P. 1
HPLC Adalah Alat Yang Sangat at Dalam Analisis

HPLC Adalah Alat Yang Sangat at Dalam Analisis

|Views: 1,770|Likes:
Published by lenthobakar

More info:

Published by: lenthobakar on Feb 24, 2011
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOCX, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

06/26/2013

pdf

text

original

HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis.

Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan setiap komponen dalam sample (analit-analit) berdasarkan kepolarannya, untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yang biasa digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik adalah RMe2SiCl dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C-8. Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi), misalnya air: asetonitril (80:20), dll, hal ini bergantung pada kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, danwaktu retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah. Waktu retensi yaitu waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggianpuncak yang maksimum dari senyawa itu.Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
y y y y

tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dar pelarut) i kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel) komposisi yang tepat dari pelarut temperatur pada kolom

Ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut(fase gerak) dan fase diam. Fase normal HPLC Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah anda baca tentang kromatografi lapis tipis atau kromatografi kolom. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom. Fase balik HPLC Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya se cara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk b ergerak bersama dengan pelarut.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa -senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom. Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC Beberapa aplikasi HPLC dalam kehidupan :
y y y y y

y y

HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi, seperti analisa kontaminasi melamin dalam pembuatan atau persiapan produk obat. Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori. Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX. Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air. HPLC juga dapat digunakan penentuan kadar vitamin dalam bahan pangan. Selain itu, yang juga banyak dilakukan adalah penggunaan HPLC untuk melihat komposisi asam amino dalam protein. Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia. Aplikasi HPLC pada analisa pangan sangat beragam. Untuk karbohidrat, HPLC bisa digunakan untuk gula dengan titik leleh rendah serta oligosakarida. Penentuan secara kuantitatif karbohidrat dalam bahan pangan dengan HPLC juga sudah menjadi standar baku. Untuk lipid yang kompleks, yang memiliki volatilitas rendah serta yang struktur kimianya sensitif terhadap suhu tinggi, HPLC juga menjadi pilihan terbaik. Selain itu, bisa diapakai untuk analisa kandungan nutrisi dalam makanan dan minuman, contoh : analisa kandungan polifenol dalam teh

Penentuan Kualitatif HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar.Contoh : Analisa carotenoid dalam yeast. Pertama-tama sel yeast dipecahkan dengan DMSO agar carotenoid yang tersekap di dalam sel dapat keluar. Kemudian diekstrak dengan pelarut methanol hingga semua carotenoid terambil.Karena carotenoid sangat peka terhadap cahaya dan panas, maka selama pekerjaan sebisa mungkin tidak terekspos langsung oleh cahaya. Pengerjaan dilakukan di dark room. Carotenoid terdapat dalam bentuk esternya, metil ester atau di metil ester. Oleh karena itu perlu treatment khusus agar carotenoid menjadi bentuk bebasnya. Hal ini dilakukan dengan penambahan larutanKOH jenuh. Baru kemudian carotenoid dalam bentuk bebas ini di ekstrak dengan penambahan dietileter. Pelarut diuapkan dengan gas nitrogen dan dilarutkan kembali dalam fasa mobil yang akan digunakan untuk HPLC.

Dalam percobaan ini digunakan standard B-carotene, C-18 sebagai kolom, dan fasag geraknya campuran acetonitril dan methanol dengan sistem isokratik, dengan pertimbangan ini adalah pelarut yang umum dan mudah ditemukan. Dengan sistem isokratik dan flow 0.5 ml/min, B-carotene terelusi pada menit ke 45. Signal sample menunjukkan terdapat B-carotene Penentuan Kuantitatif Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah:
y y y

Parameter percobaan sama antara standar dan sampel Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu. o Berdasarkan area kromatogram o Berdasarkan tinggi puncak kromatogram

Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample. Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja. Kesulitan biasanya dihadapi ketika akan mengidentifikasi suatu kromatogram yang terdiri atas banyak peak. Untuk mengetahui peak mana yang merupakan milik analat (zat target analisa) kromatogram dibandingkan dengan kromatogram standard. Cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya akan langsung di vonis sebagai peak milik analat. Memang senyawa/zat yang sama akan mempunyai RT yang juga sama, dengan catatan sample dan standard dijalankan dengan kondisi dan sistem HPLC yang sama. Namun bukan berarti RT yang sama pasti merupakan zat/senyawa yang sama. Disinilah para analis biasanya terkecoh. Jadi, melihat RT sebetulnya belumlah cukup untuk mengidentifikasi suatu zat. Hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->