Alat-alat dan teknik-teknik yang dipakai dalam rekayasa genetika

Kloning gen Teknologi DNA rekombinan, Rekayasa genetika, Kloning molekuler
Prinsip dasarnya adalah memasukkan suatu gen dari suatu organisme ke sel host dengan tujuan memelihara gen tersebut secara terus menerus dan dipelajari.

Langkah kerja dalam kloning DNA .

kedokteran forensik. . ‡ Diterapkan dalam bidang pertanian. peternakan.Teknologi DNA rekombinan ‡ Berkembang pada awal tahun 1980. ‡ Terjadi peningkatan pengetahuan yang signifikan tentang dasar molekuler penyakit-penyakit genetik pada manusia. penelitian ²penelitian dasar. ‡ Berakar dari ilmu biokimia dan genetika.

. ‡ RE dapat memotong secara simetris ikatan fosofodiester pada untai DNA yang berlawanan pada situs spesifiknya.Enzim restriksi endonuklease ‡ Teknologi DNA rekombinan tidak dapat berjalan tanpa adanya enzim restriksi endonuklease.

3¶overhang PstI 5¶-CTGCA G-3¶ 3¶-G ACGTC-5¶ .Beberapa contoh enzim restriksi Enzim EcoRI Sekuens pengenalan 5¶-GAATTC-3¶ 3¶-CTTAAG-5¶ 5¶-GGATCC-3¶ 3¶-CCTAGG-5¶ 5¶-AGCT-3¶ 3¶-TCGA-5¶ 5¶-CTGCAG-3¶ 3¶-GACGTC-5¶ Jenis ujung Sticky. 5¶ overhang Sticky. 5¶ overhang End sequences 5¶-G AATTC-3¶ 3¶-CTTAA G-5¶ 5¶-G GATCC-3¶ 3¶-CCTAG G-5¶ 5¶-AG 3¶-TC CT-3¶ GA-5¶ BamHI AluI Blunt Sticky.

Enzim restriksi endonuklease .

bakteriophage. invitro mutagenesis. ‡ Terdiri dari beberapa macam: plasmid (elemen bakteri ekstrakromosom yang dapat bereplikasi sendiri). dll.Vektor kloning ‡ Suatu ´wadahµ yang dipergunakan untuk memperbanyak fragment DNA yang ingin dipelajari. . cosmid. untuk transkripsi. dan sekuensing DNA insert.

Plasmid .

‡ Contoh: Pemotongan DNA sumber dan vektor dengan enzim RE yang sama. . ‡ Membawa gen resisten terhadap antibiotik tertentu. ditambahkan enzim T4DNA ligase DNA diinkorporasikan ke situs spesifik. ‡ Mengandung satu atau lebih situs restriksi endonuklease tunggal yang menyediakan pilihan situs insersi yang memungkinkan. disatukan dalam tube yang sama.Syarat vektor kloning ‡ Dapat dipelihara dan direplikasikan di dalam sel host.

. ‡ Keunggulan chain terminal method: Lebih mudah dikerjakan secara otomatis menggunakan mesin sekuensing.Sequencing ‡ Sequencing: metoda untuk membaca urutan basa-basa nukleotida dari suatu gen. 1977): urutan molekul DNA untai ganda ditentukan dengan menggunakan bahan kimia yang memotong molekul DNA pada posisi nukleotida tertentu. . ‡ Ada 2 metoda sequencing: .. bahan-bahan yang digunakan tidak toksik. 1977): urutan molekul DNA untai tunggal ditentukan dengan sintesis rantai polinukleotida komplementer secara enzimatis.Chain termination method (Sanger et al.Chemical degradation method (Maxam and Gilbert.

Penempelan (annealing) primer pada DNA cetakan. Mempersiapkan molekul DNA untai tunggal yang identik sebagai cetakan. ‡ Dengan gel ini dapat dipisahkan sekelompok molekul mulai dari 10 ± 1500 nukleotida ke dalam suatu seri pita DNA.Chain termination sequencing ‡ Prinsip kerja: berdasarkan perbedaan panjang molekul DNA untai tunggal yang dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamid. 2. ‡ Langkah kerja: 1. .

Pita yang bergerak paling jauh merupakan pita DNA terkecil. 5.3. Setelah elektroforesis urutan DNA dapat dibaca langsung dari posisi pita pada gel . Reaksi perpanjangan rantai dengan bantuan enzim DNA polimerase. . Inkorporasi dNTP dan ddNTP pada rantai yang diperpanjang. Elektroforesis pita DNA yang baru disintesis menggunakan gel poliakrilamid. 4.

Sequencing .

‡ Label dikaitkan ke ddNTP dengan warna yang berbeda untuk setiap nukleotidanya.Automathic chain termination ‡ Prinsip: menggunakan label radioaktif untuk melacak nukleotida yang diinkorporasikan. ‡ Keunggulan: Reaksi sekuensing dapat dilakukan dalam 1 tube dan loading ke-4 molekul nukleotida dilakukan dalam 1 lane gel poliakrilamid karena detektor fluorescent dapat membedakan antara label-label yang berbeda. . ‡ Radioaktif yang digunakan adalah 33P atau 35S karena energi emisinya rendah sehingga dapat menghasilkan resolusi yang tinggi.

Automatic chain termination .

Chemical degradation method ‡ Prinsip kerja: molekul DNA dihasilkan setelah diberi perlakuan dengan bahan kimia yang memotong secara spesifik pada nukleotida tertentu. ‡ Langkah kerja: 1. Molekul diberi dimethyl sulfate yang menempelkan grup metil pada cincin purin dari nukleotida G (terjadi modifikasi nukleotida G).Pemberian label pada masing-masing ujung DNA untai tunggal. . 3.Denaturasi DNA untai ganda menjadi untai tunggal 2.

‡ Potongan untai DNA yang dihasilkan tidak sama panjang (hasilnya equivalent dengan hasil yang didapat dari metoda chain terminal). Piperidine membuang cincin G yang dimodifikasi dan memotong molekul DNA pada ikatan fosfodiester tepat pada bagian atas dari cincin G yang dibuang. ‡ Potongan-potongan DNA ini selanjutnya dielektroforesis dalam gel poliakrilamid. ada yang terlabel dan ada yang tidak. ‡ Pada stadium ini untai DNA masih utuh. .‡ Karena pemberian dimethyl sulfate hanya dalam jumlah kecil maka proses modifikasi berlangsung lambat (1 per nukleotida). ‡ Pemotongan untai DNA akibat pemberian piperidine. ‡ Hasilnya adalah suatu set DNA yang terpotong-potong.

Chemical degradation method .

‡ Prinsip kerja: terjadinya perubahan konformasi untai DNA tunggal akibat adanya mutasi yang terdeteksi dari posisi pita DNA dalam gel poliakrilamid. .SSCP ‡ Metoda untuk mendeteksi mutasi 1 basa pada suatu untai DNA tunggal dari suatu gen.

‡ Denaturasi DNA untai ganda menjadi untai tunggal. . ‡ Elektroforesis DNA untai tunggal dalam gel poliakrilamide selama s 4 jam. ‡ Visualisasi pita-pita DNA dengan pewarnaan perak nitrat.Langkah kerja: ‡ Aplifikasi gen yang akan diamati dengan PCR.

SSCP .