PENERAPAN TEKNIK-TEKNIK KLONING GEN DALAM KEHIDUPAN MANUSIA MIZAWARTI,S.

SI Program Studi Biologi Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara I. Pendahuluan 1.1 Lahirnya Kloning Gen Kira-kira satu abat yang lalu Gregor Mandel telah merumuskan aturan-aturan untuk menerangkan pewarisan sifat-sifat biologis. Sifat-sifat organisme yang dapat diwariskan diatur oleh suatu faktor yang disebut gen, yaitu suatu partikel yang berada di suatu di dalam sel tepatnya di dalam kromosom. Gen menjadi dasar dalam pengembangan penelitian genetika meliputi pemetaan gen, menganalisis posisi gen pada kromosom. Hasil penelitian telah berkembang baik diketahuinya DNA sebagai material genetik beserta strukturnya, kode-kode genetik serta proses transkripsi dan translasi dapat dijabarkan. Suatu penelitian yang merupakan revolusi dalam Biologi medern adalah setelah munculnya metode teknologi DNA rekombinasi atau rekayasa genetika yang inti prosesnya adalah kloning gen yaitu suatu prosedur untuk memperoleh replika yang dapat sama dari sel atau organisme tunggal. II. Langkah-langkah dasar Kloning Gen Ada beberapa langkah dasar dalam Kloning Gen yaitu sebagai berikut : 1. Suatu frakmen DNA yang mengandung gen yang akan diklon diinsersikan pada molekul DNA sirkular yang di sebut sektor untuk menghasilkan chimoera atau molekul DNA rekombiner. 2. Vektor bertindak sebagai wahana yang membawa gen masuk kedalam sel tuan rumah ( host ) yang biasanya berupa bakteri, walaaupun sel-sel jenis lain dapat di gunakan. 3. Didalam sel host, vektor mengadakan replikasi menghasilkan banyak kopi atau turunan yang identik, baik vektornya sendiri maupun gen yang dibawanya. 4. Ketika sel host membelah, kopi molekul DNA rekombinasi diwariskan pada progeni dan terjadi replikasi vektor selanjutnya. 5. Setelah terjadi sejumlah besar pembelahan sel, maka dihasilkan koloni atau klonsel host yang identik Tiap-tiap sel dalam klon mengandung satu kopi atau lebih molekul DNA rekombinasi dengan demikian dikatakan bahwa gen yang dibawa oleh molekul rekombinasi telah diklon. III. Wahana dan ketrampilan dasar untuk Kloning Gen Komponen penting dalam eksperimen kloning gen adalah wahana yang membawa gen masuk sel tuan rumah dan bertanggung jawab atas replikasinya. Untuk dapat bertindak sebagai wahana suatu molekul DNA harus mampu memasuki

©2003 Digitized by USU digital library

1

tampaknya sebagai hasil dari enzim “ memutari sudut “ dan mulai mengkopi dirinya sendiri.1. adalah sama yang digunakan dalam laboratorium-laboratorium penelitian. merupakan molekul DNA sirkuler yang terdapat dalam bakteri dan berbagai organisme lain. Plasmid dapat melakukan replikasi dengan tidak tergantung pada kromosom sel tuan rumah. Pemotongan DNA murni 3. lalu disiapkan untuk disisipkan kedalam pBR 322. dengan jalan pemberi ekor dengan ©2003 Digitized by USU digital library 2 . yang disolasikan dari virus-virus tumor RNA tertentu dapat menggunakan RNA sebagai cetakan untuk mensintesis suatu untaian DNA. Enzim ini. Lingkaran tusuk konde itu mungkin merupakan suatu artefak ( sesuatu yang buatan ) ‘in vitro’ tetapi ia memang memberikan suatu primer yang sangat mudah untuk pembuatan untaian DNA yang kedua. terutama bakteriofog. IV. Ketrampilan dasar untuk melakukan kloning secara sederhana adalah : 1. Dua jenis molekul DNA alamiah yang memenuhi persyaratan tersebut adalah : 1. Preperasi sampel DNA murni 2. Hasil reaksinya adalah suatu hibrida RNA-DNA. Karena banyak protein yang bernilai komersil hanya terdapat dalam jumlah kecil dalam sel-sel dan jaringan hewan. Pengklonan c DNA Sebagian besar. dan kemudian DNA ini mengalami replikasi. Analisis ukuran fragmen DNA 4. Tehnik-tehnik Kloning Gen 2. cDNA ( DNA komplementer ) berantaian ganda yang dihasilkan mempunyai lingkaran tusuk konde yang utuh ini dapat dibelah oleh S1 nuklease. maka banyak pekerjaan komersial itu terpusat pada pengklonan c DNA dari mRNA-mRNA yang terdapat dalam jumlah sangat kecil didalam sel.sel tuan rumah serta dapat mengadakan replikasi untuk menghasilkan kopi dalam jumlah besar. metode-metode yang digunakan oleh perusahaanperusahaan pengklonan gen untuk memperoleh DNA rekombinan yang terdiri dari gen yang diinginkan dalam vektor ekspresi. dan karena ekspresi gen flon itu sangat penting. Krimosom virus. Molekul cDNA yang beruntaian ganda yang diperoleh dengan cara tersebut. yaitu suatu nuklease spesifik yang beruntaian tunggal. rantai tersebut berhibridasiasi ke ekor poli-A untuk memberikan suatu primer untuk aksinya enzim transfriptase balik. Memasukan molekul DNA ke dalam sel tuan rumah 6. namun sifat ini tidak berguna tanpa adanya tehnik-tehnik eksperimen untuk manipulasi molekul DNA di dalam laboratorium. untaian DNA yang baru itu mempunyai lingkaran tusuk konde pada ujungnya. Identifikasi sel yang mengandung molekul DNA rekombinasi. Molekul DNA plasmid dan bakteriofog mempunyai sifat-sifat dasar yang ditentukan sebagai wahana kloning. JIKa rantai-rantai pendek dari oligo –dT dicampur dengan mRNA. 2. adalah sintesis kimia dari suatu gen. Plasmid. poli-A itu memberikan jalan yang mudah untuk mensintesis suatu untaian DNA yang komplementer terhadap mRNA-nya. Pendekatan lain yang digunakan untuk memperoleh insulin manusia. Hampir setiap molekul mRNA eukariot pada ujung 3’-nya mempunyai rangkaian resedu nukleotida adenin yang disebut ekor poli-A. Apapun fungsinya. Penggolongan molekul DNA 5. yaitu virus yang harus menginfeksi bakteri pada waktu infeksi molekul DNA bakteriofog diinfeksikan ke dalam sel tuan rumah.

Hal ini dapat dideteksi dengan membiarkan ekoli terbuka bagi campuran molekul DNA rekombinan dan selanjutnya menabur selsel pada cawan fetri berisi agar. potongan “dari DNA” eukariotik yang ada pada plak tertentu merupakan kebetulan semata-mata. 2. yang sekarang mengandung ujung-ujung lekat yang dihasilkan oleh enzim tadi. Sel-sel bakteri itu mulai berkembang biak. coli “ yang sesuai dan dikembangbiakkan.terminal transferase atau dengan menambahkan tempat-tempat enzim restriksi buatan pada ujung-ujung cDNA-nya. membentuk selaput sel-sel dipermukaan agar. Walau setiap plak (plague) menghasilkan ikon unit molekul-molekul DNA rekombinan. yang dinamai ujung “lengket” karena mapu berpasangan basa dengan molekul DNA yang manapun mengandung ujung lengket pelengkap. Setiap kali hal ini terjadi ujung-ujung belahan filman ganda itu membaawa panjang tambahan emapt nukleotida. dimasukkan ke dalam strain “ E. turunan dikemas kedalam partikel-partikel berdaya tulang. Tempat-tempat restriksi ini yang kita sebut ‘penyambung” ( “linker”) adalah oligunekloitida-oligunekloitida dari 8 sampai 10 pasangan basa yang dibuat secara kimia. secara bercampur molekul-molekul DNA eukariotik akan menempel pada molekul-molekul DNA dengan ujung-ujung lengketnya masingmasing. DNA fag tersebut berlipat ganda berkali-kali. lalu penyambung-penyambung itu digunting hingga terbuka dengan enzim restriksi. Fragman-fragman ini tergabung pada DNA bakteriofag secara acak semata-mata. Pengklonan fragmen yang merupakan seluruh genam suatu organisme dinamakan pengklonan “senapan”. Gagasannya adalah memperlakukan kedua DNA eukariotik dan DNA bakteriopag dengan endonuklease retriksi yang sama sehingga tercipta ujung-ujung pelengkap pada masing-masing. Pencernaan semua DNA dalam sel-sel organisme eukariotik seperti mencit atau tikus oleh oleh endonuklease restriksi menghasilkan kumpulan fragman DNA yang sangat beragam. koli” . Begitu masuk dalam sel imangnya. dimasukkan ke dalam pBR 322 yang telah di belah dengan enzim yang sama. enzim ini membelah DNA hanya ditempat yang meliputi rangkaiannya. setiap sel yang secara berhasil diinfeksi oelh molekul-moleku DNA rekombinan akan membentuk banyak turunan baru DNA rekombinan tersebut sebelum dibunuh dan dilisis. Setiap utusan pilihan ganda itu dipotong diantara buangin dan adenin. dan proses itu diulang. DNA yang berpasangan (berhelai tunggal). Akan tetapi. Akibatnya segara nampak pada mata dengan mata telanjang sebagai zona atau plak sikular yang jernih pada “padang” sel-sel . menginfeksi sel-sel terdekat. dan cDNA-nya.2 Gen pengklonan : DNA rekombinan Bakteri merupakan mesin-mesin efesien untuk untuk menciptakan turunuan identik DNA bacterifogdalam jumlah. setiap plak merupakan suatu “flon” molekul-molekul DNA dan dapat diriakkan secara tak terbatas dengan meninfeksi lebih banyak sel ekoli. Beberapa dari hibrid atau molekul-molekul rekombinan ini akan tetap berdaya infeksi pada inang bakteriofognya (ekoli) sebagaimana bakteriofog yang normal. Molekul-molekul yang infektif dilepas. maka dapat direflikasi dengan cara yang sama sekali lagi endonukliase restriksi memungkinkan musliaht itu. Ekori adalah endonuklease resttriksi yang dihasilkan oleh “E. Kemudian plasmid rekombinan yang mengandung cDNA yang di hasilkan itu. Jika kita adapat menempelkan gen eukariotik kepada molekul DNA fag seperti itu.Penyambung-penyambung itu ditambahkan pada cDNA beruntaian ganda dengan menggunakan DNA ligase. Kemudian DNA ligase dapat dipakai untuk mengaitkan secara kovalen molekul-molekul itu bersama. baru dilepas dari sel inangnya sehingga siap mengulangi daur infeksitersebut. Dalam keadan yang sesusai. ©2003 Digitized by USU digital library 3 .

4 kb). DNA kromosom X.4. Maka terbukti kemungkinan untuk mengkon DNA dari individu kromosom.3.Kini masalahnya adalah salah satu temuan dari satu atau lebih plag (mungkin dari beberapa ribu ) yang mengandung gen edukariotik yang menarik perhatian kita. Untuk ini diperlukan suatu “tolok”. Pengklonan Onkogen Manusia sekarang ini 3 onkogen manusia yang diduga telah diklon dengan menggunakan teknik penyaringan alu dan teknik banntuan tRNA. Pengklonan Individu Kromosom karena sekarang terdapat kemungkinan untuk menyortir kromosomkromosom manusia secara fisik kedalam klas-klas ukurang yang terpisah dengan suatu prosedur yang dikenal sebagai sortasi sel yang teraktifasi fluoresens (FACS : fluoresende-activa-ted celsorting). Inilah prosedurnya. Karena plak-plak asal tidak menjadi rusak karena prosedur ini. Gen neuroblastoma sekarang juga telah diklon secara lengkap dengan menggunakan metode bantuan TRNA yang memperlihatkan gen mendekati 13. dan mancari gen-gen yang diketahui akan terbawa pada kromosom X tersebut. RNA pesuruh untuk rantai-rantai ini dapat diisolasi dari prekursor sel-sel darah merah kelinci. yaitu rangkaian DNA yang dari pada pesuruh-pesuruh hemoglobin ini ditranskripsi. genetik yang umum dan letal ini. memetakan tempat-tempat restriksi. Prosesnya mungkin tanpak rumit. Sebagaimana kita ketahui. Maka dari itu semua tehnik yang telah dilukiskan dari itu semua tehnik yang dilukiskan sebelumnya dapat digunakan untuk menganalisis DNA kromosom X. 2. Bersama-sama. mulai dengan suatu galur sel manusia dengan kariotip yang abnormal (empat kromosom X) terdapat kemungkinan mensortir cukup banyak kromosom X manusia yang bebas dari autosom untuk dapat membuat suatu perpustakaan fag X dari DNA kromosom X itu. Pesuruh-pesurh ini dapat diisolasi dari prekursor dan dapat diberi label isotop radio aktif dan digunakan untuk mencari plak-plak yang mengandung rangkaian DNA pelengkap. misalnya dapat ditunjukkan bahwa suatu pola tertentu dari tempat-tempat enzim restriksi terpaut erat pada distropi otot Duchenne dan tidak terdapat pada individu-individu normal. Maka inilah satu cara (namun bukan satu-satunya cara) untuk mencapai tujuan terdekatnya yaitu sampel murni suatu gen eukariotik. Beberapa dari DNA pada setiap plak diserap oleh kertas saring tadi. 2. jika tidak dapat dikatakan semua. tetapi sungguh sangat langsung dan akhirnya tujuan dapat diacapai. bahwa galur-galur sel yang dianggap berlainan ini mempunyai sumber yang sama. bahkan sebelum kita mengetahui gentermutasi dimana yang bertanggung jawab untuk hal itu. Misalnya. DNA yang terserat itu kemudian diubah sifatnya menjadi pelayan tunggal. sehelai kertas saring yang dibuat dari nitro selulosa secara perlahan ditekan pada permukaan lempengan agar yang berplak. Semua gen ini tampak sama (berukuran mendekati 5. mengidentifikasi rangkaian-rangkaian alu yang berulang. Misalnya kitya mencari DNA kelinci yang menjadikan lantai-lantai hemoklobinnya. tetapi kesamaan ini mungkin mencerminkan kenyataan. maka da kemungkinan besar untuk mendiagnosis penyakit. Satu tugas yang sekarang dapat dilakukan adalah mencari polimorpisme tempat restriksi untuk menentukan adakah yang terapuaut erat dengan salah satu pemyakit genetik yang terpeta kadar kromos X. jika.5 kb mengklon gen kangker kolon ©2003 Digitized by USU digital library 4 . maka molekul-molekul tambahan sampel khusus DNA rekombianan itu dapat dibiakkan dalam sel-sel “koli” tambahan untuk memproduksi sebanyak turunan sampelnya yang diinginkan. Sudah emapt laboratorium yangh berlainan yang cecara sendiri-sendiri telah mengklon gen-gen kangker kandung kemih. pag-pag rekombinan dalam perpustakaan itu mempunyai sebagian besar. dan kertas saring yang dicelupkan kedalm kedalam larutan yang berisikan molekul-molekul DNA rekombinan yang menyatakan rangkaiannya yang dicari itu.

dengan empat exon yang digunakan untuk mengklode protein yang serupa tetapi berlainan dengan berat molekul masing-masing sekitar 21. proses perkembangannya selalu gagal pada tahap embrional atau larva tertentu. baik melalui pembedahan. sebaliknya adalah jauh lebih besar karena sangat sukar untuk ©2003 Digitized by USU digital library 5 . yang masing-masing mengandung rangkaianrangkaian varsail yang tumpang tindih. karena ia teralu besar untuk diklon dalam sepotong fag. Transplantasi nukleus dengan telur-telur katak pertama kali dicapai dalam tahun 1952. Untuk mengklon seekor binatang perlu untuk mengambil nukleus dalam telur yang telah dibuahi. Protein-protein p21 itu ditemukan terikat dalam jumlah kecil pada membran plsma luar sel-sel kanker. pembelahan umbi dan rhizoma (akar rimang) dan sebagainya. Seperti onkogen-onkogen retro virus.5 Pengklonan hewan Klon-klon yang ditangani oleh para ahli biologi molekular. pembiakan aseksual lebih penting daripada pembiakan seksual. dan kanker kolon ( paru-paru ) mempunyai susunan dasar exonintron yang sama. Gen kanker kandung kemih manusia sangat serupa dengan ras onkogen virus sarkoma Harvey.(paru-paru) terbukti lebih sukar mencapai. maupun menonaktifkannya secara total dengan radiasi dan menggantikannya dengan nukleus yang diambil dari individu lain. mula-mula diisolasi lalu dianalisis dengan menggunakan tehnik-tehnik penyaring Alu dan homologi pada rangkaian gen ras virus sarcoma Kirsten. Sebaliknya. Mutasi itu mengubah sisa glesin pada posisi 12 dalam produk protein normal (protein p12) menjadi paling dalam protein sel-sel carcinoma tersebut. pada saat ini belum ada bukti bahwa perubahan sederhana ini merupakan satu-satunya penyebab carcinoma kandung kemih. sel-sel dalam kultur jaringan dan akhir-akhir ini molekul-molekul DNA. 2. dapat melahirkan katak-katak dewasa. namun gen-gen kanker kandung kemih. secara teratur menangani dan memproduksi organisme-organisme tinggat lebih tinggi yang diklon. enten. gen-gen kanker manusia ini mempunyai ekuivalen sel normal mereka. sedangkan gen kanker paru-paru sangat mirip dengan ras onkogen virus sarkomi Kirsten. biasanya klon-klon dari bakteri atau organisme lain. tetapi tentu saja akan lebih menarik untuk membiakkan mamalia secara aseksual daripada katak. untuk banyak spesies liar.Hasil pertama semacam itu menunjukkan bahwa gen kanker pada sel-sel tarsinoma kandung kemih manusia berbeda dari imbangannya dalam sel-sel normal dalam satu mutasi titik tunggal. Langkah berikutnya yang masuk akal adalah merangkai onkogen-onkogen manusia maupun ekuivalen-ekuivalen normal mereka. tanaman-tanaman yang mereka biakkan dengan pemangkasan. Para ahli taman dan pemulia tanaman sebaiknya. memang gen-gen kanker itu diduga berasal dari ekuivalen-ekuivalen sel normal mereka melalui mutasi yang dengan cara tertentu membawa onkogen yang potensial kepada produk-produk proteinnya. Demikianlah.000 (p21). Tumbuhan tinggi memberi kemungkinan untuk reproduksi aseksual dan klon. 35 macam fag. nukleus-nukleus yang ditransplantasi dari katak ‘dewasa’ sampai kini sekian jauh belum pernah mampu meningkatkan perkembangan hewan dewasa . Meskipun variasi ukurannya besar. dan mereka secara homolog erat dengan produk dari gen-gen kanker yang ditemukan sebelumnya pada retrovirus onkogen. neuroblastoma. Akan tetapi. dan kita juga tidak mengetahui peranan protein p12 itu dalam keadaan normal maupun keadaan mutasi. Masalah-masalah teknis dari reproduksi mamalia dengan transplantasi nukleus. yang masih totipoten. Ini memerlukan transplankasi suatu nukleus utuh yang tidak rusak dan mampu untuk berkembang. nukleus-nukleus yang dicangkokkan dari sel-sel embrio katak yang sangat muda. prosedur gen ini berkembang yang kemudian digunakan untuk menentukan struktur gen 45 kb. Sebaiknya hewan-hewan tingkat alami tidak bereproduksi secara aseksual.

diikuti oleh rangkaian untuk 191 asam amino dalam frotein masak. yaitu kloning dan menenukan rangkaian neuklitidanya. Hormon pertumbuhan manusia (HGH= Human Growth Hormone) adalah suatu rantai polipeptida tunggal yang mempunyai 191 asam amino dan diproduksi dalam kelenjar pituiteria (kelenjar pada infundibulum otak). hal itu tidak dapat dilakukan. ditambahkan suatu trio (triplet) basa (ATG) yang menspesifikasi asam amino metionin. 2. serangkaian percobaan semacam itu dengan tikus. Dalam teori ia dapat dicoba pada telur-telur sel embrio manusia. Selain itu tehnik-tehnik untuk menyisipkan gen-gen asing kedalam eukariotik dan prokariotik turut bekembang dan gen-gen ini secara efesien ditranskripsi dan ©2003 Digitized by USU digital library 6 . tetapi belum diulangi dan diperbuat secara bebas. untuk katak tua sekali pun. mereka tidak akan memberi sumbangan yang berarti pada pengertian kita tentang perkembangan mamalia. telah diproduksi suatu rangkaian yang mengkode asam-asam amino 1-14 telah disintesis secara kimia. Dalam masa dekat hanya terdapat kemungkinan kecil bahwa transplantasi nukleus dicoba pada spesies mamalia lain. Jika efisiensi dan reproduksibilitasnya dapat ditingkatkan. telah dilaporkan. Bakteriopag dan flasmi membentuk “DNA Rekombinan” yaitu dengan peleburan DANnya. Pada tahun 1981. tetapi merupakan fantasi murni. Sebelum metode-metode itu dapat direproduksi.coli’ menarik perhatian orang pada beberapa prilaku rekayasa genetika.1 dengan membuat kopikopi cDNA dari preparat-preparat nRNa darii sel-sel pituitaria manusia. Kedua fragmen DNA ini kemudian dikonkan secara terpisah. Kemudian “gen”dimasukkan kedalam suatu fektor ekspresi dan dimasukkan kedalam “ekoli” diaman diarahkan untuk membaut pertumbuhan manusia. PENUTUP Saat ini telah dikembangkan tehnik-tehnik mengisolasi gen terpilih.Langsung di depan kodon pertama. Dengan menggunakan kombinasi dari sintesis kimia DNA dan sintesis enzimatik cDNA. maka mungkin metode itu akan mendapat tempat di bidang penangkaran hewan. Dan perlu ditekankan bahwa belum terbukti ada kemungkinan bahwa dengan katak sekalipun untuk menghasilkan suatu individu dewasa yang diklon melalui pencangkokan nukleus sel dewasa ke dalam sebuah telur. Seperti insulin.6 Pengklonan Hormon Pertumbuhan Manusia Produksi hormon pertumbuhan manusia dalam ‘E. residu asam amino 25-19. Gen-gen enkariotik dan juga prikariotik dapat diklon dengan menyisipkannya dalam sepotong DNA. Hormon pertumbuhan mengendalikan pertumbuhan tubuh kita .Bila permulaan dari gennya telah disintesis secara kimia untuk menjamin permulaan yang tepat dari proteinnya. ia tidak terglirosilasi. V. Komplotan jutawan tua golongan gothik yang membujuk para dokter untuk mengklon beberapa kopi dari dirinya sendiri dengan pencangkokan nukleus-nukleus selnya kedalam telur-telur yang dibuahi dan kemudian menanamkannya pada wanita. dan berakhai dengan sinyal untuk menghentikan sintesisi frotein. tetapi untuk alasan apa? Tidak ada penerapan praktis.memanipulasi telur-telur mamalia tanpa merusaknya. Fragmenfragmen DNAnya dimurnikan kembali dan disambung menjadi satu untuk menghasilkan rangkaian DNA lengkap untuk horman pertumbuhan manusia mulai dengan suatu prodon inisiator yaitu metionin. maka diperoleh suatu rangkaian DNA yang mengkode sisa dari rantai polipeptida yaitu. tubuh kecil orang kerdil disebabkan karena kekurangan hormon pertumbuhan. yang dapat di reflikasi dala inang bakterinnya.

Jakarta 2. Erlangga. Yayasan Esentia Medica Yogyakarta 3. Ada juga kemungkinan bahwa tehnik-tehnik tersebut pada akhirnya dapat memungkinkan untuk memperbaiki fungsi gen yang efektif pada eukariotik atau memberikan fungsifungsi gen yang baru baginya.. Pambrey. 1991. Kurtz. 4. Penerbit ©2003 Digitized by USU digital library 7 .A. 1995. John. Tooze. Fraser. James D. Penerbit Erlangga Jakarta Buku kedokeran Biologi . Kimbal.translasi. Roberts. DAFTAR PUSTAKA 1.A. Watson. Suatu Pengantar. David T. Pengantar Kloning Gena. J. Muhammad.Edisi kedelapan Cetakan Pertama Penerbit (EGC) Jakarta. DNA Rekombinan. 1989. Tehnik-tehnik DNA rekombianan ini sudah dieploitasi dalam pembuatan protein-protein manusia yang berniai hanya oleh bakteri dan khamir. S. Edisi kelima cetakan kedua. John W. 1988. Genetika Kedokteran. Marcus E.