BAB I PENDAHULUAN 1.

1 Latar Belakang Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari mengenai makhluk hidup yang mikroskopis dan tidak dapat dilihat mata biasa. Untuk itu, dalam melakukan analisis mikrobiologi dikenal sebutan analisis mikroskopis, yaitu analisis yang dilakukan terhadap jasad renik yang tidak terlihat oleh mata biasa. Oleh karena itu, butuh alat bantu yang digunakan agar kita dapat melihat jasad renik tersebut. Mikroskop adalah salah satu alat bantu yang digunakan untuk melakukan analisis mikroskopis. Dalam penggunaannya, sebelumnya harus dipersiapkan preparat untuk analisis mikroskopis. Jika kita ingin mempelajari mikroorganisme individual, kita harus dapat memeriksa sel-sel tunggal. Untuk dapat melakukannya, kita harus mengoleskan sel-sel tunggal tersebut dan melihatnya melalui mikroskop. Sel bakteri dan mikroorganisme lainnya diamati dengan bantuan mikroskop. Terutama sel bakteri selain selnya sangat kecil, juga transparan dan tidak berwarna. Setelah metode pewarnaan diketahui dan dikembangkan. Pengamatan bakteri menjadi lebih muda. Bahkan hasil pewarnaan itu dapat digunakan untuk pewarnaan lebih lanjut dan mendalam. Diantaranya digunakan dalam penentuan jenis atau identifikasi. Banyak metode pewarnaan yang dapat dilakukan dan setiap metode mempunyai tujuan-tujuan tertentu. Untuk itu, analisis mikroskopis akan dibahas lebih lanjut di makalah ini. 1.2 Rumusan Masalah Adapun rumusan masalah dari makalah ini adalah sebagai berikut. Bagaimanakah penggunaan mikroskop untuk melakukan analisis mikroskopis ? Bagaimanakah persiapan smear, pewarnaan sederhana, dan penempelan zat basah ? Bagaimanakah pewarnaan diferensial dilakukan ? Bagaimanakah pewarnaan diferensial tambahan dilakukan ?

1.3 Tujuan

pewarnaan sederhana. .Adapun tujuan dari pembuatan makalah ini adalah sebagai berikut.4 Prinsip 1.5 Manfaat Adapun manfaat pembuatan makalah ini adalah menambah ilmu dan wawasan mengenai analisis mikroskopis bagi penyusun pada khususnnya dan bagi pembaca pada umumnya. Mengetahui prosedur penggnaan mikroskop Mengetahui proses-proses persiapan smear. dan penempelan zat basah Mengetahui proses pewarnaan diferensial Mengetahui proses pewarnaan diferensial tambahan 1.

7. sumber cahaya. kondensor cahaya. lensa okuler. Jenis lensa . penjepit sampel Mikroskop cahaya atau dikenal juga dengan nama "Compound light microscope" adalah sebuah mikroskop yang menggunakan cahaya lampu sebagai pengganti cahaya matahari sebagaimana yang digunakan pada mikroskop konvensional.1 Mikroskop Bagian-bagian dari mikroskop cahaya: 1.BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2. 4. Cermin ini akan mengarahkan cahaya dari luar kedalam kondensor. lensa objektif yang lain. 5. pengatur fokus. pengatur fokus secara halus. 9. sumber cahaya masih berasal dari sinar matahari yang dipantulkan dengan suatu cermin datar ataupun cekung yang terdapat dibawah kondensor. 8. papan letak objek/sampel/preparat yang dilihat. Pada mikroskop konvensional. lensa objektif. 2. 3. 6.

Kondensor berperan untuk menerangi obyek dan lensa-lensa mikroskop yang lain.Mikroskop cahaya menggunakan tiga jenis lensa. Lensa obyektif dan lensa okuler terletak pada kedua ujung tabung mikroskop sedangkan penggunaan lensa okuler terletak pada mikroskop bisa berbentuk lensa tunggal (monokuler) atau ganda (binokuler). Pada ujung bawah mikroskop terdapat tempat dudukan lensa obyektif yang bisa dipasangi tiga lensa atau lebih. Cara kerja . lensa okuler. dan kondensor. Sistem lensa yang ketiga adalah kondensor. Di bawah tabung mikroskop terdapat meja mikroskop yang merupakan tempat preparat. yaitu lensa obyektif.

