1. Sebutkan berbagai cara penanaman bakteri ?

Teknik penanaman dari suspensi Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir. a.1. Spread Plate (agar tabur ulas) Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah sebagai berikut : • Ambil suspensi cairan senamyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat. • Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas bunsen beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik. • Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar supaya tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar. • Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas.

a.2. Pour Plate (agar tuang) Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut : • Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media padat yang masih cair (>45oC) • Teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong • Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk menghomogenkan suspensi bakteri dan media, kemudian diinkubasi.

Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja, sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.

b. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak) Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru. b.1 Goresan Sinambung Cara kerja : • Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar. • Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180oC lanjutkan goresan sampai habis.

Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.

b.2 Goresan T Cara kerja : • Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker • Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag • Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2 (streak pada gambar). Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna • Lakukan hal yang sama pada daerah 3

b.3 Goresan Kuadran (Streak quadrant) Cara kerja : Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisma.Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.

2.Bagaimana cara menghitung koloni ? Metode MPN ( Most Probable Number) atau APM (Angka Paling Mungkin) Sejarah perkembangan Metode MPN muncul pada awal abad 20. Estimasi paling akurat dari tabel MPN di publikasikan oleh Mc Crady pada tahun 1915 kemudian dasar statistik dari metode MPN dikemukakan oleh Halvorson dan Ziegler (1933), Eisenhart dan Wilson (1943) dan Cochan (1950). Pada tahun 1957 Woodward menyarankan tentang pengabaian hasil positif (banyak tabung positif pada pengenceran tinggi dan sebaliknya) yang dapat meningkatkan kesalahan laboratorium dalam tabel MPN. Kemudian De Mann pada tahun 1983 mempublikasikan tentang metode perhitungan tingkat kepercayaan (convidence interval) dalam tabel MPN. Prinsip yang digunakan dalam metode MPN MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang ditanam dari sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah sampel atau diencerkan menurut tingkat seri tabungnya sehingga dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme yang diuji dalam nilai MPN/satuan volume atau massa sampel. Contoh : Data yang didapat adalah : 3 tabung positif dari pengenceran 1/10, 2 tabung positif dari pengenceran 1/100 dan 1 tabung positif dari pengenceran 1/1000. Lalu dicocokkan dengan tabel, menghasilkan nilai : 150 MPN/g

Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkaan frekensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin “sering” tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin “jarang” tabung positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah yang menghasilkan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dengan probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya ke dalam media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Frekuensi positif (ya) atau negatif (tidak) ini menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan. Asumsi yang diterapkan dalam metode MPN adalah : • Bakteri terdistribusi sempurna dalam sampel • Sel bakteri terpisah-pisah secara individual, tidak dalam bentuk rantai atau kumpulan (bakteri coliform termasuk E. coli terpisah sempurna tiap selnya dan tidak membentuk rantai). • Media yang dipilih telah sesuai untuk pertumbuhan bakteri target dalam suhu dan waktu inkubasi tertentu sehingga minimal satu sel hidup mampu menghasilkan tabung positif selama masa inkubasi tersebut. • Jumlah yang didapatkan menggambarkan bakteri yang hidup (viable) saja. Sel yang terluka dan tidak mampu menghasilkan tabung positif tidak akan terdeteksi. MPN dinilai dari perkiraan unit tumbuh (Growth Unit / GU) seperti CFU, bukan dari sel individu. Meskipun begitu baik nilai CFU atau MPN dapat menggambarkan seberapa banyak sel individu yang tersebar dalam sampel. Metode MPN dirancang dan lebih cocok untuk diterapkan pada sampel yang memiliki konsentrasi <100/g atau ml. Oleh karena itu nilai MPN dari sampel yang memiliki populasi mikroorganisme yang tinggi umumnya tidak begitu menggambarkan jumlah mikroorganisme yang sebenarnya. Jika jumlah kombinasi tabung positif tidak sesuai dengan tabel maka sampel harus diuji ulang. Semakin banyak seri tabung maka semakin tinggi akurasinya tetapi juga akan mempertinggi biaya analisa. Pemilihan media sangat berpengaruh terhadap metode MPN yang dilakukan. Umumnya media yang digunakan mengandung bahan nutrisi khusus untuk pertumbuhan bakteri tertentu. Misalnya dalam mendeteksi faecal coliform dan E coli dapat menggunakan media Brilliant Green Lactose 2% Bile (BGLB) broth. Di dalam media ini mengandung lactose dan garam empedu (bile salt) yang hanya mengizinkan faecal coliform dan E.coli untuk tumbuh. Jika terdapat ketidaksesuaian jenis media dan bakteri yang diinginkan maka metode MPN akan menghitung bukan bakteri yang dituju. Untuk menghitung coliform dapat menggunakan Lauryl Sulphate Tryptose (LST) broth, sedangkan untuk menghitung E.coli diperlukan media EC (Escherichia coli) broth. Berdasarkan prinsip diatas apakah mungkin metode MPN dapat untuk menghitung jenis bakteri selain jenis-jenis coliform ? Jadi nilai MPN adalah suatu angka yang menggambarkan hasil yang PALING MUNGKIN. Aspek peluang dalam metode MPN Berdasarkan prinsip diatas maka “seharusnya/sebaiknya” jumlah tabung positif pada pengenceran 1/10 > 1/100 > 1/1000 (misalnya 5-3-1) karena setiap pengenceraan mengurangi jumlah mikroorgansime target dan akibatnya semakin kecil kesempatannya untuk membuat tabung menjadi positif. Namun seringkali hasil yang didapat tidak sesuai dengan logika peluang, seperti 5-3-4 yang menghasilkan nilai 210 (lihat tabel dibawah). Bisa saja banyak sel tidak sengaja terambil dan memperbanyak pengenceran selanjutnya atau homogenisasi tidak berlangsung sempurna.

Untuk memahami peranan peluang dalam mendistribusikan sel sehingga menghasilkan tabung positif maka jumlah tabung positif (digaris bawah) pada tabel dicoba untuk dirunut dan diilustrasikan kembali dalam proses penanamannya pada gambar berikut (dianggap bahwa nilai MPN/ml sama dengan sel/ml). Namun perlu diingat, jumlah sel yang terambil tidak selalu seperti itu, semuanya adalah peluang dan angka yang didapat adalah angka paling mungkin.

Perbandingannya dengan plate count Telah disebutkan diatas bahwa MPN cocok untuk sampel dengan konsentrasi mikroorganisme rendah khususnya dari jenis sampel air, susu, atau makanan terutama yang memiliki partikel-partikel yang larut didalamnya. Partikel-partikel tersebut dimungkinkan mampu mempengaruhi keakuratan perhitungan bakteri jika menggunakan metode penanaman pada cawan petri. Hal ini karena sel bakteri yang terpisah dapat mengelompok pada partikel makanan dan mungkin tidak terpisah pada proses homogenisasi dalam pengenceran bertingkat sehingga saat diplating satu kumpulan tersebut menjadi satu koloni dan membuat data plate count menjadi bias. Metode MPN dapat mengeliminasi kekurangan ini.

Kaidah pemilihan tabung positif dan cara pelaporannya Syarat umum yang dipakai dalam pemilihan tabung positif adalah • Pilih pengenceran terendah yang tidak semua tabung menghasilkan tabung positif • Pilih pengenceran tertinggi yang paling tidak memiliki satu tabung positif • Pilih semua pengenceran diantaranya. • Kalikan setiap seri tabung yang dipilih dengan pengenceran yang diambil. Misalnya : dari inokulum 1, 0,1, 0,01, 0,001 dan 0,0001 menghasilkan kombinasi tabung positif 5-4-3-1-0 maka dipilih 5-4-3-1-0 bukan 5-4-3-1-0 atau 5-4-3-1-0 sehingga didapat nilai MPN 33/ml.

Contoh f) 0-0-1-0-0 .1 dan 0. Contoh e) 5-5-5-5-2 .0001 maka nilai harus dikalikan 10. Jika pada tingkat pengenceran tertentu semua menghasilkan tabung negatif tetapi pengenceran selanjutnya masih terdapat tabung positif. Begitu pula sebaliknya untuk contoh g yang diambil dari pengenceran (inokulum) 1.001 dan 0. 0.001 ml adalah 540 tetapi karena diambil pengenceran dari (inokulum) 0. maka pilih tingkat pengenceran sebelumnya.01. jika pada pengenceran yang lebih tinggi masih menghasilkan tabung positif maka tambahkan tabung positif tersebut ke tingkat pengenceran sebelumnya. Contoh c) 5-4-4-1-0 . Untuk kasus semua seri tabung menghasilkan tabung positif dan tidak semua pengenceran menghasilkan tabung positif dapat dilihat pada contoh berikut Contoh a) 5-5-1-0-0 dan b) 4-5-1-0-0 .01 dan 0. 0. Menghitung angka MPN tanpa tabel Nilai MPN ternyata dapat dicari dengan rumus berikut (Thomas formula) : . Catatan : pada contoh e hasil untuk 5-5-2 dengan inokulum 1.0. 0. jika tingkat pengenceran tertentu menghasilkan tabung positif maka pilih dua tingkat pengenceran sebelumnya Contoh g) 4-4-1-1-0 dipilih menjadi 4-4-2 . Contoh d) 5-4-4-0-1 . pilih pengenceran tertinggi yang menghasilkan seluruh tabung positif dan dua pengenceran berikutnya.Namun tidak semua keadaan menggambarkan kondisi ideal seperti diatas.01 maka nilai 47 harus dibagi 10. jika pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi masih menghasilkan tabung positif (103 menghasilkan 1 tabung positif) maka pada tingkat pengenceran tersebut tingkat pengenceran tertinggi yang dipilih. maka yang dinyatakan tabung positif adalah tingkat pengenceran sebelumnya. Jika pada tingkat pengenceran tertinggi masih terdapat tabung positif.

0/10) yaitu kombinasi 10-4-2 = 70/g tetapi dalam perhitungan hanya gunakan (10/10.Contoh 1 : Untuk hasil (10/10. 4/10. 10/10. 2/10. 4/10. 2/10. 0/10) jika digunakan tabel maka dipilih (10/10. 4/10. 2/10. 10/10. 0/10). Contoh 2 : . 10/10.

15 0.2 3.2 11 7.3 3. 1/5.0363 = 110/ml .000 1.01 dan 0.0 6.7 8. 0/5) yaitu kombinasi 5-3-1 = 110/ml tetapi dalam perhitungan hanya gunakan (5/5.2 1.1.10 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Tabung positif 0.4 3.1.1 6. 0. 1/5.7 8.2 9. Tabel 1.7 atas 9.01 0 0 1 1 2 3 0 0 0 1 1 2 2 3 0 0 0 1 1 1 0.5 4.5 8.15 1. bwah -0. 1 ml pada 3 seri tabung lalu selanjutnya dilakukan pengenceran sampai 104 dan tiap pengenceran ditanam 1 ml pada 3 seri tabung seperti skema di bawah ini. lim. lim.4 3.Untuk hasil (5/5.17 1.001 g inokulum Tabel MPN untuk 3 seri tabung dengan 0. 3/5.6 7.001 0 1 2 0 1 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 MPN/g 21 28 35 29 36 23 38 64 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 >1100 Conf.6 1. 0/5) pemilihan dipilih (5/5.0 3.001 0 1 0 1 0 0 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 MPN/g <3. 3/5.4 11 11 15 16 9.6 0.6 8. 1/5.5 3.6 11 18 18 38 18 18 38 20 38 42 42 42 38 42 42 42 42 94 0.5 9.001 g inokulum (95 % confidence intervals) Tabung positif 0. 0. (sama dengan hasil yang didapatkan dari tabel) Jumlah seri tabung dan pengenceran yang disarankan Menurut USDA dan FSIS untuk mengantisipasi jika jumlah mikroorganisme dalam sampel >10 CFU/g atau ml maka disarankan menanam sampel 10 ml pada 3 seri tabung.7 4.100 -- . 3/5.0 3.7 8.10 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 0.000 2.7 17 9 17 37 40 18 37 40 90 42 90 180 420 atas 42 94 94 94 94 94 110 180 180 200 420 420 420 420 430 1.6 3. Tabel MPN untuk 3 seri tabung dengan 0. bwah 4.01 dan 0.6 4. 0/5) Dengan cara yang sama maka MPN/g = 4/(0.024x0.2 14 20 15 20 27 Conf.3 3.5 8.01 2 2 2 3 3 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0.000 4.5 1.6 4.7 4.055)1/2 = 4/0.

8 -6.4 22 5 1 0 33 10 100 1 2 12 4.1 26 5 1 1 46 14 120 2 0 9.9 36 5 5 4 1600 400 4600 5 5 5 >1600 700 -- Tabel 3.0.8 15 4 2 0 22 6.001 bwah atas 0 0 <1.09 6.5 1.79 15 5 0 0 23 6. Tabung positif Conf.8 0.8 40 5 4 4 350 100 710 3 2 24 9.1 3.5 22 4 5 0 41 14 100 4 0 11 3.3 3. Tabel MPN untuk 10 seri tabung dengan 0.8 4 0 3 25 9.1 10 4 2 1 26 9.1 26 5 1 3 84 34 220 2 2 14 5.9 70 1 1 6.001 g inokulum . 0.8 40 5 4 1 170 58 400 2 2 20 6.9 36 5 2 3 120 36 250 0 0 7.7 0.8 40 5 5 0 240 70 710 4 1 24 9.8 50 0 0 2 0.1 1.8 40 5 4 3 280 100 710 3 1 21 6.6 36 5 3 3 180 70 400 1 2 17 6 36 5 3 4 210 70 400 2 0 14 5.6 0.7 36 5 4 0 130 36 400 2 1 17 6.1 22 5 2 4 150 58 400 0 1 11 3.8 17 5 0 3 58 22 150 1 1 9.4 22 5 1 2 63 22 150 2 1 12 4.7 10 4 2 2 32 10 70 0 2 6 1.01 dan 0.4 22 4 3 2 39 14 100 2 0 6.8 70 5 5 2 540 150 1700 0 0 13 4.8 15 4 4 0 34 14 100 2 1 8.8 15 4 2 3 38 14 100 1 0 4 0.8 15 4 1 3 31 10 70 3 0 5.9 4 1 0 17 6 40 1 1 3.001 g inokulum.2 3.8 70 1 0 1.8 70 0 1 6.01 0.1 35 5 5 3 920 220 2600 0 1 17 5.7 12 4 3 0 27 9.1 1.8 1.001 bwah atas 0.01 0. MPN/g MPN/g 0.9 36 5 2 0 49 15 150 3 0 12 4.4 22 4 4 2 47 15 120 3 1 10 3.5 0. (95 % confidence intervals).8 70 5 5 1 350 100 1100 5 0 25 9.8 40 0 1 1.7 10 4 1 2 26 9.8 42 2 0 3.4 22 5 0 2 43 14 100 1 0 6.8 4 0 2 21 6. 0.4 22 4 4 1 40 14 100 3 0 8.5 23 5 3 0 79 22 220 0 2 13 5.8 15 4 3 1 33 10 70 1 2 8.8 70 2 1 5.3 3.100 4 0 21 6.5 26 5 3 2 140 52 400 1 1 14 5.9 36 5 2 2 94 34 230 4 0 15 5. Tabung positif Conf.8 2.01 dan 0. lim.1.1 3.8 0.2 3.8 40 5 4 2 220 70 440 3 0 17 6.8 15 5 0 1 31 10 70 0 2 9.7 10 4 1 1 21 6.09 6.6 35 5 3 1 110 34 250 1 0 11 3.6 1.1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 Tabel MPN untuk 5 seri tabung dengan 0.5 22 4 5 1 48 15 120 0 0 4.8 70 5 4 5 430 150 1.1 0.1.8 1.1 26 5 2 1 70 22 170 3 1 14 5.8 70 0 1 4 0.lim.

7 7.8 3.Tabel MPN untuk 10 seri tabung dengan 0.8 1.2 5. bawh -0.1 6.1 3.1 0.2 5.8 2 3 4 3 4 5 4 5 6.1 6.2 4.1 7.04 0.001 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 0 1 2 0 1 0 1 2 3 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 MPN/g 17 19 21 23 19 21 24 26 22 24 26 29 24 27 29 32 27 30 33 30 33 36 34 37 17 19 22 24 19 22 25 28 31 22 25 28 32 35 25 29 32 36 Conf.33 0.001 g inokulum.3 6.001 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 MPN/g <90 0.8 2.1.1 7.8 4.8 9 11 9.01 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 5 5 5 5 6 6 6 7 7 7 8 8 0 0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 0.4 0. (95 % confidence intervals).05 0.9 2.1 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 Tabung positif 0.1 5.33 0.3 6.1 5.1 5.2 5.7 9 10 11 9 10 11 12 10 11 12 14 11 12 14 15 12 14 15 14 17 17 17 17 7.37 0. lim.04 0.1 atas 3.9 3.2 7. Tabung positif 0.1 3 2.2 9 7.1 3 3 3.2 5.9 1.1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 0.82 1.2 7.9 3.8 0.1 1.6 5.5 Conf.01 dan 0. 0.9 1.33 0.7 2.1 2.94 1.4 5.1 3 3.4 2.2 9 9 11 11 7.8 1.2 7.1 3.33 0.3 4. lim.1 7.1 1.9 1.8 0.01 0 0 0 1 1 2 2 3 0 0 0 1 1 1 2 2 3 3 4 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 4 4 5 0 0 0 1 1 1 2 2 2 0.8 1.4 2.4 1.8 4.4 7.1 11 14 11 14 14 15 15 9 9.1 3 2.1 11 10 11 14 12 14 15 0.7 0.9 2.8 0.8 1.3 9 7.33 0.2 3.4 0.81 1.1 3.4 2.1 5.8 0.1 0.4 2.5 9 10 11 9 10 11 14 14 10 11 14 14 17 12 14 15 17 atas 34 34 39 44 34 39 44 50 39 44 50 58 44 50 58 62 50 58 62 58 73 74 73 74 31 34 39 44 39 40 44 58 58 44 46 58 58 73 50 58 62 74 .4 2. bawah 7.8 2.

3 7 7 3.5 9.5 5 5.6 3.6 3.3 10 9.6 3.6 4.8 9.5 5 4.6 6.5 3.1 3.8 8 9.3 11 11 12 12 6 7.8 8 6.6 9.6 4.5 9.5 5.6 1.6 5.6 4.2 8.2 11 3 3.7 7.6 3 3.6 4.6 6.5 5 3.6 5 14 15 17 15 17 17 11 12 14 12 14 17 15 17 17 17 18 20 18 20 20 22 22 14 15 17 18 15 17 18 21 17 18 21 18 21 23 21 23 26 25 26 26 17 17 20 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 3 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 6 6 6 6 7 7 7 7 8 8 8 8 9 9 9 0 0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5 40 29 33 37 41 45 33 37 42 46 51 38 43 47 53 44 49 54 60 50 55 61 68 57 63 70 23 27 31 37 27 32 38 44 52 33 39 46 54 63 40 47 56 66 77 89 20 14 15 17 20 20 17 17 20 20 25 17 20 21 25 20 21 25 26 25 25 26 30 25 30 30 11 12 14 17 12 14 17 20 25 15 17 20 25 30 17 20 25 30 34 39 91 58 62 74 91 91 73 74 91 91 120 74 91 100 120 91 100 120 120 120 120 120 140 120 140 140 44 50 58 73 57 61 74 91 120 73 79 91 120 140 91 100 120 140 150 180 .8 11 8.5 5 5 5.2 8.1 9.1 3.5 3.1 3.8 7.2 3 3.8 4.9 11 10 11 13 11 13 14 13 14 14 7.6 2.6 7 6.7 8.6 5 5.7 3.5 7.6 2.8 5.5 5 4.2 3 2.1 3.6 8.1 3.3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 6 6 6 3 3 3 4 4 5 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 5 5 6 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 6 0 0 0 0 1 2 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 0 0 1 2 6.6 8.3 8.

6 7 7.2 7.7 6.3 7.7 5 5.4 5.5 5 6.6 7 7.4 7 7.2 11 12 14 11 12 14 15 12 14 15 14 15 17 16 17 19 17 19 19 10 12 13 15 12 13 15 17 13 15 17 19 15 17 19 21 17 19 21 23 19 21 23 21 23 5.6 7 5 5.6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 7 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 5 5 5 6 6 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 0 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 0 1 12 9.4 9 9 9 9 9 4.2 5 6.2 7.3 7.4 9 7.2 9 9 10 9 9 10 11 9 10 11 10 11 22 18 21 22 26 21 22 26 30 23 26 30 26 30 34 30 34 34 34 34 34 20 21 25 28 22 25 28 31 26 28 31 34 30 34 34 39 34 34 39 44 34 39 44 39 44 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 7 7 8 8 8 8 8 8 8 8 8 9 9 9 9 9 9 9 9 9 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 49 59 70 82 94 110 62 74 87 100 110 130 140 79 94 110 120 140 160 180 100 120 140 150 170 190 220 240 130 150 170 200 220 250 280 310 350 170 200 230 260 300 350 400 460 530 21 25 30 38 44 50 26 30 38 44 50 57 70 34 39 50 57 70 74 91 44 50 61 73 91 91 100 110 60 70 80 90 100 120 120 150 150 74 91 100 120 140 150 180 210 210 120 120 150 180 180 210 140 150 180 180 210 220 280 180 180 210 220 280 280 350 210 220 280 280 350 350 380 480 250 280 350 350 380 480 480 620 620 310 380 480 480 620 630 820 970 970 .7 9 7.4 7.6 3.

pour plate. turbidimetri. Densitas sel sangat tergantung dari jenis sample. spread plate. • • • • • • • Hal-hal penting yang harus dipikirkan matang sebelum menganalisa sampel untuk diketahui jumlah mikroorganismenya adalah: Memperkirakan jumlah mikroorganisme yang ada dalam sampel per satuan volum.). Namun dalam ulasan ini lebih ditekankan pada metode yang memerlukan penghitungan koloni pada cawan petri. tetapi ada jenis bakteri yang memang pembelahan selnya dapat terpisah baik sehingga tersebar merata tiap sel dan ada pula bakteri yang setelah membelah sel anakan masih menempel pada induknya. yeast dan molds. . sarcina dll.1 7. bakteri. diplococcus.6 7 7. Pada dasarnya sel tersebar homogen pada sampel. pour plate dll.7 7 7 8 8 8 8 8 8 8 8 6 7 7 0 0 0 0 1 1 1 1 2 0 1 0 1 2 3 0 1 2 3 25 23 26 13 15 17 19 15 17 19 21 12 11 12 5. MPN. membaca atau bahkan bagi yang “expert” didapat dari perasaan. Memilih metode yang cocok sehingga dihasilkan data yang akurat. CFU’s adalah singkatan dari Coloni Forming Unit’s yang artinya unit-unit / satuan pembentuk koloni. Memperkirakan jumlah sampel (volum/berat) yang perlu ditampung pada saat pengambilan sampel yang disesuaikan dengan sample size dari metode teretentu.2300 280 110 120 150 180 210 280 350 480 620 810 1300 1300 480 620 820 970 1300 1500 1900 2400 3400 5300 -- PRINSIP DASAR TEORI MENGHITUNG MIKROORGANISME PADA CAWAN Banyak tersedia metode untuk menganalisa jumlah mikroorganisme dalam suatu sampel. diantaranya adalah plate count (spread plate.5 9 7. seperti membrane filtration. Pemahaman tentang satuan dalam menghitung sel mikroba khususnya bakteri adalah sangat penting. atau bakteri genus tertentu saja. misalnya bermaksud akan menghitung yeast.7 9 10 46 44 50 25 26 30 34 28 31 34 39 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 610 240 290 350 430 540 700 920 1200 1600 2300 >. seperti halnya yang terjadi pada streptococcus. Mencari tahu standar/ batas ambang/ jumlah maksimum aman jika sample yang dianalisa memerlukan referensi tersebut. Menentukan media pertumbuhan yang cocok. Seorang mikrobiologiwan sebaiknya mampu memprediksi jumlah sel mikroba dalam suatu sampel tertentu atau yang disebut dengan cell density sebelum menganalisanya. Pada hasil akhir penghitungan bakteri pada cawan digunakan satuan CFU’s/volume atau berat. Kemampuan mengira-ira ini dapat diperoleh dari pengalaman. Pada jenis yang seperti ini jika tersebar merata dalam kelompok-kelompok sel maka pertumbuhan menjadi koloni tunggal bukan berasal dari satu sel saja melainkan dari beberapa sel. sehingga penyebarannya berkelompok-kelompok. Benar-benar mengetahui perbedaan morfologi koloni antara bakteri. berat kering dll. menghitung langsung dengan Petroff Hausser ataupun cara lainnya (misalnya aktivitas metabolik. Mengetahui jenis/golongan mikroorganisme yang akan dihitung. membrane filtration. spiral plate). Yang dimaksud satuan pembentuk koloni adalah sel tunggal atau sekumpulan sel yang jika ditumbuhkan dalam cawan akan membentuk satu koloni tunggal.

Sample X diperkirakan memiliki jumlah mikroba yang sangat sedikit +/-30 koloni/100ml. • Membutuhkan kerja aseptis yang lebih teliti. • Sangat sensitif terhadap kontaminan (jumlah bakteri kontaminan yang tidak sengaja masuk. Kemungkinan dua koloni bergabung menjadi satu lebih besar sehingga mengaburkan jumlah sebenarnya karena dua koloni yang bergabung tetap dihitung satu koloni. Disarankan sebelum menghitung atau menganalisa yang sebenarnya. didapatkan 10-4 yang menghasilkan koloni dengan kisaran tersebut. Kisaran 30-300 koloni ini dijadikan titik tumpu dalam menentukan semua faktor yang mempengaruhi hasil akhir ini. Mengapa dipilih range jumlah koloni seperti itu ?. jika dengan ukuran sampel: . Misal. Sebagai pijakan awal. solusi : memperbesar ukuran sampel. Jika didapat jumlah koloni lebih besar dari 300 maka : • • • Dimungkinkan ada sifat antagonisme antar spesies.. Misalnya: Sampel X tidak dapat diperkirakan jumlah densitas selnya. ada juga yang menyebutkan 25-250 koloni per cawan. Memperbesar kemungkinan kesalahan (human error) dalam menghitung koloni Solusi : memperkecil ukuran sampel atau diencerkan. terutama statistical error. Perlu dilakukan pemplatingan awal dahulu supaya diperoleh tingkat pengenceran yang cocok sehingga menghasilkan 30-300 koloni per cawan. Perlu dilakukan penentuan sample size yang tepat terlebih dahulu supaya dihasilkan 30-300 koloni per cawan atau paling tidak mendekati. maka selanjutnya dengan sampel yang sama kita dapat mengulanginya dengan tingkat pengenceran yang sama (tanpa sampai pengenceran yang lebih tinggi). Keputusan ini adalah sangat penting. harus diketahui bahwa hasil yang paling baik adalah antara 30-300 koloni per cawan . besar pengaruhnya terhadap jumlah akhir koloni per cawan). dilakukan perkiraan (analisa pendahuluan) terlebih dahulu dengan mencoba memplatingnya pada ukuran sampel atau pengenceran yang berbeda-beda.Fungsi utama memperkirakan densitas sel ini adalah untuk menentukan perlu atau tidaknya dilakukan pengenceran atau untuk menentukan jumlah sampel yang akan dianalisa. tetapi sepertinya jumlah ml/cawan adalah lebih dari 300. Hal ini ditujukan untuk meminimalisir kemungkinan-kemungkinan kesalahan dalam proses analisa. Untuk lebih jelasnya: Jika didapat jumlah koloni kurang dari 30 maka: • Kesalahan statistik tinggi. seperti berapa ukuran sampel yang harus dianalisa dan metode apakah yang cocok untuk sampel tersebut. Contohnya. misalnya bakteri A menghambat bakteri B dengan mengeluarkan metabolit tertentu (antibiotik) sehingga bakteri B tidak tumbuh sedangkan keduanya berada diposisi yang berdekatan.. Perebutan nutrisi/ kompetisi sangat tinggi yang lama-kelamaan menimbulkan keterbatasan nutrisi.

Semakin kecil volume berarti semakin sedikit yang terambil oleh pipet. dan alasan-alasan berbau statistik lainnya. yang menunjukkan bahwa kesalahan teknis pemipetan semakin tinggi dan kesempatan sel yang tersebar secara acak dalam pelarut untuk terambil oleh pipet semakin tidak seragam. Berikut adalah penjelasan singkat metode-metode beserta ukuran sampel yang disarankan: Spread plate: teknik penanaman ini didasarkan pada penyebaran sel pada permukaan agar.1: kemungkinan kesalahannya adalah sel tidak tersebar merata (tidak tersapu oleh batang L) karena volume pelarut kurang walaupun dengan pengenceran yang tepat.100 ml dihasilkan 10 koloni. Sedangkan dengan keterbatasan metode (misalnya metode filtrasi membran tidak sanggup untuk menyedot sampel seperti air teh hasil pasteurisasi sampai lebih dari 500 ml karena akan menghambat pori pada membran tersebut sehingga membran macet) maka digunakan ukuran sampel yang paling mendekati batas bawah kisaran yaitu 30 koloni per cawan. Volume sampel yang ditanamkan umumnya 0. Selanjutnya dengan sampel yang sama kita dapat menganalisa dengan sample size 500 ml atau lebih. 100 ml dihasilkan 1 koloni/cawan. 400 ml dihasilkan 11 koloni/cawan. karena kisaran 30-300 koloni ini digunakan secara internasional. Yang dimaksud ‘mendekati’ disini adalah jika misalnya ditemukan data analisa pendahuluan seperti berikut: 50 ml dihasilkan 0 koloni/cawan. 200 ml dihasilkan 22 koloni. Jika digunakan volume: <0. atau mengapa tidak 100-500 koloni per cawan. Kita tidak perlu mengetahui secara dalam mengenai mengapa harus dalam kisaran itu. Berbagai metode umum untuk uji enumerasi bakteri yang ditanamkan dalam cawan petri antara lain: • Membrane filtration Pemilihan metode yang benar tergantung kepada : Jenis sampel Densitas sel (perkiraan dari analisa pendahuluan) Spesifikasi standar baku / standar lolos uji Telah diuraikan didepan bahwa sebagai patokan sebaiknya didapatkan 30-300 koloni per cawan dengan alasan utama adalah kesalahan statistik.1 ml pada cawan dengan diameter +/-9 cm. 200 ml dihasilkan 5 koloni/cawan. seharusnya mampu memilih metode yang tepat berdasarkan acuan kisaran itu. 500 ml dihasilkan 49 koloni. Pemilihan metode dengan benar. Namun sebagai microbiologist yang baik. 500 ml dihasilkan 16 koloni/cawan. maka sample size yang paling sesuai adalah 500 ml atau lebih. Selain itu juga adanya sedikit volume yang masih menempel dan tersisa (tidak ikut tertekan keluar) sangat besar pengaruhnya pada hasil yang diperoleh • Plate count –dengan teknik penanaman spread plate dan pour plate . Penentuan sample size ini juga dipengaruhi sifat sampel itu sendiri dan keterbatasan metode yang dipakai.

Secara peluang. >0. Penggunaan teknik penanaman ini sebaiknya dari jenis sampel yang memiliki densitas sel yang tinggi dan dengan pengenceran tertentu yang sesuai.0.1 ml : volume yang tepat untuk disebarkan diatas permukaan agar dan cukup mudah mengering sehingga tidak menggenangi permukaan agar. sel bakteri dapat terambil dengan acak dan seragam dari tabung. Lebih baik tidak menganalisa jenis sampel seperti air mineral dalam kemasan dengan teknik ini karena dikhawatirkan jika terdapat pertumbuhan maka pertumbuhan tersebut kemungkinan besar adalah .1 ml : volume yang lebih besar otomatis air di permukaan agar lebih banyak sehingga sulit mengering dan dapat menyebabkan pertumbuhannya memenuhi seluruh permukaan agar karena sel dapat disebarkan oleh air (inilah kekurangan dari metode spread plate).

1 ml-nya maka secara nalar peluang untuk terambil sangat kecil. Selain itu juga adanya sedikit volume yang masih menempel dan tersisa (tidak ikut tertekan keluar) dapat berpengaruh terhadap hasil yang diperoleh.1 ml dan diplating maka kemungkinan besar adalah tidak ada pertumbuhan.kontaminan. dan jika dari sekian ratus ml sampel hanya diambil 0. Jika digunakan volume: <1ml style="">spread plate semakin kecil volume berarti semakin sedikit yang terambil oleh pipet. Pour Plate : teknik pour plate adalah teknik penanaman dengan cara mencampurkan sampel yang mengandung sel mikroba dengan media pertumbuhan (agar) sehingga sel-sel tersebut tersebar merata dan diam baik di permukaan agar atau di dalam agar. 1-2 ml : volume sampel yang cocok tentunya dengan densitas sel >30sel/ml. Misalnya saja didapati ada pertumbuhan hanya satu koloni. Volume yang dipakai pada umumnya adalah 1-2 ml pada cawan dengan diameter 9 cm dan dengan penambahan media 5-10 ml. . yang menunjukkan bahwa kesalahan teknis pemipetan semakin tinggi dan kesempatan sel yang tersebar secara acak dalam pelarut untuk terambil oleh pipet semakin tidak seragam. Permasalahan ini dapat dijelaskan dalam kasus berikut: Hasil perhitungan koloni dari ilustrasi di atas adalah sangat tidak representatif dan jika tetap diambil 0. Ketiga alasan inilah yang menjadi keterbatasan metode pour plate. Hal ini disebabkan oleh sedikitnya jumlah sel per satuan volum dalam air mineral tersebut. Konsekuensinya adalah tidak semua jenis mikroorganisme dapat tumbuh di dalam agar (bersifat mikroaerofilik). semakin besar ukuran sampel dan jika ditambah dengan volume media yang sama maka pada saat pencampuran (swirl) dapat beresiko tumpah dan membasahi celah antara tutup dan dasar cawan petri yang akhirnya mempertinggi kontaminasi karena bakteri kontaminan yang menempel pada tempat itu dapat tumbuh. Selain itu. 2 ml : semakin besar ukuran sampel maka kekuatan agar semakin berkurang dan lama memadat sehingga dapat mempertinggi resiko kesalahan teknis seperti agar jatuh ke tutup cawan. Sebaiknya sampel yang dipakai untuk teknik ini memiliki densitas sel > 30 sel/ml sehingga didapatkan kisaran 30-300 koloni/cawan. Semakin besar ukuran sampel berarti semakin kecil konsentrasi komposisi media semakin encer) dengan penambahan media yang semakin berkurang jika digunakan ukuran cawan yang sama. maka dapat timbul pertanyaan apakah koloni ini berasal dari sampel atau kontaminan.

Selain cara tersebut sampel dapat terlebih dulu diencerkan sampai tingkat yang sesuai. Hal inilah yang menjadi keterbatasan teknik filtrasi membran. Misalnya air teh. maka sampel dapat ditambah dengan air steril. Membrane filtration : Prinsip teknik ini adalah dengan melewatkan sejumlah volume sampel pada saringan dengan diameter pori lebih kecil dari pada sel mikroba. madu dll. Beberapa pengaruh tersebut adalah: Viskositas / kekentalan sampel : semakin kental cairan maka semakin sulit difiltrasi sehingga volume yang dibutuhkan tidak terlalu besar. Lalu jika timbul pertanyaan bagaimana cara yang tepat untuk menganalisa jenis sampel jus jeruk atau jus apel hasil pasteurisasi yang diperkirakan memiliki densitas sel <10 style="">pour plate. Tujuannya yaitu menurunkan kekentalan sampel tersebut sehingga lebih mudah difiltrasi. Misalnya sirup. ukuran pori-pori membran filter dan acuan 30-300 koloni. -Jika akan menghitung bakteri pada sampel yang memiliki kekentalan yang tinggi. kecap. kopi dll. -Jika akan menghitung bakteri pada sampel yang mengandung jumlah bakteri sangat tinggi: maka dapat diambil sampel dengan ukuran sampel yang kecil (misalnya 1 ml). Setelah difiltrasi maka ditambahkan air steril secukupnya (20 ml) supaya sel tersebar merata pada membran filter.Teknik penanaman ini lebih tepat untuk jenis sampel yang tidak dapat untuk difiltrasi dan sulit sulit untuk diratakan di permukaan agar seperti jus buah. -Jika akan menghitung bakteri pada sampel yang mengandung jumlah bakteri sangat sedikit maka ukuran sampel sebaiknya diperbesar. Bahan-bahan yang terlarut dalam sampel : suatu bahan-bahan mikroskopis yang dapat menghambat pori-pori sehingga semakin sedikit jumlah pori yang dapat melewatkan larutan tersebut. Jika tidak ditambahkan air steril maka pertumbuhannya akan mengelompok di pinggir yang disebabkan oleh adanya pengumpulan air sampel pada pangkal filter funnel (corong) dan juga kemungkinan masih ada sel yang menempel pada dinding filter funnel (fungsi membilas). Ciri-ciri dari jenis sampel yang seperti ini adalah terdapat bekas pada membran filter setelah dilakukan penyaringan. standar lolos uji / jumlah maksimum aman. Perhitungannya . Hal ini akan dibahas pada bagian selanjutnya. dan dapat berpengaruh kepada jenis sampel dan ukuran sampel yang akan dianalisa. Ukuran sampel yang dipakai dalam teknik membran filtrasi tergantung kepada jenis sampel.

20 ml) untuk menyebarkan sel-sel pada kertas membran (dapat dilihat pada gambar).100 koloni) lalu pada tingkat pengenceran 102 sel/ml. maka penanaman sebaiknya dilakukan dengan pour plate yaitu diambil 1 ml (+/. style=""> memperbanyak sel (koloni) untuk dihitung. Tiap pengenceran yang tepat beserta teknik penanamannya tersebut hanyalah opsi yang dapat disesuaikan dengan tujuan dan alat yang tersedia.100 koloni. Perkiraan jumlah per 500 ml air adalah <10cfu. Lalu bagaimana cara menghitungnya? Air mineral dalam kemasan merk tertentu dibuat sedemikian rupa sehingga sebisa mungkin bebas dari bakteri. Studi kasus : Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel air sungai / kali tercemar? Permasalahannya: air sungai memiliki perkiraan densitas sel yang sangat tinggi misalnya dapat mencapai 108sel/ml. Jika akan dianalisa dengan filtrasi membran dan transfer cairannya hanya 1 ml atau lebih maka sebaiknya setelah disaring. Sampel air sungai dapat diencerkan secara bertingkat (1:9) atau yang disebut teknik gradual dilution.1 ml (didapatkan +/. ditambahkan air steril secukupnya (+/. Dari tingkat pengenceran yang tepat dapat ditanam dengan metode spread plate. . maka penanaman sebaiknya dilakukan dengan spread plate yaitu diambil 0. Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel air mineral? Permasalahannya adalah bahwa sampel ini memiliki jumlah bakteri yang sangat sedikit yang terlarut dalam air dengan volume yang banyak. pour plate ataupun dengan teknik membrane filtrasi.100 koloni). Perlu diingat bahwa tetap mengacu pada kisaran 30-300 koloni per cawan sehingga misalnya pada tabung (10ml) pengenceran yang menghasilkan kira-kira 103 sel/ml.tetap mengacu pada volume sampel yang dianalisa bukan volume total setelah ditambah air steril karena air steril ini bukan bagian dari sampel. Perhatikan ilustrasi berikut: . sedangkan dari tingkat pengenceran yang diperkirakan menghasilkan 10 sel/ml maka seluruh volume dalam tabung dapat difiltrasi sehingga didapatkan +/.

. Cara analisa yang tepat adalah dengan teknik pour plate. sedangkan perbandingan antara sampel dan media adalah 1:1. Jika hal ini dilakukan maka akan membutuhkan teknik aseptis yang sangat teliti. Jadi hal ini ditujukan untuk mengimbangi ukuran sampel yang besar sehingga konsentrasi media setelah dicampur menjadi 1X. maka ukuran sampel yang diambil terlalu sedikit (0. tetapi kekurangannya adalah ukuran sampel yang kecil (1 ml).Volumesampel yang disarankan sebaiknya dengan volumeyang besar (misalnya 500ml). Hal ini disebabkan adanya zat-zat yang terkandung dalam teh yang dapat menghambat pori membran sehingga jika lebih dari 100ml (pada umumnya) proses filtrasi akan macet. Jika dianalisa dengan teknik penanaman spread plate. Hal ini jelas membutuhkan cawan minimal 70 buah dan dengan konsumsi media yang lebih boros. Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel jus buah yang mengandung ampas buah hasil pasteurisasi? Permasalahan disini yaitu jumlah bakteri yang sangat sedikit dalam volume yang banyak dan juga adanya ampas buah yang dapat menghambat pori membran filter ataupun ujung pipet ukur. Namun hal ini dapat disiasati dengan memperbesar ukuran sampel (misalnya menjadi 5 ml) dan ditambah dengan media pertumbuhan yang konsentrasinya lebih besar (misalnya 2 kali resep) sehingga saat dicampur dengan sampel maka konsentrasi media dapat menjadi 1X. Misal dalam botol 350 ml jus stroberi hasil pasteurisasi merk tertentu diperkirakan terdapat <10cfu style="">pour plate masing-masing 5 ml pada tiap cawan (d: 9 cm) dengan konsentrasi media 2X (penambahan media +/-5 ml) . Mengapa media yang ditambahkan konsentrasinya lebih besar? Karena dalam teknik yang tidak biasa ini membutuhkan sampel 5 ml. maka ampas buah dapat menghambat membran filter. tapi yang menjadi titik kelemahan disini yaitu sifat dari sampel itu sendiri yang tidak dapat disaring dengan teknik filtrasi membran dalam volume yang besar. Kemudian penjumlahannya tetap dijumlahkan total dari beberapa membran filter tersebut.Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel air teh dalam botol hasil pasteurisasi? Permasalahnnya hamper sama dengan menghitung mikroba pada air minum dalam kemasan yaitu jumlah bakteri yang sedikit. Jika dianalisa dengan teknik filtrasi membran. Namun dalam volume 500 ml itu disaring pada beberapa membran filter sehingga membran tidak terlalu mampat oleh zat-zat di dalam teh. Tidak dapat satu-satu.1ml) sehingga kesalahan statistiknya sangat tinggi.

bulgaricus yang distimulus oleh adanya molds).Kisaran hitung Seperti yang sampai saat ini diketahui (dan telah dijelaskan di depan) bahwa kisaran yang paling tepat dalam menghitung koloni pada cawan adalah 30-300 koloni/cawan atau 25-250 koloni/cawan. Selain itu komposisi nutrisi dan jarak antar koloni juga mempengaruhi jumlah koloni per cawan karena koloni tetangga mungkin dapat menghambat pertumbuhan atau menstimulus koloni didekatnya (seperti B. Breed dan Dotterrer memakai tiga kali plating tiap pengenceran (triplicate plating) dalam percobaanya dan memilih cawan yang masuk kisaran dari tiap pengenceran. Mereka menentukan kisaran ini berdasarkan alasan supaya hasil perhitungannya tidak menimbulkan kesalahan statistik yang serius. orang yang sama menyimpulkan tentang kisaran hitung 40-200 koloni/cawan yang digunakan sebagai landasan pelaporan. Tiga tahun kemudian muncul pernyataan bahwa cawan yang mempunyai koloni lebih dari 100 koloni/cawan sebaiknya diabaikan. Hill menyarankan untuk tidak menghitung cawan yang terlalu banyak jumlah koloninya (overcrowded) karena tidak memberikan hasil yang sesuai dengan kenyataan. Permulaan penentuan kisaran ini berawal dari seorang mikrobiologiwan bernama Nersser (1895) yang menyimpulkan bahwa hitungan cawan yang paling baik adalah cawan yang memiliki 10. Selanjutnya pada tahun 1897. Pada analisa ini cawan yang memiliki jumlah koloni <30 dan >400 dianggap . Kisaran ini diterima pada Comitee Standard Method of Bacteriology Water Analysis (1915) dan diubah menjadi 30-200 koloni/cawan. Mereka juga mencatat bahwa jenis bakteri dapat mempengaruhi ukuran koloni dan jumlah koloni yang tumbuh pada cawan. Kemudian tahun 1908. Pencetus kisaran hitung 25-250 koloni/cawan dikemukakan oleh Breed dan Dotterrer pada tahun 1916 yang mempublikasikan dalam seminarnya mengenai topik ini.000 koloni/cawan yang perhitungannya dilakukan dengan mikroskop pada perbesaran rendah.

sedangkan cawan yang memenuhi syarat itu sendiri berjumlah antara 50 dan 200 koloni/cawan. Bacteriological Analytical Manual) merekomendasikan 25-250 koloni/cawan sebagai kisaran hitung secara keseluruhan. Oleh karena itulah banyak koloni yang “hilang” sehingga menampakkan pengurangan koloni yang muncul pada cawan. Istilah untuk menggambarkan jumlah koloni yang melebihi batas atas kisaran hitung adalah TNTC (Too Numerous To Count). Seperti yang telah dikemukakan bahwa semakin banyak koloni yang tumbuh pada permukaan agar. Alasan inilah yang membatasi kisaran hitung pada 250 atau 300 koloni Batas bawah kisaran hitung . Batas atas kisaran hitung. maka pelaporannya adalah >2000 CFU/ml(g). ASTM menyarankan untuk melaporkan TNTC sebagai lebih besar dari batas atas. Pencetus lainnya adalah Tomasiewicz (1980) yang menyimpulkan bahwa kisaran hitung untuk plate count dengan ulangan 3 kali (triplicate) yaitu 25-250 koloni/cawan.tidak memenuhi syarat. Kenapa pada pengenceran 1/10 jumlah koloni yang diamati lebih kecil dari pada jumlah koloni yang sebenarnya dalam satuan volum yang sama?. ASTM (American Standard Testing and Methods) menyarankan untuk menggunakan ksiaran hitung 20-80 koloni/membran jika menggunakan teknik filtrasi membran. FDA BAM (Food and Drug Administration. USP (United States Pharmacopoeial) merekomendasikan untuk menggunakan kisaran hitung antara 25 dan 250 koloni/cawan untuk bakteri pada umumnya dan Candida albicans. Kesimpulan ini didapat dari data analisa susu (raw milk) pada tiga eksperimen yang berbeda. maka antar koloni dapat saling mempengaruhi baik menekan atau menstimulus pertumbuhan koloni tetangganya dan juga perebutan nutrisi dan tempat yang semakin ketat. Penjelasan logika mengenai alasan adanya batas atas kisaran hitung dapat diperhatikan pada gambar berikut. misalnya >200 CFU pada cawan dari pengenceran 1/10. 20-200 koloni/cawan untuk spread plate dan 30-300 koloni/cawan untuk pour plate. Sedangkan kisaran yang disarankan jika menganalisa jumlah Aspergillus niger adalah 8-80 koloni/cawan. Hal ini karena pertumbuhan koloni yang terlalu penuh/banyak dalam cawan dengan diameter yang sama.

Di dalam teknik plate count secara sederhana dapat dijelaskan sebagai berikut: LOD menggambarkan ada atau tidak adanya sel mikroorganisme dalam suatu sampel. ASTM menyarankan supaya analis melaporkan <1 CFU/ml jika tidak ada pertumbuhan pada cawan dalam suatu pengenceran. angka <1 didapatkan dari LOD yaitu 1 CFU. . FDA BAM menyarankan jika menghitung di bawah batas bawah kisaran hitung maka dilaporkan sebagai Jika kita melaporkan perhitungan cawan yang memiliki jumlah koloni <25. Jika jumlah koloni >LOD dan LOQ dan >LOD. Cara menghitung Khusus untuk spread plate (aerobic plate count). LOD adalah jumlah minimum koloni yang dapat dibedakan dari ketidakadaan. Secara teoretis jika jumlah koloni /cawan dibawah 25 maka kesalahan statistik yang digambarkan dalam persentase mean akan meningkat pesat karena estimasi kesalahan (error) adalah akar kuadrat dari mean sehingga nilai persentase mean akan seperti pada grafik diatas (grafik derajat kesalahan pada jumlah koloni yang rendah). Sedangkan LOQ adalah suatu batas jumlah koloni yang cukup/pantas untuk dapat dihitung dengan tingkat presisi dan akurasi yang dapat diterima. sedangkan LOQ menggambarkan batas yang memberikan kemungkinan minimal untuk salah memperkirakan jumlah sel yang sebenarnya dalam suatu sampel. tapi pada konsentrasi ini. Hal ini sangat penting jika kita menganalisa sampel dengan spesifikasi pada kisaran yang kurang dari batas bawah kisaran hitung. Misalnya <10 CFU/ml untuk pengenceran 1/10. maka analisa ini mempunyai tingkat akurasi yang rendah.Titik konsentrasi pada batas bawah kisaran hitung ini berada pada pelaporan Limit of detection / LOD (1 CFU) dan Limit of Quantification / LOQ (<25CFU atau <30CFU). sampel sangat mungkin mengandung kontaminan (ketidakmurnian) dan terdapat separuh kemungkinan untuk bernilai nol dan separuh kemungkinan untuk bernilai 1.

sehingga tidak mungkin ada n3.1. Pada kasus diatas pada pengenceran 1/100 (250) diencerkan 1/10-nya didapat 181. . Lalu dihitung dengan rumus : Pada contoh 2 ini tidak dapat dimasukkan ke dalam rumus karena terdapat kesalahan dalam tekniki menganalisanya. Pada rumus terdapat n1 dan n2. seharusnya sekitar 25 koloni.Dipilih cawan yang mempunyai koloni 25-250 koloni atau 30-300 koloni. kenapa tidak ada n3? Karena setiap pengenceran diencerkan 1/10-nya sedangkan kisarannya adalah 25-250 koloni. Jika dijumpai cawan yang memiliki koloni diluar kisaran 25-250 maka dipilih cawan yang mempunyai jumlah koloni yang paling mendekati. 2. Jika dijumpai cawan dengan jumlah koloni <250 maka dipilih cawan yang berjumlah paling mendekati batas atas kisaran tersebut.

pembulatan dibulatkan keatas jika digit ketiga adalah ≥5 dan pembulatan dibulatkan ke bawah jika digit ketiga adalah <5.1). hanya disesuaikan dengan kisaran hitung yang telah dipersyaratkan.8. TEKNIK MEMBRAN FILTER UNTUK MENGHITUNG MIKROBA . 3. Pembulatan dan merata-ratakan. Sedangkan menurut BAM dibulatkan ke atas jika digit ketiga ≥6 (6. semua cawan yang memiliki pertumbuhan koloni yang menyebar di permukaan agar dilaporkan sebagai koloni menyebar (spreader/ SPR) atau kecelakaan laboratorium (Lab Accident/ LA).*EAPC (Estimated Aerobic Plate Count) atau jumlah yang diperkirakan.7.9) dan dibulatkan ke bawah jika ≤4 (4.2. Semua cawan yang memiliki koloni rata-rata 100CFU/cm2 dilaporkan dengan perkiraan lebih besar dari 100 kali dari tingkat pengenceran tertinggi Tata cara diatas digunakan khusus untuk plate count dengan teknik spread plate atau yang disebut Aerobic Plate Count. Bila digit ketiga adalah 5 maka dibulatkan ke atas jika digit kedua adalah ganjil dan dibulatkan ke bawah jika digit kedua adalah genap. Untuk teknik plating dengan pour plate atau filtrasi membran pada dasarnya prinsip-prinsip mengenai perhitungannya adalah sama.3. Pembulatan diperlukan jika dijumpai hasil perhitungan dengan tiga digit angka signifikan. Menurut USP dan ASTM.

Praktis dalam preparasinya. Teknik filtrasi membran banyak dipakai di berbagai perusahaan makanan. Melalui proses pengeringan tertentu. Beberapa jenis mikroba yang berdiameter lebih kecil dari pori seperti Rickettsia dan Mycoplasma mampu lolos dari pori kertas membran. Nutrisi yang terdapat pada media akan berdifusi dan terserap kedalam kertas membran sehingga selsel yang tersebar acak dan kasat mata itu dapat tumbuh menjadi koloni yang dapat dihitung dengan mata telanjang setelah melewati masa waktu inkubasi tertentu. farmasi dan kosmetik untuk mengontrol jumlah mikroba pada produk atau tahap potensial lainnya. warna dan sifat lain dari masing-masing koloni tergantung kepada jenis mikroba yang berada pada kertas membran. minuman. Inhibitor pada sampel yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba seperti antibiotik.Pendahuluan Telah banyak ulasan populer mengenai teknik filtrasi membran yang dikemukakan di berbagai sumber. Oleh karena itu. Sulit untuk menghitung mikroba pada sampel yang berampas atau memiliki banyak partikel (kekeruhan tinggi) karena partikel tersebut akan menyumbat pori-pori kertas membran. Kurang praktis untuk menghitung mikroba mikroaerofilik atau anaerob (kecuali dengan perlakuan tertentu). Bentuk. Sulit untuk menghitung mikroba pada sampel dengan kekentalan yang tinggi karena membutuhkan waktu penyaringan yang lama. Kertas membran ini bersifat solid sehingga dapat menahan sel yang terjebak tetap pada posisinya dan kemudian dapat berkembang tanpa bercampur dengan sel lain yang ikut terjebak juga. dapat dilakukan berulang kali penyaringan (melipatgandakan cabang corong) dan reprodusibel. tetapi masih jarang dijumpai pembahasan secara menyeluruh yang berbahasa indonesia. sel-sel yang terdapat pada sampel akan terjebak pada permukaan membran yang relatif luas. Pada umumnya cawan yang digunakan berukuran kecil (50mm) sehingga dapat menghemat penggunaan media dan tempat pada inkubator. Dasar teori Banyak metode yang tersedia untuk menghitung mikroba. Dapat menganalisa sampel dengan volume yang besar dalam waktu yang singkat yang dibatasi oleh kekentalan dan kekeruhan cairan sampel. Sedangkan kekurangan teknik ini adalah. Semoga dapat membantu. Pada tulisan kali ini. Selanjutnya membran dipindahkan secara aseptis dari peralatan filtrasi ke dalam cawan petri berisi media. Teknik filtrasi membran yang juga dikenal sebagai molekular filter adalah metode yang mampu memisahkan antara partikel ukuran tertentu (ukuran sel bakteri) dengan sejumlah besar cairan. Dapat menganalisa sampel dengan jumlah mikroba yang sedikit (peningkatan keakuratan pendeteksian mikroba). Tulisan ini lebih bertujuan untuk membantu mikrobiologiwan yang baru mengenal atau belum berpengalaman mengenai teknik filtrasi membran. kertas membran yang telah ditumbuhi koloni dapat dijadikan dokumen atau data permanen demi kepentingan perekaman data. Jadi selama proses penyaringan berlangsung. Membran ini memiliki pori-pori berukuran mikroskopis dengan diameter lebih kecil daripada ukuran sel mikroba pada umumnya. Sejarah metode ini dikembangkan oleh Geotz dan Tsuneishi pada tahun 1951. salah satu metode yang praktis adalah teknik filtrasi membran. Kelebihan teknik filtrasi membran dibanding metode lain adalah. Sangat cocok untuk mikroba aerob (jika dibandingkan dengan pour plate) yang sebagian besar menjadi faktor pengontaminasi yang penting pada produk industri. klorin atau zat pengawet dapat terbilas. Masukan yang bersifat membangun atau mengkritisi akan dijadikan bahan pertimbangan yang sangat berharga. Ulasan yang bukan karya tulis ini berpegang pada nalar analitis proses dan sedikit kepada pengalaman orang lain yang lebih dulu (referensi) sehingga masih sangat banyak membutuhkan penambalan di berbagai bagian dari para ahli. sedangkan MPN hanya memperkirakan jumlah yang diindikasikan dengan adanya perubahan pada media Prinsip teknik filtrasi membran ini adalah dengan menyaring cairan sampel melewati saringan yang sangat tipis dan yang terbuat dari bahan sejenis selulosa. Kurang cocok untuk menghitung sampel dengan jumlah mikroba yang terlalu pekat walaupun pengenceran dapat dilakukan dengan pengenceran bertingkat. posting ini hadir untuk melengkapi kekurangan tersebut. penulis lebih menitikberatkan pembahasan pada teori dan teknik yang sebagian besar diperoleh berdasarkan pengalaman tanpa banyak didukung sumber bacaan. . Filtrasi membran diperkenalkan sebagai metode alternatif pengganti MPN yang mampu mengisolasi koloni yang berbeda.

Spread plate memiliki batas volume sampel 0. Berikut adalah gambar peralatan filtrasi yang dapat digunakan untuk sterilisasi ataupun menghitung mikroba. Pada tahun 1978 U. EPA merekomendasikan bahwa teknik membran filtrasi digunakan untuk monitoring air karena keunggulannya tersebut. Jika dibandingkan dengan metode penghitungan lain seperti spread plate. Perbedaannya adalah terletak pada kepentingannya. pour plate.5 ml sedangkan pour plate 2 ml. Prinsipnya sama.Selain digunakan untuk menghitung bakteri. Untuk perbandingan lebih detail antar metode penanaman dapat dilihat pada PRINSIP DASAR TEORI MENGHITUNG MIKROORGANISME PADA CAWAN . .S. glukosa dll. Keunggulan inilah yang melatarbelakangi pemilihan metode ini untuk jenis sampel yang cocok. yaitu menyaring suatu cairan non steril dengan kertas membran sehingga cairan yang melewatinya akan terbebas mikroba (steril). atau MPN. spiral plate. antibiotik. teknik filtrasi membran dalam mikrobiologi digunakan juga untuk proses sterilisasi secara mekanis (dengan penyaringan). Pada umumnya bahan yang disterilkan melalui cara ini adalah bahan yang mengandung senyawa tidak tahan suhu tinggi atau tekanan tinggi seperti serum darah. Jika untuk tujuan sterilisasi maka cairan hasil filtrasi harus dijaga kesterilannya dengan menyediakan tempat dan tutup yang steril dan kertas membran tidak ditanam ke dalam media melainkan dibuang. metode ini memiliki perbedaan yang mencolok yaitu kemampuannya menganalisa sampel dengan volume besar dan keakuratan pada jumlah mikroba yang sedikit.

Berikut beberapa jenis media pertumbuhan berdasarkan tujuannya beserta waktu dan suhu inkubasinya. (2). (3). Selain itu untuk menghitung bakteri kelompok tertentu atau mikroba jenis tertentu membutuhkan media pertumbuhan yang spesifik seperti endo. Standard methods agar (48-72 + 2 jam pada 35°C) m-HPC agar (48-72 + 2 jam pada 35°C) Soybean-Casein Digest Medium (24–72 jam pada 30°C–37°C) Coliform dan E. Air steril yang ditambahkan ke absorbent pad yang mengandung media yang dikeringkan (dehydrated) yang produknya disebut Nutrient Pad Set (NPS). untuk coliform. Total Count: R2A (48-72 jam pada 35 + 0. Standard Methods Agar dll. Media yang ditambahkan dari atas setelah filtrasi yang disedot dengan pompa vakum yang disebut dengan metode filtrasi membran monitor. chromocult.5°C atau 5-7 hari pada 20-28 C).Terdapat beberapa variasi penyiapan media yang digunakan pada teknik ini tetapi pada prinsipnya sama saja. Media agar yang dituang ke cawan petri kosong dan dibiarkan memadat. Banyak tersedia jenis media pertumbuhan untuk metode filtrasi membran dengan tujuan menghitung bakteri heterotrof (total count) seperti MTGE. coli: Chromocult (24 jam pada 36 ±1°C) Endo (24 jam pada 37°C) Teepol (18–24 jam pada 37°C) MacConkey (18–24 jam pada 37°C) Tergitol TTC (20 ±4 jam pada 37°C) Yeast and molds: Schaufus-Pottinger (2–3 hari pada 28–30°C) Sabouraud (2–5 hari pada 25–30°C) Wort (2–3 hari pada 25°C) Malt extract (2–3 hari pada 25–30°C) Bakteri fekal : Azide (24–48 jam pada 37°C) Bismuth-Sulfite (18–48 jam pada 37°C) Bakteri non fekal: Chapman(48 jam pada 37°C) Cetrimide (48 jam pada 37°C) . Media broth yang dituang ke absorbent pad (semacam kertas isap). Yeast extract (44 ±4 jam pada 36 ±2°C atau 68 ±4 jam pada 22 ±2°C) Standard TTC (48 jam pada 30 °C). Perbedaannya yaitu (1). (4). m-HPC Agar. Metode yang terakhir ini lebih tidak time-consuming karena hanya perlu ditambahkan sampel dan media tanpa merakit peralatan filtrasi.

Umumnya kertas membran terbuat dari senyawa selulosa. hitam dengan warna garis-garis (grid) kontras dengan warna kertas membran. 0. bukan autotrof (yang memiliki klorofil) kecuali koloni yang tumbuh pada media yang diberi zat warna atau indikator hijau seperti schauffus pottinger m-green yeast and mold media.2um. 0.65um. Beberapa warna umum kertas membran yang tersedia adalah hijau. putih. maka E. misalnya selulosa nitrat.45um. selulosa murni. Pemilihan pori kertas membran yang cocok berkorelasi dengan rata-rata diameter sel mikroba yang diinginkan. Kertas membran warna gelap (hitam) cocok untuk menghitung koloni yeast dan mold yang sebagian besar berwarna terang. Kunci keunggulan dari teknik filtrasi membran terletak pada keistimewaan kertas membran yang memiliki pori-pori lebih kecil dari benda yang disaring dan hanya mempunyai tebal 0. dan 1. Berikut adalah hubungan antara ukuran pori kertas membran dengan ukuran sel berbagai macam jenis mikroba. Kertas membran warna putih digunakan untuk menghitung koloni yang tumbuh pada media yang ditambah pewarna (dye). poliamida dll. atau polimer lain seperti polikarbonat (polimer plastik). Bahan yang paling umum diapakai dalam mikrobiologi adalah selulosa nitrat. Bahan kertas membran dari selulosa bersifat hidrofilik. . Setiap bahan memiliki kelebihan tersendiri dan fungsi yang lebih khusus. Ukuran pori-pori kertas membran yang tersedia adalah 0. Jadi warna hijau adalah warna yang cocok untuk total count dan dengan media tanpa zat warna. Mikroba yang dimungkinkan tumbuh sebaiknya mempunyai kekontrasan dengan warna kertas membran sebagai latar belakang. Lagipula sangat jarang terdapat bakteri yang memiliki warna koloni hijau. transparan. campuran ester selulosa nitrat dan selulosa asetat. maka digunakan kertas membran dengan pori 0.8um. tapi jika bertujuan untuk menyaring spora jamur dan sel ragi maka cukup dengan pori 0. Warna hijau cocok untuk menghitung mikroba yang memiliki koloni putih. 0.65um.Ketepatan pemilihan kertas membran juga perlu dipertimbangkan demi kenyamanan mata dalam menghitung.coli (green metalic sheen) yang terdeteksi akan terlihat nyata.45um. misalnya kertas membran putih diletakkan pada media endo berwarna merah muda.2um. Setiap warna memiliki tujuannya masing-masing. atau berwarna. selulosa asetat. rusak jika terkena zat volatil seperti alkohol dan tidak tahan suhu tinggi. Jika tujuan analisa untuk menyaring sel bakteri. karena sebagian besar bakteri yang menyebabkan pembusukan adalah heterotrof. abu-abu.1mm ini.

-Gridded membrane filters (kertas membran berskala). -Manifold (filtrasi bercabang). .Pengenalan peralatan pada teknik filtrasi membran Pada dasarnya alat dan bahan utama yang dibutuhkan untuk teknik filtrasi membran adalah: Corong – untuk menampung cairan sampel Tutup corong – untuk mencegah kontaminasi sekunder atau kontaminasi dari udara Dasar corong – sebagai dasar penyangga corong dan tempat peletakan kertas membran Cawan petri dan media – sebagai sumber nutrisi Labu penghisap / penampung – tempat untuk menampung cairan hasil penyaringan Pompa vakum – alat untuk menurunkan tekanan Selang / pipa – sebagai penyalur cairan atau udara antar bagian Kertas membran – alat penyaring Pinset – menjepit kertas membran Dan alat lain untuk mendukung proses kerja aseptik Misal produk dari Sartorius dapat terdiri dari: -Stainless steel funnel (corong). -Suction flask (labu pengumpul). -Water trap (alat pencegah masuknya air ke dalam pompa vakum). -Single base / filter base (dasar corong). -Lid dan gasket (tutup dan karet).

9. Menuang sampel dan menyalakan pompa vakum. merakit peralatan dengan memasang corong pada dasar corong. Mengangkat kertas membran ke dalam cawan. 7. 3. Sterilisasi dasar corong dan corong menggunakan bunsen 2. Membuka 6. . Cara kerja Sterilisasi alat Membuat media atau menambahkan air pada NPS Merakit peralatan Melepas kertas membran dan memasangnya Menuang sampel Penyedotan pompa vakum Pembilasan corong Peletakan kertas membran pada cawan Inkubasi cawan Sanitasi peralatan Hasil inkubasi 5. Menginkubasi cawan pada suhu dan waktu yang tepat. 5. 4.4. Permasalahan yang umum terjadi Pertumbuhan spreader atau koloni yang melebar TNTC (Too Numerous To Count) Koloni terkumpul di pinggir atau suatu tempat Terdapat gelembung pada kertas membran Membran terangkat dan terlipat Terdapat pertumbuhan di luar bekas corong dan pinset Inkubasi terlalu lama Cairan sampel yang kental sulit tersedot Tetesan air yang jatuh Cara kerja Gambar tahap-tahap prosedur teknik filtrasi membran adalah 1. Melepaskan corong 8. Mengeluarkan kertas membran dari pembungkus. Meletakkan kertas membran pada dasar corong.

Diharap sangat hatihati jika melakukan sterilisasi dengan cara ini. tetapi jika dipakai berulang kali maka dapat disterilisasi dengan dibakar.Sterilisasi alat Setelah prosedur permulaan kerja aseptik dilaksanakan. single base. Jumlah media cair yang berlebih dikhawatirkan dapat mengalir ke permukaan kertas membran dan menghasilkan koloni spreader. Cara sterilisasi yang utama dapat menggunakan autoklaf. Caranya yaitu dapat dibakar langsung dengan pembakar bunsen atau disemprot alkohol terlebih dahulu lalu dibakar. tapi cara ini lebih rendah tingkat sterilitasnya dibanding dengan dibakar. Merakit peralatan . Bagianbagian yang lebih diutamakan kesterilannya adalah muka single base/filter base yang akan ditempeli kertas membran dan bagian dalam funnel yang akan kontak dengan sampel. Penambahan air steril atau media cair pada absorbent pad atau Nutrient Pad Set (NPS) mengikuti petunjuk produk. funnel. Hasil penuangan media agar seharusnya memiliki permukaan yang rata supaya kertas membran dapat merekat sempurna di permukaan agar. alat-alat filtrasi seperti manifold. Selain itu hal ini dapat mempermudah menempelnya kertas membran di permukaan pad yang basah. dan lid (semuanya terbuat dari stainless steel) sebaiknya disterilisasi terlebih dahulu. Terdapat alternatif lain yang lebih aman yaitu hanya disemprot alkohol saja atau direndam dalam air panas. Volume media yang cukup dicirikan dengan adanya sedikit lingkaran air atau media yang lebih disekeliling pad yang mendukung suplai air selama masa inkubasi. Membuat media atau menambahkan air pada NPS Seperti yang telah diuraikan diatas. preparasi media yang sesuai dapat dipilih sesuai dengan kebutuhan dan keadaan.

tetapi jika dibutuhkan misalnya sampel 1-10ml disarankan menggunakan mikropipet non-fix (1-10ml) supaya volume yang terambil benarbenar presisi. 20ml) dalam penuangan sampel karena lebih beresiko untuk bertambah atau berkurangnya volume sampel. Pembilasan corong Pembilasan corong dengan air steril dilakukan untuk memastikan tidak ada mikroba yang tidak tersaring terutama untuk analisa dengan kisaran jumlah mikroba yang sedikit walaupun hal ini meningkatkan resiko kontaminasi dari air . Semakin kecil pengambilan sampel dengan spoon maka semakin tidak akurat volume yang terambil. Jika sampel yang ditambahkan sedikit dan direncanakan tidak akan dibilas maka penuangan harus langsung mengenai kertas membran. tekanan dalam ruang tertutup itu masih lebih rendah dari pada ruangan sehingga udara masih tetap tersedot walaupun semua sampel telah berada pada labu pengumpul. Melepas kertas membran dan memasangnya Mengingat kertas membran yang digunakan bersifat hidrofilik maka dasar corong yang kering (setelah sterilisasi panas) sebaiknya dibasahi dengan air steril supaya kertas membran lebih mudah ditempelkan. Terlalu ketat penjepitan kertas membran dapat mengakibatkan sobeknya kertas membran saat diangkat dan menimbulkan bekas cekungan yang dalam. Lebih baik tidak menggunakan spoon (fix volume. Jika dengan tangan pastikan kebersihan tangan dengan alkohol. 10ml. Perlu diperhatikan bahwa saat saklar pompa dimatikan. Hal ini seperti menempelkan kertas buram pada meja yang berair. Jika pada manifold dilengkapi dengan tuas (semacam kran) untuk membuka dan menutup udara. maka lebih baik udara ditutup terlebih dahulu kemudian dibuka setelah kertas membran diletakkan pada cawan supaya tekanan menjadi sama. Biasanya pada corong telah tertera skala volume. 5ml. Selain itu biasanya tekanan di dalam masih tetap rendah saat semuanya selesai dan mengakibatkan tersedotnya udara yang menimbulkan bunyi (proses menyamakan tekanan) saat kertas membran diangkat dari dasar corong. Jika sampel yang ditambahkan terlalu banyak (misalnya 500ml) dan bila tersaring semua dimungkinkan dapat menyebabkan tersumbatnya ppori kertas membran. Menuang atau menambahkan sampel Cairan sampel dapat dituang langsung dari botol atau wadah jika volumenya cukup besar. Sebaiknya menghindari pengambilan sampel dibawah 1ml karena dapat mempertinggi tingkat kesalahan penuangan (penyebaran acak atau kehomogenan sel dalam sampel kurang seragam). maka penuangan sampel dapat dibagi menjadi dua atau tiga pada corong yang berbeda sehingga perhitungannya tetap dijumlahkan dari seluruh cawan yang ada. Penyedotan pompa vakum Pompa vakum bekerja mengurangi tekanan udara dalam selang dan bagian dalam peralatan filtrasi sehingga air sampel pada corong tersedot dan ditampung pada labu pengumpul.Saat merakit peralatan filtrasi sebaiknya menggunakan penjepit atau semacamnya untuk mengurangi resiko kontaminasi dan panas setelah sterilisasi. Pastikan semua peralatan (corong dan dasar corong) benar-benar bebas dari alkohol karena sedikit alkohol dapat mengubah integritas struktur kertas membran sehingga menjadi mengkerut atau melengkung. Biasanya jarang dijumpai persyaratan yang memerintahkan pengambilan sampel dibawah 1ml karena lebih dipilih diencerkan terlebih dahulu lalu diambil volume sampel yang cukup besar atau menggunakan penanaman pour plate atau spread plate. jangan dialirkan melewati corong.

Sanitasi peralatan Sanitasi perlu dilakukan terutama setelah menganalisa dengan sampel yang mengandung gula atau nutrisi lain. Hal ini bertujuan supaya kelebihan air (media) tidak turun ke tutup cawan yang dapat mengurangi pasokan media ke absorbent pad atau mengakibatkan kontaminasi. Peletakan kertas membran pada cawan Supaya udara tidak terjebak diantara kertas membran dan pad maka penempelan atau peletakan kertas membran dilakukan dengan hati-hati dari ujung. Jika gelembung udara terbentuk maka sebaiknya dihilangkan dengan pinset. Pembilasan lebih disarankan pada penuangan volume sampel yang sedikit. misalnya 5ml. Biofilm yang dapat terbentuk pada peralatan filtrasi. Volume air steril yang ditambahkan tidak mempengaruhi hitungan atau pengenceran apapun yang dilakukan dan jumlahnya hanya berhubungan dengan seberapa efisien untuk membilas sel-sel yang masih menempel pada permukaan corong. selang dan labu pengumpul dapat meninggikan resiko kontaminan saat dipakai. Hasil inkubasi . Selain itu penambahan air steril dapat bertujuan untuk mengencerkan kekentalan sampel. Pembilasan dengan air atau agen pembersih bisa dilakukan dengan melewatkannya ke dalam jalur yang dilewati sampel atau dapat juga dicuci secara manual.steril tersebut. Biasanya ditambahkan 20 ml air steril atau larutan fisiologis. tujuan yang kedua agar kertas membran tidak jatuh saat media sudah mulai mengering terutama untuk inkubasi yang membutuhkan waktu berhari-hari. Inkubasi cawan Cawan dengan absorbent pad sebaiknya diinkubasi dengan posisi absorbent pad dibawah (jangan dibalik).

Cara menghitung koloni adalah dengan memanfaatkan transek yang terdapat pada kertas membran dengan pola zig-zag (seperti gambar) dengan Colony Counter dengan perbesaran 4x. Hal ini menyesuaikan dengan ukuran kertas membran yang kecil (47mm) lain halnya bila mengingat batas atas kisaran hitung (300 koloni) karena kisaran ini untuk cawan berdiameter 9 cm. Permasalahan yang umum terjadi Pertumbuhan spreader atau koloni yang melebar Seharusnya setelah filtrasi selesai semua cairan sampel telah tersedot dari kertas membran tetapi beberapa faktor dapat menyebabkan air sedikit tertinggal di permukaan kertas membran. Jumlah maksimal koloni per cawan yang diizinkan meurut ASTM (American Standard Testing and Methods) pada metode filtrasi membran adalah 20-80 koloni. tidak ditemukan kontaminan. Sedangkan menurut HPA (Health Protection Agency) dengan volume sampel 100ml. sel-sel (dari satu CFU) telah tersebar dan menghasilkan koloni yang spreader. TNTC (Too Numerous To Count) . Lapisan air yang tipis saja dapat meyebarkan sel yang sedang memperbanyak diri dan saat air tersebut kering selama proses inkubasi. Misalnya.Hasil pertumbuhan yang baik dicirikan dengan pertumbuhan koloni yang acak tersebar merata. ditemui koloni yang tumbuh pada bekas penjepitan corong atau koloni yang mengikuti pola garisgaris/grid (bentuk ini bukan karena sifat tepi koloni yang seperti itu). Hasil pertumbuhan spreader dapat dihindari dengan memastikan cairan benar-benar kering dari kertas membran setelah difiltrasi atau jangan menambahkan media cair terlalu banyak. Pola lain yang sering dijumpai adalah adanya lapisan tipis air yang berkumpul pada cekungan (bagian yang tidak rata dari kertas membran) akibat perlakuan tertentu atau sebab lain. Jadi batas tertinggi perhitungan adalah 100 koloni dan batas terendah adalah <1 (0). dan memenuhi kisaran hitung per cawan. jika tidak ada pertumbuhan maka dilaporkan sebagai 0 CFU/100ml dan jika terdapat lebih dari 100 koloni maka dilaporkan >100CFU/100ml. Koloni yang melebar karena lapisan air ini dapat menutupi sebagian atau seluruh permukaan kertas membran tergantung banyak sedikitnya air dan seberapa cepatnya menguap.

Lain halnya dengan kertas membran yang terangkat. Kontak kertas membran dengan media sangat berpengaruh kepada distribusi nutrisi sehingga pertumbuhan koloni akan lebih lambat atau tidak ada sama sekali. Terdapat gelembung pada kertas membran Gelembung yang terperangkap saat meletakkan kertas membran dapat membiaskan jumlah koloni yang sebenarnya. kertas membran mudah kering pada bagian yang . Hasil ini jelas tidak diinginkan dan dapat diatasi dengan menghilangkan udara yang terperangkap saat penempelan kertas membran pada cawan. Semakin banyak koloni yang tumbuh maka kompetisi mendapatkan nutrisi dan ruang juga semakin terbatas. Hal ini mungkin bukan suatu kesalahan jika suatu requirement memerintahkan penuangan sampel sebanyak 50ml lalu dihasilkan koloni TNTC. Proses penggeseran kertas membran dapat dilakukan dengan menariknya bukan mendorongnya. TNTC dapat dihindari dengan mengencerkan sampel atau menyedikitkan volume sampel. Namun lebih baik dihasilkan cawan yang memenuhi kisaran hitung sehingga dapat diketahui jumlah mikroba secara pasti dan terpercaya berdasarkan statistik. Membran terangkat dan terlipat Kertas membran yang terlipat terjadi karena kesalahan saat meletakkan pada cawan dengan pinset.Kondisi terlalu banyak untuk dihitung menggambarkan bahwa semakin besar kesalahan saat menghitung jika tetap dipaksakan untuk menghitung. kejadian ini dimungkinkan karena sedikitnya cairan media sehingga saat kertas membran diletakkan tidak semua permukaan terbasahi kemudian selama waktu inkubasi.

Jika menjumpai pola pertumbuhan koloni yang terkumpul disuatu tempat dan tidak tersebar merata maka dikarenakan sampel kurang homogen. Koloni tersebar tidak merata (terkumpul di pinggir atau disuatu tempat) Koloni yang terkumpul di pinggir kertas membran mengikuti alur bekas corong dikarenakan sampel yang ditambahkan sedikit.mengandung air lebih sedikit. Sebab lain adalah karena terdapat sedikit alkohol pada dasar corong sehingga dapat menggulungkan kertas membran. Pada saat penambahan sampel (misalnya 1ml). air yang memiliki daya adhesi akan cenderung untuk menempel di sudut corong dan membawa sebagian besar sel-sel mendekati corong. . Semua permasalahan ini dapat diatasi dengan membilasnya setelah difiltrasi. Bila tidak dibilas dengan air steril maka hasil pertumbuhan koloninya menjadi demikian.

Inkubasi terlalu lama Penentuan waktu inkubasi umumnya telah disesuaikan berdasarkan jenis media dan mikroba yang dimungkinkan tumbuh. . Tidak sempurnanya sterilisasi pinset dan bagian bawah corong yang kontak dengan kertas membran dapat menyebabkan kontaminasi ini. Jangan menghitung sebelum waktunya (saat koloni masih terlalu kecil) karena dikhawatirkan terdapat beberapa koloni yang belum terlihat tumbuh. Namun bila terjadi proses inkubasi yang terlalu lama maka pertumbuhan koloni menjadi terlalu besar dan bersinggungan sehingga mempersulit perhitungan. Inkubasi yang sesuai menghasilkan koloni-koloni yang diameternya cukup terlihat dan tersebar merata.Terdapat pertumbuhan di luar bekas corong dan bekas pinset Kontaminasi yang dapat terdeteksi pada metode ini umumnya berada diluar bekas corong atau bekas pinset. Jika koloni kontaminan tumbuh pada kertas membran dalam area corong maka tidak dapat dibedakan dengan sel yang berasal dari sampel.

Jika sampel sudah benar-benar tidak dapat lagi tersedot maka proses filtrasi gagal dan sebaiknya diulang dengan menyesuaikan sampel. . Penambahan berapapun air steril tidak mempengaruhi perhitungan koloni atau pengenceran yang dilakukan karena diasumsikan air steril tidak mengandung bakteri. Salah satu cara menanggulanginya adalah dengan memperhitungkan jumlah maksimal sampel yang ditambahkan atau ditambah air steril. Cairan yang kental sering sulit tersedot sampai habis dan masih meninggalkan sedikit lapisan dan dikhawatirkan menghasilkan koloni spreader. Cairan yang kental seperti sirup akan sulit mengalir melewati pori membran karena zat terlarutnya lebih besar dari pada pelarutnya.Cairan sampel yang kental sulit tersedot Sering kali sampel yang kekentalannya atau kekeruhannya tinggi menyebabkan macet (sampel tidak dapat tersedot lagi) dan memperberat kerja pompa vakum karena tekanan didalam ruang terlalu kecil.

Elevasi : Flat Raised Convex . medium cair ? Bakteri A. Namun terdapat jenis bakteri yang mempunyai bentuk koloni seperti tetesan air. untuk memastikannya dapat disentuh dengan pinset. apalagi jika jumlah mikroba yang tumbuh diperkirakan sedikit. Pertumbuhan pada Cawan Petri Ciri-ciri yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut : · Ukuran. Setelah mendapatkan kultur murni maka biakan yang diinginkan ditumbuhkan ke berbagai bentuk media untuk dikenali ciri koloninya. Mengamati Morfologi Koloni Bakteri Kegiatan ini merupakan tindakan pertama kali jika ingin mempelajari suatu jenis bakteri lebih lanjut. Cara Kerja : · Tumbuhkan biakan pada media NA cawan dengan streak kuadran · Tumbuhkan biakan pada media NA miring dengan pola inokulasi yang tegak lurus · Tumbuhkan biakan pada media NA tegak dengan stab inoculation · Tumbuhkan biakan pada media NB A. 3. Sebutkan sifat – sifat umum suatu koloni dan sebutkan sifat – sifat khusus koloni pada medium padat.Tetesan air yang jatuh Bagi mata yang kurang terlatih tetesan air yang mirip koloni dapat menipu. Biasanya pengembunan yang terjadi pada tutup cawan dapat mengalir kesamping saat cawan dalam posisi miring. Translucent (dapat ditembus cahaya sebagian). Opaque (tidak dapat ditembus cahaya). pinpoint/punctiform (titik) Small (kecil) Moderate (sedang) Large (besar) · Pigmentasi : mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen intraseluler. Transparant (bening) · Bentuk : Circular Irregular Spindle Filamentous Rhizoid . tetapi (entah bagaimana) adakalanya tetesan jatuh pada kertas membran.1. khususnya untuk tujuan identifikasi. beberapa jenis lain memproduksi pigmen ekstraseluler yang dapat terlarut dalam media · Karakteristik optik : diamati berdasarkan jumlah cahaya yang melewati koloni.

2.3 Pertumbuhan pada Agar Tegak Cara penanaman adalah dengan menusukkan jarum inokulum needle ke dalam media agar tegak. Ciri-ciri koloni berdasar bentuk : . Pertumbuhan pada Agar Miring Ciri-ciri koloni diperoleh dengan menggoreskan jarum inokulum tegak dan lurus Ciri koloni berdasarkan bentuk: A.Umbonate · Permukaan : Halus mengkilap Kasar Berkerut Kering seperti bubuk · Margins : Entire Lobate Undulate Serrate Felamentous Curled A.

Ciri koloni berdasar kebutuhan O2 : A.4 Pertumbuhan pada Media Cair Pola pertumbuhan berdasarkan kebutuhan O2 .

Apa beda gelatin dengan agar. Ciri-ciri koloni berdasar bentuk : . jelaskan dengan menumbuhkan bakteri ? Pertumbuhan pada Agar Miring Ciri-ciri koloni diperoleh dengan menggoreskan jarum inokulum tegak dan lurus Ciri koloni berdasarkan bentuk: Pertumbuhan pada Agar Tegak Cara penanaman adalah dengan menusukkan jarum inokulum needle ke dalam media agar tegak.Berikut merupakan beberapa contoh hasil koloni tunggal. 5.

Ciri koloni berdasar kebutuhan O2 : Pertumbuhan pada Media Cair Pola pertumbuhan berdasarkan kebutuhan O2 .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful