Alat-alat dan teknik-teknik yang dipakai dalam rekayasa genetika

Kloning gen Teknologi DNA rekombinan, Rekayasa genetika, Kloning molekuler
Prinsip dasarnya adalah memasukkan suatu gen dari suatu organisme ke sel host dengan tujuan memelihara gen tersebut secara terus menerus dan dipelajari.

Langkah kerja dalam kloning DNA .

‡ Diterapkan dalam bidang pertanian. .Teknologi DNA rekombinan ‡ Berkembang pada awal tahun 1980. kedokteran forensik. penelitian ²penelitian dasar. peternakan. ‡ Berakar dari ilmu biokimia dan genetika. ‡ Terjadi peningkatan pengetahuan yang signifikan tentang dasar molekuler penyakit-penyakit genetik pada manusia.

Enzim restriksi endonuklease ‡ Teknologi DNA rekombinan tidak dapat berjalan tanpa adanya enzim restriksi endonuklease. . ‡ RE dapat memotong secara simetris ikatan fosofodiester pada untai DNA yang berlawanan pada situs spesifiknya.

Beberapa contoh enzim restriksi Enzim EcoRI Sekuens pengenalan 5¶-GAATTC-3¶ 3¶-CTTAAG-5¶ 5¶-GGATCC-3¶ 3¶-CCTAGG-5¶ 5¶-AGCT-3¶ 3¶-TCGA-5¶ 5¶-CTGCAG-3¶ 3¶-GACGTC-5¶ Jenis ujung Sticky. 5¶ overhang End sequences 5¶-G AATTC-3¶ 3¶-CTTAA G-5¶ 5¶-G GATCC-3¶ 3¶-CCTAG G-5¶ 5¶-AG 3¶-TC CT-3¶ GA-5¶ BamHI AluI Blunt Sticky. 3¶overhang PstI 5¶-CTGCA G-3¶ 3¶-G ACGTC-5¶ . 5¶ overhang Sticky.

Enzim restriksi endonuklease .

dan sekuensing DNA insert. ‡ Terdiri dari beberapa macam: plasmid (elemen bakteri ekstrakromosom yang dapat bereplikasi sendiri).Vektor kloning ‡ Suatu ´wadahµ yang dipergunakan untuk memperbanyak fragment DNA yang ingin dipelajari. untuk transkripsi. . bakteriophage. invitro mutagenesis. dll. cosmid.

Plasmid .

Syarat vektor kloning ‡ Dapat dipelihara dan direplikasikan di dalam sel host. . disatukan dalam tube yang sama. ‡ Contoh: Pemotongan DNA sumber dan vektor dengan enzim RE yang sama. ‡ Mengandung satu atau lebih situs restriksi endonuklease tunggal yang menyediakan pilihan situs insersi yang memungkinkan. ‡ Membawa gen resisten terhadap antibiotik tertentu. ditambahkan enzim T4DNA ligase DNA diinkorporasikan ke situs spesifik.

1977): urutan molekul DNA untai ganda ditentukan dengan menggunakan bahan kimia yang memotong molekul DNA pada posisi nukleotida tertentu.Sequencing ‡ Sequencing: metoda untuk membaca urutan basa-basa nukleotida dari suatu gen. ‡ Ada 2 metoda sequencing: . 1977): urutan molekul DNA untai tunggal ditentukan dengan sintesis rantai polinukleotida komplementer secara enzimatis. . ‡ Keunggulan chain terminal method: Lebih mudah dikerjakan secara otomatis menggunakan mesin sekuensing.Chain termination method (Sanger et al.Chemical degradation method (Maxam and Gilbert. bahan-bahan yang digunakan tidak toksik. ..

‡ Langkah kerja: 1. Penempelan (annealing) primer pada DNA cetakan. 2. Mempersiapkan molekul DNA untai tunggal yang identik sebagai cetakan.Chain termination sequencing ‡ Prinsip kerja: berdasarkan perbedaan panjang molekul DNA untai tunggal yang dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamid. ‡ Dengan gel ini dapat dipisahkan sekelompok molekul mulai dari 10 ± 1500 nukleotida ke dalam suatu seri pita DNA. .

3. 4. 5. Setelah elektroforesis urutan DNA dapat dibaca langsung dari posisi pita pada gel . Reaksi perpanjangan rantai dengan bantuan enzim DNA polimerase. Inkorporasi dNTP dan ddNTP pada rantai yang diperpanjang. Pita yang bergerak paling jauh merupakan pita DNA terkecil. . Elektroforesis pita DNA yang baru disintesis menggunakan gel poliakrilamid.

Sequencing .

‡ Keunggulan: Reaksi sekuensing dapat dilakukan dalam 1 tube dan loading ke-4 molekul nukleotida dilakukan dalam 1 lane gel poliakrilamid karena detektor fluorescent dapat membedakan antara label-label yang berbeda.Automathic chain termination ‡ Prinsip: menggunakan label radioaktif untuk melacak nukleotida yang diinkorporasikan. ‡ Label dikaitkan ke ddNTP dengan warna yang berbeda untuk setiap nukleotidanya. ‡ Radioaktif yang digunakan adalah 33P atau 35S karena energi emisinya rendah sehingga dapat menghasilkan resolusi yang tinggi. .

Automatic chain termination .

Denaturasi DNA untai ganda menjadi untai tunggal 2. Molekul diberi dimethyl sulfate yang menempelkan grup metil pada cincin purin dari nukleotida G (terjadi modifikasi nukleotida G).Pemberian label pada masing-masing ujung DNA untai tunggal. 3. . ‡ Langkah kerja: 1.Chemical degradation method ‡ Prinsip kerja: molekul DNA dihasilkan setelah diberi perlakuan dengan bahan kimia yang memotong secara spesifik pada nukleotida tertentu.

‡ Potongan untai DNA yang dihasilkan tidak sama panjang (hasilnya equivalent dengan hasil yang didapat dari metoda chain terminal). ‡ Hasilnya adalah suatu set DNA yang terpotong-potong. ‡ Pemotongan untai DNA akibat pemberian piperidine. ‡ Potongan-potongan DNA ini selanjutnya dielektroforesis dalam gel poliakrilamid.‡ Karena pemberian dimethyl sulfate hanya dalam jumlah kecil maka proses modifikasi berlangsung lambat (1 per nukleotida). Piperidine membuang cincin G yang dimodifikasi dan memotong molekul DNA pada ikatan fosfodiester tepat pada bagian atas dari cincin G yang dibuang. ‡ Pada stadium ini untai DNA masih utuh. ada yang terlabel dan ada yang tidak. .

Chemical degradation method .

. ‡ Prinsip kerja: terjadinya perubahan konformasi untai DNA tunggal akibat adanya mutasi yang terdeteksi dari posisi pita DNA dalam gel poliakrilamid.SSCP ‡ Metoda untuk mendeteksi mutasi 1 basa pada suatu untai DNA tunggal dari suatu gen.

‡ Visualisasi pita-pita DNA dengan pewarnaan perak nitrat. ‡ Denaturasi DNA untai ganda menjadi untai tunggal. ‡ Elektroforesis DNA untai tunggal dalam gel poliakrilamide selama s 4 jam.Langkah kerja: ‡ Aplifikasi gen yang akan diamati dengan PCR. .

SSCP .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful