You are on page 1of 9

Teknik molekuler

Sekarang ini penggunaan metode molekuler telah sangat luas untuk analisis sel dan penentuan urutan nukleotida dari keseluruhan genom. Pengetahuan mengenai
aktivitas DNA polymerase, enzim restriksi dan DNA ligase melahirkan teknik-teknik kloning DNA dan PCR (polymerase chain reaction) yang memungkinkan diisolasinya
segmen DNA. Para ilmuwan juga telah mengembangkan alat dan metode untuk memurnikan protein dan meneliti fungsinya.
DNA
Isolasi DNA
DNA adalah molekul yang terdapat pada semua mahluk hidup. Molekul ini sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata. Tetapi DNA dapat diekstrak dari ribuan
sel sehingga DNA dapat terlihat karena jumlahnya yang sangat banyak. Tahapan dalam ekstraksi DNA adalah pemecahan sel, keluarnya DNA dari nukleus dan
pengendapan/presipitasi DNA. Ekstraksi DNA memiliki banyak aplikasi praktis, diantaranya adalah untuk tujuan pemuliaan, evolusi, sitematik, konservasi, dll.
Dalam ekstraksi DNA tumbuhan, metode ekstraksi yang sering digunakan adalah berdasarkan Doyle dan Doyle 91989). Metode ini menggunakan buffer ekstraksi yang
terdiri dari
Elektroforesis DNA
Pemisahan DNA dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel. Molekul DNA terpisah berdasarkan ukuran ketika dilewatkan pada matriks gel dengan aliran listrik.
DNA memiliki muatan negatif, dan saat berada dalam aliran listrik, akan bermigrasi melalui gel menuju kutub positif (Gambar 1). Molekul yang berukuran besar, memiliki
kesulitan melewati pori-pori gel sehingga bermigrasi lebih lambat melalui gel dibandingkan DNA yang berukuran lebih kecil. Setelah elektroforesis selesai, molekul DNA
divisualisasi dengan pewarna fluorescent seperti ethidium yang berikatan dengan DNA dan berada di antara basa-basa DNA.

Gambar 1. Elektroforesis DNA dengan gel agarosa


Dua alternatif macam gel adalah poliakrilamida dan agarosa. Poliakrilamida memiliki kapasitas resolusi yang lebih tinggi, tetapi gel poliakrilamida dapat memisahkan DNA
hanya dalam rentang ukuran DNA yang sempit. Jadi gel poliakrilamida dapat memisahkan DNA satu sama lainnya yang berbeda ukurannya hanya beberapa atau bahkan
satu pasang basa saja tetapi pada molekul yang berukuran beberapa ratus pasang basa saja (dibawah 1000 pasang basa). Gel agarosa memiliki resolusi yang lebih
rendah tetapi dapat memisahkan DNA yang berukuran sampai puluhan kilo pasang basa.
DNA yang berukuran sangat panjang tidak dapat melewati pori gel bahkan pori gel agarosa. DNA yang sangat besar melewati matriks dengan satu ujung bergerak lebih
dulu sedang ujung lainnya mengikuti. Akibatnya DNA diatas ukuran tertentu (30 -50 kb) bermigrasi dengan jarak yang sama sehingga tidak dapat diamati
pemisahannya. DNA yang sangat panjang ini dapat dipisahkan satu sama lainnya dengan jika daerah listrik diaplikasikan dalam ‘pulses’ yang berasal secara orthogonal
satu sama lainnya. Teknik ini disebut pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) (Gambar 2).

Pulsed field gel electrophoresis


Gambar 2. Pulsed field gel electrophoresis
Elektroforesis juga digunakan untuk memisahkan RNA. Seperti juga DNA, RNA memiliki muatan negative, tetapi molekul RNA merupakan molekul utas tunggal dan
memiliki struktur sekunder atau tersier. Untuk mengatasinya, RNA diberi perlakuan dengan glyoxal yang bereaksi dengan RNA sehingga menghalangi pembentukan
pasangan basa. RNA yang ter-glyoxylasi tidak dapat membentuk struktur sekunder atau tersier sehingga dapat bermigrasi dengan mobilitas yang proporsional terhadap
ukurannya. Elektroforesis juga digunakan untuk memisahkan protein dengan prinsip yang sama.
Pemotongan DNA dengan enzim restriksi
Kebanyakan molekul DNA dalam sel berukuran lebih besar dari yang diperlukan untuk analisa DNA di laboratorium. Jika akan mempelajari gen secara individual atau
mempelajari situs individual pada DNA, molekul DNA berukuran besar di dalam sel harus dipotong ke dalam fragmen-fragmen yang lebih kecil. Pemotongan DNA ini
dilakukan dengan menggunakan enzim endonuklease restriksi. Nuklease ini adalah enzim yang memotong DNA pada tempat tertentu dengan cara mengenali urutan basa
yang spesifik (Gambar 3).
Enzim restriksi yang digunakan dalam biologi molekuler umumnya mengenali urutan basa yang pendek (4-8 bp) dan memotong pada posisi tertentu yang telah
ditentukan dalam urutan sekuens DNA tersebut. Contohnya adalah enzim EcoRI yang ditemukan pada strainEscherichia coli dan merupakan enzim restriksi yang pertama
(I) ditemukan pada spesies ini. Enzim ini mengenali urutan DNA 5′-GAATTC-3′.

Gambar 3. Situs pengenalan enzim restriksi


Jika molekul DNA yang sama dipotong dengan enzim restriksi yang berbeda, misalnya oleh HindIII yang mengenali urutan 6pb (5′-AAGCTT-3′), atau dipotong dengan
EcoRI, maka molekul DNA dipotong pada posisi yang berbeda dan menghasilkan fragmen dengan ukuran yang berbeda (Gambar 4). Jadi sebuah molekul akan
menghasilkan sebuah seri karakteristik pola pemotongan DNA saat dipotong dengan satu set enzim restriksi yang berbeda.
Gambar 4. Pemotongan DNA dengan EcoRI menghasilkan fragmen DNA dengan ukuran yang bervariasi
Enzim restriksi jenis lain seperti Sau3A1 yang ditemukan pada bakteri Staphylococcus aureusmengenali sekuens teramerik (4bp) dengan urutan 5′-GATC-3′ sehingga
enzim ini memiliki frekuensi yang lebih tinggi dalam memotong DNA, kira-kira satu kali dalam 250bp. Di sisi lain terdapat enzim retriksi yang mengenali sekuens
oktamerik (8 bp) yaitu enzim NotI yang mengenali uruta 5′-GCGGCCGC-3′ dan rata-rata memotong hanya sekali dalam 65 kb.
Enzim restriksi tidk hanya berbeda dalam urutan basa yang dikenali, tetapi juga pada pada struktur hasil produk pemotongannya. Beberapa enzim seperti HpaI
menghasilkan produk dengan ujung tumpul, enzim lain seperti EcoRI, HindIII dan PstI menghasilkan ujung lengket (Gambar 5).

Gambar 5. Ujung lengket dan ujung tumpul yang merupakan hasil


pemotongan DNA dengan enzim restriksi
Hibridisasi DNA untuk mengidentifikasi molekul DNA yang spesifik
DNA yang telah terdenaturasi memiliki kapasitas untuk bergabung kembali
(untuk membentuk kembali pasngan basa di antara utas komplementer). Hal
ini menyebabkan terjadinya pembentukan molekul hybrid saat homolog, DNA
yang terdenaturasi dari dua sumber yang berbeda bercampur satu sama lain
dalam kondisi yang sesuai kekuatan ion dan temperaturnya. Proses
perpasangan basa antara polinukleotida utas tunggal yang komplementer
disebut hibridisasi.
Banyak teknik yang tergantung pada ke-khas-an hibridisasi antara dua
molekul DNA dari sekuens yang komplementer. Sebagai contoh, hibridisasi
merupakan dasar untuk mendeteksi sekuens spesifik dalam campuran asam
nukleat yang kompleks. Dalam hal ini, satu molekul adalah ‘probe’ dari
sekuens tertentu (dapat berupa sekuens yang dimurnikan atau molekul DNA
yang disintesis secara kimia. Probe digunakan untuk mencari molekul yang
memiliki sekuens komplementer dalam campuran DNA. DNA probe harus
dilabel, sehingga dapat dengan mudah diketahui lokasinya saat telah
menemukan sekuens targetnya. Campuran yang telah ter=probe
dipisahkan berdasarkan ukuran pada gel atau didistribusikan sebagai
perpustakaan klon (library of clones) Gambar 6.
Misalnya genom yeast dipotong dengan enzim EcoRI dan peneliti ingin
mengetahui ukuran fragmen DNA yang mengandung gen yang diinginkan.
Saat diwarnai dengan etidium bromida, ribuan fragmen DNA yang dihasilkan
dari pemotongan genom yeast dengan enzim restriksi berjumlah terlalu
banyak sehingga tidak dapat dipisahkan menjadi ‘band’ DNA yang terpisah.
Mereka tampak ‘smear’. Teknik yang dianamakan Southern blot hybridization
akan mengidentifikasi ukuran dari fragmen tertentu di antara smear DNA.
Gel edirendam dalam larutan alkamli untuk mendenaturasikan double heliks.
Fragmen ini kemudian ditransfer dari gel ke membrane yang bermuatan
positif tempat DNA akan terikat. Setelah DNA tertransfer pada membran,
membran diinkubasi dengan probe yang mengandung sekuens DNA
komplementer dengan sekuens yang diinginkan. ‘Probing’ dilakukan dalam
kondisi konsentrasi garam dan temperature dekat dengan kondisi denaturasi dan reanturasi asam nukleat. Dalam kondisi ini DNA probe akan berhibridisasi dengan kuat
hanya dengan komplementer yang tepat.
Media film atau media yang sensitif terhadap cahaya atau elektron yang dikeluarkan oleh DNA yang dilabel dapat mendeteksi lokasi probe berhibridisasi. Saat X-ray film
diekspos ke filter dan di-develop, maka akan menghasilkan autoradiogram dengan pola terekspos sama dengan lokasi hybrid (Gambar 6).
Gambar 6. Hasil probing DNA
Kloning DNA
Kemampuan molekul DNA membentuk rekombinan dan menjaganya dalam sel disebut kloning DNA. Proses ini melibatkan vektor yang menjadi sarana DNA untuk
memperbanyak klon DNA dalam sel dan ‘insert DNA’ yang disisipkan di dalam vector. Kunci untuk menghasilkan molekul DNa rekombinan adalah enzim restriksi yang
memotong DNA pada tempat spesifik dan enzim lain yang yang menyambung DNA yang terpotong dengan DNA lain. Dengan menghasilkan molekul DNA rekombinan
yang dapat diperbanyak pada organisme inang, fragmen DNA tertentu dapat dimurnikan dan diamplifikasi untuk menghasilkan produk dalam jumlah besar.
Kloning DNA dalam plasmid vektor
DNa dipotong dengan enzim restriksi, kemudian dimasukkan ke dalam vektor untuk diperbanyak. Inang (host) yang umum digunakan untuk memperbanyak DNA adalah
bakteriE. coli.
Vektor DNA memiliki tiga karakteristik yaitu:
1. Mengandung asal replikasi (origin of replication) yang memungkinkan DNA bereplikasi secara independen/bebas dari kromosom inang.
2. Mengandung marker selektif yang menyebabkab sel yang membawa vector (termasuk DNA yang dibawa) dapat diidentifikasi
3. Memiliki situs yang unik/khas untuk satu atau lebih enzim restriksi. Hal ini menyebabkan fragmen DNA dapat disisipkan pada tempat tertentu dalam vector
sehingga penyisipan tidak mengganggu kedua fungsi lainnya.
Vektor yang paling umum berukuran kecil (kira-kira 3 kb) merupakan molekul DNA sirkular disebut plasmid. Molekul ini biasanya ditemukan pada banyak bakteri. Pada
banyak kasus, DNA plasmid membawa gen resistensi terhadap antibiotika.
Memasukkan fragmen DNA ke dalam vector pada dasarnya merupakan proses yang mudah. Misalnya plasmid memiliki situs pengenalan untuk EcoRI, maka vector
disiapkan dengan memotongnya dengan Eco RI. Potongan DNA yang akan diklon kemudian disambungkan dengan bantuan DNA ligase (Gambar 7).

Gambar 7. Kloning DNA dalam plasmid vektor


Vektor dapat dimasukkan ke organism inang melalui transformasi
Transformasi merupakan proses dimana organisme inang mengambil DNA dari lingkungan. Beberapa bakteri, tetapi bukan E. coli dapat mengambil DNA secara alami dan
dikatakan memiliki kompetensi genetik. E. coli dapat bersifat kompeten mengambil DNA melalui perlakuan dengan ion kalsium. Antibiotika kemudian ditambahkan
dalam medium untuk menyeleksi pertumbuhan sel yang mengambil DNA plasmid - sell ini disebut transforman. Sel yang membawa plasmid akan dapat tumbuh pada
medium, sedang yang tidak membawa plasmid, tidak dapat tumbuh (Gambar 7).
Perpustakaan molekul DNA (DNA library) dapat dihasilkan melalui cloning
Perpustakaan DNA merupakan populasi vector identik yang masing-masing berisi insert yang berbeda. Untuk membuat perpustakaan DNA, DNA target dipotong dengan
enzim restriksi yang memberikan ukuran rata-rata insert yang diinginkan. Ukuran insert dapat berkisar kurang dari 100 bp sampai lebih dari satu megabase. DNA yang
telah terpotong selanjutnya dicampurkan dengan vector yang sesuai (yang dipotong dengan enzim restriksi yang sama) dan ditambah ligase. Hal ini menghasilkan
koleksi vector dengan insert DNA yang berbeda (Gambar 8).
Gambar 8. Pembentukan DNA library
Berbagai perpustakaan DNA dapat dihasilkan dengan menggunakan insert dari berbagai sumber. Perpustakaan DNA yang paling sederhana dihasilkan dari DNA genomik
total yang disebut dengan ‘genomic libraries’.
‘cDNA library’ dikembangkan untuk memperkaya ‘coding sequences’ dalam library. cDNA library dibuat dengan menggunakan mRNA yang dikonversi menjadi DNA.
Proses ini disebut reverse transcription yang dilakukan oleh enzim reverse transcriptase (Gambar 9). Saat diberi perlakuan dengan reverse transcriptase, mRNA
dikonversi menjadi kopi DNA utas ganda yang disebut cDNA (copy DNA).
Selanjutnya, proses pembentukan library sama dengan pembentukan library pada DNA genomic. cDNA dan vector diberi perlakuan dengan enzim restriksi yang sama
dan fragmen-fragmen hasilnya disambungkan ke dalam vector.

Gambar 9. Pembentukan cDNA


Hibridisasi digunakan untuk mengidentifikasi klon spesifik dari sebuah library
Identifikasi fragmen dari sebuah gen di antara klon-kon dapat dilakukan dengan menggunakan DNA probe yang urutan DNAnya sesuai dengan sebagian dari urutan DNA
gen yang diinginkan. Proses penggunaan probe dengan DNA yang dilabel digunakan untuk melakukan screening terhadap library disebut colony hybridization.
cDNA library akan memiliki ribuan insert yang berbeda dan masing-masing terdapat dalam vektot umum. Setelah transformasi ke dalam bakteri khusus yang cocok
sebagai inang, sel ditumbuhkan dalam cawan petri dalam media agar. Tiap sel akan tumbuh menjadi koloni dan tiap sel dalam koloni mengandung vector yang sama dan
insert dari library,
membrane filter dengan positive charge digunakan untuk probing. Membran ditekan di atas koloni dan cetakan koloni aakan berada pada membrane. Selanjutnya
dilakukan probing terhadap filter. Filter yang mengandung sel diberi perlakuan yang memecah sel dan mengeluarkan DNA yang kemudian terikat pada filter pada lokasi
yang sama dengan sel. Filter selajutnya diinkubasi dengan probe.
PCR (polymerase chain reaction)
PCR adalah sebuah teknik biologi molekuler untuk mereplikasikan DNA dengan menggunakan enzim Taq polimerase. PCR digunakan untuk mengamplifikasi bagian DNA
yang pendek (sampai 10 kb). Sejak ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1983, teknik ini telah melahirkan teknik PCR-based marker teknik lainnya yang sangat
bervariasi. Protokol dasar PCR adalah:
I. DNA utas ganda didenaturasi pada suhu 95C sehingga membentuj DNA utas tunggal yang berfungsi sebagai cetakan.
II. DNA utas tunggal yang pendek (disebut primer) berikatan dengan DNA cetakan pada temperature rendah. Ikatan preimer terjadi pada utas yang komplementer
dengan cetakan pada daerah ujung batas sekuen DNA target.
III. Suhu ditingkatkan menjadi 72C sehingga enzim DNA polymerase dapat melakukan sintesis DNA membentuk utas ganda DNA baru.
IV. Utas ganda DNA yang baru disintesis, didenaturasi pada suhu tinggi dan siklus berulang.
Gambar 10 menunjukkan proses PCR. Produk PCR diamati dengan gel elektroforesis dengan menggunakan gel agarose ataupun gel poliakrilamida dan diamati dengan
uv-transiluminator.
Gambar 10. Proses PCR

Dasar Teori
DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan terdapat di dalam
inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan kloroplast. Penyebutan
nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA genome inti (nuclear DNA genome)
berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari
mitokondria, DNA genom kloroplast berasal dari kloroplast. Pada organisme tingkat rendah,
DNA penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri) atau
dibungkus oleh protein tertentu (pada virus). Kromosom eukariot berbentuk linear
sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung
satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh
lebih kecil dibanding kromosom.

