Professional Documents
Culture Documents
I. Tujuan
Mempelajari prosedur umum untuk merekonstitusi medium berbentuk suspensi dan
menaruhnya dalam jumlah yang dikehendaki ke dalam wadah-wadah yang sesuai.
II. Prinsip
Aseptis
Teknik aseptis atau steril adalah suatu sistem cara bekerja (praktek) yang menjaga
sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk mencegah
kontaminasi terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan. (Pradhika, 2009).
Sterilisasi
Merupakan suatu proses untuk mematikan semua orginasme yang terdapat pada
suatu benda. Proses sterilisasi dapat dibedakan menjadi 3 macam, penggunakan
panas (pemijaran dan udara panas); penyaringin; penggunaan bahan kimia (etilena
oksida, asam perasetat, formaldehida, dan glutaraldehida alkalin) (Hadioetomo,
1993).
Pembiakan
Mikroorganisme dibiakan di laboratorium pada bahan nutrient yang disebut media.
Banyak sekali media yang tersedia; macamnya yang dipakai bergantung kepada
banyak faktor, salah satu diantaranya ialah mikroorganisme yang akan dtumbuhkan
(Pelczar, et.al., 2006)
Counting
Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji
kualitatif koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji
kuantitatif, bisa dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap (Muslim,
2011).
III. Teori Dasar
Pertumbuhan adalah penambahan secara teratur semua komponen sel suatu jasad.
Pembelahan sel adalah hasil dari pembelahan sel. Pada jasad bersel tunggal (uniseluler),
pembelahan atau perbanyakan sel merupakan pertambahan jumlah individu. Misalnya
pembelahan sel pada bakteri akan menghasilkan pertambahan jumlah sel bakteri itu
sendiri. Pada jasad bersel banyak (multiseluler), pembelahan sel tidak menghasilkan
pertambahan jumlah individunya, tetapi hanya merupakan pembentukan jaringan atau
bertambah besar jasadnya. Dalam membahas pertumbuhan mikrobia harus dibedakan
antara pertumbuhan masing-masing individu sel dan pertumbuhan kelompok sel atau
pertumbuhan populasi (sumarsih,2008).
Suatu bakteri yang dimasukkan ke dalam medium baru yang sesuai akan tumbuh
memperbanyak diri. Jika pada waktu-waktu tertentu jumlah bakteri dihitung dan dibuat
grafik hubungan antara jumlah bakteri dengan waktu maka akan diperoleh suatu grafik
atau kurva pertumbuhan. Pertumbuhan populasi mikrobia dibedakan menjadi dua yaitu
biakan sistem tertutup (batch culture) dan biakan sistem terbuka (continous culture). Pada
biakan sistem tertutup, pengamatan jumlah sel dalam waktu yang cukup lama akan
memberikan gambaran berdasarkan kurva pertumbuhan bahwa terdapat fase-fase
pertumbuhan. Fase pertumbuhan dimulai pada fase permulaan, fase pertumbuhan yang
dipercepat, fase pertumbuhan logaritma (eksponensial), fase pertumbuhan yang mulai
dihambat, fase stasioner maksimum, fase kematian dipercepat, dan fase kematian
logaritma. Pada fase permulaan, bakteri baru menyesuaikan diri dengan lingkungan yang
baru, sehingga sel belum membelah diri. Sel mikrobia mulai membelah diri pada fase
pertumbuhan yang dipercepat, tetapi waktu generasinya masih panjang. Fase permulaan
sampai fase pertumbuhan dipercepat sering disebut lag phase. Kecepatan sel membelah diri
paling cepat terdapat pada fase pertumbuhan logaritma atau pertumbuhan eksponensial,
dengan waktu generasi pendek dan konstan. Selama fase logaritma, metabolisme sel paling
aktif, sintesis bahan sel sangat cepat dengan jumlah konstan sampai nutrien habis atau
terjadinya penimbunan hasil metabolisme yang menyebabkan terhambatnya pertumbuhan.
