HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis.

Kerja HPLC pada prinsipnya adalah

pemisahan setiap komponen dalam sample (analit-analit) berdasarkan kepolarannya, untuk
selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen
tersebut (kuantitatif). Alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai
fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC
digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yang biasa digunakan (pada
kolom) HPLC jenis fasa terbalik adalah RMe2SiCl dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C-8.
Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi), misalnya air:
asetonitril (80:20), dll, hal ini bergantung pada kepolaran analit yang akan dipisahkan.

Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan waktu retensinya akan berbeda, hal
ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah. Waktu retensi yaitu waktu yang
dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor. Waktu retensi diukur
berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang
maksimum dari senyawa itu.Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda.
Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

 tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
 kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran
partikel)
 komposisi yang tepat dari pelarut
 temperatur pada kolom

Ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut (fase
gerak) dan fase diam.

Fase normal HPLC

Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah anda baca tentang kromatografi lapis tipis atau
kromatografi kolom. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar
misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang
dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.
Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang
polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar
kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

Fase balik HPLC

Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan
rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8
atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.

Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam
campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai
hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh
karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak
bersama dengan pelarut.
Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus
hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang
larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya
senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh
karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak
lambat dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui
kolom. Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC

Beberapa aplikasi HPLC dalam kehidupan :

 HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi, seperti analisa
kontaminasi melamin dalam pembuatan atau persiapan produk obat.
 Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan
dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
 Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan
dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
 Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
 Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air. HPLC juga dapat digunakan
penentuan kadar vitamin dalam bahan pangan. Selain itu, yang juga banyak dilakukan adalah
penggunaan HPLC untuk melihat komposisi asam amino dalam protein.
 Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
 Aplikasi HPLC pada analisa pangan sangat beragam. Untuk karbohidrat, HPLC bisa digunakan
untuk gula dengan titik leleh rendah serta oligosakarida. Penentuan secara kuantitatif
karbohidrat dalam bahan pangan dengan HPLC juga sudah menjadi standar baku. Untuk lipid
yang kompleks, yang memiliki volatilitas rendah serta yang struktur kimianya sensitif
terhadap suhu tinggi, HPLC juga menjadi pilihan terbaik. Selain itu, bisa diapakai untuk
analisa kandungan nutrisi dalam makanan dan minuman, contoh : analisa kandungan
polifenol dalam teh

Penentuan Kualitatif

HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi
dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar. Contoh :
Analisa carotenoid dalam yeast.

Pertama-tama sel yeast dipecahkan dengan DMSO agar carotenoid yang tersekap di dalam sel dapat
keluar. Kemudian diekstrak dengan pelarut methanol hingga semua carotenoid terambil. Karena
carotenoid sangat peka terhadap cahaya dan panas, maka selama pekerjaan sebisa mungkin tidak
terekspos langsung oleh cahaya. Pengerjaan dilakukan di dark room. Carotenoid terdapat dalam
bentuk esternya, metil ester atau di metil ester. Oleh karena itu perlu treatment khusus agar
carotenoid menjadi bentuk bebasnya. Hal ini dilakukan dengan penambahan larutan KOH jenuh.
Baru kemudian carotenoid dalam bentuk bebas ini di ekstrak dengan penambahan dietileter. Pelarut
diuapkan dengan gas nitrogen dan dilarutkan kembali dalam fasa mobil yang akan digunakan untuk
HPLC.
Dalam percobaan ini digunakan standard B-carotene, C-18 sebagai kolom, dan fasag geraknya
campuran acetonitril dan methanol dengan sistem isokratik, dengan pertimbangan ini adalah pelarut
yang umum dan mudah ditemukan.

Dengan sistem isokratik dan flow 0.5 ml/min, B-carotene terelusi pada menit ke 45. Signal sample
menunjukkan terdapat B-carotene

Penentuan Kuantitatif

Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara
kuantitatif adalah:

 Parameter percobaan sama antara standar dan sampel

 Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama
 Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutan
standar seri pada waktu retensi tertentu.
o Berdasarkan area kromatogram
o Berdasarkan tinggi puncak kromatogram

Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat
peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.

Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan
banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan
dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini
dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC
sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit
mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.

Kesulitan biasanya dihadapi ketika akan mengidentifikasi suatu kromatogram yang terdiri atas
banyak peak. Untuk mengetahui peak mana yang merupakan milik analat (zat target analisa)
kromatogram dibandingkan dengan kromatogram standard. Cara yang paling umum untuk
mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama
dengan standard umumnya akan langsung di vonis sebagai peak milik analat. Memang senyawa/zat
yang sama akan mempunyai RT yang juga sama, dengan catatan sample dan standard dijalankan
dengan kondisi dan sistem HPLC yang sama. Namun bukan berarti RT yang sama pasti merupakan
zat/senyawa yang sama. Disinilah para analis biasanya terkecoh.

Jadi, melihat RT sebetulnya belumlah cukup untuk mengidentifikasi suatu zat. Hal lain yang perlu
dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D
yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga
dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.