P. 1
Elektroforesis

Elektroforesis

|Views: 471|Likes:

More info:

Published by: Norma Rizkiananingrum on Apr 30, 2011
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

09/03/2013

pdf

text

original

LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA

LAPORAN I
(ISOLASI DAN PEMETAAN DNA PLASMID)

KHAIRUL ANAM P051090031/BTK

BIOTEKNOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010
0   

antara lain adalah : a). Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan. Lisis (pemecahan dinding sel). b). tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA. mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi.ISOLASI DAN PEMETAAN DNA PLASMID TUJUAN Praktikum ini bertujuan untuk mengisolasi DNA plasmid dan memetakan plasmid PGEM T Easy dengan digesti menggunakan beberapa enzim restriksi. 1994). yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu (Brock. karena relatif mudah dalam penanganannya. membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam.. membran luar terdiri atas lipopolisakarida. mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi. yaitu tahap kultivasi dan harvesting. Kultivasi yaitu memberikam kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. fosfolipid. plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi. protein. c). Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti. DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia. lipoprotein. dan peptidoglikan sedangkan 1    . TINJAUAN PUSTAKA Plasmid Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. 2006). et al. d). e). mempunyai penanda seleksi. Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning.

DNA dapat dilihat secara langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan migrasinya pada gel agarose maupun gel poliakrilamid. memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA (Muladno. Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat magnesium.0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. Etanol berfungsi untuk memekatkan. dan SDS (sodium dodesil sulfat). Untuk menghilangkan protein dari larutan. Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel. yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml (Suharsono dan Widyastuti. Ethidium bromida dapat menangkap sinar ultra violet sehingga pendaran sinar UV ini dapat terlihat. 2    . Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim. Migrasi DNA dalam gel disebut sebagai elektroforesis. plasmid. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. EDTA (ethilendiamin tetraasetat). Kotoran sel yang ditimbulkan akibat perusakan oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan cara sentrifugasi. 2002). kemudian dilihat di atas sinar ultra violet. Untuk dapat divisualisasikan. Ini semua menyebabkan sel menjadi lisis.8-2. dan produk PCR. sehingga yang tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA dan RNA).membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and Parkers. digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). 2006) Elektroforesis Dalam kegiatan biologi molekuler. Ethidium mengikat molekul DNA. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi. Untuk mengetahui jumlah DNA. Spektrofotometer Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Rasio OD260/OD280 antara 1. 1999). maka DNA yang terdapat di gel diwarnai dengan ethidium bromida (EtBr). maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 256 nm (260 nm). Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. elektroforesis merupakan salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA.

maka semakin lambat DNA bermigrasi. iii) agar dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Enzim ini telah ditemukan lebih dari 30 tahun yang lalu sehubungan dengan fenomena pemotongan yang spesifik terhadap bakteri inang dan modifikasi oleh virus bakteri. Enzim-enzim tersebut diketahui memotong 3    . Semakin rapat media yang digunakan. Selain itu. pembacaan pita DNA di dalam gel yang telah diwarnai dengan ethidium bromida di atas lampu UV yang dibandingkan dengan DNA standar juga sering dilakukan untuk menganalisis kuantitas jumlah DNA (Suharsono dan Widyastuti. sehingga bila diletakkan dalam medan listrik. Pewarna yang biasa digunakan adalah bromophenol blue dan xylene cyanol. DNA bermuatan negatif. sehingga DNA akan selalu berada di dasar sumur. Semakin kecil ukurannya DNA akan semakin cepat migrasi DNA. ii) pewarna untuk memudahkan meletakkan sampel DNA ke dalam sumur. iii) arus listrik yang diberikan untuk memigrasikan molekul DNA. Sebelum dilakukan elektroforesis. yang berfungsi untuk i) menambah densitas. semakin tinggi prosentasenya. Dimana jika sentrifugasi berarti memisahkan molekul menggunakan kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis berarti memisahkan molekul dengan menggunakan kekuatan elektrik. Gel elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Bakteri pada mulanya tahan terhadap infeksi virus karena bakteri memiliki sistem pertahanan dengan merusak molekul DNA asing yang masuk ke dalam selnya. Enzim restriksi yang berhasil dimurnikan pertama kali adalah EcoRI dan EcoRII dari Escherichia coli. Semakin besar arus yang diberikan. Gel elektroforesis mengambil keuntungan bahwa. Kecepatan migrasi ditentukan oleh : i) ukuran molekul DNA.sehingga molekul DNA dapat terlihat ketika dilihat di atas sinar ultra violet. maka semakin cepat DNA bermigrasi. ii) prosentase/kerapatan gel yang dilalui DNA. 2006). sebagai asam organik. molekul DNA menuju ke kutub positif (anoda) dan menjauhi kutub negatif (katoda). DNA merupakan molekul bermuatan negatif. suspensi DNA terlebih dahulu harus ditambahkan loading buffer (dye). Ketika diletakkan di dalam medan listrik. dan HindII dan HindIII dari Haemophilis influenza. DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif. Restriksi Enzim restriksi endonuklease (enzim restriksi) mengenali urutan nukleotida spesifik dan memotong DNA pada posisi di antara atau di luar sekuen yang dikenalinya tersebut.

yang menghasilkan fragmen-fragmen seukuran gen yang dapat disambungkan kembali. Enzim tipe inilah yang dipakai untuk berbagai percobaan dalam analisis DNA dan kloning gen. fungsi. dan perlu tidaknya kofaktor. coli memiliki enzim restriksi. Satu unit enzim restriksi akan memotong 1 ug DNA secara sempurna dalam 50 ul reaksi selama 1 jam. Rasio enzim : DNA : volume reaksi ini dapat digunakan sebagai pedoman dalam menentukan reaksi. Enzim restriksi biasanya terdapat dalam kombinasi dengan enzim pemodifikasi lain yang melindungi DNA-nya sendiri dari pemotongan. Enzim ini berperan dalam sistem imun pada mikroorganisme. Enzim tipe II menghasilkan fragmen-fragmen tertentu dengan pola pita-pita yang spesifik pada gel agarosa. jika bakteri E. dan ekspresi gen. posisi pemotongan. Meskipun demikian. spesifisitas sekuen DNA. multisubunit. berdasarkan pada komposisi sub unit. misalnya DNA-metil transferase (dnmt). Para peneliti dengan cepat segera mengetahui bahwa enzim restriksi merupakan alat biologis baru yang dapat digunakan untuk mempelajari organisasi. kemungkinan infeksi virus akan menurun. enzim restriksi dapat dibedakan ke dalam 3 tipe. Dnmt akan memetilasi basa DNA pada tiap untai sehingga sekuen yang dikenali oleh enzim restriksi tidak akan terpotong. Enzim restriksi melindungi bakteri dari infeksi virus. maka sebagian besar partikel virus mampu menyebabkan infeksi. enzim. coli yang tidak memiliki enzim restriksi diinfeksi virus. Enzim tipe I secara biokimia mungkin banyak berfungsi di dalam sel. dan buffer yang benar dalam volume reaksi total yang sesuai. sebagian besar peneliti mengikuti pedoman umum reaksi digesti di mana 10 kali over-digesti direkomendasikan untuk mengatasi 4    . Enzim ini memotong DNA di luar sekuen yang dikenal dan memerlukan 2 sekuen yang sama pada orientasi yang berlawanan pada untai DNA yang sama untuk dapat memotong. Namun. kombinasi antara restriksi dan pemodifikasi yang memotong DNA pada area random yang jauh dari sisi pengenalan.DNA pada urutan basa tertentu yang spesifik. Enzim-enzim tipe I merupakan enzim yang kompleks. Di antaranya adalah: gunakan jumlah DNA. Secara umum. Ada beberapa faktor kunci yang harus diperhatikan untuk melakukan pemotongan dengan enzim restriksi (enzyme digestion). Jika bakteri E. tetapi mereka kurang menguntungkan untuk digunakan dalam percobaan di laboratorium. Enzim-enzim ini jarang menghasilkan potongan yang sempurna. Enzim tipe III juga merupakan kombinasi restriksi dan enzim pemodifikasi. Enzim tipe II memotong DNA pada posisi tertentu yang dekat atau berada di antara sekuen yang dikenalnya.

Jumlah dan ukuran fragmen yang dihasilkan oleh tiap-tiap endonuklease restriksi harus ditentukan dengan elektroforesis gel. DNA plasmid superkoil dan DNA yang terikat gel agarose pada umumnya memerlukan lebih dari 1 unit/ug untuk dapat terpotong sempurna. Campur reaksi dengan baik dengan cara pemipetan atau menggoyang tabung reaksi. kemudian dibandingkan dengan ukuran marka. Enzim ini harus tetap disimpan di dalam es ketika dikeluarkan dari freezer dan harus selalu menjadi komponen yang ditambahkan terakhir pada campuran reaksi. Beberapa enzim perlu disimpan pada -70°C.variasi dalam sumber. alkohol. Pembandingan hasil digesti tunggal dan digesti ganda akan memungkinkan pemetaan banyak tempat restriksi. Selain stabilitas. 5    . deterjen (SDS) atau garam yang berlebih. Sentrifus dengan cepat selama beberapa detik jika ada cairan yang menempel di dinding tabung. yaitu DNA dipotong dengan dua enzim restriksi secara bersamaan. dapat dilakukan penambahan stopper reagent yang mengandung SDS-EDTA. Pemetaan Plasmid Menurut Brown (1991) dan Glick and Pasternak (1994). harga enzim restriksi pun mahal. Metilasi DNA dapat mengakibatkan penghambatan digesti dengan enzim tertentu. dalam menyusun peta restriksi harus dilakukan suatu rangkaian digesti restriksi. sebaiknya disimpan pada suhu -20°C untuk sebagian besar enzim. Enzim restriksi merupakan enzim yang tidak stabil. kloroform. Oleh karena itu. EDTA. DNA harus terbebas dari kontaminan seperti fenol. Hasil yang didapat harus didukung oleh hasil rangkaian digesti ganda. Untuk menghentikan reaksi enzim. jumlah dan kemurnian DNA.

5 ml lalu diendapkan dengan sentrifugasi 10. Selanjutnya pelet dilarutkan ke dalam TE (Tris-HCl pH 8 10 mM.BAHAN DAN METODE KERJA Isolasi DNA Plasmid Bakteri yang digunakan dalam praktikum ini adalah E. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan. dilakukan sentrifugasi 10. Kemudian ditambah 200 ul buffer lisis (0. 6    . Untuk mengetahui kemurnian DNA terhadap kontaminan protein. coli yang mengandung plasmid ditumbuhkan dalam 10 ml media LB (bacto tryptone 10g/l. Pelet dibilas dengan etanol 70% kemudian disentrifugasi kembali 10.5 + EDTA) dan di-vortex. EDTA 1 mM). Suspensi dihomogenkan dengan membolakbalik tabung (6-8kali) lalu didiamkan 3 menit. Satu koloni bakteri E. Setelah diinkubasi pada 30°C selama 2 jam. Lalu endapan bakteri disuspensikan ke dalam 100 ul buffer suspensi sel (Tris HCl pH 7. Suspensi DNA yang telah diencerkan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.000 rpm selama 10 menit pada 4°C. 1% SDS).5 ml kultur dipindahkan ke dalam tabung 1. dilakukan sentrifugasi 10. Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase dan diinkubasi pada 37°C semalam. Setelah itu. coli yang telah tersisipi plasmid. nilai absorbansi 260 nm dibandingkan dengan nilai absorbansi 280 nm. Bufer netralisasi (1.000 rpm 4°C selama 10 menit.2M NaOH.000 rpm 4°C selama 10 menit. bacto-yeast extract 5g/l. Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian dilakukan ekstraksi dengan PCI (fenol-kloroform-isoamil alkohol) untuk memisahkan kandungan lipid-protein dengan DNA. NaCl 10 g/l) lalu diinkubasi di atas shaker dengan kecepatan 250 rpm pada suhu 37°C selama semalam. Kemudian 1. yaitu 1 OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml.2 sehingga larutan menjadi netral dan etanol absolut untuk mengikat air. Analisis Kemurnian DNA dan Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer Suspensi DNA plasmid diencerkan dengan mengambil 1 ul dalam 99 ul H2O atau TE.000 rpm (Tomy MRX-150) 4°C selama 10 menit.32M Na-asetat pH 4. Kemudian DNA diendapkan dengan penambahan Na-asetat pH 5.8) ditambahkan sebanyak 300 ul dan dihomogenkan dengan membolak-balik tabung. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dikonversikan ke dalam konsentrasi.

dilakukan elektroforesis untuk mengecek apakah enzim telah memotong DNA. 1 ul enzim restriksi (10 unit/ul) dan dH2O hingga volume larutan menjadi 20 ul dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 500 ul (dengan urutan: dH2O. HindIII dan SacI. bromofenol biru 0. 6. 2. DNA plasmid. Bentuk DNA plasmid ditentukan dengan melihat jumlah pita di dalam gel.25%. 5. dipanaskan hingga jernih dengan microwave. Sisir dilepas kemudian gel dipindah ke dalam electrophoresis chamber.25%. Selanjutnya. DNA dimigrasikan kemudian setelah selesai migrasi. Jumlah DNA dianalisis dengan membandingkan antara pendaran pita DNA plasmid yang dianalisis dengan pendaran pita DNA penanda kuantitas 10.3 40 mM. Digesti dengan Enzim Restriksi pada Pemetaan DNA Plasmid Sebanyak 5-10 ug DNA plasmid yang akan dipotong menjadi fragmen-fragmen. Kemudian sampel DNA tersebut serta penanda kuantitas (marker. 7. EcoRI dan HindIII. Setelah suhu tidak terlalu panas (60°C). Enzim-enzim restriksi yang digunakan antara lain: 1. Sebanyak 1-2 ul DNA dicampur dengan larutan pewarna (loading dye.Analisis Kualitatif dan Kuantifikasi DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa Gel agarose 1% dibuat dengan mensuspensikan agarose ke dalam buffer TAE 1x (Tris-HCl pH 8. aktivitas enzim dihentikan dengan memanaskan larutan DNA pada suhu 65-70°C.98 mM. EcoRI. Bila telah terpotong. NotI. Kemudian larutan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C. 2 ul larutan penyangga reaksi 10x (10%). 7    . 4. dan dilihat di atas UV setelah dicuci dengan H2O. asam borat 83 mM. EDTA 1 mM) atau TBE 1x (Tris-HCl 100 mM. lalu dibiarkan beku. SacI. enzim). waktu inkubasi dan/enzim restriksi ditambahkan lagi. direndam dengan larutan etidium bromide. 3. HindIII. xylene cyanol FF 0. Bila DNA belum terpotong sempurna. dilakukan elektroforesis kembali untuk menentukan ukuran plasmid dan fragmen-fragmennya. 8. Selesai inkubasi. larutan penyangga. EDTA 1 mM). λ yang dipotong dengan enzim HindIII) diaplikasikan pada gel agarosa. NotI dan HindIII. sukrosa 40%). gel dicetak dengan menggunakan gel tray (cetakan gel) dan dipasang sisir untuk membuat sumuran. NotI dan EcoRI. asam asetat pekat 1. 20 dan 50 ng.

HASIL DAN PEMBAHASAN   Isolasi DNA Plasmid Dapat diketahui bahwa dalam proses mengisolasi plasmid dari suatu bakteri. Gambar 1. Kemudian larutan disentrifugasi untuk diambil supernatannya berupa lautan suspensi. 3. Lisis dinding dan membran sel bakteri Proses lisis diawali dengan adanya pemberian SDS + NaOH dimana SDS (sodium dodesil sulphate) merupakan deterjen yang berperan untuk melisis dinding atau membran sel yang terdiri dari lipid (fosfolipid) dan NaOH sebagai larutan basa berfungsi untuk denaturasi protein atau DNA (DNA double strain menjadi single strain). Ekstraksi DNA dengan PCI   8  . Lisis membran sel bakteri. Gambar 2. Ektraksi DNA. Pengendapan DNA. yaitu 1. Terjadinya proses lisis ditandai dengan terbentuknya lendir. 2. ada tiga tahap penting yang perlu dilakukan.

Ekstraksi dilakukan dengan adanya penambahan PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol) dengan tujuan untuk memisahkan antara DNA dan komponen lainnya dimana Phenol-Chloroform berfungsi sebagai pelarut dari senyawa organik dan komponen lipid. terdapat senyawa DNA plasmid. Pemurnian DNA dengan etanol Fase air yang diambil kemudian diendapkan menggunakan sodium acetat untuk menciptakan kondisi netral dan alcohol untuk mengikat air yang sebelumnya terikat pada DNA sehingga DNA mengendap dengan sentrifugasi. protein yang terkoagulasi di fase yang ada di tengah dan fase Phenol-Chloroform yang ada di paling bawah karena sifat chloroform yang berat jenisnya besar.   9    . Pada tahap ini tidak perlu dilakukan resuspensi karena apabila dilakukan resuspensi DNA akan sulit mengendap karena pH nya tidak netral lagi. Pelet yang didapat kemudian dimurnikan dengan penambahan etanol 70% yang kemudian disentrifugasi lagi untuk didapatkan pelet. Penambahan RNase dapat diberikan untuk menghilangkan sisa-sisa fragmen RNA setelah dilakukan pemurnian dan proses vakum dengan bantuan larutan buffer TE ataupun dH2O. Senyawa Organik dan Komponen Lipid. Protein. Gambar 3. RNA.Pada larutan suspensi sebelum diekstraksi. Dengan dilakukannya ekstraksi menggunakan PCI maka setelah disentrifugasi terbentuklah 3 fase dimana terdiri dari fase air yang ada di paling atas tempat DNA plasmid berada.

Elektroforesis dilakukan sampai larutan pewarna menjauhi sumuran. 40 ng/ul. Tabel 1.213 Abs λ280 1.8 sehingga DNA plasmid yang didapatkan belum murni. 20 ng/ul. jarak migrasi yang ditempuh tidak perlu terlalu jauh dan untuk menganalisis bentuk DNA.Analisis Kemurnian DNA dan Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer Dari DNA plasmid yang diisolasi diperoleh dilakukan kuantifikasi dengan menggunakan metode spektrofotometri. Konsentrasi DNA penanda kuantitas yang digunakan adalah 10 ng/ul. Analisis Kualitatif dan Kuantifikasi DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa Analisis menggunakan gel agarose dilakukan dengan melakukan elektroforesis DNA sampel bersama dengan DNA penanda kuantitas. Hasil elusi isolasi DNA Plasmid 10    .333 Abs λ260/ Abs λ280 1. Nilai absorbansi larutan DNA pada panjang gelombang 260 dan 280 nm Kel 6 Abs λ260 2.           Gambar 4.66 konsentrasi ng/ul 110.6 Dari data spektrofotometri dapat diketahui bahwa larutan DNA plasmid kemungkinan masih terdapat protein sebagai kontaminan dimana rasio antara absorbansi λ260/λ280 sebesar 1. Untuk kuantifikasi.66 adalah lebih kecil dari 1. didapatkan hasil seperti pada Tabel 1.

pada praktikum diperoleh pita-pita hasil elektroforesis DNA plasmid yang telah direstriksi seperti yang terlihat pada Gambar 5. sedangkan yang bermigrasi paling dekat dengan sumur adalah pita DNA plasmid yang berbentuk open sirkuler.5 ul untuk mendapatkan 100 ng DNA. pita DNA plasmid yang berada di tengah berbentuk linear. sehingga apabila larutan DNA yang dimiliki adalah 50 ul maka konsentrasi DNA yang diisolasi adalah 2000 ng/50 ul atau 40 ng/ul.Dari hasil elektroforesis dapat diketahui bahwa DNA plasmid yang terbentuk ada beberapa macam karena terbentuknya beberapa pita. Sehingga ketika akan dilakukan restriksi maka larutan DNA yang dibutuhkan adalah sekitar 2. DNA superheliks lebih kompak dibandingkan dengan DNA plasmid dalam keadaan open sirkuler atau linier. Digesti dengan Enzim Restriksi pada Pemetaan DNA Plasmid   Hasil pemotongan DNA plasmid dengan beberapa enzim restriksi menghasilkan pita-pita dengan ukuran basa yang berbeda dan unik sesuai dengan enzim restriksinya masing-masing. Hasil digesti DNA plasmid mengunakan beberapa enzim restriksi 11    . Dari hasil elektroforesisi pun dapat dikuantifikasi konsentrasi dari larutan DNA yang di dapatkan seperti pada kelompok 5. EcoRI  NotI  HindII SacI EcoRI  HindIII  NotI  I HindIII  SacI  HindIII    Gambar 5. Kemungkinan pita-pita tersebut adalah DNA plasmid dimana plasmid berbentuk superheliks (ccc = covalently closed circular) bermigrasi paling jauh dari sumur. Semakin kompak suatu DNA maka akan bermigrasi semakin cepat sehingga pada saat yang bersamaan akan bermigrasi lebih jauh dibandingkan dengan bentuk yang kurang kompak. untuk 1 ul DNA plasmid yang dielektroforesis mengandung bobot 40 ng.

1. NotI  SacI. NotI dan HindIII: 3018 bp + 762 bp + 44 bp Maka dari data tersebut dapat diperoleh pemetaan enzim restriksi pada plasmid pGEM T Easy seperti yang terlihat pada Gambar 6. EcoRI dan HindIII: 3018 bp + 762 bp + 44 bp 6.Dari hasil elektroforesis untuk proses restriksi diperoleh panjang fragmen sebagai berikut. EcoRI dan NotI memiliki dua situs pengenalan restriksi dimana satu situs pengenalan restriksi pada tempat yang sama. HindIII: 3824 bp 4. SacI: 3711 bp + 113 bp 5. pGEM T Easy  3824 bp HindIII  EcoRI. sedangkan HindIII hanya memiliki satu situs pengenalan. EcoRI. Pemetaan plasmid pGEM T Easy Dari hasil pemetaan dapat diketahui bahwa SacI. EcoRI: 3018 bp + 806 bp 3. HindIII dan SacI: 3062 bp + 649 bp + 113 bp 7. NotI  SacI  12    . NotI: 3018 bp + 806 bp 2.                     Gambar 6. Situs pengenalan pengenalan EcoRI dan NotI memiliki jarak restriksi yang sama.

U. 3. open sirkular dan diperoleh konsentrasi DNA 40 ng/ul. Glick. Molekuler Biotechnology. Teknik Rekayasa Genetika. 1991. 2002.R. Madigan. Bogor. 1994.C. Prentice Hall. Dari isolasi DNA plasmid. diperoleh DNA plasmid yang kurang murni dan diperoleh konsentrasi plasmid sebesar 110. Biology of microorganisms. Pustaka Wirausaha Muda.A.J. john M. IPB Bahan Kuliah dan Praktikum Rekayasa Genetika   13    . Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi. ASM Press. Suharsono dan Widyastuti.SIMPULAN 1. Michael T. Dari hasil elektroforesis diperoleh beberapa tipe plasmid dari linear.. 2006. Muladno. T. Washinton D. Yayasan Essentia Medica. Pasternak. Dari hasil restriksi untuk pemetaan Plasmid diketahui pGem T Easy memiliki 4 situs restriksi dengan enzim SacI. B. Martinko and Paker. and J. sirkular.6 ng/ul 2. Brown. DAFTAR ACUAN Brock. D. T. EcoRI dan NotI dan HindIII. 1994. Principles and applications of Recombinan DNA. Pengantar Kloning Gena (terjemahan). Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->