IDENTIFIKASI SPESIES MIKROORGANISME

SAMPEL

I. TUJUAN
Mahasiswa dapat menggunakan teknik pewarnaan, pengkulturan dan
uji biokimia yang telah didapat sebelumnya untuk menentukan spesies kultur
bakteri yang belum diketahui.

II. DASAR TEORI

Dalam biologi, sistem tatanama binomial merupakan sistem formal
penamaan organisme yang dikenalkan oleh Carl Linnaeus, maka sejak saat itu
nama ilmiah suatu makhluk hidup terdiri atas dua nama atau kata yaitu kata
pertama menunjukan genus (penulisannya diawali dengan huruf kapital) dan
kata kedua menunjukan nama spesiesnya, misal Staphylococcus epidermidis,
nama Staphylococcus merupakan nama genus sedangkan epidermidis
merupakan nama spesies. Spesies berasal dari bahasa Latin species yang
merupakan tingkatan dalam taksonomi yang terkecil (tingkatan terendah dalam
tingkat taksonomi), biasanya digunakan untuk mengklasifikasi organisme baik
yang hidup maupun organisme yang fosil. ( sumber dari: anonim. Binomial
Nomenclatrure. http://www.absolute astronomy.com /topics/Binomial_nom
enclature).
Metode identifikasi dapat digunakan juga sampai diketahui spesies
dari suatu bakteri. Penggunakan kunci dikotomi akan sangat membantu
praktikan sehingga tidak perlu melakukan semua uji untuk dapat mengetahui
spesies dari sampel bakteri yang tidak diketahui. Dikotomi adalah pembagian
organisme sesuai karakteristik yang muncul pada suatu kelompok dan
karakteristik tersebut tidak ditemukan pada kelompok yang lain. Dikotomi
sebagai bagian proses identifikasi spesies (kunci dikotomi) merupakan
sekelompok pertanyaan berkesinambungan (“series of question”) dimana tiap
lajur panah merupakan set dari karakteristik organisme yang ujungnya atau
akhir menunjukkan pada spesies tertentu. (sumber dari: anonim. Dichotomy.
http://www.absoluteastronomy.com/topics/Dichotomy).
Langkah pertama yang perlu dilakukan dalam pengujian ini adalah
pewarnaan gram yang berfungsi untuk mengetahui jenis gram (positif yang
ditandai dengan warna biru-ungu atau negatif yang ditandai dengan warna
merah) dan bentuk dari sel bakteri. Metode pewarnaan gram membutuhkan 4
jenis larutan atau reagen, antara lain: kristal gentian violet (Gram I), iod (Gram
II), etanol 96% (GramIII), dan safranin (Gram IV). (sumber dari: anonim.
Gram staining. http://www.absoluteastronomy.com/topics/Gram_staining).
Prinsip dasar dari metode pewarnaan gram adalah sebagai berikut
Hal pertama yang harus dilakukan adalah fiksasi, fiksasi berfungsi untuk
membunuh dan melekatkan bakteri pada kaca objek sehingga pewarnaan dapat
dilakukan dengan baik. Setelah itu baru dilanjutkan dengan penambahan
senyawa-senyawa pewarna. Reagen pertama yang digunakan disebut warna
dasar yaitu karbol gentian violet. Pewarna ini akan menempel pada lapisan
poeptidoglikan gram positif dan LPS pada gram negative. Reagen kedua untuk
memperkuat penempelan warna pada membran sel bakteri yaitu pewarna lugol.
Sedangkan raegen ke 3 yaitu etanol absolute digunkan untuk mencuci warna
(decolorizing agent). Lunturnya tidaknya warna dasar tergantung pada
komposisi dinding sel, bakteri gram negative yang mempunyai LPS warnanya
akan luntur karena lemak larut dalam alkohol, dan sedangkan warna pada
dinding sel bakteri gram positif tidak luntur karena warna sudah terikat pada
dinding sel. Dengan kata lain, pemberian etanol memiliki 2 fungsi yaitu pada
gram positif alkohol mengakibatkan peptidoglikan terdehidrasi sehingga
ukuran porinya mengecil. Ini mengakibatkan kristal violet tidak dapat keluar
dari sitoplasma. Sedangkan pada gram negatif alkohol mencuci dinding sel dan
meninggalkan lubang kecil pada peptidoglikan. Ini mengakibakan kristal violet
tercuci keluar dan sel menjadi tidak berwarna. Reagen yang terakhir adalah
warna pembanding yaitu fuchsin, pewarna tandingan ini akan masuk ke
dinding sel bakteri gram negatif. Sehingga didapat perbedaan warna antara
gram negative dan gram positif dari warna yang terlihat. Dari hasil yang
didapat, bakteri dapat diamati bentuk , ukuran, dan jenis gram bakteri. Berikut
ini adalah skema dari pewarnaan gram.

Gb. pewarnaan gram bakteri gram positif dan negatif

Setelah pewarnaan gram selesai kita lakukan, kita lakukan
pengamatan di mikroskop untuk melihat bentuk dan jenis bakteri. Bentuk
bakteri sendiri ada bermacam-macam antara lain cocci (bulat), bacilli (batang),
vibrio (koma), coccobaccil, dan masih banyak lagi. Dari berbagai bentuk
tersebut, bentuk palung umum yang dimiliki oleh sebagian besar bakteri adalah
bentuk cocci dan bacilli.
Setelah kita mengetahui bentuk dan jenis gram bakteri (gram positif
atau negatif), kita dapat melakukan berbagai uji biokimia yang jalurnya telah
ditentukan berdasarkan kunci dikotomi. Kita ikuti uji apa yang harus dilakukan
setelah kita ketahui bentuk dan jenis gramnya, tiap bakteri dengan bentuk dan
jenis gram yang berbeda akan melalui jalur uji yang berbeda. Dari hasil uji
tersebut kita bisa menentukan lagi uji apa yang harus kita lakukan selanjutnya,
hal itu terus kita lakukan hingga akhirnya kita dapat menentukan spesies
bakteri sampel kita. Berikut ini adalah kunci dikotomi untuk penentuan spesies
bakteri gram positif dan negatif :
 Sebagian besar uji yang kita lakukan adalah sama dengan yang kita
lakukan di penentuan genus bakteri, uji tersebut antara lain :
a. Uji fermentasi karbohidrat
Bakteri memproduksi asam organik ketika mereka memfermentasi
karbohidrat tertentu. Uji karbohidrat ini dirancang untuk mendeteksi
perubahan pH yang terjadi jika fermentasi dari karbohidrat tertentu tersebut
berlangsung. Asam akan menurunkan pH media dan menyebabkan indikator
phenol red berubah warna menjadi kuning. Jika bakteri tidak
memfermentasikan karbohidrat tersebut warna media akan tetap merah. Jika
dihasilkan gas selama proses fermentasi maka akan timbul gelembung pada
tabung Durham (yaitu tabung kecil yang letaknya terbalik). Media yang
digunakan dalam uji karbihidrat ini adalah Phenol red lactose broth, Phenol
red dextrose broth, dan Phenol red sucrose broth dan Phenol red mannitol
broth. Berikut ini adalah gambar hasil uji fermentasi karbohidrat:

Gb. Uji fermentasi karbohidrat

Keterangan :
 Tabung yang di kiri menunjukkan bahwa asam yang terbentuk lebih
sedikit dibandingkan dengan tabung yang paling kanan.
 Tabung yang di tengah menunjukkan bahwa tidak terjadi fermentasi
karbohirat, tidak terbentuk asam maupun gas (warna media tetap merah
dan tidak terbentuk gelembung pada tabung Durham)  uji negatif
 Tabung yang paling kanan menunjukkan bahwa terjadi fermentasi
karbohirat disertai dengan pembentukan asam dan gas (warna media
berubah menjadi kuning dan terbentuk gelembung pada tabung Durham)
 uji positif
b. Uji Indol
Indole adalah sebuah senyawa organik aromatik heterosiklik.Indole
is a popular component of fragrances and the precursor to many
pharmaceuticals. Indole adalah komponen populer wewangian dan
pendahulu untuk banyak obat-obatan. Compounds that contain an indole
ring are called indoles. Senyawa yang mengandung sebuah cincin indola
disebut indoles. The most famous derivative is the amino acid . Derivatif
yang paling terkenal adalah asam amino triptofan.
Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui apakah dalam
pertumbuhan bakteri dapat membentuk indol dari degradasi asam amino
triptophan, karena tidak semua bakteri mampu mendegradasi tiptophan
membentuk indol. Media yang digunakan dalam uji ini adalah SIM agar
deep tube . Konversi asam amino triptofan menjadi bentuk produk metabolit
yang di lakukan oleh enzim triptophanase.

Gb. Reaksi pembentukan indol

Uji positif untuk uji indol ditandai dengan ketika reagen Kovac’s
ditambahkan ke media akan terbentuk lapisan berwarna merah muda pada
permukaan media. Uji negatif ditunjukkan dengan tidak terbentuknya
lapisan merah muda. Warna merah ini dapat terbentuk karena indol yang
dihasilkan oleh bakteri bereaksi dengan p-dimetilaminobenzaldehid yang
terkandung dalam reagen Kovac’s.
 Gb. Uji indol

c. Uji Produksi H2S

Media yang digunakan untuk uji ini adalah SIM agar, media ini
mengandung peptone dan sodium tiosulfate sebagai sumber sulfur. Uji
produksi H2S positif ditandai dengan perubahan warna media menjadi
hitam, hal ini berarti bakteri menghasilkan Hidrogen Sulfit (H 2S). Indicator
yang biasa digunakan adalah FeSO4 yang berfungsi untuk memadatkan
media dan meningkatkan resiprasi anaerobik. Bila menghasilakn gas H 2S
gas tersebut akan bereaksi dengan FeSO4 dan akan membentuk presipitat
berwarna hitam.

Gb. Uji produksi H2S

d. Uji MRVP
Media yang digunakan dalam uji ini adalah MRVP Broth. Test ini
digunakan untuk menentukan 2 hal. Uji MR digunakan untuk menentukan
apakah glukosa dapat diubah menjadi produk asam seperti asam laktat,
asetat atau format. Sedangkan uji VP digunakan untuk menentukan apakah
glukosa dapat diubah menjadi asetil metil karbinol. Tes ini dilakukan
dengan membagi media yang telah ditumbuhi oleh bakteri menjadi 2 bagian.
Yang satu digunakan untuk uji MR sedangkan yang satu digunakan untuk
uji VP.
 MR test
 Beberapa bakteri dapat menghasilkan asam sebagai hasil fermentasi
glukosa. Namun, pada umumnya asam yang dihasilkan tidak cukup
banyak untuk mengubah warna metil merah menjadi merah karena
kondisi yang terlalu asam dapat mengganggu kelangsungan hidup
mikroorganisme. Uji MR dilakukan dengan menambahkan metil merah
ke dalam tabung yang akan digunakan untuk uji MR. Uji positif
ditunjukkan dengan berubahnya warna media menjadi merah.Sedangkan
uji tersebut dikatakan negatif bila terbentuk warna kuning yang berarti
glukosa diubah menjadi produk akhir yang bersifat netral.

Gb. Uji MR

 VP test
Pertama tama larutan alfa naftol (Reagen Barrit A) dan KOH 40%
(reagen Barrit B) ditambahkan ke dalam medium VP. Setelah beberapa
saat akan terjadi perubahan warna media menjadi mereah jika asetil metil
karbinol dihasilkan oleh bakteri tersebut (uji positif). Jika asetil metil
karbinol tidak dihasilkan maka media akan berwarna kuning.

 
 Gb. Uji VP

e. Uji Penggunaan Sitrat

Uji ini dilakukan untuk mengetes apakah bakteri tersebut dapat
mengkonversi sitrat (salah satu senyawa antara dalam siklus Kreb’s)
menjadi oksaloasetat (senyawa antara lain dalam siklus Kreb’s). Media yang
digunakan adalah Sommon’s Citrate agar, pada media ini sitrat merupakan
satu-satunya sumber karbon yang tersedia bagi bakteri. Jika bakteri
terssebut tidak dapat menggunakan sitrat maka bakteri tersebut tidak akan
tumbuh. Jika bakteri dapat menggunakan sitrat, maka bakteri akan tumbuh
dan media akan berubah warnanya menjadi biru sebagai dampak dari
meningkatnya pH dari media.

