamelin Perkasa, Jalan Cheras, 56100 Kuala Lumpur, MALAYSIA Perpustakaan Negara Malaysia Data Pengkatalogan-dalam-Penerbitan

Yap, Kok Leong Mikrobiologi makmal / Yap Kok Leong, Abdul Hamid Abdul Aziz, Mohd Salleh Mohd Yasin. Mengandungi indeks 1. Microbiological laboratories. I. Abdul Hamid Abdul Aziz. II. Mohd Salleh Mohd Yasin. III. Judul. 579.078 ISBN 967-942-439-1

4

KANDUNGAN

Prakata . . . 7 1. Amalan dan Peraturan dalam Makmal Mikrobiologi . . . 9 1.1. Prosedur Umum di dalam Makmal Mikrobiologi . . . 9 1.2. Bantuan Pemula Kecemasan di dalam Makmal . . . 9 1.3. Disinfektan untuk Kegunaan Makmal . . . 10 1.4. Tatacara Aseptik . . . 11 2. Mikroskop Cahaya dalam Mikrobiologi . . . 14 2.1. Tatacara Mikroskop Cahaya . . . 14 3. Pengamatan Mikrob . . . 17 3.1. Pengamatan Bakteria . . . 17 3.2. Pengamatan Fungus . . . 30 3.3. Pengamatan Virus dengan Mikroskop Elektron . . . 38 3.4. Reagan Pewarnaan: Rumusan dan Persediaan . . . 42 4. Pengkulturan Mikrob . . . 44 4.1. Pengkulturan Bakteria . . . 44 4.2. Pengkulturan Fungus . . . 54 4.3. Pengkulturan Virus . . . 59 5. Pengenalpastian Agen Mikrob . . . 73 5.1. Ujian Makmal dalam Pengenalpastian Bakteria . . . 73 6. Ujian Sensitiviti Antibiotik In Vitro . . . 91 6.1. Ujian Resapan Disk . . . 91 6.2. Ujian Pencairan Tabung . . . 94 7. Ujian Serologi dalam Mikrobiologi . . . 97 7.1. Ujian ELISA . . . 97 Indeks . . . 101

5

PRAKATA Mikrobiologi merupakan suatu sains praktik. Teknik asas ini biasanya diajarkan kepada pelajar mikrobiologi dalam sesi amali yang terancang. Oleh itu. Buku ini mengandungi 81 teknik dan maklumat teknikal. Oleh yang demikian. Menyedari hakikat di atas. Sungguhpun kaedah yang digunakan dalam mikrobiologi banyak dan berbagai-bagai. kami menulis buku ini yang bukan sahaja memaparkan kaedah serta pelaksanaan yang sempurna. Ini dilakukan supaya pelajar dapat memahami teori serta penggunaan teknik-teknik di atas dengan lebih mendalam kerana buku ini menyertakan beberapa petunjuk dan petua bagi mencapai hasil yang baik dan diharapkan. Penggunaan setiap teknik ini sengaja diolah berdasarkan konsep yang dimaksudkan di atas. terdapat beberapa kaedah seperti pewarnaan bakteria yang boleh dianggap sebagai teknik asas dalam amalan sains ini. Kami menaruh harapan agar buku ini berguna dalam mempertingkatkan lagi kemahiran pelajar mahupun pengamal mikrobiologi. di samping menambahkan sebuah lagi judul teks ke dalam senarai buku-buku teknikal dalam Bahasa Melayu yang tercinta. sebuah buku yang menyentuh tentang teknik-teknik dasar makmal dan tradisional mikrobiologi amat diperlukan. Daripada pengalaman kami dalam mengendalikan sesi amali mikrobiologi terdapat beberapa kesilapan serta amalan yang tidak sewajarnya diulangi oleh setiap kumpulan pelajar baru. selain mempelajari dan mengumpul fakta serta konsep adalah penting bagi pelajar dan pengamal mikrobiologi mahir dan cekap dalam mengendalikan kaedah-kaedah makmal mikrobiologi. tetapi juga merangkumi pengenalan ringkas dan tepat mengenai teknik-teknik tersebut. Sering juga terdapat soalan serta kemusykilan yang sama yang diajukan oleh mereka. Yap Kok Leong Abdul Hamid Abdul Aziz Mohd Salleh Mohd Yasin Jabatan Sains Bioperubatan Fakulti Sains Kesihatan Bersekutu UKM 6 .

.

6. 10. Gunakan penyedut getah atau alat penyedut khas untuk tujuan ini. Simpan buku dan catatan berjauhan daripada tempat bekerja anda di dalam makmal untuk menghindari daripada tercemar. Jangan menyedut sebarang cairan ke dalam pipet dengan mulut. 5. PROSEDUR UMUM DI DALAM MAKMAL MIKROBIOLOGI Mikroorganisma boleh menyebabkan penyakit pada manusia. 3. 13. Jangan menyentuh kawasan muka atau mulut anda semasa bekerja. Panggillah instruktor dengan segera jika berlaku sebarang KEMALANGAN terutama yang berkaitan dengan kultur mikroorganisma. pekerja makmal haruslah mempunyai sedikit sebanyak pengetahuan mengenai bantuan pemula dan tindakan yang perlu diambil serta sedar akan keperluan ini. Buangkan semua bahan dan kultur yang tercemar ke dalam bekas khusus yang disediakan. 7. 1. Tumpuan khusus perlu diberikan kepada aspek-aspek keselamatan dan ketelitian di dalam makmal mikrobiologi demi kepentingan diri sendiri mahupun pekerja-pekerja lain. jari atau sebarang objek ke dalam mulut atau membasahkan pelekat dengan menggunakan lidah. bakteria dan virus. 14. Jangan membawa keluar dari makmal sebarang kultur atau bahan-bahan dalam kelas amali. Pakai kot makmal dan kasut pada setiap waktu anda bekerja di dalam makmal. 4. 2.2. 3. Jangan makan. BANTUAN PEMULA KECEMASAN DI DALAM MAKMAL Oleh kerana kemalangan boleh berlaku di dalam makmal. Mikrobiologi adalah mengenai mikroorganisma atau jasad renik yang mempunyai saiz kecil seperti fungus (kulat). AMALAN DAN PERATURAN DALAM MAKMAL MIKROBIOLOGI 1. 8. 12. 4. Jangan membawa bahan-bahan makmal yang rosak. 5. 11. Tutup gas dan paip air dengan rapat dan bersihkan meja setelah anda selesai bekerja dan bersiap sedia untuk meninggalkan makmal. Basuh tangan dengan sabun dan air atau dengan disinfektan kulit sebelum anda memulakan sebarang pekerjaan di makmal. Basuh tangan anda semula dengan sabun dan air atau dengan disinfektan kulit sebelum meninggalkan makmal. 9. khususnya dalam kes-kes kecederaan ringan. Bekalan Bantuan Pemula Kecemasan 1. pecah atau tercemar kepada instruktor. Untuk mencapai matlamat ini sentiasalah mengingati dan mematuhi peraturan-peraturan umum makmal berikut: 1.1. Periksa penunu Bunsen dari semasa ke semasa untuk memastikan tidak berlaku kebocoran gas. Oleh itu adalah penting bagi kita menyedari dan mengawasi prosedur dan perilaku dengan betul serta penuh tanggungjawab semasa bekerja dengannya. Gantikan tiubnya jika perlu. Jangan memasukkan pensil. misalnya bikar yang berisi disinfektan atau bekas yang disediakan khas. minum atau merokok di dalam makmal pada setiap waktu. 2.1. Kot makmal janganlah dipakai di luar makmal. Antiseptik ringan untuk luka dan luka terbakar Kain kasa (gauz) atau pembalut steril Larutan asid asetik 2% Natrium bikarbonat Jeli petroleum/vaselin 9 . Jangan nyalakan mancis semasa bekerja dengan/atau berdekatan dengan reagen meruap seperti alkohol dan eter.

Jika luka kelihatan parah. Boleh digunakan dalam bidang virologi. tidak digunakan untuk darah dan virus. 4. pastikan mata dicuci dengan air yang banyak dengan air paip. 4. Aktiviti antimikrobnya tidak banyak dikurangkan oleh bahan organik dan tidak bertindak terhadap logam. sapukan lapisan tipis jeli petroleum di kawasan berkenaan. 2. tahap pemusnahan di peringkat ini tidaklah perlu mencapai tahap pensterilan. objek di dalam makmal seperti tempat kerja. Disinfektan adalah bahan kimia yang dimaksudkan di atas yang digunakan untuk memusnahkan mikrob patogenik pada sesuatu objek tak bernyawa (inanimate). DISINFEKTAN UNTUK KEGUNAAN MAKMAL Pekerja di makmal mikrobiologi sentiasa berhadapan dengan bahan-bahan berbahaya terutamanya yang mengandungi mikrob patogenik. Untuk luka bakar kulit yang ringan (kulit kemerahan tetapi tidak sampai mengelupas). sesuai untuk menginaktivasi virus. 5. Sesuai untuk kerja mikrobiologi umum. Untuk luka ringan dan cakaran. Hipoklorit sesuai digunakan dengan detergen anionik dan bukan ionik tetapi tidak sesuai 3. balang buangan sisa makmal. Untuk mengelakkan penyebaran patogen. iaitu pemusnahan semua bentuk hidupan. Contoh: Clearsol. Segera simbah dengan sabun dan air dan sapukan dengan natrium bikarbonat. Aktiviti antimikrobnya dikurangkan oleh bahan organik. Luka bakar api.3. objek seperti spesimen klinikal dan pipet dikumpulkan di dalam bekas yang sesuai sebelum disterilkan dan dibuang. cuci luka dan teliti sama ada terdapat bendasing (kaca) di dalam luka. Sebatian kimia halogen dan fenol adalah di antara agen yang penting sebagai disinfektan. jumpalah doktor. Balut dengan kain pembalut berperekat atau dengan balutan longgar. Bilas dengan alkohol 70% atau dengan antiseptik. Sudol. 2. Gunakan hipoklorit untuk bahan yang mengandungi hanya sedikit bahan organik atau sedikit darah. Bahan antimikrob ini menyerang logam. 10 . Luka. jangan berikan sebarang rawatan tetapi bawalah mangsa ke hospital. jangan menggunakan antiseptik. Jika formalin atau mana-mana cairan tersimbah ke dalam mata. 3. 2. tetapi tidak digunakan untuk bahan tuberkulosis atau yang diperbuat daripada logam.Tatacara Rawatan Bantuan Pemula 1. Disinfektan Jenis Hipoklorit 1. Jika keradangan pada mata tersebut masih berterusan. spesimen dan bahan terpakai terlebih dahulu disimpan buat sementara di dalam bahan kimia tertentu sehingga pekerjaan di makmal tersebut selesai. hematologi dan patologi kimia di dalam balang buangan sisa makmal. 3. Disinfektan Jenis Fenolik Jernih 1. 1. Bilas bersungguh-sungguh dengan asid asetik 2%. Digunakan pada pencairan seperti yang ditetapkan oleh pengeluar disinfektan. Digunakan untuk kebanyakan bahan organik. balang pipet terpakai dan untuk mendisinfeksi permukaan. Bagi luka bakar yang lebih serius. Namun demikian. Luka bakar alkali. Umumnya. bahan tuberkulosis dan bahan bakteriologi umum. Luka bakar asid. Segera berjumpa doktor. pipet dan slaid mikroskop juga sering tercemar. Di samping ini. Elak daripada menggunakan air kerana boleh menyebarkan alkali berkenaan. 4.

2. Gelung dawai ini merupakan alat utama di makmal bakteriologi yang digunakan untuk memindahkan bakteria daripada suatu kultur ke tempat-tempat lain. 4. Dengan perkataan lain. Keluarkan dawai. Gelung dawai haruslah sentiasa disterilkan melalui pembakaran merah membara seperti di atas sebelum dan sesudah digunakan. Pensterilan Gelung Dawai dengan Api Gelung dawai adalah sejenis dawai yang umumnya terdiri daripada nichrome atau platinum dengan garis pusat berukuran 0. P E R H AT I A N 1. 6. 2.5 mm yang dibentuk melingkar seperti gelung pada salah satu penghujungnya.1.4. gelung dawai ini disterilkan setiap kali selepas digunakan. 3. Penghujung lainnya dicantumkan kepada sebatang pemegang dawai. 7. Biarkan ia supaya dingin semula (sama ada dengan memegang atau meletakkannya di atas rak khas) sebelum digunakan. pakaian mahupun tempat anda bekerja di makmal) dan juga ke atas pekerja-pekerja lain. Lakukan pembakaran sehingga peringkat keseluruhan dawai menjadi merah membara. Tatacara Pensterilan Gelung Dawai dengan Api BAHAN 1. Penggunaan umum: 1000 ppm klorin bebas. Masukkan gelung dawai ke dalam api penunu Bunsen seperti yang ditunjukkan pada Rajah 1. Nyalakan penunu Bunsen dan buka sepenuhnya liang kemasukan udaranya. TATACARA ASEPTIK Teknik aseptik bukan sahaja bertujuan untuk menjamin kesterilan bahan yang anda sedang kendalikan (iaitu tanpa berlakunya sebarang pencemaran ke atas bahan berkenaan) tetapi juga merangkumi tindakan menghindari daripada berlakunya pencemaran mikroorganisma yang sedang dikaji ke atas diri anda sendiri (tangan. Pastikan gelung dawai yang steril ini tidak tersentuh sebarang objek sebelum digunakan. Letakkan ia di atas rak khas atau pegang sahaja sementara menunggu dingin. 1. gelung dawai ini disterilkan. Elakkan daripada meletakkannya langsung di atas meja. gelung dawai ini terlebih dahulu dibakar supaya semua mikrooganisma yang terdapat pada permukaannya musnah dan terhapus serta tidak akan tercampur atau mencemari kultur bakteria murni yang akan diambil dengannya nanti. 3. Gelung dawai Rak gelung dawai Penunu Bunsen TATA C A R A 1. Balang pipet: 2500 ppm klorin bebas. 11 . Contoh: Chloros. 2. Sebelum digunakan. dengan detergen kationik.5. Presept. Adalah penting juga dalam mengamalkan teknik aseptik.

Singkirkan alkohol yang berlebihan. Dalam tempoh alkohol pada permukaan objek tersebut terbakar. Sentuhkan objek beralkohol kepada api penunu Bunsen supaya alkohol terbakar. misalnya. mikroorganisma yang terdapat pada permukaan objek tersebut juga turut terbakar dan akhirnya dihapuskan. ia kurang meyakinkan dibandingkan dengan pensterilan yang diperolehi dengan menggunakan autoklaf. 2. Pegang objek kecil seperti slaid mikroskop atau penutup slaid dengan forseps dan objek yang lebih besar pada pemegangnya. 3. 2. Sungguhpun ini merupakan suatu kaedah pensterilan yang boleh digunakan dalam keadaan-keadaan tertentu. Naikkan gelung perlahan-lahan sehingga bahagian gelung keluar dari kemuncak api biru dan biarkan terbakar sehingga merah membara. Celup objek atau bahagian yang akan disterilkan ke dalam balang alkohol. Seterusnya bakar keseluruhan dawai sehingga menjadi merah sebelum dikeluar dan didinginkan di udara.1 Cara membakar gelung dawai Pensterilan Alat dengan Alkohol yang Membakar Suatu tatacara cepat untuk mensterilkan objek kecil atau sebahagian daripada sesuatu objek. RAJAH 1.Mulakan dengan memasukkan gelung dawai langsung ke dalam api (biru) di bahagian gas tak terbakar. 4. seperti bahagian memotong gunting ialah dengan mencelupkan objek atau bahagian daripada objek berkenaan ke dalam alkohol dan kemudian membakar objek beralkohol tersebut. Tatacara Pensterilan Alat dengan Alkohol yang Membakar BAHAN 1. 12 . Balang alkohol (mengandungi etanol 70%) Penunu Bunsen TATACARA 1.

5. Jadi udara di persekitaran api akan terbawa arus ini ke atas dan akan mencegah partikel kecil seperti debu dan sebagainya daripada mendap di kawasan persekitaran ini. PERINGATAN Amalkan prosedur ini setiap kali anda melakukan penginokulasian supaya pencemaran khususnya dari udara di sekitar kita dapat dihindari. Kaedah ini hanya boleh digunakan untuk objek kaca dan logam sahaja. 2. Dengan demikian. Teknik ini membolehkan anda melakukan dua perkara secara serentak dengan kedua-dua tangan. 2. tanpa meletakkannya (lakukan prosedur ini berdekatan dengan api penunu Bunsen). iaitu arus udara yang bergerak ke atas disebabkan haba dari api tersebut. NOTA 1. Tanggalkan penutup botol/tabung tersebut dengan jari kelengkeng kanan dan pegang terus penutup ini dengan jari berkenaan. Mata gunting mestilah dalam keadaan terbuka semasa proses pensterilan supaya bahagian tajamnya terdedah kepada alkohol dan pembakaran. 2. Sentiasalah memegang objek supaya parasnya lebih rendah daripada paras tangan untuk mengelak daripada alkohol yang sedang terbakar mengalir ke tangan dan mengakibatkan kebakaran pada diri sendiri. segera lalukan mulut botol/tabung ke dalam api beberapa kali dan kemudian masukkan sesuatu yang diambil dengan gelung dawai atau pipet steril dengan tangan kanan. bekerja berdekatan dengan api ini amat digalakkan dan seharusnyalah menjadi amalan di bidang mikrobiologi. api penunu Bunsen menghasilkan arus perolakan. 5. 3. ia dapat mengelak daripada berlakunya pencemaran dari udara disebabkan partikel-partikel yang kecil apatah lagi spora fungus dan bakteria yang biasanya terapung atau berterbangan akan bergerak ke atas menurut arus dan tidak akan terjatuh ke dalam mana-mana media yang terdedah di bawahnya berdekatan dengan api. PERHATIAN 1. Lalukan semula mulut botol/tabung ke dalam api beberapa kali sebelum botol/tabung tersebut ditutup. Letakkan balang berisi alkohol berjauhan daripada api penunu Bunsen untuk mengelak daripada disambar api tersebut. Pada prinsipnya. Dengan tangan kiri. Bahan kaca seperti slaid atau penutupnya akan pecah sekiranya dibiarkan dalam api pembakar terlalu lama. Berdasarkan konsep ini. untuk melaksanakan pengambilan inokulum dari spesimen tertentu atau penginokulasian sesuatu media. NOTA 1. 2. 3. Peganglah botol/tabung di bahagian dasarnya (iaitu agak berjauhan daripada mulut botol/ tabung) dengan tangan kiri. iaitu mensterilkan mulut botol/tabung sambil menghindari daripada berlakunya pencemaran udara dan mengambil inokulum daripada sejenis media kultur ataupun memasukkan inokulum ke dalam media. Oleh itu. dipercayai bahawa bekerja berdekatan dengan sesuatu sumber api umumnya boleh mengurangkan kadar pencemaran dari udara. 4. Longgarkan dahulu penutup botol/tabung yang ketat dengan tangan kanan. ATAU dengan peralatan yang sama keluarkan sesuatu bahan (misalnya kultur) daripada botol/tabung berkenaan. Jauhkan objek daripada api penunu Bunsen dan biarkan sehingga api pembakaran alkohol tersebut padam dengan sendirinya. 13 . Tatacara Mengeluarkan dan Memasukkan Bahan daripada Botol yang Tertutup 1.

10. 6. Amatilah apusan melalui kanta okular. Kanta okular (mata) biasanya mempunyai kuasa pembesaran 10X. cahaya yang dibiaskan pasti tidak akan masuk ke dalam kanta. 4. jika ruang antara spesimen dan kanta adalah udara. 7. Sebelum memulakannya terlebih dahulu naikkan kanta objektif (100X) sehingga ke had maksimum. Walau bagaimanapun. Turunkan objektif dengan memutarkan tombol pengatur fokus kasar sehingga jarak objektif berada kira-kira 1 mm di atas slaid. Cahaya menjadi tertumpu dengan intensiti yang meningkat dan akan memberikan resolusi yang tinggi. 3. Sebenarnya. Kemudian. TATACARA MIKROSKOP CAHAYA Tatacara Menggunakan Mikroskop Cahaya Biasa BAHAN 1. MIKROSKOP CAHAYA DALAM MIKROBIOLOGI Antara teknik asas makmal yang seharusnya diketahui oleh seseorang penuntut mikrobiologi ialah pengamatan ke atas mikrooganisma serta sel-sel yang terinfeksi mikroorganisma dengan menggunakan mikroskop. Pusingkan tombol pengatur fokus kasar perlahan-lahan supaya objektif bergerak ke atas sehingga anda dapat melihat dan memfokus sesuatu pada slaid. Dengan menggunakan cahaya biasa untuk memancarkan imej objek. peringkat yang paling halus sekali yang boleh kita lihat (kuasa resolusi) adalah 0. Oleh yang demikian. Ulangi prosedur di atas dengan kanta objektif rendaman minyak (100X).2 mikron (µm) atau 200 nm kerana ini adalah had yang ditentukan oleh gelombang cahaya yang dapat dilihat. Sebaliknya. 14 . yang lazim dan paling sering digunakan ialah mikroskop cahaya jenis kompaun iaitu mempunyai dua set kanta (Rajah 2. resolusi mikroskop cahaya biasa ialah 300 nm. 5. Mikroskop makmal yang biasa mempunyai sekurang-kurangnya tiga kanta objektif: objektif kuasa rendah (pembesaran 10X). Jumlah kuasa pembesaran adalah kuasa pembesaran objektif darab kuasa pembesaran kanta okula. letakkan satu titis minyak rendaman di dalam lingkaran apusan pada slaid.1). sebahagian besar daripada cahaya akan dibiaskan disebabkan perbezaan indeks refraktif yang besar antara kaca dan udara. 4. 2. kuasa resolusi 200 nm ini adalah dalam keadaan optimum dan sungguhpun objek boleh ‘diamati’. Letakkan slaid di atas pentas/dataran mikroskop dengan apusan di sebelah atas. Pusingkan tombol pengatur fokus halus perlahan-lahan supaya objektif bergerak ke atas sehingga dapat memfokus sesuatu objek pada slaid. Sungguhpun kini terdapat pelbagai jenis mikroskop. Amatilah apusan melalui kanta okular (mata). 2. Keadaan ini memberikan imej yang lebih terang kerana cahaya yang melalui slaid mikroskop dan terkena pada spesimen yang sedang diamati tidak dibiaskan dan oleh yang demikian disalurkan ke dalam kanta rendaman minyak sebab indeks refraktif kaca dan minyak rendaman adalah hampir sama. Putarkan pula tombol pengatur fokus halus untuk mendapatkan imej objek yang tajam dan terang. 8. Tukarkan kepada kanta objektif (100X) dan turunkannya sehingga hampir-hampir menyentuh permukaan slaid. struktur dan saiznya amat sukar dipastikan. Spesimen dihubungkan secara fizikal dengan kanta rendaman minyak melalui minyak rendaman. Mikroskop cahaya Slaid apusan bakteria yang telah diwarnai Minyak rendaman Kertas/tisu kanta TATACARA 1. kuasa sederhana (40-45X) dan kuasa tinggi (100X) atau rendaman minyak (kuasa yang paling tinggi). Putarkan objektif (40X) supaya berada tepat di atas apusan. 2. 3. 9.2.1.

Adalah suatu amalan yang baik jika dalam melaksanakan pemfokusan ke atas sesuatu objek. putarkan tombol fokus halus perlahan-lahan supaya objektif bergerak ke atas sehingga anda dapat memfokus dan meneliti morfologi sel bakteria dengan jelas. Setelah selesai pengamatan. Ini kerana dalam sesetengah jenis/jenama mikroskop. 13. Turunkan objektif semula sehingga terendam di dalam minyak rendaman dan hampir-hampir menyentuh slaid. yang digerakkan adalah objektif mikroskop daripada permukaan slaid ke arah atas dan bukan sebaliknya. Lapkan minyak rendaman daripada objektif dengan kertas kanta kering atau dibasahi dengan sedikit xilena diikuti dengan kertas kanta kering yang bersih lainnya sejurus selepas setiap kali anda selesai melakukan pengamatan minyak rendaman. atau minyak rendaman yang diletakkan di atas apusan tidak mencukupi. 2. Sebelum melakukan pengamatan. 3. NOTA 1. gerakkan objektif ke atas menjauhi slaid. atau slaid melekat kepada kanta objektif dan turut bergerak ke atas semasa kanta digerakkan (masalah ini boleh diatasi dengan menekan slaid dengan satu jari semasa objektif digerakkan).11. 14. Sambil mengamati melalui kanta okular. pastikan terlebih dahulu apusan pada permukaan slaid berada di sebelah atas atau slaid tidak diletakkan dalam keadaan terbalik. Tiub binokular Bahagian mata (eye piece) Bahagian mercu yang berputar Objektif Pentas Kondenser Tombol pengatur fokus Lampu Pentas mikroskop RAJAH 2. Jika spesimen masih tidak kelihatan dengan kanta rendaman minyak ada kemungkinan spesimen tidak dapat difokus kerana tombol pengatur objektif mikroskop diputarkan terlalu cepat.1 Komponen-komponen mikroskop cahaya 15 . 12. objektif dapat diturunkan sehingga boleh melampaui paras pentas mikroskop dan apabila ini berlaku semasa pemfokusan besar kemungkinan penghujung objektif akan menekan ke atas slaid dan boleh menyebabkan slaid pecah. atau mungkin juga slaid dalam keadaan terbalik dan apusan berada di sebelah bawah.

16 . Ia perlu dirawat secara berterusan khususnya dengan menyalutkan semula bahan kimia berkenaan pada waktu tertentu. tetapi perlindungan ini. 5.4. Terdapat jenama mikroskop yang kantanya dilapisi dengan bahan kimia untuk mencegah masalah ini. Jika minyak rendaman pada kanta rendaman minyak tidak dilap dengan baik. Penggunaan kertas tisu lain seperti kertas tisu muka. lambat-laun debu akan melekat dan menutupi kanta tersebut dan akan menyebabkan pengamatan kabur serta menimbulkan kesulitan. Cara yang mudah dan baik untuk mengatasi hal ini adalah dengan menyimpan mikroskop di dalam bilik atau ruangan tertutup yang dilengkapi dengan alat penyahlembap (dehumidifier) yang akan mempastikan suasana udara di dalam bilik atau ruangan tersebut sentiasa kering. Tatacara Penjagaan Mikroskop Cahaya Iklim di Malaysia adalah lembap dan keadaan ini menggalakkan pertumbuhan fungus pada permukaan kanta mikroskop. atau tisu tandas atau sapu tangan untuk membersihkan permukaan kanta hanya akan mengakibatkan calar ke atas kanta dan ini akan mempersulitkan pengamatan seterusnya. dipercayai tidak berkekalan.

2. 2. misalnya untuk menentukan pergerakannya (motiliti). Sekiranya menggunakan kultur broth tukarkan langkah 4 kepada berikut: 4a. Tatacara Pelekapan Titisan Tergantung BAHAN 1. 17 . Amati pergerakan bakteria dengan kanta objektif 40X.1.3. Letakkan 1 gelung penuh kultur cecair bakteria (yang agak keruh atau tebal) ke atas slaid mikroskop. Kultur bakteria (dalam botol media broth atau plat kultur) Slaid mikroskop Penutup slaid Botol larutan salin (steril) TATACARA 1. Tatacara Pelekapan Basah Bakteria BAHAN 1. 5. Letakkan setitis kecil salin steril di atas sekeping slaid mikroskop bersih. 4. Buatkan 1 lingkaran/cincin plastisin berukuran tidak melebihi luas penutup slaid. PENGAMATAN PERGERAKAN BAKTERIA DI DALAM SUSPENSI CAIRAN Bakteria dalam keadaan semulajadi susah untuk diamati dengan mikroskop cahaya kerana bersifat transparen atau tidak mempunyai warna. Letakkan sekeping penutup slaid di atas suspensi bakteria seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3. Buatkan suspensi bakteria dari gelung dawai di dalam titisan salin di atas. Sentuhkan gelung dawai steril kepada 1 koloni bakteria pada plat kultar. Letakkan lingkaran tersebut di atas penutup slaid supaya titisan suspensi berada tepat di tengahtengah lingkaran plastisin dan tekan sedikit supaya lingkaran ini melekat kepada penutup slaid.1. Walau bagaimanapun.1. 4b. 2. 3.1. iaitu pelekapan basah dan titisan tergantung. Sediakan 1 titis suspensi bakteria di tengah-tengah sebuah penutup slaid mengikut tatacara pelekapan basah. 4. 4. Sterilkan gelung dawai melalui kaedah pembakaran dan biarkannya sehingga sejuk. 3. 3. 3. Sterilkan gelung dawai melalui kaedah pembakaran dan biarkannya sehingga sejuk. PENGAMATAN MIKROB PENGAMATAN BAKTERIA 3. 5. Kultur bakteria (dalam botol media broth atau plat kultur) Slaid mikroskop Penutup slaid Plastisin Botol larutan salin (steril) TATACARA 1. pengamatan dalam keadaan seperti ini terpaksa dilakukan juga. 2. Pengamatan motiliti bakteria di dalam suspensi cairan digunakan khusus untuk bakteria yang dikulturkan dalam media broth kerana tidak dapat tumbuh dengan baik pada media padat (agar). Dalam hal ini terdapat dua tatacara yang boleh digunakan. 3. 6.

2. Intensiti cahaya perlu dikurangkan dengan menurunkan kondenser dan mengecilkan diafragma untuk memberikan kontras yang secukupnya. atau disebabkan mikroskop tergoncang. 3.Letakkan setitis larutan salin di atas slaid mikroskop bersih dan sentuh 1 koloni bakteria dengan gelung dawai dan buatkan suspensi. NOTA Letakkan sebuah slaid mikroskop yang bersih di atas lingkaran plastisin dan tekan sedikit supaya ia melekat kepada plastisin. Ini adalah untuk mengelak daripada suspensi bakteria mengalami gegaran goncangan yang akan menyulitkan pengamatan. partikel (termasuk bakteria) bergerak perlahan-lahan secara bolak-balik (to and fro) tanpa arah tertentu. 5. Semasa melakukan pengamatan jangan letakkan tangan di atas meja ataupun menekan meja di mana mikroskop berada. Kadangkala kesemua partikel bergerak ke satu arah menurut aliran cecair. 6. Amatilah pelekapan basah ini di bawah kanta objektif pembesaran 40X. RAJAH 3. Amati pergerakan bakteria dengan kanta objektif 40X. Dalam pergerakan Brown. Angkat dan terbalikkan slaid mikroskop dengan cepat supaya penutup slaid berada di atas dan suspensi bakteria menjadi tergantung.1 Tatacara melakukan pelekapan basah Rajah muka surat 18 4. Ini membolehkan sel bakteria kelihatan lebih jelas dan pergerakannya dapat diamati dengan mudah. Letakkan sebuah penutup slaid mikroskop dan dengan berhati-hati lekapkan di atas suspensi bakteria (usahakan supaya tidak terbentuk gelembung udara). 1. atau berlakunya 18 .

Letakkan kaca penutup slaid di atas permukaan yang bersih dan titiskan. Kemudian letakkan sebuah slaid mikroskop yang bersih di atas plastisin dan tekan sedikit supaya melekat kepada plastisin. Pengeraman optimum yang biasanya digunakan. adalah kira-kira 2 jam dan bagi kebanyakan bakteria. RAJAH 3. yakni 22°C atau 25°C. Oleh yang demikian. Dengan berhati-hati sekali angkat dan terbalikkan slaid mikroskop dengan cepat. dalam hal ini. atau buatkan suspensi bakteria di atasnya. Dengan hati-hati letakkan cincin plastisin melingkari suspensi tanpa menyentuhnya. Motiliti sebenarnya ditunjukkan dengan gerakan yang aktif bercorak putaran. 5. Kebanyakan spesies yang diambil daripada kultur padat sering memberikan hasil yang negatif untuk motiliti (memperlihatkan tidak motil). disarankan agar kultur cecair digunakan. atau partikel individu bergerak dengan pantas menuju ke sesuatu arah tertentu. suhu pengeramannya adalah di bawah 37°C. untuk melakukan ujian motiliti.2 Tatacara melakukan pelekapan titisan tergantung 19 . penyejatan dari sisi kaca penutup. Dengan demikian suatu suspensi bakteria yang tergantung akan dihasilkan.4. Kelebihan tatacara ini daripada tatacara pelekapan basah adalah perubahan rupa bentuk (distortion) bakteria dikurangkan kerana tidak ditindih oleh penutup kaca.

Campurkan 5 ml asid hidroklorik pekat kepada 1 liter etanol 70%. Tatacara Membuat Apusan Bakteria BAHAN 1. Cuci dengan air suling. Letakkan slaid di atas kertas penyerap dan biarkan sehingga sejuk. TATACARA 1. 4. 2.1. Keluarkan slaid mikroskop yang disimpan di dalam bekas yang mengandungi alkohol dengan menggunakan sebuah forseps bersih. 3. 3. Lakukan di dalam kabinet asap. 2. 5. 3. PENYEDIAAN UNTUK PEWARNAAN BAKTERIA Tatacara Membersihkan dan Menyimpan Slaid Mikroskop BAHAN 1. 2.3. PERHATIAN Pastikan balang slaid tidak diletak berhampiran penunu Bunsen atau sebarang sumber api kerana alkohol mudah terbakar. Slaid mikroskop Etanol 70% Metanol 95% Asid hidroklorik pekat PERSEDIAAN REAGEN Alkohol asid 0. Rendam slaid kaca di dalam alkohol asid semalaman. Slaid mikroskop yang disimpan di dalam metanol 95% di dalam bekas yang tertutup Forseps Kertas turas Penunu Bunsen Gelung dawai Pensil gris/pena tanda (marker) kalis air Kultur bakteria Larutan salin 0. 4. Hapuskan alkohol dengan membakarnya dengan api penunu Bunsen. 2. 2. 7. 6. 4. Jauhkan bekas slaid yang mengandungi alkohol daripada api. Simpan di dalam balang tertutup yang mengandungi metanol 95%. 3.85% (steril) TATACARA 1. Jangan pegang slaid yang dibakar dengan forseps secara tegak untuk mengelak kemungkinan alkohol mengalir ke atas tangan dan menyebabkan kebakaran. PERHATIAN 1. 8.2. 20 .5%. Pegang slaid supaya aras tangan berada lebih tinggi daripada slaid.

Suspensi bakteria harus disebarkan dengan baik supaya menghasilkan apusan yang sama rata. 6.5 x 2. 21 .5 x 2. Sebarkan suspensi bakteria sehingga membentuk bulatan seluas kira-kira 1 – 2 cm garis pusat. Gunakan setitis suspensi sahaja supaya apusan cepat kering. 3.5 cm. Sebarkan sehingga membentuk bulatan seluas kira-kira 1 cm garis pusat. 6. Letakkan setitis kecil salin steril di atas sebuah slaid. 2. Letakkan setitis kecil salin steril di atas sebuah slaid bersih. Kultur bakteria dari media padat (agar) 1. Sterilkan gelung dawai. sel-sel bakteria akan kelihatan tersusun terlalu rapat dan padat sehingga sukar untuk menentukan morfologinya. 4. 4. Nanah dan eksudat Ambil 1 gelung penuh spesimen dan sebarkannya di atas slaid supaya mencapai seluas 1. 5.Kultur bakteria dari broth 1. 1. Biarkan sehingga kering di udara. 2. 2. Tandakan sudut kiri atas slaid dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. Jika tidak. 3. sel bakteria berada dalam keadaan berkelompok dan kemungkinan pewarnaan yang didapati juga tidak sama rata dan morfologi sel individu sukar untuk ditentukan. 8. Urin dan cecair serebrospina 1. Tuangkan supernatan dan masukkan beberapa titis salin steril ke dalam tiub emparan ini. 2. Swab yang mengandungi spesimen klinikal Letakkan setitis kecil salin steril di atas sebuah slaid dan emulsifikasikan spesimen dari swab di dalam titisan salin ini. Pada apusan yang terlalu tebal.000 g selama 10 minit pada suhu bilik. 7. Buat apusan dengan suspensi bakteria yang diperolehi. Sentuh 1 koloni bakteria yang terasing dengan gelung dawai. 3. Kacau. Terbalikkan slaid dan buatkan lingkaran di sekeliling kawasan apusan dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. Biarkan supaya kering di udara. Buatkan suspensi bakteria daripada gelung dawai di dalam titisan salin. Terbalikkan slaid dan buatkan lingkaran di sekeliling kawasan apusan dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. 3.5 cm. 4. NOTA Emparkan urin dan cecair serebrospina pada tekanan emparan 10. 5. Tandakan sudut kiri atas slaid dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. Sterilkan gelung dawai. Gunakan sedikit kultur bakteria supaya apusan yang disediakan membentuk filem yang agak tipis. Kahak (sputum) Pindahkan sedikit kahak dari bekas spesimen dengan swab steril ke atas sebuah slaid bersih dan sebarkan seluas 1. Letakkan 1 gelung penuh kultur cecair di atas sebuah slaid bersih.

Biarkan slaid dingin di udara. 2. Di samping kebaikan dari segi kesihatan. Tatacara Memfiksasi Bakteria dengan Haba BAHAN 1. sebab tidak akan memberikan hasil seperti yang diharapkan dan sebaliknya apa yang diperoleh ialah suatu keadaan yang dikenal sebagai artifak. Permukaan slaid di mana terdapatnya apusan ini dapat dipastikan dengan tanda pensil gris yang dapat dikikis atau pena tanda kalis air pada permukaan bawah slaid. Pemanasan ke atas apusan yang basah dipercayai boleh mengakibatkan perubahan rupa (distortion) morfologi bakteria yang ketara. 3. juga akan menghilangkan haba dari slaid. Cara yang popular memfiksasi bakteria adalah dengan menggunakan haba dari suatu sumber api. Sebelum bakteria diwarnai. Slaid disentuhkan ke atas tapak tangan selepas setiap kali pemanasan. Fiksasi Bakteria dengan Haba Sebarang proses yang membeku serta memejalkan sel bakteria dan strukturnya dikenali sebagai fiksasi. 2.4. tetapi juga untuk mengekalkan (mengawet) struktur sel bakteria tersebut serta meningkatkan daya penglihatan ke atasnya. Justeru. 3. fiksasi juga boleh membunuh bakteria. Apusan bakteria ke atas slaid mikroskop Penunu Bunsen TATACARA 1. Dengan cepat sentuhkan slaid ke atas tapak tangan. Ulangi prosedur ini sebanyak 3 kali (kesemuanya). Sekiranya slaid dirasakan terlalu panas pada tapak tangan maka besar kemungkinan sel bakteria pada apusan telah mengalami kehancuran atau telah berlaku artifak. Ini selain mempastikan slaid tidak terlalu panas. 2. Proses ini tidaklah semata-mata bertujuan untuk melekatkan sel bakteria kepada slaid. pastikan bahawa permukaan slaid mikroskop yang mengandungi apusan berada di sebelah atas menghadap kanta objektif. 1. biarkan apusan sehingga benar-benar kering sebelum melakukan fiksasi. Adalah lumrah jika di dalam kelas amali terdapat pelajar yang memegang slaid dengan forseps dan memasukkannya ke dalam api penunu Bunsen dengan tujuan untuk mengeringkan dan sekaligus memfiksasi apusan. 5. Akibatnya pewarnaan yang diusahakan akan sia-sia sahaja. ia terlebih dahulu difiksasi. 5. di sekeliling kawasan apusan (di sebelah bawah slaid) dilingkari dengan pensil gris atau pena tanda kalis air supaya tapak di mana terdapatnya apusan mudah dikesan untuk diletak tepat di bawah kanta objektif serta untuk meletakkan titisan minyak rendaman. dehidrasi) dan cara kimia. Sebaik-baiknya. pembunuhan bakteria adalah penting dalam pewarnaan kerana pada umumnya bakteria yang masih hidup sering bersifat kurang telap terhadap kebanyakan pewarna yang digunakan. Melalukan slaid dengan cepat ke dalam api penunu Bunsen sebanyak 3 kali adalah mencukupi bagi tujuan pemfiksasian. Lalukan slaid sekali dengan cepat ke dalam api penunu Bunsen. NOTA Pegang salah satu penghujung slaid dengan ibu jari dan jari telunjuk dengan apusan di sebelah atas. Amalan ini tidak digalakkan kerana dengan cara demikian adalah sukar untuk menentukan sama ada fiksasi tercapai atau apusan telah terdedah kepada haba terlalu lama. Lazimnya. Pemanasan yang berlebihan akan menyebabkan perubahan besar dalam bentuk sel bakteria atau sel bakteria menjadi pecah dan mengalami kerosakan. 22 . Dalam pengamatan ke atas sesuatu apusan dengan mikroskop. 4. Fiksasi boleh dilakukan dengan cara fizikal (haba.

mampu menyusup masuk ke dalam sel dengan lebih baik dan pewarnaannya lebih kekal. dengan demikian hanya latar belakang (kawasan di luar bakteria) sahaja yang diwarnai. satu filem pewarna gelap meliputi ruang dan celah di antara bakteria-bakteria (latar belakang) dan bakteria tidak diwarnakan.3. Pewarna dan Jenis Pewarnaan Bahan pewarna boleh dibahagikan kepada dua golongan: pewarna asid dan pewarna bes. keseluruhan sel bakteria diwarnakan secara sama rata dan substruktur atau komponen-komponen selnya tidak dibezakan. iaitu sama ada berasal daripada spesimen klinikal atau dari kultur pertumbuhan. Pada pewarna asid. berasal daripada terbitan garam asid bebas kerana bentuk ini lebih larut. Tambahan pula. maka jurang perbezaan optikalnya juga adalah sedemikian. ciri pewarnaan adalah bergantung kepada anion (ion negatif) dan pada pewarna bes. Di samping membolehkan bakteria dilihat dengan lebih mudah. kristal ungu) kerana protoplasma bakteria mempunyai kandungan asid nukleik bercas negatif yang tinggi. ciri pewarnaan bergantung kepada kationnya (ion positif). Keadaan ini mengakibatkan sel bakteria sukar untuk diamati. Untuk menunjukkan perbezaan yang wujud di kalangan sel bakteria tertentu. Dalam pewarnaan negatif. atau mordan mempertingkatkan afiniti ataupun kecenderungan pewarna terhadap struktur tertentu. Sebagai langkah untuk mengatasi masalah ini perbezaan warna digunakan untuk memudahkan melihat keseluruhan sel bakteria dan juga untuk mempamerkan substruktur bakteria dan segala-galanya mengenai bakteria dengan lebih terperinci. pewarnaan ini juga digunakan untuk menggolongkan bakteria. Apabila sel bakteria diwarnakan dengan satu jenis pewarna sahaja. Pewarnaan Gram Pewarnaan Gram adalah tatacara pewarnaan utama di bidang bakteriologi. tatacara pewarnaan perbezaan yang menggunakan dua atau lebih pewarna digunakan. Perlu disedari bahawa ciri-ciri pewarnaan bakteria (serta morfologi) dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti umur kultur dan sumber bakteria. cas yang negatif ini akan bertindak dengan ion positif pewarna bes. Bakteria menunjukkan kecenderungan atau afiniti yang kuat terhadap pewarna bes (contoh: safranin.3. pewarnaan ini disebut pewarnaan sederhana (simple staining). Apabila diwarnakan dengan pewarna bes. metilena biru. Dalam tatacara pewarnaan Gram. Tindakan aksentuator ini tidak melibatkan pergabungannya dengan pewarna seperti yang berlaku pada mordan. Intensiti pewarnaan boleh dipertingkatkan (ataupun supaya sasaran dapat diwarnakan) dengan menggunakan haba dalam keadaan tertentu atau menggunakan bahan kimia (aksentuator) seperti asid asetik. umumnya. Mordan adalah bahan kimia yang membolehkan sesuatu pewarna mewarnakan sesuatu bahan. pewarna digunakan secara berlebihan dan kemudian agen penghapus warna atau pembeza digunakan untuk 23 . Pewarnaan juga digunakan untuk menunjukkan taburan dan jenis kimia berbagai-bagai komponen sel serta membezakan antara golongan-golongan bakteria. Sebaliknya cas negatif ini akan menolak pewarna asid. perbezaan indeks biasan yang kecil antara komponen-komponen sel bakteria juga menyulitkan substruktur bakteria untuk dilihat. Pewarna yang digunakan. Pewarnaan yang diterangkan setakat ini dikenal sebagai pewarnaan positif kerana yang diwarnakan ialah bakteria. PEWARNAAN BAKTERIA Oleh kerana perbezaan indeks biasan antara bakteria dan kawasan sekelilingnya tidak besar. Pada umumnya dalam pewarnaan ini.1. fenol atau anilin.

reaksi Gram berubah dengan umur kultur. Nota: peringkat No. sel vegetatifnya akan terwarna Gram-negatif atau granul-granul di dalam sel diwarnakan Grampositif selama beberapa generasi selepas spora bergerminasi. keringkan di udara dan fiksasi apusan tersebut. Kultur bakteria Kristal ungu Iodin Lugol Aseton-alkohol Safranin/karbol fuksin Kertas turas Tatacara 1. Liputi pula apusan dengan iodin Lugol selama 1 minit. sentiasa memberikan tindak balas Gram-negatif. 2. Pegang slaid di dalam sinki secara condong dan titiskan dengan cepat aseton-alkohol ke atas apusan sehingga tiada warna biru (kristal ungu) terlihat keluar dari apusan (lebih kurang 3-10 saat bergantung kepada ketebalan apusan). Protoplasma bakteria. 5. 5. Sel bakteria berwarna merah/merah jambu: Gram-negatif. 7. Dalam kebanyakan spesies bakteria.menghilangkan pewarna berkenaan. dalam hal ini. Tatacara Pewarnaan Gram BAHAN 1. kemudian buangkan. 8. 4. NOTA 1. 6. 3. Bacillus subtilis). 6. Ada juga bakteria Gram-positif seperti Corynebacterium yang mudah kehilangan warna pertamanya dan seringkali kelihatan sebagai Gram-negatif. manakala yang kehilangan pewarna ini dan diwarnai dengan pewarna kedua dinyatakan sebagai Gram-negatif. Larutan iodin Lugol yang digunakan berfungsi sebagai mordan dan pelarut organik seperti alkohol dan aseton digunakan sebagai pembeza atau pengnyahwarna. Liputi apusan dengan kristal ungu selama 1 minit. 24 . Cuci dengan air. 4. 8 = cuci & keringkan Pengamatan dan Pentafsiran Sel bakteria berwarna biru: Gram-positif. Segera cuci dengan air. Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas penyerap (lipat kertas turas/penyerap. Pewarna yang digunakan untuk menggantikan pewarna pertama yang dihilangkan oleh pembeza disebut pewarna balas (counter stain). kemudian singkirkan keseluruhan air tersebut. Kemudian liputi apusan dengan safranin atau karbol fuksin cair selama 30 saat. Pada beberapa spesies basilus aerobik yang menghasilkan spora (contoh. Bakteria yang mengekalkan pewarna pertama (kristal ungu) disebut sebagai Gram-positif. 2. 3. Hasil tindak balas pewarnaan Gram adalah bergantung kepada komposisi dinding sel bakteria yang berkemampuan untuk mengikat pewarna pertama atau tidak. Kultur tua bakteria Gram-positif memberikan reaksi Gram tak tetap (Gram variable) – ada sel yang terwarna biru dan ada yang terwarna merah bercampur di antara satu dengan lainnya. Buat apusan bakteria pada slaid mikroskop. masukkan slaid ke dalam lipatan dan tekan kertas dari luar sehingga semua air terserap daripada slaid tanpa menggosok permukaan slaid atau apusan). 2.

Liputi pula apusan dengan metilena biru selama 30 saat. Sel bakteria berwarna biru kehijauan: bakteria tak tahan asid. Biarkan sejuk dan cuci dengan air. Banjirkan apusan dengan pewarna karbol fuksin Ziehl-Neelsen. Lakukan ini sehingga keluar wap dari apusan selama 5-10 minit. pewarna berkenaan kekal di dalam sel. pewarna fenol mempunyai kelarutan yang tinggi di dalam sel dibandingkan dengan pembeza (penghilang warna). 6. 6. Di samping ciri-ciri ini. dalam tatacara ini slaid perlu dipanaskan sehingga wap keluar kerana. Buat apusan bakteria pada slaid mikroskop. kadar resap pewarna pada sel yang tahan asid adalah rendah berbanding dengan sel tak tahan asid. 7. 8. Sifat tahan asid ini merupakan ciri yang berfaedah dan penting dalam membezakan mikobakteria dengan bakteria lain.Pewarnaan Ziehl-Neelsen (Pewarnaan Tahan Asid) Mikobakteria yang diwarnakan dengan pewarna fenilmetana (contoh: fuksin bes) dalam larutan anilin atau fenol akan mengekalkan warna tersebut meskipun telah didedahkan kepada asid yang kuat berbanding dengan bakteria jenis lain. apabila bakteria yang telah diwarnakan didedahkan kepada penghilang warna. manakala pada bakteria tak tahan asid pewarna tersebut akan hanya masuk ke dalam sel dan kemudian disingkirkan daripada sel oleh penghilang warna. Panaskan slaid dengan api pembakaran kain gauz yang dibasahi dengan alkohol. 5. 7. Kultur bakteria Karbol fuksin Ziehl-Neelsen Alkohol asid Metilena biru Alkohol Sebatang kaca yang satu penghujungnya dibalut kain kasa (gauz) Kertas turas Penunu Bunsen TATACARA 1. Cuci dengan air. 5. (Pastikan pewarna tidak mendidih atau menjadi kering). keringkan di udara dan fiksasikan apusan tersebut. 2. Pemanasan dilakukan dari bahagian bawah slaid (apusan di permukaan atas) yang diletakkan di atas rak pewarnaan iaitu dengan menggunakan api kecil penunu Bunsen. Tambahkan alkohol-asid (penghilang warna) selama 25-30 saat. Mikobakteria yang tahan asid mempunyai karbohidrat. 3. Oleh yang demikian. haba digunakan untuk membolehkan pewarnaan terlaksana dalam jangka masa yang munasabah. Tatacara Pewarnaan Ziehl-Neelsen BAHAN 1. 4. 2. 3. (Beberapa spesies aktinomiset juga tahan asid). PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Sel bakteria berwarna merah: bakteria tahan asid. bakteria golongan pertama ini disebut sebagai bakteria tahan asid. Oleh yang demikian. Sebaliknya boleh juga dengan menggunakan sebatang kaca yang salah satu penghujungnya 25 . 4. 8. Oleh yang demikian. NOTA 1. dalam hal ini. Ciri-ciri ini disebabkan oleh perbezaan komposisi kimia (secara kuantitatif dan kualitatif) bakteria tahan asid dan bakteria tak tahan asid. Pada bakteria tahan asid. Cuci dan keringkan dengan kertas penyerap. alkohol dan asid lemak (seperti asid mikolik) yang tersendiri.

Sitoplasma bakteria yang berwarna hijau tanpa butir-butir berwarna biru kehitaman di dalamnya: Tiada granul metakromatik. 3. 2. Toluidina biru adalah pewarna metakromatik: apabila pewarna ini masuk ke dalam kompleks granul volutin yang besar. Jika spesimen klinikal digunakan. volutin ini mengubahkan spektrum serapan (absorption) toluidina biru supaya pada mata kasar pewarna ini kelihatan telah berubah warnanya dari biru kepada biru kehitaman. dibalut dengan kain yang dicelup di dalam alkohol dan kemudian dinyalakan. Tatacara Pewarnaan Albert BAHAN 1.2. Tapak atau kedudukan spora di dalam sel serta saiz spora berbanding dengan sel yang mengandunginya mempunyai kepentingan taksonomi. Jika diwarnai dengan toluidina biru. Keadaan ini disebabkan oleh fenomena metakromasi yang melibatkan perubahan di dalam warna sesuatu bahan. komponen ini akan kelihatan berwarna biru kehitaman dan bukan biru. Pewarnaan Schaeffer-Fulton (Pewarnaan Spora) Bakteria Genus Bacillus dan Clostridium dicirikan dengan kehadiran struktur bulat atau bujur yang dinamakan spora (atau endospora). Walau bagaimanapun. 2. 4. Apusan kultur bakteria Pewarna Albert Iodin Gram Kertas turas TATACARA 1. pendedahan metilena biru kepada udara menyebabkan sebahagian kecil daripada pewarna ini dioksidasi menjadi metilena ungu pada pH tinggi dan metilena ungu secara selektif mewarnakan volutin tersebut. Tetapi jika metilena biru digunakan. 3. Liputi apusan dengan pewarna Albert selama 5 minit. daya kelarutan fenol di dalam air dan kehadiran elektrolit di dalam larutan pewarna. Volutin ini terdiri daripada polimetafosfat yang mempunyai berat molekul tinggi dan dihubungkaitkan dengan bakteria genus Corynebacterium. Cuci dengan air dan keringkan. 4. Dalam keadaan ini. Pemanasan meningkatkan ketelapan dinding spora sehingga pewarna malakit hijau dapat dengan mudah masuk dan mewarnai struktur ini. keringkan dan fiksasikannya. Spora bakteria hanya dapat diwarnakan jika mordan atau haba digunakan. Ini adalah suatu artifak yang disebabkan oleh beberapa faktor seperti kemurnian pewarna karbol fuksin. 5. sel pesakit akan berwarna biru-kehijauan. 3. granul volutin akan kelihatan merah dan bukan biru. Semasa pendinginan/pencucian pewarna terperangkap di dalamnya. Kadangkala sel mikobakteria tidak terwarna sama rata dan kelihatan berjalur merah berselang-seli dengan bahagian tanpa warna atau kelihatan berbutir. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Butir-butir berwarna biru kehitaman di dalam sitoplasma bakteria yang berwarna hijau: Kehadiran granul metakromatik. Cuci dengan air. Liputi pula apusan dengan iodin Gram selama 1 minit. Pewarnaan Albert (Pewarna Granul Metakromatik) Volutin bakteria (granul metakromatik) adalah bahan basofilik yang refraktif. keadaan ini sebenarnya bukanlah merupakan fenomena metakromasi sungguhpun di dalam bidang bakteriologi ia dinyatakan demikian. Elakkan daripada memanaskan slaid dan pewarna dengan memegang slaid dengan forseps dan memasukkannya langsung ke dalam api penunu Bunsen. Buat apusan pada slaid mikroskop. sedangkan pada sel 26 .

5. ia tercuci bersih. 27 . Cuci dengan air. Apusan kultur bakteria Malakit hijau 5% Safranin Batang kaca yang dibalut kain kasa pada salah satu penghujungnya Kertas turas Alkohol TATACARA 1. di dalam apusan akan kelihatan spora yang bebas. spora akan kelihatan tanpa warna atau berwarna pudar. tetapi granulgranul halus dakwat India hanya menghasilkan latar belakang yang gelap dalam bidang penglihatan. 6. Oleh kerana sebahagian daripada sel telah mengalami lisis. Liputi pula apusan dengan safranin selama 30 saat. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Butir-butir berwarna hijau di dalam sel bakteria yang berwarna merah ATAU butir-butir berwarna hijau bertaburan di luar sel bakteria. Disebabkan ketumpatan kapsul lebih rendah daripada sel. Pewarna malakit hijau nampaknya merupakan pewarna terbaik untuk pewarnaan spora bakteria. manakala bahagian sel vegetatif bakteria berwarna merah. keringkan dan fiksasikannya. Teknik ini sebenarnya tidak mewarnai sebarang struktur pada mikroorganisma. 3. 7. Biarkan selama 1 hingga 3 minit. 4. 5. Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India (Pewarnaan Kapsul) Pewarnaan negatif dengan dakwat India membolehkan bakteria diamati dalam keadaan masih utuh dan tanpa perubahan rupa bentuk yang disebabkan oleh agen kimia (contoh: pewarna) dan agen fisikal (contoh: haba) serta membolehkan morfologinya ditentukan dengan cepat. maka ia kelihatan lebih terang (di sekeliling sel). Liputi apusan dengan malakit hijau 5%. 2. Tatacara Pewarnaan Schaeffer-Fulton (Pewarnaan Spora) BAHAN 1. tatacara ini jarang digunakan kecuali untuk mengamati kapsul. 2. Butir berwarna hijau adalah spora bakteria. Buat apusan pada slaid mikroskop. Pewarna balas memberikan warna yang kontras supaya spora dapat dikesan dengan mudah. 4. iaitu suatu struktur yang menyelubungi keseluruhan sel bakteria dan sukar untuk diwarnai. Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas turas. 3. 6.vegetatif. Panaskan sehingga wap keluar beberapa kali tetapi jangan sampai mendidih (tambah pewarna jika akan mengalami kekeringan). 2. NOTA 1. Walau bagaimanapun. Jika apusan bakteria tidak dipanaskan secukupnya.

2. 5. Letakkan setitis kecil kultur cecair ke atas slaid mikroskop atau buatkan suspensi organisma dari sedikit pertumbuhan kultur muda mikroorganisma pada media padat di dalam setitis salin dengan menggunakan dawai inokulasi.5 Kepingan kertas turas gred Whatman No. pH 6. tatacara pewarnaan flagela yang hasilnya kemudian diamati dengan mikroskop cahaya adalah sukar dilakukan. Klebsiella pneumoniae dan fungus Cryptococcus neoformans. bengkok No. Kurangkan cahaya mikroskop dengan menurunkan kondensernya dan amati kultur dengan objektif 40X (untuk fungus) atau objektif minyak rendaman (untuk bakteria). 4. Namun demikian. Kultur bakteria Forseps jenis tukang jam tangan. Ia merupakan tatacara yang paling mudah untuk mengesan kehadiran kapsul dan sering digunakan ke atas spesies bakteria seperti Streptococcus pneumoniae. Tutup campuran dengan penutup slaid. Tatacara Pewarnaan Negatif Flagela dengan Asid Fosfotungstik BAHAN 1. 10.85% (steril) Tabung yang steril Gelung dawai Penunu Bunsen Alat penyimpan grid atau piring Petri yang dialas dengan kertas turas 28 . 3. 3. 3. Sebagai pilihan lain. Campurkan dengan baik satu gelung kecil dakwat India ke dalam suspensi mikroorganisma yang telah disediakan.7 Grid mikroskop elektron yang disaluti filem Formvar Asid fosfotungstik 1.Tatacara Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India (Pewarnaan Kapsul) BAHAN 1. 7. 6. 3. Tambahan pula.85% (steril) Penutup slaid Slaid mikroskop Dakwat India (PelicanTM atau PilotTM) TATACARA 1. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Kapsul kelihatan sebagai suatu lapisan cincin lutcahaya atau bersinar melingkari keseluruhan sel di atas latar belakang yang gelap. Kultur bakteria Larutan salin 0. 1 Larutan salin 0. struktur flagela serta tapaknya lebih mudah dipastikan dengan mikroskop elektron melalui pewarnaan negatif dengan asid fosfotungstik. Dalam hal ini. 2.5%. NOTA 1. 2. Intensiti cahaya perlu dikurangkan untuk memberikan kontras yang lebih baik. Jika terlalu banyak dakwat digunakan bakteria mungkin tidak dapat dilihat kerana transmisi cahaya terhalang. 2. 5. 4. ia mempunyai nilai diagnostik. 9. 8. 4. Pewarnaan Negatif Flagela dengan Asid Fosfotungstik Pengamatan flagela bakteria dapat dilihat dengan mikroskop cahaya selepas berlakunya pewarnaan seperti pewarnaan tatacara Gray. ia melibatkan penggunaan logam berat yang akan menyumbang kepada pencemaran alam sekitar.

5. Simpan grid di atas alat penyimpan grid atau di dalam piring Petri yang dialas dengan kertas turas. 7.TATACARA 1. 6. 2.4. Ini merupakan suatu kriteria yang berfaedah dalam pengenalpastian bakteria. Susunan sel-sel basilus: Sel tunggal Berpasangan Berantai Palisad Tak teratur 29 . kuasa pembesaran yang digunakan adalah di antara 5000 – 10 000 kali ganda sahaja. 4. Pindahkan 1 titis larutan asid fosfotungstik ke atas grid berkenaan dan biarkan 1 minit. Serapkan larutan asid fosfotungstik dengan menyentuhkan pinggir grid dengan kepingan kertas turas. Sterilkan gelung dawai dan pindahkan 1 koloni bakteria ke dalam tabung. oleh kerana saiz bakteria lebih besar daripada virus. 3. PENGKELASAN BENTUK DAN SUSUNAN SEL VEGETATIF BAKTERIA Bentuk Kokus Basilus Vibrio Spirilla Spiroket Berfilamen Susunan Bakteria yang membiak secara aktif mempunyai kecenderungan untuk mengekalkan susunan selnya yang menjadi ciri bakteria tersebut. Biarkan 1 minit sebelum cairan diserap oleh kepingan kertas turas. Pindahkan 1 titis suspensi bakteria ke atas grid pada permukaan yang disaluti Formvar. Tatacara Pengamatan Grid yang Disaluti Spesimen Bakteria Selepas Pewarnaan Negatif Tatacaranya adalah seperti pengamatan partikel virus (lihat muka surat 41-42). Berbagai-bagai susunan sel bakteria dikenali dan telah ditentukan berdasarkan perbezaan dari segi pertumbuhan serta strukturnya. 3. Walau bagaimanapun.1. Pindahkan 1 ml salin ke dalam tabung.

Amati dengan objektif 10X (jumlah kuasa 100X) dan kemudian 40X (jumlah kuasa 400X). di mana pelekapan basahnya hanya terhad kepada ujian motiliti. 3. ataupun ke atas kultur dari sesuatu spesimen klinikal. Tambahkan 1 titis spesimen. 2. 2. pengamatan fungus boleh dilakukan sama ada melalui pemeriksaan secara langsung ke atas spesimen yang diambil. PERHATIAN 1. 3. Letakkan 1 titis salin ke atas slaid mikroskop.2. Di dalam salin. Beberapa pewarnaan yang digunakan dalam bidang bakteriologi juga digunakan dalam bidang mikologi sungguhpun prosedurnya disesuaikan untuk fungus.1. Tutup dengan kaca penutup slaid. PENGAMATAN FUNGUS DI DALAM SUSPENSI CAIRAN Pelekapan basah fungus di dalam salin dilakukan dalam pengamatan secara langsung fungus. 4. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Fungus akan kelihatan refraktil.2. Pengamatan ke atasnya boleh dilakukan dalam bentuk pelekapan basah atau terhadap apusan fungus yang telah diwarnai. 3. Perbezaan di antara yis dengan gelembung udara dan sel darah merah: Sel yis mengandungi badan inklusi. berkilat atau hijau pudar.Susunan sel-sel kokus: Kokus tunggal Diplokokus Tetrad (berempat) Berantai Berkelompok 3. Tatacara Pelekapan Basah Salin BAHAN 1. keutuhan sel dan organisma tersebut dapat dikekalkan. 30 . PENGAMATAN FUNGUS Seperti juga bakteria. perhitungan jumlah sel epitelium dan sel darah putih dapat dilakukan.85% Kaca penutup slaid TATACARA 1. Spesimen yang disyaki mengandungi fungus Larutan salin 0. dan jika perlu. pelekapan basah fungus berperanan penting dalam pengenalpastian fungus serta diagnosis penyakit yang disebabkan olehnya. Berbeza dengan bakteria.

Kulit. Tekan kaca penutup slaid. Amati dengan objektif 10X dan kemudian 40X (jumlah kuasa. NOTA Intensiti cahaya dikurangkan. Perbezaan di antara hifa dengan benang kapas: Pinggiran atau lebar (kaliber) benang kapas tidak teratur dan serat benang sering berpilin atau kelihatan melingkari sesuatu paksi dan penghujungnya berumbai. 31 . Panaskan dengan api pilot penunu Bunsen sehingga pelekapan basah ini menjadi jernih tanpa pendidihan (5-20 minit). 4. Masalah ini boleh diatasi dengan menggunakan beberapa persediaan yang boleh menghancurkan serta melarutkan keratin supaya latar belakang menjadi jernih. Mosaik fungus (artifak): Jaringan jisim yang mempunyai bentuk yang berbeza-beza dan tidak teratur. rambut dan kuku. 4. Proses penjernihan dapat dipercepatkan melalui pemanasan. Tutup spesimen dengan kaca penutup perlahan-lahan. Untuk kuku dan kikisan kulit yang keras. bentuk kristal berbeza-beza dan larut air. Perbezaan hifa dengan kristal panjang: Penghujung kristal tidak bersambung atau terputus-putus. Letakkan 1 titis larutan KOH di tengah slaid mikroskop.2. 2. PERHATIAN Pelekapan KOH juga boleh digunakan untuk spesimen kahak (sputum) atau spesimen daripada vagina yang banyak mengandungi bahan mukoid. Pelekapan Basah Kalium Hidroksida (KOH) Spesimen kikisan kulit dan rambut diamati secara langsung untuk pengesanan fungus dalam pelekapan basah yang terdiri daripada larutan penjernih. adalah legap dan latar belakang ini boleh menyelubungi fungus. biasanya terletak di penghujung atau perbatasan sel. Pelekapan ini tidak dipanaskan dan diamati dalam masa 20 minit. 4. 5. 6. Masukkan spesimen ke dalam titisan KOH. KOH (20%) melarutkan keratin dan memudahkan pengamatan ke atas hifa fungus. Tatacara Pelekapan Basah Kalium Hidroksida (KOH) BAHAN 1. 2. tatacara ini dapat diubahsuai dengan penambahan dimetil sulfoksida (DMSO) 40%. dengan kondenser mikroskop diturunkan untuk memberikan kontras yang secukupnya. 3. Spesimen 10-20% Kaca penutup slaid Penunu Bunsen KOH TATACARA 1. Penjernihan biasanya dilakukan dengan KOH mungkin kerana bahan kimia ini mudah didapati di dalam makmal. masing-masing 100X dan 400X). 3. Jenis larutan kalium hidroksida penjernih termasuklah natrium lauryl 5% di dalam air suling. 3. natrium sulfida 10% di dalam alkohol 20% dan larutan kalium hidroksida (KOH) atau natrium hidroksida (NaOH). Gliserin yang ditambah mengakibatkan pelekapan menjadi lambat kering dan menghalang presipitasi KOH. yang mengandungi keratin.

