P. 1
Alat & Teknik 2

Alat & Teknik 2

|Views: 276|Likes:

More info:

Published by: Khaidir ﺧﻴﺪ ﻴﺮ Rahman on May 06, 2011
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PPT, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

03/13/2014

pdf

text

original

Alat-alat dan teknik-teknik yang dipakai dalam rekayasa genetika

Kloning gen Teknologi DNA rekombinan, Rekayasa genetika, Kloning molekuler
Prinsip dasarnya adalah memasukkan suatu gen dari suatu organisme ke sel host dengan tujuan memelihara gen tersebut secara terus menerus dan dipelajari.

Langkah kerja dalam kloning DNA .

peternakan.Teknologi DNA rekombinan ‡ Berkembang pada awal tahun 1980. penelitian ²penelitian dasar. ‡ Berakar dari ilmu biokimia dan genetika. ‡ Diterapkan dalam bidang pertanian. . kedokteran forensik. ‡ Terjadi peningkatan pengetahuan yang signifikan tentang dasar molekuler penyakit-penyakit genetik pada manusia.

‡ RE dapat memotong secara simetris ikatan fosofodiester pada untai DNA yang berlawanan pada situs spesifiknya.Enzim restriksi endonuklease ‡ Teknologi DNA rekombinan tidak dapat berjalan tanpa adanya enzim restriksi endonuklease. .

Beberapa contoh enzim restriksi Enzim EcoRI Sekuens pengenalan 5¶-GAATTC-3¶ 3¶-CTTAAG-5¶ 5¶-GGATCC-3¶ 3¶-CCTAGG-5¶ 5¶-AGCT-3¶ 3¶-TCGA-5¶ 5¶-CTGCAG-3¶ 3¶-GACGTC-5¶ Jenis ujung Sticky. 5¶ overhang Sticky. 3¶overhang PstI 5¶-CTGCA G-3¶ 3¶-G ACGTC-5¶ . 5¶ overhang End sequences 5¶-G AATTC-3¶ 3¶-CTTAA G-5¶ 5¶-G GATCC-3¶ 3¶-CCTAG G-5¶ 5¶-AG 3¶-TC CT-3¶ GA-5¶ BamHI AluI Blunt Sticky.

Enzim restriksi endonuklease .

‡ Terdiri dari beberapa macam: plasmid (elemen bakteri ekstrakromosom yang dapat bereplikasi sendiri). . bakteriophage. invitro mutagenesis. dll. untuk transkripsi. dan sekuensing DNA insert. cosmid.Vektor kloning ‡ Suatu ´wadahµ yang dipergunakan untuk memperbanyak fragment DNA yang ingin dipelajari.

Plasmid .

‡ Contoh: Pemotongan DNA sumber dan vektor dengan enzim RE yang sama.Syarat vektor kloning ‡ Dapat dipelihara dan direplikasikan di dalam sel host. ‡ Membawa gen resisten terhadap antibiotik tertentu. ‡ Mengandung satu atau lebih situs restriksi endonuklease tunggal yang menyediakan pilihan situs insersi yang memungkinkan. disatukan dalam tube yang sama. ditambahkan enzim T4DNA ligase DNA diinkorporasikan ke situs spesifik. .

.. ‡ Keunggulan chain terminal method: Lebih mudah dikerjakan secara otomatis menggunakan mesin sekuensing. 1977): urutan molekul DNA untai tunggal ditentukan dengan sintesis rantai polinukleotida komplementer secara enzimatis.Sequencing ‡ Sequencing: metoda untuk membaca urutan basa-basa nukleotida dari suatu gen.Chain termination method (Sanger et al. .Chemical degradation method (Maxam and Gilbert. ‡ Ada 2 metoda sequencing: . bahan-bahan yang digunakan tidak toksik. 1977): urutan molekul DNA untai ganda ditentukan dengan menggunakan bahan kimia yang memotong molekul DNA pada posisi nukleotida tertentu.

. 2. Mempersiapkan molekul DNA untai tunggal yang identik sebagai cetakan. ‡ Langkah kerja: 1.Chain termination sequencing ‡ Prinsip kerja: berdasarkan perbedaan panjang molekul DNA untai tunggal yang dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamid. ‡ Dengan gel ini dapat dipisahkan sekelompok molekul mulai dari 10 ± 1500 nukleotida ke dalam suatu seri pita DNA. Penempelan (annealing) primer pada DNA cetakan.

4. Pita yang bergerak paling jauh merupakan pita DNA terkecil. Elektroforesis pita DNA yang baru disintesis menggunakan gel poliakrilamid. Inkorporasi dNTP dan ddNTP pada rantai yang diperpanjang. Reaksi perpanjangan rantai dengan bantuan enzim DNA polimerase. Setelah elektroforesis urutan DNA dapat dibaca langsung dari posisi pita pada gel .3. . 5.

Sequencing .

‡ Radioaktif yang digunakan adalah 33P atau 35S karena energi emisinya rendah sehingga dapat menghasilkan resolusi yang tinggi.Automathic chain termination ‡ Prinsip: menggunakan label radioaktif untuk melacak nukleotida yang diinkorporasikan. ‡ Keunggulan: Reaksi sekuensing dapat dilakukan dalam 1 tube dan loading ke-4 molekul nukleotida dilakukan dalam 1 lane gel poliakrilamid karena detektor fluorescent dapat membedakan antara label-label yang berbeda. ‡ Label dikaitkan ke ddNTP dengan warna yang berbeda untuk setiap nukleotidanya. .

Automatic chain termination .

‡ Langkah kerja: 1. 3.Pemberian label pada masing-masing ujung DNA untai tunggal.Denaturasi DNA untai ganda menjadi untai tunggal 2.Chemical degradation method ‡ Prinsip kerja: molekul DNA dihasilkan setelah diberi perlakuan dengan bahan kimia yang memotong secara spesifik pada nukleotida tertentu. . Molekul diberi dimethyl sulfate yang menempelkan grup metil pada cincin purin dari nukleotida G (terjadi modifikasi nukleotida G).

‡ Pemotongan untai DNA akibat pemberian piperidine. ‡ Potongan untai DNA yang dihasilkan tidak sama panjang (hasilnya equivalent dengan hasil yang didapat dari metoda chain terminal). ‡ Hasilnya adalah suatu set DNA yang terpotong-potong. ‡ Pada stadium ini untai DNA masih utuh. Piperidine membuang cincin G yang dimodifikasi dan memotong molekul DNA pada ikatan fosfodiester tepat pada bagian atas dari cincin G yang dibuang.‡ Karena pemberian dimethyl sulfate hanya dalam jumlah kecil maka proses modifikasi berlangsung lambat (1 per nukleotida). ada yang terlabel dan ada yang tidak. ‡ Potongan-potongan DNA ini selanjutnya dielektroforesis dalam gel poliakrilamid. .

Chemical degradation method .

SSCP ‡ Metoda untuk mendeteksi mutasi 1 basa pada suatu untai DNA tunggal dari suatu gen. ‡ Prinsip kerja: terjadinya perubahan konformasi untai DNA tunggal akibat adanya mutasi yang terdeteksi dari posisi pita DNA dalam gel poliakrilamid. .

‡ Elektroforesis DNA untai tunggal dalam gel poliakrilamide selama s 4 jam.Langkah kerja: ‡ Aplifikasi gen yang akan diamati dengan PCR. . ‡ Denaturasi DNA untai ganda menjadi untai tunggal. ‡ Visualisasi pita-pita DNA dengan pewarnaan perak nitrat.

SSCP .

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->