P. 1
Dna

Dna

|Views: 571|Likes:
Published by Mehawati Tarombo

More info:

Published by: Mehawati Tarombo on Dec 22, 2010
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOC, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

06/25/2013

pdf

text

original

Teknik molekuler

Sekarang ini penggunaan metode molekuler telah sangat luas untuk analisis sel dan penentuan urutan nukleotida dari keseluruhan genom. Pengetahuan mengenai aktivitas DNA polymerase, enzim restriksi dan DNA ligase melahirkan teknik-teknik kloning DNA dan PCR (polymerase chain reaction) yang memungkinkan diisolasinya segmen DNA. Para ilmuwan juga telah mengembangkan alat dan metode untuk memurnikan protein dan meneliti fungsinya. DNA Isolasi DNA DNA adalah molekul yang terdapat pada semua mahluk hidup. Molekul ini sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata. Tetapi DNA dapat diekstrak dari ribuan sel sehingga DNA dapat terlihat karena jumlahnya yang sangat banyak. Tahapan dalam ekstraksi DNA adalah pemecahan sel, keluarnya DNA dari nukleus dan pengendapan/presipitasi DNA. Ekstraksi DNA memiliki banyak aplikasi praktis, diantaranya adalah untuk tujuan pemuliaan, evolusi, sitematik, konservasi, dll. Dalam ekstraksi DNA tumbuhan, metode ekstraksi yang sering digunakan adalah berdasarkan Doyle dan Doyle 91989). Metode ini menggunakan buffer ekstraksi yang terdiri dari Elektroforesis DNA Pemisahan DNA dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel. Molekul DNA terpisah berdasarkan ukuran ketika dilewatkan pada matriks gel dengan aliran listrik. DNA memiliki muatan negatif, dan saat berada dalam aliran listrik, akan bermigrasi melalui gel menuju kutub positif (Gambar 1). Molekul yang berukuran besar, memiliki kesulitan melewati pori-pori gel sehingga bermigrasi lebih lambat melalui gel dibandingkan DNA yang berukuran lebih kecil. Setelah elektroforesis selesai, molekul DNA divisualisasi dengan pewarna fluorescent seperti ethidium yang berikatan dengan DNA dan berada di antara basa-basa DNA.

Gambar 1. Elektroforesis DNA dengan gel agarosa Dua alternatif macam gel adalah poliakrilamida dan agarosa. Poliakrilamida memiliki kapasitas resolusi yang lebih tinggi, tetapi gel poliakrilamida dapat memisahkan DNA hanya dalam rentang ukuran DNA yang sempit. Jadi gel poliakrilamida dapat memisahkan DNA satu sama lainnya yang berbeda ukurannya hanya beberapa atau bahkan satu pasang basa saja tetapi pada molekul yang berukuran beberapa ratus pasang basa saja (dibawah 1000 pasang basa). Gel agarosa memiliki resolusi yang lebih rendah tetapi dapat memisahkan DNA yang berukuran sampai puluhan kilo pasang basa. DNA yang berukuran sangat panjang tidak dapat melewati pori gel bahkan pori gel agarosa. DNA yang sangat besar melewati matriks dengan satu ujung bergerak lebih dulu sedang ujung lainnya mengikuti. Akibatnya DNA diatas ukuran tertentu (30 -50 kb) bermigrasi dengan jarak yang sama sehingga tidak dapat diamati pemisahannya. DNA yang sangat panjang ini dapat dipisahkan satu sama lainnya dengan jika daerah listrik diaplikasikan dalam ‘pulses’ yang berasal secara orthogonal satu sama lainnya. Teknik ini disebut pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) (Gambar 2).

Pulsed field gel electrophoresis Gambar 2. Pulsed field gel electrophoresis Elektroforesis juga digunakan untuk memisahkan RNA. Seperti juga DNA, RNA memiliki muatan negative, tetapi molekul RNA merupakan molekul utas tunggal dan memiliki struktur sekunder atau tersier. Untuk mengatasinya, RNA diberi perlakuan dengan glyoxal yang bereaksi dengan RNA sehingga menghalangi pembentukan pasangan basa. RNA yang ter-glyoxylasi tidak dapat membentuk struktur sekunder atau tersier sehingga dapat bermigrasi dengan mobilitas yang proporsional terhadap ukurannya. Elektroforesis juga digunakan untuk memisahkan protein dengan prinsip yang sama. Pemotongan DNA dengan enzim restriksi Kebanyakan molekul DNA dalam sel berukuran lebih besar dari yang diperlukan untuk analisa DNA di laboratorium. Jika akan mempelajari gen secara individual atau mempelajari situs individual pada DNA, molekul DNA berukuran besar di dalam sel harus dipotong ke dalam fragmen-fragmen yang lebih kecil. Pemotongan DNA ini dilakukan dengan menggunakan enzim endonuklease restriksi. Nuklease ini adalah enzim yang memotong DNA pada tempat tertentu dengan cara mengenali urutan basa yang spesifik (Gambar 3). Enzim restriksi yang digunakan dalam biologi molekuler umumnya mengenali urutan basa yang pendek (4-8 bp) dan memotong pada posisi tertentu yang telah ditentukan dalam urutan sekuens DNA tersebut. Contohnya adalah enzim EcoRI yang ditemukan pada strainEscherichia coli dan merupakan enzim restriksi yang pertama (I) ditemukan pada spesies ini. Enzim ini mengenali urutan DNA 5′-GAATTC-3′.

Gambar 3. Situs pengenalan enzim restriksi Jika molekul DNA yang sama dipotong dengan enzim restriksi yang berbeda, misalnya oleh HindIII yang mengenali urutan 6pb (5′-AAGCTT-3′), atau dipotong dengan EcoRI, maka molekul DNA dipotong pada posisi yang berbeda dan menghasilkan fragmen dengan ukuran yang berbeda (Gambar 4). Jadi sebuah molekul akan menghasilkan sebuah seri karakteristik pola pemotongan DNA saat dipotong dengan satu set enzim restriksi yang berbeda.

DNA probe harus dilabel. hibridisasi merupakan dasar untuk mendeteksi sekuens spesifik dalam campuran asam nukleat yang kompleks. Probe digunakan untuk mencari molekul yang memiliki sekuens komplementer dalam campuran DNA. HindIII dan PstI menghasilkan ujung lengket (Gambar 5). Dalam hal ini. DNA yang terdenaturasi dari dua sumber yang berbeda bercampur satu sama lain dalam kondisi yang sesuai kekuatan ion dan temperaturnya. ‘Probing’ dilakukan dalam kondisi konsentrasi garam dan temperature dekat dengan kondisi denaturasi dan reanturasi asam nukleat. sehingga dapat dengan mudah diketahui lokasinya saat telah menemukan sekuens targetnya. Campuran yang telah ter=probe dipisahkan berdasarkan ukuran pada gel atau didistribusikan sebagai perpustakaan klon (library of clones) Gambar 6. Dalam kondisi ini DNA probe akan berhibridisasi dengan kuat hanya dengan komplementer yang tepat. Misalnya genom yeast dipotong dengan enzim EcoRI dan peneliti ingin mengetahui ukuran fragmen DNA yang mengandung gen yang diinginkan. Pemotongan DNA dengan EcoRI menghasilkan fragmen DNA dengan ukuran yang bervariasi Enzim restriksi jenis lain seperti Sau3A1 yang ditemukan pada bakteri Staphylococcus aureusmengenali sekuens teramerik (4bp) dengan urutan 5′-GATC-3′ sehingga enzim ini memiliki frekuensi yang lebih tinggi dalam memotong DNA. Enzim restriksi tidk hanya berbeda dalam urutan basa yang dikenali. maka akan menghasilkan autoradiogram dengan pola terekspos sama dengan lokasi hybrid (Gambar 6). Gel edirendam dalam larutan alkamli untuk mendenaturasikan double heliks. ribuan fragmen DNA yang dihasilkan dari pemotongan genom yeast dengan enzim restriksi berjumlah terlalu banyak sehingga tidak dapat dipisahkan menjadi ‘band’ DNA yang terpisah. Setelah DNA tertransfer pada membran. Banyak teknik yang tergantung pada ke-khas-an hibridisasi antara dua molekul DNA dari sekuens yang komplementer. Gambar 5. Fragmen ini kemudian ditransfer dari gel ke membrane yang bermuatan positif tempat DNA akan terikat. Saat diwarnai dengan etidium bromida. Media film atau media yang sensitif terhadap cahaya atau elektron yang dikeluarkan oleh DNA yang dilabel dapat mendeteksi lokasi probe berhibridisasi. membran diinkubasi dengan probe yang mengandung sekuens DNA komplementer dengan sekuens yang diinginkan. enzim lain seperti EcoRI. Saat X-ray film diekspos ke filter dan di-develop. kira-kira satu kali dalam 250bp. . satu molekul adalah ‘probe’ dari sekuens tertentu (dapat berupa sekuens yang dimurnikan atau molekul DNA yang disintesis secara kimia. Di sisi lain terdapat enzim retriksi yang mengenali sekuens oktamerik (8 bp) yaitu enzim NotI yang mengenali uruta 5′-GCGGCCGC-3′ dan rata-rata memotong hanya sekali dalam 65 kb. Beberapa enzim seperti HpaI menghasilkan produk dengan ujung tumpul. Mereka tampak ‘smear’.Gambar 4. Sebagai contoh. tetapi juga pada pada struktur hasil produk pemotongannya. Proses perpasangan basa antara polinukleotida utas tunggal yang komplementer disebut hibridisasi. Teknik yang dianamakan Southern blot hybridization akan mengidentifikasi ukuran dari fragmen tertentu di antara smear DNA. Ujung lengket dan ujung tumpul yang merupakan hasil pemotongan DNA dengan enzim restriksi Hibridisasi DNA untuk mengidentifikasi molekul DNA yang spesifik DNA yang telah terdenaturasi memiliki kapasitas untuk bergabung kembali (untuk membentuk kembali pasngan basa di antara utas komplementer). Hal ini menyebabkan terjadinya pembentukan molekul hybrid saat homolog.

Beberapa bakteri. Vektor DNA memiliki tiga karakteristik yaitu: 1. 2. Antibiotika kemudian ditambahkan dalam medium untuk menyeleksi pertumbuhan sel yang mengambil DNA plasmid . Hal ini menyebabkan fragmen DNA dapat disisipkan pada tempat tertentu dalam vector sehingga penyisipan tidak mengganggu kedua fungsi lainnya. Gambar 7. Untuk membuat perpustakaan DNA. tidak dapat tumbuh (Gambar 7). sedang yang tidak membawa plasmid. Proses ini melibatkan vektor yang menjadi sarana DNA untuk memperbanyak klon DNA dalam sel dan ‘insert DNA’ yang disisipkan di dalam vector. DNA yang telah terpotong selanjutnya dicampurkan dengan vector yang sesuai (yang dipotong dengan enzim restriksi yang sama) dan ditambah ligase. Hal ini menghasilkan koleksi vector dengan insert DNA yang berbeda (Gambar 8). E. Vektor yang paling umum berukuran kecil (kira-kira 3 kb) merupakan molekul DNA sirkular disebut plasmid. Perpustakaan molekul DNA (DNA library) dapat dihasilkan melalui cloning Perpustakaan DNA merupakan populasi vector identik yang masing-masing berisi insert yang berbeda. Kloning DNA dalam plasmid vektor DNa dipotong dengan enzim restriksi. fragmen DNA tertentu dapat dimurnikan dan diamplifikasi untuk menghasilkan produk dalam jumlah besar. Mengandung marker selektif yang menyebabkab sel yang membawa vector (termasuk DNA yang dibawa) dapat diidentifikasi 3. Pada banyak kasus. Potongan DNA yang akan diklon kemudian disambungkan dengan bantuan DNA ligase (Gambar 7).Gambar 6. coli dapat mengambil DNA secara alami dan dikatakan memiliki kompetensi genetik. Kloning DNA dalam plasmid vektor Vektor dapat dimasukkan ke organism inang melalui transformasi Transformasi merupakan proses dimana organisme inang mengambil DNA dari lingkungan. Hasil probing DNA Kloning DNA Kemampuan molekul DNA membentuk rekombinan dan menjaganya dalam sel disebut kloning DNA. Memiliki situs yang unik/khas untuk satu atau lebih enzim restriksi. coli dapat bersifat kompeten mengambil DNA melalui perlakuan dengan ion kalsium. . Mengandung asal replikasi (origin of replication) yang memungkinkan DNA bereplikasi secara independen/bebas dari kromosom inang. kemudian dimasukkan ke dalam vektor untuk diperbanyak.sell ini disebut transforman. Memasukkan fragmen DNA ke dalam vector pada dasarnya merupakan proses yang mudah. Inang (host) yang umum digunakan untuk memperbanyak DNA adalah bakteriE. DNA target dipotong dengan enzim restriksi yang memberikan ukuran rata-rata insert yang diinginkan. Dengan menghasilkan molekul DNA rekombinan yang dapat diperbanyak pada organisme inang. Misalnya plasmid memiliki situs pengenalan untuk EcoRI. Kunci untuk menghasilkan molekul DNa rekombinan adalah enzim restriksi yang memotong DNA pada tempat spesifik dan enzim lain yang yang menyambung DNA yang terpotong dengan DNA lain. coli. DNA plasmid membawa gen resistensi terhadap antibiotika. Sel yang membawa plasmid akan dapat tumbuh pada medium. maka vector disiapkan dengan memotongnya dengan Eco RI. tetapi bukan E. Ukuran insert dapat berkisar kurang dari 100 bp sampai lebih dari satu megabase. Molekul ini biasanya ditemukan pada banyak bakteri.

Selanjutnya. mRNA dikonversi menjadi kopi DNA utas ganda yang disebut cDNA (copy DNA). Saat diberi perlakuan dengan reverse transcriptase. DNA utas ganda didenaturasi pada suhu 95C sehingga membentuj DNA utas tunggal yang berfungsi sebagai cetakan. cDNA library akan memiliki ribuan insert yang berbeda dan masing-masing terdapat dalam vektot umum. Tiap sel akan tumbuh menjadi koloni dan tiap sel dalam koloni mengandung vector yang sama dan insert dari library. Suhu ditingkatkan menjadi 72C sehingga enzim DNA polymerase dapat melakukan sintesis DNA membentuk utas ganda DNA baru. Utas ganda DNA yang baru disintesis. Proses penggunaan probe dengan DNA yang dilabel digunakan untuk melakukan screening terhadap library disebut colony hybridization. Membran ditekan di atas koloni dan cetakan koloni aakan berada pada membrane. Pembentukan DNA library Berbagai perpustakaan DNA dapat dihasilkan dengan menggunakan insert dari berbagai sumber. Ikatan preimer terjadi pada utas yang komplementer dengan cetakan pada daerah ujung batas sekuen DNA target. Filter yang mengandung sel diberi perlakuan yang memecah sel dan mengeluarkan DNA yang kemudian terikat pada filter pada lokasi yang sama dengan sel. ‘cDNA library’ dikembangkan untuk memperkaya ‘coding sequences’ dalam library. II. teknik ini telah melahirkan teknik PCR-based marker teknik lainnya yang sangat bervariasi. III. Gambar 10 menunjukkan proses PCR. DNA utas tunggal yang pendek (disebut primer) berikatan dengan DNA cetakan pada temperature rendah. . cDNA dan vector diberi perlakuan dengan enzim restriksi yang sama dan fragmen-fragmen hasilnya disambungkan ke dalam vector. Sejak ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1983. membrane filter dengan positive charge digunakan untuk probing. proses pembentukan library sama dengan pembentukan library pada DNA genomic. cDNA library dibuat dengan menggunakan mRNA yang dikonversi menjadi DNA. PCR (polymerase chain reaction) PCR adalah sebuah teknik biologi molekuler untuk mereplikasikan DNA dengan menggunakan enzim Taq polimerase. Produk PCR diamati dengan gel elektroforesis dengan menggunakan gel agarose ataupun gel poliakrilamida dan diamati dengan uv-transiluminator. Proses ini disebut reverse transcription yang dilakukan oleh enzim reverse transcriptase (Gambar 9).Gambar 8. Pembentukan cDNA Hibridisasi digunakan untuk mengidentifikasi klon spesifik dari sebuah library Identifikasi fragmen dari sebuah gen di antara klon-kon dapat dilakukan dengan menggunakan DNA probe yang urutan DNAnya sesuai dengan sebagian dari urutan DNA gen yang diinginkan. Setelah transformasi ke dalam bakteri khusus yang cocok sebagai inang. Protokol dasar PCR adalah: I. Perpustakaan DNA yang paling sederhana dihasilkan dari DNA genomik total yang disebut dengan ‘genomic libraries’. PCR digunakan untuk mengamplifikasi bagian DNA yang pendek (sampai 10 kb). Filter selajutnya diinkubasi dengan probe. IV. didenaturasi pada suhu tinggi dan siklus berulang. Selanjutnya dilakukan probing terhadap filter. Gambar 9. sel ditumbuhkan dalam cawan petri dalam media agar.

DNA genom kloroplast berasal dari kloroplast. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan potasium. atau sel manusia. Pertama. Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol. dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan kloroplast. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. DNA penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri) atau dibungkus oleh protein tertentu (pada virus). maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. DNA genome inti (nuclear DNA genome) berasal dari inti sel. hewan dan tumbuhan terdapat di dalam inti sel. DNA genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari mitokondria. Proses ini membebaskan DNA kromosom. Selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih plasmid. Proses PCR Dasar Teori DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia. Untuk memisahkan DNA plasmid. kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA). Supernatan yang mengandung DNA plasmid. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya. Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air. Sumber DNA bisa dari tanaman. DNA plasmid. Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Kromosom eukariot berbentuk linear sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Isolasi DNA kromosom. protein dan komponen lain.Gambar 10. Isolasi DNA plasmid DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen. RNA dan protein yang tersisa dipisahkan. sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. Penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. . kultur mikroorganise. RNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90 oC untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Pada organisme tingkat rendah. sehingga yang tinggal adalah DNA. membran sel dilisis dengan penambahan detergen. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding kromosom.

Atau RNA total juga dapat di isolasi dari sel dengan menambahkan enzim DNase yang berfungsi untuk mendegradasi DNA Ekstraksi DNA dari organisme eukaryote (manusia. Hasil ekstraksi tersebut merupakan tahapan penting untuk langkah berikutnya. Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti EDTA (ethyllenediamine tetraacetic). mRNA eukariot dapat dipisahkan dari DNA dengan menggunakan oligonukleotida dT. Jumlah populasi mRNA akan lebih banyak dibanding dengan DNA. Berbagai teknik ekstraksi DNA telah dikembangkan dari prinsip dasar tersebut. Oleh sebab itu dalam pelaksanaannya harus dilakukan dengan baik dan bebas kontaminasi. lapisan tengah berwarna putih tipis adalah sel darah putih (buffy coat) dan lapisan bawah adalah sel darah merah. Lapisan kedua yang merupakan sel darah putih diambil dengan klinipette. sel darah merah dan sel darah putih (dilapisan buffy coat) dengan teknik sentrifugasi. dan mengendapkan DNA sewaktu dicampur dengan ethanol. Isolasi DNA dengan teknik sentrifugasi akan mengendapkan DNA. hanya sel darah putih yang mempunyai inti dan mengandung DNA. hewan dan tumbuhan) dilakukan melalui proses penghancuran dinding sel (lysis of cell walls). dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). Dalam proses ini sebagian kecil RNA juga dapat dibersihkan. sehingga saat ini muncul berbagai teknik ekstraksi dan purifikasi DNA. EDTA berfungsi sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion magnesium (ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuclease yang merusak asam nukleat). Oleh sebab itu sampel darah total (whole blood) yang masih segar langsung dipisahkan menjadi serum. memisahkan DNA dari larutan. Sedangkan choloform digunakan untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari larutan. Pada manusia. SDS merupakan sejenis deterjen yang berfungsi merusak membrane sel. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Agar lebih efisien. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader 193). Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Enzim RNAase digunakan untuk menghancurkan RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh. Pemurnian atau purifikasi DNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan DNA tersebut dengan NaCl yang berfungsi memekatkan. penghilangan protein dan RNA (cell digestion) dan pengendapan DNA (precipitation of DNA) dan pemanenan. Setelah disentrifugasi. isolasi DNA dilakukan hanya terhadap sel darah putih. Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen sel lainnya. Proses sentrifugasi dengan kecepatan tinggi akan mengendapkan tepung berwarna putih (DNA) dan menempel di dasar tabung ependorf. yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell 2002). yaitu lapisan paling atas merupakan serum. terutama mRNA merupakan materi genetik yang mengkode suatu protein. Enzim proteinase K dapat digunakan untuk menghancurkan protein. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah. Kemudian molekul nuleotida (DNA dan RNA) yang telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan menggunakan phenol.Isolasi RNA RNA. Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Supaya hasil isolasi berupa DNA murni yang tidak tercampur dengan molekul-molekul lain maka dalam . sampel darah total akan terbagi menjadi tiga lapisan.

Akan tetapi pada beberapa kelompok pergerakan DNA tiadak dapat diamati. Penambahan warna ini berfungsi untuk menambah densitas sehingga DNA bearada di bagian bawah sumur. NaOH sendiri dapat mendenaturasi protein. Kemurnian DNA plasmid kelompok 8 menunjukan hasil sebesar 1. Elektroforesis memisahkan DNA. Selain itu kesalahan juga dapat terjadi karena DNA yang telah masuk ke dalam sumur tersedot kembali masuk ke dalam pipet mikro. Selain itu larutan A juga berfungsi sebagai buffer dan pengkelat. Sedangkan larutan C befrungsi untuk merenarutasikan kembali. Sebelum proses elektroforesis suspensi DNA dicampur dengan peyangga muatan berwarna loading dye.proses isolasinya dicampurkan berbagai macam larutan. RNA. Bakteri yang telah lisis ini ditandai dengan munculnya lendir. Kecepatan pergerakan ini tergantung pada ukuran molekul DNA. Larutan B yang terdiri atas SDS dan NaOH berfungsi sebagai larutan pelisis. Sehingga sumur tidak berisi DNA. . Kuantifikasi DNA total dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm menunjukkan bahwa rendemen isolasi DNA konsentrasinya berkisar antara 19610 ng/ µL dan 19800 ng/ µL tiap 1500 µL bahan biakan E. Agar proses lisisnya bakteri sempurna maka larutan dibolak-balik secara halus. Pemilihan buffer tersebut dilihat dari kemampuan buffer menghasilhkan arus listrik. Tingkat kemurnian DNA plasmid yang diisolasi dilihat dari nilai absorban pada panjang gelombang 260 nm dibadi nilai absorban pada panjang gelombang 280 nm. DNA hasil elektroforesis yang terlihat di atas lampu UV dapat dilihat pergerakannya. Hal ini dapat dilihat dari pergerakannya yang tinggi. Larutan A berfungsi sebagai resuspensi yaitu penggabunagn kembali pelet yang telah terbentuk dengan larutan yang dicampurkan. Larutan di vortex untuk memudahkan bakteri tersuspensi. Larutan ddH2O yang ditambahkan berfungsi agar endapan DNA yang dihasilkan didapat dengan konsentrasi yang cukup tinggi. coli. serta arus listrik yang diberikan untuk bermigrasi molekul DNA. dan protein berdasarkan bobot molekul dan muatanya dengan menggunakan media pemisah. DNA bermuatan negatif sehingga pada elektroforesis DNA akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Hasil elektroforesis DNA total menunjukkan adanya pita-pita DNA yang diisolasi dari bakteri Escherichia coli yang kemungkinan adalah DNA plasmid (Gambar 1). Sehingga pergerakan yang tinggi ini menunjukan ukuran DNA yang tidak terlalu besar. selain itu pewarna ini digunakan untuk memudahkan meletakan contoh DNA ke dalam sumur dan bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Hal ini menunjukkan bahwa DNA total yang diisolasi mempunyai keutuhan yang tinggi. Cairan ini ditambahkan RNase untuk melisiskan RNA supaya hasil yang diisolasi berupa DNA murni. Ciran DNA yang dihasilkan kemudina dipisahkan dari endapannya.115. Plasmid merupakan DNA sirkuler yang ukurannya relatif kecil. Pergerakan DNA di agarose berhubungan dengan besar molekul. DNA yang telah diisolasi diuji kualitas dan kuantitasnya melalui elektroforesis dan spektrofotometer. kerapatan media gel yang dilalui DNA. Bisa jadi DNA yang dimasukan tidak masuk benar-benar ke dalam sumur gel sehingga saat elektroforesis DNA tidak bergerak. Bakteri yang telah diendapkan tersebut kana lisis dengan penambahan larutan buffer. Nilai ini belim termasuk nilai DNA murni karena isolasi DNA murni nilainya lebih besar atau sama dengan 1. Etanol 70% yang digunakan dalam proses isolasi berfungsi untuk mengeluarkan endapan garam karena Na+ bermuatan positif dan DNA bermuatan negatif.8. Kejadian ini dapat terjadi karena kesalahan teknis saat memasukan DNA ke dalam sumur gel agarose.

khususnya plasmid. sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan. plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC). sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. . Dengan demikian. Pertama. Teknik Isoalsi DNA Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik. yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi. Oleh karena itu. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. tekanan tinggi. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl . Setelah sel mengalami lisis. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor. remukan-remukan sel harus dibuang. aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom. beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim.Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel. zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->