.

dan berfungsi untuk memperbesar bayangan yang dihasilkan oleh lensa obyektif berkisar antara 4 hingga 25 kali.• Lensa obyektif berfungsi guna pembentukan bayangan pertama dan menentukan struktur serta bagian renik yang akan terlihat pada bayangan akhir serta berkemampuan untuk memperbesar bayangan obyek sehingga dapat memiliki nilai "apertura" yaitu suatu ukuran daya pisah suatu lensa obyektif yang akan menentukan daya pisah spesimen. • Lensa kondensor. adalah lensa mikroskop yang terdapat di bagian ujung atas tabung berdekatan dengan mata pengamat. sehingga mampu menunjukkan struktur renik yang berdekatan sebagai dua benda yang terpisah. • Lensa okuler. adalah lensa yang berfungsi guna mendukung terciptanya pencahayaan pada obyek yang akan dilihat sehingga dengan pengaturan yang tepat maka akan diperoleh daya pisah maksimal. .

kemudian dilanjutkan dengan pemotongan menggunakan mikrotom. sayatan yang terbentuk lebih rapi. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dan . yang dapat diperoleh dengan melakukan fiksasi yang bertujuan untuk membuat sel dapat menyerap warna. Setiap pewarna mengikat molekul yang memiliki kespesifikan tertentu.2 Persiapan Smear. preparat dilapisi dengan monomer resin melalui proses pemanasan karena pada umumnya jaringan memiliki tekstur yang lunak dan mudah pecah setelah mengalami fiksasi. mematikan sel. contohnya : Hematoksilin. Preparasi sediaan Persiapan preparat di dalam mikroskop cahaya terbagi menjadi dua jenis. dan mengawetkannya.Jika daya pisah kurang maksimal maka dua benda akan terlihat menjadi satu dan pembesarannyapun akan kurang optimal. yaitu : • Preparat Non-permanen. membuat sel tidak bergerak. dan Pewarnaan Sederhana Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. 2. • • Tahap selanjutnya. yang bertujuan untuk memotong sayatan hingga setipis mungkin agar mudah diamati di bawah mikroskop. Preparat permanen. yaitu pembuatan sayatan. kemudian diamati di bawah mikroskop. dilanjutkan dengan pewarnaan. yang mampu mengikat asam amino basa (lisin dan arginin) pada berbagai protein. Oleh karena itu. Umumnya mata pisau mikrotom terbuat dari berlian karena berlian tersusun dari atom karbon yang padat. dan eosin. Penempelan zat basah. Setelah dilakukan penyayatan. yang mampu mengikat molekul asam (DNA dan rantai samping pada aspartat dan glutamat). Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. yang bertujuan untuk memperbesar kontras antara preparat yang akan diamati dengan lingkungan sekitarnya. yang dapat diperoleh dengan menambahkan air pada sel hidup di atas kaca objek.

teknik ini disebut pewarna sederhana. 2. eosin dan lain-lain. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif. Pewarnaan sederhana ini diperlukan untuk mengamati morfologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Teknik pewarnaan yang lain adalah pewarnaan diferensial. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. krisdal violet dan karbol fuehsin. yang menggunakan senyawa pewarna yang . Contoh pewarna asam misalnya : tinta cina. Pewarna asam ini disebut pewrna negatif. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. larutan Nigrosin. Pewarnaan basa bisa terjadi biasenyawa pewarna bersifat positif.3 Pewarnaan Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri. sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. kristal violet. sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah memilen biru. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa Pewarna asam dapat tejadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. maka sel tidak berwarna. Teknik pewarnaan asam basa ini hanya menggunakan satu jenis senyawa pewarna. sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa misalnya metilin biru.basa). safranin dan lain-lain. baik bentukmaupun susunan sel. kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. asam pikrat.

Letakkan setetes air pada kaca obyek. Biarkan mengering diudara. kapsula. lalu denganjarum inokulasi ambil bakteri dari biakan padat. Apusan yang baik adalah yang tipis dan kering. Juga diperlukan untuk mengamati struktur bakteri seperti flagela. Apusan ini dapat berasal dari biakan cair atau padat. mempersiapkan apusan. . Kaca obyek ini harus bersih dan bebas lemak. Fiksasi dengan pemanasan.. cm. Suspensi sel sebanyak satu atau dua mata jarum inokulasi diletakkan pada kaca obyek.. Lalu diapuskan pada kaca obyek selebar .lebih dari satu jenis. Proses peletakan apusan pada kaca obyek dapat dilakukan diantaranyadengan cara memanaskan diatas api. untuk membuat apusan dari bakteri yang diwarnai. spora dan nukleus. letakkan pada tetesan air dan apusan. Bakteri yang dikultur pada medium padat tidak dapat langsung dibuat apusan seperti dari biakan cair. bakteri gram positif dan bakteri gram negatif atau bakteri tahan asam dan tidak tahan asam. Apusan bakteri pada akaca obyek bila tidak diletakkan secara kuat. Biarkan mengering diudaraata diatas api kecil dengan jarak 25 cm. Biakan Padat. Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang belkau yakni sebagai berikut: mempersiapkan kaca obyek. dapat terhapus pada waktu proses pewarnaan lebih lanjut. terlihat seperti lapisan yang tipis. Diperlukan untuk mengelompokkan bakteri misalnya. tapi harus diencerkan dulu. Biakan Cair.

maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar.Tujuan untuk membedakan antar bakteri . 2. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Pewarnaan Gram Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Pw. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat. maka warna akan tercuci.Contoh: Pw. maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Gram. 2005)). berupa pewarna basa. Bakteri Tahan Asam Pewarnaan Diferensial terdiri dari : 1. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat . walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Reagen terakhir adalah warna pembanding. Reagen pertama disebut warna dasar. bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna. yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar.Tujuan hanya untuk melihat bentuk sel Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi.4 Macam-Macam Pewarnaan 1. Pewarnaan sedehana . Pewarnaan diferensial . Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan Reece. yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.2. Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri. tapi jika suspensi bakteri terlalu encer.Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) . Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel.menggunakan lebih dari satu macam zat warna . Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent).

Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin.Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa. sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatka. 1990). Pada zat warna basa.dan dipelajari (Volk dan Whleer.Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif. olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran. Congo Red dll (Irawan. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya. Malachite Green dll. Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-zat warna (Hadioetomo. Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. . 1985) : . susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella. dan hal-hal terperinci tertentu di dalam sel. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. 1998). Base Fuchsin. Methylene Blue. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Banyak senyawa organik berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopik dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan untuk (Suriawiria. 2008). . yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer. Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa hingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair.Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar. . Safranin. sel bakteri sulit terlihat. bentuk. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. 1998). Pada umumnya.

1985). . Misalnya kuman difteri mempunyai granula metakhromatik karena bila diwarnai dalam sediaan. Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba.Penempatan olesan atau lapisan spesimen pada kaca objek. Pewarnaan Acid-Fast 3.Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad. . Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan untuk (Suriawiria. Pewarnaan Granula Metakromatik Di dalam sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatikyang terdiri atas volutin. Granula metakhromatik sering ditemukan pada jenis-jenis kuman patogen tertentu dan berbentuk khas untuk kuman tersebut. Sehingga kalau kita memberikan pewarnaan yang bermuatan positif ataupun negatif (Suriawiria.Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri. granula tersebut akan berwarna lain dari pada zat warna yang digunakan. Karena pewarnaan tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif ataupun negative.Langkah-langkah utama dalam persiapan spesimen mikroba untuk pemeriksaan mikroskopik adalah (Pelczar.Fiksasi olesan pada kaca objek. . ragi ataupun fungi.Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial. 1986) : . Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan memberikan reaksi kalu mengenai bagian tubuh jasad.Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui. Misalnya bila diwarnai sediaan kuman difteri dengan zat warna biru metilen.granula glikogen serta granula lemak. 2.Memperjelas ukuran dan bentuk jasad . Di dalam sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatik yang tersebut di dalam sediaan mikroskopik. . Sel bakteri bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral. 1985) : . banyak dilakukan baik secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni).granula Babes-Ernst akan berwarna coklat tua. .

Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya.Pada spesies kuman tertentu. maka akan tampak bentuk sel bakteri. Pewarnaan Negatif Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. granula metakhromatik terletak pada tempat-tempat khas di dalam sel kuman. Tapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Pewarnaan Granula dapat dilakukan dengan metode selain Neisser yaitu : 1. melengkungi dinding sel. 2005). 2. Bila bahan berlendir tersebut kompak dan tampak sebagai suatu bentuk yang pasti ( bundar/lonjong) maka disebut kapsul. Disamping material nukleus. 3. Setelah dilihat di mikroskop. sitoplasma bakteri mungkin mengandung inklusi selkepingan-kepingan kecil material yang tidak menjadi bagian utuh struktur sel. Butiran khusus ini yang rupanya bertindak sebagai sumber fosfat dan energi disebut butiran metakromat karena akan menyerap warna merah apabila diwarnai dengan biru metilen. Pewarnaan Kapsul Beberapa jenis bakteri dan amoeba hijau-biru mengeluarkan bahan-bahan yang amat berlendir dan lengket pada permukaan selnya. Pewarnaan khusus . . Metode Albert’s 2. spora.Untuk mewarnai struktur khusus/tertentu dari bakteri→ kapsul. tetapi bila tidak teratur bentuknya dan menempelnya pada sel kurang erat maka disebut selaput lendir. Metode Much Weis (Mycobacterium tuberculose). sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam (Campbell dan Reece. Butiran metakromat disebut juga kolektif volutin. flagel dll Pewarnaan Khusus terdiri dari : 1.

Endospora jauh lebih tahan terhadap pengaruh luar yang buruk dari pada bakteri biasa yaitu bakteri dalam bentuk vegetatif. Salah satu pewarnaan simpai (kapsul) ini ( metode Welch) meliputi pemberian larutan kristal ungu panas disusul kemudian dengan pencucian dengan larutan tembaga sulfat. Ukuran kapsul berbeda-beda menurut jenis bakterinya dan juga dapat berbeda diantara jalur-jalur yang berlainan dalam satu spesies. tapi dapat berfungsi sebagai makanan cadangan. Semua kapsul bakteri tampaknya dapat larut dalam air. Garam tembaga memberi pula warna pada latar belakang. Komposisi kimiawi kapsul ada yang berupa glukosa ( misalnya dektrosa pada leokonostok mesendteroides). polimer gula amino (misalnya asam hialuronat pada Staphylococcus piogenik). Spora lazim disebut endospora ialah karena spora itu dibentuk di dalam sel. perlindungan terhadap fagositosis ( baik dalam tubuh inang maupun dialam bebas ) atau perlindungan terhadap dehidrasi. Komposisi medium juga dapat mempengaruhi ukuran kapsul. 3. Segera setelah keadaan luar baik lagi bagi mereka. Sporulasi dapat dicegah. . maka pecahlah bungkus spora dan tumbuhlah bakteri. Pada beberapa jenis bakteri adanya kapsul sebagai petunjuk virulensi. Kemampuan menghasilkan kapsul merupakan sifat genetis. sehingga sel dan latar belakang akan tampak biru tua dan simpai berwarna biru yang lebih muda. polipeptida (misalnya polimer asam D-glutamat pada Bacillus antraksis) atau kompleks polisakarida protein ( misalnya B disentri). Pewarnaan Spora Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Simpai biasanya diperlihatkan dengan cara pewarnaan negatif atau modifikasi dari cara itu. Tembaga sulfat ini digunakan untuk menghilangkan zat warna berlebihan karena pencucian biasa dengan air akan melarutkan simpai. tetapi produksinya sangat dipengaruhi oleh komposisi medium tempat ditumbuhkannya sel-sel yang bersangkutan.Kapsul dan lendir tidaklah esensial bagi kehidupan sel.

proses ini diteliti secara mendalam untuk mempelajari peristiwa apa yang memicu perubahan enzim dan morfologi. Spora biasanya terlihat sebagai badan-badan refraktil intrasel dalam sediaan suspensi sel yang tidak diwarnai atau sebagai daerah tidak berwarna pada sel yang diwarnai secara biasa. Spora kuman dapat berbentuk bulat. ini pula yang mencegah hilangnya zat warna spora setelah melalui pencucian dengan alkohol yang cukup lama untuk menghilangkan zat warna sel vegetatif. Berdasarkan letaknya spora di dalam sel kuman. Endospora dibuat irisan dapat terlihat terdiri atas pembungkus luar. karena itu. sehingga menyebabkan pembengkakan sel kuman. Spora biasanya diwarnai dengan hijau malachit atau carbol fuchsin. lonjong atau silindris. 4.jika selalu diadakan pemindahan piaraan ke medium yang baru. dikenal letak sentral. memproduksi dinding sel yang sama sekali baru dan berubah bentuk. Dinding spora relatif tidak dapat ditembus. sel ini membuat enzim baru. Ada spora yang garis tengahnya lebih besar dari garis tengah sel kuman. Apabila sel vegetatif membentuk endospora. Dengan kata lain sporulasi adalah bentuk sederhana diferensiasi sel.subterminal dan terminal. Sel vegetatif akhirnya dapat diberi zat warna kontras. korteks dan inti yang mengandung struktur nukleus. Pewarnaan Flagella Tujuan Mempelajari dasar dasar kimiawi dan kinerja prosedur pewarnaan flagella BAB III METODE BAB IV KESIMPULAN DAN SARAN .