Professional Documents
Culture Documents
Sekarang ini penggunaan metode molekuler telah sangat luas untuk analisis sel dan penentuan urutan nukleotida dari keseluruhan genom. Pengetahuan mengenai
aktivitas DNA polymerase, enzim restriksi dan DNA ligase melahirkan teknik-teknik kloning DNA dan PCR (polymerase chain reaction) yang memungkinkan diisolasinya
segmen DNA. Para ilmuwan juga telah mengembangkan alat dan metode untuk memurnikan protein dan meneliti fungsinya.
DNA
Isolasi DNA
DNA adalah molekul yang terdapat pada semua mahluk hidup. Molekul ini sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata. Tetapi DNA dapat diekstrak dari ribuan
sel sehingga DNA dapat terlihat karena jumlahnya yang sangat banyak. Tahapan dalam ekstraksi DNA adalah pemecahan sel, keluarnya DNA dari nukleus dan
pengendapan/presipitasi DNA. Ekstraksi DNA memiliki banyak aplikasi praktis, diantaranya adalah untuk tujuan pemuliaan, evolusi, sitematik, konservasi, dll.
Dalam ekstraksi DNA tumbuhan, metode ekstraksi yang sering digunakan adalah berdasarkan Doyle dan Doyle 91989). Metode ini menggunakan buffer ekstraksi yang
terdiri dari
Elektroforesis DNA
Pemisahan DNA dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel. Molekul DNA terpisah berdasarkan ukuran ketika dilewatkan pada matriks gel dengan aliran listrik.
DNA memiliki muatan negatif, dan saat berada dalam aliran listrik, akan bermigrasi melalui gel menuju kutub positif (Gambar 1). Molekul yang berukuran besar, memiliki
kesulitan melewati pori-pori gel sehingga bermigrasi lebih lambat melalui gel dibandingkan DNA yang berukuran lebih kecil. Setelah elektroforesis selesai, molekul DNA
divisualisasi dengan pewarna fluorescent seperti ethidium yang berikatan dengan DNA dan berada di antara basa-basa DNA.
Dasar Teori
DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan terdapat di dalam
inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan kloroplast. Penyebutan
nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA genome inti (nuclear DNA genome)
berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari
mitokondria, DNA genom kloroplast berasal dari kloroplast. Pada organisme tingkat rendah,
DNA penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri) atau
dibungkus oleh protein tertentu (pada virus). Kromosom eukariot berbentuk linear
sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung
satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh
lebih kecil dibanding kromosom.
Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA
yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan
campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat
molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada
pada bagian atas tabung (Mader 193). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua
macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada
bagian bawah (Campbell 2002).
Isolasi DNA dengan teknik sentrifugasi akan mengendapkan DNA. Supaya hasil isolasi
berupa DNA murni yang tidak tercampur dengan molekul-molekul lain maka dalam
proses isolasinya dicampurkan berbagai macam larutan. Larutan A berfungsi sebagai
resuspensi yaitu penggabunagn kembali pelet yang telah terbentuk dengan larutan
yang dicampurkan. Selain itu larutan A juga berfungsi sebagai buffer dan pengkelat.
Pemilihan buffer tersebut dilihat dari kemampuan buffer menghasilhkan arus listrik.
Larutan B yang terdiri atas SDS dan NaOH berfungsi sebagai larutan pelisis. NaOH
sendiri dapat mendenaturasi protein. Sedangkan larutan C befrungsi untuk
merenarutasikan kembali. Etanol 70% yang digunakan dalam proses isolasi berfungsi
untuk mengeluarkan endapan garam karena Na+ bermuatan positif dan DNA
bermuatan negatif. Larutan ddH2O yang ditambahkan berfungsi agar endapan DNA
yang dihasilkan didapat dengan konsentrasi yang cukup tinggi. Larutan di vortex
untuk memudahkan bakteri tersuspensi. Bakteri yang telah diendapkan tersebut
kana lisis dengan penambahan larutan buffer. Agar proses lisisnya bakteri sempurna
maka larutan dibolak-balik secara halus. Bakteri yang telah lisis ini ditandai dengan
munculnya lendir. Ciran DNA yang dihasilkan kemudina dipisahkan dari endapannya.
Cairan ini ditambahkan RNase untuk melisiskan RNA supaya hasil yang diisolasi
berupa DNA murni.
DNA yang telah diisolasi diuji kualitas dan kuantitasnya melalui elektroforesis dan
spektrofotometer. Elektroforesis memisahkan DNA, RNA, dan protein berdasarkan
bobot molekul dan muatanya dengan menggunakan media pemisah. DNA bermuatan
negatif sehingga pada elektroforesis DNA akan bergerak dari kutub negatif ke kutub
positif. Kecepatan pergerakan ini tergantung pada ukuran molekul DNA, kerapatan
media gel yang dilalui DNA, serta arus listrik yang diberikan untuk bermigrasi
molekul DNA. Sebelum proses elektroforesis suspensi DNA dicampur dengan
peyangga muatan berwarna loading dye. Penambahan warna ini berfungsi untuk
menambah densitas sehingga DNA bearada di bagian bawah sumur, selain itu
pewarna ini digunakan untuk memudahkan meletakan contoh DNA ke dalam sumur
dan bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat
digunakan sebagai tanda migrasi DNA.
DNA hasil elektroforesis yang terlihat di atas lampu UV dapat dilihat pergerakannya.
Hasil elektroforesis DNA total menunjukkan adanya pita-pita DNA yang diisolasi dari
bakteri Escherichia coli yang kemungkinan adalah DNA plasmid (Gambar 1). Hal ini
dapat dilihat dari pergerakannya yang tinggi. Pergerakan DNA di agarose
berhubungan dengan besar molekul. Sehingga pergerakan yang tinggi ini
menunjukan ukuran DNA yang tidak terlalu besar. Plasmid merupakan DNA sirkuler
yang ukurannya relatif kecil. Hal ini menunjukkan bahwa DNA total yang diisolasi
mempunyai keutuhan yang tinggi. Akan tetapi pada beberapa kelompok pergerakan
DNA tiadak dapat diamati. Kejadian ini dapat terjadi karena kesalahan teknis saat
memasukan DNA ke dalam sumur gel agarose. Bisa jadi DNA yang dimasukan tidak
masuk benar-benar ke dalam sumur gel sehingga saat elektroforesis DNA tidak
bergerak. Selain itu kesalahan juga dapat terjadi karena DNA yang telah masuk ke
dalam sumur tersedot kembali masuk ke dalam pipet mikro. Sehingga sumur tidak
berisi DNA.