Gb. Uji sitrat

(http://web.fccj.edu/%7Elnorman/index.htm?index=0)

f. Uji Reduksi Nitrat

Semua makhluk hidup memerlukan berbagai materi organik dan
anorganik. Nitrogen merupakan komponen penyusun protein dan asam
nukleat yang ada di dalam jaringan hidup. Dalam metabolisme dikatakan
bahwa metabolisme tersebut anaerobik jika tidak molekul oksigen yang
tersedia sebagai akseptor elektron terakhir ( H+ ditangkap O2 jadi H2O).
Pada beberapa bakteri dalam kondisi anaerob tersebut, mampu
menggunakan senyawa anorganik lain sebagai akseptor elektron. Senyawa
yang dapat digunakan adalah senyawa sulfat dan nitrat. Jika senyawa nitrat
digunakan, maka senyawa nitrat akan diubah menjadi nitrit. Enzim yang
berperan dalam proses ini adalah nitrat reduktase. Pada beberapa organisme,
reaksi ini tidak hanya saja berhenti sampai nitrit namun dapat berlanjut
dengan reduksi nitrit menjadi ammonia atau molekul nitrogen. Reaksinya
adalah sebagai berikut :
NO3- + 2H+ NO2- + H2O
Reduksi nitrat oleh nitrat reduktase
Reduksi nitrit lebih
lanjut menjadi
NO2- NH3+ amoniak atau
atau molekul nitrogen

2NO3- + 12H+ + 10e- N2 + 6H2O

Dalam uji ini media yang digunakan adalah nitrate broth yang
komposisi utamanya antara lain, nutrien broth dan 0.1% KNO3 sebagai
sumber nitrat. Selain itu juga agar ditambahkan sehingga medium ini
menjadi semi-solid sehingga menghalangi masuknya oksigen ke dalam
media agar kondisi anaerobik dapat tercipta.
Hasil uji dikatakan positif jika muncul warna merah pada larutan
setelah penambahan reagen larutan A yang mengandung asam sulfanilat,
dan larutan B yang mengandung α-naphtylamine.

PembenReaksi pembentukan warna merah pada uji

nitrat
Namun jika hasil negatif yang didapat yaitu setelah penambahan
reagen warna larutan tidak berubah, belum dapat dipastikan bahwa bakteri
tersebut tidak mampu mereduksi nitrat. Ada dua kemungkinan sehingga hal
 tersebut dapat terjadi. Kemungkinan yang pertama adalah nitrat tidak
direduksi oleh bakteri, dan yang kedua adalah nitrit yang telah terbentuk
telah direduksi lebih lanjut menjadi amonia atau molekular nitrogen
sehingga diperlukan analisa lebih lanjut untuk memastikan kemungkinan
mana yang terjadi. Oleh karena itu, larutan diberi bubuk Zn yang dapat
berfungsi untuk mereduksi nitrat menjadi nitrit dan membentuk warna
merah. Jadi apabila setelah penambahan Zn warna larutan berubah menjadi
merah berarti nitrat di media memang tidak direduksi oleh bakteri dan dapat
dipastikan hasil uji bernilai negatif. Sebaliknya jika tidak terbentuk warna
merah, berarti nitrat pada media telah direduksi oleh bakteri.

Gb. Uji reduksi nitrat

g. Uji Katalase
“Katalase adalah enzim umum yang ditemukan hampir pada semua
mahkluk hidup yang terexpos oleh oksigen, dimana ia berfungsi untuk
mendekomposisi hidrogen peroksida. Satu molekul katalase dapat
mengubah jutaan molekul hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen
perdetik”, (dikutip dari http://www.absoluteastronomy.com/topics/
Catalase).
Selama respirasi aerobik, mikroorganisme dapat memproduksi
hidrogen peroksida sebagai produk samping. Hidrogen Peroksida adalah
senyawa superoksida yang bersifat toksik, jika terakumulasi dalam jumlah
besar dapat mengakibatkan kematian organisme itu sendiri. Hidrogen
Peroksida ini diproduksi ketika bakteri aerob, facultative anaerob, dan
 mikroaerophile menggunakan jalur respirasi aerobik selama proses
degradasi karbohidrat berlangsung. Oleh karena itu mikroorganisme
memerlukan enzim katalase yang akan memecah H2O2 menjadi H2O dan O2.
2H2O2 2H2O + O2 (g)
Untuk menguji adanya enzim katalase oleh suatu bakteri, maka
bakteri tersebut dapat ditumbuhkan pada media trypticase soy agar. Setelah
inkubasi (24 – 48 jam pada 370C) dan koloni bakteri telah tumbuh pada
media, maka dapat ditambahkan hidrogen peroksida pada media. Jika ada
enzim katalase, maka diindikasikan oleh munculnya gelembung dari gas
oksigen yang ‘terbebas’ sehingga uji ini dikatakan positif; sedangkan jika
tidak terbentuk gelembung berarti uji menunjukan hasil negatif.

h. Uji Urease
“Enzim urease yang dihasikan bakteri untuk menguraikan urea
menjadi amonia dan karbonat. Amonia bergabung dengan air membentuk
amonium sehingga pH air makin tinggi” ( dikutip dari
http://www.indofarma.co.id/index.php?
option=com_content&task=view&id=20& Itemid=125). Urease adalah
enzim hidrolitik yang menyerang ikatan nitrogen dan karbon pada
komponen amida misalnya urea dan membentuk alkaline yang produk
akhirnya adalah ammonia.
Uji aktivitas urease dilakukan dengan pertama-tama menumbuhkan
bakteri uji pada media urea broth yang mengandung indikator pH yaitu
phenol red. Adanya amonia dalam media akan menyebabkan warna
indikator berubah menjadi pink tua yang menandakan bahwa bakteri uji
memiliki enzim urease sehingga dapat dikatakan reaksi ini menunjukan
hasil uji positif. Hasil negatif ditandai dengan tidak terbentuknya warna pink
tua pada larutan.

Keterangan:
Tabung yang paling kiri
menunjukkan uji positif, tabung
yang di tengah menunjukkan uji
negatif, sedangkan tabung yang di
kanan adalah media yang tidak
 Gb. Uji Aktivitas urease
i. Uji Litmus Milk
Media yang dipakai dalam uji ini adalah litmus milk yaitu media
yang terdiri dari 2 komponen utama yaitu susu dan litmus. “Litmus milk
adalah medium berbasis susu untuk membedakan spesies antar bakteri.
Laktosa, litmus dan kasein terkandung dalam medium yang dapat
dimetabolisme oleh tipe bakteri yang berbeda. Penambahan litmus lebih
mengarah pada perubahan pH berlaku sebagai oksidasi dan reduksi
indikator. Tes sendiri menunjukan ketika bakteri dapat menfermentasikan
laktosa, mereduksi litmus, membentuk gas, membentuk gumpalan atau
memulai peptonisasi.”(dikutip dari
http://www.absoluteastronomy.com/topics/ Litmus_milk). Jadi uji ini
bertujuan untuk melihat kemampuan bakteri dalam menggunakan
komponen-komponen yang terdapat pada susu, misalnya laktosa, protein
susu (kasein), lacto-albumin, dan lactoglobulin. Dan untuk mendeteksi
perubahan digunakan indikator litmus.
Bakteri-bakteri yang mampu menggunakan laktosa sebagai sumber
karbon, berarti mempunyai enzim galaktosidase yang dapat memecah
molekul laktosa menjadi glukosa. Proses berikutnya adalah fermentasi
karbohirat yang akan menghasilkan asam sebagai produk akhirnya. Oleh
karena adanya asam maka akan mengakibatkan perubahan warna litmus dari
ungu menjadi merah muda. Perubahan warna litmus ini akan terjadi di
sekitar pH 4. Fermentasi biasanya diikuti juga dengan pembentukan gas.
Gas yang terbentuk umumnya adalah gas hidrogen dan gas karbondioksida.
Pembentukan gas ini dapat menyebabkan muncul retakan pada curd yang
terbentuk. Selain mendekteksi peristiwa diatas, uji litmus milk dapat
digunakan untuk menguji kemampuan bakteri dalam mereduksi litmus.
Litmus ini tereduksi akibat adanya peranan litmus sebagai akseptor elektron
dalam proses metabolisme bakteri tersebut. Pereduksian litmus ini akan
mengubah warna media dari ungu menjadi putih susu
Aktivitas biokimia bakteri dapat menghasilkan dua jenis curd, yaitu
acid curd dan rennet curd bergantung pada mekanisme pembentukannya.
Acid curd terbentuk karena adanya asam organik pada media dan dapat
menyebabkan presipitasi berupa calcium caseinate dari kasein susu
membentuk gumpalan yang tidak dapat larut. Gumpalan yang terbentuk
keras dan tidak dapat berpindah dari dinding tabung walaupun tabung
dimiringkan. Sedangkan rennet curd, diproduksi oleh beberapa organisme
yang mampu memproduksi renin, suatu enzim yang bekerja pada kasein dan
membentuk paracasein yang dengan keberadaan ion kalsium akan diubah
menjadi calcium paracaseinate dan membentuk gumpalan lembut dan
bersifat semisolid. Apabila tabung digoyangkan, maka gumpalan akan ikut
bergerak. Bagian lain dari susu yang dapat digunakan adalah protein susu.
Beberapa bakteri dapat menghasilkan enzim proteolisis yang dapat
memecah protein menjadi asam amino dan hal itu dapat dilihat dari media
yang menjadi jernih kecoklatan. Proses pemecahan ini akan mengakibatkan
pelepasan amonia yang akan meningkatkan kebasaan dari media. Naiknya
nilai pH ini akan menimbulkan pita berwarna ungu tua pada bagian atas
media. Kegunaan lainnya, uji litmus milk juga dapat digunakan untuk
menguji kemampuan bakteri dalam mendegradasi kasein. Degradasi dari
kasein menjadi rantai polipeptida yang lebih pendek ini diikuti dengan
pelepasan produk akhir yang bersifat basa yang mengakibatkan perubahan
warna litmus dari ungu menjadi biru tua.
 Gb. Uji litmus milk

Selain berbagai uji di atas, ada beberapa uji lain yang tidak kita
lakukan dalam penentuan genus bakteri. Uji-uji tersebut antara lain:
a. Uji hemolitik
Hemolisis adalah pemecahan sel darah merah oleh suatu subtansi yang
disebut hemolisin. Kemampuan koloni bakteri dalam memecahkan sel
darah merah ketika bakteri tumbuh dapat digunakan dalam
mengklasifikasikan mikroorganisme tertentu. Ada beberapa tipe
hemolisis antara lain;
1. Hemolisis Alfa
Hemolisis jenis ini dapat diketahui dengan munculnya warna gelap
dan kehijauan pada media disekeliling atau di bagian bawah koloni
bakteri. Peristiwa ini juga dapat dikatakan hemolisis parsial atau
hemolisis tidak sempurna. Alfa hemolisis umumnya terjadi karena
peroksida yang dihasilkan oleh bakteri.
2. Hemolisis Beta
Kadang-kadang disebut juga hemolisis sempurna atau complete
hemolysis, dimana sel darah merah sepenuhnya terlisiskan. Hal itu
dapat dilihat dengan munculnya area transparan dan terang pada
media disekeliling koloni atau di bagian bawah koloni bakteri.
3. Hemolisis gamma
Disebut juga non-hemolisis, organisme jenis ini tidak dapat
melakukan pemecahan sel darah merah atau hemolisis, hal ini ditandai
dengan tidak berubahnya media disekeliling atau bagian bawah koloni
bakteri
Darah yang digunakan untuk agar ini adalah tanpa molekul fibrin
sehingga dapat dipastikan pembekuan darah tidak terjadi di media, karena
 jika terjadi pembekuan darah dapat mengganggu deteksi visual dari reaksi
hemolisis. (sumber dari: anonim. Hemolysis (Microbiology).
http://www.absoluteastronomy.com /topics/Hemolysis_(microbiology) )

(sumber gambar dari:

http://randstarteam.blogspot.com/2007/
12/principles-of-test-used-by-
team.html)

Gb. Uji hemolisis

b. Uji Bile Esculin
Uji ini digunakan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi anggota
dari genus Enterococcus. Bakteri yang dikatakan dapat menghidrolisis
esculin adalah ketika muncul warna hitam akibat interaksi ferric citrate
dengan esculetin yang merupakan hasil hidrolisis esculin setelah bakteri
diinkubasi selama 24-48 jam pada 37˚C. (sumber dari: anonim. Bile
Esculin Agar http://www.absoluteastronomy.com
/topics/Bile_esculin_agar)

c. Uji Pigmen
Pigment bakteri dapat digolongkan menjadi dua yaitu pigmen
bakteri yang dapat larut dalam air dan yang larut di dalam minyak.
Beberapa strain dari S. aureus mampu memproduksi staphyloxanthin
(sebuah karotenoid) sebagai antioksidan yang membantu mikroba tetap
hidup walau ada substansi penyebab oksidasi seperti hidrogen peroksida.
 (sumber dari: anonim. Staphylococcus aureus.
http://www.absoluteastronomy.com/ topics/Staphylococcus_aureus).
Ada tidaknya pigment dapat digunakan dalam mengidentifikasi
suatu bakteri. Namun warna dari pigment tidak dapat dijadikan acuan
karena terkadang warna dari suatu koloni bakteri tergantung dari kondisi
dan lingkungan hidupnya.
d. Uji Bile Solubility
Uji digunakan untuk membedakan golongan bakteri alfa hemolisis.
Media yang digunakan mengandung bile atau bile salt, contohnya SDS
(Sodium Dodecyl Sulphate), ketika ditumbuhkan pada media ini, dinding
sel bakteri Pneumococcus akan mengalami lisis sedangkan kelompok alfa
hemolisis yang lain tidak mengalami lisis sehingga kelompok ini disebut
bile insoluble (pada media akan terlihat keruh). Pada kultur bile soluble
media akan terlihat jernih. (sumber dari: anonim. 2007. Principles of Test
used by the team: Laboratory test Principles.
http://randstarteam.blogspot.com/2007/12/principles-of-test-used-by-
team.html)

e. Uji 6.5% Sodium Chloride Broth

NaCl dipakai untuk membedakan antara gram positive cocci yang
akan dapat bertumbuh dalam 6.5% NaCl dengan yang tidak teradaptasi
pada konsentrasi garam ini. Spesies Enterococcus akan dapat bertahan
pada konsentrasi garam yang lebih tinggi dibandingkan dengan gram
positive cocci yang lain. (sumber dari: anonim. 2007. Principles of Test
used by the team: Laboratory test Principles.
http://randstarteam.blogspot.com/2007/12/principles-of-test-used-by-
team.html)
III. ALAT DAN BAHAN
1. Alat :
- Tabung
- Cawan petri
- Objek glass
- Jarum ose
- Erlemeyer
- Beker glass
- Pipet
- Hotplate stirrer
- Lampu spiritus

2. Bahan :
- Sampel bakteri (Sampel A, B, C) - Phenol Red Lactose Broth
- Crystal violet (Gram I)
- Gram’s iodine (Gram II)
- Etanol 95% (Gram III)
- Safranin (Gram IV)
- Barrit A dan Barrit B
- Reagen kovac’s
- H2O2 3%
- Medium TSA
- Nitrate Broth
- Phenol Red Dextrose Broth
- Phenol Red Sucrose Broth
- Medium SIM Agar
- MRVP Broth
- Simmon’s Citrate Agar
- Urea Broth
- Starch Agar
- Medium Litmus Milk
IV. CARA KERJA
1. Melakukan pewarnaan gram untuk menentukan jalur uji yang harus
dilakukan agar kita dapat mengetahui spesies sampel, lankah-langkahnya
adalah sebagai berikut :
a. Menetesi preparat olesan bakteri yang telah difiksasi dengan beberapa
tetes larutan karbolgentian violet (Gram I), membiarkan selama 3 menit.
Membilas dengan air.
b. Menetesi preparat dengan larutan lugol (Gram II) beberapa tetes.
Membiarkan selama 1 menit.
c. Membilas dengan air.
d. Mencuci dengan larutan Gram III (alkohol 96%) dengan cara
memiringkan preparat kemudian menetesi perlahan- lahan dengan Gram
III hingga tidak ada pewarna yang terlunturkan.
e. Membilas preparat secara hati-hati dnegan air
f. Menetesi preparat dengan larutan fuchsin (Gram IV) beberapa tetes.
Mendiamkan selama 3 menit.
g. Membilas preparat dengan air. Kemudian mengeringkan di udara atau
dengan cara menyerap kelebihan air dengan tissue.
h. Mengamati preparat di mikroskop dan mencatat hasilnya.
2. Dari hasil pewarnaan gram, ada beberapa kemungkinan hasil yang kita
dapatkan antara lain :
 Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya cocci
Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah
Micrococcus spp, Staphylococcus spp dan Streptococcus spp. Untuk
mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji
 biokimia yaitu uji katalase.
 Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya Bacilli
Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah
Corynebacterium spp. dan Lactobacillus spp.Untuk mengetahui lebih
detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan pewarnaan spora.
 Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya cocci
Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah
Branhamella spp, Moraxella spp, dan Neisseria spp.Untuk mengetahui
lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji biokimia
yaitu uji glukosa.
 Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya Bacilli
Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah
Citrobacter spp, Enterobacter spp., Escherichia spp., Klebsiella spp.,
Proteus spp., dan Pseudomonas spp.Untuk mengetahui lebih detail
tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji biokimia yaitu uji
laktosa.

A. Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya cocci, maka jalur uji
yang harus dilakukan :
1. Uji Katalase
1a. Bila uji katalase menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah Micrococcus spp. dan Staphylococcus
spp. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita,
maka dilakukan uji mannitol.
1b. Bila uji katalase menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah Streptococcus spp.. Untuk
mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan
uji bile esculin.
2. Uji Mannittol
2a. Bila uji Mannitol menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah Staphylococcus aureus.
2b. Bila uji Mannitol menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah S. Saprophyticus, S.epidermis,
M.luteus, M.varians. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies
sampel kita, maka dilakukan Uji Pigment.
3. Uji Bile Esculin
3a. Bila uji Bile Esculin menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah E. Faecalis dan S.bovis. Untuk
mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan
uji pada 6.5% NaCl Broth.
3b. Bila uji Bile Esculin menunjukkan negatif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah S.pneumoniae, S.mitis dan
S.pyogenes. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel
kita, maka dilakukan Uji Hemolysis.
4. Uji Pigment
4a. Bila uji Pigment menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah M.luteus dan M. varians. Untuk
mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan
Uji Fermentasi Glukosa.
4b. Bila uji Pigment menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah S. Saprophyticus dan S.epidermis.
Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka
dilakukan Uji Fermentasi Fruktosa.
5. Uji pada 6.5% NaCl Broth
5a. Bila uji pada 6.5% NaCl Broth menunjukkan positif maka
kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. Faecalis.
5b. Bila uji pada 6.5% NaCl Broth menunjukkan negatif maka
kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S.bovis.
6. Uji Hemolysis
6a. Bila uji Hemolysis menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah alpha hemolysis yaitu S.pneumoniae
 dan S.mitis. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel
kita, maka dilakukan Uji Bile Solubility.
6b. Bila uji Hemolysis menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah S.pyogenes.

7. Uji Fermentasi Glukosa

7a. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah M. varians.
7b. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif maka
kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M. luteus.

8. Uji Fermentasi Fruktosa

8a. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah S. epidermis.
8b. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif maka
kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S.
saprophyticus.
9. Uji Bile Solubility
9a. Bila uji Bile Solubility menunjukkan positif maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah S.pneumoniae.
9b. Bila uji Bile Solubility menunjukkan negatif maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah S. mitis.

B. Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya Bacilli, maka jalur

uji yang harus dilakukan :
1. Uji pewarnaan spora
1a. Bila terdapat spora dalam sampel, maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah Bacillus spp. Untuk mengetahui lebih
detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji mannitol.
1b. Bila tidak ditemukan adanya spora, maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah Corynebacterium spp. dan Lactobacillus
spp. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita,
maka dilakukan uji katalase.
2. Uji mannitol
2a. Bila uji mannitol menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah B. Megaterium dan B.subtilis. Untuk
mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan
Uji Voges-Proskauer.
2b. Bila uji mannitol menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah B. cereus.
3. Uji katalase
3a. Bila uji katalase menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah Corynebacterium spp. Untuk
mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan
Uji Reduksi Nitrat.
3b. Bila uji katalase menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah Lactobaciillus spp. Untuk mengetahui
lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji
Fermentasi Glukosa.
4. Uji Voges-Proskauer
4a. Bila uji mannitol menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah B.subtilis.
4b. Bila uji mannitol menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah B. Megaterium.
5. Uji Reduksi Nitrat
5a. Bila uji katalase menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah C. xerosis.
5b. Bila uji katalase menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah C. Kutscheri.
6. Uji Fermentasi Glukosa
 6a. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif (terbentuk asam
dan gas), maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah
L.fermentum.
6b. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif (hanya terbentuk
asam), maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L.
casei dan L. delbrueckii Untuk mengetahui lebih detail tentang
spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Fermentasi Mannitol.
7. Uji Fermentasi Mannitol.
7a. Bila uji Fermentasi Mannitol menunjukkan positif, maka
kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. casei
7b. Bila uji Fermentasi Mannitol menunjukkan negatif, maka
kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. delbrueckii.

C. Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya cocci. Maka jalur uji
yang harus dilakukan :
1. Uji Fermentasi Glukosa
1a. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif, maka
kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Neisseria spp.
Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka
dilakukan Uji Reduksi Nitrat .
1b. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif, maka
kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Branhamella
spp dan Moraxella spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang
spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat.
2. Uji Reduksi Nitrat
- Untuk uji glukosa positif
2a. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan positif, maka
kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah N.
mucosa .
2b. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan negatif, maka
kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah N.sicca .
 - Untuk uji glukosa negatif
2a. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan positif, maka
kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah
B.catarrhalis
2b. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan negatif, maka
kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M. bovis

D. Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya Bacilli, maka jalur

uji yang harus dilakukan :
1. Uji Fermentasi Laktosa
1a. Bila uji Fermentasi Laktosa menunjukkan positif, maka
kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Citrobacter spp,
Enterobacter spp., Escherichia spp. dan Klebsiella spp.Untuk
mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan
Uji Produksi Indole .
1b. Bila uji Fermentasi Laktosa menunjukkan negatif, maka
kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Proteus spp.,
dan Pseudomonas spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies
sampel kita, maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa
2. Uji Produksi Indole
2a. Bila uji produksi indol menunjukkan positif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah C. Intermedius dan E.
coli.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka
dilakukan Uji Penggunaan Citrate .
2b. Bila uji produksi indol menunjukkan negatif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah C. freundii, Enterobacter spp.,
Escherichia spp. dan Klebsiella spp.Untuk mengetahui lebih detail
tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Metyl Red .
3. Uji Fermentasi Glukosa
3a. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif, maka
kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Proteus
 spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka
dilakukan Uji Produksi Indole.
3b. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif, maka
kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Pseudomonas
spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka
dilakukan Uji Reduksi Nitrate.

4. Uji Penggunaan Citrate

4a. Bila uji Penggunaan Citrate menunjukkan positif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah C. Intermedius
4b. Bila uji Penggunaan Citrate menunjukkan negatif, maka
kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. coli.
5. Uji Metyl Red
5a. Bila uji Metyl Red menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah C. freundii dan K.ozaenae..Untuk
mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan
Uji Produksi H2S.( I )
5b. Bila uji Metyl Red menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah E. Aerogenes dan K. Pneumoniae.
Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka
dilakukan Uji aktivitas urease. ( I )
6. Uji Produksi Indole
6a. Bila uji Produksi Indole menunjukkan positif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah P. vulgaris dan
P.rettgeri.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita,
maka dilakukan Uji Produksi H2S. ( II )
6b. Bila uji Produksi Indole menunjukkan negatif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah P. mirabilis dan P.
inconstans.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel
kita, maka dilakukan Uji aktivitas urease . ( II )
7. Uji Reduksi Nitrate
7a. Bila uji Reduksi Nitrate menunjukkan positif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah P.aeruginosa dan
P.fluorescens.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel
kita, maka dilakukan Uji Litmus Milk.
7b. Bila uji Reduksi Nitrate menunjukkan negatif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah P.mallei.

8. Uji Produksi H2S( I )

8a. Bila uji Produksi H2S menunjukkan positif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah C. freundii
8b. Bila uji Produksi H2S menunjukkan negatif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah K.ozaenae..
9. Uji aktivitas urease( I )
9a. Bila uji aktivitas urease menunjukkan positif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah K. Pneumoniae.
9b. Bila uji aktivitas urease menunjukkan negatif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah E. Aerogenes.
10. Uji Produksi H2S( II )
10a.Bila uji Produksi Indole menunjukkan positif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah P. vulgaris.
10b.Bila uji Produksi Indole menunjukkan negatif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah P.rettgeri.
11. Uji aktivitas urease( II )
11a.Bila uji aktivitas urease menunjukkan positif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah P. mirabilis.
11b.Bila uji aktivitas urease menunjukkan negatif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah P. inconstans.
12. Uji Litmus Milk
12a.Bila uji Litmus Milk menunjukkan positif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah P.aeruginosa yang mengalami
peptonization
 12b.Bila uji Litmus Milk menunjukkan positif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah P.fluorescens yang mengalami
reaksi alkaline.

V. HASIL PERCOBAAN
 Sampel bakteri A9
Pewarnaan gram : bakteri gram positif, bentuk bacilli.
Pewarnaan spora : memiliki spora
Uji fermentasi manitol : uji +
Uji VP : uji +
Jadi bakteri sampel A9 adalah Bacillus subtilis.
 Sampel bakteri B9
Pewarnaan gram : bakteri gram negatif, bentuk bacilli.
Uji fermentasi laktosa : uji +
Uji indol : uji –
Uji MR : uji –
Uji Urea : uji –
Jadi bakteri sampel B9 adalah Enterobacter aerogenes.
 Sampel bakteri C9
Pewarnaan gram : bakteri gram positif, bentuk cocci.
Uji katalase : uji +
Uji manitol : uji +
Jadi bakteri sampel C9 adalah Staphylococcus aureus.
VI. PEMBAHASAN
1. Sampel A9
Jalur uji yang dilakukan adalah sebagai berikut :
 Pewarnaan Gram & Morfologi
Uji morfologi pada sampel A9 menunjukkan bahwa bakteri
tersebut termasuk ke dalam golongan bakteri gram positif dengan
bentuk bacilli. Bakteri tersebut berwarna ungu setelah diwarnai dengan
pewarnaan gram. Hal ini disebabkan karena dinding sel bakteri tersebut
tersusun dari lapisan peptidoglikan yang tebal sehingga ketika dibilas
dengan gram III (alkohol 96%) warna ungu dari kristal violet tidak
hilang. Oleh karena itu, dari hasil pewarnaan gram dan bentuk
morfologinya dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel A9 merupakan
bakteri gram positif dengan bentuk bacil sehingga uji berikutnya yang
harus dilakukan (sesuai dengan kunci dikotomi) adalah uji pewarnaan
spora.

Bakteri gram positif (berwarna ungu) dengan selnya berbentuk bacilli.

 Uji Pewarnaan spora

Uji pewarnaan spora ini dilakukan menggunakan pewarna
malachite green dan fuchsin. Bila bakteri tersebut memiliki spora, maka

Uji manitol +
 akan muncul warna hijau pada preparat bakteri tersebut jika bakteri
tidak memiliki spora maka hanya akan terlihat warna merah. Hasil yang
kami dapatkan adalah bakteri A9 positif memiliki spora. Oleh karena
itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan kunci
dikotomi adalah uji fermentasi manitol.

Warna biru ditengah-tengah sel bakteri menunjukkan bbakteri tersebut memi

 Uji Fermentasi manitol

Uji Fermentasi manitol ini dilakukan pada medium Phenol Red
Manitol Broth. Pada uji ini, bakteri A9 menunjukkan hasil positif yaitu
warna medium yang tadinya merah berubah menjadi agak kekuningan.
Hal ini berarti bakteri tersebut dapat memfermentasi manitol dan dari
proses fermentasi tersebut dihasilkan asam yang ditandai dengan
berubahnya warna indikator phenol red menjadi kuning. Sehingga uji
yang harus dilakukan berikutnya sesuai dengan kunci dikotomi adalah
uji Voges-Proskauer.

Uji manitol +
Warna media yang tadinya merah tua berubah menjadi oran

 Uji Voges-Proskauer
 Media yang digunakan dalam uji VP ini adalah MRVP broth.
Uji Voges-Proskauer digunakan untuk menentukan kemampuan
beberapa organisme untuk memproduksi produk akhir non asam atau
netral seperti asetilmetil -karbinol yang berasal dari metabolisme
glukosa. Reagen yang digunakan dalam uji ini adalah reagen Barrit A
dan Barrit B yang mengandung campuran α-naphthol alkoholik dan
larutan 40% potassium hydroxide (KOH). Keberadaan warna merah
pada kultur setelah penambahan reagen Barritt mengindikasikan
keberadaan acetylmethylcarbinol dan merupakan hasil positif, dan bila
tidak ada berarti hasilnya negatif. Hasil pengujian sampel kita
menunjukkan uji positif, dengan demikian dapat kita simpulkan bahwa
sampel bakteri A9 adalah Bacillus subtilis.

Uji VP +
Terbentuk cincin berwarna merah setelah penambahan reagen Barrit

2. Sampel B9
Jalur uji yang dilakukan adalah sebagai berikut :
 Pewarnaan Gram & Morfologi
Hasil uji morfologi pada sampel B9 menunjukkan bahwa bakteri
pada sampel B termasuk ke dalam golongan bakteri gram negatif
dengan bentuk bacilli. Bakteri tersebut berwarna ungu setelah diwarnai
dengan pewarnaan gram. Hal ini disebabkan karena dinding sel bakteri
ini tersusun dari lapisan lipopolisakarida sehingga ketika dicuci dengan
gram III (alkohol) lapisan tersebut akan larut sehingga warna ungu dari
karbol violet juga luntur. Dengan demikian dari hasil pewarnaan gram
dan pengamatan morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri B9
 merupakan bakteri gram negatif dengan bentuk bacilli sehingga untuk
uji berikutnya yang harus dilakukan adalah uji fermentasi laktosa.

Bakteri gram negatif (berwarna merah) dengan bentuk sel bacilli.

 Uji Fermentasi Laktosa

Uji Fermentasi Laktosa ini dilakukan pada medium phenol red
lactosa broth. Hasil yang didapatkan adalah bakteri B9 dapat
memfermentasi laktosa. Hasil uji positif ini ditunjukkan dengan
perubahan warna media yang tadinya merah menjadi merah
kekuningan. Oleh karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan
sesuai dengan kunci dikotomi adalah uji indol.

Uji Laktosa +
Warna media yang tadinya merah berubah menjadi merah kekuningan.

 Uji Produksi Indol

Media yang digunakan untuk uji indol adalah SIM agar, untuk
melakukan pengujian kita perlu menambahkan reagen Kovac. Setelah
reagen kovac ditambahkan tidak terjadi perubahan pada media, tidak
terbentuk cincin merah yang menandakan uji positif. Hasil yang negatif
ini berarti bahwa bakteri B9 tidak memiliki enzim triptophanase yang
dapat memecah asam amino triptophan menjadi indol. Oleh karena itu,
 uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan kunci dikotomi
adalah uji metil red.

Uji Indol -
Tidak terbentuk cincin merah setelah ditetesi reagen Kovac’s, berarti bakteri B9 tidak memiliki

 Uji Metil Red

Uji metil merah dilakukan dengan menggunakan medium
MRVP Broth. Pada uji ini, bakteri B menunjukkan hasil negatif.
Namun, pada saat melakukan pengujian kami melakukan kesalahan.
Seperti terlihat pada gambar, kami terlalu banyak menambahkan
indikator metil merah sehingga warna media berubah menjadi kemerah-
merahan. Namun, warna merah ini lama kelamaan agak memudar
karena sebenarnya bakteri B tidak dapat membentuk asam dalam
jumlah besar sehingga tidak mampu mengubah indikator metil merah
menjadi merah. Oleh karena itu, uji selanjutnya yang harus dilakukan
adalah uji aktivitas urease.

media terlihat merah karena kami terlalu banyak menambahkan reagen Kovac. Tetapi karena sebenarnya uji tersebut hasiln

 Uji aktivitas urease

 Uji aktivitas urease digunakan untuk mengetaui kemampuan
bakteri B9 untuk melakukan degradasi urea menggunakan enzim
urease. Media yang digunakan untuk uji ini adalah urea broth. Pada uji
ini, bakteri menunjukkan hasil negatif yaitu ditandai dengan tidak
berubahnya warna media dari ungu menjadi pink tua. Hal ini berarti
bakteri tidak memiliki enzim urease sehingga tidak dapat memcah urea
menjadi karbon dioksida, air dan amonia. Karena hasil uji urease ini
hasilnya negatif maka kami dapat menyimpulkan bahwa sampel
bakteri B9 adalah Enterobacter aerogenes.

Uji Urease -
Warna media tidak berubah menjadi pink tua, berarti bakteri B9 tidak memiliki e

3. Sampel C9
Jalur uji yang dilakukan adalah sebagai berikut :
 Pewarnaan Gram & Morfologi
Uji morfologi pada sampel C9 menunjukkan bahwa bakteri
tersebut termasuk ke dalam golongan bakteri gram positif dengan
bentuk cocci. Bakteri tersebut berwarna ungu setelah diwarnai dengan
pewarna gram. Hal ini disebabkan karena dinding sel bakteri tersebut
tersusun dari lapisan peptidoglikan yang tebal sehingga ketika dibilas
dengan gram III (alkohol 96%) warna ungu dari kristal violet tidak
hilang. Oleh karena itu, dari hasil pewarnaan gram dan bentuk
morfologinya dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel C9 merupakan
 bakteri gram positif dengan bentuk cocci sehingga uji berikutnya yang
harus dilakukan sesuai dengan kunci dikotomi adalah uji aktivitas
katalase

Bakteri gram positif (warna ungu) dengan sel berbentuk cocci.

 Uji aktivitas katalase

Uji aktifitas katalase dilakukan dengan menggunakan
medium TSA dan selanjutnya dilakukan penambahan reagen berupa
H2O2 3%. Bakteri sampel C menunjukkan hasil positif pada uji ini yang
artinya bakteri sampel C memiliki enzim katalase. Hasil positif tersebut
ditunjukkan dengan adanya gelembung – gelembung gas pada
permukaan koloni ketika ditetesi dengan H2O2 3%. Hal ini berarti
bakteri sampel B dapat memecah hidrogen peroksida menjadi air dan
karbondioksida sesuai reaksi berikut

Oleh karena itu, untuk uji

berikutnya yang harus dilakukan adalah uji fermentasi mannitol.

 Uji Fermentasi Mannitol

Uji Fermentasi Mannitol ini dilakukan pada medium phenol red
mannitol broth. Pada uji ini, bakteri C9 menunjukkan hasil positif, yaitu
dapat memfermentasikan manitol. Hasil uji positif ini ditunjukkan oleh
 warna media yang berubah menjadi merah kekuningan. Dengan
demikian dapat kita simpulkan bahwa bakteri sampel C9 adalah
Staphylococcus aureus.

VII. KESIMPULAN
Identifikasi spesies bakteri sampel yang diberikan dilakukan dengan
melihat bentuk dan jenis gram bakteri lalu dilanjutkan dengan berbagai uji
biokimia. Tiap bakteri memiliki sifat dan kharakteristik yang khas
sehingga jalur uji yang dilakukan untuk tiap bakteri berbeda-beda sesuai
dengan kunci dikotomi yang dijadikan pedoman. Dengan demikian dapat
kita simpulkan bahwa :
Bakteri A9 adalah Bacillus subtilis
Bakteri B9 adalah Enterobacter aerogenes
Bakteri C9 adalah Staphylococcus aureus

VIII. DAFTAR PUSTAKA

1. anonim. Binomial Nomenclatrure. http://www.absolute astronomy.com
/topics/Binomial_nom enclature
2. anonim. Dichotomy. http://www.absoluteastronomy.com/topics/Dichotomy
3. anonim. Gram staining.
http://www.absoluteastronomy.com/topics/Gram_staining).
4. http://web.fccj.edu/%7Elnorman/index.htm?index=0
5. http://www.absoluteastronomy.com/topics/ Catalase
6. http://www.indofarma.co.id/index.php?
option=com_content&task=view&id=20& Itemid=125
7. http://www.absoluteastronomy.com/topics/ Litmus_milk
8. Anonim. Hemolysis (Microbiology). http://www.absoluteastronomy.com
/topics/Hemolysis_(microbiology)
9. http://randstarteam.blogspot.com/2007/12/principles-of-test-used-by-team.html
10. Anonim. Bile Esculin Agar http://www.absoluteastronomy.com
/topics/Bile_esculin_agar
11. Anonim. Staphylococcus aureus. http://www.absoluteastronomy.com/
topics/Staphylococcus_aureus
12. Anonim. 2007. Principles of Test used by the team: Laboratory test
Principles. http://randstarteam.blogspot.com/2007/12/principles-of-test-
used-by-team.html
13. Anonim. 2007. Principles of Test used by the team: Laboratory test
Principles. http://randstarteam.blogspot.com/2007/12/principles-of-test-
used-by-team.html)