ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA ISOFLAVON PADA BIJI KEDELAI

(Glycine max)
(Metode Maserasi, Kromatografi Lapis Tipis, dan
KLT-Spektrofotodensitometri )
BAB I
PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

Kedelai telah menunjukan beberapa keuntungan kesehatan yang disebabkan karena
kandungan nutrisinya yang tinggi dan kandungan fitokimianya. Kedelai tidak hanya kaya
protein, tetapi mengandung mineral yang berguna seperti, kalsium, besi, dan serat terlarut.
Protein kedelai memenuhi kebutuhan protein pada manusia. Protein dan isoflavon dari
kedelai telah terbukti menurunkan resiko penyakit jantung dan sebagai antikanker.
Isoflavon merupakan subkelas dari flavonoid atau isomer flavon yang merupakan
flavonoid minor, yang jumlahnya sangat sedikit dan sebagai bagi tumbuhan berfungsi sebagai
fitoaleksin yaitu senyawa pelindung yang terbentuk dalam tumbuhan untuk pertahanan
terhadap serangan penyakit. Isoflavon di alam sering dijumpai dialam dalam bentuk
glikosidanya (terikat pada gugus gula). Bentuk glikon dari isoflavon larut dalam pelarut polar,
sedangkan bentuk aglikonnya larut dalam pelarut nonpolar. Flavonoid minor isoflavon
penyebarannya terbatas pada beberapa jenis tumbuhan. Salah satunya terdapat pada tanaman
kacang kedelai (Glycine max). Senyawa isoflavon yang terdapat di kacang kedelai antara lain
genistein dan daidzein. Isoflavon sukar dicirikan karena reaksinya tidak khas dengan pereaksi
warna manapun. Beberapa isoflavon (misalnya daidzein) memberikan warna biru muda
cemerlang dengan sinar UV bila diuapi dengan ammonia, tetapi kebanyakan yang lain
(misalnya genistein) tampak sebagai bercak lembayung pudar yang dengan ammonia berubah
menjadi coklat pudar (Harbone, 1987).
Isoflavon merupakan bagian dari kelompok flavonoid. Isoflavon ditemukan sebagian
besar pada kacang kedelai dan memiliki struktur kimia yang hampir sama dengan hormon
estrogen. Isoflavon utama yang ditemukan pada kacang kedelai adalah genistein dan
daidzein. Karena strukturnya yang mirip dengan estrogen dan dapat berinteraksi dengan
reseptor estrogen lain, isoflavon dari kedelai sering digunakan sebagai fitoestrogen (McCuey,
2004)
Struktur isoflavon kedelai yang mirip dengan estrogen dan kemudahannya untuk
berinteraksi dengan estrogen reseptor membuat isoflavon ini diduga bermanfaat dalam
mengatasi sistem somatik, perasaan, dan hal-hal yang berhubungan dengan menopause.
1
Mengkonsumsi suplemen fitoisoflavon telah terbukti dapat berpengaruh pada gejala
premenopause. Isoflavonoid dari kedelai juga berpotensi sebagai sarana alternatif dalam
terapi kesehatan jangka panjang yang berhubungan dengan menopause dan khususnya
osteoporosis (McCuey, 2004).
Isoflavon ini boleh dibilang hanya terdapat pada kedelai saja. Isoflavon ini berfungsi
melakukan regulasi untuk menghambat pertumbuhan kanker terutama kanker prostat. Selain
berfungsi untuk mencegah kanker prostat, biji kedelai juga berfungsi untuk menurunkan
resiko terkena penyakit jantung, diabetes, ginjal dan osteoporosis (Asih, 2009). Karena begitu
pentingnya fungsi tanaman ini, serta dugaan terhadap adanya senyawa golongan isoflavon
yang dikandung, maka pada penelitian ini dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa
golongan isoflavon dari biji kedelai (Glycine max).
Proses identifikasi isoflavon pada kedelai dimulai dengan pengumpulan bahan,
kemudian penyederhanaan bentuk bahan dengan mengubah biji menjadi bentuk serbuk.
Serbuk ini kemudian dimaserasi yaitu perendaman dengan pelarut, maserasi dilakukan untuk
mengeluarkan bahan aktif dari serbuk simplisia. Teknik maserasi dipilih karena peralatan
yang digunakan sederhana, dan tidak memerlukan keahlian dari praktikan. Dengan teknik
maserasi bahan aktif dapat diperoleh dari simplisia dengan maksimal, karena perendaman
yang dilakukan lebih dari satu hari. Teknik lanjutan setelah maserasi yang digunakan adalah
kromatografi kolom lambat, metode ini dipilih karena dengan metode ini akan didapat fraksi-
fraksi yang akan membantu dalam analisis selanjutnya. Selanjutnya adalah pemisahan
dengan kromatografi lapis tipis (KLT), metode ini dilakukan untuk memisahkan senyawa
isoflavon yang ada dalam fraksi hasil kromatografi kolom. Dengan metode ini didapatkan
harga Rf yang spotnya dapat diperjelas dengan penampak bercak dan dilihat dibawah sinar
UV. Setelah pemisahan dengan KLT, dilakukan pengujian dengan geseran spektrum.
Pengujian dengan geseran spektum membantu dalam menentukan pola oksigenasi. Disamping
itu, kedudukan gugus hidroksil fenol bebas pada inti flavonoid dapat ditentukan dengan
menambahkan peraksi geser ke dalam larutan cuplikan dan mengamati pergeseran puncak
serapan yang terjadi. Dengan demikian, secara tidak langsung cara ini berguna untuk
menentukan kedudukan gula atau metal yang terikat pada salah satu gugus hidroksil fenol
(Markham, 1988)

2
1.2 Rumusan Masalah
1. Bagaimana cara mengisolasi senyawa isoflavon yang terkandung pada biji kedelai
Glycine max?
2. Bagaimana cara mengidentifikasi senyawa isoflavon berdasarkan metode geseran
spektrum?

1.3 Tujuan Penelitian

1. Untuk mengisolasi senyawa isoflavon yang terdapat dalam biji kedelai
2. Untuk mengidentifikasi senyawa isoflavon yang terdapat dalam biji kedelai

1.4 Manfaat Penelitian

Penelitian ini memiliki manfaat untuk mengetahui cara isolasi dan identifikasi senyawa
isoflavon dari biji kedelai Glycine max dengan metode maserasi, kromatografi kolom, dan
geseran spektrum.

3
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Deksripsi Tanaman

Kedelai merupakan tanaman asli Daratan Cina dan telah dibudidayakan oleh manusia
sejak 2500 SM. Sejalan dengan makin berkembangnya perdagangan antarnegara yang terjadi
pada awal abad ke-19, menyebabkan tanaman kedelai juga ikut tersebar ke berbagai negara
tujuan perdagangan tersebut, yaitu Jepang, Korea, Indonesia, India, Australia, dan Amerika.
Kedelai mulai dikenal di Indonesia sejak abad ke-16. Awal mula penyebaran dan
pembudidayaan kedelai yaitu di Pulau Jawa, kemudian berkembang ke Bali, Nusa Tenggara,
dan pulau-pulau lainnya. Pada awalnya, kedelai dikenal dengan beberapa nama botani, yaitu
Glycine soja dan Soja max. Namun pada tahun 1948 telah disepakati bahwa nama botani yang
dapat diterima dalam istilah ilmiah, yaitu Glycine max (L.) Merill.

2.1.1 Klasifikasi Tanaman

Divisio : Spermatophyta
Classis : Dicotyledoneae
Ordo : Rosales
Familia : Papilionaceae
Genus : Glycine
Species : Glycine max (L.) Merill
(Irwan, 2006)

Gambar 1. Tanaman Kedelai

4
2.1.2. Morfologi Tanaman Kedelai
Tanaman kedelai umumnya tumbuh tegak, berbentuk semak, dan merupakan tanaman
semusim. Morfologi tanaman kedelai didukung oleh komponen utamanya, yaitu akar, daun,
batang, polong, dan biji sehingga pertumbuhannya bisa optimal (Irwan, 2006).
A. Akar
Akar kedelai mulai muncul dari belahan kulit biji yang muncul di sekitar misofil.
Calon akar tersebut kemudian tumbuh dengan cepat ke dalam tanah, sedangkan kotiledon
yang terdiri dari dua keping akan terangkat ke permukaan tanah akibat pertumbuhan yang
cepat dari hipokotil. Sistem perakaran kedelai terdiri dari dua macam, yaitu akar tunggang dan
akar sekunder (serabut) yang tumbuh dari akar tunggang. Selain itu kedelai juga seringkali
membentuk akar adventif yang tumbuh dari bagian bawah hipokotil. Pada umumnya, akar
adventif terjadi karena cekaman tertentu, misalnya kadar air tanah yang terlalu tinggi.
Perkembangan akar kedelai sangat dipengaruhi oleh kondisi fisik dan kimia tanah, jenis tanah,
cara pengolahan lahan, kecukupan unsur hara, serta ketersediaan air di dalam tanah.
Pertumbuhan akar tunggang dapat mencapai panjang sekitar 2 m atau lebih pada kondisi yang
optimal, namun demikian, umumnya akar tunggang hanya tumbuh pada kedalaman lapisan
tanah olahan yang tidak terlalu dalam, sekitar 30-50 cm. Sementara akar serabut dapat tumbuh
pada kedalaman tanah sekitar 20-30 cm. Akar serabut ini mula-mula tumbuh di dekat ujung
akar tunggang, sekitar 3-4 hari setelah berkecambah dan akan semakin bertambah banyak
dengan pembentukan akar-akar muda yang lain (Irwan, 2006).
B. Batang dan cabang
Hipokotil pada proses perkecambahan merupakan bagian batang, mulai dari pangkal
akar sampai kotiledon. Hipokotil dan dua keping kotiledon yang masih melekat pada
hipokotil akan menerobos ke permukaan tanah. Bagian batang kecambah yang berada diatas
kotiledon tersebut dinamakan epikotil. Pertumbuhan batang kedelai dibedakan menjadi dua
tipe, yaitu tipe determinate dan indeterminate. Perbedaan sistem pertumbuhan batang ini
didasarkan atas keberadaan bunga pada pucuk batang. Pertumbuhan batang tipe determinate
ditunjukkan dengan batang yang tidak tumbuh lagi pada saat tanaman mulai berbunga.
Sementara pertumbuhan batang tipe indeterminate dicirikan bila pucuk batang tanaman masih
bisa tumbuh daun, walaupun tanaman sudah mulai berbunga. Disamping itu, ada varietas
hasil persilangan yang mempunyai tipe batang mirip keduanya sehingga dikategorikan
sebagai semi-determinate atau semiindeterminate. Jumlah buku pada batang tanaman
dipengaruhi oleh tipe tumbuh batang dan periode panjang penyinaran pada siang hari. Pada
kondisi normal, jumlah buku berkisar 15-30 buah. Jumlah buku batang indeterminate

5
umumnya lebih banyak dibandingkan batang determinate. Cabang akan muncul di batang
tanaman. Jumlah cabang tergantung dari varietas dan kondisi tanah, tetapi ada juga varietas
kedelai yang tidak bercabang. Jumlah batang bisa menjadi sedikit bila penanaman dirapatkan
dari 250.000 tanaman/hektar menjadi 500.000 tanaman/hektar. Jumlah batang tidak
mempunyai hubungan yang signifikan dengan jumlah biji yang diproduksi. Artinya, walaupun
jumlah cabang banyak, belum tentu produksi kedelai juga banyak (Irwan, 2006).
C. Daun
Tanaman kedelai mempunyai dua bentuk daun yang dominan, yaitu stadium kotiledon
yang tumbuh saat tanaman masih berbentuk kecambah dengan dua helai daun tunggal dan
daun bertangkai tiga (trifoliate leaves) yang tumbuh selepas masa pertumbuhan. Umumnya,
bentuk daun kedelai ada dua, yaitu bulat (oval) dan lancip (lanceolate). Kedua bentuk daun
tersebut dipengaruhi oleh faktor genetik. Bentuk daun diperkirakan mempunyai korelasi yang
sangat erat dengan potensi produksi biji. Umumnya, daerah yang mempunyai tingkat
kesuburan tanah tinggi sangat cocok untuk varietas kedelai yang mempunyai bentuk daun
lebar. Daun mempunyai stomata, berjumlah antara 190-320 buah/m2.Umumnya, daun
mempunyai bulu dengan warna cerah dan jumlahnya bervariasi. Panjang bulu bisa mencapai 1
mm dan lebar 0,0025 mm. Kepadatan bulu bervariasi, tergantung varietas, tetapi biasanya
antara 3-20 buah/mm2. Jumlah bulu pada varietas berbulu lebat, dapat mencapai 3-4 kali lipat
dari varietas yang berbulu normal. Contoh varietas yang berbulu lebat yaitu IAC 100,
sedangkan varietas yang berbulu jarang yaitu Wilis, Dieng, Anjasmoro, dan Mahameru.
Lebat-tipisnya bulu pada daun kedelai berkait dengan tingkat toleransi varietas kedelai
terhadap serangan jenis hama tertentu. Hama penggerek polong ternyata sangat jarang
menyerang varietas kedelai yang berbulu lebat. Oleh karena itu, para peneliti pemulia
tanaman kedelai cenderung menekankan pada pembentukan varietas yang tahan hama harus
mempunyai bulu di daun, polong, maupun batang tanaman kedelai (Irwan, 2006).
D. Bunga
Tanaman kacang-kacangan, termasuk tanaman kedelai, mempunyai dua stadium
tumbuh, yaitu stadia vegetatif dan stadia reproduktif. Stadium vegetatif mulai dari tanaman
berkecambah sampai saat berbunga, sedangkan stadia reproduktif mulai dari pembentukan
bunga sampai pemasakan biji. Tanaman kedelai di Indonesia yang mempunyai panjang hari
rata-rata sekitar 12 jam dan suhu udara yang tinggi (>30° C), sebagian besar mulai berbunga
pada umur antara 5-7 minggu. Tanaman kedelai termasuk peka terhadap perbedaan panjang
hari, khususnya saat pembentukan bunga. Bunga kedelai menyerupai kupu-kupu. Tangkai
bunga umumnya tumbuh dari ketiak tangkai daun yang diberi nama rasim. Jumlah bunga pada
setiap ketiak tangkai daun sangat beragam, antara 2-25 bunga, tergantung kondisi lingkungan
6
tumbuh dan varietas kedelai. Bunga pertama yang terbentuk umumnya pada buku kelima,
keenam, atau pada buku yang lebih tinggi. Pembentukan bunga juga dipengaruhi oleh suhu
dan kelembaban. Pada suhu tinggi dan kelembaban rendah, jumlah sinar matahari yang jatuh
pada ketiak tangkai daun lebih banyak. Hal ini akan merangsang pembentukan bunga. Setiap
ketiak tangkai daun yang mempunyai kuncup bunga dan dapat berkembang menjadi polong
disebut sebagai buku subur. Tidak setiap kuncup bunga dapat tumbuh menjadi polong, hanya
berkisar 20-80%. Jumlah bunga yang rontok tidak dapat membentuk polong yang cukup
besar. Rontoknya bunga ini dapat terjadi pada setiap posisi buku pada 1- 10 hari setelah mulai
terbentuk bunga. Periode berbunga pada tanaman kedelai cukup lama yaitu 3-5 minggu untuk
daerah subtropik dan 2-3 minggu di daerah tropik, seperti di Indonesia. Jumlah bunga pada
tipe batang determinate umumnya lebih sedikit dibandingkan pada batang tipe indeterminate.
Warna bunga yang umum pada berbagai varietas kedelai hanya dua, yaitu putih dan ungu
(Irwan, 2006).
E. Polong dan biji
Polong kedelai pertama kali terbentuk sekitar 7-10 hari setelah munculnya bunga
pertama. Panjang polong muda sekitar 1 cm. Jumlah polong yang terbentuk pada setiap ketiak
tangkai daun sangat beragam, antara 1-10 buah dalam setiap kelompok. Pada setiap tanaman,
jumlah polong dapat mencapai lebih dari 50, bahkan ratusan. Kecepatan pembentukan polong
dan pembesaran biji akan semakin cepat setelah proses pembentukan bunga berhenti. Ukuran
dan bentuk polong menjadi maksimal pada saat awal periode pemasakan biji. Hal ini
kemudian diikuti oleh perubahan warna polong, dari hijau menjadi kuning kecoklatan pada
saat masak. Gambar polong kedelai Di dalam polong terdapat biji yang berjumlah 2-3 biji.
Setiap biji kedelai mempunyai ukuran bervariasi, mulai dari kecil (sekitar 7-9 g/100 biji),
sedang (10-13 g/100 biji), dan besar (>13 g/100 biji). Bentuk biji bervariasi, tergantung pada
varietas tanaman, yaitu bulat, agak gepeng, dan bulat telur. Namun demikian, sebagian besar
biji berbentuk bulat telur. Biji kedelai terbagi menjadi dua bagian utama, yaitu kulit biji dan
janin (embrio). Pada kulit biji terdapat bagian yang disebut pusar (hilum) yang berwarna
coklat, hitam, atau putih. Pada ujung hilum terdapat mikrofil, berupa lubang kecil yang
terbentuk pada saat proses pembentukan biji. Warna kulit biji bervariasi, mulai dari kuning,
hijau, coklat, hitam, atau kombinasi campuran dari warna-warna tersebut. Biji kedelai tidak
mengalami masa dormansi sehingga setelah proses pembijian selesai, biji kedelai dapat
langsung ditanam. Namun demikian, biji tersebut harus mempunyai kadar air berkisar 12-
13% (Irwan, 2006).

7
 Gambar 2. Biji Kedelai
Menurut Handbook of Pharmacognosy deskripsi biji kedelai adalah sebagai berikut.
Biji berbentuk bulat telur, dengan panjang sekitar 6-11 mm, lebar sekitar 5-8 mm, dan tebal
antara 4-7 mm. 100 biji kedelai beratnya antara 14,5 sampai 33 mg. Biji kedelai berwarna
kuning pucat atau kekuning-kuningan. Epidermis dari beberapa kulit biji terdiri dari sel-sel
prisma poligon dengan tinggi 45 sampai 60 mikron dan lebar 7 sampai 20 mikron, akibat
penebalan dinding antiklinal selulosa, sedangkan hipodermis berbentuk "bearercells" dengan
tinggi 40 hingga 120 mikron dan lebar 30 hingga 40 mikron di bagian atas dan dasar, serta
18 hingga 30 mikron di bagian tengah. Minyak kacang kedelai berwarna kuning emas, jika
dipanaskan sampai 260oC berubah menjadi pucat; dengan berat jenis 0,922 ke 0,928; nilai
penyabunan 190-195; nilai yodium 130-142; indeks bias 1,4680 pada 40oC (Wallis, 2005)
2.2 Penyiapan Bahan
Proses penyiapan bahan baku simplisia dimulai dari proses pemanenan,
2.2.1.Pengumpulan bahan baku (Pemanenan)
Waktu panen suatu organ tanaman dari suatu jenis tanaman sangat berhubungan erat
dengan pembentukan senyawa bioaktif dalam organ tanaman tersebut. Waktu yang tepat
untuk panen adalah pada saat senyawa bioaktif berada dalam jumlah maksimal pada organ
tanaman yang dikumpulkan. Biji dapat dapat dipanen pada saat mulai mengeringnya buah
atau sebelum semuanya pecah (Tim Penyusun, 2006).
2.2.2.Sortasi basah
Sortasi basah dilakukan untuk membersihkan benda-benda asing dari luar. Seperi
tanah, kerikil, rumput, bagian tanaman lain, bagian lain tanaman, dan bahan yang rusak (Tim
Penyusun, 2006)
2.2.3. Pencucian
Air yang digunakan dapat dari berbagai sumber namun tetap harus memperhatikan
kemungkinan adanya pencemaran (Tim Penyusun, 2006).

8
 Pencucian (sumber Air)

Mata Air Air Sumur Air PAM

Cemaran: Cemaran: Cemaran:

Mikroba Mikroba Kapur
pestisida limbah Klor

Gambar 3. Cemaran yang mungkin pada sumber air.

2.2.4. Pengeringan
Tujuan pengeringan organ tanaman atau tanaman yang dipanen adalah untuk
mendapatkan simplisia yang awet, tidak rusak dan dapat digunakan atau disimpan dalam
jangka waktu relatif lama dengan cara mengurangi kandungan air dan menghentikan reaksi
enzimatik yang mungkin dapat menguraikan senyawa bioaktif dan menurunkan mutu atau
merusak simplisia itu. Air dalam sel dan jaringan tumbuhan yang ada setelah sel atau jaringan
itu mati akan merupakan media pertumbuhan jamur. Demikian pula enzim-enzim tertentu
dalam sel akan menguraikan senyawa bioaktif tertentu, sesaat setelah sel mati dan selama sel
atau organ tersebut masih mengandung jumlah air tertentu yang memungkinkan reaksi
enzimatik berlangsung. Pengeringan dapat dilakukan dengan dua tahap, yaitu pengeringan
alamiah dan pengeringan buatan.
Pengeringan alamiah bergantung dari zat aktif yang dikandung dalam organ tanaman
yang dikeringkan, dapat dilakukan dengan dua cara pengeringan yaitu dengan panas sinar
matahari langsung dan tidak dikenai sinar matahari langsung. Pengeringan dengan sinar
matahari langsung dilakukan untuk mengeringkan organ tanaman yang relatif keras (kayu,
kulit kayu, biji, dan lain-lain) dan mengandung senyawa bioaktif yang relatif stabil.
Pengeringan yang tidak dikenai sinar matahari langsung dilakukan dengan diangin-anginkan
di tempat teduh (bunga) atau ditutup dengan kain hitam (daun, rimpang). Digunakan kain
hitam karena kain hitam dapat menyerap panas bukan sinarnya, sehingga uv terhalang (uv
dapat merusak zat aktif). Pengeringan buatan menggunakan alat yang dapat diatur suhu,
kelembaban, tekanan, dan sirkulasi udaranya. Misalnya oven (Tim Penyusun, 2006).
2.2.5.Sortasi kering
Sortasi setelah pengeringan sebenarnya merupakan tahap akhir penyiapan simplisia.
Tujuan sortasi disini adalah memisahkan benda-benda asing seperti bagian-bagian tanaman

9
yang masih ada dan tertinggal pada simplisia kering. Proses ini dilakukan sebelum simplisia
dibungkus kemudian disimpan (Tim Penyusun, 2006).
2.2.6. Pengepakan dan Penyimpanan
Mutu simplisia akan menjadi turun kalau kondisi penyimpanan tidak diperhatikan.
Tujuan penyimpanan yang baik dari suatu simplia adalah untuk mencegah menurunnya mutu
simplisia dalam masa penyimpanan.
Wadah yang bersih, kedap udara diperlukan untuk simplisia. Kekedapan terhadap
udara luar diperlukan untuk mencegah masuknya kelembaban udara yang tinggi dari luar ke
dalam wadah. Udara tropik dengan kelembaban tinggi memudahkan pertumbuhan jamur.
Wadah dari logam tidak dianjurkan karena dalam beberapa hal berpengaruh terhadap kadar
senyawa aktif. Wadah dari plastik tebal kualitas baik atau dari gelas berwarna gelap relatif
baik. Pengaruh-pengaruh luar yang perlu dicegah antara lain masuknya serangga, sinar
matahari langsung, dan kotoran udara lain.
Ruang penyimpanan simplisia yang telah diwadahi juga perlu diperhatikan. Suhu
rendah, kelembaban relatif rendah, tekanan udara dalam ruang relatif tinggi dari tekanan
udara luar atau sistem sirkulasi udara yang baik, adalah kondisi ruang yang dianjurkan. Di
samping itu perlu juga diatur letak dan susunan wadah di dalam ruang sehingga memudahkan
orang mencari simplisia yang diperlukan. (Tim Penyusun, 2006)
2.3. Prosedur Ekstraksi
Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari
simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua
pelarut diuapkan dan massa serbuk atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga
memenuhi baku yang telah ditetapkan (Depkes RI, 1995). Proses ekstraksi bahan
nabati/bahan obat alami dapat dilakukan berdasarkan teori penyarian. Penyarian merupakan
peristiwa perpindahan massa zat aktif yang semula berada di dalam sel, ditarik oleh cairan
penyari sehingga terjadi larutan aktif dalam cairan penyari tersebut. Terdapat 4 metode
ekstraksi yaitu:
2.3.1. Maserasi
Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara
merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel
dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan karena
adanya perbedan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel,
maka larutan yang terpekat didesak keluar. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi
keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel (Depkes RI, 1986).

10
 Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif yang
mudah larut dalam cairan penyari, tidak mengandung zat yang mudah mengembang dalam
cairan penyari, tidak mengandung benzoin, stirak, dan lain-lain (Depkes RI, 1986).
Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol, atau pelarut lain.
Bila cairan penyari digunakan air maka untuk mencegah timbulnya kapang, dapat
ditambahkan bahan pengawet, yang diberikan pada awal penyarian (Depkes RI, 1986).
Keuntungan cara penyarian dengan maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan
yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Sedangkan kerugian cara maserasi adalah
pengerjaannya lama dan penyariannya kurang sempurna (Depkes RI, 1986).
Maserasi pada umumnya dilakukan dengan cara: 10 bagian simplisia dengan derajat
halus yang cocok dimasukkan ke dalam bejana, kemudian dituangi dengan 75 bagian cairan
penyari, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya, sambil berulang - ulang
diaduk. Setelah 5 hari sari diserkai, ampas diperas. Ampas ditambah cairan penyari
secukupnya diaduk dan diserkai, sehingga diperoleh seluruh sari sebanyak 100 bagian.
Benjana ditutup, dibiarkan ditempat sejuk, terlindung dari cahaya, selama 2 hari. Kemudian
endapan dipisahkan (Depkes RI, 1986).

Gambar 4. Alat maserasi

(Depkes RI, 1986)

2.3.2. Perkolasi
Perkolasi adalah cara penyarian dengan mengalirkan penyari melalui serbuk simplisia
yang telah dibasahi (Depkes RI, 1986).
Prinsip perkolasi adalah sebagai berikut:
Serbuk simplisia ditempatkan dalam suatu bejana silinder, yang dibagian bawahnya
diberi sekat berpori. Cairan penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk tersebut,
cairan penyari akan melarutkan zat aktif sel-sel yang dilalui sampai mencapai keadaan jenuh.

11
Gerak ke bawah disebabkan oleh kekuatan gaya beratnya sendiri dan cairan di atasnya,
dikurangi dengan daya kapiler yang cenderung untuk menahan (Depkes RI, 1986).
Kekuatan yang berperan pada perkolasi antara lain: gaya berat, kekentalan, daya larut,
tegangan permukaan, difusi, osmosis, adhesi, daya kapiler dan daya geseran (friksi). Cara
perkolasi lebih baik dibandingkan dengan cara maserasi karena:
Aliran cairan penyari menyebabkan adanya pergantian larutan yang terjadi dengan
larutan yang konsentrasinya lebih rendah, sehingga meningkatkan derajat perbedaan
konsentrasi. Ruangan diantara butir – butir serbuk simplisia membentuk saluran tempat
mengalir cairan penyari. Karena kecilnya saluran kapiler tersebut, maka kecepatan pelarut
cukup untuk mengurangi lapisan batas, sehingga dapat meningkatkan perbedaan konsentrasi.
(Depkes RI, 1986)
Alat yang digunakan untuk perkolasi disebut perkolator, cairan yang digunakan untuk
menyari disebut cairan penyari atau menstrum, larutan zat aktif yang keluar dari perkolator
disebut sari atau perkolat, sedang sisa setelah dilakukannya penyarian disebut ampas atau sisa
perkolasi (Depkes RI, 1986).

Gambar 5. Alat perkolasi

Kalau tidak dinyatakan lain perkolasi dilakukan dengan membasahi 10 bagian
simplisia atau campuran simplisia dengan derajat halus yang cocok dibasahi dengan 2,5
bagian sampai 5 bagian cairan penyari, lalu dimasukkan ke dalam bejana tertutup sekurang -
kurangnya selama 3 jam. Kemudian massa dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam
perkolator sambil tiap kali ditekan hati - hati. Selanjutnya dituangi dengan cairan penyari
secukupnya sampai cairan mulai menetes dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan
penyari. Kemudian perkolator ditutup dan dibiarkan selama 24 jam. Selanjutnya cairan
dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 ml/menit dan ditambahkan berulang - ulang cairan
penyari berikutnya sehingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia, hingga
jika 500 mg perkolat yang keluar terakhir diuapkan, tidak meninggalkan sisa. Perkolat
kemudian disuling atau diuapkan dengan tekanan rendah pada suhu tidak lebih dari 50 0C
hingga konsistensi yang dikehendaki. Pada pembuatan ekstrak cair 0,8 bagian perkolat
pertama dipisahkan, perkolat selanjutnya diuapkan hingga diperoleh 0,2 bagian yang
12
selanjutnya dicampurkan ke dalam perkolat pertama. Keuntungan metode ini adalah tidak
memerlukan langkah tambahan yaitu sampel padat (marc) telah terpisah dari ekstrak.
Sedangkan kerugiannya adalah kontak antara sampel padat tidak merata atau terbatas
dibandingkan dengan metode refluks, dan pelarut menjadi dingin selama proses perkolasi
sehingga tidak melarutkan komponen secara efisien (Depkes RI, 1986).
2.3.3. Soxhletasi
Soxhletasi merupakan penyarian simplisia secara berkesinambungan, cairan penyari
dipanaskan sehingga menguap, uap cairan penyari terkondensasi menjadi molekul-molekul air
oleh pendingin balik dan turun menyari simplisia dalam klongsong dan selanjutnya masuk
kembali ke dalam labu alas bulat setelah melewati pipa sifon (Depkes RI, 1986).
Alat soxhletasi merupakan penyempurnaan alat ekstraksi, alat tersebut disebut alat
”Soxhlet”. Uap cairan penyari naik ke atas melalui pipa samping, kemudian diembunkan
kembali oleh pendingin tegak. Cairan turun ke labu melalui tabung yang berisi serbuk
simplisia. Cairan penyari sambil turun melarutkan zat aktif serbuk simplisia. Karena adanya
sifon maka setelah cairan mencapai permukaan sifon, seluruh cairan kembali ke labu. Cairan
ini lebih menguntungkan karena uap panas tidak melalui serbuk simplisia, tetapi melalui pipa
samping. Ekstraksi sempurna ditandai bila cairan di sifon tidak berwarna, tidak tampak noda
jika di KLT, atau sirkulasi telah mencapai 20-25 kali. Ekstrak yang diperoleh dikumpulkan
dan dipekatkan (Depkes RI, 1986).
Keuntungan:
• Cairan penyari yang diperlukan lebih sedikit, dan secara langsung dapat diperoleh
hasil yang lebih pekat.
• Serbuk simplisia disari oleh cairan penyari yang murni, sehingga dapat menyari zat
aktif yang lebih banyak.
• Penyarian dapat diteruskan sesuai dengan keperluan, tanpa menambah volume cairan
penyari.
(Depkes RI, 1986)
Kerugian:
• Larutan dipanaskan terus-menerus, sehingga zat aktif yang tidak tahan panas kurang
cocok. Ini dapat diperbaiki dengan menambahkan peralatan untuk mengurangi tekanan
udara.
• Cairan dididihkan terus menerus, sehingga cairan penyari yang baik harus murni atau
campuran azeotrop.
(Depkes RI, 1986)

13
 Gambar 6. Alat soxhletasi

2.3.4. Refluks
Refluks adalah penyarian untuk mendapatkan ekstrak cair yaitu dengan proses
penguapan dengan menggunakan alat refluks. Prinsip kerja refluks yaitu dengan cara cairan
penyari diisikan pada labu, serbuk simplisia diisikan pada tabung dari kertas saring atau
tabung yang berlubang-lubang dari gelas, baja tahan karat atau bahan lainya yang cocok.
Cairan penyari dipanaskan hingga mendidih. Uap penyari akan naik ke atas melalui serbuk
simplisia. Uap penyari mengembun karena didinginkan oleh pendingin balik. Embun turun
melalui serbuk simplisia sambil melarutkan zat aktifnya dan kembali ke labu. Cairan akan
menguap kembali berulang seperti proses di atas (Depkes RI, 1986).
Keuntungan dari metode refluks ini yaitu menggunakan pelarut yang sedikit, hemat
serta ekstrak yang didapat lebih sempurna. Sedangkan kerugian metode ini yaitu uap panas
langsung melalui serbuk simplisia (Depkes RI, 1986).

Gambar 7. Alat refluks

2.4. Metode Pemisahan Bahan Alam

Pada prinsipnya kromatografi merupakan proses pemisahan yang melibatkan beberapa
sifat fisika utama dari molekul yaitu :
14
 • Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan)
• Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi,
penjerapan)
• Kecenderungan molekul untuk menguap (keatsirian)
(Harbone, 1987)
Dalam penggunaan analitik secara kualitatif metode ini bertujuan untuk
mengungkapkan ada tidaknya senyawa tertentu dalam cuplikan. Keuntungan kromatografi
sebagai metode kualitatif yaitu cuplikan senyawa yang diperlukan untuk analisis sangat
sedikit dan waktu analisis pendek. Pemakaian kromatografi secara kuantitatif bertujuan untuk
mengungkapkan banyaknya masing-masing komponen yang terdapat dalam suatu campuran.
Keuntungan metode kuantitatif adalah dapat menganalisis langsung suatu komponen
campuran atau hasil suatu reaksi tanpa harus melakukan fraksinasi terlebih dahulu, sehingga
dapat menjamin ketelitian hasil pemeriksaan (Harbone, 1987).
2.4.1. Kromatografi Kertas (KKt)
Kromatografi kertas dapat digunakan terutama bagi kandungan tumbuhan yang mudah
larut dalam air, yaitu karbohidrat, asam amino, basa asam nukleat, asam organik, dan fenolat.
Untuk pekerjaan penyiapannya kromatografi kertas biasanya pada lembaran kertas saring
yang tebal (Harbone, 1987).
Satu keuntungan utama kromatografi kertas adalah kemudahan dan kesederhanaannya
pada pelaksanaan pemisahan, yaitu hanya pada lembaran kertas saring yang berlaku sebagai
medium pemisahan dan juga sebagai penyangga. Keuntungan lain adalah keterulangan
bilangan Rf yang besar pada kertas sehingga pengukuran Rf merupakan parameter yang
berharga dalam memaparkan senyawa tumbuhan baru (Harbone, 1987).
Kromatografi pada kertas biasanya melibatkan kromatografi pembagian atau
penjerapan. Pada kromatografi pembagian, senyawa terbagi dalam pelarut alkohol yang
sebagian besar tidak bercampur dengan air (misalnya n-butanol). Pengembang
kromatografinya adalah air murni dan dapat digunakan untuk memisahkan purin dan
pirimidin biasa, dan secara umum dapat dipakai juga untuk senyawa fenol dan glikosida
tumbuhan. Pada kromatografi kertas senyawa biasanya dideteksi sebagai bercak berwarna
atau bercak berfluoresensi-UV setelah direaksikan dengan pereaksi kromogenik yang
digunakan sebagai pereaksi semprot atau pereaksi celup (Harbone, 1987).
2.4.2. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
KLT merupakan metode pilihan untuk pemisahan semua kandungan yang larut dalam
lipid, yaitu lipid, steroid, karotenoid, kuinon sederhana, dan klorofil. Untuk pekerjaan
penyiapannya KLT biasanya dilakukan pada lapisan penjerap yang tebal. Bila KLT
15
dibandingkan dengan KKt (Kromatografi Kertas), kelebihan KLT adalah keserbagunaan,
kecepatan, dan kepekaannya. Keserbagunaan KLT disebabkan oleh kenyataan bahwa
disamping selulosa, sejumlah penjerap yang berbeda-beda dapat disaputkan pada pelat kaca
atau penyangga lain yang digunakan untuk kromatografi. Kecepatan KLT yang lebih besar
disebabkan oleh sifat penjerap yang lebih pada bila disaputkan pada pelat dan merupakan
keuntungan bila kita menelaah senyawa labil. Kepekaan KLT sedemikian rupa sehingga bila
diperlukan dapat dipisahkan dari bahan yang jumlahnya lebih sedikit dari ukuran µg
(Harbone, 1987).
Satu kekurangan KLT adalah kerja penyaputan pelat kaca dengan penjerap. Kerja ini
kemudian agak diringankan dengan adanya penyaput otomatis (Harbone, 1987).
Pelarut yang digunakan pada KLT lebih banyak dibandingkan pada KKt, dan pada
umumnya terdapat ruang gerak yang lebih leluasa dalam perbandingan pelarut yang
digunakan dalam bidang pengembang. Untuk mengukur Rf pada KLT dengan seksama dapat
membakukan kondisi, tetapi hal itu merupakan suatu proses yang memakan waktu. Biasanya
dilakukan dengan cara pengembangan naik di dalam suatu bejana yang dindingnya dilapisi
kertas saring sehingga atmosfer di dalam bejana jenuh dengan fase pelarut (Harbone, 1987).
Deteksi senyawa pada pelat KLT biasanya dilakukan dengan penyemprotan dan
karena permukaan pelat lebih sempit (20 × 20 cm). maka penyemprotannya merupakan
prosedur yang nisbi sederhana. Satu keuntungannya bila dibandingkan dengan KKt adalah
pelat kaca dapat disemprot dengan asam sulfat pekat, yaitu pereaksi pendeteksi steroid dan
lipid yang berguna (Harbone, 1987).
2.4.3. Kromatografi Gas Cair (KGC)
Penggunaan utama KGC adalah pada pemisahan senyawa atsiri, yaitu asam lemak,
mono dan sesquiterpen, hidrokarbon, dan senyawa belerang. Tetapi keatsirian kandungan
tumbuhan yang bertitik didih tinggi dapat diperbesar dengan mengubahnya menjadi ester atau
eter trimetilsilil, sehingga hanya ada sedikit saja golongan yang sama sekali tidak cocok
dipisahkan dengan cara KGC (Harbone, 1987).
Komponen yang diperlukan untuk KCG sangat canggih dan mahal dibandingkan
dengan komponen untuk KLT ataupun KKt. Tetapi pada prisipnya KGC tidaklah lebih rumit
dari prosedur kromatografi yang lain. Komponen KGC memiliki empat bagian utama yaitu:
• Kolom berupa pipa kecil yang panjang yang dikemas dengan fase diam yang melekat
pada serbuk lebam. Disini fase diam disaputkan sebagai film pada permukaan kolom
bagian dalam.

16
 • Pemanas digunakan untuk memanaskan kolom secara meningkat. Suhu di tempat
masuk ke kolom dikendalikan terpisah sehingga cuplikan dapat diuapkan dengan cepat
ketika diteruskan ke kolom.
• Aliran Gas terdiri atas gas pembawa yang lembam seperti nitrogen dan argon.
Pemisahan senyawa dalam kolom bergantung pada pengaliran gas ini melalui kolom
dengan laju aliran yang terkendali.
• Detektor diperlukan untuk mengukur senyawa ketika senyawa itu dialirkan melalui
kolom. Pendeteksian didasarkan pengionan nyala atau penangkap elektron. Detektor
dihubungkan dengan perekam potensiometri yang memberikan hasil pemisahan
berupa serangkaian puncak yang berbeda-beda kekuatannya. (Harbone, 1987)
Hasil KGC dapat dinyatakan dengan Volume Retensi RV (volume gas pembawa yang
diperlukan untuk mengelusi suatu komponen dari kolom) atau dengan waktu retensi R t (waktu
yang diperlukan untuk mengelusi komponen dari kolom) (Harbone, 1987).
Perubah utama dalam KGC adalah sifat fase diam dalam kolom dan suhu kerja.
Keduanya diubah-ubah menurut kepolaran dan keatsirian senyawa yang dipisahkan. KGC
memberikan data kuantitatif maupun kualitatif senyawa tumbuhan karena luas daerah
dibawah puncak yang ditunjukkan pada kromatogram berbanding lurus dengan konsentrasi
masing-masing komponen yang berbeda yang terdapat dalam campuran asal (Harbone, 1987).

Gambar 8. Grafik Kromatografi Gas Cair

Keterangan gambar: Kromatogram gas cair pemisahan campuran sterol asetat yang terdapat
dalam biji gandum ( Avena sativa ). Keterangan: (1) kolestrol, (2) brasikasterol, (3)
kampesterol, (4) stigmasterol, (5) sitosterol, (6) Δ5 avenasterol, (7) Δ7 avenasterol. Fase diam
sikloheksandimetanol suksinat 1% + polivinil pirolidon 2% pada gas krom P 255 yang telah
dicuci dengan asam (Harbone, 1987).
2.4.4. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
KCKT dapat memisahkan kandungan yang keatsiriannya kecil. KCKT adalah suatu
metode yang menggabungkan koefisiennya kolom dan kecepatan analisis. KCKT dapat
17
disamakan dengan KGC dalam hal kepekaan dan kemampuannya menghasilkan data
kualitatif dan kuantitatif dengan sekali kerja saja. Perbedaannya adalah fase diam yang terikat
pada polimer berpori terdapat pada kolom baja tahan karat yang bergaris tengah kecil, dan
fase gerak cair mengalir akibat tekanan yang besar. Alat KCKT lebih mahal daripada KGC,
terutama karena diperlukan sistem pompa yang cocok serta semua sambungan harus diskrup
agar dapat menahan tekanan. Fase geraknya adalah campuran pelarut yang dapat bercampur.
Campuran ini dapat tetap susunannya atau dapat diubah perbandingannya secara
kesinambungan dengan menambahkan ruang pencampur kepada susunan alat (elusi landaian)
(Harbone, 1987).
Senyawa dipantau ketika keluar dari kolom dengan menggunakan pendeteksi,
biasanya dengan mengukur spektrum serapan UV. Kolom yang biasanya dikemas dengan
partikel bulat kecil yang terbuat dari silika yang berlapiskan atau berkaitan dengan fase diam,
terutama peka terhadap cemaran. KCKT digunakan terutama untuk senyawa tak atsiri,
misalnya terpenoid tinggi, segala jenis senyawa fenol, alkaloid, lipid, dan gula. KCKT paling
baik untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spektrum UV atau di daerah sinar tampak
(Harbone, 1987).
2.4.5. Spektrofotodensitometri
Prinsip dasar pengukuran kadar suatu senyawa dengan sistem spektrofotodensitometri
adalah mengukur serapan atau fluorosensi dari analit yang menyerap sinar UV. Pada mode
serapan (absorbsi), yang diukur adalah banyaknya REM yang diabsorsi atau diserap oleh
kromofor suatu senyawa. Sedangkan untuk mode fluorosensi yang diukur adalah energi yang
dilepas setelah kromofor tersebut diberikan bereksitasi. Setelah diberikan energi REM
berlebih, senyawa akan tereksitasi. Namun, pada kondisi tersebut, elektron berada pada
kondisi yang kurang stabil. Elektron akan cenderung menempati posisi yang lebih stabil,
sehingga terjadi relaksasi. Saat terjadi eksitasi, elektron melepaskan sejumlah tertentu energi
misalnya berupa dalam bentuk cahaya. Peristiwa ini disebut dengan fluorosensi (Gandjar,
2007).
Penentuan kadar masing-masing senyawa dapat dilakukan dengan cara analisis
multikomponen menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis, atau dilakukan dengan
metode kromatografi, baik KLT maupun KCKT. Analisis kuantitatif dari suatu senyawa yang
telah dipisahkan dengan KLT biasanya dilakukan dengan densitometer langsung pada
lempeng KLT (secara in situ), yang mana densitometer dapat bekerja secara serapan maupun
fluoresensi (Gandjar, 2007).
Evaluasi visual kromatogram sebelum derivatisasi hanya mampu memberikan hasil
kualitatif sedangkan evaluasi optikal secara langsung (insitu) pada plat menggunakan suatu
18
instrumen dapat memberikan hasil kualitatif dan hasil kuantitatif. Alat optis yang dapat
digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif ini adalah spektrofotodensitometer atau
sering disebut dengan TLC Scaner. Spektrofotodensitometer digunakan dengan
menghubungkan pada suatu perangkat komputer (PC) yang dikendalikan dengan suatu
program evaluasi. PC akan menampilkan hasil kalkulasi, protokol pendukung, menyediakan
data dari semua parameter dari peralatan dan program evaluasi serta data hasil yang berupa
angka dan grafik (Deinstrop, 2007).

Gambar 9. TLC Scanner

Menurut Settel (1997) prinsip kerja spektrofotodensitometri berdasarkan interaksi

antara radiasi elektromagnetik dari sinar UV-Vis dengan analit yang merupakan noda pada
plat. Untuk evaluasi bercak hasil KLT secara densitometri, bercak di-scanning dengan sumber
sinar dalam bentuk celah (slit) yang dapat dipilih baik panjangnya maupun lebarnya. Sinar
yang dipantulkan diukur dengan sensor cahaya (fotosensor). Perbedaan antara sinyal optik
daerah yang tidak mengandung bercak dengan daerah yang mengandung bercak dihubungkan
dengan banyaknya analit yang ada melalui kurva kalibrasi yang telah disiapkan dalam
lempeng yang sama. Pengukuran densitometri dapat dibuat dengan absorbansi atau dengan
fluoresensi.
Kebanyakan pengukuran kromatogram lapis tipis dilakukan dengan cara absorbansi.
Kisaran ultraviolet rendah (di bawah 190 nm sampai 300 nm) merupakan daerah yang paling
berguna (Settel, 1997).

19
 Gambar 10. Komponen Spektrofotodensitometer

Karena adanya penghamburan sinar oleh partikel-partikel yang ada di lempeng, maka
suatu persamaan matematis yang sederhana dan terdefinisi dengan baik yang menyatakan
hubungan antara sinyal sinar dan banyaknya (konsentrasi) senyawa dalam lapisan lapis tipis
tidak pernah dijumpai. Sebagai akibatnya hubungan ini tidak bersifat linier. Meskipun
demikian, karena saat ini tersedia perangkat lunak (software) ataupun integrator yang dapat
menangani hubungan yang tidak linier, maka tidak diperlukan untuk melinierkan hubungan
antara konsentrasi dan respon optis (Settel, 1997).
Untuk scanning dengan fluororesensi, intensitas sinar yang diukur berbanding
langsung dengan banyaknya analit (senyawa) yang berfluororesensi lebih sensitif dibanding
dengan pengukuran absorbansi dan fungsi kalibrasi seringkali linier pada kisaran konsentrasi
yang agak luas. Karena alasan-alasan ini, senyawa-senyawa yang bersifat fluororesensi secara
inhiren selalu di-scan dengan fluororesensi. Untuk senyawa-senyawa yang tidak
berfluororesensi, maka senyawa tersebut dapat diperlakukan dengan cara mereaksikannya
dengan reagen tertentu hingga dihasilkan senyawa yang berfluororesensi (Settel, 1997).
Sumber radiasi pada spektrofotodensitometri ada tiga macam tergantung pada rentang
panjang gelombang dan prinsip penentuan. Lampu deuterium dipakai untuk pengukuran pada
daerah ultraviolet (190-400 nm) dan lampu tungsten digunakan untuk pengukuran pada
daerah sinar tampak (400-800 nm) sedangkan untuk penentuan secara flouresensi digunakan
lampu busur merkuri bertekanan tinggi (Deinstrop, 2007).

20
2.5 Skrining Fitokimia
2.5.1. Cara Identifikasi Alkaloid
A.Reaksi pengendapan
Larutan percobaan untuk pengendapan alkaloid dibagi dalam 4 golongan sebagai
berikut:
Golongan I : Larutan percobaan dengan alkaloid membentuk garam yang tidak larut: Asam
silikowolframat LP, Asam fosfomolibdat LP, dan asam fosfowolframat LP.
Golongan II : Larutan percobaan yang dengan alkaloid membentuk senyawa kompleks
bebas,
kemudian membentuk endapan: Bourchardat LP dan Wagner LP.
Golongan III : Larutan percobaan yang dengan alkaloid membentuk senyawa adisi yang
tidak
larut: Mayer LP, Dragendroff LP, dan Marme LP.
Golongan IV : Larutan percobaan yang dengan alkaloid membentuk ikatan asam organik
dengan alkohol: Harger LP.
(Depkes RI, 1980)
Cara percobaan:
Timbang 500 mg serbuk simplisia, tambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air,
panaskan di atas penangas air selama 2 menit, dinginkan dan saring. Pindahkan 3 tetes filtrat
pada kaca arloji, tambahkan 2 tetes Bouchardat LP. Jika pada kedua percobaan tidak terjadi
endapan, maka serbuk tidak mengandung alkaloid. Jika dengan Mayer LP terbentuk endapan
menggumpal berwarna putih atau kuning yang larut dalam methanol P dan dengan
Bouchardat LP terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam, maka kemungkinan terdapat
alkaloid. Lanjutkan percobaan dengan mengocok sisa filtrat dengan 3 ml ammonia pekat P
dan 10 ml campuran 3 bagian volume eter P dan 1 bagian volume kloroform P. Ambil fase
organik, tambahkan natrium sulfat anhidrat P, saring. Uapkan filtrat diatas penangas air,
larutkan sisa dalam sedikit asam klorida 2 N.
Lakukan percobaan dengan keempat golongan larutan percobaan, serbuk mengandung
alkaloid jika sekurang-kurangnya terbentuk endapan dengan menggunakan dua golongan
larutan percobaan yang digunakan.
(Depkes RI, 1980)

21
 B. Reaksi Warna
Cara percobaan:
Lakukan penyarian dengan campuran eter-kloroform seperti pada cara reaksi
pengendapan. Pindahkan beberapa ml filtrat pada cawan porselin, uapkan.
Pada sisa tambahkan 1 sampai 3 tetes larutan percobaan seperti yang tertera pada masing-
masing monografi. Larutan percobaan, asam sulfat P, asam nitrat P, Frohde LP, dan Erdman
LP.
(Depkes RI, 1980)
2.5.2.Cara Identifikasi Glikosida
A. Larutan percobaan
Sari 3 g serbuk simplisia dengan 30 ml campuran 7 bagian volume etanol (95%) P dan
3 bagian volume air dalam alat pendingin alir balik selama 10 menit, dinginkan, saring. Pada
20 ml filtrat tambahkan 25 ml air dan 25 ml timbal (II) asetat 0,4 M, kocok, diamkan selama 5
menit, saring. Sari filtrat 3 kali, tiap kali dengan 20 ml campuran 3 bagian volume kloroform
P dan 2 bagian volume isopropanol P. Pada kumpulan sari tambahkan natrium sulfat anhidrat
P, saring, dan uapkan pada suhu tidak lebih dari 50oC. Larutkan sisa dengan 2 ml methanol P
(Depker RI, 1980).
B. Percobaan umum terhadap glikosida
Cara percobaan:
Uapkan 0,1 ml larutan percobaan di atas penangas air, larutkan sisa dalam 5 ml asam
asetat anhidrat P. Tambahkan 10 tetes asam sulfat P; terjadi warna biru atau hijau,
menunjukkan adanya glikosida (reaksi Liebermann Burchard).
Masukkan 0,1 ml larutan percobaan dalam tabung reaksi, uapkan di atas penangas air.
Pada sisa tambahkan 2 ml air dan 5 tetes Molish LP. Tambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat P;
terbentuk cincin berwarna ungu pada batas cairan, menunjukkan adanya ikatan gula (reaksi
Molish). (Depkes RI, 1980)
C. Kromatografi Lapis Tipis
Sari 300 mg serbuk simpllisia dengan 5 ml methanol P, saring, pada 2 titik masing-
masing 20 ml fitrat pada lempeng KLT setebal 0,25 mm. Elusi dengan campuran benzen P-
etanol (95%) P (70+30) dengan jarak rambat 15 cm. Semprot kromatogram pertama dengan
anisaldehida-asam sulfat LP, panaskan pada suhu 110oC selama 10 menit, amati dengan sinar
biasa dan sinar ultraviolet 366 nm. Pada kromatogram tampak bercak berwarna biru. Semprot
kromatogram kedua dengan asam perklorat P, panaskan pada suhu 110oC selama 10 menit,

22
amati dengan sinar biasa dan sinar ultraviolet 366 nm, bercak tidak berflourosensi (Depkes
RI, 1980).
D. Percobaan terhadap glikosida antrakinon
Cara percobaan.
Campur 200 mg serbuk simplisia dengan 5 ml asam sulfat 2 N, panaskan sebentar,
dinginkan. Tambahkan 10 ml benzen P, kocok, diamkan. Pisahkan lapisan benzen, saring;
filtrat berwarna kuning, menunjukkan adanya antrakinon. Kocok lapisan benzen dengan 1 ml
sampai 2 ml natrium hidroksida 2 N, diamkan; lapisan air berwarna merah intensif dan
lapisan benzen tidak berwarna (Depkes RI, 1980).
2.5.3. Cara Identifikasi Saponin
A. Pembuihan
Cara percobaan.
Masukkan 0,5 g serbuk yang diperiksa ke dalam tabung reaksi, tambahkan 10 ml air
panas, dinginkan dan kemudian kocok kuat-kuat selama 10 detik. (Jika zat yang diperiksa
berupa sediaan cair, encerkan 1 ml sediaan yang diperiksa dengan 10 ml air dan kocok kuat-
kuat selama 10 menit); terbentuk buih yang mantap selama tidak kurang dari 10 menit,
setinggi 1 cm sampai 10 cm. Pada penambahan 1 tetes asam klorida 2 N, buih tidak hilang
(Depkes RI, 1980).
B. Haemolisa
Larutan dapar fosfat PH 7,4. Larutkan 16,0 g natrium fosfat P yang telah dikeringkan
pada suhu 130oC hingga bobot tetap dan 4,4 g natrium dihidrogen fosfat P dalam 1.000 ml air.
Untuk menambahkan stabilitas tambahkan 0,1 g natrium fluoride P (Depkes RI, 1980).
Suspensi darah. Masukkan 10 ml larutan natrium sitrat P 3,65 % b/v ke dalam labu
takar bersumbat kaca 100 ml. Tambahkan darah sapi segar secukupnya hingga 100 ml,
campur baik-baik hingga homogen. (larutan stabil selama 7 hari jika disimpan dalam lemari
pendingin). Pipet 2 ml larutan diatas ke dalam labu takar bersumbat kaca 100 ml, tambahkan
larutan dapar fosfat pH 7,4 secukupnya hingga 100 ml, campur baik-baik. Larutan dapat
dipergunakan jika larutan jernih dan jika terjadi endapan, endapan tidak berwarna ungu
(Depkes RI, 1980).
Cara percobaan :
Campur 0,5 g serbuk yang diperiksa atau sisa kering 5 ml sediaan berbentuk cair,
dengan 50 ml larutan dapar fosfat pH 7,4, panaskan sebentar, dinginkan, saring. Ambil 1 ml
filtrat, campur dengan 1 ml suspensi darah. Untuk serbuk yang mengandung tannin, encerkan
0,2 ml filtrat dengan 0,8 ml larutan dapat fosfat pH 7,4, campur dengan 1 ml suspensi darah.

23
Diamkan selama 30 menit, terjadi haemolisa total, menunjukkan adanya saponin (Depkes RI,
1980).

2.5.4. Cara Identifikasi Flavonoid

A. Larutan percobaan
Sari 0,5 g serbuk yang diperiksa atau sisa kering 10 ml sediaan berbentuk cairan,
dengan 10 ml methanol P, menggunakan alat pendingin balik selama 10 menit. Saring panas
melalui kertas saring kecil berlipat. Encerkan filtrat dengan 10 ml air. Setelah dingin
tambahkan 5 ml eter minyak tanah P, kocok hati-hati, diamkan. Ambil lapisan metanol,
uapkan pada suhu 40oC di bawah tekanan. Sisa dilarutkan dalam 5 ml etil asetat P, saring
(Depkes RI, 1980).
B. Cara percobaan :
Uapkan hingga kering 1 ml larutan percobaan, sisa dilarutkan dalam 1 ml sampai 2 ml
etanol (95%) P; tambahkan, 5 g serbuk seng P dan 2 ml asam klorida 2 N, diamkan selama 1
menit. Tambahkan 10 tetes asam klorida pekat P, jika dalam waktu 2 sampai 5 menit terjadi
warna merah intensif, menunjukkan adanya flavonoid (glikosida-3-flavonol). Uapkan hingga
kering 1 ml larutan percobaan, sisa dilarutkan dalam 1 ml etanol (95%) P, tambahkan 0,1 g
serbuk magnesium P dan 10 tetes asam klorida pekat P, jika terjadi warna merah jingga
sampai merah ungu, menunjukkan adanya flavon, kalkon dan auron. Uapkan hingga kering 1
ml larutan percobaan, basahkan sisa dengan aseton P, tambahkan sedikit serbuk halus asam
borat P dan serbuk halus asam oksalat P, panaskan hati – hati di atas penangas air dan hindari
pemanasan yang berlebihan. Campur sisa yang diperoleh dengan 10 ml eter P. Amati dengan
sinar ultraviolet 366 nm; larutan berflurorensensi kuning intensif, menunjukkan adanya
flavonoid (Depkes RI, 1980).
2.6. Standarisasi Ekstrak
2.6.1. Kadar abu
Prosedur penetapan kadar abu yaitu lebih kurang 2 g sampai 3 g zat yang telah digerus
dan ditimbang seksama, masukkan ke dalam krus platina atau krus silikat yang telah
dipijarkan dan ditara, ratakan. Pijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, dinginkan,
timbang. Jika dengan cara ini arang tidak dapat dihilangkan, tambahkan air panas, saring
melalui kertas saring bebas abu. Pijarkan sisa dan kertas saring dalam krus yang sama.
Masukkan filtrat ke dalam krus, uapkan, pijarkan hingga bobot tetap, timbang. Hitung kadar
abu terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Depkes RI, 1980).
Kadar abu yang tidak larut dalam asam

24
 Prosedur: Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu, didihkan dengan 25 ml asam
klorida encer P selama 5 menit, kumpulkan bagian yang tidak larut dalam asam. Saring
melalui krus kaca masir atau kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas, pijarkan hingga
bobot tetap, timbang. Hitung kadar abu yang tidak larut dalam asam terhadap bahan yang
telah dikeringkan di udara (Depkes RI, 1980).
2.6.2. Kadar sari yang larut dalam air
Prosedur: Keringkan serbuk (4/18) di udara, maserasi selama 24 jam 5,0 g serbuk
dengan 100 ml air kloroform P, menggunakan labu bersumbat sambil berkali-kali dikocok
selama 6 jam pertama dan kemudian dibiarkan selama 18 jam. Saring, uapkan 20 ml filtrat
hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara, panaskan sisa pada suhu
1050C hingga bobot tetap. Hitung kadar dalam persen sari yang larut dalam air, dihitung
terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Depkes RI, 1980).
2.6.3. Kadar sari yang larut dalam etanol
Keringkan serbuk (4/18) di udara, maserasi selama 24 jam 5,0 g serbuk dengan 100 ml
etanol (95%), menggunakan labu bersumbat sambil berkali-kali dikocok selma 6 jam pertama
dan kemudian dibiarkan selama 18 jam. Saring cepat dengan menghindarkan penguapan
etanol (95%), uapkan 20 ml filtrat hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang
telah ditara, panaskan sisa pada suhu 1050C hingga bobot tetap. Hitung kadar dalam persen
sari yang larut dalam etanol (95%), dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara
(Depkes RI, 1980).
2.6.4. Bahan organik asing
Cara penetapan :
Timbang antara 25 g dan 500 g simplisia, ratakan. Pisahkan sesempurna mungkin
bahan organik asing, timbang dan tetapkan jumlahnya dalam persen terhadap simplisia yang
digunakan. Makin kasar simplisia yang diperiksa makin banyak jumlah simplisia yang
ditimbang (Depkes RI, 1980).
2.6.5. Kadar Air
A. Cara Titrasi
Pereaksi dan larutan yang digunakan peka terhadap air, hingga harus dilindungi dari
pengaruh kelembaban udara (Depkes RI, 1980).
Pereaksi Karl Fischer disimpan dalam botol yang diperlengkapi dengan buret
otomatik. Untuk melindungi dari pengaruh kelembaban udara, buret dilengkapi dengan
tabung pengering. Labu titrasi kapasitas lebih kurang 60 ml, dilengkapi dengan 2 elektroda
platina, sebuah pipa pengalir nitrogen, sebuah sumbat berlubang untuk ujung buret dan
sebuah tabung pengering. Zat yang diperiksa dimasukkan ke dalam labu melalui pipa pengalir
25
nitrogen atau melalui pipa samping yang dapat disumbat. Pengadukan dilakukan dengan
mengalirkan gas nitrogen yang telah dikeringkan atau dengan pengaduk magnit. Penunjuk
titik akhir terdiri dari batere kering 1,5 volt atau 2 volt yang dihubungkan dengan tahanan
variabel lebih kurang 2.000 ohm. Tahanan diatur sedemikian rupa sehingga arus utama yang
cocok yang melalui elektroda platina berhubungan secara seri dengan mikroammeter (Depkes
RI, 1980).
Setelah setiap kali penambahan pereaksi Karl Fischer, penunjuk mikroammeter
menyimpang akan tetapi segera kembali ke kedudukan semula. Pada titik akhir,
penyimpangan akan tetap selama waktu yang lebih lama (Depkes RI, 1980).
Untuk zat-zat yang melepaskan air secara perlahan-lahan, maka pada umumnya
dilakukan titrasi tidak langsung. Kecuali dinyatakan lain dalam monografi maka penetapan
kadar air dilakukan dengan titrasi langsung (Depkes RI, 1980).
Cara Penetapan:
Titrasi langsung
Kecuali dinyatakan lain, masukkan lebih kurang 20 ml methanol P ke dalam labu
titrasi. Titrasi dengan pereaksi Karl Fischer hingga titik akhir tercapai. Masukkan dengan
cepat sejumlah zat yang ditimbang saksama yang diperkirakan mengandung 10 mg sampai 50
mg air, ke dalam labu titrasi, aduk selama 1 menit. Titrasi dengan pereaksi Karl Fischer yang
telah diketahui kesetaraan airnya. Hitung jumlah air dalam mg dengan rumus :
VxF
V adalah volume dalam ml pereaksi Karl Fischer pada titrasi kedua, F adalah faktor
kesetaraan air (Depkes RI, 1980).
Titrasi tidak langsung
Masukkan lebih kurang 20 ml metanol P ke dalam labu titrasi. Titrasi dengan pereaksi
Karl Fischer hingga titik akhir tercapai. Masukkan dengan cepat sejumlah zat yang ditimbang
saksama yang diperkirakan mengandung 10 mg sampai 50 mg air, campur. Tambahkan
pereaksi Karl Fischer berlebihan dan yang diukur saksama, biarkan selama beberapa waktu
hingga reaksi sempurna. Titrasi kelebihan pereaksi dengan larutan baku air-metanol. Hitung
jumlah dalam mg air dengan rumus :
FV1-aV2
F adalah faktor kesetaraan air pereaksi Karl Fischer, V1 adalah volume dalam ml
pereaksi Karl Fischer yang diukur saksama, a adalah kadar cair dalam mg tiap ml dari larutan
baku air-metanol dan V2 adalah volume dalam ml larutan baku air-metanol (Depkes RI, 1980).
Pereaksi
Pereaksi Karl Fischer
26
 Larutkan 60 g yodium P dalam 100 ml piridina mutlak P, dinginkan dalam es, alirkan
belerang dioksida P hingga bobot bertambah 32,3 g sambil dilindungi dari pengaruh
kelembaban udara. Tambahkan metanol mutlak P secukupnya hingga 500 ml, biarkan selama
24 jam. Lakukan pembakuan sebagai berikut:
Masukkan lebih kurang 20 ml metanol mutlak P ke dalam labu titrasi. Titrasi dengan
pereaksi Karl Fischer tanpa mencatat volume yang digunakan. Masukkan air yang ditimbang
saksama sejumlah yang cocok. Titrasi dengan pereaksi Karl Fischer. Hitung kesetaraan air
dalam mg tiap ml pereaksi. Pereaksi Karl Fischer harus dibakukan segera sebelum digunakan.
Peraksi Karl Fischer harus disimpan di lemari yang dingin pada suhu antara 20-80C, terlindung
dari cahaya. 1 ml pereaksi Karl Fischer segar setara dengan lebih kurang 5 mg air (Depkes RI,
1980).
Larutan baku air metanol
Encerkan 2 ml air dengan metanol P secukupnya hingga 1.000,0 ml. Titrasi 25,0 ml
larutan dengan pereaksi Karl Fischer. Hitung kadar air dalam mg tiap ml dengan rumus
(VF/25). V adalah volume dalam ml pereaksi Karl Fischer, F adalah faktor kesetaraan air
(Depkes RI, 1980).
B. Cara Destilasi
Alat
Sebuah labu 500-ml (A) dihubungkan dengan pendingin alir balik (C) dengan
pertolongan alat penampung (B). Tabung penerima 5 ml (E), berskala 0,1 ml. Pemanas yang
digunakan sebaiknya pemanas listrik yang suhunya dapat diatur atau tangas minyak. Bagian
atas labu tabung penyambung (D) sebaiknya dibungkus dengan asbes (Depkes RI, 1980)

Gambar 11. Alat Destilasi

Pereaksi

27
 Toluen. Sejumlah toluen P, kocok dengan sedikit air, biarkan memisah, buang lapisan
air suling (Depkes RI, 1980).

Cara Penetapan
Bersihkan tabung penerima dan pendingin dengan asam pencuci, bilasi dengan air,
keringkan dalam lemari pengering. Ke dalam labu kering masukkan sejumlah zat yang
ditimbang saksama yang diperkirakan mengandung 2 ml sampai 4 ml air. Jika zat berupa
pasta, timbang dalam sehelai lembaran logam dengan ukuran yang sesuai dengan leher labu.
Untuk zat yang dapat menyebabkan gejolak mendadak, tambahkan pasir kering yang telah
dicuci secukupnya hingga mencukupi dasar labu atau sejumlah tabung kapiler, panjang lebih
kurang 100 mm yang salah satu ujungnya tertutup. Masukkan lebih kurang 200 ml toluen ke
dalam labu, hubungkan dengan alat. Tuang toluen ke dalam tabung penerima melalui alat
pendingin. Panaskan labu hati-hati selama 15 menit (Depkes RI, 1980).
Setelah toluen mulai mendidih, suling dengan kecepatan lebih kurang 2 tetes tiap
detik, hingga sebagian besar air tersuling, kemudian naikkan kecepatan hingga 4 tetes tiap
detik. Setelah semua air tersuling, cuci bagian dalam pendingin dengan toluen sambil
dibersihkan dengan sikat tabung yang disambungkan pada sebuah kawat tembaga dan lebih
dibasahi dengan toluen. Lanjutkan penyulingan selama 5 menit. Biarkan tabung penerima
pendingin hingga suhu kamar. Jika ada tetes air yang melekat pada pendingin tabung
penerima, hosok dengan karet yang diikatkan pada sebuah kawat tembaga dan basahi dengan
toluen hingga tetesan air turun. Setelah air dan toluen memisah sempurna, baca volume air.
Hitung kadar air dalam %. (Depkes RI, 1980).
2.6.6.Penetapan Susut Pengeringan
Berdasarkan Materia Medika Indonesia, susut pengeringan adalah kadar bagian yang
menguap suatu zat. Kecuali dinyatakan lain, suhu penetapan adalah 105oC dan susut
pengeringan ditetapkan sebagai berikut: Timbang saksama 1 g dan 2 g zat dalam bobot
timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu penetapan selama 30
menit dan telah ditara. Jika zat berupa hablur besar, sebelum ditimbang digerus dengan cepat
hingga ukuran butiran lebih kurang 2 mm. Ratakan zat dalam botol timbang dengan
menggoyangkan botol, hingga merupakan lapisan setebal lebih kurang 5 mm sampai 10 mm,
masukkan ke dalam ruang pengering, buka tutupnya, keringkan pada suhu penetapan hingga
bobot tetap. Sebelum setiap pengeringan, biarkan botol dalam keadaan tertutup mendingin
dalam desikator hingga suhu kamar. Jika suhu lebur zat lebih rendah dari suhu penetapan,
pengeringan dilakukan pada suhu antara 5o dan 10oC dibawah suhu leburnya selama 1 jam

28
sampai 2 jam, kemudian pada suhu penetapan selama waktu yang ditentukan atau hingga
bobot tetap (Depkes RI, 1980).

29
2.7 Metode Ekstraksi
Sekitar 10 g serbuk biji kedelai dimaserasi dengan metanol teknis sebanyak 75
mL. Ekstrak yang diperoleh kemudian disaring dan diuapka sampai diperoleh ekstrak kental
metanol. Ekstrak ini kemudian dihidrolisis dengan HCl 2N selama 30 menit. Hasil hidrolisis
diekstraksi dengan n-heksana. Ekstrak yang bercampur dengan n-heksana yang diperoleh
duapkan sehingga diperoleh ekstrak kental (Asih, 2009).
2.8 Metode Pemisahan
Fase diam yang digunakan pada kromatografi kolom adalah silika gel, sedangkan fase
geraknya fase gerak n-heksana : kloroform : etil asetat (9:1:0,5). Kolom yang digunakan
sepanjang 25 cm, dengan diameter kurang lebih 2 cm. Silika gel 60 (70-100) mesh kering
terlebih dahulu dimasukkan ke dalam kolom hingga tinggi 25 cm, kemudian dipanaskan
dalam oven pada suhu 1100 C, kemudian ditambahkan sedikit fase geraknya sehingga menjadi
bubur. Pelarut (fase gerak yang digunakan) dimasukkan ke dalam kolom sampai hampir
penuh dan keadaan kran kolom tertutup. Setelah itu kecepatan aliran kolom diatur dan bubur
dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam kolom sampai keseluruhan bubur masuk ke dalam
kolom. Setelah bubur masuk, fase diam ini dielusi hingga homogen (kolom didiamkan selama
1 hari sehingga diperoleh pemampatan yang sempurna). Sementara itu sampel dilarutkan
dalam pelarut, kemudian sampel dimasukkan dengan hati-hati melalui dinding kolom dan
aliran fase gerak diatur. Begitu sampel masuk ke dalam fase diam, fase gerak ditambahkan
secara kontinyu sampai terjadi pemisahan. Eluat ditampung pada botol penampung fraksi
setiap 3 mL dan diuapkan sampai terbentuk ekstrak kental, kemudian keseluruhan fraksi yang
dihasilkan dilakukan KLT.
Fase diam yang digunakan pada KLT adalah silika gel GF254 dan sebagai fase gerak
digunakan n-heksana, kloroform, etil asetat dan n-butanol. Bejana kromatografi sebelum
digunakan untuk elusi, terlebih dahulu dijenuhkan dengan fase geraknya. Sedikit fraksi positif
flavonoid dilarutkan dengan pelarutnya (eluen yang akan dipakai) kemudian ditotolkan pada
plat kromatografi lapis-tipis dengan menggunakan pipa kapiler. Setelah kering lalu
dimasukkan dalam bejana. Bila fase gerak telah mencapai batas yang ditentukan, plat
diangkat dan dikeringkan di udara terbuka. Sebagai penampak noda digunakan asam sulfat.
Noda yang terbentuk diamati dengan lampu UV 254 nm dan 366 nm kemudian dihitung Rf-
nya (Asih, 2009)
2.9 Pengujian Dengan Spektrofotodensitometri

30
 Pengukuran spektrum dilakukan pada panjang gelombang 250-500 nm. Plat hasil
pemisahan dengan KLT di-scan pada rentang panjang gelombang, kemudian data hasil
scanning dianalisis dan dicocokkan dengan literatur.
Tabel 1. Tabel Data Panjang Gelombang Komponen di dalam kedelai
No Nama Kandungan MeOH (λmaks nm) NaOMe (λmaks
nm)
1 Daidzein 238bh,249, 260bh, 259, 289bh, 328
303 bh
2 Formononetin 240bh, 248, 259bh, 255, 273bh, 335
311
3 Genistein 261, 328bh 276, 327bh
4 Aprormosin 258, 320 258, 349
5 Tektorigenin 267, 330 278, 328
6 Orobol 262, 294, 294bh, 269, 334
338bh

31
 BAB III
ALAT DAN BAHAN
3.1 Skrining Fitokimia
Alat dan Bahan :
Alat : Alat-alat gelas
Bahan : - Simplisia kedelai
- Metanol
- Eter minyak tanah
- Etil asetat
- Etanol 95%
- Larutan H2SO4
3.2 Uji Susut Pengeringan
Alat dan Bahan
Alat :- Oven
- Botol timbang
- Timbangan analitik
Bahan : Simplisia kedelai
3.3 Ekstraksi Simplisia (Maserasi, Hidrolisis, Partisi Cair-cair)
Alat dan Bahan :
Alat : - Kertas Saring
- Penangas air

Bahan: - Serbuk kedelai

- Metanol
- HCl pekat
- n-heksana
3.4 Isolasi Isoflavon (Kromatografi Kolom)
Alat dan Bahan Kromatografi Kolom
Alat :
- Gelas beker
- Kolom
- Pipet tetes
- Evaporator
Bahan :

32
 - N-heksana
- Kloroform
- Etil asetat
- Silika gel
- Glasswool
3.5 Identifikasi (KLT)
Alat dan Bahan pembuatan larutan percobaan:
Alat : - Chamber
- Plat Silika GF 60
- Tissue
- Kertas Saring
Bahan: - Kloroform
- n-heksana
- Etil asetat
- Esktrak kental dari kedelai

3.6 Identifikasi Senyawa Isoflavonoid dengan Spektrofotodensitometer

Alat dan Bahan pembuatan larutan percobaan:
Alat : - Spektrofotodensitometer
Bahan : - Plat hasil pemisahan dengan KLT

33
 BAB IV
CARA KERJA DAN EVALUASI HASIL

4.1 Skema Umum Isolasi dan Identifikasi Flavonoid

Pengujian susut pengeringan dan skrining fitokimia

Biji kedelai diblender untuk memperkecil ukuran partikel biji

menjadi serbuk

Serbuk dimaserasi selama 7 hari dengan menggunakan methanol

kemudian maserat disaring lalu diuapkan

Hidrolisis dengan larutan HCL 2 N, kemudian hasil hidrolisis

difraksinasi dengan n-heksan. Fase n-heksan dipisahkan dan
diuapkan

Ekstrak positif flavonoid dilakukan pengisolasian pada

kromatografi kolom

Fraksi diidentifikasi melalui spektrofotodensitometri

Plat dilakukan pembacaan panjang gelombang dengan

spektrofotometri UV pada rentang panjang gelombang 200 nm-800
nm, data dicocokkan dengan literatur

34
4.2 Penetapan Susut Pengeringan Ekstrak

Dipanaskan botol timbang dangkal bertutup pada suhu 1050 C selama 30

menit dan kemudian ditara

Ditimbang ekstrak sebanyak 1 g

Perlahan-lahan zat uji diratakan sampai setinggi ± 5 mm, dengan ruahan

≤ 10 mm

Ditimbang botol timbang yang telah berisi ekstrak

Dimasukkan ke dalam oven dalam keadaaan tutup dibuka, tutup

diletakkan oven

Dikeringkan pada suhu 1050C hingga bobot tetap

Oven dibuka, botol segera ditutup

Dimasukkan ke dalam desikator dibiarkan dingin hingga suhu kamar

Ditimbang dan dihitung susut pengeringan ekstrak

35
4.3 Skema Kerja Penetapan Susut Kering Serbuk

Silika pada desikator dipanaskan pada oven hingga berwarna biru

menyala

Ditimbang botol timbang beserta tutupnya

1 gram serbuk daun seledri dimasukkan ke dalam botol timbang

Ditimbang botol timbang yang telah berisi ekstrak

Botol timbang dimasukkan ke dalam oven dalam keadaan tutup dibuka

Dikeringkan pada suhu 1050C selama 15 menit

Setelah oven dibuka, botol segera ditutup

Botol dimasukkan ke dalam desikator dalam keadaan tutup dibuka

selama 15 menit

Lalu botol ditimbang dan dicatat hasil penimbangannya

Botol dimasukkan lagi ke dalam oven dalam keadaan tutup dibuka

selama 15 menit

Langkah diatas diulangi hingga diperoleh bobot tetap

Diperoleh susut pengeringan serbuk

36
4.4 Ekstraksi Biji Kedelai

Dimaserasi 10 g serbuk biji kedelai dalam L metanol

Ekstrak disaring dan diuapkan dengan evaporator

g Ekstrak kental metanol

Dihidrolisis dengan HCl 2 N kuvet selama 3 jam

Hasil diekstraksi dengan n-heksana

Ekstrak n-heksana diuapkan dalam evaporator

g ekstrak kental n-heksana

37
4.5 Isolasi Isoflavon (Kromatografi Kolom)
Skema Kerja:

Silika gel 60 dipanaskan dalam oven pada suhu 1100

Ditambahkan fase gerak sampai menjadi bubur

Fase gerak dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam kolom sampai hampir penuh (keadaan
kran kolom tertutup)

Kecepatan aliran kolom diatur dan bubur dimasukkan sedikit demi sedikit sampai seluruh
bubur masuk ke dalam kolom

Fase diam dielusi hingga homogen (didiamkan kuvetama 1 hari)

Sampel dilarutkan di dalam pelarut dan dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam kolom

Fase gerak ditambahkan secara kontinyu sampai terjadi pemisahan

Eluat ditampung setiap 3 mL dan diuapkan sampai terbentuk ekstrak kental

Fraksi dilakukan KLT

38
4.6 Identifikasi (KLT)

Chamber dijenuhkan dengan fase gerak

Sedikit fraksi positif flavonoid dilarutkan dengan eluen

Fraksi ditotolkan pada plat silika GF 60 dengan menggunakan pipet kapiler dan dikeringkan

Plat dimasukkan ke dalam chamber dan dielusi dengan fase gerak sampai batas yang
ditentukan

Plat diangkat dan dikeringkan di udara terbuka

Plat disemprot dengan menggunakan asam sulfat sampai terbentuk noda

Noda diamati di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm dan Rf-nya
dihitung

39
40
4.7.Identifikasi dengan KLT-Spektrofotodensitometri

Disiapkan plat silica gel GF 254 dengan ukuran

10 x 10 cm

Plat silica selanjutnya dicuci dengan 3 mL metanol, lalu

diaktivasi pada suhu 1200 C selama 30 menit

Disiapkan eluen n-heksana : kloroform : etil asetat

( 9: 1: 0,5 ) sebanyak 10 mL

Fraksi dan ekstrak pembanding direkonstitusi dengan

0,5 mL metanol, chamber dijenuhkan dengan eluen

Masing-masing fraksi dan ekstrak pembanding

dirtotolkan pada plat sebanyak 10 µl pada titik yang
berbeda dengan jarak penotolan 0,7 cm

Plat dielusi hingga mencapai jarak elusi 8 cm, lalu plat

dikeringkan dengan diangin-anginkan

Plat dilihat di bawah sinar UV pada panjang gelombang

254 nm dan 366 nm

Discan pada spektrofotodensitometer pada panjang

gelombang 200-800 nm

BAB V

41
 HASIL PRAKTIKUM
Tabel 2. Tabel Hasil Praktikum

42
No Kegiatan Hasil
1 Uji Susut Pengeringan - Berat botol
timbang : 22,7920
ditimbang serbuk kedelai sebanyak 1 gram gram
- Berat serbuk
kedelai : 1,004
gram
- penyusutan I :
botol timbang ditara 0,8909 gram
- penyusutan II :
0,7899 gram

botol timbang dipanaskan dalam oven

(105 0C, 15 menit)

didinginkan

serbuk dimasukkan ke dalam botol timbang

dipanaskan dalam oven (105 C, 15 menit)

didinginkan

ditimbang

dipanaskan

didinginkan

43

ditimbang
No Kegiatan Hasil

44
 8 Elusi
Sampel (ekstrak kental) dilarutkan -sampel statis pada
Permukaan
kolom hingga
penambahan
Dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam kolom fase gerak 50 mL
(19 november 2010)

-fase gerak menguap

Hingga
Fase gerak ditambahkan secara kontinyu
bagian tengah kolom

-silika dibersihkan dari

Kolom
Eluat ditampung setiap 3 mL (21 november 2010)

9 Maserasi (pengulangan)
Serbuk kedelai ditimbang sebanyak 10 gram

Direndam dengan metanol sebanyak 75 mL

Didiamkan selama 3 hari

-Berat cawan porselen

10 Penyaringan kosong :
Disiapkan beaker glass, batang pengaduk,
kertas saring dan corong kaca 62,735 gram
- Berat cawan + ekstrak :
63,591 gram
- Berat ekstrak : 0,856
Gram
Diletakkan kertas saring pada corong kaca

Maserat dituangkan dan ditampung dalam

beaker glass

Bilas sisa maserat dengan metanol

45
 BAB VI
PEMBAHASAN

Isoflavon merupakan subkelas dari flavonoid atau isomer flavon yang merupakan
flavonoid minor, yang jumlahnya sangat sedikit dan bagi tumbuhan berfungsi sebagai
fitoaleksin yaitu senyawa pelindung yang terbentuk dalam tumbuhan untuk pertahanan
terhadap serangan penyakit. Isoflavon di alam sering dijumpai dialam dalam bentuk
glikosidanya (terikat pada gugus gula). Bentuk glikon dari isoflavon larut dalam pelarut polar,
sedangkan bentuk aglikonnya larut dalam pelarut nonpolar. Flavonoid minor isoflavon
penyebarannya terbatas pada beberapa jenis tumbuhan. Salah satunya terdapat pada tanaman
kacang kedelai (Glycine max). Senyawa isoflavon yang terdapat di kacang kedelai antara lain
genistein dan daidzein. Isoflavon sukar dicirikan karena reaksinya tidak khas dengan pereaksi
warna manapun. Beberapa isoflavon (misalnya daidzein) memberikan warna biru muda
cemerlang dengan sinar UV bila diuapi dengan ammonia, tetapi kebanyakan yang lain
(misalnya genistein) tampak sebagai bercak lembayung pudar yang dengan ammonia berubah
menjadi coklat pudar (Harbone, 1987).
Pada praktikum kali ini dilakukan pengujian secara kualitatif terhadap senyawa
isoflavon yang terdapat pada serbuk biji kedelai (Glycine max) melalui metode KLT-
spektrofotodensitometri yang pada tahap awal dilakukan proses isolasi dan pemisahan dengan
menggunakan metode Maserasi, hidrolisis, dan partisi cair-cair.
Sebelum dilakukan isolasi falvonoid golongan isoflavon dari ekstrak biji kedelai,
praktikum diawali dengan perlakuan skrinning fitokimia terhadap serbuk biji kedelai untuk
menentukan ada atau tidaknya senyawa flavonoid dalam serbuk biji kedelai. Skrinning
fitokimia merupakan langkah awal yang dapat memberikan gambaran mengenai ada tidaknya
senyawa target, yaitu flavonoid dalam serbuk biji kedelai yang akan dianalisis, bila hasil
skrinning fitokimia memberikan hasil positif terhadap adanya flavonoid, maka prosedur
analisis selanjutnya dapat diteruskan, namun apabila skrinning fitokimia menunjukkan hasil

46
negatif terhadap adanya flavonoid, maka prosedur analisis selanjutnya tidak dapat diteruskan.
Metode skrinning fitokimia sebagian besar merupakan reaksi pengujian warna dengan suatu
pereaksi warna. Dalam praktikum ini, dilakukan skrinning fitokimia terhadap golongan
flavonoid, di mana terlebih dahulu disiapkan larutan percobaan dengan cara melarutkan
serbuk biji kedelai dalam 10 mL metanol, lalu disaring dan filtrat yang dihasilkan diencerkan
dengan air, kemudian dipartisi dengan 5 mL eter minyak tanah. Lapisan metanol (lapisan
bawah) diambil, lalu diuapkan pada suhu 40ºC, endapan dilarutkan dengan 5 mL etol asetat,
dan disaring (terbentuk larutan percobaan). Terhadap larutan percobaan ini selanjutnya
dilakukan pengujian warna dengan penambahan 2 mL etanol 95 % dan 2-4 tetes larutan
H2SO4 pekat dan diperoleh warna merah tua pada larutan percobaan. Hasil yang diperoleh
menunjukkan hasil uji positif terhadap senyawa flavonoid, sehingga percobaan dengan
prosedur selanjutnya dapat dilakukan.
Seteleh dilakukan skrinning fitokimia, dilakukan penentuan susut pengeringan
simplisia Glycine max. Susut pengeringan adalah kadar bagian yang menguap dari suatu zat,
kecuali dinyatakan lain suhu penetapan adalah 105oC (Depkes RI, 1986). Berdasarkan
perhitungan diperoleh besarnya susut pengeringan sebesar 21,32 %. Dalam hal ini penentuan
susut pengeringan juga dapat menunjukkan kandungan air yang terdapat dalam serbuk
simplisia, di mana berkurangnya massa serbuk simplisia setelah dipanaskan atau dikeringkan
diakibatkan oleh hilangnya kandungan air dalam serbuk simplisia dan besarnya persentase
susut pengeringan sebanding dengan persentase air yang terkandung dalam serbuk simplisia
tersebut. Menurut literatur (Tim Penyusun, 2006), kandungan air yang boleh ada dalam suatu
simplisia adalah kurang dari 10 %. Tingginya kandungan air dalam serbuk simplisia Glycine
max ini dimungkinkan tidak dilakukannya proses pengeringan pada pembuatan serbuk kedelai
dari biji kedelai. Mengingat senyawa flavonoid yang terdapat dalam biji kedelai sangat mudah
terdegradasi oleh adanya panas, maka setelah dibentuk menjadi serbuk, kami tidak melakukan
proses pengeringan terhadap serbuk kedelai tersebut. Setelah mendapatkan hasil pada skrining
fitokimia dan uji susut pengeringan selanjutnya dilakukan ekstraksi sebagai langkah awal
dalam isolasi flavonoid. Teknik maserasi yang dipilih adalah teknik maserasi.
Maserasi merupakan salah satu cara ekstraksi yang paling sederhana. Proses ini
dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari selama waktu
tertentu. Pada praktikum ini, proses maserasi dilakukan dengan merendam serbuk biji kedelai,
dengan metanol sebagai cairan penyarinya. Pemilihan metanol sebagai cairan penyari karena
isoflavon larut dalam metanol . Selain itu metanol memiliki beberapa keunggulan diantaranya
cukup stabil secara fisika dan kimia, bereaksi netral, dan tidak mempengaruhi zat aktif dari
kedelai.
47
 Proses perendaman dilakukan selalam 7 hari dengan pengadukan setiap harinya.
Tujuan dari dilakukannya pengadukan adalah untuk mengoptimalkan proses ekstraksi. Selama
proses perendaman, cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga
sel yang mengandung senyawa isoflavon. Senyawa isoflavon akan larut dan karena adanya
perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan di luar sel, maka larutan
yang terpekat didesak keluar. Proses ini berulang sampai terjadi keseimbangan konsentrasi
antara larutan di luar sel dan di dalam sel.
Setelah 7 hari, maserat kasar disaring dengan kertas saring. Penyaringan ini bertujuan
untuk memisahkan serbuk biji kedelai dengan cairan penyari yang telah melarutkan zat aktif.
Kemudian maserat hasil maserasi diuapkan hingga diperoleh esktrak kental.
Jumlah rendemen ekstrak hasil maserasi serbuk biji kedelai yang dihasilkan dari
maserasi sebesar 7,8%. Persen rendemen yang dihasilkan ini relatif rendah. Kemungkinan hal
ini disebabkan karena larutan ekstrak telah mencapai titik jenuh mengingat proses maserasi
cukup lama. Semakin lama waktu ektraksi semakin tinggi rendemen yang dihasilkan sampai
batas 6 jam karena kesempatan bersentuhan antara bahan dan pelarut semakin besar dan lewat
dari 6 jam rendemen ekstrak menurun kemungkinan hal ini terjadi karena larutan sudah
mencapai titik jenuh (Suryandari, 1981). Demikian halnya dengan kehalusan bahan, semakin
halus bahan yang digunakan semakin tinggi rendemen yang dihasilkan. Hal ini disebabkan
karena permukaan bahan semakin luas sehingga memperbesar terjadinya kontak antara
partikel serbuk biji kedelai dengan pelarut.
Selanjutnya ekstrak kental dihidrolisis dengan HCl 2N selama 30 menit. Hidrolisis ini
berfungsi untuk memisahkan senyawa isoflavon (aglikon) dari biji kedelai dengan glikonnya.
Setelah itu dilakukan ekstraksi menggunakan metode ekstraksi cair-cair dengan ditambahkan
n-heksana sebagai fase organik. Ekstraknya kemudian diuapkan sehingga didapatkan ekstrak
kental n-heksana sebanyak 0,015 gram. Ekstrak ini kemudian dilakukan pemisahan dengan
kromatografi kolom lambat.
Pada pembuatan kolom kromatografi dengan cara basah, menggunakan eluen dengan
campuran n-hesksana : kloroform : etil asetat dengan perbandingan 9 : 1 : 0,5. Tujuan
mengkombinasikan pelarut adalah untuk mengisolasi senyawa-senyawa aktif yang terdapat
dalam ekstrak kental biji kedelai, baik yang bersifat polar maupun non polar. Adsorben yang
digunakan adalah silica gel yang bersifat polar, karena kolom dibuat dengan cara basah maka
silica gel dilarutkan terlebih dahulu dengan eluennya hingga menjadi bubur adsorben.
Selanjutnya, kolom diisi dengan eluen secukupnya untuk memudahkan dalam memasukkan
glass wool ke dasar kolom. Glass wool berfungsi untuk menopang absorben. Bubur silica gel
dimasukkan ke dalam kolom secara hati-hati melalui dinding kolom sehingga adsorben jatuh
48
perlahan. Hal ini dilakukan untuk menghindari terjadinya gelembung udara, karena adanya
gelembung udara dapat merusak kolom yang akan mempengaruhi hasil pemisahan. Semakin
panjang kolom, maka efisiensi pemisahan akan semakin besar. Ini berarti, kemampuan untuk
memisahkan komponen – komponen dalam suatu campuran akan lebih baik. Permukaan silika
gel terdiri atas gugus Si-O-Si dan silanol (Si-OH). Gugus silanol bersifat sedikit asam dan
polar karena mampu membentuk ikatan hidrogen dengan solut-solut yang agak polar sampai
sangat polar (Gandjar dkk, 2007). Kolom yang dibuat setinggi 14,2 cm dan memiliki diameter
sebesar 2,5 cm. Kolom didiamkan selama 3 hari untuk mendapatkan kolom yang kompak dan
dapat menghasilkan pemisahan yang baik. Dilakukan penambahan eluen yang cukup agar
kolom tidak kering.
Selanjutnya dilakukan pemisahan dengan menggunakan kolom yang telah siap
digunakan. Ekstrak kental dilarutkan dahulu dengan sedikit fase gerak untuk mempermudah
memasukkan ekstrak kental ke dalam kolom. Cuplikan dimasukkan melalui pinggiran kolom
memutar secara perlahan agar tidak merusak kolom. Setelah cuplikan mencapai permukaan
kolom, dilakukan pengembangan kromatogram dengan mengalirkan eluen melalui dinding
kolom. Teknik pengelusian yang digunakan yaitu cara isokratik dimana campuran pelarut
yang digunakan untuk keseluruhan pengerjaan kromatografi sama. Cuplikan akan terpartisi
diantara fase diam dan fase geraknya karena perbedaan migrasi antara komponen-komponen
akibat perbedaan distribusi pada dua fase yang tidak saling bercampur. Masing-masing
komponen dalam campuran mengalami adsorpsi dan desorpsi pada fase diam dan karenanya
mengalami perlambatan dengan tingkat berbeda-beda sesuai dengan daya ikat masing-masing
terhadap kolom.
Pada praktikum ini, ketika elusi larutan ekstrak tidak terlihat mengalami migrasi, hal
ini ditandai dengan tidak adanya perubahan warna dan pembentukan pita pemisahan pada
dinding kolom. Hingga 2 jam waktu elusi belum terdapat fraksi yang berwarna sehingga
fraksi tidak dapat ditampung. Karena waktu praktikum yang tidak memadai kolom dengan
larutan ekstrak di dalamnya dibiarkan selama 2 hari, namun pada hari kedua pelarut pada
kolom menguap sehingga praktikan tidak memperoleh fraksi. Menguapnya pelarut pada
kolom disebabkan karena kebocoran kertas aluminium foil yang digunakan untuk menutup
kolom, selain itu lubang pada kran bawah kolom tidak ditutup dengan rapat, sehingga
memudahkan pelarut menguap, karena pelarut yang digunakan adalah sebagian besar berupa
n-heksan yang bersifat sangat mudah menguap. Karena praktikan tidak mendapatkan fraksi
untuk pengujian selanjutnya maka dilakukan pengulangan prosedur, yakni mulai dari proses
maserasi.

49
 Proses maserasi kedua dilakukan selama 3 hari karena keterbatasan waktu, maserasi
kedua memperoleh jumlah ekstrak kental sebanyak 0,856 gram(8,56%). Terdapat perbedaan
hasil dengan maserasi pertama, yakni maserasi kedua menghasilkan lebih banyak ekstrak. Hal
ini disebakan karena wadah maserasi yang digunakan pada maserasi pertama lebih besar
daripada maserasi kedua, sehingga kemungkinan tertinggalnya lebih banyak maserat lebih
banyak pada maserasi pertama. Tertinggalknya maserat pada wadah maserasi menyebabkan
perolehan ekstrak pada maserasi pertama lebih sedikit daripada maserasi kedua. Ekstrak
kental tersebut diambil sebanyak 0,574 gram untuk dihidrolisis sedangkan sisanya tidak
dihidrolisis dengan HCl. Perlakuan ini untuk membandingkan hasil antara ekstrak yang
dihidrolisis dan yang tidak. Jumlah ekstrak hasil hidrolisis sebanyak 0,401 gram. Selanjutnya
dilakukan pemisahan dengan Kromatografi Lapis Tipis, tetapi isolasi dengan Kromatografi
Kolom tidak dilakukan karena keterbatasan waktu.
Pada teknik kromatografi lapis tipis fase diamnya berupa lapisan tipis adsorben yang
dilekatkan pada permukaan penyangga datar. Fase gerak yang digunakan adalah sama dengan
fase gerak pada kromatografi kolom biasa cara basah. Selanjutnya, dilakukan penjenuhan
chamber yang bertujuan agar tekanan dalam chamber sama sehingga jalannya sampel tersebut
lurus, untuk memperkecil penguapan pelarut dan menghasilkan bercak yang lebih bundar dan
lebih baik (Beaker, 1965). Sebelum penotolan, ekstak hasil hidrolisis dan yang tidak hidrolisis
direkonstitusi dengan metanol sebanyak 2 ml. Larutan ditotolkan pada plat sebanyak 10
mikloliter dengan menggunakan pipet mikro. Totolan dibuat sekecil mungkin agar spot yang
dihasilkan tidak besar/luas, tidak berekor atau tailing, karena hal ini akan menghasilkan
pemisahan yang kurang sempurna (Beaker, 1985). Dan hasil totolan pada plat KLT
dikeringkan dengan diangin-anginkan sebelum dikembangkan dengan eluen juga untuk
menghindari diameter totolan yang besar. Plat KLT tidak boleh disentuh langsung dengan
jari-jari tangan karena keringat dapat menyebabkan kekacauan pada kromatogram
(menggangu analisis). Selanjutnya, plat KLT diletakkan pada chamber kromatografi yang
telah dijenuhan. Kemudian solven akan melewati spot sampel dan membawa komponen-
komponen sampel melalui fase diam. Garis terakhir yang dicapai oleh pelarut terdepan saat
proses pengembangan dihentikan disebut tepi depan pelarut. Proses pergerakan fase gerak
yang menghasilkan pemisahan pemisahan disebut pengembangan. Pada praktikum ini
digunakan metode pengembangan ascending development. Plat KLT ditata secara vertical
sedemikian rupa sehingga ujung bagian bawahnya terendam dalam solven pada dasar
chamber dan jangan sampai merendam titik spot sampel. Solven naik pada kertas plat karena
adanya aksi kapiler. Selanjutnya dilakukan deteksi noda di bawah sinar UV dengan panjang
gelombang 254 dan 366 nm.
50
 Dari deteksi tersebut pada panjang gelombang 254 nm tidak terlihat adanya noda,
sedangkan pada panjang gelombang 366 nm terlihat satu noda berwarna hitam pada totolan
larutan ekstrak yang tidak dihidrolisis, jarak noda tersebut kurang lebih 5 cm dari batas
bawah. Selanjutnya dilakukan identifikasi dengan spektrofotodensitometer.
Analisis kualitatif dilanjutnya dengan metode spektrofotodensitometri pada panjang
gelombang 200-800 nm. Karena tidak terdapatnya data spesifik dari daidzein dan genistein
pada library spektrofotodensitometer, dan akibat keterbatasan literatur, yaitu hanya diperoleh
literatur yang menunjukkan pola spektrum dari senyawa genistein, maka pada metode
spektrofotodensitometri ini, senyawa yang dianalisis secara kualitatif adalah senyawa
genistein. Prinsip dasar pengukuran kadar suatu senyawa dengan sistem
spektrofotodensitometri adalah mengukur serapan atau fluorosensi dari analit yang menyerap
sinar UV. Pada praktikum ini, digunakan sistem serapan (absorbsi) karena zat yang di ukur
tidak berfluoresensi, di mana pengukuran oleh densitometer dilakukan terhadap banyaknya
REM yang diabsorsi atau diserap oleh kromofor suatu senyawa. Pada metode ini, digunakan
rentang panjang gelombang 200-800 nm karena mode absorbsi dengan
spektrofotodensitometri terjadi pada daerah dengan rentang panjang gelombang tersebut.
Pendeteksian dengan metode spektrofotodensitometer ini dilakukan dengan teknik
semiautomatis karena alat spektrofotodensitometer hanya bisa mendeteksi analit dengan jarak
penotolan kelipatan 0,5 cm. Dalam praktikum ini, jarak penotolan yang digunakan adalah 0,7
cm (bukan kelipatan 0,5 cm) sehingga terjadi kekacauan dalam penentuan jumlah track.
Pada alat spektrofotodensitometer, jumlah track yang dideteksi berjumlah 19 track,
sedangkan jumlah track sebenarnya adalah 2 track, yang terdiri dari 2 fraksi yang merupakan
fraksi terhidolisis dan tidak terhidrolisis, sedangkan 13 track sisanya merupakan fraksi dari
kelompok 4. . Akibat dari ketidaksesuaian jumlah track dengan jumlah totolan , harus
dilakukan penyesuaian secara manual antara track yang dideteksi oleh alat pada jarak
penotolan 0,5 cm dengan track sebenarnya pada jarak penotolan 0,7 cm. Hasil penyesuaian
antara track pada keadaan sebenarnya dengan track yang dibaca oleh alat adalah sebagai
berikut : track 1 menjadi track 2; track 2 menjadi track 3; track 3 menjadi track 4; track 4
menjadi track 6; track 5 menjadi track 7; track 6 menjadi track 9; track 7 menjadi track 10;
track 8 menjadi track 11; track 9 menjadi track 13; track 10 menjadi track 14; track 11
menjadi track 16; track 12 menjadi track 17; dan track 13 menjadi track 18.
Dari hasil analisis oleh alat spektrofotodensitometer, tidak ada spot dari setiap track
yang memberikan bentuk spektrum yang sama dengan bentuk spektrum genistein pada
literatur, sehingga analisis hanya dapat dilakukan melalui perbandingan harga Rf yang
diperoleh untuk setiap spot dengan harga Rf genistein menurut literatur, yaitu 75. Dari hasil
51
analisis terhadap harga Rf, pada track 17 dan 18 ditemukan harga Rf yang mendekati lieratur
yakni 83 namum panjang gelombang yang dimiliki tidak sesuai, berdasarkan panjang
gelombang, terdapat panjang gelombang yang mendekati literatur, yaitu pada track 18 dengan
panjang gelombang 268 nm. Namun hasil ini tidak dapat dikatakan valid karena bentuk
spektrum yang dihasilkan tidak sesuai dengan pola spektrum genistein pada literatur. Menurut
literatur (Markham, 1988), genistein memiliki panjang gelombang maksimum 261 nm dan
bahu 328 nm dengan pola spektrum sebagai berikut :

Gambar 12. Spektra Isoflavon (Markham,1988).

Dari hasil analisis, diperoleh pula harga Rf yang sangat kecil, yaitu di bawah 0,40
pada beberapa track penotolan. Hal ini menunjukkan bahwa pada plat yang dianalisis terdapat
senyawa yang bersifat polar, sehingga senyawa tersebut lebih tertahan oleh fase diam dan
tidak terelusi oleh fase gerak. Terdapatnya senyawa polar dalam hasil analisis dan
ketidaksesuaian spektrum genistein yang diperoleh pada analisis KLT-
spektrofotodensitometri ini dengan literatur disebabkan oleh beberapa faktor, yaitu proses
hidrolisis yang tidak maksimal. Pada proses hidrolisis ketika ekstrak dicampurkan dengan
HCL 2 N ekstrak tidak melarut sempurna, dan ketika proses penyaringan masih terdapat
adanya gumpalan. Adanya gumpalan ekstrak ini menyebabkan ekstrak tidak terhidrolis
sempurna sehingga komponen aglikon yang diinginkan tidak diperoleh secara maksimal. Hal
ini ditunjukkan ketika partisi cair-cair larutan hasil hidrolisis dengan n-heksane, fase n-heksan
yang diperoleh sangat sedikit, dan jumlah yang sedikit ini memungkinkan terjadinya
kehilangan sampel selama proses preparasi untuk pengujian selanjutnya. Selain itu
penyimpanan plat KLT yang terlalu lama, di mana seharusnya plat yang telah dielusi tidak
boleh disimpan terlalu lama atau harus segera dianalisis dengan spektrofotodensitometri
karena penyimpanan plat akan menyebabkan rusaknya plat dan senyawa dalam plat dapat
terdegradasi, sehingga akan mengganggu proses scanning dengan spektrofotodensitometri.
Perbandingan Hasil Maserasi dan Soxhletasi
52
 Percobaan dengan biji kedelai ini, dilakukan dengan menggunakan 2 metode ekstraksi
yaitu metode maserasi (metode ekstraksi dingin) yang dilakukan oleh kelompok 3 dan metode
soxhletasi (metode ekstraksi panas) yang dilakukan oleh kelompok 4. Berikut adalah tabel
perbedaan hasil ketiga metode ekstraksi tersebut :

53
 Tabel 3. Perbandingan Hasil dari Beberapa Metode Ekstraksi
Pembanding Maserasi Soxhletasi
Randemen ekstrak 7,8% dan 8, 56 % 8,67 %
kental hasil ekstraksi
Susut pengeringan 21,32 % 29,48 %
ekstrak
Warna Ekstrak Kuning kecoklatan Kuning muda
Hasil Soxhletasi
Jumlah Bercak 1 spot cukup jelas 2 spot yang
KLT di bawah sinar UV cukup jelas, yaitu spot 2
366 nm dan spot 3
Warna bercak di Gelap Gelap
bawah UV 366 nm
Nlai Rf pada 0,46 0,75 pada fraksi
spektrofotodensitometer 2 dan 0,74 pada fraksi 3
Senyawa rujukan Genistein Genistein

Berdasarkan tabel di atas dapat dilihat adanya perbedaan hasil antara kedua metode
ekstraksi. Dilihat dari randemen ekstrak yang diperoleh, ekstraksi dengan metode maserasi
menghasilkan rendemen yang lebih sedikit daripada ekstraksi dengan metode soxhletasi.
Seharusnya, rendemen yang diperoleh dari metode maserasi lebih banyak daripada rendemen
dari metode soxhletasi, karena pada metode maserasi, kontak antara serbuk biji kedelai
dengan cairan penyari dapat berlangsung dalam waktu yang lebih lama, sehingga cairan
penyari dapat menyari zat aktif yang terdapat dalam serbuk biji kedelai dalam jumlah yang
lebih banyak pula, dan dengan demikian ekstrak yang diperoleh dengan cara maserasi tersebut
seharusnya mengandung senyawa target dalam jumlah yang lebih banyak. Namun, dalam hal
ini rendemen yang lebih sedikit justru dihasilkan dari ekstraksi dengan menggunakan metode
maserasi. Persen rendemen yang dihasilkan ini relatif rendah. Kemungkinan hal ini
disebabkan karena larutan ekstrak telah mencapai titik jenuh mengingat proses maserasi
cukup lama. Semakin lama waktu ektraksi semakin tinggi rendemen yang dihasilkan sampai
batas 6 jam karena kesempatan bersentuhan antara bahan dan pelarut semakin besar dan lewat
dari 6 jam rendemen ekstrak menurun kemungkinan hal ini terjadi karena larutan sudah
mencapai titik jenuh (Suryandari, 1981). Selain itu kemungkinan ekstrak ada yang tertinggal
pada kertas saring saat dilakukan penyaringan ekstrak. Pada proses ekstraksi dengan teknik
soxhletasi kecepatan dan jumlah sirkulasi pada proses soxhletasi berpengaruh pada jumlah zat
aktif yang diekstrak. Pada praktikum yang dilakukan oleh kelompok 4, sirkulasi pada
soxhletasi hanya dilakukan sebanyak 2 kali sirkulasi, namun karena waktu untuk 1 kali
54
sirkulasi tergolong cukup lama, maka dapat diperoleh ekstrak dengan warna yang cukup
pekat. Dilihat dari warna ekstrak yang dihasilkan, ekstrak hasil maserasi memiliki warna yang
lebih pekat dibandingkan dengan warna ekstrak hasil soxhletasi. Ini menunjukkan bahwa
ekstrak hasil maserasi kemungkinan lebih banyak mengandung senyawa target daripada
ekstrak hasil soxhletasi. Hasil susut pengeringan serbuk biji kedelai yang diperoleh oleh
kelompok 3 dan kelompok 4 berbeda. Perbedaan ini disebabkan oleh perbedaan serbuk
simplisia yang digunakan.

55
 BAB VII
KESIMPULAN

7.1 Kesimpulan
1. Pengujian pada praktikum kali ini dilakukan untuk mengidentifikasi
kandungan senyawa isoflavon pada biji serbuk kedelai dengan metode KLT-
spektrofotodensitometri yang sebelumnya dilakukan proses pemisahan dengan
metode maserasi, hidrolisis, dan partisi cair-cair, dengan genistein sebagai
senyawa utama yang dianalisis.
2. Rendemen ekstrak kental hasil maserasi yang diperoleh adalah sebesar 7,58 %
dan 8, 56%
3. Persentase susut pengeringan serbuk biji kedelai sebesar 21,32%
4. Dari hasil analisis dengan KLT-spektrofotodensitometri, didapatkan data yang
memiliki kedekatan hasil dengan literatur adalah data pada track 18 yaitu fraksi
yang tidak dihidrolisis dengan panjang gelombang 268 nm dan dan fraksi yang
tidak dihrolisi dengan harga Rf sebesar 83.
7.2 Saran
1. Diskusi sebelum dan sesudah praktikum perlu diadakan guna mencegah
kesalahan prosedur dan memantau hasil yang diperoleh praktikan.
2. Peralatan dan bahan praktikum agar lebih dilengkapi guna meningkatkan
ketrampilan dan kompetensi mahasiswa.
3. Adanya banyak perubahan yang dilakukan terhadap cara kerja dari literatur
menyebabkan hasil yang diperoleh tidak sesuai dengan yang diharapkan.

56
 DAFTAR PUSTAKA

Asih, A. 2009. “Isolasi dan Identifikasi Senyawa Isoflavon Dari Kacang Kedelai (Glycin
max)”. Jurnal Kimia 3 (1)
Beacker, C.A. and R.C. Bakhuizen van den Brink. 1965. Flora of Java Volume II.
Nedherland : Noordhoff Groningen N.V.P.
Deinstrop, E. H. 2007. Applied Thin Layer Chromatography, 2nd Edition. Weinheim : Wiley
VCH Verlag.
Depkes RI. 1980. Materia Medika Indonesia Jilid IV. Jakarta: Departemen Kesehatan
Republik Indonesia
Depkes RI. 1986. Sediaan Galenik. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia
Depkes RI. 1995. Farmakope indonesia IV. Jakarta: Departemen Kesehatan
Gandjar, I.G. dan A. Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar. Yogyakarta.

Harbone, J.B. 1987. Metode Fitokimia. Bandung: ITB

Irwan, W.A. 2006. Budidaya Tanaman Kedelai (Glycin max (L.) Merill). Jatinangor : Jurusan
Budidaya Pertanian Unibersitas Padjajaran.
Kok, Tjie.1997. Spektrofotometri Uv-Vis:Aplikasi Kuantitatif. Kristal.No.14. hal 1-6
Kusmardiani,S dan A. Nawawi.1992. Kimia Bahan Alam. Jakarta: Pusat Antar Universitas
Bidang Ilmu Hayati
Markham, K.R. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Bandung : Penerbit ITB
MccUE, Patrick. 2004. Health Benefits of Soy Isoflavonoids and Strategic for Enhancement a
Review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 44:361–367
Suryandari, S. 1981. Pengambilan Oleoresin Jahe dengan cara Solvent Extraction. BBIHP.
Bogor.
Settel, F. 1997. Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry. New Jersey :
Prentice Hall PTR
Tim Penyusun. 2006. Buku Ajar Farmakognosi. Bukit Jimbaran: Jurusan Farmasi Fakultas
MIPA Universitas Udayana
Wallis, TE, 2005. Textbook of Pharmacognosy Fifth Edition. New Delhi : Darya Ganj

57