Masukkan spesimen ke dalam titisan LCB. Ambil sebahagian kecil bahan fungus dari kultur dengan menggunakan jarum atau dawai bengkok di atas. 2. Pelekapan Basah Lactophenol Cotton Blue (LCB) Pelekapan basah yang juga mengandungi sejenis pewarna akan memudahkan pengamatan fungus. Persediaan menjadi lebih jernih dan oleh yang demikian. jangan tersalah anggapan bahawa bahagian tepi sel (dinding sel) adalah hifa. 32 . Tatacara Pelekapan Basah Lactophenol Cotton Blue (LCB) BAHAN 1. NOTA 1. Dalam hal ini. 2. fenol membunuh fungus.PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Hifa adalah dalam bentuk filamen kurus dengan bahagian tepinya sejajar dan disusun secara rawak berbanding dengan sel. 4. maka memudahkan fungus diamati. 4. 6. Jangan panaskan pelekapan KOH terlalu lama atau dengan suhu yang terlalu tinggi kerana akan terbentuk hablur KOH. Amati dengan objektif pembesaran 10X dan 40X. Dalam pengamatan ke atas fungus. 7. Titiskan 1 titis kecil LCB di tengah-tengah slaid mikroskop. 5. 3. 6. 3. Intensiti cahaya dikurangkan untuk memberikan kontras yang secukupnya. Asid laktik mengekalkan struktur fungus serta menjernihkan latar belakang. 5. persediaan lactophenol cotton blue digunakan untuk membuat pelekapan basah fungus sama ada dari spesimen ataupun dari kultur untuk pengamatan mikroskop. 5. 3. Spesimen fungus Slaid mikroskop Kaca penutup slaid Jarum atau dawai dengan penghujungnya dibengkokkan Lactophenol cotton blue (LCB) TATACARA 1. gliserol mengelak pelekapan basah menjadi kering dan pewarna cotton blue diserap oleh struktur kitin fungus dan mewarnainya. fungus lebih mudah dapat diamati jika dibiarkan 1 hingga 2 jam. Penutup slaid ditekan untuk memperoleh sediaan yang tipis dan untuk mengeluarkan KOH yang berlebihan. Bakar jarum atau dawai apabila sudah selesai. Leraikan bahan fungus ini dengan menggunakan 2 dawai. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Miselium (dinding dan septum sel) serta struktur spora (fruiting structures) kelihatan biru tua di atas latar belakang yang berwarna pudar (muda). Pelekapan yang tidak jernih mungkin mengandungi artifak yang mirip dengan struktur fungus. 4. 2. Tutup spesimen dengan kaca penutup dengan perlahan tanpa menekan spesimen.

6.5% di dalam etanol 95% Kertas turas Penunu Bunsen TATACARA 1. Pada kultur fungus. PEWARNAAN FUNGUS 3. Cuci dengan air. 4. 8. Sebaliknya fungsi haba diambil alih oleh sejenis detergen (Tergitol) yang bertindak di atas permukaan sel. 7. Cuci dengan air yang mengalir. Kapsul Cryptococcus neoformans lazimnya menghalang sel yis ini daripada diwarnai dengan sempurna dan seringkali mengakibatkan ia kelihatan seperti bahan lemak Gram-negatif berwarna merah jambu pucat (lavender) dengan badan inklusi yang bergranul berwarna ungu (Gram-positif). Hilangkan pewarna dengan asid sulfurik 1% sehingga tiada lagi pewarna yang keluar.NOTA 1. 33 . Aktinomiset adalah golongan bakteria yang hampir menyerupai fungus dan secara tradisional dirangkumkan ke dalam bidang mikologi. 2. 7. negatif. 4. Banjiri slaid dengan karbol fuksin Kinyoun dan biarkan selama 5 minit. 6. Banjiri dengan etanol 50% sehingga tiada lagi pewarna yang keluar (biasanya sejurus selepas alkohol ditambah). Pewarnaan Tahan Asid Diubahsuai Kinyoun Tatacara ini tidak menggunakan haba untuk memudahkan pewarna memasuki sel.2. muka surat 23-24). kontrol kultur positif dan negatif dan biarkan kering di udara. Struktur fungus lebih mudah dilihat jika pelekapan ini dibiarkan selama kira-kira 10 minit. Pewarnaan Gram Semua fungus adalah Gram-positif. 3. 5. 3. 2. Tatacara Pewarnaan Gram Tatacara tersebut adalah seperti yang dilakukan untuk bakteria (lihat pewarnaan Gram. 2.2. Kultur fungus (kontrol kultur positif. Buatkan 3 apusan tipis. Masing-masing daripada kultur yang diuji. Fiksasi apusan dengan haba. Cuci dengan air. 5. kultur yang diuji) Karbol fuksin Kinyoun Etanol 50% Asid sulfurik 1% Metilena biru 2. Oleh yang demikian. ambillah spesimen daripada bahagian koloni yang terletak di antara tepi dan tengahnya: bahagian tepi dan tengah koloni biasanya terdiri daripada struktur yang sama ada terlalu muda atau terlalu tua dari segi pembentukan spora dan berkemungkinan akan memberikan hasil pengamatan yang kurang memuaskan. suatu pengubahsuaian pewarnaan tahan asid perlu dilakukan khususnya untuk Nocardia. Pewarna tahan asid yang digunakan untuk mikobakteria mungkin menyahwarnakan pewarna secara berlebihan ke atas spesies ini dan memberikan hasil yang negatif palsu. Tatacara Pewarnaan Tahan Asid Diubahsuai Kinyoun BAHAN 1. Nocardia adalah aktinomiset yang bersifat separuh tahan asid.

2. Pewarnaan ini amat berguna untuk mengesan fungus pada keratan tisu serta apusan seperti kikisan kulit. Bilas seketika dengan air suling. 10. 3. Pewarnaan ini memberi kontras yang lebih ketara dan biasanya mewarnakan elemen fungus yang tidak ditunjukkan oleh pewarnaan lain. Cuci dengan air paip selama 10 minit sehingga warna merah jambu muncul. nukleus kelihatan biru dan latar belakang adalah hijau. Titiskan larutan asid periodik selama 10 minit.9. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Fungus (dan juga komponen tisu) yang mempunyai polisakarida di dalam strukturnya kelihatan merah ungu. Reagen ini masih boleh digunakan jika ia cepat berubah menjadi ungu-merah. 7. 2. 34 . PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Nocardia kelihatan merah manakala bakteria lain dan fungus kelihatan biru.2-glikol daripada polisakarid fungus ke gugusan aldehid. Liputi dengan larutan metilena biru selama 1 minit. 2. Askus yis kelihatan merah manakala blastokonidia berwarna biru. Aktinomiset tidak diwarnakan dengan baik atau langsung tidak diwarnakan dengan tatacara ini. Balas warna dengan metil hijau selama 5 – 10 minit. Grup aldehid yang reaktif ini bergabung dengan reagen Schiff-leuko-fuksin untuk menghasilkan warna fuksin merah ungu. Fiksasikan apusan dengan metanol mutlak selama 5 – 15 minit. 5. ia tidak boleh digunakan lagi jika tiada warna yang muncul atau warnanya ungubiru. NOTA 1. Tatacara Pewarnaan Asid Periodik-Schiff BAHAN 1. Pewarnaan Metenamin-Argentum Gomori Pewarnaan metenamin-argentum Gomori dianggap sebagai pewarnaan yang amat berguna dalam penyaringan spesimen klinikal bagi fungus. 6. asid periodik mengoksidasi gugusan 1. 4. Titiskan reagen Schiff selama 20 minit. Sebaliknya. 3. Pewarnaan Asid Periodik-Schiff Dalam pewarnaan asid periodik-Schiff (periodic acid-Schiff – PAS). Cuci dengan air suling selama 15 minit dan keringkan. 6. Cuci dengan air dan keringkan. Apusan spesimen pada slaid mikroskop Metanol mutlak Asid periodik 1% Reagen Schiff Metil hijau 2% Air suling TATACARA 1. 5. 4. Keberkesanan tindakan pewarna Schiff boleh diuji dengan menitiskannya ke dalam formalin 40%.

Cuci dengan air. 35 . Balas warna dengan pewarna light green selama 30-45 saat. 3. 11.1% Natrium thiosulfat 2% Larutan light green 0. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Dinding sel fungus (serta fiber retikulum dan fiber elastik tisu) terwarna hitam. 17. 95% dan mutlak. 7. 16. Larutan stok metenamin-argentum nitrat adalah stabil jika disimpan di dalam peti beku. 3. Bilas dengan natrium bisulfit selama 1 minit. 10. 15. 7. Liputi apusan dengan larutan emas klorid 0. Cuci dengan air paip selama 15 saat. 4. 8. Bilas 6 kali dengan air suling apabila kontrol menunjukkan pewarnaan yang optimum telah dicapai. 2. Presipitasi putih yang muncul berikutan penyimpanan boleh dihilangkan dengan menggoncangnya. 6. 10.04% Alkohol mutlak. 9. Bilas dengan air suling. Cuci 3 kali dengan air suling. 9. 11. Komponen tisu sebagai latar belakang diwarnai kuning dengan nukleus berwarna hitam. 12. alkohol 95%. alkohol 70% Xilena Forseps yang disaluti parafin PermountTM TATACARA 1. 12. 13. Sesetengah bakteria (termasuk Nocardia spp) serta sesetengah komponen tisu juga diwarnakan. Apusan spesimen pada slaid mikroskop Ketuhar Asid kromik 5% Natrium bisulfit 1% Larutan metenamin-argentum nitrat (pewarna Gomori) Aurum (emas) klorid 0.Tatacara Metenamin-Argentum Gomori BAHAN 1. 14. NOTA 1. Jernihkan spesimen dengan 2 hingga 3 kali pertukaran xilena. Letakkan slaid di dalam bekas yang mengandungi larutan metenamin-argentum nitrat dan eramkan bekas berkenaan di dalam ketuhar pada suhu 58-60°C. 2. Oleh yang demikian semua yang diwarnakan kelabu tua tidak semestinya fungus. Cryptococcus neoformans diwarnai merah muda gelap atau merah. Periksa apusan dengan mikroskop untuk menentukan sama ada fungus telah terwarna perang tua atau memerlukan pengeraman yang lebih lama. 2. 8. manakala bahagian di dalam miselium dan hifa diwarnakan kelabu tua dan latar belakang adalah hijau muda. Lekapkan dengan media pelekap PermountTM. Gunakan forseps yang diselaputi dengan parafin untuk mengeluarkan slaid dari larutan metenamin-argentum nitrat dan celupkannya ke dalam air suling. Keringkan dengan 2 pertukaran masing-masing alkohol 70%. 4. 6. 5.1% selama 2 hingga 5 minit. Hilangkan argentum yang tidak tereduksi dengan natrium thiosulfat selama 2 hingga 5 minit. Letakkan slaid yang mengandungi apusan di dalam larutan asid kromik selama 1 jam. 5. Cuci dengan air paip selama 5 – 10 minit.

Bercabang Tak bercabang Membengkak 36 . Tatacara ini boleh juga digunakan untuk keratan tisu dari ketulan parafin. Nocardia serta fungus tua dan yang telah mati mungkin memerlukan masa pengeraman yang lebih lama (sehingga 90 minit) dengan larutan metenamin-argentum nitrat untuk diwarnai. keratan tisu terlebih dahulu dihilangkan parafinnya dengan 2 pertukaran rendaman di dalam xilena dan kemudian dihidrasikan melalui suatu urutan rendaman di dalam alkohol mutlak.2.3. Pastikan pewarnaan tidak menjadi telalu gelap hingga struktur morfologi halus tidak dapat diamati. BENTUK DAN STRUKTUR FUNGUS DALAM KULTUR 1. Tatacara Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India Tatacara tersebut adalah seperti yang dilakukan ke atas bakteria (Rujuk tatacara yang sama bagi bakteria) 3. Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India Pewarnaan ini digunakan untuk menunjukkan kehadiran kapsul yis. 5. Morfologi mikroskopik Morfologi fungus bermiselium Hifa: Saiz: garis pusat yang berbeza Pigmentasi: tanpa warna atau berwarna Berseptum atau tak berseptum Bercabang atau tak bercabang Spora aseksual: Blastokonidia (blastospora) Klamidokonidia (klamidospora) Artrokonidia (artrospora) Bentuk spora yang dihasilkan secara langsung dari miselium vegetatif. khususnya bagi Cryptococcus neoformans di dalam mendapan cairan serebrospina dalam diagnosis kes meningitis. alkohol 95% dan air suling. Dengan spesimen jenis ini. Spora asekual (konidia) yang dihasilkan daripada hifa khas yang disebut konidiofor. 4.3.

Bentuk konidiofor: Konidia Makrokonidia (konidia bersaiz besar pada fungus yang menghasilkan konidia yang besar dan kecil) Septum: Berseptum atau tanpa septum Bujur Raket Berbentuk gada (clavate) Bernodul Sabit Sigar Bengkok dan berkeadaan tidak sempurna (distorted) Bentuk: Berasingan Berkelompok Berantai Susunan dari konidiofor: Mikrokonidia (konidia bersaiz kecil pada fungus yang menghasilkan konidia yang besar dan kecil). Bulut/sfera Bujur (ovoid) Ala buah pear (piriform) Gada Bentuk: Tunggal Bertunas Multipel 37 .

Pengamatan ke atasnya boleh dilakukan dengan teknik mikroskopi elektron langsung ataupun dalam bentuk teknik pengubahsuaian mikroskopi elektron imun – yang dapat meningkatkan kesensitifan dalam pengesanan virus melalui mikroskopi elektron tersebut.3. sama ada ke atas spesimen yang diambil ataupun ke atas kultur daripada sesuatu spesimen klinikal. Filem sokongan ini diletakkan di atas grid kuprum berbentuk jaringan halus. Filem yang nipis serta lembut ini diletak ke atas suatu jaringan halus berbentuk bulat yang dinamakan grid. 4. 3. 2.5% di dalam kloroform Grid kuprum 400 mesh. spesimen diletakkan di atas satu lapisan tipis plastik atau karbon yang disebut filem sokongan. Mikroskop elektron transmisi mempunyai julat kuasa pembesaran di antara 1500 hingga 500000 kali dan had kuasa resolusi 0. spesimen yang akan diamati diletakkan pada sebuah slaid kaca yang kemudian diletak di atas pentas mikroskop. 2.3. plastik formal polivinil (Formvar TM). Formvar E larutan 0. diwarnakan secara negatif dan kemudian diamati dengan mikroskop elektron. Penaburan elektron oleh spesimen menghasilkan imej yang diperbesar di atas layar pendaflour. 7.5 nm berbanding dengan kuasa pembesar mikroskop cahaya yang hanya berkisar di antara 30 sehingga 1500 kali dan had resolusi 200 nm. Slaid berkenaan kemudian dikeluarkan dan permukaan slaid dipegang secara tegak dengan paksi panjangnya agak disendengkan dan biarkan sehingga kering. pengamatan terhadap virus boleh dilakukan secara langsung. garis pusatnya bergantung kepada jenis mikroskop elektron Slaid mikroskop Pisau cukur Mangkuk kaca ~ 10 cm isipadu Forseps Air suling TATACARA 1. dan kedua-dua jenis plastik tersebut yang distabilkan oleh karbon. Dalam elektron mikroskop jenis transmisi. karbon murni. 5. Penyalutan Grid dengan Lapisan Formvar Virus perlu diletak di atas filem sokongan sebelum partikel virus dapat “diwarnakan” dan diamati. 6. Potong filem di bahagian yang berhampiran dengan tepi slaid supaya terdapat filem berbentuk segi empat. Tatacara Penyalutan Grid dengan Lapisan Formvar BAHAN 1. Dalam mikroskopi elektron. Isikan bekas air dengan air suling sehingga penuh. Bahan-bahan yang berfungsi sebagai filem sokongan adalah plastik nitroselulos (contoh Parlodion TM). 3. aliran elektron yang digunakan sebagai sumber radiasi diarahkan ke atas spesimen. dan satu siri kanta magnetik yang digunakan untuk membelok dan memfokuskan aliran elektron. PENGAMATAN VIRUS DENGAN MIKROSKOP ELEKTRON Dalam pengamatan bakteria dan fungus dengan mikroskop cahaya. Komponen asas mikroskop elektron adalah sumber elektron. Slaid dicelupkan ke dalam larutan formvar selama 15 – 20 saat. Fokus yang halus boleh didapati dengan binokular berkuasa rendah. 4. Tunggu sehingga semua gelembung udara bergerak ke permukaan air. Dua elektromagnet mempunyai fungsi seperti kondenser mikroskop cahaya untuk memfokuskan aliran elektron ini ke atas spesimen tersebut. Spesimen virus diletakkan di atas lapisan filem ini. 38 . Seperti juga bakteria dan fungus.

7. natrium tungstat dan garam uranium seperti uranil asetat. Proses perlekatan bahan protein ke atas filem memerlukan beberapa saat sahaja dan selepas itu. 6. Apungkan 1 grid dengan permukaan filem sokongannya bersentuhan dengan titis suspensi virus selama 3 minit. 39 . Tatacara Pewarnaan Negatif dengan Asid Fosfotungstik BAHAN 1. Keadaan ini wujud kerana kawasan yang mempunyai lebih “pewarna” seperti kawasan di sekeliling virus dan celah-celah permukaan virus akan menaburkan lebih elektron berbanding dengan kawasan yang kurang “pewarna”. Masukkan slaid ke dalam air pada sudut 30 darjah supaya filem terapung bebas pada permukaan air. jumlah elektron yang sampai ke layar dari kawasan yang mempunyai lebih “pewarna” adalah lebih rendah dan menyebabkan kawasan ini kelihatan lebih gelap daripada kawasan lainnya. Sampel virus Forseps halus jenis tukang jam yang bengkok No. air suling dan pewarna dalam 1 barisan di atas sekeping kertas gris. Oleh yang demikian. proses yang berikutnya. Gunakan slaid mikroskop baru yang sengaja dilap dengan kertas pengering tangan. seperti virus. Pewarnaan negatif melibatkan penanaman (embedding) bahan kecil yang berpartikel. ke dalam suatu lapisan bahan berketumpatan tinggi supaya spesimen dapat diamati sebagai objek yang cerah di atas latar belakang gelap.7 Grid mikroskop elektron yang disaluti filem Formvar Kepingan kertas turas gred Whatman No. Letakkan setitis (~ 20 µl) suspensi virus. Slaid yang dicuci dengan teliti (dengan asid alkohol) akan melekatkan filem dengan kuat sehingga membuatkannya sukar untuk ditanggalkan daripada slaid. 3. NOTA 1. Pegang slaid berdekatan dengan mulut dan keluarkan nafas dengan kuat supaya permukaan filem diliputi dengan wap yang terkondensasi dari mulut. Penyalutan Virus Ke atas Grid dan Pewarnaan Negatif: Teknik Mikroskop Elektron Secara Langsung Spesimen diletakkan di atas filem sokongan melalui kaedah pemindahan titisan tunggal sebelum pewarnaan dilakukan. 3. 2. 2. 4.5 TATACARA 1. 2. ia tidak akan tanggal lagi kecuali jika dilarutkan atau dihadamkan. pH 6. Tekan grid perlahan-lahan dengan forseps untuk mencapai sentuhan yang baik di antara filem dan grid. 9. Tetapi natrium fosfotungstat merupakan pewarna negatif yang utama. 6. dapat dilakukan tanpa kehilangan virus. Terdapat beberapa pewarna negatif seperti natrium fosfotungstat. Letakkan sekeping kertas turas di atas filem dan apabila kertas ini tenggelam ia dikeluarkan dan filem dibiarkan sehingga menjadi kering. 1 Kertas lilin Asid fosfotungstik 1. Oleh yang demikian. Letakkan grid dalam 2 barisan di atas filem yang terapung-apung di atas air tersebut. 8. 5.5. Dengan forseps halus keluar dan sentuhkan tepi grid dengan sekeping kertas turas supaya dapat menghilangkan cairan yang berlebihan. seperti pewarnaan virus. Pastikan air yang digunakan bersih.5%.

9. Tatacara Mikroskopi Elektron Imun BAHAN 1. Apungkan grid dengan permukaan yang didedahkan kepada virus di atas titisan air suling selama 30 saat. 3. 3. 8. 2. elakkan daripada berlakunya pencemaran silang dengan menggunakan forseps yang berbeza atau mencelupkan forseps yang telah digunakan di dalam air mendidih setiap kali sebelum digunakan semula. Pindahkan grid ke sekeping kertas turas yang terletak di dalam sebuah piring Petri. 4. 5. 5. 7. Teknik Mikroskopi Elektron Imun Kesensitifan mikroskopi elektron ( ME) boleh dipertingkatkan iaitu dengan menggunakan antibodi yang spesifik untuk mengelompokkan partikel-partikel virus. 1 Kertas lilin Antiserum yang spesifik terhadap virus berkenaan Larutan salin ditampan fosfat TATACARA 1. 4. 7. NOTA Letakkan grid tersebut di atas kertas gris dan biarkan sehingga kering. Cara ini juga digunakan untuk menentukan identiti virus yang tidak mempunyai morfologi permukaan yang khusus. Kertas turas yang dikoyak adalah lebih berkesan daripada yang digunting. 2. Buang sediaan ini apabila didapati berubah kepada warna kebiruan. Cecair yang berlebihan disingkirkan dengan menyentuhkan bahagian tepi grid sambil dipegang dengan penghujung forseps. Permukaan grid yang disaluti dengan filem yang digunakan untuk melekatkan virus adalah permukaan di sebelah atas kertas turas. Keluar dan hilangkan cairan yang berlebihan. Sampel virus Forseps halus jenis tukang jam tangan Grid mikroskop elektron yang disaluti filem Formvar Asid fosfotungstik 1. Eramkan campuran virus/antiserum di dalam bekas ini selama satu jam pada 37°C. Larutkan antiserum dalam larutan salin ditampan fosfat (nisbah antiserum: larutan salin yang digunakan bergantung kepada sediaan antiserum).5%.4. Letakkan kertas lilin dengan campuran virus/antiserum di dalam piring Petri yang dialas dengan kertas turas lembap.5 Kepingan kertas turas gred Whatman No. Bagi spesimen multipel. 5. 4. 6. Keluar serta hilangkan cairan yang berlebihan. 6. 8. Letakkan campuran ke atas grid dan warnakan mengikut bahagian “tatacara menyaluti grid dengan virus & tatacara pewarnaan negatif dengan asid fosfotungstik” di muka surat 39-40. Apungkan grid dengan permukaan yang didedahkan kepada virus ke atas titis pewarna selama 30 saat. Campurkan 15 µl virus dengan 15 µl tiap larutan antiserum ke atas sekeping kertas lilin. 3. Ia diagihagihkan dalam jumlah kecil ke dalam botol dan disimpan beku kecuali satu botol untuk kegunaan semasa yang seharusnya disimpan di dalam peti beku. Asid fosfotungstik seharusnya disediakan dengan menggunakan air suling steril. 40 . 1. Pegang grid dengan kemas dengan menggunakan forseps kerana grid-grid ini amat ringan dan mudah terlepas daripada forseps akibat tarikan tegangan permukaan titisan cecair. pH 6. 2. 5.

2. 2. Amati layar melalui tingkap pengamatan. Dalam keadaan antibodi yang berlebihan. 8. supaya spesimen mencapai tempat yang ditetapkan. Juga. Pengamatan Spesimen Virus Terletak di atas Grid Mikroskop Elektron Persediaan penggunaan mikroskop memerlukan seseorang yang terlatih di dalam bidang ini. Oleh yang demikian. Saiz serta bentuk virus. Kurangkan kuasa pembesaran kepada 80 kali dan pilih satu kawasan (segi empat sama) untuk diamati. Campuran virus dan antiserum daripada satu siri pencairan dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi antibodi yang optimum untuk menghasilkan pengelompokan virus. jika diketahui. Untuk mengamati sesuatu objek dengan lebih teliti dan mendalam. Serum haruslah didedahkan kepada suhu tinggi (56°C) sebelum digunakan untuk menghapuskan komplemen yang boleh melisiskan sampul (envelop) virus. 3. Skan secara teratur kawasan di dalam segi empat tepat yang dipilih supaya seluruh kawasan diamati. gunakan binokular. adalah amat penting sekali. Suspensi virus murni boleh menyebabkan partikel virus dikelompokkan secara spontan. dalam hal ini. 4.000 kali ganda dan dalam masa yang sama pusatkan semula pancaran elektron serta tingkatkan intensitinya. 5.NOTA 1. Putarkan batang pemegang ke arah lawan pusingan jam. NOTA Letakkan spesimen dengan menggunakan forseps di dalam ruang khas pemegang spesimen (berhati-hati supaya tidak tersentuh bahagian pemegang spesimen yang akan diletakkan di dalam ruang hampas udara). Dalam memilih segi empat tepat untuk diamati. jika teknik ini dilakukan dengan menggunakan spesimen tanpa campuran antibodi sebagai kontrol. 4. Dalam tatacara ini. 2. 6. partikel virus akan disaluti dengan suatu lapisan protein yang tebal dan ini akan menyukarkan pengamatan ke atas struktur virus serta menyebabkan perubahan bentuk vitus berkenaan. Putarkan tombol fokus sehingga memperolehi imej yang paling jelas. janganlah memilih segi empat yang kelihatan terlalu “bersih” kerana ia tidak dapat memberikan kontras yang baik di antara virus dengan latar belakangnya. janganlah mendapatkan kawasan yang gelap kerana virus akan terlindung/tersembunyi dan susah untuk diamati. Tatacara Pengamatan Spesimen Virus dengan Mikroskop Elektron BAHAN 1. 7. 2. 41 . Letakkan batang pemegang spesimen ke dalam tapak yang ditetapkan dan tunggu sehingga lampu merah padam. Serum biasa pun sudah mencukupi. 1. Grid yang diliputi dengan spesimen yang diwarnakan Mikroskop elektron jenis transmisi TATACARA 1. Naikkan kuasa pembesaran kepada 60. tidak semestinya IgG atau IgM yang murni digunakan. Apa yang akan dibentangkan dalam bahagian ini adalah cara untuk memasukkan spesimen ke dalam mikroskop dan beberapa petua untuk mengamati virus. akan banyak membantu dalam proses pencarian virus berkenaan. iaitu sebagai isyarat bahawa ruang hampas udara telah pun dicapai di dalam ruang spesimen. 3.

3. Campurkan 1 bahagian larutan stok ini dengan 5 bahagian air suling untuk digunakan dalam pewarnaan.0%) Larutkan 5 g pewarna di dalam 100 ml air suling. SF yellowish di dalam 100 ml air suling dan tambah 0. Asid sulfurik Campurkan 1 ml asid sulfurik pekat ke dalam 100 ml air suling. Alkohol asid Campurkan 5 ml asid hidroklorik dengan 95 ml etanol 95%. Aseton-alkohol Campurkan aseton dan etil alkohol 95% dalam nisbah isipadu yang sama.3%) Larutkan 0. Malakit hijau (5. 2. 9. Larutkan 8 g fenol di dalam 100 ml air suling.2 g malakit hijau di dalam 2 ml etanol 95%. 10. amatilah 5 segi empat tepat.5 g iodin dan tambah air sehingga mencapai 100 ml. 6. Karbol fuksin Kinyoun Larutkan 2 g fuksin bes di dalam 10 ml etanol 95%. Tambahkan 20 g kristal fenol dan larutkan dengan air panas di dalam penganggas air pada suhu 70°C.2 ml asid asetik glacial.4.3 g metilena biru di dalam 30 ml etanol dan tambahkan 100 ml air suling. 12. Light green. Iodin Gram Larutkan 1 g kalium iodid di dalam 70 ml air suling.075 g cotton blue. Tambahkan 0. Karbol fuksin Ziehl-Neelsen Larutkan 4 g fuksin bes di dalam 20 ml etanol 95%. Goncang sehingga keseluruhan iodin tersebut larut. 4. Campurkan kedua-dua sediaan ini.15 g toluidina biru dan 0. Larutkan pewarna cotton blue dengan meletakkan bekas di dalam penganggas air. atas serta kiri dan kanan grid sebelum spesimen tersebut dapat dianggap sebagai tidak mengandungi virus (iaitu pada tahap kesensitifan mikroskop elektron dalam mengesan virus). 3.05%) Larutan 0. 42 .3. Lakukan di dalam almari asap. iaitu yang berada di tengah. Saring larutan ini dengan kertas turas. Kemudian tambahkan 0. REAGEN PEWARNAAN: RUMUSAN DAN PERSEDIAAN 1. Karbol fuksin (0. Campurkan 1 ml asid asetik dan tambahkan 100 ml air suling. Kristal ungu Larutkan 1 g kristal ungu di dalam 100 ml air suling. 13. Campurkan kedua-dua sediaan ini.05g fuksin bes di dalam 100 ml air suling. larutan pewarna Albert Larutkan 0. Oleh kerana terdapat kemungkinan bahawa taburan virus di atas filem grid tidak rata. 5. Metilena biru (0. Albert. bawah. Larutan pewarna Larutkan 0. Lactophenol cotton blue Campurkan 20 ml asid laktik dengan 40 ml gliserol dan 40 ml air suling. Larutkan 5 g fenol di dalam 100 ml air suling. 7.2 g Light Green. 11. 8.

larutan pewarnaan Larutkan 2 ml boraks (borax) 5% di dalam 25 ml air dan kemudian campurkan larutan ini dengan 25 ml larutan stok metenamin-argentum nitrat. 43 . Safranin (0. Saring dengan kertas turas dan simpan larutan reagen Schiff ini di dalam botol gelap di dalam peti beku. Metenamin-argentum nitrat. 15. Tambahkan 20 ml 1N HCl dan 1g kalium metabisulfit bentuk kontang. Kemudian kurangkan suhu kepada 50°C dan saringkan dengan kertas turas. Metenamin-argentum nitrat.14. Biarkan di tempat gelap selama 2 hari. Tambahkan 0. 16.5 g arang kayu yang teraktivasi dan goncang sekali-sekala dalam tempoh 1 jam.5%) Larutkan 0. Reagan Schiff-leuko-fuksin Larutkan 1g fuksin bes di dalam 200 ml air suling yang mendidih.5 g safranin di dalam 100 ml air suling. 17. larutan stok Campurkan 50 ml larutan argentum nitrat 5% yang disediakan di dalam air suling dengan 100 ml metenamin (heksa-metilena-tetra-amin) 3% yang disediakan di dalam air suling.

misalnya vaksin. Jika mikrob ini merupakan suatu agen “baru” yang mungkin belum dikenali. Media sintetik adalah media yang semua komponennya merupakan bahan kimia yang nyata dan spesifik daripada segi kandungannya. melalui pengkulturan dapatlah diwujudkan satu sumber atau bekalan kultur agen berkenaan supaya kajian boleh dijalankan untuk menentukan ciri-cirinya. Media diperkaya (enriched media) adalah media dasar yang dicampurkan dengan bahan yang boleh menggalakkan pertumbuhan seperti cecair tubuh (contohnya darah. misalnya bakteria ataupun virus. PENGKULTURAN MIKROB Mikroorganisma dan virus dikulturkan untuk beberapa tujuan. media juga digunakan untuk pemencilan. Pepton soya disediakan daripada tindakan enzim terhadap kacang soya. ujian yang dijalankan ke atas kultur sesuatu mikrob tertentu dapat membantu mengenal pasti atau menentukan identiti mikrob berkenaan. Keadaan pengkulturan mikrob adalah berbeza-beza bergantung kepada jenis mikrob. Hasil daripada penghadaman enzim ke atas bahan organik. Dari segi penggunaan. vitamin tertentu. garam dan air. otak atau hati). protein atau sebarang nutrien yang memiliki ciri yang khas dan tepat. Dalam bidang perindustrian dan bioteknologi. mikrob merupakan salah satu komponen yang harus diperolehi bagi penghasilan sesuatu produk. broth nutrien. Di samping pertumbuhan. yis atau darah di mana kandungannya kurang jelas atau tidak dapat dipastikan. Contoh. Contoh: Agar nutrien. Media boleh dibahagikan kepada media sintetik (media yang diketahui kandungannya) dan media tiruan atau kompleks. media kultur dibahagikan kepada beberapa golongan: Media dasar (juga dipanggil media nutrien atau media basal) yang mengandungi infusi.4. ujian motiliti dan menentukan ciri-ciri metabolik dan fisiologi bakteria. PENGKULTURAN BAKTERIA 4.1. pepton. jantung. Media pengaya (enrichment media) digunakan untuk pertumbuhan bakteria yang tidak tumbuh baik pada media dasar atau kerana pertumbuhannya pada media ini lebih baik dan cepat berbanding dengan bakteria yang lazimnya tumbuh dengan pesat dan seringkali mengatasi kecepatan pertumbuhannya dalam media dasar. manakala media tiruan adalah media yang mengandungi bahan-bahan kompleks seperti ekstrak daging lembu. Kadangkala keadaan yang berbeza ini wujud walaupun di kalangan mikrob daripada golongan yang sama. broth infusi (otak-jantung. pepton P adalah penghadaman daging oleh pepsin. Dalam mikrobiologi diagnostik. asid amino. 44 . serum). Infusi – Pepton – Ekstraks daging. JENIS MEDIA KULTUR Media kultur digunakan terutama untuk pertumbuhan bakteria (dan mikroorganisma lain) dan terdapat dalam bentuk pepejal. separuh pepejal dan cecair.1. 4.1.

Reduksi telurit akan menghasilkan koloni berwarna hitam. ia juga dianggap sebagai media pemilih. dalam broth selenit F natrium selenit pada pH 7. kebanyakan media pembeza juga mempunyai reagen yang dapat menghalang pertumbuhan bakteria tertentu dan dalam hal ini. Media ini juga meningkatkan peluang untuk memencilkan bakteria tertentu di dalam sesuatu kultur campuran. Media pemilih (selective) adalah media dasar atau media diperkaya yang dicampurkan dengan bahan yang menghalang pertumbuhan majoriti jenis bakteria dan memberikan kelebihan kepada segolongan kecil bakteria lain yang diinginkan untuk tumbuh. Dari segi fungsi. ia memberi peluang kepada Salmonella dan/atau Shigella untuk membiak dengan lebih baik kerana kekurangan atau ketiadaan persaingan pertumbuhan spesies koliform lainnya.1. Fermentasi manitol menghasilkan koloni bakteria berwarna kuning. triptos Kanji Sumber darah: kambing biri-biri.0 adalah toksik terhadap bakteria koliform dan dengan demikian. Media pembeza (differential) adalah media dasar atau media diperkaya yang mengandungi bahan kimia khusus yang akan bertindak ke atas sesetengah jenis bakteria melalui cara yang membolehkan bakteria berkenaan dikenali. Penghasilan H2S akan menukar ferik ammonium sitrat kepada ferik sulfida dan pembentukan warna hitam pada koloni bakteria. 45 . 2. Pada hakikatnya. arnab atau kuda. Contoh media yang mempunyai ciri pemilih dan pembeza Nama media Bahan pemilih Ciri MacConkey Potassium telurit Deoksikolat sitrat Hempedu Kalium telurit Natrium deoksikolat Fermentasi laktosa Reduksi telurit Fermentasi laktosa Kesan penghasilan H2S Fermentasi manitol – Ciri pembezaan Indikator Neutral red Kalium telurit Neutral red Ferik ammonium Sitrat Fenol merah Garam manitol Lowenstein-Jensen Natrium klorida Malakit hijau Fermentasi laktosa akan menyebabkan koloni menjadi merah atau merah jambu. misalnya dalam bentuk perubahan warna koloni (fermentasi) ataupun perubahan kepada media itu sendiri (hemolisis). Media pengaya (enrichment) digunakan untuk pemencilan (misalnya patogen usus) dengan merencat atau menekan pertumbuhan saprofit dan/atau flora normal tubuh. Contoh media diperkaya Nama media Agar darah Agar coklat Broth (atau agar) serum Agar darah triptos Agar Mueller-Hinton Bahan campuran khas Darah utuh Darah yang dipanaskan Serum Darah. Sebagai contoh. media pengaya boleh juga disifatkan sebagai media pemilih.

misalnya Proteus spp. 3. 4. 4. 7. Elakkan daripada menggoncang media agar sebelum dituangkan ke dalam plat. Sungguhpun suhu yang tinggi diperlukan untuk mencairkan agar. Pada agar yang tidak mengandungi bahan protein seperti darah. media tersebut perlulah dikeringkan terlebih dahulu kerana penginokulasian di atas media yang berkeadaan sedemikian hanya akan menyulitkan pemencilan mikroorganisma nantinya. 46 . BENTUK MEDIA AGAR Media kultur dipadatkan dengan agar dan disediakan dalam 2 bentuk. manakala pengkulturan pada cerun agar digunakan untuk ujian biokimia atau sebagai kultur simpanan. 3. Tiap-tiap bentuk agar mempunyai fungsi tersendiri. Tindakan menggoncang ini hanya akan menyebabkan pembentukan gelembung udara di dalam media dan mengakibatkan media plat yang tidak rata apabila membeku kelak. Putarkan plat supaya agar tersebar sama rata. Tatacara Menyediakan Plat Media Agar BAHAN 1. 1. Sebaliknya jika agar dibiarkan sehingga terlalu sejuk. apabila keseluruhan agar menjadi cair. bakteria dikulturkan ke atas plat media agar melalui teknik plat garisan untuk mendapatkan koloni bakteria yang terpencil. 3. akan saling bersentuhan dan bercantum semula di antara satu dengan lain. Pada keesokan harinya pastikan tiada pertumbuhan (bakteria/fungus) atau kontaminasi berlaku ke atas media. Eramkan secara terbalik dengan penutup dalam keadaan terbuka pada suhu 37°C selama semalaman. 2. Pada umumnya. Biarkan sehingga beku. 2. Jika setelah penuangan media. Koloni-koloni bakteria yang seharusnya telah terasing. NOTA Larutkan media agar berisipadu kecil di dalam bikar air mendidih dan media agar berisipadu besar di dalam penganggas air atau autoklaf. Jika didapati demikian.1. 8. Tutup plat dan simpan pada suhu 4 – 8°C jika tidak digunakan.2. Letakkan larutan media agar ke dalam penganggas air bersuhu 50°C. Semasa media agar digunakan. besar kemungkinan bahan pelengkap (supplement) ini tidak akan bercampur dengan baik dan merata di dalam media. suhu tersebut mestilah diturunkan kepada 48°C sebelum darah dan bahan lain yang tidak tahan panas dicampurkan. 5. pastikan permukaannya tidak basah.4. Media agar Bikar air yang mendidih Penganggas air Piring Petri TATACARA 1. 6. 4. 2. sebagai satu lapisan rata di dalam plat Petri (juga dipanggil ‘plat agar’/‘piring agar’) dan dalam bentuk cerun (agar cerun/ condong) di dalam tabung atau botol. apatah lagi jika di kalangan bakteria yang ingin dipencilkan terdapat spesies yang dapat bergerak atau menunjukkan kemampuan untuk menyebar (swarming). Tuangkan 15 – 20 ml agar ke dalam setiap piring Petri bergaris pusat 90 cm. segera hilangkan dengan mengarahkan/ melalukan api penunu Bunsen ke atas gelembung-gelembung tersebut sehingga semuanya terhapus/ tersingkir sebelum media menjadi beku. masih terdapat gelembung udara pada permukaan media plat. ada baiknya juga jika media agar dituangkan selepas suhu diturunkan kerana ini akan mengurangkan pemeluapan.

2.Tatacara Menyediakan Media Agar Condong/Cerun BAHAN 1. KULTUR MURNI 4. 2. Kemudian. 4. Berdasarkan teori bahawa satu koloni bakteria merupakan hasil daripada pertumbuhan yang berasal daripada satu sel bakteria.3. Plat Garisan Kultur murni adalah kultur yang mengandungi satu jenis atau spesies bakteria sahaja. misalnya ciri morfologi koloni. Setelah pensterilan. bahagi-bahagikan media berkenaan dalam isipadu yang ditetapkan ke dalam tabung atau botol yang terlebih dahulu disterilkan.1. Tutup tabung atau botol tersebut dan sterilkan. Simpan media cerun agar pada 4° – 8°C jika tidak digunakan. 3. 1. jika sesuatu bahan yang ingin dicampurkan ke dalam media adalah daripada jenis yang tidak tahan panas. 3. Ini boleh mengelakkan daripada tercemar semasa membahagikan media yang telah disterilkan terlebih dahulu ke dalam tabung atau botol. Kultur bakteria Piring Petri yang mengandungi media agar 47 . kultur murni diperolehi dengan menggunakan media padat. dengan teknik aseptik. 2. 2. Media agar untuk tujuan persiapan media agar cerun disediakan dan dibahagi-bahagikan ke dalam tabung atau botol dan kemudian disterilkan. maka satu koloni akan hanya terdiri daripada satu jenis atau spesies sahaja. maka media dalam isipadu yang besar tersebut perlu disterilkan terlebih dahulu. sungguhpun teknik aseptik diamalkan. Media agar Bikar air yang mendidih Penganggas air Tabung/botol TATACARA 1. Tatacara Plat Garisan BAHAN 1. sama ada melalui teknik plat garisan atau teknik plat tuangan (pour plate). NOTA Tuangkan 10 hingga 15 ml media agar yang telah dicairkan ke dalam setiap tabung atau botol. Bakteria daripada koloni ini kemudian boleh ditumbuhkan semula supaya semua koloni di dalam sesuatu plat terdiri daripada jenis bakteria yang sama. letakkan tabung atau botol dalam keadaan condong dan biarkan membeku pada suhu bilik. Selepas pensterilan. Teknik plat garisan merupakan teknik yang paling mudah untuk mendapatkan koloni terpisah dan terasing. 4. reaksi pewarnaan. morfologi sel. dinginkan sehingga mencapai suhu sekitar 48°C. reaksi imunologi dan kepekaannya terhadap berbagai agen antimikrob. Kultur yang sedemikian ini dikenali sebagai kultur murni dan menunjukkan pertumbuhan koloni yang morfologinya kelihatan serupa di antara satu dengan lain. Sebaliknya. Kemudian tambahkan bahan berkenaan yang steril dan campurkan dengan baik dan merata. Umumnya. biokimia. Kultur murni penting kerana ia diperlukan dalam kajian-kajian mengenai pelbagai ciri sesejenis bakteria.

Pegang dan angkat bahagian dasar plat sehingga permukaan media yang terdedah menghadap anda. 11. 3. NOTA Labelkan plat Petri yang mengandungi media pertumbuhan yang steril (pada bahagian dasar atau bawahnya dan bukan di atas penutupnya). 8. Piring Petri yang telah diinokulasi dieramkan pada suhu tertentu dalam keadaan terbalik. Pastikan juga garisan yang dibuat tersebut rapi. yang penting ialah menyentuh gelung pada permukaan media dan menggariskannya. 5. 5. 10. usahakan menggaris perlahan-lahan supaya anda tidak sampai mencungkil atau merobek media sehingga mengakibatkan media menjadi pecah-pecah. Pastikan garisan yang terakhir tidak menyentuh sebaran inokulum yang pertama. Dengan gelung dawai steril pindahkan kultur/spesimen ke atas media plat dan inokulum seluas 1 cm garis pusat. 1. Terbalikkan plat Petri yang me-ngandungi media dengan bahagian dasarnya di sebelah atas. Sterilkan gelung dawai melalui pembakaran api penunu Bunsen dan setelah sejuk. Bakar semula gelung dawai dan biarkan sejuk. Putarkan plat ~ 90 darjah dan buatkan pula beberapa garisan mengulangi prosedur di atas sehingga garisan meliputi keseluruhan kawasan permukaan media. Sebarkan inokulum seluas 1 cm garis pusat. berterusan tetapi terpisah serta tidak saling memotong atau bersilang di antara garisan atas dengan yang di bawahnya supaya mendapatkan koloni bakteria yang berasingan. Jangan bercakap semasa melakukan prosedur ini untuk mengelakkan semburan air liur terjatuh ke atas permukaan media agar.3. 6. 2. Garisan seterusnya bermula daripada kawasan di sekitar penghujung garisan-garisan pertama. Piring Petri yang telah diinokulasi dieramkan secara terbalik supaya sebarang pemeluapan yang berlaku pada penutupnya tidak akan menitis ke atas kultur. 4. 6. Gunakan penghujung gelung dawai sahaja untuk menyentuh permukaan media supaya mendapatkan garisan yang halus dan tipis. Letakkan plat Petri tersebut dengan bahagian dasarnya di sebelah atas. 9. 2. 4. Bekerjalah berdekatan dengan sumber api. Bermula daripada sebaran di atas gariskan inokulum dengan menggerakkan gelung bolakbalik supaya garisan meliputi satu kawasan seluas kira-kira sepertiga daripada plat. ambil spesimen dengannya. Gelung dawai Penunu Bunsen TATACARA 1. Gelung dawai dibakar semula selepas garisan dibuat pada bahagian pertama piring Petri supaya inokulum (jumlah bakteria) dikurangkan. 7. 3. 48 . 4. Letakkan gelung yang mengandungi spesimen di atas permukaan media agar kira-kira 1 cm daripada dinding plat Petri tersebut. maka koloni bakteria yang terpisah akan didapati. Dalam membuat garisan.

Koloni bakteria biasanya diamati berdasarkan pertumbuhannya di atas media padat. Putarkan plat 60-90 darjah dan buatkan pula beberapa garisan. ciri genetik dan antigenik bakteria berkenaan. Seperti juga ciri-ciri morfologi sel bakteria.1.1 Cara melakukan plat garisan 4. ciri-ciri koloni bakteria dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti jenis media.4. Pinggiran/konfigurasi (ditentukan dengan mikroskop): Menyeluruh Beralun Lobate Erose 49 . Ulangi kaedah ini sehingga garisan meliputi keseluruhan kawasan permukaan media. umur kultur. suhu pertumbuhan. strain bakteria dan semua keadaan ini biasanya diambil kira dan dinyatakan semasa menghurai sesuatu koloni bakteria. 1.Gariskan inokulum secara bolek-balik bermula daripada sebarannya sehingga meliputi kira-kira sepertiga kawasan plat. CIRI-CIRI KOLONI BAKTERIA Kajian mengenai koloni bakteria adalah penting kerana ia boleh memberikan maklumat lanjut mengenai identiti. aktiviti biokimia. RAJAH 4. Bentuk: Bulat Tidak teratur Berfilamen Berserabut Bertitik bujur 2.

Pertumbuhan yang nipis seperti membran. Berkerut 5. Seperti mentega atau lekit. Permukaan: Elevasi Datar Menaik Cembung Umbonat Pulvinat Cembung papilat Cembung berkerut 4. Batasan secara radial : permukaan berbatas-batas yang terpancar dari tengah-tengah koloni. Likat: Pertumbuhan mengikut bekas garisan dawai inolukasi. 7. Ciri optik: Luster Legap Lutsinar Opalesens : Iridesens Pudar Berkilat Fotogenik – memancar di dalam gelap. Pendaflour – satu warna dengan cahaya transmisi dan warna lain (yang cerah dan terserlah) dengan cahaya pantulan (berpendafluor).3. Permukaan: Konsistensi Kelihatan kering & rapuh. Bergelung Berfilamen Bergranul 50 . Permukaan: Tekstur Licin Kasar Berkontour : permukaan licin dan undulat (beralun) secara tak teratur. Struktur dalam (ditentukan dengan mikroskop): Seperti warna baiduri (warna putih-kebiruan atau warna susu dengan ciri warna yangkekilatan berubah-ubah) : Warna yang berubah dengan sudut (posisi) koloni dipandang. 6.

Justeru itu ia tidak dapat tumbuh dalam keadaan kehadiran oksigen dan kemungkinan akan mengalami kematian apabila terdedah kepada gas berkenaan. irregular rhizoid punctiform entire indulate curled flat raised convex imbonate pulvinate convex papillate convex rugose radially ridged rugose brittle butyrous dull glistening. Ada bakteria yang hanya boleh menggunakan oksigen bebas sebagai penerima akhir hidrogen (aerob obligat).5. Sebaliknya. apabila ditumbuhkan dalam kehadiran udara (oksigen). Bakteria golongan ini melakukan fermentasi meskipun dalam kehadiran oksigen. metabolismenya akan berubah kepada keadaan aerobik dan 51 . osmolariti media dan kepekatan ion hidrogen (pH).8. aras oksigen. pengkulturan bakteria di dalam makmal hanya dapat dicapai jika keadaan alam persekitarannya dapat diwujudkan. Terdapat pula segolongan bakteria yang dinamakan aerotoleran kerana berkeupayaan untuk tumbuh di dalam udara. terdapat juga bakteria yang sama sekali tidak dapat menggunakan oksigen sebagai penerima akhir hidrogen (anaerob obligat). maka bakteria dari lingkungan yang berbeza memerlukan keadaan sekeliling yang berbeza pula untuk pertumbuhan yang optimum. beberapa faktor lain di alam sekeliling juga mempengaruhi pertumbuhan dan tumbesarannya. Faktor ini termasuk suhu pengeraman. Perubahan kepada media Hemolisis (pada agar darah) Penghasilan pigmen Perubahan kepada media pembeza Penghasilan bau atau aroma Istilah Bahasa Malaysia dan Istilah Bahasa Inggeris dalam pencirian koloni bakteria tidak teratur berserabut bertitik menyeluruh beralun keriting datar menaik cembung imbonat pulvinat cembung papilat cembung berkerut batasan secara radial berkerut rapuh seperti mentega/lekit pudar berkilat 4. Pengeraman Bakteria dalam Keadaan Anaerobik Pada bakteria heterotrof. air. Sekumpulan besar bakteria mempunyai sistem enzim yang boleh menggunakan oksigen atau terbitan organik sebagai penerima akhir hidrogen (aerob fakultatif atau anaerob fakultatif). Di samping pengaruh kandungan media ke atas pertumbuhan bakteria. Oleh yang demikian. sungguhpun ia tidak menjalankan metabolisme oksidatif. Bakteria jenis ini boleh tumbuh secara anaerobik dan dalam keadaan ini akan memfermentasi karbohidrat dengan menghasilkan produk fermentasi seperti berbagai-bagai jenis asid. Walau bagaimanapun.1. glossy KEADAAN PERTUMBUHAN BAKTERIA DI DALAM MAKMAL Oleh kerana penyesuaian bakteria kepada alam sekelilingnya. Oleh yang demikian ia hanya dapat tumbuh dalam kehadiran oksigen. tenaga yang digunakan untuk menjalankan proses biosintesis berpunca daripada tindakan oksidatif ke atas bahan organik.

3. 2. Balang anaerobik (plastik atau logam)/bekas berbentuk silinder Tangki silinder gas campuran (N285%. Eramkan keseluruhan balang bersama isi kandungannya di dalam inkubator 37°C semalaman. 4. Tetapi masa kehilangan warnanya dicapai lebih lewat daripada pencapaian keadaan anaerobik di dalam balang. 6. Tatacara Mewujudkan Keadaan Anaerobik dengan Pengisian Gas Nitrogen ke dalam Balang Anaerobik BAHAN 1. Dalam keadaan tanpa oksigen metilena biru akan menghilangkan warnanya. Potong salah satu sudut atas paket GasPak dan letakkan sampul GasPak secara menegak di sebelah susunan plat. Pasang alat pencengkam penutup supaya balang tertutup dengan rapi dan rapat sehingga tidak dapat ditembusi udara. 7. H2 10%) 52 . 5. Mangkin ini kemudian disimpan di dalam tempat kering atau balang pengering (desikator). Letakkan indikator redoks (oksidasi-reduksi) di sebelah susunan plat. Balang anaerobik (jenama GasPak) Satu paket GasPak Pipet Air Penunu Bunsen Satu pek katalis Indikator redoks TATACARA 1. CO2 5%. Tatacara Mewujudkan Keadaan Anaerobik di dalam Balang Anaerobik dengan GasPaktm BAHAN 1.karbohirat umumnya akan dioksidasi kepada air dan CO2. 4. Masukkan 10 ml air paip ke dalam GasPak dengan pipet. Terdapat segolongan bakteria lagi yang menunjukkan pertumbuhan optimum pada kadar oksigen yang rendah dan bakteria ini dikenal sebagai mikroaerofilik. Katalis – biji-biji aluminium disaluti paladium GasPakTM – kit penjana/pembebas hidrogen NOTA 1. 5. 8. 2. Masukkan media plat yang telah diinokulasi ke dalam balang. 6. pastikan proses ini dilakukan jauh dari gas yang boleh meletup. Balang jenama GasPak menggunakan katalis atau mangkin ‘sejuk’ yang tidak perlukan dipanaskan sejurus sebelum GasPak digunakan. 3. 2. 7. 2. Kemudian lekapkan penutup tepat pada kedudukannya menutupi mulut balang. Gunakan balang anaerobik yang sedia dilengkapi dengan 1 pek mangkin aktif yang dilekatkan kepada penutupnya. Butir-butir mangkin yang terpakai dipulihkan kepada aktiviti penuh dengan dipanaskan di dalam ketuhar pada suhu 160-170°C selama 2 jam. 3. Indikator redoks metilena biru digunakan untuk memastikan keadaan anaerobik dicapai. Pada balang anaerobik yang menggunakan mangkin yang perlu dipanaskan dengan arus elektrik atau api.

Buka kepala salur gas kedua ini dan salurkan gas ke dalam balang sehingga terisi penuh kemudian tutup dengan rapat. Nyalakan lilin tersebut dan masukkannya ke dalam bekas. Bekas logam dengan penutup berbentuk bulat (tin susu tepung) Sebatang lilin Slaid mikroskop TATACARA 1. 5. Tutup rapat kepala salur gas pertama ini dan sambungkan sebuah tiub pada kepala kedua yang menghubungkannya dengan tangki silinder gas campuran. Tempatkan lilin berjauhan dengan piring Petri yang mengandungi media yang telah diinokulasi. 3. 2. Keadaan atmosfera yang dicapai di dalam balang lilin adalah CO2 5%. 4. 2. Instrumentasi adalah di luar skop buku ini dan haruslah mengikuti arahan dengan teliti di dalam buku operasi (manual) yang dibekalkan 53 . Masukkan media plat yang telah diinokulasi ke dalam bekas ini dan kemudian tutup rapat dengan bantuan pencengkam penutup tersebut. 2. Penutup bekas yang digunakan mesti berbentuk bulat kerana bentuk ini mempastikan ia tidak ditembusi udara. Eramkan balang bersama isi kandungannya di dalam inkubator 37°C selama semalaman. Lekatkan sebatang lilin kepada sebuah slaid kaca mikroskop. NOTA Gunakan balang anaerobik yang terpakai (atau bekas plastik berbentuk silinder yang mempunyai dua lubang kecil pada penutupnya). 3. Prosedur ini akan mengelakkan kemungkinan lilin yang sedang menyala daripada terjatuh dari tempatnya semasa tin dipindahkan. 4. Buka salah satu kepala salur gas dan hubungkan dengan tiub ke sebuah pam vakum dan kemudian sedut keluar udara di dalam balang sehingga terbentuk ruang hampa gas sepenuhnya. 3. 2. Tanggalkan semua tiub penyambung pada balang dan tutup lubang kepala salur gas dengan pita selofan. Tatacara Balang Lilin dalam Pengeraman Kultur dalam Keadaan Atmosfera Karbon Dioksida BAHAN 1. Tutup tin dengan rapat dan biarkan sebentar sebelum tin dieramkan supaya lilin terpadam dengan sendirinya. Tatacara Menggunakan Inkubator Karbon Dioksida dalam Pengeraman Kultur dalam Keadaan Atmosfera Karbon Dioksida Inkubator CO2 merupakan suatu alat yang lumrah didapati di makmal mikrobiologi. 3. 7. 6.TA TACARA 1. Pastikan saiz tin yang digunakan tidak terlalu kecil supaya terdapat sedikit ruangan untuk menempatkan lilin yang menyala pada jarak yang agak berjauhan dengan piring Petri. NOTA 1. Gunakan tin dengan penutup berbentuk bulat supaya tin dapat ditutup dengan rapat. Dengan adanya alat ini pengeraman kultur bakteria (ataupun kultur sel) di dalam atmosfera CO2 adalah lebih mudah dilakukan di samping kehadiran ruang yang boleh memuatkan lebih banyak kultur.

3. Agar infusi otak dan jantung dicampur 5% darah kambing biri-biri merupakan sejenis media yang diperkaya dan digunakan untuk pemencilan Histoplasma dan Nocardia.6. Pengkulturan Candida albicans di dalam serum lembu misalnya boleh menunjukkan penghasilan tiub germa oleh yis berkenaan. Alat inkubator CO2 yang mempunyai jaket air adalah lebih cekap dalam menstabilkan suhu dan melambatkan penurunan suhu jika bekalan elektrik terputus. MEDIA KULTUR Media kultur utama yang digunakan untuk kultur primer fungus (pengkulturan daripada spesimen klinikal) adalah agar dekstrosa Sabouraud (SDA ) yang merupakan sejenis media dasar seperti juga agar nutrien. manakala koloni berhifa atau miselium seperti kapas atau permaidani pada permukaan media. 6.2. 4. Alat inkubator CO2 yang lebih moden mempunyai mekanisme yang menghentikan bekalan gas ini secara automatik semasa pintu dibuka dan menyambungnya semula hanya apabila pintu ditutup semula. 54 .1. Ini memberi peluang yang lebih baik kepada fungus patogenik untuk tumbuh.2. sungguhpun terdapat banyak juga fungus patogenik yang terhalang pertumbuhannya. 4. aras CO2 ditetapkan pada 7% dan kultur sel 5%. Pengkulturan fungus ke atas plat agar boleh menonjolkan dua bentuk ini iaitu koloni yis kelihatan bulat dan agak lekit. Pada kultur bakteria. ia lebih sesuai bagi inkubator yang kerapkali dibuka. 2. 5.2. Sistem ini mengelakkan pembaziran gas. Ini merupakan suatu ujian diagnostik. kecuali Histoplasma capsulatum dan beberapa strain aktinomiset seperti Nocardia asteriodes. Pastikan juga terlebih dahulu apa yang akan dikeluarkan daripada inkubator CO2 atau dimasukkan supaya dapat mengurangkan lamanya ia dibuka. Alat inkubator CO 2 yang mempunyai sensor jenis inframerah membolehkan paras CO2 di dalam inkubator kembali ke paras asalnya dengan lebih cepat berbanding dengan sensor jenis konduktiviti termal (haba). Oleh yang demikian. 4. Jangan gunakan inkubator CO2 yang sama untuk kultur bakteriologi dan kultur sel untuk mengelakkan pencemaran bersilang. PENGKULTURAN FUNGUS 4. Apa yang akan dibentangkan di sini hanyalah beberapa nota mengenai jenis inkubator CO2 dan penggunaan alat ini. Media ini biasanya digunakan untuk pengkulturan dermatofit dan Candida albicans kerana spesies-spesies ini tidak sensitif terhadap kedua-dua jenis agen antimikrob tersebut. Media padat ini terdiri daripada dekstrosa 4%. Rancangkan terlebih dahulu dalam tempoh masa kerja. Keadaan pH asid dan tanpa bahan yang kaya menghalang pertumbuhan kebanyakan jenis bakteria tetapi membenarkan pertumbuhan fungus. sama ada kontaminan (fungus saprofitik daripada alam sekitar) atau fungus patogenik.05% dan Chloramphenicol 0. Pada fungus berfilamen.005% mengurangkan pencemaran oleh bakteria dan fungus bukan patogenik.5-2% dan mempunyai pH asid 5. 7.2. Media agar ini boleh dibekukan di dalam piring Petri atau tabung uji. pepton 1% yang sesuai untuk fungus dan agar 1.bersama-sama dengan alat ini. apa yang akan disimpan atau dikeluarkan daripada inkubator CO 2 ini supaya dapat mengelak daripada terlalu kerap membukanya. Agar dekstrosa Sabouraud yang dicampurkan dengan cycloheximide 0. pengamatan kultur secara in situ dapat dilakukan dengan teknik kultur slaid. NOTA 1. PENGKULTURAN FUNGUS Fungus wujud dalam dua bentuk: yis dan hifa atau miselium.

4. manakala di bahagian pertengahannya pula mungkin sudah agak tua dan ‘steril’. 3. 4. 4. 10. Cungkilkan sedikit kultur dan letakkan inokulum ini di tengah-tengah plat agar atau tabung cerun agar. pertumbuhan fungus adalah lebih lambat. 2. 2. perlulah diingat bahawa dalam hal ini. penginokulasian kultur disarankan dilakukan di dalam kabinet “biohazard” kelas 2 yang memberi perlindungan kepada pengguna. Kultur koloni fungus Plat agar/cerun agar Jarum inokulasi Penunu Bunsen TATACARA 1. fungus yang dikulturkan serta alam sekeliling. 6. Eramkan pada suhu 30°C dan/atau 37°C selama 4 minggu. Kultur fungus Agar dekstrosa atau agar dekstrosa kentang Piring Petri Balang alkohol Penunu Bunsen Sebatang kaca berukuran 6 cm Penutup slaid Slaid mikroskop Air suling (steril) Pisau pembedahan (steril) Dawai inokulasi lurus 55 . 7. 3. Sungguhpun suhu bilik (25°C) digunakan sebagai suhu pengeraman oleh beberapa makmal. 2. 11.1. 8. Masukkan jarum ke dalam koloni fungus pada tapak di antara tengah dan tepi koloni fungus. 2. Inokulum daripada tapak di antara pertengahan dan tepi koloni yang diambil. NOTA Sterilkan jarum inokulasi dengan pembakaran api penunu Bunsen. Tatacara Membuat Kultur Slaid BAHAN 1. atau tidak mengandungi spora atau badan pembuahan (fruiting body) lagi. 5.Tatacara Penginokulasian Plat Agar dengan Kultur Yis Tatacaranya adalah seperti yang dilakukan dengan bakteria iaitu melalui teknik garisan ke atas plat (sila rujuk bahagian 4. 9. Untuk mengelakkan pencemaran oleh fungus khususnya dari udara. 3. 3.3) NOTA Kultur fungus dalam bentuk yis dieramkan pada suhu 37°C. 1. kerana koloni yang di tepi mungkin terlalu muda dan belum bersporulasi atau membentuk spora. Tatacara Penginokulasian Plat Agar dengan Kultur Berfilamen BAHAN 1.

7. Masukkan 1 koloni yis ke dalam serum dan leraikan sel-sel dari koloni dengan menggoncanggoncangkan jarum inokulasi di dalam serum. Inokulasi fungus dengan menyentuh keempat-empat sudut ketulan agar. Sterilkan sekeping slaid mikroskop dengan pembakaran alkohol dan letakkannya di atas batang kaca berbentuk ‘V’. 2. Kultur yis Tabung uji Penganggas air Jarum inokulasi Slaid mikroskop Penutup slaid Serum lembu (steril) TATACARA 1. 6. Dalam penyediaan pelekapan basah. pastikan jarum dimasukkan tepat ke dalam koloni supaya inokulum mengandungi bahagian vegetatif fungus bersama bahagian aerialnya (yang mengandungi spora). 5.TATACARA 1. Apabila struktur reproduktif mulai terlihat. 56 . penutup slaid dan jarum inokulasi disterilkan dengan pembakaran api atau alkohol. Masukkan 0. Tuangkan sekitar 5 ml air suling steril ke dalam piring Petri ini untuk memberikan kelembapan yang berterusan semasa pengeraman kultur. 12. NOTA 1. 10. 2. Letakkan piring Petri di atas pentas mikroskop dan amati pertumbuhan fungus dari masa ke masa. Pastikan air di dalam piring Petri yang memberikan kelembapan kepada atmosfera ruangan kultur slaid sentiasa ada dan tidak sampai kering dan tambah jika perlu. jangan tekan penutup slaid kerana ini boleh mengakibatkan struktur konidia terpisah daripada hifa. Bengkokkan batang kaca itu sehingga mencapai bentuk ‘V’ dan biarkan sehingga sejuk di udara. 6. 3. agar dekstrosa kentang) berukuran 1 cm persegi dan letakkan di atas slaid.5 ml serum lembu (steril) ke dalam satu tabung uji. slaid mikroskop. 14. lepaskan penutup kaca (yang mempunyai pertumbuhan fungus pada permukaannya) daripada ketulan agar dan amati dengan sediaan pelekapan basah lactophenol cotton blue. 4. Semasa pengambilan inokulum. 3. 11. Tunggu sehingga objek yang disterilkan menjadi sejuk sebelum meneruskan dengan prosedur selanjutnya. Sterilkan batang kaca ini dengan pembakaran alkohol. 4. Amati juga fungus yang tumbuh pada permukaan slaid dengan pelekapan basah lactophenol cotton blue. 4. Tutup plat Petri dan eramkan pada suhu bilik. Sterilkan sekeping kaca penutup slaid dengan pembakaran alkohol dan letakkan di atas permukaan ketulan agar. 3. Tatacara Kultur yang Merangsang Penghasilan Tiub Germa BAHAN 1. 4 objek iaitu batang kaca berbentuk ‘V’. 2. 2. 8. Biarkannya sejuk dan letakkan di dalam sebuah piring Petri. Tekan kaca penutup slaid supaya terdapat kontak yang baik di antara permukaan agar dan penutup tersebut. 5. 13. 9. Potong seketul agar (agar dekstrosa. 7. Dalam tatacara ini. Bakarkan sebatang kaca berukuran 6 cm di bahagian tengahnya sehingga menjadi lembut.

Tofografi: Mendatar dan berlipat secara terpencar Mendatar dan tepian bulat menyeluruh 57 . adalah penting jenis media pertumbuhannya juga disebutkan kerana fungus boleh mempamerkan ciri yang berbeza-beza menurut jenis media yang digunakan. dan amati penghasilan tiub germa di bawah mikroskop. PERHATIAN Tiub germa akan kelihatan sebagai filamen yang muncul daripada blastospora tanpa adanya penyempitan mahupun pembengkakan pada bahagian-bahagian tertentu di sepanjang filamen tersebut. kerana ini akan menyebabkan terjadinya aerosol yang mengandungi spora fungus yang akan bertebaran di udara dan boleh tersedut oleh bukan sahaja orang yang sedang mengkajinya.3. 2 jam dan 3 jam. Bagi sesetengah individu ini boleh menimbulkan alahan yang serius. Walau bagaimanapun.3. Di samping jenis media. PERHA TIAN Dalam pengamatan fungus pada kultur plat agar. Dalam catatan mengenai morfologi koloni fungus. Pigmentasi pada permukaan fungus biasanya dihasilkan oleh spora dan hifa. Dengan penyempitan Tanda penyempitan NOTA 1. CIRI-CIRI KOLONI FUNGUS 4. manakala pigmentasi pada bahagian dasar koloni ditentukan melalui pigmen hifa vegetatif dan pigmen larut yang meresap ke dalam agar. di dalam struktur itu sendiri. Buat pelekapan basah selepas 1 jam. pigmentasi pada fungus sering kali tidak digunakan sebagai ciri pengesahan utama spesies-spesiesnya kerana ciri ini umumnya tidak stabil atau berubah. Eramkan pada suhu 37°C selama 3 jam di dalam penganggas air. sekalipun daripada strain yang sama. tetapi juga mereka yang berada di dalam ruangan yang sama. Serum yang digunakan kali pertama harus diuji dengan suatu strain Candida albicans yang telah dipastikan boleh mengeluarkan tiub germa.2. 2. beberapa faktor lain seperti suhu pengeraman dan umur koloni juga mempengaruhi tekstur koloni fungus. Morfologi Keseluruhan Koloni Fungus 1. seboleh-bolehnya elakkan daripada membuka penutup Petri/botol. Pastikan ampaian yis yang disediakan tidak tebal kerana inokulum yang besar akan mengurangkan bilangan sel yang menunjukkan tiub germa (105 – 106 sel/ml adalah kepekatan optimum). 4.

Mendatar dan berlipat tak teratur Mendatar dan tepian bergerigi Bertimbun dan ala-tombol Bertimbun dan bahagian tengahnya tertekan Menaik ala-butang Kraterforme hingga ke bentuk plikatil Berkerut Serebriforme (serupa otak) 2. Tekstur: Krim (seperti rupa koloni yis) seperti tekstur lilin Berserbuk Berkapas Bergranul (berpasir/berbutir) seperti baldu 3. Pigmentasi: (permukaan dan dasar koloni) Berbeza bergantung kepada umur dan jenis fungus Istilah Bahasa Malaysia – Bahasa Inggeris tepian bulat menyeluruh tepian bergerigi berlipat tak teratur tengahnya tertekan ala-tombol ala-butang menaik ala-tekstur lilin ala-baldu entire edge fringed edge irregular folding depressed center knob-like button-like raised glabrous velvety 58 .

Serum Jenis serum yang diperlukan bergantung kepada jenis kultur sel. maka ia dipilih dan diutamakan daripada bentuk lainnya. Oleh itu kita perlu menumbuhkan sel-sel tertentu terlebih dahulu untuk dijadikan kultur bagi pembiakan virus. Labelkan nombor pengeluaran (batch number). tekanan osmotik dan membekalkan tenaga. 2. Simpan beku.2 µm. Aspek-aspek mengenai pertumbuhan sel secara in vitro ini dikenal se-bagai kultur sel. Antibiotik juga dicampurkan ke media untuk mengawal daripada pencemaran serta pertumbuhan mikrob.1. Gunakan serum fetus lembu kerana serum ini berbeza dengan serum lembu dewasa atau anak lembu. ia terlebih dahulu dilarutkan di dalam air suling supaya mencapai kepekatan 5X atau 10X.3. serum lembu yang menjadi pilihan. Dalam kebanyakan kultur sel. Media mesti disterilkan melalui penyaringan dengan penyaring membran berukuran liang 0. seharusnya pada suhu – 20°C. Serum (biasanya serum lembu) diperlukan untuk pengkulturan sel dan sistem fisiologik ini memerlukan suatu sistem pengawalan pH iaitu sejenis larutan tampan. pada suhu – 20°C jika boleh. Media ini mengekalkan pH. Pastikan sampel dari sesuatu botol itu steril dan dapat menampung pertumbuhan kultur sel dengan baik dengan membandingkannya dengan serum yang diketahui memberikan hasil yang baik. Agih-agihkan media ini dalam isipadu 10 atau 20 ml di dalam botol universal dan simpan beku. Jika media berbentuk serbuk. Pastikan serum fetus lembu yang diperolehi mempunyai jangka hayat simpanan yang panjang. 1. Media Maklumat tentang kesesuaian sesuatu media untuk sesejenis kultur sel boleh didapati dari buku maklumat yang dikeluarkan oleh syarikat yang memasarkan media kultur berkenaan atau dari artikel jurnal. PENGKULTURAN VIRUS Berbeza dengan bakteria dan fungus. Agihkan ke dalam isipadu 10 atau 20 ml. terutama disebabkan ia bebas daripada antibodi yang mungkin dapat menghalang pengkulturan virus dalam kultur sel. Eramkan serum lembu di dalam penganggas air pada suhu 50°C selama 30 minit untuk menghapuskan bahan atau faktor-faktor yang terdapat di dalamnya yang boleh menghalang pertumbuhan sel apabila digunakan nanti.3. Oleh demikian. Media yang pekat boleh disimpan di dalam bekas-bekas yang lebih kecil. Fenol merah digunakan sebagai penunjuk pH. Larutan ini dicampurkan dengan asid amino dan vitamin serta glukosa sebagai sumber tenaga. 59 . Pastikan semua media serbuk dilarutkan sehingga kelihatan betul-betul jernih. Jika sesuatu jenis media yang berkepekatan 10X didapati dalam bentuk cecair. 4. dan tarikh diagihkan.4. Apabila hendak digunakan media dikeluarkan dari simpanan dan biarkannya pada suhu bilik buat seketika dan kemudian buatkan suatu pencairan berkepekatan 1X dan campurkan bahan-bahan yang diperlukan untuk pertumbuhan. Media ini umumnya didapati dalam bentuk serbuk atau cecair dan dalam kepekatan 1X atau 10X. virus hanya boleh beraplikasi di dalam sel hidup. sel yang dapat ditumbuhi dan dibiakkan in vitro boleh merupakan suatu sumber ‘media’ untuk pembiakan virus. KULTUR SEL DALAM VIROLOGI Media Kultur Sel Semua media yang digunakan dalam kultur sel atau tisu pada asasnya mengandungi suatu campuran tiruan yang terdiri daripada garam-garam tak organik yang disebut larutan garam seimbang atau larutan garam fisiologik.

Antibiotik Antibiotik dicampurkan ke media kultur untuk menghalang pertumbuhan mikrob. Larutan antibiotik dicairkan 1:100 di dalam media. Biarkan reagen yang disimpan beku seperti media. 5. Saringkan dengan menggunakan penyaring membran berukuran liang 0.2 hingga 7. 3. gunakan pipet steril untuk memindahkannya). Sistem Penampan pH yang Digunakan di dalam Media Kultur Sel Pertumbuhan sel haiwan di dalam media kultur sel yang lengkap biasanya adalah optimum apabila media ditampan dalam julat pH 7. Gentamicin adalah agen antibakteria berspektrum luas (aktif terhadap bakteria Gram-positif dan Gram-negatif) dan berkesan terhadap mikoplasma. Persediaan Natrium Bikarbonat Larutkan 5. Untuk kedua-dua jenis antibiotik ini. 2. Lapkan permukaan luar setiap bekas dengan tuala kertas sehingga kering.6g NaHCO 3 di dalam 95.5 ml fenol merah 0.2 µm atau diautoklaf pada 20 tekanan paun setiap inci (pound per square inch: psi). Tatacara dalam Persediaan Media Kultur Sel BAHAN 1. Simpan pada suhu bilik. 3. 4.4%.0 ml dan disimpan beku. Jika natrium bikarbonat diperlukan juga sebagai nutrien maka kepekatannya seharusnya tidak melebihi 10 mM (0. Media kultur sel Serum fetus lembu Antibiotik (Gentamicin dan Amphotericin B) NaHCO3 Air suling (steril) Bekas (steril) Pipet bersukat (steril) TATACARA 1.2 µm. 7. Kepekatan natrium bikarbonat yang digunakan adalah bergantung kepada jenis media. 2. Kedua-dua agen antimikrob ini disediakan dalam kepekatan 100X di dalam air suling steril (jika dibekalkan dalam bentuk serbuk).3. Larutan tampan HEPES (asid N-2-Hidroksietilpiperazin-N’-2-etanasulfonik) yang berfungsi sebagai zwitterion juga boleh digunakan sebagai larutan penampan menggantikan natrium bikarbonat dalam sistem terbuka dan ia digunakan pada kepekatan mutlak 20 mM. Kepekatan yang sesuai digunakan adalah Gentamicin 30 µg/ml dan Amphotericin B 5 µg/ml. Antibiotik yang sesuai adalah Gentamicin dan Amphotericin B (Fungizone).4.85 g/l). Amphotericin B adalah agen antifungus. Larutan penampan pH yang sering kali digunakan di dalam media kultur sel adalah natrium bikarbonat. Tuangkan media ke dalam 1 botol steril jika kesemua kandungannya diperlukan (jika hanya sebahagian sahaja media yang diperlukan. 4.5 ml air suling dan campurkan 0. Gaskan dengan CO 2 sehingga warna media menjadi oren. 6. Agih-agihkannya ke dalam botol yang kemudian ditutup rapat. Jangan masukkan ke dalam penganggas air untuk mengelakkan pencemaran. diagih-agihkan dalam isipadu 1. 60 . Larutan natrium bikarbonat disterilkan melalui penyaringan ataupun diautoklaf. disaring melalui penyaring dengan saiz liang 0. Larutan penampan ini digunakan dalam sistem tertutup (bekas kultur ditutup rapat) yang diseimbangkan dengan udara atau sistem terbuka (seperti piring Petri) yang diseimbangkan dengan atmosfera yang mengandungi kadar CO 2 yang tinggi seperti di dalam inkubator CO2. gunakan gred yang ditentukan khusus untuk kultur sel. 5. Adalah sesuai jika ia disediakan dalam kepekatan 10X yang seterusnya hanya perlu dicairkan menjadi 1X apabila hendak digunakan nantinya di dalam media lengkap. serum dan antibiotik mencair pada suhu bilik di atas meja.

Biasanya media pertumbuhan memerlukan 5 – 10% serum dan media pengekal 0 – 2%. 61 . Sterilkan dengan menggunakan penyaringan membran dengan liang 0. 7. 12. 10. 5. TRIPSINISASI Tripsinisasi adalah proses peleraian tisu atau sel selapisan kepada sel-sel individu menggunakan enzim tripsin. asid amino ini perlulah ditambahkan ke dalamnya jika media tersebut disimpan lebih daripada 2 minggu. salah satu komponen sesetengah media. 6. bagi media yang seharusnya mengandungi L-glutamina. L-glutamina. Oleh yang demikian. 6. 2. 8. N OTA 1.0 % tripsin dan 0. Campurkan isipadu air suling yang diperlukan diikuti dengan larutan penampan dan antibiotik. PERHATIAN Persediaan ini dilakukan dengan menggunakan kabinet aliran udara laminar kelas 1 atau kelas 2. Simpan pada suhu 4°C. Ini bukanlah suatu pencemaran. 11. goncangkannya terlebih dahulu untuk menentukan kehadiran pencemaran yang berat yang ditandai dengan kekeruhan pada media tersebut. Serum yang dibeku dan dicairkan kadangkala mengandungi serpihan-serpihan yang mendap di dasar botol. Campurkan serum supaya mencapai peratus kepekatan yang diperlukan.4% versena di dalam PBS. Sebelum media digunakan. 3. 5. 9. Seluruh haiwan atau tisu Gunting 2 pasang Gunting bengkok dan tajam Alat pengaduk magnet Magnet disaluti silikon/teflon Kelalang kon Larutan tripsin-versena Etanol 70% Larutan salin ditampan fosfat (phosphate buffered saline: Gentamicin dan Fungizone 5 µg/ml Penyaring kasar (steril) Mikroskop cahaya jenis terbalik Bekas kultur sel PBS) yang mengandungi 30 µg/ml PERSEDIAAN 1. Tatacara untuk Tripsinisasi Tisu Seluruh BAHAN 1. Campurkan kedua-dua jenis larutan ini dalam isipadu yang sama. Larutan tripsin dan versena Larutkan 1.2 µm. Simpan media pertumbuhan atau pengekal pada suhu 4°C. 7. 4. tetapi seboleh-bolehnya elakkan daripada menggunakannya. adalah tidak stabil dalam bentuk cecair. Tempoh simpanan media yang mengandungi serum adalah 4 minggu. 2.4.

Tambahkan air suling sehingga mencapai satu liter. Emparkan suspensi sel pada 400 g selama 15-30 minit dan leraikan mendapan sel di dalam media yang sesuai dan lakukan perhitungan hidup.PBS tanpa kalsium dan magnesium 2. 1.15g Na2HPO4. N OTA 1. Dalam pilihan kedua. Bunuh haiwan yang berkenaan dan letakkan menelentang supaya bahagian tubuh atau tapak di mana pembedahan akan dijalankan terdedah. manakala majoriti akan melekat pada permukaan bekas kultur dan tumbuh membentuk satu lapisan sel.2% PBS tanpa kalsium dan magnesium (steril) 62 . TATACARA 1. Semua alat dan reagen yang digunakan disterilkan terlebih dahulu.25% dan versena 0. Tuangkan larutan tripsin 10 minit selepas proses ini bermula. Suhu 37°C dapat dicapai dengan melakukan proses peleraian di dalam bilik panas atau dengan menggunakan alat pengaduk magnet yang juga berfungsi sebagai plat pemanas. 2. 0. 2. Ubah kepekatan sel menjadi 2 x 10 5 sel/ml media pertumbuhan dan kulturkan di dalam bekas kultur. Pindahkan potongan tisu ke dalam sebuah kelalang kon yang mengandungi magnet yang disaluti teflon atau silikon. Lap kulit bahagian yang terdedah ini dengan etanol 70% dan bedah/potong untuk mendapatkan organ yang diperlukan. Masukkan larutan tripsin-versena (lebih kurang 20 ml setiap 1g tisu). Goyang piring Petri perlahanlahan untuk membersihkan potongan-potongan tisu. 11.0g NaCl. Larutkan 8. Masukkan PBS yang mengandungi antibiotik dan antifungus. Tambahkan tripsin baru dan aduk semula. 9. Campuran tripsin 0. Sebelum sel ini boleh dipindahkan ke tempat lain atau separuh daripadanya dikeluarkan untuk mengelak kesesakan yang akan menghalang pertumbuhan dan menjejaskan keupayaannya untuk hidup (viabilitinya). Elakkan daripada terjadinya pembentukan buih (frothing) semasa tisu diaduk. Agih-agihkan larutan ini ke dalam botol dan sterilkan dengan autoklaf pada 10 psi (suhu mencapai aras 115°C) selama 15 minit.2g KH2PO4 di dalam 950 ml air suling. sel mestilah ditanggalkan dari permukaan bekas kultur. Tatacara untuk Tripsinisasi Sel Selapisan dan Pengeraman Kultur Sel BAHAN 1.2g KCl. 4. 6. Aduk kandungan kelalang dengan pengaduk magnet pada suhu 37°C. 8. Keluarkan organ dan letakkan di dalam piring Petri di mana ia dipotong menjadi serpihanserpihan kecil berukuran 2 mm3. 10. Saring suspensi sel melalui penyaring kasar untuk memisahkan sel-sel dari serpihan tisu-tisu besar. Aturkan nilai pH larutan kepada 7. 0. Tripsinisasi Sel Selapisan dan Pengeraman Kultur Sel Sesetengah jenis kultur sel wujud sebagai suspensi di dalam bekas kultur. 3. 5.3. Tatacara berikut dilakukan dalam keadaan aseptik dengan menggunakan peralatan yang steril. Tambahkan tripsin baru setiap kali ini dilakukan. 3. 2. kelalang tidak diletakkan secara langsung di atas plat pemanas tetapi dimasukkan ke dalam sebuah bikar berisi air yang ditempatkan di atas plat pemanas tersebut. Simpan pada suhu bilik. Dari masa ke masa tuangkan sel yang telah dileraikan daripada tisu dan simpan pada 4°C. 7.

Masukkan sedikit campuran tripsin dan versena dan goncangkan botol untuk meliputi ke seluruh monolapisan sel. untuk menghalang aktiviti tripsin tersebut. Aturkan nilai pH larutan kepada 7. alirkan campuran gas (9% CO2. kultur sel ini dieramkan di dalam inkubator CO 2 yang mengandungi CO2 pada kadar 5%. Pencairan dengan media pertumbuhan boleh mengurangkan kepekatan tripsin dan versena kepada suatu aras yang tidak akan menjejaskan pertumbuhan sel. 11. Pipet bersukat (steril) Mikroskop cahaya jenis terbalik Kabinet aliran udara laminar kelas 1 atau 2 PERSEDIAAN 1. 63 . Oleh itu. Larutan tripsin dan versena Larutkan tripsin 0. 8. Jika didedahkan terlalu lama kepada tripsin. Amatilah selalu dengan mikroskop untuk menentukan sama ada sel telah berbentuk bulat. Aturkan kepekatan suspensi sel supaya mencapai 1 x 105 sel/ml media pertumbuhan. Pada sistem terbuka. Eramkan pada suhu 37°C selama 1 hingga 5 minit. amati sel dengan mikroskop untuk menentukan sama ada sel telah menjadi bulat dan/atau telah tanggal. goncangkan bekas kultur supaya PBS meliputi sel monolapisan. 2.2g KH2PO4 di dalam 950 ml air suling. Pada jenis kultur sel yang tumbuh dengan pesat. pipet keluar PBS. 81. Pipet media pertumbuhan (isipadunya bergantung kepada saiz bekas) ke dalam bekas dan cuci sel daripada permukaan bekas dengan memancutkan media daripada pipet yang dipasang dengan bal penyedut getah untuk meleraikan kelompok sel. 3. Agihagihkan ke dalam botol dan sterilkan dengan autoklaf pada 10 psi (115°C) selama 15 minit. 6. 10% O2. 5. 2.2g KCl. Pada jenis kultur sel yang tumbuh dengan lambat atau perlahan. Masa yang diambil untuk penanggalan sel daripada permukaan dalam bekas bergantung kepada jenis kultur yang terlibat. 3. Peganglah kultur sel hampir tegak lurus dan ketuk permukaan bekas kultur untuk menentukan sama ada sel boleh ditanggalkan (dilepaskan) daripada permukaan atau belum. 9. 4. 1. Tambahkan air suling sehingga mencapai 1 liter. sel tidak perlu dicuci melalui emparan dan supernatannya dituang keluar untuk menghilangkan campuran tripsin dan versena tersebut. Simpan pada suhu 4°C. Jika campuran tripsin dan versena yang digunakan sedikit sahaja.5% N 2) ke dalam bekas kultur menggantikan udara di dalam ruang bekas sebelum penutupnya ditutup dengan rapat. Cuci 2 kali dengan PBS : pipet PBS ke dalam bekas.15g Na 2HPO4 dan 0. Campurkan 2 jenis larutan ini dalam isipadu yang sama.0g NaCl. 0. 7. 2. Sel akan mengalami kerosakan atau mati jika didedahkan terlalu lama. 10.5% dan versena 0. tutup penutup bekas kultur dengan rapat. TATACARA 1. media yang mengandungi serum digunakan dalam mensuspensikan sel selepas sel-sel ditanggalkan. Aktiviti tripsin ini boleh dihapuskan oleh serum. PBS tanpa kalsium dan magnesium Larutkan 8. 4. Dalam masa ini. Biarkan botol berdiri tegak selama 1 hingga 2 minit sebelum cecair yang mengalir ke dasar bekas dipipet keluar. Keluarkan media secara aseptik dengan pipet bersukat. Goncangkan bekas kultur sel sebelum diletakkan di dalam inkubator supaya sel-sel bertaburan sama rata. Sterilkan dengan menggunakan penyaring membran dengan liang 0-2 µm. 5.4% di dalam PBS . N OTA 1.3. Hitunglah suspensi sel dengan hemositometer.3. Simpan pada suhu bilik. sel-sel akan mati.

Apa yang perlu hanyalah menghitung sel-sel di dalam SES kecil yang terletak di tengah dan di keempat-empat sudut hemositometer tersebut sahaja). walaupun tidak 64 . Simpan di dalam peti beku. maka sel-sel di dalam kesemua 25 SES kecil dihitung. Untuk mengelakkan daripada kehilangan sel-sel ini sebahagian dari-pada kultur sel berkenaan haruslah disimpan dalam keadaan yang boleh mengekalkan viabilitinya tanpa pertumbuhan. SES ini dibahagikan pula kepada 25 SES yang dipisahkan oleh tiga garis.1% tripan biru di dalam PBS Hemositometer jenis Neubauer Mikroskop cahaya PERSEDIAAN Tripan biru 0. Hitung sel di dalam SES yang kecil ini. ada kemungkinan kultur sel ini boleh terhapus disebabkan kemusnahan akibat pencemaran oleh bakteria atau fungus. Suspensi sel 0. 4. Bilangan sel ml-1 = jumlah sel yang dihitung x 25 x 10 4 x faktor pencairan jumlah SES yang digunakan 6. Dalam cara ini. Sebab kedua kenapa penyimpanan sel ini diperlukan adalah kerana sesuatu kultur sel itu hanya digunakan pada masa-masa tertentu sahaja. tatacara nisbah perpisahan (split ratio) boleh digunakan. TATACARA 1. 4. Sebagai panduan. Tetapi jika suspensi mengandungi banyak sel maka perhitungan sel-sel di dalam kesemua SES kecil tidak perlu dilakukan lagi. Satu sebab lain yang penting dalam hal penyimpanan kultur sel ini. 2. 5.4. peganglah bekas supaya permukaan di mana terdapatnya sel adalah di atas. Saringkan melalui kertas turas. 2. dalam keadaan yang telah menjadi kebiasaan seperti pertumbuhan sel di dalam bekas kultur yang sama ukurannya. Larutkan 1/10 dengan 10X PBS sebelum digunakan. Dalam keadaan tertentu. 5. Semasa mencuci sel-sel daripada permukaan bekas kultur. sel yang menyentuh atau melintang garis sebelah kiri dan atas setiap segi SES dihitung atau diambil kira. Dalam hal ini. penjimatan kos. kepekatan sel mestilah ditentukan terlebih dahulu supaya jenis sel dengan kepekatan yang diperlukan boleh ditetapkan. Tetapi. Kriopengawetan Sel yang Hidup Oleh kerana kultur sel adalah suatu hidupan. Pada posisi ini lapisan sel lebih mudah diamati dan sel-sel ditanggalkan dengan lebih mudah kerana tidak diselaputi oleh lapisan media semasa dicuci. 3. Hemositometer Neubauer mempunyai sembilan segi empat sama (SES) yang besar terletak di tengah. atau ia mengalami kematian kerana keadaan pertumbuhan yang tidak sesuai. tenaga dan masa boleh dicapai jika kultur sel ini disimpan sewaktu tidak digunakan.1% tripan biru di dalam 10 ml air suling. manakala yang menyentuh atau melintang garis bawah dan kanan SES tidak dihitung atau diabaikan. kultur sel dari satu bekas kultur dibahagikan (dibelah) kepada dua hingga empat bahagian (bergantung kepada jenis kultur sel) dan setiap bahagian dikulturkan secara berasingan di dalam bekas kultur yang mempunyai isipadu yang sama dengan bekas induk. 3.1% di dalam PBS Larutkan 0. Tatacara Menghitung Sel dengan Menggunakan Hemositometer BAHAN 1. Hitunglah sekurang-kurangnya 100 sel (ini bermakna bahawa pada suspensi tidak mengandungi banyak sel.

Balutkan dengan kapas. 2. jika ada. Jika perubahan yang tidak sesuai berlaku dalam kultur sel yang sedang digunakan. 15. 3. nombor pindahan sel (cell passage no. 8. 8. tukarkan media kultur sekitar 24 jam sebelum sel diproses. 6. Pindahkan 1 ml ke dalam setiap kriovial. Dalam hal ini. 10. 9. Kultur simpanan ini lazimnya masih mempunyai ciri-ciri yang dikehendaki kerana ia merupakan kultur sel yang mempun-yai riwayat pensubkulturan yang awal. pensterilan ke atas bahan adalah tidak perlu kerana DMSO dianggap steril. 6. 14. Simpan pada lantai peti bek – 70°C semalaman dan segera pindahkan ke dalam bekas yang mengandungi nitrogen cecair. 5. Jangan tambah DMSO kepada suspensi sel secara langsung ke dalam media pertumbuhan. Pindahkan ke dalam 1 tabung atau botol steril dan tambahkan media jika perlu. Pilih kultur sel yang sihat. TATACARA 1. 65 . 3. Keluarkan supernatan dan masukkan media pertumbuhan yang mengandungi DMSO 10%. 2. 3. 5. Apabila sesuatu sel dikulturkan untuk jangka masa yang berlarutan terdapat kemungkinan ciri-cirinya akan berubah: yang paling sering dikesan ialah sensitivitinya terhadap virus menjadi berkurangan. 4. Emparkan pada 200 g selama 15 minit. N OTA 1. 7. 7. Tatacara Kriopengawetan Sel yang Hidup BAHAN 1. ms 62-64).) dan tarikh. Kultur sel Campuran larutan tripsin (0. iaitu dalam fasa tumbesaran logaritmanya dan hampir mencapai lapisan sel yang meliputi keseluruh permukaan bekas kultur. 10. kemudian balut dengan kertas timah dan masukkan ke dalam satu kotak polistirena (5-10 cm tebal). Campurkan dan hitung jumlah sel untuk menentukan kadar sel hidup.5%) dan versena (0. ialah untuk mengekalkan ciri-ciri kultur sel tertentu. 2. kultur ini boleh digantikan dengan kultur sel lain yang disimpan.begitu ketara. Sediakan suspensi sel di dalam media yang mengandungi serum 10% (lihat tatacara tripsinisasi sel. Jika sel mengambil masa yang lama untuk mencapai keadaan di atas. 11. 4. Atursuaikan supaya kepekatan sel adalah 2 x 106 sel setiap ml. 9. Labelkan kriovial dengan nama sel.02%) Media pertumbuhan PBS (steril) Tripan biru Dimetil sulfoksida (DMSO) Kriovial Peti beku suhu – 70°C Tangki nitrogen cair untuk menyimpan spesimen Alat emparan Mikroskop cahaya Mikroskop cahaya terbalik Kapas Kertas timah nipis PERSEDIAAN Dimetil sulfoksida (DMSO) 10% v/v di dalam media pertumbuhan Tambahkan 1 ml DMSO ke dalam 9 ml media yang mengandungi serum 10% pada hari kultur sel akan disimpan. 12.

Oleh kerana amat sukar untuk mengekalkan suhu peti beku pada – 70°C. 9. Lagipun. Kriovial kultur sel Media pertumbuhan Penganggas air 37°C Bekas kultur sel Pipet steril Inkubator suhu 37°C TATACARA 1. tudung ampul dengan sehelai kain dan pakai kaca mata pelindung kerana ampul yang tidak ditaup dengan sempurna boleh meletup. 6. 4. Pegang kriovial di dalam penganggas air sehingga semua pembekuan menjadi cair. Walaupun ampul kaca atau polipropilen boleh digunakan sebagai bekas untuk simpanan. Untuk mengelakkan penyejatan. 66 . Amalan ini dipraktikkan kerana sel haiwan yang disimpan pada suhu – 70°C tidak boleh mengekalkan viabilitinya dalam masa yang begitu lama. Sebelum sesuatu kumpulan kultur sel yang disimpan dianggap sempurna. 8.4. Tatacara Mengkulturkan Semula Sel yang Dikrioawetkan BAHAN 1. 7. Kultur sel yang disimpan pada – 70°C harus dikulturkan selepas 6 bulan sebelum disimpan semula. Tambahkan media pertumbuhan yang mengandungi DMSO yang tersedia kepada sel-sel selepas diemparkan. 5. kadangkala ampul yang dimasukkan ke dalam air untuk pencairan boleh meletup jika penaupan tidak dilakukan dengan sempurna. Ini dicapai dengan kriovial dibalut dengan kapas serta kertas timah dan disimpan di dalam kotak polistirena. 5. Keluarkan kriovial/ampul sejurus selepas suspensi sel menjadi cair. 6. Semasa kandungan kriovial dicairkan. Keluarkan sebuah kriovial dari tempat simpanan dan serta-merta pindahkannya ke dalam penganggas air. adalah lebih selamat jika sel disimpan di dalam nitrogen cair. N OTA 1. Adukkan suspensi sel sejurus sebelum diagihkan ke dalam botol kriovial untuk memperoleh suspensi sel yang sama rata. 7. Keringkan permukaan luar ampul dan lap dengan alkohol. manakala ampul biasanya harus ditutup melalui penaupan dengan pembakaran api. Kita juga harus menyedari bahawa ada kemungkinan suhu – 70°C tersebut tidak dicapai di seluruh ruangan simpanan di dalam peti beku. 5. kriovial lebih mudah dikendalikan kerana dilengkapi dengan penutup. 3. 2. pastikan salah satu bekas kultur sel daripada kumpulan ini boleh dihidupkan semula tanpa terjadinya sebarang pencemaran mikrob. 2. pastikan aras air tidak mencapai penutupnya untuk mengelak kemungkinan air menyentuh bahagian mulut kriovial dan berlakunya pencemaran. Pindahkan kandungan kriovial atau ampul ke dalam sebuah bekas kultur dan campurkan media pertumbuhan ke dalamnya. selepas sel telah melekat pada permukaan bekas kultur pipet keluar media dan gantikan dengan media baru. bekas nitrogen cair disimpan di dalam bilik sejuk dan dipastikan nitrogen cair ditambahkan semula dalam tempoh masa yang sesuai mengikut kekerapan bekas tersebut dibuka. 8. Jika ampul kaca digunakan. Selepas beberapa jam hingga semalaman. 3. Adalah penting suhu kultur sel yang disimpan dikurangkan secara beransur-ansur. 6. Eramkan pada 37°C. 4.

Bekas kultur sel digoncang bukan sahaja untuk menyebarkan virus tetapi juga untuk mempastikan seluruh sel monolapisan sentiasa diliputi cecair untuk mengelak daripada kekeringan. atau udara di dalam ruangan bekas kultur digantikan dengan campuran gas yang mengandungi CO 2 5%. Pilih suhu pengeraman yang optimum untuk sesejenis virus yang dikulturkan. 7. 2. Pada kebanyakan virus haiwan. Goncangkan bekas setiap 10-15 minit untuk menyebarkan semula suspensi virus ke seluruh monolapisan. 3. media boleh dikeluarkan dengan pipet yang dihubungkan kepada sebuah pam udara. 3. 6. 7. Jika banyak kultur sel perlu diinokulasi dalam masa yang sama. 5. Amati kehadiran kesan sitopatik (untuk virus sitopatik) setiap hari atau selang sehari.2. Sama ada inokulum virus dikeluarkan selepas tempoh penjerapan atau tidak bergantung kepada keperluan. suhu pengeraman adalah 37°C sungguhpun pada virus respiratori suhu yang lebih rendah. Jika kultur berada di dalam bekas kaca. Tatacara Inokulasi Kultur Sel dengan Virus BAHAN 1. Pergandaan infektiviti.) yang sesuai.i yang terlalu tinggi digunakan ada kemungkinan sebahagian besar virus yang tak lengkap dihasilkan. Untuk memperoleh pemulihan kultur sel yang lebih cepat. m. Permukaan bekas kaca dibakar sebelum dan sesudah cecair dituang. Penjerapan virus dilakukan dalam isipadu cecair yang kecil untuk memudahkan kontak di antara virus dan sel. 4. 4. 4. Sama ada kriovial digoncang untuk menggalakkan pembekuan suspensi sel supaya lebih cepat mencair atau tidak bergantung kepada jenis sel tertentu kerana terdapat jenis sel yang viabilitinya terjejas akibat goncangan dengan kuat. pada peringkat awal tempoh pertumbuhan sel. 3. 3. Persediaan ini dilakukan dengan menggunakan kabinet biohazard kelas 2. Eramkan pada suhu yang sesuai (biasanya pada suhu 37°C) selama 30-60 minit. adalah nisbah partikel virus berinfeksi dan sel. 5. Amati kultur sel dan pilih kultur yang hampir atau baru mencapai monolapisan yang lengkap atau penuh (seluruh permukaan bekas kultur sel diliputi dengan sel).o.i. kandungannya bolehlah dituang. 5. 9. Masukkan media pertumbuhan dan eramkan pada suhu yang sesuai. 67 . Suspensi virus Larutan garam seimbang Hank dengan antibiotik (pencair virus) Kultur sel dalam bentuk monolapisan penuh PBS (steril) TATACARA 1. Masukkan suspensi virus ke dalam bekas kultur dan sebarkan ke seluruh lapisan sel. 2. 8. yakni 35°C merupakan suhu yang optimum. Penjerapan boleh dilakukan pada suhu bilik atau pada suhu pengeraman kultur. atau di dalam bekas khas yang mengandungi CO 2 5%. Media kultur dibuang dan digantikan dengan yang baru secepat boleh supaya DMSO dan selsel yang mati yang boleh menjejaskan pertambahan sel-sel yang hidup disingkirkan. 6. 2. 1. Keluarkan media dari bekas kultur. Jika m. N OTA Lakukan pencairan virus supaya mencapai pergandaan infektiviti (multiplicity of infection. eramkan kultur di dalam inkubator CO 2.o. Cuci 2 kali dengan PBS. Lap keseluruhan bahagian luar bekas dengan alkohol untuk mengelakkan pencemaran. 4.

