Alat-alat dan teknik-teknik yang dipakai dalam rekayasa genetika

Kloning gen Teknologi DNA rekombinan, Rekayasa genetika, Kloning molekuler
Prinsip dasarnya adalah memasukkan suatu gen dari suatu organisme ke sel host dengan tujuan memelihara gen tersebut secara terus menerus dan dipelajari.

Langkah kerja dalam kloning DNA .

Teknologi DNA rekombinan ‡ Berkembang pada awal tahun 1980. . penelitian ²penelitian dasar. peternakan. kedokteran forensik. ‡ Berakar dari ilmu biokimia dan genetika. ‡ Diterapkan dalam bidang pertanian. ‡ Terjadi peningkatan pengetahuan yang signifikan tentang dasar molekuler penyakit-penyakit genetik pada manusia.

. ‡ RE dapat memotong secara simetris ikatan fosofodiester pada untai DNA yang berlawanan pada situs spesifiknya.Enzim restriksi endonuklease ‡ Teknologi DNA rekombinan tidak dapat berjalan tanpa adanya enzim restriksi endonuklease.

3¶overhang PstI 5¶-CTGCA G-3¶ 3¶-G ACGTC-5¶ . 5¶ overhang Sticky. 5¶ overhang End sequences 5¶-G AATTC-3¶ 3¶-CTTAA G-5¶ 5¶-G GATCC-3¶ 3¶-CCTAG G-5¶ 5¶-AG 3¶-TC CT-3¶ GA-5¶ BamHI AluI Blunt Sticky.Beberapa contoh enzim restriksi Enzim EcoRI Sekuens pengenalan 5¶-GAATTC-3¶ 3¶-CTTAAG-5¶ 5¶-GGATCC-3¶ 3¶-CCTAGG-5¶ 5¶-AGCT-3¶ 3¶-TCGA-5¶ 5¶-CTGCAG-3¶ 3¶-GACGTC-5¶ Jenis ujung Sticky.

Enzim restriksi endonuklease .

‡ Terdiri dari beberapa macam: plasmid (elemen bakteri ekstrakromosom yang dapat bereplikasi sendiri). . dan sekuensing DNA insert. invitro mutagenesis. dll. bakteriophage. cosmid. untuk transkripsi.Vektor kloning ‡ Suatu ´wadahµ yang dipergunakan untuk memperbanyak fragment DNA yang ingin dipelajari.

Plasmid .

disatukan dalam tube yang sama. ‡ Contoh: Pemotongan DNA sumber dan vektor dengan enzim RE yang sama. .Syarat vektor kloning ‡ Dapat dipelihara dan direplikasikan di dalam sel host. ditambahkan enzim T4DNA ligase DNA diinkorporasikan ke situs spesifik. ‡ Mengandung satu atau lebih situs restriksi endonuklease tunggal yang menyediakan pilihan situs insersi yang memungkinkan. ‡ Membawa gen resisten terhadap antibiotik tertentu.

Sequencing ‡ Sequencing: metoda untuk membaca urutan basa-basa nukleotida dari suatu gen.Chemical degradation method (Maxam and Gilbert.. 1977): urutan molekul DNA untai ganda ditentukan dengan menggunakan bahan kimia yang memotong molekul DNA pada posisi nukleotida tertentu. 1977): urutan molekul DNA untai tunggal ditentukan dengan sintesis rantai polinukleotida komplementer secara enzimatis. . . ‡ Keunggulan chain terminal method: Lebih mudah dikerjakan secara otomatis menggunakan mesin sekuensing.Chain termination method (Sanger et al. ‡ Ada 2 metoda sequencing: . bahan-bahan yang digunakan tidak toksik.

‡ Dengan gel ini dapat dipisahkan sekelompok molekul mulai dari 10 ± 1500 nukleotida ke dalam suatu seri pita DNA. Penempelan (annealing) primer pada DNA cetakan.Chain termination sequencing ‡ Prinsip kerja: berdasarkan perbedaan panjang molekul DNA untai tunggal yang dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamid. ‡ Langkah kerja: 1. Mempersiapkan molekul DNA untai tunggal yang identik sebagai cetakan. . 2.

Elektroforesis pita DNA yang baru disintesis menggunakan gel poliakrilamid. Pita yang bergerak paling jauh merupakan pita DNA terkecil. Reaksi perpanjangan rantai dengan bantuan enzim DNA polimerase. 4. Setelah elektroforesis urutan DNA dapat dibaca langsung dari posisi pita pada gel . Inkorporasi dNTP dan ddNTP pada rantai yang diperpanjang.3. . 5.

Sequencing .

‡ Label dikaitkan ke ddNTP dengan warna yang berbeda untuk setiap nukleotidanya. ‡ Radioaktif yang digunakan adalah 33P atau 35S karena energi emisinya rendah sehingga dapat menghasilkan resolusi yang tinggi.Automathic chain termination ‡ Prinsip: menggunakan label radioaktif untuk melacak nukleotida yang diinkorporasikan. ‡ Keunggulan: Reaksi sekuensing dapat dilakukan dalam 1 tube dan loading ke-4 molekul nukleotida dilakukan dalam 1 lane gel poliakrilamid karena detektor fluorescent dapat membedakan antara label-label yang berbeda. .

Automatic chain termination .

. ‡ Langkah kerja: 1. 3.Pemberian label pada masing-masing ujung DNA untai tunggal.Denaturasi DNA untai ganda menjadi untai tunggal 2. Molekul diberi dimethyl sulfate yang menempelkan grup metil pada cincin purin dari nukleotida G (terjadi modifikasi nukleotida G).Chemical degradation method ‡ Prinsip kerja: molekul DNA dihasilkan setelah diberi perlakuan dengan bahan kimia yang memotong secara spesifik pada nukleotida tertentu.

‡ Pada stadium ini untai DNA masih utuh. . Piperidine membuang cincin G yang dimodifikasi dan memotong molekul DNA pada ikatan fosfodiester tepat pada bagian atas dari cincin G yang dibuang. ada yang terlabel dan ada yang tidak. ‡ Potongan-potongan DNA ini selanjutnya dielektroforesis dalam gel poliakrilamid. ‡ Pemotongan untai DNA akibat pemberian piperidine. ‡ Potongan untai DNA yang dihasilkan tidak sama panjang (hasilnya equivalent dengan hasil yang didapat dari metoda chain terminal).‡ Karena pemberian dimethyl sulfate hanya dalam jumlah kecil maka proses modifikasi berlangsung lambat (1 per nukleotida). ‡ Hasilnya adalah suatu set DNA yang terpotong-potong.

Chemical degradation method .

. ‡ Prinsip kerja: terjadinya perubahan konformasi untai DNA tunggal akibat adanya mutasi yang terdeteksi dari posisi pita DNA dalam gel poliakrilamid.SSCP ‡ Metoda untuk mendeteksi mutasi 1 basa pada suatu untai DNA tunggal dari suatu gen.

. ‡ Elektroforesis DNA untai tunggal dalam gel poliakrilamide selama s 4 jam. ‡ Denaturasi DNA untai ganda menjadi untai tunggal.Langkah kerja: ‡ Aplifikasi gen yang akan diamati dengan PCR. ‡ Visualisasi pita-pita DNA dengan pewarnaan perak nitrat.

SSCP .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful