Professional Documents
Culture Documents
PENDAHULUAN
Bagian-bagian dari mikroskop cahaya: 1. lensa okuler, 2. lensa objektif, 3. lensa objektif
yang lain, 4. pengatur fokus, 5. pengatur fokus secara halus, 6. papan letak
objek/sampel/preparat yang dilihat, 7. sumber cahaya, 8. kondensor cahaya, 9. penjepit
sampel
Mikroskop cahaya atau dikenal juga dengan nama "Compound light microscope"
adalah sebuah mikroskop yang menggunakan cahaya lampu sebagai pengganti cahaya
matahari sebagaimana yang digunakan pada mikroskop konvensional. Pada mikroskop
konvensional, sumber cahaya masih berasal dari sinar matahari yang dipantulkan dengan
suatu cermin datar ataupun cekung yang terdapat dibawah kondensor. Cermin ini akan
mengarahkan cahaya dari luar kedalam kondensor.
Jenis lensa
Mikroskop cahaya menggunakan tiga jenis lensa, yaitu lensa obyektif, lensa okuler, dan
kondensor.
Lensa obyektif dan lensa okuler terletak pada kedua ujung tabung mikroskop sedangkan
penggunaan lensa okuler terletak pada mikroskop bisa berbentuk lensa tunggal
(monokuler) atau ganda (binokuler). Pada ujung bawah mikroskop terdapat tempat
dudukan lensa obyektif yang bisa dipasangi tiga lensa atau lebih. Di bawah tabung
mikroskop terdapat meja mikroskop yang merupakan tempat preparat.
Sistem lensa yang ketiga adalah kondensor. Kondensor berperan untuk menerangi obyek
dan lensa-lensa mikroskop yang lain.
Cara kerja
• Lensa obyektif berfungsi guna pembentukan bayangan pertama dan menentukan
struktur serta bagian renik yang akan terlihat pada bayangan akhir serta
berkemampuan untuk memperbesar bayangan obyek sehingga dapat memiliki
nilai "apertura" yaitu suatu ukuran daya pisah suatu lensa obyektif yang akan
menentukan daya pisah spesimen, sehingga mampu menunjukkan struktur renik
yang berdekatan sebagai dua benda yang terpisah.
• Lensa okuler, adalah lensa mikroskop yang terdapat di bagian ujung atas tabung
berdekatan dengan mata pengamat, dan berfungsi untuk memperbesar bayangan
yang dihasilkan oleh lensa obyektif berkisar antara 4 hingga 25 kali.
Preparasi sediaan
Persiapan preparat di dalam mikroskop cahaya terbagi menjadi dua jenis, yaitu :
2.3 Pewarnaan
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain
bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal
tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat
terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini
merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi.
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen
selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen.
Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun
pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam
dan pewarna basa
Pewarna asam dapat tejadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif.
Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif,
sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka
sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewrna negatif. Contoh pewarna asam
misalnya : tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin dan lain-lain. Pewarnaan
basa bisa terjadi biasenyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh
dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna
basa misalnya metilin biru, kristal violet, safranin dan lain-lain.
Teknik pewarnaan asam basa ini hanya menggunakan satu jenis senyawa
pewarna, teknik ini disebut pewarna sederhana. Pewarnaan sederhana ini diperlukan
untuk mengamati morfologi, baik bentukmaupun susunan sel. Teknik pewarnaan
yang lain adalah pewarnaan diferensial, yang menggunakan senyawa pewarna yang
lebih dari satu jenis. Diperlukan untuk mengelompokkan bakteri misalnya, bakteri
gram positif dan bakteri gram negatif atau bakteri tahan asam dan tidak tahan asam.
Juga diperlukan untuk mengamati struktur bakteri seperti flagela, kapsula, spora dan
nukleus.
Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan
bekerja serta mengikuti aturan dasar yang belkau yakni sebagai berikut:
mempersiapkan kaca obyek. Kaca obyek ini harus bersih dan bebas lemak, untuk
membuat apusan dari bakteri yang diwarnai.
mempersiapkan apusan.
Apusan yang baik adalah yang tipis dan kering, terlihat seperti lapisan yang tipis.
Apusan ini dapat berasal dari biakan cair atau padat.
Biakan Cair.
Suspensi sel sebanyak satu atau dua mata jarum inokulasi diletakkan pada kaca
obyek. Lalu diapuskan pada kaca obyek selebar ... cm. Biarkan mengering diudaraata
diatas api kecil dengan jarak 25 cm.
Biakan Padat.
Bakteri yang dikultur pada medium padat tidak dapat langsung dibuat apusan
seperti dari biakan cair, tapi harus diencerkan dulu. Letakkan setetes air pada kaca
obyek, lalu denganjarum inokulasi ambil bakteri dari biakan padat, letakkan pada
tetesan air dan apusan. Biarkan mengering diudara.
Apusan bakteri pada akaca obyek bila tidak diletakkan secara kuat, dapat terhapus
pada waktu proses pewarnaan lebih lanjut. Proses peletakan apusan pada kaca obyek
dapat dilakukan diantaranyadengan cara memanaskan diatas api.
2.4 Macam-Macam Pewarnaan
1. Pewarnaan sedehana
- Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin)
- Tujuan hanya untuk melihat bentuk sel
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang
kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi
jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri
dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel
bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan Reece, 2005)).
2. Pewarnaan diferensial
- menggunakan lebih dari satu macam zat warna
- Tujuan untuk membedakan antar bakteri
- Contoh: Pw. Gram, Pw. Bakteri Tahan Asam
Pewarnaan Diferensial terdiri dari :
1. Pewarnaan Gram
Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas
dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram
negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen
pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai
dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent).
Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen
dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila
komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci.
Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna
pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar.
Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri
itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara
keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan
terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai
adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat
dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998).
Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus
pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa hingga sukar
dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan
indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar
belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-zat
warna (Hadioetomo, 1990).
Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan
dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus diperlukan
untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal terperinci tertentu di dalam
sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, yang salah
satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer, 1998).
Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran
100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel
bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan
menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan
membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatka.
Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang
berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif.
Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna
memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan
negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara
lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll.
Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll (Irawan, 2008).
Banyak senyawa organik berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopik dan telah dikembangkan prosedur
pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) :
- Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar.
- Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme.
- Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa.
Langkah-langkah utama dalam persiapan spesimen mikroba untuk pemeriksaan
mikroskopik adalah (Pelczar, 1986) :
- Penempatan olesan atau lapisan spesimen pada kaca objek.
- Fiksasi olesan pada kaca objek.
- Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna
atau reagen (pewarnaan diferensial.
Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik secara langsung
(bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni).
Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) :
- Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun fungi.
- Memperjelas ukuran dan bentuk jasad
- Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
- Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia
yang ada akan dapat diketahui.
Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan
memberikan reaksi kalu mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarnaan tersebut
berbentuk ion yang bermuatan positif ataupun negative. Sel bakteri bermuatan
mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral. Sehingga kalau kita
memberikan pewarnaan yang bermuatan positif ataupun negatif (Suriawiria, 1985).
2. Pewarnaan Acid-Fast
3. Pewarnaan khusus
- Untuk mewarnai struktur khusus/tertentu dari bakteri→ kapsul, spora, flagel dll
1. Pewarnaan Negatif
Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat
dengan pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan
mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar
belakang hitam (Campbell dan Reece, 2005).
Setelah dilihat di mikroskop, maka akan tampak bentuk sel bakteri.
2. Pewarnaan Kapsul
3. Pewarnaan Spora
Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan
diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Segera setelah keadaan luar baik lagi
bagi mereka, maka pecahlah bungkus spora dan tumbuhlah bakteri. Spora
lazim disebut endospora ialah karena spora itu dibentuk di dalam sel.
Endospora jauh lebih tahan terhadap pengaruh luar yang buruk dari pada
bakteri biasa yaitu bakteri dalam bentuk vegetatif. Sporulasi dapat dicegah,
jika selalu diadakan pemindahan piaraan ke medium yang baru.
Endospora dibuat irisan dapat terlihat terdiri atas pembungkus luar, korteks
dan inti yang mengandung struktur nukleus. Apabila sel vegetatif membentuk
endospora, sel ini membuat enzim baru, memproduksi dinding sel yang sama
sekali baru dan berubah bentuk. Dengan kata lain sporulasi adalah bentuk
sederhana diferensiasi sel, karena itu, proses ini diteliti secara mendalam
untuk mempelajari peristiwa apa yang memicu perubahan enzim dan
morfologi.
Spora biasanya terlihat sebagai badan-badan refraktil intrasel dalam sediaan
suspensi sel yang tidak diwarnai atau sebagai daerah tidak berwarna pada sel
yang diwarnai secara biasa. Dinding spora relatif tidak dapat ditembus, ini
pula yang mencegah hilangnya zat warna spora setelah melalui pencucian
dengan alkohol yang cukup lama untuk menghilangkan zat warna sel
vegetatif. Sel vegetatif akhirnya dapat diberi zat warna kontras. Spora
biasanya diwarnai dengan hijau malachit atau carbol fuchsin.
Spora kuman dapat berbentuk bulat, lonjong atau silindris. Berdasarkan
letaknya spora di dalam sel kuman, dikenal letak sentral,subterminal dan
terminal. Ada spora yang garis tengahnya lebih besar dari garis tengah sel
kuman, sehingga menyebabkan pembengkakan sel kuman.
4. Pewarnaan Flagella
Tujuan
Mempelajari dasar dasar kimiawi dan kinerja prosedur pewarnaan flagella
BAB III
METODE
BAB IV