Alat-alat dan teknik-teknik yang dipakai dalam rekayasa genetika

Kloning gen Teknologi DNA rekombinan, Rekayasa genetika, Kloning molekuler
Prinsip dasarnya adalah memasukkan suatu gen dari suatu organisme ke sel host dengan tujuan memelihara gen tersebut secara terus menerus dan dipelajari.

Langkah kerja dalam kloning DNA .

‡ Berakar dari ilmu biokimia dan genetika. kedokteran forensik. ‡ Diterapkan dalam bidang pertanian. penelitian ²penelitian dasar. peternakan. ‡ Terjadi peningkatan pengetahuan yang signifikan tentang dasar molekuler penyakit-penyakit genetik pada manusia.Teknologi DNA rekombinan ‡ Berkembang pada awal tahun 1980. .

. ‡ RE dapat memotong secara simetris ikatan fosofodiester pada untai DNA yang berlawanan pada situs spesifiknya.Enzim restriksi endonuklease ‡ Teknologi DNA rekombinan tidak dapat berjalan tanpa adanya enzim restriksi endonuklease.

3¶overhang PstI 5¶-CTGCA G-3¶ 3¶-G ACGTC-5¶ . 5¶ overhang Sticky. 5¶ overhang End sequences 5¶-G AATTC-3¶ 3¶-CTTAA G-5¶ 5¶-G GATCC-3¶ 3¶-CCTAG G-5¶ 5¶-AG 3¶-TC CT-3¶ GA-5¶ BamHI AluI Blunt Sticky.Beberapa contoh enzim restriksi Enzim EcoRI Sekuens pengenalan 5¶-GAATTC-3¶ 3¶-CTTAAG-5¶ 5¶-GGATCC-3¶ 3¶-CCTAGG-5¶ 5¶-AGCT-3¶ 3¶-TCGA-5¶ 5¶-CTGCAG-3¶ 3¶-GACGTC-5¶ Jenis ujung Sticky.

Enzim restriksi endonuklease .

invitro mutagenesis. cosmid. ‡ Terdiri dari beberapa macam: plasmid (elemen bakteri ekstrakromosom yang dapat bereplikasi sendiri). . untuk transkripsi. dll. bakteriophage. dan sekuensing DNA insert.Vektor kloning ‡ Suatu ´wadahµ yang dipergunakan untuk memperbanyak fragment DNA yang ingin dipelajari.

Plasmid .

ditambahkan enzim T4DNA ligase DNA diinkorporasikan ke situs spesifik.Syarat vektor kloning ‡ Dapat dipelihara dan direplikasikan di dalam sel host. ‡ Contoh: Pemotongan DNA sumber dan vektor dengan enzim RE yang sama. ‡ Mengandung satu atau lebih situs restriksi endonuklease tunggal yang menyediakan pilihan situs insersi yang memungkinkan. ‡ Membawa gen resisten terhadap antibiotik tertentu. . disatukan dalam tube yang sama.

Chain termination method (Sanger et al. 1977): urutan molekul DNA untai ganda ditentukan dengan menggunakan bahan kimia yang memotong molekul DNA pada posisi nukleotida tertentu. .Sequencing ‡ Sequencing: metoda untuk membaca urutan basa-basa nukleotida dari suatu gen. bahan-bahan yang digunakan tidak toksik. ‡ Keunggulan chain terminal method: Lebih mudah dikerjakan secara otomatis menggunakan mesin sekuensing. ‡ Ada 2 metoda sequencing: .. 1977): urutan molekul DNA untai tunggal ditentukan dengan sintesis rantai polinukleotida komplementer secara enzimatis. .Chemical degradation method (Maxam and Gilbert.

Mempersiapkan molekul DNA untai tunggal yang identik sebagai cetakan. 2. ‡ Dengan gel ini dapat dipisahkan sekelompok molekul mulai dari 10 ± 1500 nukleotida ke dalam suatu seri pita DNA. Penempelan (annealing) primer pada DNA cetakan. . ‡ Langkah kerja: 1.Chain termination sequencing ‡ Prinsip kerja: berdasarkan perbedaan panjang molekul DNA untai tunggal yang dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamid.

Pita yang bergerak paling jauh merupakan pita DNA terkecil. Inkorporasi dNTP dan ddNTP pada rantai yang diperpanjang.3. Setelah elektroforesis urutan DNA dapat dibaca langsung dari posisi pita pada gel . 5. 4. Elektroforesis pita DNA yang baru disintesis menggunakan gel poliakrilamid. Reaksi perpanjangan rantai dengan bantuan enzim DNA polimerase. .

Sequencing .

‡ Label dikaitkan ke ddNTP dengan warna yang berbeda untuk setiap nukleotidanya. ‡ Radioaktif yang digunakan adalah 33P atau 35S karena energi emisinya rendah sehingga dapat menghasilkan resolusi yang tinggi. ‡ Keunggulan: Reaksi sekuensing dapat dilakukan dalam 1 tube dan loading ke-4 molekul nukleotida dilakukan dalam 1 lane gel poliakrilamid karena detektor fluorescent dapat membedakan antara label-label yang berbeda. .Automathic chain termination ‡ Prinsip: menggunakan label radioaktif untuk melacak nukleotida yang diinkorporasikan.

Automatic chain termination .

Molekul diberi dimethyl sulfate yang menempelkan grup metil pada cincin purin dari nukleotida G (terjadi modifikasi nukleotida G).Denaturasi DNA untai ganda menjadi untai tunggal 2. ‡ Langkah kerja: 1. .Pemberian label pada masing-masing ujung DNA untai tunggal. 3.Chemical degradation method ‡ Prinsip kerja: molekul DNA dihasilkan setelah diberi perlakuan dengan bahan kimia yang memotong secara spesifik pada nukleotida tertentu.

‡ Hasilnya adalah suatu set DNA yang terpotong-potong.‡ Karena pemberian dimethyl sulfate hanya dalam jumlah kecil maka proses modifikasi berlangsung lambat (1 per nukleotida). ‡ Pada stadium ini untai DNA masih utuh. . ada yang terlabel dan ada yang tidak. Piperidine membuang cincin G yang dimodifikasi dan memotong molekul DNA pada ikatan fosfodiester tepat pada bagian atas dari cincin G yang dibuang. ‡ Potongan-potongan DNA ini selanjutnya dielektroforesis dalam gel poliakrilamid. ‡ Pemotongan untai DNA akibat pemberian piperidine. ‡ Potongan untai DNA yang dihasilkan tidak sama panjang (hasilnya equivalent dengan hasil yang didapat dari metoda chain terminal).

Chemical degradation method .

. ‡ Prinsip kerja: terjadinya perubahan konformasi untai DNA tunggal akibat adanya mutasi yang terdeteksi dari posisi pita DNA dalam gel poliakrilamid.SSCP ‡ Metoda untuk mendeteksi mutasi 1 basa pada suatu untai DNA tunggal dari suatu gen.

. ‡ Denaturasi DNA untai ganda menjadi untai tunggal. ‡ Visualisasi pita-pita DNA dengan pewarnaan perak nitrat.Langkah kerja: ‡ Aplifikasi gen yang akan diamati dengan PCR. ‡ Elektroforesis DNA untai tunggal dalam gel poliakrilamide selama s 4 jam.

SSCP .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful