PENERAPAN TEKNIK-TEKNIK KLONING GEN DALAM KEHIDUPAN MANUSIA MIZAWARTI,S.

SI Program Studi Biologi Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara I. Pendahuluan 1.1 Lahirnya Kloning Gen Kira-kira satu abat yang lalu Gregor Mandel telah merumuskan aturan-aturan untuk menerangkan pewarisan sifat-sifat biologis. Sifat-sifat organisme yang dapat diwariskan diatur oleh suatu faktor yang disebut gen, yaitu suatu partikel yang berada di suatu di dalam sel tepatnya di dalam kromosom. Gen menjadi dasar dalam pengembangan penelitian genetika meliputi pemetaan gen, menganalisis posisi gen pada kromosom. Hasil penelitian telah berkembang baik diketahuinya DNA sebagai material genetik beserta strukturnya, kode-kode genetik serta proses transkripsi dan translasi dapat dijabarkan. Suatu penelitian yang merupakan revolusi dalam Biologi medern adalah setelah munculnya metode teknologi DNA rekombinasi atau rekayasa genetika yang inti prosesnya adalah kloning gen yaitu suatu prosedur untuk memperoleh replika yang dapat sama dari sel atau organisme tunggal. II. Langkah-langkah dasar Kloning Gen Ada beberapa langkah dasar dalam Kloning Gen yaitu sebagai berikut : 1. Suatu frakmen DNA yang mengandung gen yang akan diklon diinsersikan pada molekul DNA sirkular yang di sebut sektor untuk menghasilkan chimoera atau molekul DNA rekombiner. 2. Vektor bertindak sebagai wahana yang membawa gen masuk kedalam sel tuan rumah ( host ) yang biasanya berupa bakteri, walaaupun sel-sel jenis lain dapat di gunakan. 3. Didalam sel host, vektor mengadakan replikasi menghasilkan banyak kopi atau turunan yang identik, baik vektornya sendiri maupun gen yang dibawanya. 4. Ketika sel host membelah, kopi molekul DNA rekombinasi diwariskan pada progeni dan terjadi replikasi vektor selanjutnya. 5. Setelah terjadi sejumlah besar pembelahan sel, maka dihasilkan koloni atau klonsel host yang identik Tiap-tiap sel dalam klon mengandung satu kopi atau lebih molekul DNA rekombinasi dengan demikian dikatakan bahwa gen yang dibawa oleh molekul rekombinasi telah diklon. III. Wahana dan ketrampilan dasar untuk Kloning Gen Komponen penting dalam eksperimen kloning gen adalah wahana yang membawa gen masuk sel tuan rumah dan bertanggung jawab atas replikasinya. Untuk dapat bertindak sebagai wahana suatu molekul DNA harus mampu memasuki

©2003 Digitized by USU digital library

1

Preperasi sampel DNA murni 2. Hampir setiap molekul mRNA eukariot pada ujung 3’-nya mempunyai rangkaian resedu nukleotida adenin yang disebut ekor poli-A. dengan jalan pemberi ekor dengan ©2003 Digitized by USU digital library 2 . Penggolongan molekul DNA 5. lalu disiapkan untuk disisipkan kedalam pBR 322. Karena banyak protein yang bernilai komersil hanya terdapat dalam jumlah kecil dalam sel-sel dan jaringan hewan. Plasmid. merupakan molekul DNA sirkuler yang terdapat dalam bakteri dan berbagai organisme lain. dan karena ekspresi gen flon itu sangat penting. maka banyak pekerjaan komersial itu terpusat pada pengklonan c DNA dari mRNA-mRNA yang terdapat dalam jumlah sangat kecil didalam sel. tampaknya sebagai hasil dari enzim “ memutari sudut “ dan mulai mengkopi dirinya sendiri. Hasil reaksinya adalah suatu hibrida RNA-DNA. Dua jenis molekul DNA alamiah yang memenuhi persyaratan tersebut adalah : 1.1. adalah sintesis kimia dari suatu gen. Molekul DNA plasmid dan bakteriofog mempunyai sifat-sifat dasar yang ditentukan sebagai wahana kloning. adalah sama yang digunakan dalam laboratorium-laboratorium penelitian. Tehnik-tehnik Kloning Gen 2. Pemotongan DNA murni 3. Plasmid dapat melakukan replikasi dengan tidak tergantung pada kromosom sel tuan rumah. Ketrampilan dasar untuk melakukan kloning secara sederhana adalah : 1. rantai tersebut berhibridasiasi ke ekor poli-A untuk memberikan suatu primer untuk aksinya enzim transfriptase balik. Krimosom virus. Lingkaran tusuk konde itu mungkin merupakan suatu artefak ( sesuatu yang buatan ) ‘in vitro’ tetapi ia memang memberikan suatu primer yang sangat mudah untuk pembuatan untaian DNA yang kedua. IV.sel tuan rumah serta dapat mengadakan replikasi untuk menghasilkan kopi dalam jumlah besar. yaitu suatu nuklease spesifik yang beruntaian tunggal. 2. untaian DNA yang baru itu mempunyai lingkaran tusuk konde pada ujungnya. Pengklonan c DNA Sebagian besar. Analisis ukuran fragmen DNA 4. metode-metode yang digunakan oleh perusahaanperusahaan pengklonan gen untuk memperoleh DNA rekombinan yang terdiri dari gen yang diinginkan dalam vektor ekspresi. yang disolasikan dari virus-virus tumor RNA tertentu dapat menggunakan RNA sebagai cetakan untuk mensintesis suatu untaian DNA. Molekul cDNA yang beruntaian ganda yang diperoleh dengan cara tersebut. poli-A itu memberikan jalan yang mudah untuk mensintesis suatu untaian DNA yang komplementer terhadap mRNA-nya. Identifikasi sel yang mengandung molekul DNA rekombinasi. terutama bakteriofog. JIKa rantai-rantai pendek dari oligo –dT dicampur dengan mRNA. Memasukan molekul DNA ke dalam sel tuan rumah 6. dan kemudian DNA ini mengalami replikasi. namun sifat ini tidak berguna tanpa adanya tehnik-tehnik eksperimen untuk manipulasi molekul DNA di dalam laboratorium. Apapun fungsinya. yaitu virus yang harus menginfeksi bakteri pada waktu infeksi molekul DNA bakteriofog diinfeksikan ke dalam sel tuan rumah. Pendekatan lain yang digunakan untuk memperoleh insulin manusia. Enzim ini. cDNA ( DNA komplementer ) berantaian ganda yang dihasilkan mempunyai lingkaran tusuk konde yang utuh ini dapat dibelah oleh S1 nuklease.

membentuk selaput sel-sel dipermukaan agar. Akan tetapi. Setiap kali hal ini terjadi ujung-ujung belahan filman ganda itu membaawa panjang tambahan emapt nukleotida. Pengklonan fragmen yang merupakan seluruh genam suatu organisme dinamakan pengklonan “senapan”. Beberapa dari hibrid atau molekul-molekul rekombinan ini akan tetap berdaya infeksi pada inang bakteriofognya (ekoli) sebagaimana bakteriofog yang normal. ©2003 Digitized by USU digital library 3 . 2. maka dapat direflikasi dengan cara yang sama sekali lagi endonukliase restriksi memungkinkan musliaht itu. baru dilepas dari sel inangnya sehingga siap mengulangi daur infeksitersebut. Begitu masuk dalam sel imangnya. lalu penyambung-penyambung itu digunting hingga terbuka dengan enzim restriksi. setiap plak merupakan suatu “flon” molekul-molekul DNA dan dapat diriakkan secara tak terbatas dengan meninfeksi lebih banyak sel ekoli. Pencernaan semua DNA dalam sel-sel organisme eukariotik seperti mencit atau tikus oleh oleh endonuklease restriksi menghasilkan kumpulan fragman DNA yang sangat beragam. setiap sel yang secara berhasil diinfeksi oelh molekul-moleku DNA rekombinan akan membentuk banyak turunan baru DNA rekombinan tersebut sebelum dibunuh dan dilisis. Jika kita adapat menempelkan gen eukariotik kepada molekul DNA fag seperti itu. Kemudian plasmid rekombinan yang mengandung cDNA yang di hasilkan itu. Sel-sel bakteri itu mulai berkembang biak. DNA fag tersebut berlipat ganda berkali-kali. dimasukkan ke dalam strain “ E. enzim ini membelah DNA hanya ditempat yang meliputi rangkaiannya. koli” . yang sekarang mengandung ujung-ujung lekat yang dihasilkan oleh enzim tadi. secara bercampur molekul-molekul DNA eukariotik akan menempel pada molekul-molekul DNA dengan ujung-ujung lengketnya masingmasing. potongan “dari DNA” eukariotik yang ada pada plak tertentu merupakan kebetulan semata-mata. turunan dikemas kedalam partikel-partikel berdaya tulang. Akibatnya segara nampak pada mata dengan mata telanjang sebagai zona atau plak sikular yang jernih pada “padang” sel-sel . Hal ini dapat dideteksi dengan membiarkan ekoli terbuka bagi campuran molekul DNA rekombinan dan selanjutnya menabur selsel pada cawan fetri berisi agar.2 Gen pengklonan : DNA rekombinan Bakteri merupakan mesin-mesin efesien untuk untuk menciptakan turunuan identik DNA bacterifogdalam jumlah.Penyambung-penyambung itu ditambahkan pada cDNA beruntaian ganda dengan menggunakan DNA ligase. Kemudian DNA ligase dapat dipakai untuk mengaitkan secara kovalen molekul-molekul itu bersama. dan proses itu diulang. menginfeksi sel-sel terdekat. Fragman-fragman ini tergabung pada DNA bakteriofag secara acak semata-mata. Walau setiap plak (plague) menghasilkan ikon unit molekul-molekul DNA rekombinan. dan cDNA-nya. Molekul-molekul yang infektif dilepas. Setiap utusan pilihan ganda itu dipotong diantara buangin dan adenin. yang dinamai ujung “lengket” karena mapu berpasangan basa dengan molekul DNA yang manapun mengandung ujung lengket pelengkap. Dalam keadan yang sesusai. dimasukkan ke dalam pBR 322 yang telah di belah dengan enzim yang sama. DNA yang berpasangan (berhelai tunggal). Ekori adalah endonuklease resttriksi yang dihasilkan oleh “E. Gagasannya adalah memperlakukan kedua DNA eukariotik dan DNA bakteriopag dengan endonuklease retriksi yang sama sehingga tercipta ujung-ujung pelengkap pada masing-masing. Tempat-tempat restriksi ini yang kita sebut ‘penyambung” ( “linker”) adalah oligunekloitida-oligunekloitida dari 8 sampai 10 pasangan basa yang dibuat secara kimia.terminal transferase atau dengan menambahkan tempat-tempat enzim restriksi buatan pada ujung-ujung cDNA-nya. coli “ yang sesuai dan dikembangbiakkan.

Bersama-sama. bahwa galur-galur sel yang dianggap berlainan ini mempunyai sumber yang sama. Inilah prosedurnya. Maka inilah satu cara (namun bukan satu-satunya cara) untuk mencapai tujuan terdekatnya yaitu sampel murni suatu gen eukariotik. maka da kemungkinan besar untuk mendiagnosis penyakit. Karena plak-plak asal tidak menjadi rusak karena prosedur ini. Semua gen ini tampak sama (berukuran mendekati 5. mengidentifikasi rangkaian-rangkaian alu yang berulang. Maka terbukti kemungkinan untuk mengkon DNA dari individu kromosom.4. Satu tugas yang sekarang dapat dilakukan adalah mencari polimorpisme tempat restriksi untuk menentukan adakah yang terapuaut erat dengan salah satu pemyakit genetik yang terpeta kadar kromos X. tetapi kesamaan ini mungkin mencerminkan kenyataan. maka molekul-molekul tambahan sampel khusus DNA rekombianan itu dapat dibiakkan dalam sel-sel “koli” tambahan untuk memproduksi sebanyak turunan sampelnya yang diinginkan. Untuk ini diperlukan suatu “tolok”. DNA yang terserat itu kemudian diubah sifatnya menjadi pelayan tunggal. memetakan tempat-tempat restriksi. Beberapa dari DNA pada setiap plak diserap oleh kertas saring tadi.5 kb mengklon gen kangker kolon ©2003 Digitized by USU digital library 4 . Misalnya. jika. Gen neuroblastoma sekarang juga telah diklon secara lengkap dengan menggunakan metode bantuan TRNA yang memperlihatkan gen mendekati 13. misalnya dapat ditunjukkan bahwa suatu pola tertentu dari tempat-tempat enzim restriksi terpaut erat pada distropi otot Duchenne dan tidak terdapat pada individu-individu normal. genetik yang umum dan letal ini. pag-pag rekombinan dalam perpustakaan itu mempunyai sebagian besar.Kini masalahnya adalah salah satu temuan dari satu atau lebih plag (mungkin dari beberapa ribu ) yang mengandung gen edukariotik yang menarik perhatian kita. Sudah emapt laboratorium yangh berlainan yang cecara sendiri-sendiri telah mengklon gen-gen kangker kandung kemih. DNA kromosom X. sehelai kertas saring yang dibuat dari nitro selulosa secara perlahan ditekan pada permukaan lempengan agar yang berplak. 2.3. Pengklonan Onkogen Manusia sekarang ini 3 onkogen manusia yang diduga telah diklon dengan menggunakan teknik penyaringan alu dan teknik banntuan tRNA. Pengklonan Individu Kromosom karena sekarang terdapat kemungkinan untuk menyortir kromosomkromosom manusia secara fisik kedalam klas-klas ukurang yang terpisah dengan suatu prosedur yang dikenal sebagai sortasi sel yang teraktifasi fluoresens (FACS : fluoresende-activa-ted celsorting). tetapi sungguh sangat langsung dan akhirnya tujuan dapat diacapai.4 kb). Pesuruh-pesurh ini dapat diisolasi dari prekursor dan dapat diberi label isotop radio aktif dan digunakan untuk mencari plak-plak yang mengandung rangkaian DNA pelengkap. Prosesnya mungkin tanpak rumit. Sebagaimana kita ketahui. Misalnya kitya mencari DNA kelinci yang menjadikan lantai-lantai hemoklobinnya. yaitu rangkaian DNA yang dari pada pesuruh-pesuruh hemoglobin ini ditranskripsi. dan kertas saring yang dicelupkan kedalm kedalam larutan yang berisikan molekul-molekul DNA rekombinan yang menyatakan rangkaiannya yang dicari itu. RNA pesuruh untuk rantai-rantai ini dapat diisolasi dari prekursor sel-sel darah merah kelinci. jika tidak dapat dikatakan semua. dan mancari gen-gen yang diketahui akan terbawa pada kromosom X tersebut. bahkan sebelum kita mengetahui gentermutasi dimana yang bertanggung jawab untuk hal itu. mulai dengan suatu galur sel manusia dengan kariotip yang abnormal (empat kromosom X) terdapat kemungkinan mensortir cukup banyak kromosom X manusia yang bebas dari autosom untuk dapat membuat suatu perpustakaan fag X dari DNA kromosom X itu. 2. Maka dari itu semua tehnik yang telah dilukiskan dari itu semua tehnik yang dilukiskan sebelumnya dapat digunakan untuk menganalisis DNA kromosom X.

Gen kanker kandung kemih manusia sangat serupa dengan ras onkogen virus sarkoma Harvey. Ini memerlukan transplankasi suatu nukleus utuh yang tidak rusak dan mampu untuk berkembang. yang masih totipoten. 2. 35 macam fag. biasanya klon-klon dari bakteri atau organisme lain. dan kanker kolon ( paru-paru ) mempunyai susunan dasar exonintron yang sama. karena ia teralu besar untuk diklon dalam sepotong fag. dengan empat exon yang digunakan untuk mengklode protein yang serupa tetapi berlainan dengan berat molekul masing-masing sekitar 21. tanaman-tanaman yang mereka biakkan dengan pemangkasan. neuroblastoma. Tumbuhan tinggi memberi kemungkinan untuk reproduksi aseksual dan klon. dan kita juga tidak mengetahui peranan protein p12 itu dalam keadaan normal maupun keadaan mutasi. Untuk mengklon seekor binatang perlu untuk mengambil nukleus dalam telur yang telah dibuahi. Mutasi itu mengubah sisa glesin pada posisi 12 dalam produk protein normal (protein p12) menjadi paling dalam protein sel-sel carcinoma tersebut. dan mereka secara homolog erat dengan produk dari gen-gen kanker yang ditemukan sebelumnya pada retrovirus onkogen.(paru-paru) terbukti lebih sukar mencapai. memang gen-gen kanker itu diduga berasal dari ekuivalen-ekuivalen sel normal mereka melalui mutasi yang dengan cara tertentu membawa onkogen yang potensial kepada produk-produk proteinnya. sedangkan gen kanker paru-paru sangat mirip dengan ras onkogen virus sarkomi Kirsten. sel-sel dalam kultur jaringan dan akhir-akhir ini molekul-molekul DNA. untuk banyak spesies liar. maupun menonaktifkannya secara total dengan radiasi dan menggantikannya dengan nukleus yang diambil dari individu lain. baik melalui pembedahan. pembelahan umbi dan rhizoma (akar rimang) dan sebagainya. mula-mula diisolasi lalu dianalisis dengan menggunakan tehnik-tehnik penyaring Alu dan homologi pada rangkaian gen ras virus sarcoma Kirsten. secara teratur menangani dan memproduksi organisme-organisme tinggat lebih tinggi yang diklon. pembiakan aseksual lebih penting daripada pembiakan seksual. Protein-protein p21 itu ditemukan terikat dalam jumlah kecil pada membran plsma luar sel-sel kanker. pada saat ini belum ada bukti bahwa perubahan sederhana ini merupakan satu-satunya penyebab carcinoma kandung kemih. proses perkembangannya selalu gagal pada tahap embrional atau larva tertentu.5 Pengklonan hewan Klon-klon yang ditangani oleh para ahli biologi molekular. Sebaiknya hewan-hewan tingkat alami tidak bereproduksi secara aseksual. Meskipun variasi ukurannya besar. Akan tetapi. sebaliknya adalah jauh lebih besar karena sangat sukar untuk ©2003 Digitized by USU digital library 5 . Langkah berikutnya yang masuk akal adalah merangkai onkogen-onkogen manusia maupun ekuivalen-ekuivalen normal mereka. tetapi tentu saja akan lebih menarik untuk membiakkan mamalia secara aseksual daripada katak. Seperti onkogen-onkogen retro virus. Sebaliknya. Transplantasi nukleus dengan telur-telur katak pertama kali dicapai dalam tahun 1952. Masalah-masalah teknis dari reproduksi mamalia dengan transplantasi nukleus. Demikianlah. dapat melahirkan katak-katak dewasa. nukleus-nukleus yang dicangkokkan dari sel-sel embrio katak yang sangat muda.000 (p21). prosedur gen ini berkembang yang kemudian digunakan untuk menentukan struktur gen 45 kb. enten. namun gen-gen kanker kandung kemih. yang masing-masing mengandung rangkaianrangkaian varsail yang tumpang tindih. nukleus-nukleus yang ditransplantasi dari katak ‘dewasa’ sampai kini sekian jauh belum pernah mampu meningkatkan perkembangan hewan dewasa . Para ahli taman dan pemulia tanaman sebaiknya. gen-gen kanker manusia ini mempunyai ekuivalen sel normal mereka.Hasil pertama semacam itu menunjukkan bahwa gen kanker pada sel-sel tarsinoma kandung kemih manusia berbeda dari imbangannya dalam sel-sel normal dalam satu mutasi titik tunggal.

2. Pada tahun 1981. Komplotan jutawan tua golongan gothik yang membujuk para dokter untuk mengklon beberapa kopi dari dirinya sendiri dengan pencangkokan nukleus-nukleus selnya kedalam telur-telur yang dibuahi dan kemudian menanamkannya pada wanita. tetapi merupakan fantasi murni. tetapi belum diulangi dan diperbuat secara bebas. Dalam masa dekat hanya terdapat kemungkinan kecil bahwa transplantasi nukleus dicoba pada spesies mamalia lain. serangkaian percobaan semacam itu dengan tikus. ia tidak terglirosilasi. hal itu tidak dapat dilakukan. yaitu kloning dan menenukan rangkaian neuklitidanya. dan berakhai dengan sinyal untuk menghentikan sintesisi frotein.6 Pengklonan Hormon Pertumbuhan Manusia Produksi hormon pertumbuhan manusia dalam ‘E. yang dapat di reflikasi dala inang bakterinnya. Selain itu tehnik-tehnik untuk menyisipkan gen-gen asing kedalam eukariotik dan prokariotik turut bekembang dan gen-gen ini secara efesien ditranskripsi dan ©2003 Digitized by USU digital library 6 . V.Langsung di depan kodon pertama. Bakteriopag dan flasmi membentuk “DNA Rekombinan” yaitu dengan peleburan DANnya. Jika efisiensi dan reproduksibilitasnya dapat ditingkatkan. PENUTUP Saat ini telah dikembangkan tehnik-tehnik mengisolasi gen terpilih. Dalam teori ia dapat dicoba pada telur-telur sel embrio manusia.1 dengan membuat kopikopi cDNA dari preparat-preparat nRNa darii sel-sel pituitaria manusia. Hormon pertumbuhan manusia (HGH= Human Growth Hormone) adalah suatu rantai polipeptida tunggal yang mempunyai 191 asam amino dan diproduksi dalam kelenjar pituiteria (kelenjar pada infundibulum otak). Fragmenfragmen DNAnya dimurnikan kembali dan disambung menjadi satu untuk menghasilkan rangkaian DNA lengkap untuk horman pertumbuhan manusia mulai dengan suatu prodon inisiator yaitu metionin. maka mungkin metode itu akan mendapat tempat di bidang penangkaran hewan.coli’ menarik perhatian orang pada beberapa prilaku rekayasa genetika. tetapi untuk alasan apa? Tidak ada penerapan praktis. mereka tidak akan memberi sumbangan yang berarti pada pengertian kita tentang perkembangan mamalia. Hormon pertumbuhan mengendalikan pertumbuhan tubuh kita . tubuh kecil orang kerdil disebabkan karena kekurangan hormon pertumbuhan. telah diproduksi suatu rangkaian yang mengkode asam-asam amino 1-14 telah disintesis secara kimia. diikuti oleh rangkaian untuk 191 asam amino dalam frotein masak. Kedua fragmen DNA ini kemudian dikonkan secara terpisah. Dan perlu ditekankan bahwa belum terbukti ada kemungkinan bahwa dengan katak sekalipun untuk menghasilkan suatu individu dewasa yang diklon melalui pencangkokan nukleus sel dewasa ke dalam sebuah telur. telah dilaporkan. Dengan menggunakan kombinasi dari sintesis kimia DNA dan sintesis enzimatik cDNA. Seperti insulin.memanipulasi telur-telur mamalia tanpa merusaknya. ditambahkan suatu trio (triplet) basa (ATG) yang menspesifikasi asam amino metionin.Bila permulaan dari gennya telah disintesis secara kimia untuk menjamin permulaan yang tepat dari proteinnya. Kemudian “gen”dimasukkan kedalam suatu fektor ekspresi dan dimasukkan kedalam “ekoli” diaman diarahkan untuk membaut pertumbuhan manusia. Gen-gen enkariotik dan juga prikariotik dapat diklon dengan menyisipkannya dalam sepotong DNA. residu asam amino 25-19. Sebelum metode-metode itu dapat direproduksi. untuk katak tua sekali pun. maka diperoleh suatu rangkaian DNA yang mengkode sisa dari rantai polipeptida yaitu.

Edisi kedelapan Cetakan Pertama Penerbit (EGC) Jakarta. DNA Rekombinan. 1988. Muhammad. 1991. Genetika Kedokteran. Roberts. Suatu Pengantar.translasi. DAFTAR PUSTAKA 1. 4.A. Watson. James D. John W. J. Penerbit Erlangga Jakarta Buku kedokeran Biologi . Jakarta 2. Pengantar Kloning Gena. Tehnik-tehnik DNA rekombianan ini sudah dieploitasi dalam pembuatan protein-protein manusia yang berniai hanya oleh bakteri dan khamir. Penerbit ©2003 Digitized by USU digital library 7 . 1989. Yayasan Esentia Medica Yogyakarta 3. 1995. Kimbal. Fraser. S. Ada juga kemungkinan bahwa tehnik-tehnik tersebut pada akhirnya dapat memungkinkan untuk memperbaiki fungsi gen yang efektif pada eukariotik atau memberikan fungsifungsi gen yang baru baginya. Edisi kelima cetakan kedua. Erlangga. David T.A. Tooze.. Pambrey. Marcus E. Kurtz. John.