Isolasi DNA kromosom.


Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen
sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Membran
sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada
ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan
RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA.
Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90 oC untuk menginaktifasi enzim
yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan
bisa dilarutkan lagi dengan air.

Isolasi DNA plasmid


DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid
harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih
kecil daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan
perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis
dengan penambahan detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid,
RNA, protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan
penambahan potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan
cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang
tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA
dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol.
Isolasi RNA
RNA, terutama mRNA merupakan materi genetik yang mengkode suatu protein. Jumlah
populasi mRNA akan lebih banyak dibanding dengan DNA. mRNA eukariot dapat dipisahkan
dari DNA dengan menggunakan oligonukleotida dT. Atau RNA total juga dapat di isolasi dari
sel dengan menambahkan enzim DNase yang berfungsi untuk mendegradasi DNA
Ekstraksi DNA dari organisme eukaryote (manusia, hewan dan tumbuhan) dilakukan melalui
proses penghancuran dinding sel (lysis of cell walls), penghilangan protein dan RNA (cell
digestion) dan pengendapan DNA (precipitation of DNA) dan pemanenan. Berbagai teknik
ekstraksi DNA telah dikembangkan dari prinsip dasar tersebut, sehingga saat ini muncul
berbagai teknik ekstraksi dan purifikasi DNA. Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah
serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen sel lainnya. Hasil
ekstraksi tersebut merupakan tahapan penting untuk langkah berikutnya. Oleh sebab itu
dalam pelaksanaannya harus dilakukan dengan baik dan bebas kontaminasi.
Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti
EDTA (ethyllenediamine tetraacetic), dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). EDTA berfungsi
sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion magnesium (ion ini berfungsi untuk
mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuclease yang
merusak asam nukleat). SDS merupakan sejenis deterjen yang berfungsi merusak
membrane sel. Enzim proteinase K dapat digunakan untuk menghancurkan protein. Kotoran
akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Kemudian molekul nuleotida (DNA dan
RNA) yang telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan menggunakan
phenol. Dalam proses ini sebagian kecil RNA juga dapat dibersihkan. Sedangkan choloform
digunakan untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari larutan. Enzim
RNAase digunakan untuk menghancurkan RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh.
Pemurnian atau purifikasi DNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan DNA tersebut
dengan NaCl yang berfungsi memekatkan, memisahkan DNA dari larutan, dan
mengendapkan DNA sewaktu dicampur dengan ethanol. Proses sentrifugasi dengan
kecepatan tinggi akan mengendapkan tepung berwarna putih (DNA) dan menempel di dasar
tabung ependorf.
Pada manusia, hanya sel darah putih yang mempunyai inti dan mengandung DNA. Agar
lebih efisien, isolasi DNA dilakukan hanya terhadap sel darah putih. Oleh sebab itu sampel
darah total (whole blood) yang masih segar langsung dipisahkan menjadi serum, sel darah
merah dan sel darah putih (dilapisan buffy coat) dengan teknik sentrifugasi. Setelah
disentrifugasi, sampel darah total akan terbagi menjadi tiga lapisan, yaitu lapisan paling atas
merupakan serum, lapisan tengah berwarna putih tipis adalah sel darah putih (buffy coat)
dan lapisan bawah adalah sel darah merah. Lapisan kedua yang merupakan sel darah putih
diambil dengan klinipette.

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA
yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan
campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat
molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada
pada bagian atas tabung (Mader 193). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua
macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada
bagian bawah (Campbell 2002).

