Kromatografi Kertas

Pada kromatografi kertas sebagai penjerap digunakan sehelai kertas dengan susunan serabut dan
tebal yang sesuai. Pemisahan kromatografi dapat berlangsung menggunakan fase cair tunggal
dengan proses yang sama dengan kromatografi adsorpsi dalam kolom. Oleh karena kandungan
air pada kertas, atau imbibisi selektif dari komponen hidrofilik fase cair oleh serat kertasnya,
dapat dianggap sebagai fase diam, maka mekanisme partisi berperan penting dalam pemisahan.
Sebagai alternatif dapat juga digunakan sistem dua fase. Kertas diimpregnasi dengan salah satu
fase, yang kemudian menjadi fase diam (umumnya fase yang Iebih polar dalam hal kertas yang
tidak dimodifikasi). Kromatogram dilakukan dengan merambatkan fase gerak, melalui kertas.
Dapat dilakukan kromatografi menaik, pelarut merambat naik pada kertas ditarik oleh gaya
kapiler, ataupun kromatografi menurun, pelarutnya mengalir oleh gaya gravitasi.
Perbedaan harga H , bila kromatogram dikembangkan searah serat kertas (arah mesin),
dibandingkan dengan yang dikembangkan dengan arah tegak lurus terhadap serat kertas. Oleh
karena itu, dalam suatu seri kromatogram, arah perambatan pelarut harus dipertahankan tetap
terhadap arah serat kertas. (Arah mesin umumnya ditandai oleh pabrik pada kemasan kertas
kromatografi).
KROMATOGRAFI MENURUN
Pada kromatografi menurun, fase gerak diitarkan merambat turun pada kertas.
Alat Alat utama untuk kromatografi menurun terdiri dari komponen-komponen berikut ini.
Bejana kromatografi bertutup kedap uap dan mempunyai lubang untuk penambahan pelarut
atau untuk pengurangan tekanan dalam. Bejana sebaiknya dari kaca, baja tahan karat atau
porselen, dan dirancang sedemikian, hingga dapat dilakukan pengamatan selama kromatografi
berlangsung, tanpa membuka bejana. Tabung silinder kaca yang tinggi dapat digunakan. jika
dibuat kedap uap dengan tutup yang sesuai.
Rak tahan korosi, yang lebih kurang 5 cm lebih rendah dari tinggi bejana bagian dalam. Rak
digunakan sebagai penyangga bak pelarut dan batang kaca antisifon, yang menahan kertas
kromatografi.
Satu atau lebih bak pelarut terbuat dari kaca, yang dapat menampung sejumlah pelarut lebih
dari yang diperlukan untuk satu kali kromatografi. Panjang bak pelarut harus lebih lebar dari
kertas kromatografi.
Batang kaca antisifon, yang disangga oleh rak, letaknya di luar sejajar dengan dan sedikit
lebih tinggi dengan tepi bak pelarut.
Kertas kromatografi, berupa kertas saring khusus, dengan lebar tidak kurang dari 2,5 cm,
tidak lebih lebar dari panjang bak pelarut dan dipotong lebih kurang sama dengan tinggi bejana.
Dibuat garis tipis dengan pensil melintang pada kertas 'pada jarak tertentu dari salah satu ujung
kertas, hingga jika kertas digantung pada batang kaca antisifon, dengan ujung atas di dalam bak
pelarut dan ujung bawahnya tergantung bebas dalam bejana, garis tersebut terletak beberapa cm
di bawah batang kaca antisifon. Usaha-kan agar kertas tidak terkontaminasi dan tidak kotor.
Prosedur Zat dilarutkan dalam pelarut yang sesuai. Sejumlah volume larutan zat yang
umumnya mengandung I µg hingga 20 µg ditotolkan dengan pipet mikro pada titik-titik tertentu
pada garis pensil, diameter bercak 6 mm hingga 10 mm dengan jarak antar bercak tidak kurang
dari 3 cm. Jika jumlah larutan yang ditotolkan akan menghasilkan bercak dengan diameter
melebihi 6 mm hingga 10 mm; totolkan larutan sedikit demi sedikit pada titik yang sama, tiap
kali biarkan mengering dahulu sebelum ditotolkan lagi.
Kertas tersebut digantung dalam bejana dengan menggunakan batang kaca antisifon yang
menahan ujung alas kertas dalam hak pelarut. Dasar bejana digenangi dengan sistem pelarut
yang ditetapkan. Penjenuhan bejana dapat dipercepat dengan cara melapis dinding bagian dalam
bejana dengan kertas saring yang dibasahi dengan sistem pelarut yang ditetapkan. Bagian kertas
yang tergantung di bawah batang kaca antisifon harus tergantung bebas di dalam bejana tanpa
menyentuh rak, dinding bejana atau cairan yang terdapat dalam bejana. Bejana ditutup rapat,
agar terjadi penjenuhan bejana dan kertas dengan uap pelarut. Jika perlu, tekanan dalam yang
berlebihan dikurangi. Untuk bejana berukuran besar, mungkin perlu dilakukan penjenuhan
selama satu malam.
Sejumlah fase gerak dengan volume lebih dari yang diperlukan untuk kromatografi
dijenuhkan dengan fase diam dengan cara pengocokan. Setelah jenuh, fase gerak dimasukkan ke
dalam bak pelarut melalui lubang. Lubang ditutup dan fase gerak dibiarkan merambat turun pada
kertas sejauh yang dikehendaki. Pada waktu membuka tutup bejana dan mengangkat kertas,
usahakan agar pelarut tidakmerambat lagi. Batas rambat pelarut segera ditandai dan kertas
dikeringkan.
Kromatogram diamati dan diukur langsung atau setelah disemprot dengan pereaksi yang
sesuai untuk menampakkan letak bercak obat yang telah terpisah. Bagian kertas yang telah
ditentukan mengandung obat yang telah terpisah dapat digunting dan dieluasi dengan pelarut
yang sesuai, dan dibuat larutan mencapai volume tertentu untuk analisis secara kuantitatif
dengan teknik kimia atau instrumen yang sesuai. Prosedur yang sama dapat dilakukan dengan
berbagai kadar baku pembanding yang ditotolkan pada kertas yang sama dengan rentang kadar
yang sesuai untuk membuat kurva kalibrasi yang absah.
KROMATOGRAFI MENAIK
Pada kromatografi menaik, ujung bawah kertas dicelupkan ke dalam fase gerak, sehingga
memungkinkan fase gerak merambat naik pada kertas oleh gaya kapiler.
Alat Alat yang digunakan pada dasarnya sama dengan peralatan yang diuraikan pada
Kromatografi menurun.
Prosedur Larutan uji ditotolkan pada kertas dengan cara seperti yang tertera pada
Kromatografi menurun, di atas batas kertas yang tercelup dalam fase gerak. Dasar bejana
digenangi dengan sistem pelarut untuk eluasi. Jika digunakan sistem dua fase, maka kedua fase
tersebut ditambahkan. Sebaiknya dinding bagian dalam bejana dilapisi dengan kertas saring dan
lapisan kertas ini dijenuhkan dengan sistem pelarut. Bak pelarut kosong ditempatkan pada dasar
bejana dan kertas digantung dan sedemikian hingga bagian ujung kertas yang telah ditotolkan
tergantung bebas di dalam bak pelarut kosong.
Bejana ditutup rapat dan dijenuhkan menurut cara yang tertera pada Kromatografi menurun.
Kemudian fase gerak dengan jumlah berlebih dari yang diperlukan untuk membasahi seluruh
kertas dituangkan ke dalam bak pelarut melalui lubang. Bejana kemudian ditutup lagi. Jika batas
perambatan pelarut telah mencapai ketinggian yang dikehendaki, bejana dibuka, kertas
dikeluarkan dan dikeringkan.
Analisis kuantitatif bercak dapat dilakukan menurut cara yang tertera pada Kromatografi
menurun.
1. KROMATOGRAFI KERTAS.

Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua cairan
yang sating tidak bercampur. Kromatografi kertas berbeda dengan ekstraksi yang menggunakan
corong pemisah yang sudah diterangkan terdahulu adalah bahwa fase bawah berupa air atau
pelarut yang mengandung air terikat secara stasioner pada selulosa kertas. Jadi partisi suatu
senyawa terjadi antara kompleks selulosa-air dan fase mobil yang melewatinya berupa pelarut
organik yang sudah dijenuhkan dengan air atau campuran pelarut.
Jika kromatografi kertas terutama merupakan kromatografi partisi, maka tidak dapat
diabaikan bahwa proses adsorpsi juga terjadinya tergantung dari jenis pelarut yang digunakan
dan sifat kertas kromatografi.
Kertas kromatografi terdiri dari selulosa murni dengan serabut panjang,, yang dalam
keadaan menggelembung bersama-sama dengan air atau pelarut yang mengandung air
merupakan fase stasioner atau melalui impregnasi dengan' senyawa lipofil dapat bertindak
sebagai bahwa pengemban Dilihat dari sifat selulosa maka kemurnian, kehomogenan,
kemampuan menyerap dan mekanik ketangguhan' merupakan faktor yang menentukan.
Kapasitas dan lamanya kromatografi tergantung dari ketebalan dan kemampuan menyerap
atau kemampuan menggelembung kertas. Antara kecepatan migrasi dan ketajaman pemisahan
terdapat hubungan. Kertas yang melewatkan dengan cepat; umumnya memisahkan lebih baik.
Dalam perdagangan terdapat berbagai kertas kromatografi dengan sifat yang sudah tertentu.
Yang berbeda adalah kecepatan migrasi, kemampuan memisahkan dan mekanik ketangguhan.
Umumnya arah migrasi ditunjukkan dengan punah pada tepi dasar. Jika tidak deniikian,
biasanya dilakukan pada arah panjang lembar kertas. Besarnya lembar kertas tergantung dari
bejana pengembangan dan juga dari beberapa noda senyawa yang akan ditotolkan. Sifat dapat
memisahkan kertas dapat diubah dengan impregnasi. Impregnasi dapat dilakukan dengan
mencelup atau mengembangkan dengan suatu larutan tertentu atau dengan penyemprotan.
Pengubahan sifat dapat memisahkan dapat juga diperoleh dengan penyiapan kertas
kromatografi misalnya melalui asetilasi selulosa. Untuk pemisahan tertentu digunakan kertas
terasetilasi terfosforitasi atau terformilasi. Untuk kromatografi fase balik, kertas dalam
perdagangan diimpregnasi dengan zat lipofil seperti parafin cair; parafin, vaselin atau undekan.
Sebelum suatu senyawa dikarakterisasi atau dipisahkan secara kromatograf kertas, pertama-tama
harus ditotolkan. Untuk itu senyawa dilarutkan dalam pelarut sesuai dan ditotolkan dengan pipet
ukur berskala (pipet gula darah, pipet kapiler yang dapat terisi sendiri, pipet konstriksi dan
semprotan mikro) sebagai bentuk titik atau bentuk garis. Hasil yang terbaik akan diperoleh
dengan alat penotol automatik. Konsentrasi larutan yang hendak ditotolkan haruslah antara 1
sampai 5%. Untuk penotolan berbentuk titik dibutuhkan volume 1 sampai 10 μl.
Ketajaman pemisahan tergantung dari noda awal. Makin kecil noda ini dapat diperoleh,
makin besar ketajaman pemisahan. Makin mudah menguap pelarut yang ,digunakan untuk
penotolan, makin kecil diameter noda. Untuk menguapkan pelarut larutan uji yang ditotolkan
jika perlu digunakan kipas. Sebelum senyawa yang hendak dipisahkan ditotolkan, untuk garis
awal ditandai dengan garis menggunakan pensil dan pada garis ini ditandai masing-masing titik
awal.
Untuk kromatografi menurun garis awal dibuat dengan jarak 15 cm dari tepi kertas. Untuk
kromatografi menaik jarak ini diukur 4 sampai 5 cm. Jarak noda awal masing-masing satu antara
lain sebaiknya 1 sampai 3 cm.
Proses kromatografi disebut pengembangan. Pada kromatografi kertas dibedakan 3 jenis
pengembangan:
− Kromatografi menaik,
− Kromatografi menurun,
− Kromatografi horizontal.
Untuk kromatografi menaik lembar kromatografi digantung ke dalam "tahang" yang berisi
fase mobil atau lembar kertas dibentuk silinder dengan bantuan penjepit sintetik dan dipasang
pada tahang yang sudah disediakan.
Untuk kromatografi menurun lembar kertas digantung dengan ujung atas kedalam palung
yang berisi fase mobil.
Untuk kromatografi horizontal atau untuk pengembangan kromatografi melingkar dibutuhkan
cawan petri yang sama besarnya dengan tepi ditangkupkan satu sama lain sebagai bejana
pengembang. Pelarut pengembang dialirkan dari bawah dengan bantuan kapiler kertas atau
sumbu kapas pada titik pusat kromatogram atau dari atas dengan melubangi, diteteskan dengan
bantuan pipet yang sesuai.
Untuk pelaksanaan pengembangan dibutuhkan bejana pemisahan. Bejana ini merupakan
bejana kering yang tertutup rapat dan mempunyai besar dan bentuk berbeda. Sebelum memulai
proses pengembangan pada dasar bejana pengembangan ditambahkan sedikit pelarut
pengembang dan sedikit air dan harus dijaga agar kertas kromatografi tidak langsung dibasahi.
Setelah bejana pengembangan ditutup dengan hati-hati, kertas kromatografi dibiarkan dalam
keadaan ini 2 sampai 3 jam sampai terjadi kesetimbangan atau klimatisasi. Dengan demikian
akan tercapai suatu keadaan jenuh yang tergantung pada sistem dan derajat penggelembungan.
Selanjutnya untuk memulai pengembangan, dalam cawan yang ada dasar yang di dalamnya;
terdapat kertas kromatografi atau dimana terdapat silinder kromatografi, diisikan pelarut
pengembang sejumlah tertentu hingga kertas tercelup kira-kira 5 cm. Pada kromatografi menurun
dengan cara yang sesuai palung kromatografi diisi dengan pelarut pengembang. Jika pada
kromatografi menaik tepi muka pelarut telah berjarak 3 sampai 5 cm dan tepi kertas sebelah atas
dan pada kromatografi menurun dengan ukuran sama dari tepi bawah kertas, maka kertas
dikeluarkan dari bejana pengembangan kemudian tepi muka pelarut diberi tanda garis dengan
pensil. Kemudian kertas kromatografi dikeringkan dalam rak pengering atau dengan bantuan
kipas. Jika pada pengembangan pertama tidak tercapai pemisahan yang memuaskan, maka dapat
dilakukan kromatografi dua dimensi. Untuk itu setelah dikeringkan, kertas dikembangkan sekali
lagi dengan arah 90° dari arah pertama. Pada senyawa yang bermigrasi tidak baik, kromatogram
dapat diselesaikan dengan bantuan kromatografi menurun. Kromatogram lewat diperoleh jika
pelarut dibiarkan bermigrasi beberapa hari, yaitu kromatografi tidak dihentikan jika tepi muka
pelarut pengembang sampai pada akhir lembar kertas. Dengan demikian harga Rf tidak dapat
lagi ditentukan. Untuk identifikasi, senyawa pembanding dengan sifat diketahui harus juga
ditotolkan dan dikembangkan bersama.
Pemilihan pelarut pengembang diarahkan pada fase stasioner dan diorientasikan pada
deretan eluotrop. Pelarut pengembang yang sesuai harus mempunyai sifat fisiko-kimia meliput
sifat akseptor - donor, gaya dipol, gaya dispersi, gaya koordinasi serta mempunyai kemampuan
rnengikat ion cuplikan yang hendak dipisahkan. Orientasi cepat mengenai efek pemisahan suatu
pelarut yang dipilih dapat diberikan oleh apa yang dinamakan teknik mikrosirkular. Untuk itu
campuran senyawa yang hendak dipisahkan ditotolkan pada kertas dalam bentuk titik. Jika fase
mobil diteteskan secara sentral dari suatu pipet maka dapat diperkirakan apakah pelarut yang
dipilih itu sesuai atau tidak. pelarut pengembang optimal telah terpilih jika menunjukkan banyak
cincin koaksial yang terpisah baik. Jika senyawa bermigrasi dalam daerah tepi muka, maka
pelarut pengembang adalah polar. Jika senyawa tinggal dekat titik awal, maka polaritas pelarut
pengembang adalah rendah.
Deteksi. Pada senyawa yang mempunyai warna sendiri, maka penyelesaian kromatogram
pasti dapat dilakukan secara visual. senyawa yang tidak berwarna harus dibuat tampak dengan
prosedur identifikasi sesuai (deteksi). Prosedur identifikasi fisika yang sering digunakan adalah
eksitasi fluoresensi. Dengan demikian senyawa dengan kromofor sesuai dapat ditunjukkan
dengan fluoresensi karakteristik dengan menyinarinya dengan cahaya UV gelombang pendek
254 nm) atau gelombang panjang (365 nm). Jika dihadapkan pada senyawa yang menyerap
cahaya pada panjang gelombang 254 nm, maka berkurangnya fluoresensi atau pemadaman
fluorosensi indikator fluoresensi yang ditambahkan pada fase stasi-oner dapat digunakan untuk
deteksi. Tergantung dari indikator flourosensi akan terjadi noda gelap dengan latar belakang
berfluoresensi. Yang paling sering digunakan adalah prosedur identifikasi kimia. Untuk itu
kromatogram diletakkan dalam atmosfer gas yang sesuai (uap amonia, iod, osmiumtetraoksida)
atau disemprot dengan larutan pereaksi sesuai. Penyelesaian kualitatif kromatogram dilakukan
secara visual langsung dengan pengukuran dan perhitungan harga Rf atau dibandingkan dengan
senyawa yang diketahui.
Untuk penyelesaian kuantitatif dapat dibedakan dua prosedur yaitu tidak langsung dan
langsung. Jika senyawa yang hendak ditentukan untuk pengukuran kuantitatif diekstraksi dari
fase stasioner, maka dinamakan metode penentuan tidak langsung. Untuk penentuan jumlah
dapat dipilih metode di bawah ini:
– Mikrotitrimetri,
– Pengukuran dalam daerah sinar tampak dan UV,
− Pengukuran refraksi,
— Penentuan polarografi,
— Pengukuran fluorimetri.