Selanjutnya pada fase pertumbuhan yang mulai terhambat, kecepatan pembelahan sel
berkurang dan jumlah sel yang mati mulai bertambah. Pada fase stasioner maksimum
jumlah sel yang mati semakin meningkat sampai terjadi jumlah sel hidup hasil pembelahan
sama dengan jumlah sel yang mati, sehingga jumlah sel hidup konstan, seolah-olah tidak
terjadi pertumbuhan (pertumbuhan nol). Pada fase kematian yang dipercepat kecepatan
kematian sel terus meningkat sedang kecepatan pembelahan sel nol, sampai pada fase
kematian logaritma maka kecepatan kematian sel mencapai maksimal, sehingga jumlah sel
hidup menurun dengan cepat seperti deret ukur. Walaupun demikian penurunan jumlah sel
hidup tidak mencapai nol, dalam jumlah minimum tertentu sel mikrobia akan tetap
bertahan sangat lama dalam medium tersebut. Grafik pertumbuhan mikroba dalam biakan
sistem tertutup (batch culture) (Sumarsih,2008).
Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji
kualitatif koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji
kuantitatif, bisa dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap. Waktu, mutu
sampel, biaya, tujuan analisis merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif
koliform. Bakteri koliform dapat dihitung dengan menggunakan metode cawan petri
(metode perhitungan secara tidak langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa setiap
sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni yang merupakan suatu indeks
bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terdapat pada sampel) (Muslim, 2011)
Ada beberapa cara yang dapat digunakan untuk menghitung atau mengukur jumlah
jasad renik di dalam suatu suspensi atau bahan, yang dapat dibedakan atas beberapa
kelompok yaitu :
A. Perhitungan jumlah sel
1. Hitungan mikroskopik
2. Hitungan cawan
3. MPN (Most Probable Number)
B. Perhitungan massa sel secara langsung
1. Volumetrik
2. Gravimetrik
3. Kekeruhan (turbidimetri)
C. Perhitungan massa sel secara tidak langsung
1. Analisis komponen sel
2. Analisis produk katabolisme
3. Analisis konsumsi nutrien
Dari metode-metode tersebut, metode hitungan cawan paling banyak digunakan. Hal ini
disebabkan metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk menghitung
jumlah mikroba karena:
1. Hanya sel yang masih hidup yang dihitung
2. Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus
3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba karena koloni yang terbentuk
mungkin berasal dari satu sel dengan penampakan pertumbuhan yang spesifik. Prinsip dari
metode hitungan cawan adalah menumbuhkan sel mikrobia yang masih hidup pada metode
agar, sehingga sel mikrobia tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang
dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop (Fardiaz, 1993).
Metode hitungan cawan dapat dibedakan atas dua cara yaitu :
1. Metode tuang (pour plate)
2. Metode permukaan (surface / spread plate)
Pada perhitungan menggunakan metode cawan, diperlukan suatu pengenceran agar jumlah
koloni mikrobia yang ada pada cawan dapat dihitung dan sesuai standar, yaitu berjumlah
30 – 300 per cawan. Pengenceran dilakukan secara decimal yntuk memudahkan
perhitungan (Fardiaz, 1993).
Dalam melaporkan suatu analisis mikrobiologi digunakan suatu standar yang disebut
“Standard Plate Count” yang menjelaskan cara menghitung koloni pada cawan serta cara
memilih data yang ada untuk menghitung jumlah koloni dalan suatu contoh. Cara
menghitung koloni pada cawan adalah sebagai berikut :
1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30
sampai 300.
2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni yang
besar dimana jumlah koloninya diragukan, dapat dihitung sebagai satu koloni.
3. suatu deretan (rantai) kolini yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu
koloni.
Sedangkan data yang dilaporkan sebagai SPC harus mengikuti peraturan sebagai berikut :
1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama dibelakang
koma dan angkan kedua dibelakang koma. Jika angka ketiga sama dengan atau lebih besar
dari 5, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka kedua.
2. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk menanam menghasilkan angka kurang dari
30 pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran yang terendah yang dihitung.
Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tapi
jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan.
3. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk menanam menghasilkan angka lebih besar
dari 300 pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggi yang
dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan dengan besarnya
pengenceran, tapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan.
4. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan jumlah antara 30
dan 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran
tersebut lebih kecil atau sama dengan 2, yang digunakan adalaha rata-ratanya. Jika
perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih
besar dari 2, yang dilaporkan hanya hasil terkecil.
5. Jika digunakan dua cawan Petri (duplo) per pengenceran, data yang diambil harus dari
kedua cawan tersebut, meskipun salah satunya tidak memenuhi syarat diantara 30 dan 300.
Koloni adalah kumpulan dari mikrobia yang memilki kesamaan sifat-sifat seperti bentuk,
susunan, permukaan, dan sebagainya. Sifat-sifat yang perlu diperhatikan pada koloni yang
tumbuh di permukaan medium adalah:
1. Besar kecilnya koloni. Ada koloni yang hanya serupa suatu titik, namun ada pula yang
melebar sampai menutup permukaan medium.
2. Bentuk. Ada koloni yang bulat, ada yang memanjang. Ada yang tepinya rata, ada yang
tidak rata.
3. Kenaikan permukaan. Ada koloni yang rata saja dengan permukaan medium, ada pula
yang timbul yaitu menjulang tebal di atas permukaan medium.
4. Halus kasarnya permukaan. Ada koloni yang permukaannya halus, ada yang
permukaannya kasar dan tidak rata.
5. Wajah permukaan. Ada koloni yang permukaannya mengkilat, ada yang permukaannya
suram.
6. Warna. Kebanyakan koloni bakteri berwarna keputihan atau kekuningan.
7. Kepekatan. Ada koloni yang lunak seperti lendir, ada yang keras dan kering
(Dwidjoseputro, 1978).
Koliform merupakan suatu grup bakteri yang digunakan sebagai indikator adanya
pencemaran dan kondisi sanitasi yang tidak baik terhadap air, makanan, susu dan produk-
produk susu. Ada beberapa jenis E. Coli yang bersifat invasif atau meracuni makanan,
Contoh E. Coli ini yaitu E. Coli enteropatogenik (EPEC), EIEC (enteroinvasif E. Coli), dan
ETEC (enterotoksigenik E. Coli). Selain itu bakteri yang akan dihitung koloninya adalah
Lactobacillus acid. Pada saat perhitungan koloni, apabila jumlah koloni yang di temukan
kurang dari standart yang telah di tetapkan, maka suatu sample bisa di katakan murni
(Schlegel, 1994).
Terkadang untuk menghitung kuantitas mikroorganisme pada sample dapat di uji dengan
cara menghitung jumlah koloni pada agar. Agar lempengan yang telah ditetapkan,
disingkat jumlah penjumlahan pada lempengan (Standart plate count) (Dwisaputro, 2002).
Standart plate count (perhitunngan jumlah pada lempengan) sangat berguna dalam hal
mengetahui kuantitas mikroorganisme pada suatu tempat atau sampel sehingga bisa di
ketahui apakah sampel tersebut murni atau tidak murni (Waluyo, 2004).
Adapun cara perhitungan koloni, sebagai berikut:
Pour plate : 1 × ∑ koloni
Faktor pengencer
Spread plate : 1 × 10 × ∑ koloni
Faktor pengencer
Standart plate count : 30 – 300 koloni
Syarat :
• Jika kurang dari 2 : Dipakai pengencer terbesar
• Jika lebih dari 2 : Dipakai rata-rata
Perhitungan jumlah koloni akan lebih mudah dan cepat jika pengenceran dilakukan secara
decimal. Semakin tinggi jumlah mikroba yang terdapat di dalam sample, semakin tinggi
pengenceran yang harus dilakukan (Fardiaz, 1993).
IV. Alat dan Bahan
4.1 Alat
1. Cawan petri steril (3 buah)
2. Kapas untuk sumbat
3. Labu Erlenmeyer
4. Pembakar spirtus
5. Pipet 1 ml steril (1 buah)
6. Pipet 10 ml steril (1 buah)
7. Rak tabung
8. Tabung reaksi steril (5 buah)
4.2 Bahan
1. Aquades
2. Nutrien Agar (NA)
3. Suspensi bakteri
4.3 Gambar Alat
V. Prosedur
Pada praktikum kali ini, praktikan harus menggunakan peralatan yang steril. Oleh
karena itu, alat-alat yang akan digunakan disterilisasi terlebih dahulu dengan cara
pemanasan menggunakan autoclave. Alat-alat yang sudah disterilkan dan bahan yang akan
digunakan pada praktikum kali ini dipersiapkan terlebih dahulu. Suspensi bakteri
dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian, tiga buah tabung reaksi dan tiga buah
cawan petri diberi tanda masing-masing 10-1, 10-2, dan 10-3. Suspensi bakteri dipipet
sebanyak 1 ml dan dimasukan ke dalam tabung reaksi bertanda 10 -1 dan tabung reaksi
tersebut ditambahkan dengan aquades 9 ml menggunakan pipet 10 ml,lalu tabung reaksi
tersebut disumbat dengan kapas. Proses tersebut dilakukan didekat api spirtus agar bakteri
tidak terkontaminasi oleh udara lingkungan. Tabung reaksi bertanda 10-2 ditambahkan
dengan 1 ml suspensi dari tabung bertanda 10-1 menggunakan pipet 1 ml dan ditambahkan
juga aquades 9 ml menggunakan pipet 10 ml, lalu tabung reaksi tersebut disumbat dengan
kapas. Proses tersebut dilakukan didekat api spirtus agar bakteri tidak terkontaminasi oleh
udara lingkungan. Tabung reaksi bertanda 10-3 ditambahkan dengan 1 ml suspensi dari
tabung bertanda 10-2 menggunakan pipet 1 ml dan ditambahkan juga aquades 9 ml
menggunakan pipet 10 ml, lalu tabung reaksi tersebut disumbat dengan kapas. Proses
tersebut dilakukan didekat api spirtus agar bakteri tidak terkontaminasi oleh udara
lingkungan. Selanjutnya, suspensi dari ketiga tabung tersebut dimasukkan kedalam cawan
petri yang masing-masing sudah ditandai seperti pada tabung reaksi. Masing-masing
tabung diambil 1 ml suspensi dengan menggunakan pipet 1 ml dan dimasukan ke dalam
cawan petri sesuai dengan tandanya. Cara memasukkan ke dalam cawan petri yaitu
mwnggunakan pipet 1 ml, dan cawan petri dibuka dekat api spirtus sambil dimiringkan.
Setelah suspensi dimasukkan, pipet dan cawan petri difiksasi terlebih dahulu sebelum
ditutup kembali. Hal tersebut dilakukan untuk ketiga suspensi. Ketiga cawan petri tersebut
dibungkus dengan menggunakan Koran sebelum dilakukan inkubasi pada suhu 40oC
selama 18-24 jam. Setelah itu, dilakukan counting bakteri yang tumbuh pada setiap cawan
petri.
VI. Data Pengamatan
5.1 Tabel Pengamatan
Cawan Petri Jumlah Bakteri Gambar
10-1 1148
10-2 759 -
10-3 609
VIII. Kesimpulan
Fardiaz, S. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. PT. Raja Grafindo Persada; Jakarta.
Pelczar, J. Michael, & Chan, E.C.S. 2006. Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid 1. UI-Press.
Jakarta.
Schlegel, H., G. 1994. Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University Press; Yogyakarta.