4. yang digunakan ialah kotak cahaya atau lampu suluh yang telah diubahsuai. N OTA Pilih telur yang bersih dan mempunyai cangkerang yang berwarna putih pudar untuk memudahkan pengamatan bahagian dalamnya. Gunting kedua-dua penghujung kon ini supaya tepinya menjadi sama rata dan garis pusat bahagian yang lebih besar adalah sama dengan ukuran kepala lampu dan bahagian kecil adalah lebih kurang sama dengan ukuran penghujung telur yang lebih bulat.2. Pilih tempat yang gelap.3. Perkukuhkan kontak ini dengan menambahkan pita selofan. Sebelum inokulasi dilakukan adalah penting untuk menentukan terlebih dahulu sama ada telur yang akan digunakan tersebut mempunyai embrio yang masih hidup dan kedua. Tiga jenis tapak pada telur – membran amnion. Pada masa ini. Dengan ini cahaya lampu akan ditujukan ke luar melalui lubang yang lebih kecil. Pengamatan Telur Melalui Transiluminasi (Penyuluhan) Embrio telur dipastikan hidup dengan cara transiluminasi yang diberi istilah candling dalam bahasa Inggeris kerana pada zaman dahulu cahaya lilin digunakan untuk tujuan ini. 2. TATACARA 1. Pasangkan penghujung kon yang besar kepada kepala lampu suluh. Nyalakan lampu dan amatilah bahagian dalam telur. Telur berembrio Lampu suluh Kertas manila Pita selofan Gunting Pena penanda PERSEDIAAN Alat untuk penyuluhan Gulungkan sekeping kertas manila supaya berbentuk kon. membran alantoik dan membran korioalantoik – boleh digunakan bergantung kepada jenis virus yang terlibat. 4. 5. 3. Pastikan salur darah korioalantoik telur berembrio kelihatan jelas sekali dan embrio bergerak-gerak. tapak yang sesuai untuk suntikan. bentuk embrio juga jelas kelihatan. Tekan lubang terowong lampu suluh kepada cangkerang telur. 68 . Gunakan pita selofan untuk melekatkannya dan mengekalkan bentuk ini. 2. Tatacara Penyuluhan Telur BAHAN 1. PENGKULTURAN VIRUS DENGAN MENGGUNAKAN TELUR BEREMBRIO Telur ayam berembrio hidup merupakan suatu sistem yang digunakan untuk pengkulturan beberapa jenis virus. Semua ini adalah tanda yang menunjukkan bahawa embrio tersebut masih hidup. 3. 6. khususnya mata embrio yang besar dan kehadiran ruang udara. 4.

Tandakan dengan pena penanda tapak ruang udara. 3. 7. 3. Lap tapak celah tersebut dengan etanol. 6. Suluh telur untuk menentukan embrio masih hidup. Suntikan Virus ke dalam Ruang Amniotik Cara ini digunakan untuk pemencilan primer (kali pertama virus ditumbuh dalam keadaan makmal) virus influenza dan mumps. Tatacara Penyuntikan Virus ke dalam Ruang Alantoik BAHAN 1. 3.Suntikan Virus ke dalam Ruang Alantoik Pertumbuhan virus di dalam membran alantoik digunakan untuk virus influenza dan paramiksovirus yang telah disesuaikan beraplikasi dalam keadaan makmal. Ketuk dan pecahkan cangkerang tepat di atas ruang udara berkenaan dengan pemegang gunting dan guntingkan satu lubang besar sehingga mencapai pinggir ruang udara. 69 . Tutup celah dengan pita selofan. Suluh telur untuk menentukan embrio masih hidup. 3. 6. 8. Telur berembrio berumur 10 hingga 12 hari Jarum (28 gauge) dan picagari Etanol 70% Penggerudi berputar yang dipasang dengan cakera pemotong Pita selofan TATACARA 1. 4. 4. Suntikkan 0.1 ml inokulum ke dalam celah ini dengan jarum yang dimasukkan beberapa mm ke dalam celah. 2. 5. Terbalikkan telur untuk membersihkan membran cangkerang daripada cebisan-cebisan cangkerang. 2. Tatacara Penyuntikan Virus di dalam Ruang Amniotik BAHAN 1. Eramkan dengan tapak yang diinokulasi virus di sebelah atas selama 1 hingga 3 hari mengikut keperluan. Gerudi satu lubang atau celah yang kecil pada cangkerang pada tapak yang ditandakan untuk mendedahkan membran cangkerang. 5. Tandakan dengan pena tanda satu tapak yang agak berjauhan dengan sebarang salur darah. Lapkan membran cangkerang dengan parafin cecair supaya membran cangkerang menjadi jernih. 7. 2. 2. 4. Telur berembrio berumur 10-12 hari atau 12-14 hari Jarum panjang (11/4) dan picagari berisipadu 1 ml Etanol 70% Penggerudi berputar yang dipasang dengan cakera pemotong Pita selofan Parafin cair Gunting kecil dengan penghujungnya bengkok Swab steril TATACARA 1. 5. 4. 5.

5. Telur berembrio selepas penyuntikan virus dan pengeraman Gunting Pipet Pasteur Botol (steril) Etanol 70% 70 . Letakkan setitis larutan salin yang steril di atas celah. 5. Tatacara Penyuntikan Virus ke atas Membran Korioalantik BAHAN 1. 3. Gerudikan satu lubang kecil di kawasan ruang udara. 2. 8. Gerudikan satu celah cangkerang yang kecil pada tapak yang ditandakan tersebut untuk mendedahkan membran cangkerang sahaja. 4. supaya membran korioalantoik di bawah celah tersedut dan kelihatan terjatuh atau terlepas daripada cangkerang dan suatu pundi udara terbentuk. 6. Penyuntikan Virus ke atas Membran Korioalantoik Pengkulturan virus di atas membran korioalantoik membolehkan perbezaan di antara poksvirus jenis variola dengan vaksinia dan di antara virus herpes simplex taip 1 dengan taip 2 berdasarkan morfologi poks yang dihasilkan. Telur berembrio berumur 10 sehingga 12 hari Jarum (28 gauge) dan picagari Etanol 70% Penggerudi berputar yang dipasang dengan cakera pemotong Pita selofan Pena penanda Bal penyedut getah besar Larutan salin 0. Suntikkan 0. 7. Lap tapak celah dengan etanol. Tutup celah dengan pita selofan. Eramkan dengan tapak yang diinokulasi di sebelah atas selama dua hingga tiga hari pada suhu 37°C. 8. 2.1 ml inokulum ke dalam celah ini dengan jarum yang dimasukkan beberapa mm ke dalam celah. 5.85% (steril) TATACARA 1.6. Suluh telur untuk menentukan embrio masih hidup. 3. 3. Tandakan dengan pena penanda satu tapak yang tidak mendekati mana-mana salur darah. 2. 11. 10. 4. 8. Tatacara Mengumpulkan Cecair Alantoik BAHAN 1. Tutup lubang dengan pita selofan. Suntikkan 0. Lepaskan tekanan bal getah. 9. 7. Tekan bal penyedut getah besar dengan sepenuhnya dan lekapkan penghujungnya pada lubang di ruang udara. 7. 6. 4.1 ml inokulum ke pundi amniotik dengan menusukkan jarum ke tapak yang berhampiran dengan kepala embrio. Eramkan dengan tapak yang diinokulasi di sebelah atas selama 1 hingga 3 hari mengikut keperluan.

Telur berembrio selepas penyuntikan virus dan pengeraman Gunting Piring Petri Forseps Larutan salin 0. Pecahkan cangkerang di atas ruang udara dan guntingkan satu lubang besar. 71 . 5. Lap tapak suntikan dengan alkohol. Tatacara Pengambilan Membran Korioalantoik BAHAN 1. 6. Lap cangkerang di bahagian atas ruang udara telur dengan etanol. 3.5 ml larutan salin yang steril. 2.85% (steril) Etanol 70% TATACARA 1. Tatacara Mengumpulkan Cecair Amniotik BAHAN 1. N OTA Telur disejukkan untuk membunuh embrio serta mengecutkan salur darah supaya pengumpulan cecair yang mengandungi virus dilakukan tanpa pencemaran dengan sel darah merah. 4. 3. tambahkan 0. 3. Letakkan telur di dalam peti sejuk selama beberapa jam atau di dalam peti beku suhu – 20°C selama 1 jam. 2. Telur berembrio selepas penyuntikan virus dan pengeraman Forseps Pipet Pasteur Botol (steril) Larutan salin 0. 4. Sedut dan keluarkan cecair daripada pipet beberapa kali sebelum dikumpulkan. 2. Gunakan pipet Pasteur untuk menolak embrio dan pundi kuning telur ke tepi dan kumpulkan cecair alantoik dengan menggunakan pipet Pasteur lain. Letakkan telur di dalam peti sejuk selama beberapa jam atau di dalam peti beku suhu – 20°C selama 1 jam. Pegang pundi amniotik dengan forseps dan tembusinya dengan pipet Pasteur untuk mengeluarkan cecair amniotik daripada ruang amniotik. 2. N OTA Jika cecair amniotik didapati kurang. 5. Tanggalkan pita selofan yang menutupi tapak suntikan pada permukaan telur. Tanggalkan pita selofan yang menutupi ruang udara. 3. 4.TATACARA 1. Letakkan telur di dalam peti sejuk selama beberapa jam atau di dalam peti beku suhu – 20°C selama 1 jam.85% (steril) TATACARA 1. 3. 2.

72 . Pegang membran korioalantoik ini dan gunting di sekelilingnya sehingga semuanya terlepas daripada cangkerang. Cuci membran korioalantoik yang dikeluarkan di dalam larutan salin steril dan rentangkannya di dalam piring Petri.4. 6. 5. Pecahkan cangkerang di atas celah dengan bahagian pemegang gunting dan potong cangkerang sehingga ke pinggir ruang udara palsu.

iaitu bukan fermentasi. fermentasi dipastikan secara tidak langsung melalui pengamatan perubahan warna indikator pH akibat penghasilan asid. beberapa kumpulan bakteria tertentu menghasilkan bahan pertengahan metabolisme yang spesifik seperti asetil-metil-karbinol berikutan fermentasi glukos yang boleh digunakan untuk membezakan kumpulan bakteria yang menghasilkannya daripada yang tidak. bromthymol blue: neutral – hijau. Aktiviti yang luas ini dikawal oleh faktor genetik serta alam sekelilingnya. misalnya manitol adalah sejenis alkohol. Hasilan bukan gas ditunjukkan oleh tindakan kimia yang menghasilkan terbitan yang berwarna. ataupun dari menggunakan substrat bukan karbohidrat. Misalnya. Kultur bakteria pada plat agar Media cecair gula di dalam tabung reaksi atau botol Bijou Gelung dawai Penunu Bunsen 73 . iaitu tanpa oksigen bebas. Dalam fermentasi karbohidrat beberapa produk dihasilkan termasuk pelbagai jenis asid dan gas. Daripada segi genetik. sesuatu aktiviti biokimia ditentukan oleh enzim-enzim yang dihasilkan oleh bakteria. Enzim juga boleh ditunjukkan dalam tindakan serologi yang menghasilkan kompleks enzim (sebagai antigen) – antibodi yang muncul sebagai presipitasi. istilah gula meliputi senarai substrat berkenaan. alkali – biru).1. yang merangkumi proses kemusnahan dan proses pembinaan (atau sintesis). asid – kuning. asid – merah. alkalin – tanpa warna. Dalam ujian bakteriologi. dan substrat organik merupakan penerima terakhir elektron. Proses in berlaku dalam keadaan anaerobik. jenis dan kuantiti asid campuran (mixed acids) – pelbagai jenis asid organik yang berasal dari asid piruvik yang dihasilkan serta kemampuan menghasilkan gas. Gas yang dihasilkan dikesan secara langsung melalui pengamatan penghasilan gelembung gas atau secara tidak langsung melalui penggantian cecair di dalam tiub Durham dengan gas. 4. perbezaan ini merupakan salah satu ciri penting dalam pengenalpastian spesis bakteria. Tatacara Ujian Fermentasi Gula: Penghasilan Asid dan Gas BAHAN 1. Hasilan aktiviti enzim ini boleh berupa gas atau terbitan bukan gas. faktor ini dengan spesifisiti sesejenis enzim terhadap substrat tertentu membolehkan bakteria dikenal pasti dalam keadaan sekeliling yang terkawal seperti di makmal. Akan tetapi penurunan pH boleh dicapai melalui proses penggunaan karbohidrat yang bukan anaerobik. 3. Bakteria berbeza dalam jenis karbohidrat yang boleh digunakan sebagai sumber tenaga melalui proses fermentasi. kehadiran rekahan atau celah-celah di dalam agar atau melalui tindakan kimia yang menghasilkan terbitan yang berwarna dan tidak larut (misalnya H 2S). PENGENALPASTIAN AGEN MIKROB UJIAN MAKMAL DALAM PENGENALPASTIAN BAKTERIA Bakteria mempunyai kisaran aktiviti biokimia yang amat luas. 5. Walau bagaimana pun. Ujian Fermentasi Gula: Penghasilan Asid dan Gas Fermentasi adalah suatu proses kimia yang melibatkan oksidasi-reduksi. Kehadiran sesejenis enzim dikenal pasti secara tidak langsung melalui tindakannya terhadap sesuatu substrat. tidak semua ujian yang digunakan untuk menguji kebolehan sesejenis bakteria mendegradasikan secara enzimatik ‘gula’ menjadi produk asid merupakan proses fermentatif. Dalam hal ini sungguhpun tidak semua substrat yang digunakan dalam ujian fermentasi adalah gula. istilah ‘fermentasi’ digunakan secara longgar dalam konteks ujian bakteriologi diagnostik.5. Oleh yang demikian. 2. Penghasilan asid ditunjukkan oleh perubahan warna indikator pH (sesuatu jenis pewarna) yang bergantung kepada jenis indikator yang digunakan (contoh. Dalam pengenalpastian bakteria. Andrade: neutral – kuning pucat. Oleh yang demikian.

3. Media TSI ditampan pada pH 7. Tegakkan semula botol media. 6. Sebaliknya. Tiub Durham adalah sebuah tabung/tiub kecil yang boleh dimuatkan di dalam botol Bijou dan diletakkan terbalik (dengan mulutnya di bawah). Sentuhkan pada 1 koloni bakteria pada media plat. Jika pada mulanya tiub ini hanya dipenuhi dengan media. Amati perubahan warna media dan penghasilan gas (yang terperangkap di dalam tiub Durham). penghasilan gas dan penghasilan hidrogen sulfid. 74 . N OTA 1. 2. Biasanya media ini juga disertakan sejenis indikator pH. setelah penghasilan gas oleh mikroorganisma. 5. Media TSI disediakan dalam agar condong. 2.0%) dan sukrosa (1. Tutup rapat media yang telah diinokulasi dan tunggangkan sekali supaya keseluruhan tiub Durham dipenuhi media dan sama sekali tidak mengandungi gelembung udara di dalamnya.0%). Penghasilan gas Ujian positif: Ruang kosong di dalam tiub Durham Ujian negatif: Tiub Durham masih dipenuhi media Pentafsiran hasil positif: Bakteria menghasilkan gas semasa menfermentasi gula Ujian Tiga Gula-Besi Media tiga gula-besi atau Triple Sugar Iron ( TSI ) merupakan sejenis media campuran yang digunakan untuk membezakan spesies bakteria dalam famili Enterobacteriaceae dengan berdasarkan kepada kemampuan spesies-spesies ini untuk memfermentasi gula dekstros. Eramkan pada 37°C selama semalaman. Bahagian permukaan agar (agar condong) (slant) adalah terdedah kepada udara maka wujud dalam keadaan aerobik. gas ini akan mengganti media yang dimaksudkan dan akan terperangkap di dalam tiub maka kehadiran ruang tanpa media menunjukkan kehadiran gas. Indikator pH. serta dilengkapi dengan tiub Durham) TATACARA 1. adalah fenol merah yang akan menjadi kuning pada pH 6. Catatkan hasil selepas 24 jam pengeraman dan seterusnya pengeraman dilanjutkan selama beberapa hari sebelum hasilnya dinyatakan sebagai negatif. Gula yang digunakan adalah glukosa (0.4 iaitu pH alkali maka warna agar kelihatan oren-kemerahan atau merah. 3. Media cecair terdiri daripada gula 1% di dalam air pepton 1%.1%) .8 (keadaan asid). laktos atau sukros atau kombinasi daripada ketiga-tiga gula tersebut. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN 1. bahagian puntung agar (di bahagian dasar tabung) (butt) dilindungi dari udara dan wujud dalam keadaan anaerobik (walaupun bukan 100%). Inokulasikan kultur ini ke dalam media cecair yang mengandungi sejenis gula. Sterilkan gelung dawai melalui pembakaran api penunu Bunsen dan biarkan sehingga dingin.Media cecair gula: (media dasar yang mengandungi jenis-jenis gula atau karbohidrat tertentu dan indikator pH. 7. laktosa (1. Penghasilan asid Ujian positif: Media berwarna merah Ujian negatif: Tanpa perubahan warna media Pentafsiran hasil positif: Bakteria dapat menfermentasikan gula berkenaan 2. 4. sebagai penunjuk fermentasi. Ulangkan inokulasi ke dalam media yang mengandungi gula lain.

Kultur bakteria 2. Tetapi di permukaan agar yang terdedah kepada oksigen udara.Peptid dan asid amino yang berasal dari pepton di dalam media TSI didegradasikan melalui proses dekarboksilasi oksidatif kepada amina. Sukrosa dicampurkan untuk menyaringkan spesies Salmonella dan Shigella kerana kedua-dua bakteria ini tidak menfermentasi sukrosa atau laktosa. Walau bagaimanapun. Sterilkan keseluruhan dawai lurus melalui pembakaran dan biarkan supaya sejuk. Dawai inokulasi lurus (dawai lurus) 4. Penunu Bunsen (Reagen TSI: Dari sumber komersial) TATACARA 1. Jika bakteria hanya boleh menfermentasi glukosa. Hidrogen sulfid yang dihasilkan akan bertindakbalas dengan ferrous sulfat dan suatu presipitasi hitam (ferik sulfid) akan terbentuk di dalam media. Jika bakteria yang diinokulasi tidak menfermentasi karbohidrat. Penghasilan gas ditunjukkan dengan kehadiran gelembung gas atau bahagian puntung agar akan kelihatan pecah-pecah. 4. Tatacara Ujian Tiga Gula Besi BAHAN 1. oksigen di dalam udara tidak dapat sampai maka proses dekarboksilasi oksidatif adalah pada tahap minimum. kuantiti asid yang dihasilkan adalah terhad kerana kuantiti glukosa yang digunakan adalah rendah (0. 2. Di bahagian puntung. Tusukkan inokulum menembusi cerun agar TSI di dalam tabung sehingga ke dasarnya. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Rujuk kepada Jadual 5. Jadi. Eramkan semalaman dan teruskan selama 48 jam (jika perlu). pH asid di bahagian permukaan agar akan berubah semula menjadi alkali (ungu-merah) manakala bahagian puntung agar (bahagian dasar tabung) akan kekal asid (kuning) kerana di situ amina yang dihasilkan tidak mencukupi untuk mengatasi kesan asid. kuantiti ini mencukupi untuk bahagian permukaan dan puntung agar menjadi kuning.1%).1 75 . walaupun amina dihasilkan kuantiti asid yang dihasilkan terlalu besar untuk perubahan pH kembali kepada keadaan alkali maka bahagian condong mahupun bahagian puntung agar akan tetap berkeadaan asid (kuning). Jika laktosa atau sukrosa. atau kedua-duanya difermentasi kuantiti asid yang dihasilkan daripada salah satu di antara kedua gula ini adalah besar kerana konsentrasi kedua-dua gula ini adalah tinggi iaitu masing-masing 1%. asid tidak dihasilkan dan warna merah akan kekal di seluruh media. Proses in dipercepatkan oleh bakteria yang tumbuh di bahagian permukaan agar. 3. Sentuhkan penghujung dawai kepada koloni bakteria. 5. sejenis terbitan alkali. Tarik semula dawai dan gariskan organisma di atas permukaan agar yang condong. amina dihasilkan dan lama kelamaan (18-24 jam selepas pengeraman) kuantitinya mencapai aras yang mampu mengatasi kesan kuantiti rendah asid yang dihasilkan. Cerun agar TSI di dalam tabung uji 3.

Tatacara Ujian Indol BAHAN 1. Oleh kerana sesetengah spesies Proteus dan beberapa spesies lainnya boleh memberikan reaksi pada TSI yang serupa dengan Salmonella ataupun Shigella. terdapat beberapa jenis reagen untuk mengesannya. Kuning Fermentasi glukosa & laktosa atau sukrosa + – Aerobacter aerogenes. mirabilis. 2. manakala Proteus. P.Providencia. Arizona * Atau tiada perubahan dan warna agar seperti warna sebelum diinokulasi N OTA 1.enteritidis paratyphi. Shigella Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa _ + Salmonella typhosa.JADUAL 5.Citrobacter. sonnei. Proteus rettgeri.M. Morganella morganii.Klebsiella. P. Pseudomonas. Streptococcus.S. Serratia Rupa Agar Tafsiran Condong Merah* Ungu-kemerahan Puntung Merah Kuning Tiada fermentasi gula Fermentasi glukosa Gas – – H 2S – – Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa + – Salmonella cholera-suis.S. Mimae Shigella dysenteriae. maka untuk membezakan spesies-spesies ini ujian urease dilakukan.Providencia Kuning Kuning Fermentasi glukosa & laktosa atau sukrosa + + Proteus vulgaris. Sungguhpun tindak balas kimia asas dalam pengesanan indol adalah sama. Indol bertindak dengan para-dimetil-aminobenzaldehid dan menghasilkan pewarna rosindole (warna merah tua). E. schottmuelleri. Serratia Kuning . Ujian Indol Bakteria menghasilkan indol (benzopyrrole) daripada asid amino triptofan akibat tindakan enzim triptofanase. cloacae. Kultur bakteria Air pepton di dalam tabung uji Broth triptofan di dalam tabung uji 76 . coli. morganii. Proteus mira bilis. urease-positif).1 Pola Hasil Tindakan Bakteria ke atas TSI Penghasilan Kemungkinan Bakteria (Jenis) Alcaligenes. enter itidis. vulgaris. Providencia. Arizona. Edwardsiella Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa + + Salmonella typhimurium.vulgaris.Ed-wardsiella Kuning Kuning Fermentasi glukosa & laktosa atau sukrosa – – Hafnia. (Salmonella dan Shigella adalah urease-negatif. proteus rettgeri. Walau bagaimanapun. 2. reagen Kovac merupakan yang paling popular digunakan di masa kini. A. Proteus rettgeri. S.Arizona. S. 3. Klebsiella. Tabung TSI harus ditutup secara longgar sahaja selepas diinokulasi supaya udara dapat masuk ke dalam tiub kultur untuk membolehkan berlakunya oksidasi dan perubahan balik condong agar daripada asid (kuning) ke alkali (ungu-kemerahan). Proteus mirabilis.Staphylococcus. Citrobacter. Citrobacter.P.

6. 5. Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. 4. Dengan perlahan dan hati-hati campurkan 50 ml HCl pekat (Lakukan di dalam kabinet asap). asetik. TATACARA 1. 2. Amatilah pembentukan lapisan warna (cincin) pada permukaan suspensi. Ujian indol yang dilakukan dengan reagen Kovac tidak memerlukan kloroform. 3. Simpan di dalam botol gelap dengan penutup kaca di dalam peti beku. Bakteria yang menggunakan tapak jalan fermentasi asid campuran dalam katabolisme glukosa biasanya menghasilkan kuantiti pelbagai jenis asid organik (formik. Metil-merah (Media MR-VP: Dari sumber komersial) 77 . Eramkan selama 24 – 48 jam.4. Panaskan di dalam penganggas air pada 56°C sehingga larut. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Merah tua Ujian negatif: Kuning Pentafsiran hasil positif: Penghasilan indol akibat degradasi protein triptofan oleh bakteria. 5. Biarkan sehingga dingin. Kultur bakteria 2. media diuji biasanya dicampurkan kloroform sejenis bahan kimia yang toksik. Ciri ini digunakan untuk membezakan di antara spesies bakteria yang menghasilkan asid ‘kuat’ (strong acids) dalam kuantiti besar dan spesies bakteria yang tidak berbuat demikian. Broth MR-VP di dalam tabung uji 4. kepekatan komponen media yang sesuai untuk ujian metilmerah serta ujian Voges Proskauer telah ditentukan dan media untuk kedua-dua ujian ini kemudian dipasarkan sebagai media MR-VP (Methyl Red – Voges Proskauer). reagen Ehrlich juga boleh digunakan dalam ujian Indol. Masukkan 2 titis suspensi ini ke dalam broth triptofan. Ujian Metil-Merah Metil-merah pada pH neutral dan asid sederhana (nilai 7-6) berwarna kuning tetapi menjadi merah pada pH yang agak rendah iaitu di bawah nilai 4. dalam ujian yang menggunakan reagen Ehrlich. Walau bagaimanapun.4.5 ml) reagen Kovac (berwarna kuning). Reagen ini stabil selama beberapa tahun. Air pepton 3. Reagen ini berwarna kuning muda.4 manakala bakteria yang menggunakan tapak jalan fermentasi butilena glikol tidak menghasilkan asid. N OTA Di samping reagen Kovac. Goncang dan biarkan selama 10 minit. isoamilalkohol atau butilalkohol. Tatacara Ujian Metil-Merah BAHAN 1. Pipet Pasteur (steril) Reagen Kovac PERSEDIAAN Reagen Kovac Masukkan 10 g p-dimetilaminobenzaldehid ke dalam 150 ml alkohol jenis amilalkohol. Dalam penciptaan ujian metil-merah. laktik) yang mencukupi untuk menurunkan pH media di bawah nilai 4. Masukkan 5 titis (~ 0.

Pentafsiran hasil positif: Menunjukkan penghasilan asid dalam kuantiti tinggi hasil fermentasiglukosa oleh bakteria. 4. Tatacara Ujian Voges-Proskauer BAHAN 1. 5. Masukkan dua titis suspensi ini ke dalam 1. 5. 3. Masukkan 2 titis metil-merah ke dalam setiap 0. 78 . Eramkan pada 37°C selama 24 – 48 jam. Goncang dengan baik dan biarkan selama 5 – 20 minit. Penghasilan asetoin merupakan salah satu kriteria dalam fermentasi glukosa oleh bakteria yang digunakan dalam pengenalpastian. Goncang dan biarkan seketika.5 ml kultur. N OTA 1.5 ml broth MR-VP.5 ml) di dalam tabung uji a -naftol 5% dalam alkohol pekat 95% KOH (40% yang mengandungi 0. Kultur bakteria Air pepton Broth MR-VP (0. Masukkan 2 titis suspensi ini ke dalam 0. Ujian Voges-Proskauer Asetil-metil karbinol (atau asetoin) adalah metabolit pertengahan/perantaraan dalam proses penghasilan butilena glikol pada fermentasi glukosa. 3. Amatilah pembentukan warna di permukaan media PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Warna merah jambu sehingga merah.6 ml larutan a -naftol. 6. 3. diasetil. ujian diulangi ke atas kultur dengan pengeraman yang lebih lama. Diasetil kemudian bertindak dengan kumpulan NH2 bebas daripada kumpulan guanidina (kreatin adalah sumber kumpulan guanidina) untuk menghasilkan kompleks berwarna merah.5% kreatin) TATACARA 1. 7. 6. Dalam kehadiran KOH dan oksigen (dari udara) asetoin secara spontan (tidak melibatkan enzim) dioksidasi menjadi metabolit pertengahan.1 g metil-merah di dalam 300 ml etanol 95%.0 ml broth MR-VP. Sensitiviti ujian ini dipertingkatkan dengan penambahan a -naftol. Ujian negatif: Warna kuning. Amati pembentukan warna. TATACARA 1. Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. 4. Eramkan selama 24 jam pada 37°C.PERSEDIAAN Reagen metil-merah Larutkan 0. 2. 3. warna pertengahan di antara kuning dan merah tidak dianggap positif. 4.2 ml larutan KOH. 2. Masukkan pula 0. 2. Inokulum yang tebal adalah penting supaya kuantiti asid yang besar dapat dihasilkan untuk membolehkan ujian dibaca berikutan pengeraman selama 18-24 jam. 5. Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. 2. Tambahkan 0. Jika hasil yang kurang pasti didapati. Campurkan air suling sehingga 500 ml. Warna oren.

Disk Bacitracin dan disk Optochin (Reagen Bacitracin dan Optochin: Dari sumber komersial) TATACARA 1. Sapukan permukaan agar dengan menggunakan swab steril pada arah 90° daripada arah garisan pertama bakteria untuk mendapatkan lapisan bakteria yang tersebar dan sama rata di atas permukaan media. maka elakkan daripada menggerak-gerakkan tabung sehingga membolehkan warna tersebut muncul segera selepas reagen dicampurkan dan tabung digoncang supaya sebati. Kadangkala tindak balas mengambil masa yang lama (~ 2 jam) sebelum kemunculan warna yang dimaksudkan. Kultur bakteria 2. adalah sensitif terhadap Optochin dan menghasilkan zon rencatan pertumbuhan di sekeliling disk tersebut. Agar darah 3. Pentafsiran hasil positif: Kehadiran asetil-metil-karbinol (asetoin). streptokokus selain daripada kedua spesies ini menunjukkan keresistanan sama ada terhadap Bacitracin bagi kumpulan b-hemolitik atau terhadap Optochin bagi kumpulan a -hemolitik menurut ujian yang dilakukan di atas. sejenis antibiotik. Ujian negatif: Tiada perubahan atau kuning. Ujian Sensitiviti Terhadap Bacitracin dan Optochin Sensitiviti terhadap Bacitracin. Sebaliknya. Swab (steril) 4. Pneumokokus (Streptococcus pneumoniae) selain larut di dalam hempedu. Sensitiviti terhadap Optochin (ethylhydrocuprein hydrochloride) pula digunakan untuk membezakan Streptococcus pneumoniae daripada streptokokus a -hemolitik lainnya. 3. 79 . Tatacara Ujian Sensitiviti Terhadap Bacitracin dan Optochin BAHAN 1. Ujian ini menunjukkan korelasi yang rapat dengan ujian kelarutan hempedu. suatu hasil pertengahan dalam proses fermentasi glukosa oleh sesetengah bakteria. Letakkan secara aseptik dengan menggunakan jarum atau forseps steril 1 disk Bacitracin ke atas agar sejurus sebelum pengeraman kultur. Jarum/forseps steril 6. Streptokokus a -hemolitik yang lainnya pula tumbuh sehingga mencapai ke pinggir disk atau kadangkala hanya menghasilkan zon rencatan pertumbuhan yang biasanya dibaca sebagai resistan. Streptococcus pyogenes (atau streptokokus kumpulan A Lancefield) sensitif terhadap Bacitracin. manakala Streptococcus pneumoniae sensitif terhadap Optochin. N OTA Oleh kerana suatu perubahan warna akan berlaku di antara permukaan campuran kultur dan reagen. Ambil 1 koloni bakteria streptokokus b-hemolitik dan buat garisan-garisan pada permukaan agar darah. Kesimpulannya.PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Merah. digunakan untuk membezakan streptokokus kumpulan A Lancefield daripada streptokokus b-hemolitik lainnya. Gelung dawai 5. 2. Kajian yang telah dilakukan menunjukkan bahawa kebanyakan streptokokus kumpulan A (93-98%) sensitif terhadap konsentrasi rendah Bacitracin dan sebaliknya streptokokus bukan kumpulan A amnya resistan.

PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif Bacitracin: Ujian positif Optochin: Pentafsiran hasil positif: Zon perencatan pertumbuhan. V dan XV : Dari sumber komersial) TATACARA 1. dan X bersama V tertentu menandakan ia memerlukan faktor tersebut dan sebaliknya. Buat suspensi murni bakteria di dalam air pepton. Jarum/forseps (steril) 7. Letakkan disk-disk yang mengandungi faktor tumbesaran secara aseptik di atas agar kirakira 1 atau 2 cm daripada pinggir media dalam pola sebagai berikut: misalnya disk Faktor X : tepat pada titik jam tangan yang menunjukkan jam 12. Koloni spesies bakteria yang menunjukkan pertumbuhan di sekeliling disk yang mengandungi faktor tumbesaran X. Amati zon perencatan pertumbuhan bakteria. manakala disk XV. Eramkan pada 37°C selama 18 sehingga 24 jam. V. 80 .4. Eramkan pada suhu 37°C selama 18 dan teruskan sehingga 48 jam. ia tidak mempunyai kemampuan untuk mensintesis faktor berkenaan dalam kuantiti yang optimum. XV (Disk faktor X. saiz yang bergantung kepada kepekatan reagen yang digunakan. 2. Inokulasi seluruh permukaan plat agar nutrien dengan bakteria berkenaan dengan menggaris-gariskannya menggunakan gelung dawai. 7. Bakteria sensitif terhadap Bacitracin/Optochin. Disk Optochin jenama Oxoid. Gelung dawai 6. 5. code DD1: 5 mm atau lebih zon perencatan yang diukur dari tepi disk. Spesies Haemophilus dan Bordetella boleh dikenal pasti berdasarkan sama ada media dasar memerlukan penambahan faktor tumbesaran X (hemin) dan faktor V (NAD. Tekan disk pada permukaan agar dengan forseps atau jarum steril supaya tidak tanggal. 3. Pengeraman seharusnya dilakukan dalam CO 2 5-10% untuk mencapai pertumbuhan optimum. jika perlu dalam atmosfera CO2 5-10%. Ulangi kaedah di atas dengan menggunakan kultur streptokokus a -hemolitik dan disk Optochin. V. 5. Kultur bakteria 2. Disk dengan dua unit Bacitracin: 15 – 20 mm garis pusat (termasuk garis pusat disk). Agar nutrien 3. 6. 4. tepat pada jam 8. disk faktor V : tepat pada jam 4. juga dinamakan koenzim I) supaya pertumbuhan bakteria dapat berlaku. Tatacara Ujian Keperluan Faktor Tumbesaran X dan V BAHAN 1. Disk dengan 15 mg Optochin: 18 mm atau lebih dari tepi disk. Amati kehadiran atau tidaknya pertumbuhan di sekeliling disk. Swab (steril) 5. Ujian Keperluan Faktor Tumbesaran X dan V Disk kertas yang diserap dengan faktor tumbesaran digunakan untuk membezakan antara spesies bakteria genus Haemophilus. Air pepton 4. Disk faktor X.

H. Pengubahsuaian ini membolehkan pertumbuhan bakteria dikesan dengan lebih mudah kerana dalam metabolisme karbon pada sitrat (pertumbuhan positif). hasilnya ditafsir berdasarkan berlakunya kekeruhan pada media broth akibat pertumbuhan bakteria. bromthymol blue. Dalam ujian yang menggunakan media Koser. H. Kehadiran pertumbuhan bererti kemampuan bakteria mengurai sitrat sebagai sumber karbon. Simmons mengubahsuai media Koser tersebut dengan menambahkan agar dan indikator. iaitu agar nutrien yang mana spesies-spesies yang diuji tidak mungkin tumbuh padanya tanpa penambahan faktor tumbesaran tertentu. apatah lagi agar coklat dalam melakukan ujian ini. yang kelihatan hijau pada pH 6. pertussis. manakala yang tidak memerlukan faktor X atau V adalah B. influenzae parainfluenzae aegyptius ducreyi hemolyticus parahemolyticus pertussis – – – – – – + X – – – + + – + V – + – – + + + XV + + + + + + + N OTA 1.6. Simpan disk pada suhu 4°C dan bukan pada 0°C. Perhatikan bahawa media yang digunakan berupa media minimum. H. dan hasil ujian dinyatakan sebagai positif untuk sitrat. Bakteria golongan aerogen boleh menggunakan sitrat sebagai sumber karbon. Penggunaan Sitrat Koser mencipta sejenis media broth asas yang mengandungi natrium ammonium fosfat sebagai sumber tunggal nitrogen. Elakkan daripada menggunakan agar darah. suatu tindak balas alkali berlaku dan ini ditunjukkan dengan perubahan pada warna media daripada hijau kepada biru tua.1 Keperluan bakteria untuk faktor X dan V Pertumbuhan Berlaku Dengan Faktor: Spesies – H.8 dan biru pada pH lebih 7. dan natrium sitrat sebagai sumber tunggal karbon.PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Pertumbuhan di sekeliling disk dengan: Faktor X dan XV – memerlukan faktor X sahaja Faktor V dan XV – memerlukan faktor V sahaja Faktor XV sahaja – memerlukan faktor X mahupun faktor V Bakteria yang memerlukan faktor X dan V atau salah satu di antaranya adalah spesies Haemophilus. 2. B. Perubahan warna. H. dalam hal ini. H. manakala golongan koliform tidak. 81 . Kadangkala bacaan hasil ujian tidak semata-mata berdasarkan kepada perubahan warna. tetapi sama ada terdapat atau tidaknya pertumbuhan bakteria pada garis inokulasi di atas media. JADUAL 5. Seterusnya. mempermudahkan lagi pembacaan hasil ujian.

Ujian Penggunaan Sitrat
BAHAN

1. Kultur bakteria 2. Dawai lurus 3. Cerun agar sitrat Simmons di dalam botol Bijou (Agar sitrat Simmons: Dari sumber komersial)
TATACARA

1. 2. 3. 4. 5.

Sterilkan keseluruhan dawai lurus dan biarkan sehingga sejuk. Sentuhkan pada koloni bakteria dengan penghujung dawai. Buatkan 1 garisan tipis bakteria pada permukaan agar. Eramkan pada 37°C selama semalaman atau 48 jam, jika perlu. Amatilah perubahan warna pada media.

PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN

Ujian positif: Pertumbuhan dengan/tanpa media menjadi biru. Ujian negatif: Tiada pertumbuhan atau media tetap hijau. Pentafsiran ujian positif: Kemampuan menggunakan sitrat sebagai sumber tunggal karbon.
N OTA

1.

2. 3.

Gunakan sedikit sahaja inokulum supaya semasa penginokulasian inokulum ini tidak kelihatan sama sekali pada garis inokulasi dan untuk mengelakkan reaksi positif palsu akibat bakteria yang mati membebaskan karbon dan nitrogen dalam kuantiti yang boleh menampung pertumbuhan. Elakkan daripada mengambil sebarang bahan nutrien daripada media kultur di mana inokulum diambil. Kultur yang menunjukkan pertumbuhan tanpa perubahan pH (perubahan warna) juga dianggap positif kerana pada sesetengah bakteria yang lambat tumbuh keadaan tindak balas alkali tidak dapat dicapai dalam tempoh pengeraman yang ditetapkan. Pengeraman selama 48 jam mungkin diperlukan untuk bakteria yang lambat tumbuh supaya warna biru dapat muncul.

Ujian Urease Urea adalah substrat spesifik yang dihidrolisis oleh enzim urease kepada ammonia dan karbon dioksida. Ammonia menyebabkan campuran tindak balas menjadi alkali. Tanda kehadiran urease dapat dikesan melalui indikator pH yang menunjukkan perubahan warna media daripada oren (pH 6.8) kepada merah jambu (pH 8.1) Ujian untuk mengesan penghasilan enzim urease oleh bakteria biasanya digunakan dalam pengenalpastian bakteria genus Proteus. Walau bagaimanapun, bakteria-bakteria lain yang juga penting dalam perubatan mempunyai kemampuan untuk menghasilkan urease. Terdapat beberapa jenis ujian urease dengan sensitiviti yang berbeza-beza. Tahap sensitiviti ini ditentukan terutamanya oleh kandungan larutan penampan. Pemilihan dari segi jenis ujian ini adalah bergantung kepada kegunaannya. Oleh kerana pH media boleh ditingkatkan melalui sesuatu tindak balas lain, maka hasil positif palsu untuk urease memang terdapat. Untuk mengesan keadaan seperti ini ujian kawalan terhadap media yang tidak mengandungi urea diperlukan.

82

Tatacara Ujian Urease
BAHAN

1. 2. 3. 4. 5.

Kultur bakteria Air pepton Broth urea di dalam botol Bijou Gelung dawai Pipet Pasteur steril

TATACARA

1. 2. 3. 4.

Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. Masukkan 2 titis suspensi ini ke dalam broth urea. Eramkan selama 24 jam. Amati warna broth urea.

PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN

Positif: Merah. Negatif: Kuning. Pentafsiran hasil positif: Kehadiran enzim urease yang menghidrolisis urea kepada ammonia. Ujian Oksidase Ujian oksidase menentukan kehadiran sitokrom C, sejenis enzim respiratori. Oleh yang demikian, ujian ini hanya positif untuk bakteria yang memiliki sitokrom C. Sitokrom adalah protein yang mengandungi heme dan merupakan enzim oksidatif dalam kitaran respiratori yang terlibat dalam fosforilasi oksidatif. Dalam ujian oksidase tatacara Kovacs, reagen oksidase adalah tetrametil-pfenilena-diamina dihidroklorida 1%. Enzim oksidase sitokrom tidak bertindak secara langsung dengan reagen oksidase, tetapi menyebabkan oksidasi sitokrom C yang kemudian menyebabkan oksidasi tetrametil-p-fenilena-diamina dihidroklorida sehingga membentuk sejenis bahan kimia berwarna biru yang disebut biru Wunster. Sitokrom C yang direduksi (ditambah elektron) dalam tindakan ini diubah secara tidak langsung kepada bentuk yang teroksidasi oleh oksidase sitokrom yang menerima elektronnya. Enzim oksidase sitokrom kemudian menggantikan elektron tersebut kepada oksigen untuk menghasilkan air dengan ion hidrogen. Ujian ini digunakan untuk membezakan streptokokus (oksidase-negatif) daripada neisseria (oksidase-positif). Tatacara Ujian Oksidase
BAHAN

1. 2. 3. 4. 5.

Kultur bakteria Slaid mikroskop Kepingan kecil kertas turas Whatman No. 1 Reagen oksidase (tetrametil-p-fenilena-diamina dihidroklorida 1%) Kayu aplikator

TATACARA

1. 2.

Letakkan sekeping kertas turas kecil di atas slaid mikroskop bersih. Titiskan 2 hingga 3 titis reagen oksidase ke atas kertas turas.

83

3. 4.

Ambil koloni bakteria dengan kayu aplikator dan goreskan ke atas kertas turas pada bahagian yang menyerap reagen oksidase. Amati kemunculan warna dalam beberapa saat.

PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN

Kemunculan warna lavender (ungu pudar) yang cepat (dalam beberapa saat) menjadi biru/ungu. Ujian negatif: Tiada perubahan warna atau warna muncul hanya setelah beberapa minit. Pentafsiran hasil positif: Perubahan segera ke warna biru/ungu menunjukkan bakteria memilikim sitokrom C.
N OTA

Ujian positif:

1.

2. 3.

4. 5.

Reagen ini mesti disediakan segar kerana sifatnya yang tidak stabil. Auto-oksidasi oleh oksigen bebas dari udara boleh berlaku dan oleh yang demikian reagen ini dengan sendirinya akan berubah menjadi biru atau ungu jika dibiarkan di udara agak lama. Reagen yang baru disediakan perlu dibiarkan selama 15 minit untuk menjadi “masak” sebelum digunakan. Pastikan dan patuhi tempoh masa yang ditetapkan untuk mentafsirkan hasil ujian ini kerana pada ujian yang disimpan lama sebelum dibaca hasil positif palsu boleh berlaku kerana warna biru atau ungu boleh muncul akibat auto-oksidasi yang berlaku ke atas reagen. Gunakan kayu aplikator atau dawai platinum untuk mengambil koloni. Dawai nikrom juga boleh mempengaruhi hasil ujian dan memberikan hasil positif palsu. Tatacara alternatif ujian oksidase ini adalah dengan membanjiri kultur pada piring Petri dengan reagen dan kemudian segera menyingkirkan bahan yang berlebihan ini dengan pipet. Hasilnya ditunjukkan dengan perubahan warna koloni bakteria kepada warna ungu (oksidase-positif) atau tiada perubahan warna (oksidase-negatif).

Ujian Koagulase Ujian untuk menentukan penghasilan enzim koagulase oleh stafilokokus adalah suatu ujian penting dalam mikrobiologi diagnostik. Ia membezakan stafilokokus patogenik kerana berkemampuan untuk menghasilkan enzim ini, daripada yang tidak menghasilkannya atau tidak patogenik. Terdapat dua jenis koagulase; yang satu terikat pada dinding sel bakteria (koagulase terikat) dan tidak bebas, dan yang satu jenis lagi dirembeskan oleh sel ke dalam media atau cairan (koagulase bebas). Ujian slaid di mana penggumpalan atau pengelompokan bakteria dihasilkan dipercayai disebabkan oleh koagulase terikat yang terdapat pada dinding sel. Enzim bentuk ini bertindak secara langsung ke atas fibrinogen haiwan-haiwan tertentu dan menghasilkan fibrin yang memerangkap bakteria sehingga berlakunya penggumpalan/pengelompokan tersebut. Sebaliknya, koagulase yang dihasilkan secara bebas bertindak dengan protrombin untuk menghasilkan trombin, yang seterusnya bertindak ke atas fibrinogen untuk menghasilkan fibrin (pembekuan). Tatacara Ujian Koagulase Slaid
BAHAN

1. 2. 3. 4. 5.

Kultur bakteria Larutan salin 0.85% Slaid mikroskop Gelung dawai Plasma arnab

84

Sediakan suspensi stafilokokus di dalam larutan salin (atau gunakan kultur broth). PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pembentukan gumpalan bakteria. 3. Tambahkan setitis plasma arnab kepada suspensi dan campurkan dengan gelung dawai. Mana-mana bakteria yang boleh menggunakan sitrat sebagai sumber tenaga boleh membebaskan kalsium yang akan mengakibatkan pembekuan plasma jika plasma tersebut diambil daripada darah yang bercampur sitrat. 3. Gunakan plasma arnab atau manusia dan bukan spesies mamalia lain kerana kebanyakan plasma daripada spesies lain tidak bertindak dengan koagulase stafilokokus. aureus yang menghasilkan hanya koagulase bebas yang tidak bertindak dalam ujian koagulase slaid. 6. Campurkan 1 isipadu suspensi bakteria dengan 5 isipadu larutan plasma. 4. Pentafsiran hasil positif: Bakteria memiliki enzim koagulase. ujian haruslah dilakukan juga ke atas beberapa jenis bakteria kawalan yang memberikan hasil positif kuat. 85 .TATACARA 1. N OTA 1. 6. 2. Tatacara Ujian Koagulase Tabung BAHAN 1. 5. Ujian negatif: Tiada penggumpalan dan suspensi bakteria kelihatan homogen. 2. 4. 2. Oleh yang demikian. Plasma perlulah diuji terlebih dahulu dengan strain kawalan positif dan negatif sebelum digunakan. Seterusnya. 3. 2. Ambil beberapa koloni bakteria dengan gelung dawai steril. Perlu juga diperhatikan bahawa kadangkala plasma manusia yang digunakan mengandungi bahan perencat yang akan memberikan hasil negatif palsu. adalah amat penting untuk mempastikan bahawa bakteria yang diuji adalah benar-benar kultur murni stafilokokus. Hasil positif yang berlaku lewat atau negatif diuji semula dengan ujian koagulase tabung kerana terdapat strain S. Kultur bakteria Larutan salin 0. dan ujian ini digunakan semata-mata untuk membezakan antara strain yang menghasilkan koagulase daripada yang tidak. Buatkan suspensi bakteria ini di dalam titisan salin. 5. supaya hasil ujian boleh dipercayai dan diterima tanpa ragu-ragu. 5. Goncangkan slaid dan amatilah penggumpalan (clumping) bakteria yang akan kelihatan sebagai kelompak-kelompak putih dalam masa 15 saat. Sediakan 1:9 pencairan plasma arnab atau manusia di dalam larutan salin. Pastikan koloni bakteria boleh diemulsifikasi di dalam salin supaya tidak menimbulkan masalah dalam pembacaan hasilnya nanti. Ujian positif palsu boleh berlaku jika penggumpalan yang berlaku lewat diambil kira. positif lemah dan kawalan negatif.85% Tabung uji steril Gelung dawai Plasma arnab Penganggas air pada 37°C TATACARA 1. Letakkan setitis larutan salin steril di atas sebuah slaid mikroskop yang bersih dan kering. 4. 3.

jika masih negatif. Pentafsiran hasil positif: Bakteria memiliki enzim koagulase N OTA 1. tabung uji dicondongkan. 3. Sesetengah strain stafilokokus menghasilkan enzim fibrinolisin yang akan melisis semula pembekuan plasma yang dihasilkan. Letakkan setitis larutan hidrogen peroksida di atas sebuah slaid kaca bersih dan kering. Pembekuan jika hadir. akan kekal di dasar tabung uji. aureus yang kadar penghasilan koagulasenya adalah rendah maka masa yang panjang diperlukan untuk koagulase mencapai aras yang memberi hasil yang positif (hasil positif yang lewat) Ujian Katalase Katalase adalah enzim dengan bahagian (moieti) yang mengandungi besi.4. Campurkan dengan memutarkan tabung uji di antara kedua dua tapak tangan. Ujian katalase digunakan khususnya untuk membezakan antara stafilokokus (katalase positif) dengan streptokokus (katalase negatif) dan juga kadangkala digunakan dalam pengenalpastian pelbagai jenis bakteria. Eramkan pada suhu 37°C di dalam penganggas air dan amati selepas 1. Masukkan organisma ke dalam titisan reagen di atas slaid. 3 dan 6 jam dan selepas semalaman. tabung haruslah diamati beberapa kali di sepanjang tempoh pengeraman. 86 . Pastikan tabung tidak digoncang semasa mengamati dan membaca hasil ujian (penghasilan pembekuan) kerana ini akan mengakibatkan pembekuan menjadi terlerai dan tidak dapat dikesan. Tindak balas kimia yang berlaku dalam ujian katalase adalah : 2H 2O 2 Æ 2H 2O + O2 • Penghasilan gelembung gas . Kultur bakteria Slaid mikroskop Kayu aplikator Hidrogen peroksida 3% TATACARA 1. rancak dan berterusan. 3. Jangan campur dengan goncangan. 4. 4. 5. (oksigen) adalah tanda bagi ujian yang positif. Untuk memudahkan pembekuan diamati. 3. 2. Amatilah kehadiran gelembung-gelembung gas yang dihasilkan dengan cepat. Tatacara Ujian Katalase BAHAN 1. Untuk mengelakkan daripada memperolehi hasil yang negatif palsu. Ujian negatif: Campuran tetap cair. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Penghasilan dan pembebasan gas dengan cepat dicirikan dengan gelembunggelembung gas yang dibebaskan dengan rancak. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pembentukan pembekuan. Sentuhkan penghujung kayu aplikator kepada koloni bakteria. Spesimen yang memberi hasil negatif pada masa pengeraman 6 jam dieramkan semula semalaman kerana terdapat strain S. 2. 2.

Ini untuk mengelakkan daripada terambil bersama sel darah dan mendapatkan hasil yang positif palsu seperti di atas. 5. 4. 4. Jangan gunakan dawai gelung kerana positif palsu boleh berlaku. Sesetengah bakteria yang menghasilkan H2S tidak dapat tumbuh pada media yang mengandungi terbitan ferum (besi). Tetapi. Pada kultur anaerobik. Ujikan juga se-bahagian daripada plat agar yang belum diinokulasi dengan bakteria dengan menuangkan sedikit reagen di atasnya sebelum meneruskan dengan ujian katalase plat ini untuk mengelak-kan hasil positif palsu. Ujian katalase plat: Ujian ini boleh dilakukan ke atas koloni di atas plat kultur dengan me-nuangkan reagen ke atas koloni berkenaan KECUALI jika media kultur tersebut adalah agar darah kerana ia boleh memberikan hasil positif palsu. Gas H 2S yang dibebaskan akan dikesan melalui perubahan warna kertas putih kepada warna hitam akibat pembentukan plumbum sulfida. Penghasilan segelintir gelembung kecil selepas 20-30 saat tidak dianggap positif. Oleh yang demikian. Seboleh-bolehnya elakkan daripada mengambil koloni yang tumbuh pada permukaan media agar darah. 2. Gunakan H 2 O 2 pada kepekatan 3% untuk mendapatkan hasil ujian yang terbaik atau optimum. Kertas ini hanya diletakkan pada sisi mulut tabung di atas kultur bakteria pada agar condong. Pentafsiran hasil positif: Bakteria memiliki enzim katalase. 2. berhati-hatilah dalam pengambilan tersebut untuk mempastikan hasil yang tepat dan betul. Penghasilan Hidrogen Sulfida Bakteria boleh menghasilkan H 2S daripada terbitan sulfur organik yang didapati di dalam pepton yang digunakan atau daripada terbitan sulfur tak organik yang dicampurkan dengan media kultur.Ujian negatif: Tiada sebarang tindak balas. Serapkan sekeping kertas turas dengan plumbum asetat 5% dan biarkan sehingga kering. Larutan H2O2 disimpan di dalam botol gelap di dalam peti beku. Gariskan bakteria ke atas cerun agar di dalam tabung uji. Kultur bakteria Cerun agar nutrien di dalam tabung Dawai lurus Kertas turas Plumbum asetat 5% TATACARA 1. 5. tanpa menyentuh permukaan agar tersebut kerana plumbum asetat boleh menghalang pertumbuhan sesetengah bakteria. Penghasilan H2S oleh sesejenis bakteria menandakan keupayaan bakteria tersebut untuk mereduksi sulfur kepada sulfida. 3. Tatacara Ujian Penghasilan Hidrogen Sulfida BAHAN 1. Perlu ditekankan di sini bahawa darah juga mengandungi enzim katalase yang dapat bertindak balas dengan reagen. Jangan gunakan kultur yang berusia lebih daripada 24 jam untuk mengelak daripada memperolehi hasil negatif palsu kerana enzim ini hanya dapat dikesan pada kultur hidup yang masih segar dan mungkin tiada lagi pada kultur tua. H2S yang dihasilkan oleh bakteria golongan ini dikesan dengan kertas yang diserapkan dengan larutan plumbum asetat 5%. sekiranya hal ini tidak dapat dielakkan. dedahkan kultur kepada udara selama setengah jam sebelum ujian dilakukan untuk membolehkan oksidasi aerobik ke atas katalase yang tereduksi berlaku. 6. 3. 87 . Ini adalah kerana sesetengah media mungkin mengandungi sedikit katalase yang boleh memberikan tindak balas yang lemah dan lambat serta boleh menyulitkan pembacaan hasil. 2. NOTA 1.

Titiskan 2 titis antitoksin (antilesitinase) Cl. Enzim ini juga bertindak ke atas fosfolipid lainnya. 2. hasilnya menunjukkan kehadiran suatu zon opalesens (antibodi anti-lesitinase) di sekeliling koloni yang menandakan penghasilan lesitinase oleh bakteria. Antitoksin Clostridium perfringens (Cl. Penganggas air pada 50°C 4. Eramkan secara anaerobik. perfringens pada setengah bahagian daripada media plat. 6. Emulsi kuning telur pekat 6.3. 4. dan lesitinase A. Campurkan emulsi “kuning telur pekat” (Difco: SR47) untuk mencapai kepekatan 5% dan tuangkan agar campuran ini ke dalam sebuah piring Petri. Sebarkan antitoksin ini sama rata ke atas permukaan setengah plat agar dan biarkan ia meresap dan kering. Cairkan 20 ml agar nutrien yang steril (Difco: Blood Agar Base CM55). 88 . 4. 8. Ekstrak Fildes 5. Biarkan kering. Pentafsiran hasil positif: Bakteria boleh menghasilkan H2S daripada sulfur. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian hasil positif: Kertas menjadi hitam. vitellenin) daripada kuning telur yang mempresipitasikan lemak bebas. Buatkan 1 garisan bakteria melintasi kedua-dua bahagian setengah plat agar ini (bahagian yang disapu antitoksin dan yang tidak). welchii) (antibodi anti-lesitinase) 8. Piring Petri 7. Agar nutrien 3. welchii) sungguhpun terdapat laporan yang menyatakan bahawa bakteria lain seperti Pseudomonas aeruginosa juga boleh menghasilkan enzim ini. Gantung kertas ini pada sisi mulut tabung uji dan pastikan kertas ini tidak menyentuh permukaan agar. Ujian Nagler Penentuan penghasilan enzim lesitinase oleh bakteria adalah berfaedah dalam pengenalpastian bakteria genus Clostridium khususnya Clostridium perfringens (Clost. Eramkan pada 37°C semalaman. Gelung dawai (Reagen agar Nagler dan kuning telur : Dari sumber komersial) TATACARA 1. Turunkan suhu kepada 50°C dengan membiarkan media di dalam penganggas air selama 15 minit. Selepas pengeraman. Swab (steril) 9. 7. Kultur bakteria 2. Mekanisme penghasilan opalesens dipercayai disebabkan oleh tiga faktor iaitu lemak digliserid yang dihasilkan. 5. 3. Ujian hasil negatif: Tiada perubahan warna pada kertas. Ujian Nagler pada mulanya dilakukan dengan menumbuhkan bakteria pada media agar kuning telur. Tatacara Ujian Nagler BAHAN 1. B dan D juga bertindak ke atas lesitin tetapi terhadap terbitan-terbitan lain yang dihasilkan. lemak bebas daripada kuning telur selepas lesitin dihancurkan dan protein tak larut air (vitellin. Campurkan 1 ml ekstrak Fildes. Fenomena ini kali pertama dilaporkan oleh Nagler yang pada waktu itu menggunakan serum sebagai sumber lesitin. Enzim lesitinase C menghidrolisis lesitin (lecithin-phosphatidyl choline) kepada fosforilkolin dan sejenis digliserid.

kawalan negatif dan yang diuji) secara tegak lurus (90°) melintasi jalur kertas antitoksin. 7. Pentafsiran hasil positif: Bakteria menghasilkan serta merembeskan enzim lesitinase yang dikenal pasti kerana aktivitinya menghasilkan zon opalesens dihalang oleh antibodi anti-lesitinase (antitoksin). 89 . Letakkan kertas yang mengandungi antitoksin di tengah piring agar sejurus selepas agar mem-beku. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Garis presipitasi kelihatan muncul daripada sudut pertumbuhan bakteria yang diuji dan bakteria kawalan positif. 3. Ujian negatif: Tidak terbentuk zon opalesens di sekeliling koloni pada keseluruhannya (pada kedua-dua kawasan disapu antitoksin dan tidak). Piring Petri yang steril 9. Serum lembu 7. 2. Tatacara Ujian Elek BAHAN 1. Pentafsiran ujian positif: Bakteria menghasilkan toksin difteria. Kertas turas 8. Inokulasi permukaan agar dengan bakteria (kawalan positif. Penganggas air 50°C 6. Titiskan 1 ml antitoksin difteria (1000 unit) ke atas jalur kertas supaya diserap dan biarkan kering. Inkubator (Reagen agar dasar jenis Elek: Dari sumber komersial) TATACARA 1. Turunkan suhu kepada 50°C dengan membiarkan di dalam penganggas air selama 15 minit. Biarkan agar menjadi kering. secara tradisi ujian ini dimasukkan ke bahagian ujian biokimia. 5. Tuangkan agar campur serum ke dalam piring Petri. Letakkan sekeping kertas turas ke dalam 1 piring Petri kosong yang steril. 4. 9. Cairkan 10 ml agar dasar Elek. 8. Walau bagaimanapun. Ujian Elek Strain Corynebacteria diphtheriae yang menghasilkan toksin dapat dikesan secara in vitro melalui penghasilan presipitasi apabila toksin ini bertindak dengan antitoksin. Kultur bakteria yang diuji 2.PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Lesitinase dihasilkan jika zon opalesens hanya kelihatan di sekeliling koloni di bahagian setengah plat agar tanpa antitoksin. manakala pada bahagian setengah plat agar yang disapu dengan antitoksin tidak terbentuk zon opalesens. Campurkan 2 ml serum lembu. Agar dasar Elek 5. Ujian negatif: Tiada garis presipitasi. Kultur bakteria kawalan positif (disahkan menghasilkan toksin difteria) 3. Kultur bakteria kawalan negatif (disahkan tidak menghasilkan toksin difteria) 4. Penghasilan garis presipitasi adalah hasil suatu tindak balas serologi yang melibatkan antigen (toksin) dan antibodi (antitoksin). Eramkan dan amati selepas 24 jam dan 48 jam. 6. Antitoksin difteria 10. 10.

Pertumbuhan beberapa jenis bakteria tertentu mungkin dihalang oleh garam tetrazolium. Elakkan daripada menggerakkan dawai ke kiri atau ke kanan semasa dikeluarkan (dan juga semasa dawai ditusuk) kerana ini akan menyebabkan pertumbuhan yang kelihatan tersebar dan memberi tafsiran positif palsu mengenai mobiliti.N OTA 1. 3. 2. Amati pola pertumbuhan bakteria. Gunakan inokulum yang tebal. Tatacara Ujian Motiliti (Pergerakan) pada Agar Separuh Pejal BAHAN 1. 2. 2. Oleh kerana keseluruhan dawai lurus akan ditusuk ke dalam agar maka pastikan keseluruhan dawai ini dibakar untuk mensterilkannya. 3. Pastikan strain kawalan negatif dan strain kawalan positif diikut sertakan. N OTA 1. Ujian negatif: Pertumbuhan bakteria terhad kepada garis tusukan. Dawai yang ditusuk ke dalam media dikeluarkan seboleh-bolehnya bertepatan dengan garis kemasukannya. Tusukkan hujung dawai ke dalam agar separuh pejal sehingga ke dasar tabung. Plat harus disediakan pada hari ujian dilakukan. Eramkan semalaman. Garam tetrazolium digunakan dalam ujian motiliti ini kerana ia memudahkan pengesanan pertumbuhan serta penyebaran bakteria secara visual di dalam media. Pentafsiran ujian: Ujian positif – bakteria motif. 5. ujian negatif – bakteria tak motil. 4. Kultur bakteria Agar nutrien (0. 2.4% atau <) merupakan suatu media separuh pejal yang membolehkan bakteria bergerak dan menyebar ke pelbagai arah di dalamnya. Sentuh koloni bakteria dengan penghujung dawai. Garam tetrazolium adalah tanpa warna dan akan diubah kepada formazan. kompleks tak larut berwarna merah hasil pereduksian oleh bakteria yang tumbuh. 4. Bakteria yang tak motil akan tetap pada garis inokulasi dan sama sekali tidak akan tersebar. Sterilkan keseluruhan dawai lurus. 3. Jika plat dieramkan lebih 48 jam. 4. kemungkinan garis presipitin juga dihasilkan oleh strain kawalan negatif (dan juga Corynebacterium akibat antigen yang umum kepada semua korinebakteria).4% atau <) yang mengandungi indikator (garam tetrazolium) di dalam tabung uji Dawai lurus Inkubator TATACARA 1. Jika bakteria mempunyai kemampuan untuk bergerak atau bersifat motil ia akan menunjukkan penyebaran yang bermula dari garis inokulasi. 3. Ujian Motiliti dengan Menggunakan Agar Separuh Pejal Media pertumbuhan dengan kepekatan agar yang rendah (0. 4. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pertumbuhan bakteria (merah) tersebar daripada garis tusukan dawai lurus. 90 . Beberapa bakteria seperti Pseudomonas adalah aerobik dan akan hanya menunjukkan motiliti pada bahagian atas media ini.

UJIAN SENSITIVITI ANTIBIOTIK IN VITRO Rawatan penyakit dengan sesuatu bahan atau sebatian kimia dinamakan kemoterapi. Celupkan swab steril ke dalam suspensi bakteria yang berada di dalam tabung uji. Seseorang doktor haruslah mengetahui mengenai tahap kerentanan (susceptibility) sesuatu mikroorganisma terhadap antibiotik tertentu supaya memudahkannya membuat keputusan yang sesuai dalam rawatan serta pengurusan seseorang pesakit. suatu zon rencatan pertumbuhan akan terbentuk di sekeliling disk yang mengandungi antibiotik tersebut. Sapukan swab sambil memutarkannya pada permukaan media agar untuk penginokulasian mengikut corak seperti diterangkan di bawah: Sapukan swab mula-mula ke satu arah sehingga memenuhi keseluruhan permukaan media dan kemudian sapukan pula menurut arah kira-kira 90 darjah daripada arah sapuan semula. Suspensi bakteria yang diuji di dalam air pepton Swab (steril) Plat agar darah Mueller-Hinton TATACARA 1. 3. 3. organisma yang diuji digariskan (atau diinokulasi dan kemudian disebarkan) memenuhi permukaan media agar di dalam piring Petri. jika ia resistan. iaitu tatacara Stoke dan tatacara perbandingan. Pada masa ini kebanyakan antibiotik dan terbitannya yang digunakan dalam rawatan dihasilkan secara sintetik atau buatan. atau bersama bakteria kawalan.6. Buangkan swab ke dalam bekas khas yang mengandungi disinfektan. Cara lain ialah organisma dicampurkan dengan media agar yang masih cecair dan kemudian dituangkan ke dalam piring. Antibiotik tersebut akan merembes keluar daripada disk dan meresap ke dalam media. Maklumat ini boleh diperolehi di makmal umumnya melalui dua teknik atau pendekatan iaitu ujian resapan disk dan asai pencairan tiub. Tatacara Membuat Inokulasi Bakteria pada Keseluruhan Permukaan Media Plat Agar BAHAN 1. UJIAN RESAPAN DISK Dalam ujian resapan disk. Putarkan swab pada dinding sebelah dalam tabung untuk menyingkirkan suspensi yang berlebihan. Sebaliknya. 4. 91 . Jika kultur bakteria sensitif terhadap sesuatu antibiotik. bahkan kadangkala boleh tumbuh di bawah disk. pertumbuhan akan berlaku sehinggalah mencapai ke pinggir disk. 6. namun demikian kebanyakannya tidak mempunyai nilai perubatan kerana sesetengahnya mungkin terlalu toksik terhadap pengguna atau sukar diperolehi. Kemudian disk diletakkan di atas inokulum yang telah disebarkan pada permukaan agar atau pada permukaan media agar yang telah dicampur organisma sebelum pengeraman. Dalam ujian resapan disk. 2. Pendekatan ini disebut sebagai ujian resapan disk dan terdapat dua tatacara yang umum. Agen kemoterapi yang dihasilkan berikutan aktiviti metabolik bakteria atau fungus disebut antibiotik. pada keseluruhan permukaan media plat agar. Senarai antibiotik yang dipencilkan dan dikenal pasti sememangnya cukup panjang. 2.1. Biasanya larutan antibiotik ini tidak terus diletakkan ke atas agar. prosedur pertama (awal) adalah penginokulasian hanya bakteria yang diuji. tetapi terlebih dahulu diserapkan ke dalam disk-disk kertas (satu disk satu jenis antibiotik dengan satu unit pencairan).