Penentuan kuantitatif langsung mungkin dilakukan melalui pembandingan luas secara visual
masing-masing noda dengan menggunakan planimetri, dengan densitometri, dengan spektrofoto-
metri, dengan pengukuran.fluoresensi atau penentuan radioaktivitas pada penggunaan senyawa
yang dicacah.
Kromatografi kertas, yang pada pelaksanaannya rumit dan lebih lama dibandingkan
kromatografi lapis tipis, sekarang terutama digunakan untuk pemisahan golongan senyawa
sangat hidrofil, dan kromatografi lapis tipis tidak dapat digunakan. Golongan zat itu adalah:
— Gula,
— Alkohol bervalensi banyak;
— Asam alfa amino,
— Fenol dan asam fenilkarboksilat,
— Asam organik alifatik,
− Glikosida,
– Zat anorganik (kation).
 1.3.2 Kromatografi kertas
Satu keuntungan utama KKt ialah kemudahan dan kesederhanaannya pada pelaksanaan
pemisahan, yaitu hanya pada lembaran kertas saring yang berlaku sebagai medium pemisahan
dan juga sebagai penyangga. Keuntungan lain ialah keterulangan bilangan RF yang besar pada
kertas sehingga pengukuran RF merupakan parameter yang berharga dalam memaparkan
senyawa tumbuhan baru. Memang, untuk senyawa antosianin yang tidak mempunyai ciri fisika
lain yang jelas, RF adalah sarana terpenting dalam memaparkan dan membedakan pigmen yang
satu dengan pigmen yang lain (Harborne, 1967).
Kromatografi pada kertas biasanya melibatkan kromatografi pembagian atau penjerapan.
Pada kromatografi pembagian, senyawa terbagi dalam pelarut alkohol yang sebagian besar tidak
bercampur dengan air (misalnya n-butanol) dan dalam air. Campuran pelarut klasik yaitu n-
butanol—asam asetat—air (4 : 1 : 5, lapisan atas) (disingkat BAA), memang dirancang sebagai
sarana untuk meningkatkan kadar air lapisan n-butanol dan dengan demikian memperbaiki
manfaat campuran pelarut tersebut. Memang, BAA masih tetap dipakai secara luas sebagai
pengembang umum untuk banyak golongan kandungan tumbuhan. Sebaliknya, gaya jerap
merupakan salah satu ciri utama KKt dalam pengembang air. Air murni ialah pengembang
kromatografi yang sungguh-sungguh serba guna dan dapat digunakan untuk memisahkan purina
dan pirimidina biasa, dan secara umum dapat dipakai juga untuk senyawa fenol dan glikosida
tumbuhan.
Pemilihan radas untuk KKt, sampai batas tertentu, bergantung pada luas ruang laboratorium
yang tersedia. Misalnya, KKt datar dan lingkar memerlukan tempat yang sedikit lebih luas
daripada bejana KLT baku. Daya pisah kromatografi kertas betul-betul baik dan digunakan,
misalnya, untuk memisahkan karotenoid. Di kebanyakan laboratorium, KKt dilakukan dengan
cara menurun dalam sebuah bejana yang dapat menampung kertas Whatman berukuran 46 X 57
cm. KKt menurun adalah yang paling berguna karena pengembang dapat dengan lebih mudah
dibiarkan lewat ujung bila diperlukan. Cara ini juga sedikit lebih mudah untuk pemisahan dua
arah.
Untuk mencapai pemisahan dengan teknik kromatografi tertentu, dalam perdagangan tersedia
berbagai jenis kertas saring yang sudah dimodifikasi. Misalnya, sifat polar selulosa dapat
dikurangi dengan memadukan asam silikat atau alumina ke dalam kertas sehingga lebih cocok
untuk memisahkan lipid. Kertas dapat dimodifikasi juga di laboratorium, misalnya dengan
merendamnya dalam parafin atau minyak silikon agar dapat digunakan untuk kromatografi fase-
balik, juga untuk lipid. Untuk pemisahan skala besar dapat dibeli lembaran kertas saring
kromatografi yang tebal (Whatman no. 3 atau 3MM), dan kertas semacam ini dapat menampung
beberapa mg senyawa per lembar. Pada KKt, senyawa biasanya dideteksi sebagai bercak ber-
warna atau bercak berfluoresensi - UV setelah dircaksikan dengan pereaksi kromogenik yang
digunakan sebagai pereaksi semprot atau pereaksi celup. Untuk lembaran besar, pencelupan
biasanya lebih mudah tetapi susunan pereaksi semprot harus diubah agar mudah kering, dan
dengan demikian mencegah difusi waktu pencelupan. Selanjutnya kertas dapat dipanaskan untuk
menimbulkan warna.
Bilangan RF adalah jarak yang ditempuh senyawa pada kromatografi, nisbi terhadap garis
depan. Bilangan RF diperoleh dengan mengukur jarak antara titik awal dan pusat bercak yang
dihasilkan senyawa, dan jarak ini kemudian dibagi dengan jarak antara titik awal dan garis depan
(yaitu jarak yang ditempuh cairan pengembang). Bilangan ini selalu berupa pecahan dan terletak
antara 0,01 dan 0,99. Akan lebih mudah bila bilangan tersebut dikalikan 100, dan bilangan RF
dalam buku ini dinyatakan sebagai RF (X100). Kadang-kadang RF (X100) dinyatakan sebagai
hRF.
Bila kita membandingkan bilangan RF dari suatu deret senyawa yang strukturnya berkaitan,
ada manfaatnya bila kita memperhatikan tetapan kromatografi lain, yaitu bilangan RM . Kaitan
antara RM dan RF dinyatakan dalam persamaan:
RM =log( -1) RF
Menghubungkan gerakan kromatografi dengan struktur kimia ada faedahnya karena bilangan
Δ RM dalam deret homolog biasanya tetap. Jadi, pada senyawa flavonoid, Δ RM tetap untuk
sejumlah substitusi hidroksil dan glikosil yang ada dalam molekul (Bate-Smith dan Westall,
1956). Prosedur ini dapat digunakan untuk menghitung bilangan RF dari senyawa anggota yang
belum diketahui dalam suatu deret senyawa untuk mempermudah pencarian senyawa tertentu
dalam ekstrak tumbuhan. Prosedur yang demikian digunakan, misalnya, dalam pencirian
(karakterisasi) eter metil kemferol yang baru. Ternyata bilangan RF yang dihitung dan RF yang
sebenarnya sangat bersesuaian (tabel 1.1) (Harborne, 1969).
Di antara pustaka yang sangat banyak, yang membahas KKt, ada satu pengantar yang
berguna yang ditulis untuk pemula, yaitu buku karangan Peereboom (1971). Buku mengenai KKt
yang bernilai, terutama sebagai sumber data RF, ialah buku karangan Lederer dan Lederer
(1957), Linskens (1959), serta Sherma dan Zweig (1971).
13.5 Teknik Kromatografi Kertas
Proses pengeluaran asam mineral dari kertas disebut desalting. Larutan ditempatkan
pada kertas dengan menggunakan mikropipet pada jarak 2-3 cm dari salah satu ujung
kertas dalam bentuk coretan garis horizontal. Setelah kertas dikeringkan, ia diletakkan
di dalam ruang yang sudah dijenuhkan dengan air atau dengan pelarut yang sesuai.
Penjenuhan dapat dilakukan 24 jam sebelum analisis. Terdapat tiga teknik pelaksanaan
analisis. Descending adalah salah satu teknik di mana cairan dibiarkan bergerak
menuruni kertas akibat gravitasi. Pada teknik ascending; pelarut bergerak ke atas dengan
gaya kapiler. Nilai R f harus sama baik pada descending maupun ascending. Sedangkan
yang ketiga dikenal sebagai cara radial atau kromatografi kertas sirkuler. Kondisi-kondisi
berikut harus diperhatikan untuk memperoleh nilai R f yang reprodusibel. Temperatur
harus dikendalikan dalam variasi tidak boleh lebih dari 0,5°C. Kertas harus
didiamkan dahulu paling tidak 24 jam dengan atmosfer pelarutnya, agar mencapai
kesetimbangan sebelum pengaliran pelarutnya pada kertas. Dilakukan beberapa
pengerjaan yang paralel, Rf nya tidak boleh berbeda lebih dari ± 0,02.
Suatu atomiser umumnya digunakan sebagai reagent penyemprot bila batas
permukaan pelarut dan zat terlarut dalam kertas ingin dibuat dapat dilihat. Atomiser
yang harus lebih disukai. Gas-gas juga dapat digunakan sebagai penanda bercak.
Untuk karbohidrat notasi R G digunakan untuk menggantikan R f . Setelah penandaan
bercak atau batas permukaan, selanjutnya dapat dilakukan analisis kolorimetri atau
spektroskopi reflektansi bila sampel berupa logam. Materi yang terdapat di dalam
kertas dapat ditentukan secara langsung dengan pelarutan. Kromatografi kertas selain
untuk pemisahan dan analisis kuantitatif, juga sangat bermanfaat untuk identifikasi.
Hal ini dapat dilakukan misalkan dengan membuat grafik antara RM α terhadap jumlah
kation dalam suatu deret homolog, maka memungkinkan untuk mengidentifiksi suatu
anggota deret homolog.
 Kromatografi Kertas
Dalam tahun 1944, lagi-lagi dari laboratorium Martin, dilaporkan pemisahan suatu campuran
asam amino dengan menggunakan kromatografi kertas. Dalam teknik ini sedikit larutan contoh
diteteskan pada satu ujung pita kertas saring dan noda itu dibiarkan mengering (meniupnya
dengan pengering rambut cukup nyaman). Ujung kertas saring itu kemudian dicelupkan ke
dalam pelarut yang sesuai yang berada dalam bejana dan seluruh sistem berada dalam bilik
tertutup. Dalam kromatografi kertas naik, yang tampak dalam Gambar 18.13, kertas itu
digantung pada bagian atas bilik sehingga tercelup ke dalam pelarut pada dasar bilik, dan pelarut
itu akan merayap naik sepanjang kertas karena kapilaritas. Dalam bentuk turun, kertas dikaitkan
dalam cawan (trough) pelarut pada bagian atas bilik dan dibiarkan menggelantung ke bawah;
pelarut akan bermigrasi ke bawah berkat kapilaritas dan dibantu gaya berat. Setelah garis depan
pelarut bergerak menjalani hampir sepanjang pita kertas itu, pita itu diambil, dikeringkan dan
diperiksa. Dalam kasus yang sukses, zat-zat terlarut dari dalam campuran asli akan ikut
bermigrasi sepanjang kertas pada laju yang berbeda, sehingga ter-bentuk sederet noda yang
terpisah. Jika senyawaan-senyawaan itu berwarna, tentu saja noda-noda itu akan tampak. Jika
tidak mereka harus ditemukan dengan sesuatu cara lain. Beberapa senyawa berpendar, dalam hal
ini dapat terlihat noda-noda yang membara bila kertas itu ditaruh di bawah lampu ultraviolet.
Untuk asam-asam amino, kertas itu biasanya disemprot dengan larutan ninhidrin, suatu reagensia
yang bereaksi dengan gugus amino untuk menghasilkan senyawa ungu. Untuk analisis kualitatif,
noda-noda itu bisa digunting bersama kertas saringnya, zat-zat terlarut dilarutkan dan dalam
kertas dengan pelarut yang tepat, dan larutan-larutannya diperiksa dengan teknik yang sesuai,
seringkali adalah spektrofotometri
Untuk maksud identifikasi, noda-noda sering dicirikan oleh nilai - Rfnya. Nilai-R f ialah
perbandingan angka jarak berpindah zat terlatur itu dan jarak berpindahnya garis depan pelarut
pada waktu yang sama. Nilai-nilai Rf yang identik untuk senyawa yang diketahui dan yang tidak
diketahui, dengan menggunakan sistem-sistem pelarut yang berlainan, akan merupakan bukti
yang cukup kuat bahwa keduanya identik, terutama jika mereka dijalankan bersama-sama
sepanjang satu pita kertas.
Kadang-kadang terjadi bahwa semua komponen suatu contoh talc dapat dipisahkan dengan
menggunakan satu sistem pelarut apapun; beberapa komponen berpisah dengan lebih baik dalam
satu sistem, beberapa dalam sistem yang lain. Maka dapatlah digunakan kromatografi kertas dua
dimensi. Contoh itu ditotalkan di dekat satu sudut lembar kertas saring bujur sangkar. Setelah
migrasi zat-zat terlarut paralel dengan satu sisi kertas dengan menggunakan satu sistem pelarut,
kertas itu diputar 90 dan suatu sistem pelarut kedua mengangkut zat-zat terlarut ke dalam bagian
kertas yang belum dipakai Pola noda-noda yang disemprot dengan ninhidrin yang dihasilkan dari
penerapan teknik ini pada asam-asam amino dalam hidrolisat protein seringkali disebut "sidik
jari'' protein itu. (Lihat Gambar 18.14.)
Pada awalnya kromatografi dianggap semata-mata sebagai suatu bentuk partisi cairan-cairan.
Serat selulosa yang hidrofilik dan kertas itu dapat mengikat air; setelah disingkap ke udara yang
lembap, kertas saring yang tampak kering itu sebenarnya dapat mengandung air dengan
persentase tinggi, katakan 20% (bobot/bobot) atau lebih. Jadi kertas itu dipandang sebagai analog
dengan sebatang kolom yang berisi fase stasioner berair. Zat-zat terlarut itu kemudian
dipartisikan antara air ini dan pelarut organik yang bergerak dan tak dapat campur dengan air.
Tetapi, segera disadari bahwa model ini terlalu sederhana. Pemisahan diperoleh padahal fase
geraknya dapat campur dengan air atau dalam beberapa kasus malahan fase geraknya adalah
larutan air itu sendiri. Jadi meskipun partisi cairan-cairan mungkin memang memainkan peranan
dalam beberapa kasus, seringkali mekanisme kromatografi kertas lebih rumit daripada itu.
Antaraksi antara zat terlarut dan penopang selulosa agaknya terlibat, misalnya, adsorpsi dan
pengikatan hidrogen. Gugus karboksil dan yang dapat terionkan lainnya dimasukkan ke dalam
kerangka selulosa selama operasi pembuatan bubur kayu dan pengelantangan dalam pembikinan
kertas, dan karena itu kertas itu dapat juga bertindak sebagai penukar ion.
 B. KROMATOGRAFI KERTAS

Pada kromatografi kertas sebagai penyerap digunakan sehelai kertas dengan susunan
serabut dan tebal yang cocok. Pemisahan dapat dilakukan menggunakan pelarut tunggal
dengan proses yang analog dengan kromatografi penyerapan atau menggunakan dua pelarut
yang tidak dapat bercampur dengan proses yang analog dengan kromatografi pembagian.
Pada kromatografi pembagian, fase bergerak merambat perlahan-lahan melalui fase tidak
bergerak yang membungkus serabut kertas atau yang membentuk kompleks dengan serabut
kertas. Perbandingan jarak perambatan suatu suatu zat terhadap jarak perambatan fase
bergerak dihitung dari titik penetesan larutan zat, dinyatakan sebagai Rf zat tersebut.
Perbandingan jarak perambatan suatu zat dengan jarak perambatan zat pembanding kimia
dinyatakan sebagai Rf.

Penggunaan zat pembanding kimia pada percobaan identifikasi. Harga Rf mutlak sukar
ditetapkan, karena harga R f yang diperoleh tergantung dari kondisi percobaan. Harga R f
tersebut sangat berguna untuk identifikasi pendahuluan zat kimia. Identifikasi pemastian
dilakukan dengan menggunakan zat pembanding kimia.

Dalam hal ini dibuat 3 kromatogram pada sehelai kertas; pertama dari zat yang diperiksa,
kedua dari zat pembanding kimia dan ketiga dari campuran zat yang diperiksa dengan zat
pembanding kimia dengan jumlah yang lebih kurang sama. Untuk masing-masing
kromatogram digunakan sejumlah zat yang bobotnya lebih kurang sama. Jika zat yang
diperiksa sama dengan zat pembanding kimia, maka ketiga kromatogram memberikan
warna dan mempunyai harga Rf yang sama, dan kromatogram campuran memberikan
bercak tunggal (Rf = 1,0).

Letak bercak.

Letak bercak yang diperoleh dari zat yang dikromatografi dapat ditetapkan dengan cara
berikut:
1. Pengamatan langsung. jika zat tampak dengan cahaya biasa atau dengan sinar
ultraviolet.
2. Pengamatan dengan cahaya biasa atau dengan sinar ultraviolet setelah kertas
disemprot dengan pereaksi yang dapat memberikan warna pada bercak.
3. Menggunakan pencacah Geiger-Muller atau otoradiografik, jika ada zat radioaktif.
4. Menempatkan pita atau potongan kertas pada medium perbiakan yang telah ditanami,
untuk melihat hasil stimulasi atau hambatan dari pertumbuhan bakteri.

Kromatografi kertas menurun. Pemisahan zat dengan cara kromatografi kertas menurun
dilakukan dengan membiarkan fase bergerak merambat turun pada kertas kromatografi.

Alat.

Bejana kromatografi. Bejana bertutup kedap uap yang mempunyai lubang untuk
penambahan pelarut atau untuk pengurangan tekanan dalam. Bejana sebaiknya terbuat dari
kaca, baja tahan karat a t au. porselen dan bentuknya sedemikian rupa sehingga pengamatan
selama kromatografi dapat dilakukan tanpa membuka tutup bejana. Silinder kaca yang
tinggi dapat digunakan jika dapat ditutup hingga kedap uap dengan tutup yang cocok
dengan pertolongan lemak penutup.

Rak tahan korosi. Tinggi rak 5 cm kurang dari tinggi bejana bagian dalam. Rak digunakan
sebagai penyangga bak pelarut dan batang kaca antisifon.
Bak pelarut. Satu atau lebih bak pelarut terbuat dari kaca, dapat diisi dengan sejumlah
volume pelarut lebih besar dari pada yang diperlukan. Panjang bak pelarut harus lebih
besar dari lebar kertas kromatografi.

Batang kaca antisifon. Disangga oleh rak. letaknya diluar sejajar dengan tepi bak pelarut
dan sedikit lebih tinggi. Batang tersebut digunakan sebagai penahan kertas kromatografi.

Kertas kromatografi. Digunakan kertas saring tertentu yang panjangnya lebih kurang sama
dengan tinggi bejana. Lebar kertas tidak kurang dari 2,5 cm tetapi tidak lebih lebar dari
panjang bak pelarut. Buat garis tipis dengan pensil melintang pada kertas pada salah satu
ujung kertas sedemikian rupa. hingga jika kertas digantungkan pada batang kaca antisifon
dengan salah satu ujungnya dalam bak pelarut dan ujun g lain tergantung bebas, garis ter-
sebut terletak beberapa cm di bawah batang kaca antisifon. Usahakan agar kertas tidak
terkena kotoran.

Cara kerja

Cara I. Zat yang diperiksa dilarutkan dalam pelarut yang cocok. Sejumlah volume larutan
zat yang diperiksa umumnya mengandung 1 mcg sampai 20 mg, teteskan pada titik-titik
tertentu pada garis pensil, garis tengah fetesan 6 mm sampai 10 min dengan jarak masing-
masing tidak kurang dan 3 cm. Jika jumlah larutan yang diteteskan akan menghasilkan
tetesan dengan garis tengah lebih besar dan 10 mm, teteskan larutan sedikit demi sedikit
pada titik yang sama, tiap kali dibiarkan mengering dahulu sebelum ditetesi lagi. Kertas
digantungkan di dalam bejana dengan menggunakan batang kaca antisifon dan batang kaca
tebal lain yang dapat menahan ujung atas kertas di dalam bak pelarut. Dasar bejana
digenangi dengan fase tidak bergerak yang tertera pada masing-masing monografi. Bagian
kertas yang tergantung dibawah batang kaca antisifon harus tergantung bebas di dalam
bejana tanpa menyinggung rak, dinding bejana atau cairan yang terdapat dalam bejana.
Bejana ditutup sehingga bejana dan kertas jenuh dengan uap pelarut. Jika perlu tekanan
dalam yang berlebihan dikurangi. Penjenuhan bejana yang berukuran besar jika perlu
dilakukan selama 1 malam. Sejumlah fase bergerak dengan volume yang cukup untuk
kromatografi, jenuhkan dengan fase tidak bergerak dengan cara pengocokan. Setelah
penjenuhan bejana, fase bergerak dimasukkan kedalam bak pelarut melalui lubang. Lubang
ditutup dan fase bergerak dibiarkan merambat turun pada kertas sejauh yang dikehendaki
Pada waktu membuka tutup bejana dan mengangkat kertas, usahakan agar pelarut tidak
merambat lagi. Batas perambatan pelarut segera ditandai dan kertas dikeringkan.
Kromatogram diamati dan diukur langsung atau setelah disemprot dengan pereaksi yang
cocok.

Cara II. Lakukan menurut cara yang tertera pada Cara I tetapi bejana dijenuhkan dengan
fase bergerak dan kertas telah diimpregnasikan dengan fase tidak bergerak.