Isolasi DNA dengan teknik sentrifugasi akan mengendapkan DNA. Supaya hasil isolasi
berupa DNA murni yang tidak tercampur dengan molekul-molekul lain maka dalam
proses isolasinya dicampurkan berbagai macam larutan. Larutan A berfungsi sebagai
resuspensi yaitu penggabunagn kembali pelet yang telah terbentuk dengan larutan
yang dicampurkan. Selain itu larutan A juga berfungsi sebagai buffer dan pengkelat.
Pemilihan buffer tersebut dilihat dari kemampuan buffer menghasilhkan arus listrik.
Larutan B yang terdiri atas SDS dan NaOH berfungsi sebagai larutan pelisis. NaOH
sendiri dapat mendenaturasi protein. Sedangkan larutan C befrungsi untuk
merenarutasikan kembali. Etanol 70% yang digunakan dalam proses isolasi berfungsi
untuk mengeluarkan endapan garam karena Na+ bermuatan positif dan DNA
bermuatan negatif. Larutan ddH2O yang ditambahkan berfungsi agar endapan DNA
yang dihasilkan didapat dengan konsentrasi yang cukup tinggi. Larutan di vortex
untuk memudahkan bakteri tersuspensi. Bakteri yang telah diendapkan tersebut
kana lisis dengan penambahan larutan buffer. Agar proses lisisnya bakteri sempurna
maka larutan dibolak-balik secara halus. Bakteri yang telah lisis ini ditandai dengan
munculnya lendir. Ciran DNA yang dihasilkan kemudina dipisahkan dari endapannya.
Cairan ini ditambahkan RNase untuk melisiskan RNA supaya hasil yang diisolasi
berupa DNA murni.

DNA yang telah diisolasi diuji kualitas dan kuantitasnya melalui elektroforesis dan
spektrofotometer. Elektroforesis memisahkan DNA, RNA, dan protein berdasarkan
bobot molekul dan muatanya dengan menggunakan media pemisah. DNA bermuatan
negatif sehingga pada elektroforesis DNA akan bergerak dari kutub negatif ke kutub
positif. Kecepatan pergerakan ini tergantung pada ukuran molekul DNA, kerapatan
media gel yang dilalui DNA, serta arus listrik yang diberikan untuk bermigrasi
molekul DNA. Sebelum proses elektroforesis suspensi DNA dicampur dengan
peyangga muatan berwarna loading dye. Penambahan warna ini berfungsi untuk
menambah densitas sehingga DNA bearada di bagian bawah sumur, selain itu
pewarna ini digunakan untuk memudahkan meletakan contoh DNA ke dalam sumur
dan bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat
digunakan sebagai tanda migrasi DNA.

DNA hasil elektroforesis yang terlihat di atas lampu UV dapat dilihat pergerakannya.
Hasil elektroforesis DNA total menunjukkan adanya pita-pita DNA yang diisolasi dari
bakteri Escherichia coli yang kemungkinan adalah DNA plasmid (Gambar 1). Hal ini
dapat dilihat dari pergerakannya yang tinggi. Pergerakan DNA di agarose
berhubungan dengan besar molekul. Sehingga pergerakan yang tinggi ini
menunjukan ukuran DNA yang tidak terlalu besar. Plasmid merupakan DNA sirkuler
yang ukurannya relatif kecil. Hal ini menunjukkan bahwa DNA total yang diisolasi
mempunyai keutuhan yang tinggi. Akan tetapi pada beberapa kelompok pergerakan
DNA tiadak dapat diamati. Kejadian ini dapat terjadi karena kesalahan teknis saat
memasukan DNA ke dalam sumur gel agarose. Bisa jadi DNA yang dimasukan tidak
masuk benar-benar ke dalam sumur gel sehingga saat elektroforesis DNA tidak
bergerak. Selain itu kesalahan juga dapat terjadi karena DNA yang telah masuk ke
dalam sumur tersedot kembali masuk ke dalam pipet mikro. Sehingga sumur tidak
berisi DNA.

Kuantifikasi DNA total dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm


menunjukkan bahwa rendemen isolasi DNA konsentrasinya berkisar antara 19610 ng/
µL dan 19800 ng/ µL tiap 1500 µL bahan biakan E. coli. Tingkat kemurnian DNA
plasmid yang diisolasi dilihat dari nilai absorban pada panjang gelombang 260 nm
dibadi nilai absorban pada panjang gelombang 280 nm. Kemurnian DNA plasmid
kelompok 8 menunjukan hasil sebesar 1,115. Nilai ini belim termasuk nilai DNA murni
karena isolasi DNA murni nilainya lebih besar atau sama dengan 1,8.
Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel,
yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi,
beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah
berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah
diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang
lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau
dengan sodium dodesil sulfat (SDS).
Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran
nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya
pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa
dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk
kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA
yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA
sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul
DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan
amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan
CsCl .
Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik
maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam
molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama,
plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau
dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA
kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial
yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih
tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh
karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid
dengan DNA kromosom.

Teknik Isoalsi DNA


Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid,
zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa
molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit
daripada jumlah yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya.
Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan
kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga
keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan.

You might also like