Kultur bakteria (masing-masing untuk ujian dan kawalan) Gelung dawai Penunu Bunsen Tabung air pepton Swab (steril) Jarum atau forseps (steril) Disk antibiotik Inkubator Pembaris TATACARA Hari pertama 1. 4. Sentuhkan dengan swab yang mengandungi bakteria yang diuji bahagian tepi plat dan liputi kawasan permukaan agar ini dengan inokulum ini sehingga hampir menyentuh pinggir kawasan inokulum pertama. Ujian Resapan Disk: Tatacara Perbandingan BAHAN 1. Suatu garis perbatasan antara kedua-dua jenis bakteria kawalan dan ujian akan diperolehi di mana disk-disk antibiotik akan diletakkan nanti. 2.Tatacara Membuat Inokulasi 2 Jenis Bakteria di Bahagian yang Berasingan pada Permukaan Media Plat Agar BAHAN 1. 3. 4. Sterilkan gelung dawai. 2. 2. 3. Suspensi bakteria yang diuji di dalam air pepton Suspensi bakteria kawalan Swab (steril) Plat agar darah Mueller-Hinton Alat pemutar plat Petri TATACARA 1. N OTA Pastikan swab tidak terlalu basah atau meninggalkan kesan yang tidak diingini pada permukaan agar. 3. Celupkan swab yang steril ke dalam suspensi bakteria kawalan. Lakukan kaedah 2 dan 3 untuk bakteria yang akan diuji. 5. Letakkan plat agar di atas pentas pemutar plat Petri. 7. 9. 2. 8. 4. 3. 5. 6. Pindahkan 3 koloni bakteria (garis pusat 1-2 mm) ke dalam 1 tabung air pepton. 6. 4. Buka penutup plat Petri dan inokulasi media dengan mula-mula menyentuh bahagian tengah plat dengan swab yang mengandungi bakteria kawalan sehinggalah penginokulasian ini memenuhi suatu kawasan bulatan kira-kira 5 cm garis pusat. Putarkan swab pada dinding sebelah dalam tabung uji berkenaan untuk menyingkirkan suspensi yang berlebihan. Inokulasi strain bakteria ini pada keseluruhan permukaan media agar dengan swab steril (rujuk kepada tatacara di ms. Kaedah ini dilaksanakan sejajar dengan pergerakan alat pemutar plat. Goncangkan untuk mendapatkan suspensi yang homogenus. 93). 5. 92 .

separuh sensitif (intermediate) atau resistan. 2.5. 3. Pastikan pertumbuhan bakteria yang diuji dan bakteria kawalan adalah secara kuantitatif hampir sama. 4. 9. Eramkan plat pada 37°C semalaman. 93 . Inokulasi bakteria yang diuji dan bakteria kawalan di atas plat yang sama di bahagian yang berasingan (rujuk kepada bahagian tatacara di m. 10. 2. 2. Jika suatu carta rujukan piawai diperolehi atau sudah tersedia. Bandingkan hasil sensitiviti kedua-dua strain terhadap antibiotik dan tentukan sama ada strain yang diuji sensitif. Letak dan tekan disk antibiotik tepat di atas garis perbatasan antara kedua-dua kultur supaya sebelah disk berada di kawasan kultur kawalan dan sebelah lagi di kawasan kultur yang diuji. 3. Seseorang hanya perlu merujuk kepada carta tersebut untuk menentukan pola sensitiviti strain bakteria yang diuji menurut senarai yang ditetapkan di dalam carta berkenaan. Eramkan plat pada 37°C semalaman. Ini bagi menyatakan sama ada bakteria tersebut sensitif. 94). 9. Tatacara perbandingan berdasarkan carta atau suatu piawai yang tersedia dikenali sebagai Tatacara Kirby-Bauer. 5. Ulangi kaedah 1 hingga 5 untuk strain kawalan pada plat lain yang mengandungi media yang sama.5 cm antara satu disk dengan yang lain dan juga disk dengan dinding plat. 8. separuh sensitif. Biarkan supaya permukaan media menjadi kering dan kemudian letakkan disk-disk antibiotik di atas media dengan menggunakan jarum atau forseps steril dan tekan disk ke atas permukaan agar. Ujian Resapan Disk: Tatacara Stoke BAHAN 1. 7. 7. atau resistan. Pastikan terdapat jarak sekurang-kurangnya 1. 6. 6. 10. Balikkan plat dan ukurlah garis pusat zon tanpa pertumbuhan bakteria (zon rencatan).s. Hari kedua 8. Pastikan terdapat jarak yang sekurang-kurangnya 1.5 cm antara 1 dengan lain mahupun antara disk dengan dinding plat. ujian ke atas strain kawalan tidak perlu dijalankan. Kultur bakteria (masing-masing untuk ujian dan kawalan) Gelung dawai Penunu Bunsen Tabung air pepton Swab (steril) Alat pemutar plat Petri Jarum atau forseps (steril) Disk antibiotik Inkubator Pembaris TATACARA Hari pertama 1. N OTA 1.

bermula daripada titik pusat disk). tetapi memperlihatkan juga pertumbuhan bakteria yang berbonjol di sekitar pinggir zon harus dilaporkan sebagai resistan. 3. Dalam keadaan ini. Pastikan pertumbuhan bakteria yang diuji dan kawalan hampir sama secara kuantitatif untuk memberikan perbandingan yang tepat di antara kedua-duanya.2. Kultur plat harus dieramkan sejurus selepas disk diletakkan. Gunakan isipadu agar yang sama setiap kali supaya ketebalan agar dalam piring Petri sentiasa sama. Stafilokokus yang menghasilkan zon rencatan yang jelas. 7. Jangan gunakan disk antibiotik yang telah tamat tempoh penggunaannya atau melebihi tarikh pelupusannya. Kelewatan meletakkan disk menyebabkan bakteria tumbuh sebelum antibiotik dapat meresap ke dalam media dan bertindak ke atas bakteria. Jika ini tidak dipatuhi. Fenomena ini mungkin ditemui di kalangan stafilokokus penghasil enzim betalaktamase yang diuji dengan disk antibiotik yang mengandungi penisilin dan terbitannya. kepekatan antibiotik yang meresap ke dalam media agar juga akan sentiasa sama. 8. antibiotik disediakan dalam pencairan dua kali ganda di dalam suatu siri tabung media pertumbuhan. ukuran garis pusat atau jejari yang terkecil yang diambil kira. Ia memakan masa lebih lama. UJIAN PENCAIRAN TABUNG Pendekatan yang lebih kuantitatif untuk menguji sensitiviti bakteria terhadap sesuatu antibiotik adalah tatacara pencairan tabung. 6. 4. Balikkan plat dan ukurlah jejari zon tanpa pertumbuhan bakteria (zon rencatan. Dalam prosedur ini. 5. 2. N OTA 1. Kepekatan terendah untuk antibiotik yang menunjukkan hasil “tiada pertumbuhan bakteria” pada subkultur dianggap sebagai kepekatan antibiotik terendah yang berupaya membunuh bakteria tersebut – kepekatan bakterisidal minimum (minimum bactericidal concentration: MBC). Bagi bakteria yang sukar tumbuh pada media ini bolehlah dicampurkan darah 5% sebagai nutrien tambahan. Ini dilakukan dengan mengamati tiub berkepekatan antibiotik terendah atau paling minimum dalam siri pencairan yang menghalang pertumbuhan bakteria (tiub yang jernih tepat disebelah tiub yang mula menunjukkan kekeruhan). oleh itu tidak disyorkan sebagai tatacara rutin. Dalam keadaan ini. Buat perbandingan antara zon tanpa pertumbuhan yang dihasilkan terhadap strain ujian dengan zon yang dihasilkan terhadap strain kawalan untuk menentukan keresistanan bakteria kepada sesuatu antibiotik. besar kemungkinan zon rencatan pertumbuhan yang lebih besar akan dihasilkan kerana resapan antibiotik terlebih dahulu berlaku sebelum pertumbuhan bakteria bermula. Zon rencatan yang berbentuk bujur boleh disebabkan oleh disk yang tergeser di atas permukaan media atau disk diletakkan terlalu rapat dengan pinggir piring.Hari kedua 4. Sama ada antibiotik berkenaan bersifat bakterisiadal (membunuh bakteria) atau bakteriostatik (merencat pertumbuhan bakteria) dapat dipastikan dengan melakukan pensubkulturan daripada tiub yang tidak menunjukkan pertumbuhan tersebut ke atas media agar tanpa antibiotik. 94 . 6. 5. Ini menghasilkan pembacaan yang kurang tepat. Agar Mueller-Hinton merupakan media yang paling sesuai untuk ujian sensitiviti resapan disk. Kemudian setiap tiub diinokulasi dengan organisma berkenaan dan kepekatan perencatan minimum (minimum inhibitory concentration: MIC ) ditentukan. Disk antibiotik harus diletakkan sejurus selepas inokulasi dilakukan.

dan tabung kawalan negatif yang mengandungi antibiotik sahaja (jernih). 2. Kultur tabung harus dieramkan sejurus selepas bakteria dicampurkan. Siri tabung ujian Plat-plat agar Pipet Pasteur MIC TATACARA 1. 3. Tuliskan nombor siri tabung (atau kepekatan antibiotik) pada setiap separuh plat. Bakteria kawalan adalah bakteria yang sensitif terhadap antibiotik yang digunakan dalam ujian ini dan mesti beri hasil yang positif sebelum hasil bakteria yang diuji boleh diterima. Eramkan pada 37°C semalaman. 3. 2. 5. termasuk satu tabung yang mengandungi broth tanpa antibiotik (tabung kawalan positif). 3. 2. isipadu larutan 0. Untuk memastikan sama ada berlaku pertumbuhan atau tidak. 4.5 ml). 4. 5. Gunakan pena penanda untuk membahagikan permukaan dasar setiap plat media kepada 2 bahagian sama besar untuk mendapatkan 2 ‘separuh plat’ bagi setiap plat media. 5. 2. Sediakan 2 siri tabung yang mengandungi siri pencairan 2 kali ganda antibiotik yang diuji di dalam broth dengan kepekatan tertinggi antibiotik 200 µg atau 200 unit setiap ml (tabung bersaiz 13 mm x 100 mm. Tatacara Ujian MBC (Kepekatan Bakterisidal Minimum) BAHAN 1. 4.5 ml ke dalam setiap tabung. Dengan menggunakan pipet yang sama. Mulakan penitisan dari separuh tabung dengan kepekatan antibiotik yang tertinggi hinggalah kepada tabung dengan kepekatan yang paling rendah. Pastikan permukaan agar betul-betul kering. Goncang dan amatilah setiap tabung daripada kedua-dua siri tabung ini untuk menentukan pertumbuhan bakteria (positif . cara yang mudahnya adalah dengan merujuk kepada tabung kawalan positif yang mengandungi bakteria tanpa antibiotik (keruh). Lakukan pencairan kultur broth semalaman bakteria yang diuji dan bakteria kawalan sebanyak 1:1000 di dalam broth baru untuk memperoleh ~ 10 5 bakteria hidup setiap ml. negatif . Masukkan 0.Tatacara Ujian MIC (Kepekatan Perencatan Minimum) BAHAN 1. 3.keruh. Biarkan titisan larutan mengering sebelum mengeramkan plat pada 37°C semalaman. 4. 6. titiskan (secara terpisah) 3 titis kandungan setiap tabung yang didapati jernih sahaja dalam siri tabung ujian MIC ke atas separuh plat. Pastikan tabung yang steril digunakan dan pencairan dibuat secara teknik aseptik. Kultur broth bakteria yang diuji Kultur broth bakteria kawalan Tabung-tabung uji (steril) Pipet bersukat Antibiotik Inkubator bersuhu 37°C TATACARA 1. 95 .jernih). 2. 3. N OTA 1. Pastikan terdapat juga 1 tabung yang mengandungi antibiotik dengan broth yang tidak mengandungi bakteria (tabung kawalan negatif).

6. 96 . Tentu dan pastikan pencairan yang terendah di mana tidak terdapat pertumbuhan bakteria lagi. Amati pertumbuhan koloni di atas plat bagi setiap pencairan. Ini merupakan kepekatan bakterisidal minimum. 7.

7. 7. N OTA 1. tindakan sesuatu mikrob dengan antibodi yang spesifik terhadapnya adalah suatu pendekatan yang digunakan dalam pengenalan identiti sesuatu mikrob. maka adalah sukar untuk menentukan identiti kebanyakan mikrob berdasarkan pengamatan secara langsung. tatacara perencatan. terdapat banyak ujian serologi dan banyak variasi sesuatu ujian. ELISA terdiri daripada beberapa jenis asai: tatacara persaingan. fasa pepejal anti-IgM dan tatacara secara tidak langsung (asai untuk pengesanan antibodi). Dalam hal ini. Pemisahan ini dilakukan melalui pencucian. iaitu ELISA. Tindakan antigen mikrob dengan antibodi dapat dikenal pasti dengan beberapa cara seperti mewujudkan presipitasi atau aglutinasi. ELISA dan aglutinasi lateks biasanya dilakukan dengan reagen komersial. Rancangkan kekerapan ujian yang akan dijalankan untuk mengoptimumkan penggunaan sesuatu kit kerana reagen dan fasa pepejal (telaga. Di bidang mikrobiologi. Oleh yang demikian. Jika percantuman adalah dengan fluorokrom. aspek umum kedua-dua ujian berkenaan akan dibentangkan.1 ELISA Asai imunosorben bergabung enzim (enzyme-linked immunosorbent assay) atau lebih terkenal dengan singkatan ELISA adalah sejenis imunoasai yang antigen atau antibodi larut dilekatkan kepada suatu permukaan pepejal seperti permukaan manik atau telaga tanpa menghilangkan reaktiviti komponen imunologiknya. aglutinasi lateks dan imunopendafluor. 2. mikrob berkemampuan menghasilkan antibodi yang bertindak secara spesifik dengannya. Asai ini merupakan imunoasai heterogenus kerana ia mempunyai suatu peringkat di mana komponen yang dilabelkan (gabungkan) enzim yang telah bertindak dengan ligannya dipisahkan daripada komponen yang sama yang tidak bertindak. rasanya tidaklah sesuai untuk dibahaskan tentang tatacara masing-masing. maka kit daripada pengeluar yang berbeza mempunyai tatacara tersendiri. Walau bagaimanapun. Ikuti arahan dengan tepat mengenai tatacara yang dinyatakan oleh pengeluar ujian. 3. ELISA boleh merupakan asai kuantitatif atau kualitatif. Jangan gunakan reagen selepas tarikh pelupusan bagi mengelakkan kemungkinan hasil negatif palsu. Dalam bahagian ini hanya tiga ujian mikrobiologi. Oleh yang demikian. tatacara dwilapisan antibodi. manik) yang disaluti antigen atau antibodi juga digunakan kerana sampel kawalan positif dan negatif turut diasaikan dengan sampel ujian setiap kali ujian dijalankan. sungguhpun kebanyakan ELISA untuk kegunaan dalam mikrobiologi adalah termasuk dalam golongan kedua ini. mikologi dan virologi. Oleh kerana mikrob merupakan antigen yang baik. kebanyakan mikrob seperti bakteria memiliki morfologi kasar yang sama. pancaran cahaya berwarna tertentu – seperti warna hijau-kuning oleh fluorokrom FITC adalah tanda kehadiran kompleks antigenantibodi. Sungguhpun mikroskop boleh digunakan. UJIAN SEROLOGI DALAM MIKROBIOLOGI Suatu aspek yang penting dalam bidang mikrobiologi adalah pengesanan jenis mikrob yang merupakan agen etiologi sesuatu penyakit. Ada juga ujian yang merupakan ujian rekaan makmal sendiri (in-house) di samping ujian komersial. tatacara dwilapisan antibodi yang diubahsuai. pengesanan identiti sesejenis mikrob adalah sukar kerana ia mempunyai saiz yang amat kecil dan tidak dapat dilihat dengan mata kasar. diterangkan kerana ketiga-tiga ujian berkenaan mempunyai aplikasi dalam bidang bakteriologi. 97 . Percantuman antibodi dengan enzim membolehkan antibodi yang melekat kepada antigen dikesan apabila tindakan enzim menukar warna substratnya.

Ujian Aglutinasi Lateks Slaid Antibodi atau antigen boleh digabungkan dengan partikel polistirin (digelarkan ‘lateks’ kerana warna putihnya menyerupai lateks tumbuhan) bagi mengesan antigen atau antibodi masing-masing. Biarkan reagen mencapai suhu bilik sebelum ujian dilakukan kerana penggunaan kit sejurus selepas dikeluarkan dari peti beku mungkin memberikan hasil yang kurang memuaskan. 2. 3. Jangan gunakan reagen selepas tarikh pelupusan supaya mengelakkan kemungkinan hasil positif palsu. Pergabungan antigen dengan antibodi akan menyebabkan kelompok-kelompok besar partikel lateks yang dapat diamati dengan mata kasar. Oleh kerana ujian direka dengan sensitiviti yang tinggi. 5. 9. Jangan lakukan ujian dengan menggunakan reagen daripada beberapa kit yang mempunyai nombor pengeluaran yang berbeza. Jangan tunggu terlalu lama selepas hasil asai dibaca. akan menukar warna hasil ujian daripada apa yang didapati sejurus selepas asai tamat. Tidak semuanya boleh dianggap memuaskan dari segi spesifisiti dan sensitiviti. N OTA 1. Pastikan sisa asai seperti cucian dimasukkan di dalam bekas disinfektan yang sesuai untuk mengelakkan berlakunya infeksi ke atas pengguna makmal. Sungguhpun ujian aglutinasi lateks slaid mudah dilakukan. sungguhpun tindak balas enzim ke atas substratnya telah dihentikan dengan bahan kimia yang sesuai. 6. Baca hasil ujian pada masa yang ditetapkan selepas ujian dimulakan. sama ada daripada segi masa cucian mahupun bilangan cucian yang dilakukan. Tambahan pula. Jangan lakukan ujian dengan menggunakan reagen daripada beberapa kit yang mempunyai nombor pengeluaran yang berbeza. Para pengguna harus mempastikan sesuatu ujian itu bermutu tinggi dan sesuai untuk tujuan mereka. Pastikan sisa daripada asai seperti cucian dimasukkan di dalam bekas disinfektan yang sesuai untuk mengelakkan berlakunya infeksi ke atas pengguna makmal. Ujian ini adalah cepat serta mudah dilakukan dan tidak memerlukan alat radas yang mahal atau canggih. khususnya. 4. Goncang botol-botol reagen supaya memperolehi suspensi reagen lateks yang sama rata sebelum reagen lateks digunakan. Titisan dengan isipadu yang sama boleh dicapai dengan menggunakan mikropipet. umpamanya semalaman sungguhpun pada suhu peti beku. 98 . 7. jika ia dilakukan dengan menggunakan alat pembaca ELISA. Reagen komersial biasanya mempunyai sensitiviti yang amat tinggi dan ini boleh menimbulkan hasil positif palsu jika pencucian antara peringkat pengeraman dengan reagen tidak dilakukan dengan sempurna.4. 8. Amalan ini seharusnya jangan dilakukan kerana mengurangkan isipadu reagen boleh menimbulkan hasil negatif palsu. penyimpanan lama. Dalam sesetengah sistem enzim-indikator. Di pasaran. terdapat berbagai-bagai jenama ujian aglutinasi lateks untuk pengesanan berbagai-bagai antigen/antibodi. 7. 5. beberapa peraturan harus dipatuhi supaya hasil yang didapati boleh diyakini. ujian ini tidak membazirkan reagen jika dilakukan ke atas sebilangan sampel yang kecil. atau pun hasil negatif palsu. Titisan besar reagen daripada botol reagen mungkin menggalakkan para pengguna berusaha untuk mengurangkan isipadu reagen bagi mengurangkan kos. Titisan reagen lateks yang dititiskan daripada botol reagen adalah berbeza-beza. 6. ada kemungkinan hasil negatif palsu didapati jika sampel diuji lebih daripada masa yang ditetapkan. Ikut arahan dengan tepat mengenai tatacara yang dinyatakan oleh pengeluar ujian.

Fluorokrom adalah sebatian semula jadi atau sintetik yang boleh menyerap cahaya gelombang tertentu dan sejurus selepas itu mengeluarkan tenaga sebagai cahaya dengan gelombang yang lebih panjang. Titiskan suspensi sampel (sel diinfeksi mikrob dan ditanggalkan dari permukaan bekas kultur. 2. maka ia meningkatkan spesifisiti. Fluoresein digunakan dalam bentuk fluorescein isothiocyanate ( FITC) kerana kehadiran kumpulan sianat yang mempunyai afiniti untuk protein membolehkan antibodi dicantum dengannya. Tatacara Ujian Imunopendafluor Tidak Langsung BAHAN 1. 9. 8. 13. 3. 3. 4.Ujian Imunopendafluor Tidak Langsung Kehadiran sejenis antigen (misalnya. Jenis warna (gelombang cahaya) yang dikeluarkan adalah khas untuk sejenis fluorokrom. 11. 4. 2. Autopendafluor berwarna hijau-kuning jarang berlaku. Dalam lain perkataan. 10. komponen mikrob) dapat dikenal pasti secara tidak langsung melalui pengamatan mikroskop apabila antigen berkenaan digabung secara spesifik dengan antibodi yang secara langsung tercantum fluorokrom (ujian langsung). gabungan secara spesifik antibodi dengan sesuatu antigen dikenal pasti melalui gabungan antibodi berkenaan dengan antibodi terhadapnya yang tercantum fluorkrom (ujian tak langsung). Biarkan kering. Dalam pendekatan lain. fluoresein adalah fluorokrom yang paling umum digunakan kerana ia mempunyai beberapa kelebihan: 1. 5. 3. Slaid mikroskop atau slaid khas untuk ujian imunopendafluor Piring Petri Kertas turas Kayu aplikator Varnis kuku Antiserum Konjugat antibodi terhadap antiserum dan FITC (‘konjugat’) Larutan salin yang ditampankan fosfat (PBS) Metanol Air suling Larutan PBS 90% dan gliserol 10% Inkubator bersuhu 37°C Mikroskop imunopendafluor TATACARA Penyediaan spesimen sel yang diuji ke atas slaid mikroskop 1. Sebarkan sehingga meliputi kawasan bulat seluas 1 cm garis pusat slaid mikroskop atau memenuhi seluruh telaga. Nisbah amaun tenaga yang dikeluarkan kepada tenaga yang diserap adalah amat tinggi (~85%) maka ia memberi sensitiviti yang baik. 12. Pancaran cahayanya pada gelombang 520 mµ adalah di kawasan sensitiviti pengamatan yang paling baik maka ia memberi sensitiviti yang baik. 7. cahaya suatu warna diserap dan cahaya warna lain dikeluarkan oleh fluorokrom. Sungguhpun terdapat berbagai jenis fluorokrom seperti rodamin dan Texas Red. atau sel dari spesimen klinikal) ke atas sekeping slaid mikroskop atau di dalam telaga cetak slaid mikroskop khas untuk ujian imunopendafluor. Fiksasi spesimen (spesimen yang dititiskan kepada slaid mikroskop atau sel yang ditumbuhkan di atas slaid penutup dan diinfeksi dengan virus) 99 . 6. 2.

3. Tindak balas dengan reagen antibodi 7. 15. 5. Biarkan kering di dalam tempat gelap seperti laci yang tertutup. Cuci semula 2 kali. 18. Sinaran pendafluor latar belakang boleh ditindaskan dengan spesimen dieramkan dengan metilin biru selepas tindakan dengan konjugat antibodi-fluorokrom. 2. pastikan ia berfungsi dengan baik sebelum amaun yang lebih besar dibeli. Pencucian yang dilakukan selepas pengeraman boleh dipendekkan serta lebih berkesan jika PBS dalam bekas yang mengandungi slaid spesimen dikacau dengan alat magnet yang berputar. 11. 1. Pastikan mikroskop imunopendafluor dinyalakan sekurang-kurangnya 20 minit sebelum ia dipadamkan supaya jangka hayat lampu raksa dapat dikekalkan lama. Fiksasi spesimen yang terlalu lama mungkin menimbulkan pendafluor yang tak spesifik. penutup slaid berkenaan ditekan. Biarkan lampu raksa mikroskop bernyala kira-kira 15 minit bagi menstabilkan pancaran cahayanya sebelum spesimen diamati. Untuk mengelakkan kehilangan aktiviti biologinya akibat reagen selalu dicairkan dan dibeku. Reagen konjugat antibodi-fluorokrom biasanya diperolehi daripada sumber komersial. 21. amaun yang kecil digunakan setiap kali. Titiskan persediaan konjugat ke atas spesimen dan sebarkan supaya meliputi ke seluruh spesimen. Masukkan di dalam bekas lembap. spesimen masih boleh dibaca selepas disimpan semalaman. Bilas spesimen yang ada di atas slaid (atau penutup slaid) dengan PBS. 13. 24. 9. reagen berkenaan boleh disimpan pada suhu – 20°C tanpa dibeku jika ia dicampurkan dengan isipadu sama gliserol. 7. Kelilingi spesimen dengan 1 bulatan varnis kuku. Letakkan spesimen yang berada pada penutup slaid di atas slaid yang diletakkan di atas kayu aplikator. 6. Rendam dalam PBS selama 3 minit di dalam piring Petri (cuci). 20. Letakkan slaid di atas kayu aplikator supaya slaid berada lebih tinggi daripada aras kertas turas. 19. Reagen konjugat. 14. 8. 4. 16. Oleh yang demikian. Bilas spesimen ke atas slaid (atau penutup slaid) dengan PBS . Spesimen di atas penutup slaid dilekapkan di atas setitis kecil larutan PBS gliserol. Celup di dalam metanol pada suhu 4°C selama 2 minit. 17. 8. Bilas dengan air suling. 6. 5. biasanya digunakan dalam pencairan yang amat tinggi. Tutup piring Petri dan eramkan di dalam inkubator bersuhu 37°C selama 30-60 minit. Cuci 3 kali dengan PBS. 23. Penyimpanan spesimen di dalam tempat yang gelap akan melambatkan proses ini. Spesimen harus dibaca (diamati dengan mikroskop pendafluor) secepat mungkin kerana intensiti cahaya pendafluor akan berkurang. Jika reagen bermutu tinggi dan ujian dilakukan dengan sempurna. Oleh yang demikian. 100 .4. 12. Keluarkan dan biarkan kering. dan lebih-lebih lagi antiserum. Titiskan persediaan antiserum (sumber antibodi terhadap virus) ke atas spesimen dan sebarkan supaya meliputi seluruh spesimen. 22. Tutup piring Petri dan eramkan dalam alat inkubator bersuhu 37°C selama 30-60 minit. 10. N OTA Alas satu piring Petri dengan sekeping kertas turas dan basahkan dengan air. Patahkan sebatang kayu aplikator di bahagian tengahnya dan letakkan dalam bentuk ‘V’ di atas kertas turas di dalam piring Petri (Ini merupakan bekas lembap). Amati dengan mikroskop pendafluor.

12-13 Pewarnaan Albert (pewarnaan granul metakromatik). 47-49 Inokulasi plat agar dengan 1 jenis bakteria untuk ujian sensitiviti antibiotik. 47-49 Prosedur umum makmal mikrobiologi. 69 Telur-mengumpulkan cecair alantoik. 20 Telur-melakukan penyuluhan. 83-84 Ujian Metil-merah. 82-83 Ujian Voges-Proskauer. 86-87 Ujian keperluan faktor pertumbuhan X dan V. 84-86 Ujian Oksidase. 27 Pewarnaan tahan asid (rujuk kepada pewarnaan ZiehlNeelsen). 23 Pewarnaan Gram untuk fungus. 95 Ujian Motiliti bakteria di dalam agar separuh pepejal. 27 Pewarnaan Kinyoun (terubahsuai) untuk fungus. 25 Pelekapan basah bakteria. 64 Kultur sel-pengkulturan semula sel yang dikrioawetkan. 16 Mikroskop cahaya-pembersihan kanta. 41 Mikroskop elektron-pewarnaan negatif. 56-57 Media agar-menyediakan di dalam plat Petri. 74-76 Ujian Urease. 90 Ujian Resapan disk: Tatacara perbandingan. 70-71 Telur-mengumpulkan cecair amniotik. 26-27 Pewarnaan spora (rujuk kepada pewarnaan Schaeffer Fulton). 92-93 Ujian Resapan disk: Tatacara Stokes. 34 Pewarnaan Gram untuk bakteria. 53-54 Kultur sel-inokulasi dengan virus. 70 Telur-membuat inokulasi ruang amniotik. 39-40 Mikroskop elektron-tatacara imun. 40 Mikroskop cahaya-mengelakkan pertumbuhan fungus. 98 Ujian ELISA. 66 Kultur sel-persediaan media. 17-19 Plat garisan-teknik.penggunaan. 46 Media agar-menyediakan sebagai cerun. 69 Telur-membuat inokulasi ruang alantoik. 10 Fiksasi bakteria dengan haba-membuat. 92 Inkubator CO2 . 91 Inokulasi plat agar dengan 2 jenis bakteria untuk ujian sensitiviti antibiotik. 33 Pewarnaan kapsul (rujuk kepada pewarnaan negatif dengan dakwat India). 79 Ujian Tiga gula besi. 23 Mikroskop elektron-pengamatan spesimen virus. 93-94 Ujian Sensitiviti: Bacitracin. 22 GasPak-mewujudkan keadaan anaerobik. 44-45 Mikroskop elektron-menyaluti grid dengan Formvar. 68 Telur-membuat inokulasi membran korioalantoik. 34-35 Pewarnaan negatif dengan dakwat India. 14-15 Pensterilan gelung dawai dengan api. 64-65 Kultur sel-penghitungan dengan menggunakan hemosiometer. 71-72 Ujian aglutinasi lateks slaid. 97-98 Ujian Elek. 20-21 Asepsis-pemindahan benda dari botol yang tertutup. 16 Mikroskop cahaya-penggunaan. 79 Ujian Sensitiviti: Optochin. 67 Kultur sel-kriopengawetan kultur sel yang hidup. 26 Pewarnaan asid periodik-Schiff. 95 Ujian MBC (Kepekatan Bakterisidal Minimum). 11 Pensterilan menggunakan alkohol yang membakar. 78 101 . 33 Pewarnaan metenamina-argentum Gomori. 17 Pelekapan basah KOH untuk fungus. 61-62 Kultur sel-tripsinisasi sel selapisan dan pengermaan kultur sel. 62-63 Kultur slaid fungus-membuat. 53 Bantuan pemula-rawatan. 60-61 Kultur sel-tripsinisasi seluruh tisu. 89 Ujian Fermentasi gula dan penghasilan gas. 52 Inokulasi plat agar dengan kultur yis. 31 Pelekapan basah lactophenol coton blue untuk fungus. 71 Telur-mengambil membran korioalantoik. 99-100 Ujian Katalase. 32 Pelekapan basah salin untuk fungus. 77-78 Ujian MIC (Kepekatan Perencatan Minimum) tabung. 13 Balang anaerobik-penggunaan. 47 Media bakteria-jenis. 38-39 Mikroskop elektron-pengamatan spesimen bakteria. 80-81 Ujian Koagulase. 30 Pelekapan titisan tergantung untuk bakteria. 76-77 Ujian Imunopendafluor. 52 Balang lilin-mewujudkan atmosfera karbon dioksida. 73-74 Ujian Indol. 25 Pewarnaan Ziehl-Neelsen.INDEKS Apusan bakteria-membuat. 9 Slaid mikroskop-membersihkan dan simpanan. 10 Disinfektan-penggunaan. 36 Pewarnaan Schaeffer-Fulton. 55-56 Kultur yis-merangsang penghasilan tiub germa.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful