Alat-alat dan teknik-teknik

yang dipakai dalam rekayasa

genetika
Kloning gen Teknologi
DNA rekombinan, Rekayasa
genetika, Kloning molekuler

Prinsip dasarnya adalah memasukkan suatu

gen dari suatu organisme ke sel host
dengan tujuan memelihara gen tersebut
secara terus menerus dan dipelajari.
Langkah kerja dalam kloning DNA
Teknologi DNA rekombinan
• Berkembang pada awal tahun 1980.
• Berakar dari ilmu biokimia dan genetika.
• Terjadi peningkatan pengetahuan yang
signifikan tentang dasar molekuler
penyakit-penyakit genetik pada manusia.
• Diterapkan dalam bidang pertanian,
peternakan, kedokteran forensik, penelitian
–penelitian dasar.
Enzim restriksi endonuklease

• Teknologi DNA rekombinan tidak

dapat berjalan tanpa adanya enzim
restriksi endonuklease.
• RE dapat memotong secara simetris
ikatan fosofodiester pada untai DNA
yang berlawanan pada situs
spesifiknya.
Beberapa contoh enzim restriksi

Enzim Sekuens Jenis ujung End sequences

pengenalan
EcoRI 5’-GAATTC-3’ Sticky, 5’ overhang 5’-G AATTC-3’
3’-CTTAAG-5’ 3’-CTTAA G-5’

BamHI 5’-GGATCC-3’ Sticky, 5’ overhang 5’-G GATCC-3’

3’-CCTAGG-5’ 3’-CCTAG G-5’

AluI 5’-AGCT-3’ Blunt 5’-AG CT-3’

3’-TCGA-5’ 3’-TC GA-5’

PstI 5’-CTGCAG-3’ Sticky, 3’overhang 5’-CTGCA G-3’

3’-GACGTC-5’ 3’-G ACGTC-5’
Enzim restriksi endonuklease
 Vektor kloning
• Suatu “wadah” yang dipergunakan untuk
memperbanyak fragment DNA yang ingin
dipelajari, untuk transkripsi, invitro
mutagenesis, dan sekuensing DNA insert.
• Terdiri dari beberapa macam: plasmid
(elemen bakteri ekstrakromosom yang
dapat bereplikasi sendiri), bakteriophage,
cosmid, dll.
Plasmid
 Syarat vektor kloning

• Dapat dipelihara dan direplikasikan di dalam sel

host.
• Mengandung satu atau lebih situs restriksi
endonuklease tunggal yang menyediakan pilihan
situs insersi yang memungkinkan.
• Contoh: Pemotongan DNA sumber dan vektor
dengan enzim RE yang sama, disatukan dalam tube
yang sama, ditambahkan enzim T4DNA ligase
DNA diinkorporasikan ke situs spesifik.
• Membawa gen resisten terhadap antibiotik
tertentu.
 Sequencing
• Sequencing: metoda untuk membaca urutan basa-basa
nukleotida dari suatu gen.
• Ada 2 metoda sequencing:
- Chain termination method (Sanger et al., 1977): urutan
molekul DNA untai tunggal ditentukan dengan sintesis rantai
polinukleotida komplementer secara enzimatis.
- Chemical degradation method (Maxam and Gilbert, 1977):
urutan molekul DNA untai ganda ditentukan dengan
menggunakan bahan kimia yang memotong molekul DNA pada
posisi nukleotida tertentu.
• Keunggulan chain terminal method: Lebih mudah dikerjakan
secara otomatis menggunakan mesin sekuensing, bahan-bahan
yang digunakan tidak toksik.
Chain termination sequencing
• Prinsip kerja: berdasarkan perbedaan panjang molekul DNA
untai tunggal yang dipisahkan dengan elektroforesis gel
poliakrilamid.
• Dengan gel ini dapat dipisahkan sekelompok molekul mulai
dari 10 – 1500 nukleotida ke dalam suatu seri pita DNA.
• Langkah kerja:
1. Mempersiapkan molekul DNA untai tunggal yang identik
sebagai cetakan.
2. Penempelan (annealing) primer pada DNA cetakan.
3. Reaksi perpanjangan rantai dengan bantuan
enzim DNA polimerase.
4. Inkorporasi dNTP dan ddNTP pada rantai
yang diperpanjang.
5. Elektroforesis pita DNA yang baru disintesis
menggunakan gel poliakrilamid.
Setelah elektroforesis urutan DNA dapat dibaca
langsung dari posisi pita pada gel . Pita yang
bergerak paling jauh merupakan pita DNA
terkecil.
Sequencing
 Automathic chain termination

• Prinsip: menggunakan label radioaktif untuk melacak

nukleotida yang diinkorporasikan.
• Radioaktif yang digunakan adalah 33P atau 35S karena energi
emisinya rendah sehingga dapat menghasilkan resolusi yang
tinggi.
• Label dikaitkan ke ddNTP dengan warna yang berbeda untuk
setiap nukleotidanya.
• Keunggulan: Reaksi sekuensing dapat dilakukan dalam 1 tube
dan loading ke-4 molekul nukleotida dilakukan dalam 1 lane
gel poliakrilamid karena detektor fluorescent dapat
membedakan antara label-label yang berbeda.
Automatic chain
termination
 Chemical degradation method

• Prinsip kerja: molekul DNA dihasilkan setelah diberi

perlakuan dengan bahan kimia yang memotong secara
spesifik pada nukleotida tertentu.
• Langkah kerja:
1.Denaturasi DNA untai ganda menjadi untai tunggal
2.Pemberian label pada masing-masing ujung DNA untai
tunggal.
3. Molekul diberi dimethyl sulfate yang menempelkan grup
metil pada cincin purin dari nukleotida G (terjadi
modifikasi nukleotida G).
• Karena pemberian dimethyl sulfate hanya dalam jumlah
kecil maka proses modifikasi berlangsung lambat (1 per
nukleotida).
• Pada stadium ini untai DNA masih utuh.
• Pemotongan untai DNA akibat pemberian piperidine.
Piperidine membuang cincin G yang dimodifikasi dan
memotong molekul DNA pada ikatan fosfodiester tepat
pada bagian atas dari cincin G yang dibuang.
• Hasilnya adalah suatu set DNA yang terpotong-potong, ada
yang terlabel dan ada yang tidak.
• Potongan untai DNA yang dihasilkan tidak sama panjang
(hasilnya equivalent dengan hasil yang didapat dari metoda
chain terminal).
• Potongan-potongan DNA ini selanjutnya dielektroforesis
dalam gel poliakrilamid.
 Chemical
degradation
method
SSCP
• Metoda untuk mendeteksi mutasi 1 basa
pada suatu untai DNA tunggal dari suatu
gen.
• Prinsip kerja: terjadinya perubahan
konformasi untai DNA tunggal akibat
adanya mutasi yang terdeteksi dari posisi
pita DNA dalam gel poliakrilamid.
Langkah kerja:

• Aplifikasi gen yang akan diamati dengan

PCR.
• Denaturasi DNA untai ganda menjadi untai
tunggal.
• Elektroforesis DNA untai tunggal dalam gel
poliakrilamide selama  4 jam.
• Visualisasi pita-pita DNA dengan
pewarnaan perak nitrat.
SSCP