LAPORAN PRAKTIKUM

BIOTEKNOLOGI PERTANIAN I
Disusun untuk memenuhi Tugas Mata Kuliah Praktikum Biotek I

Disusun oleh :

Anne Yuliana H
150110080121

AGROTEKNOLOGI – C
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2009
PRAKTIKUM I
Mengamati Morfologi Bakteri dengan Pengecatan Tunggal
dan Gram

PENDAHULUAN

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang
khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri merupakan organisme mikroskopis yang
mempunyai ciri-ciri : tubuh uniseluler, tidak berklorofil, bereproduksi dengan membelah
diri, habitatnya dimana-mana (tanah, air, udara, dan makhluk hidup), dan aktif bergerak
pada kondisi lembab. Beberapa bentuk bakteri yaitu basil, kokus, dan spirilum. Bentuk-
bentuk tersebut dapat menunjukkan karakteristik spesies bakteri, tetapi bergantung pada
kondisi pertumbuhannya. Hal ini dipengaruhi oleh keadaan lingkungan, medium, dan
bakteri (Edukasi, 2008).

Bakteri bersifat transparan dan berukuran sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat
dengan mata telanjang. Salah satu cara untuk mengetahui struktur, morfologi, dan sifat
kimia bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau
pewarnaan. Zat warna yang biasa dijadikan untuk mengecat bakteri adalah methylene
blue, basic fuchsin, dan crystal violet.

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion
karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna.
Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa

Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif,
sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel
tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewarna negatif. Contoh pewarna asam
misalnya : tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin dan lain-lain. Pewarnaan basa
bisa terjadi pada senyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel
bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa misalnya
methylene blue, kristal violet, safranin dan lain-lain.

Beberapa pengecatan yang kita kenal ialah pengecatan tunggal atau sederhana dan
pengecatan majemuk. Pengecatan tunggal ialah pengecatan yang hanya digunakan satu
macam zat warna saja (Gupte, 1990). Sedangkan pengecatan majemuk ialah pengecatan
yang menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Pengecatan tunggal hanya bertujuan
untuk melihat bentuk sel, sedangkan pengecatan majemuk dapat membedakan
karakteristik suatu morfologi tertentu. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan
pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa)
sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat
alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).

Sebelum melakukan pengecatan bakteri, dibuat dahulu film di atas gelas objek dari
suspensi bakteri. Tujuan pembuatan film adalah mematikan sel bakteri dengan cepat
tanpa merusak morfologinya dan melekatkan sel bakteri ke permukaan gelas objek.
1.1. PENGECATAN TUNGGAL

Tujuan:

Untuk melihat morfologi (bentuk susunan) bakteri dengan menggunakan satu macam zat
warna.

Alat dan bahan :

Biakan bakteri Azotobacter chroococcum dan Pseudomonas sp.
Zat warna carbol fuchsin/ safranin/ carbol gentian violet/ methylene blue
Gelas objek, ose, lampu spirtus, botol semprot
Kertas saring
Minyak imersi
Mikroskop

Prosedur kerja :

A. Pembuatan Film
Pembuatan film berperan penting dalam pengamatan morfologi. Bakteri yang terlalu
bertumpuk atau terlalu tipis di atas gelas objek akan menghasilkan gambaran yang kurang
jelas di bawah mikroskop.

Cara membuat film :

1) Membersihkan gelas objek dengan kapas beralkohol untuk menghilangkan lemak
dan mikroba yang menempel, lalu mengeringkannya di udara
2) Mengambil satu ose suspensi bakteri secara aseptik, yaitu dengan membakar ose di
atas lampu spirtus sampai memijar, kemudian mendinginkannya sebentar lalu
menempelkan pada bagian dalam tabung biakan sebelum mengambil suspensi
bakteri.
3) Membuat film setipis mungkin di atas gelas objek
 4) Melakukan fiksasi dengan menggerakkan film di atas api secara cepat dua sampai
tiga kali. Hal ini dimaksudkan untuk membunuh sel bakteri secara cepat sehingga
tidak mengalami perubahan bentuk. Selain itu fiksasi juga dapat melekatkan sel
bakteri pada gelas objek.

B. Pengecatan
1) Menambahkan salah satu zat warna di atas film dengan waktu yang sesuai, yaitu
untuk carbol fuchsin 15-20”, carbol gentian violet 30-45”, dan methylene blue 3-5’.
2) Membuang zat warna tersebut lalu mencucinya dengan mengalirkan air
menggunakan botol semprot untuk menghilangkan zat warna yang tidak terpakai
3) Mengeringkan dengan menggunakan kertas saring dengan menempelkan perlahan
ke atas film yang telah diwarnai
4) Menambahkan satu tetes minyak imersi
5) Mengamati di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat (lensa objektif 100x)
6) Mencatat dan menggambar morfologi bakteri tersebut

Hasil dan Kesimpulan :

1.2. PENGECATAN GRAM
Teori:
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884.
Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif
dan gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut.
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan Gram. Bakteri dapat digolongkan menjadi dua kelompok yaitu
Gram positif dan Gram negatif didasarkan pada perbedaan struktur dinging sel. Bakteri
Gram positif memiliki dinding sel yang terdiri atas lapisan peptidoglikan yang tebal dan
asam teichoic. Sementara bakteri Gram negatif memiliki lapisan luar, lipopolisakarida
yang terdiri atas membran dan lapisan peptidoglikan yang tipis terletak pada periplasma
(di antara lapisan luar dan membran sitoplasmik). Bakteri gram-positif akan
mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara
bakteri gram-negatif tidak. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi
dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme
yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.  ( Tryana ,S .T ,2008 ).
Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna
merah (Textbook, 2008). Berikut adalah beberapa perbedaan Bakteri gram positif dengan
bakteri gram negatif, diantaranya :

Perbedaan Gram Positif (+) Gram Negatif (-)

Lapisan petidoglikan Lebih tebal Lebih tipis
Kadar lipid 1-4% 11-22%
Resistensi terhadap alkali
Lebih pekat Larut
(1% KOH)
Kepekaan terhadap Lebih peka Kurang peka
 Yodium
Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
Resistensi terhadap
Lebih tahan Lebih peka
tellurit
Sifat tahan asam Ada yang tahan asam Tidak ada yang tahan asam
Kepekaan terhadap
Lebih peka Kurang peka
penisilin
Kepekaan terhadap
Tidak peka Peka
streptomisin

Tujuan:

Untuk membedakan bakteri yang bersifat Gram positif dan Gram negatif.

Alat dan bahan :

Biakan murni S. aureus, E. coli, dan B. subtilis
Zat warna carbol gentian violet, fuchsin/ safranin
Larutan lugol ( I, KI, air), alkohol 95%, minyak imersi
Gelas objek, ose, lampu spirtus, kertas saring
Mikroskop

Prosedur kerja :
1. Membuat film seperti pada praktikum I
2. Menambahkan carbol gentian violet selama 3 menit
3. Mencuci dengan air yang dialirkan dari botol semprot
4. Menambahkan larutan lugol selama 1 menit
5. Menambahkan 2-3 tetes alkohol kemudian membiarkan selama 30 detik sampai tidak
ada zat warna yang larut
6. Mencuci dengan air, lalu menambahkan fuchsin/ safranin selama 1-2 menit
7. Mencuci dengan air, dan mengeringkannya dengan kertas saring
8. Mengamati di bawah mikroskop dengan perbesaran lensa objek 100x
9. Mencatat dan menggambar morfologi dan warna sel.
Hasil dan Kesimpulan :

Staphylococcus adalah bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang
berkoloni dan berbentu seperti buah buah anggur. Staphylococcus Aureus yang berwarna
kuning, karakterististik yang dimiliki Staphylococcus Aureus diantaranya hemolytic pada
darah agar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15
sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan
menghasilkan enzim coagulase.

Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami
sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic
suhu berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat
hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan
terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau
oxidative kondisi, dan panas atau etanol Bakteri ini hanya memiliki satu molekul DNA
yang berisi seperangkat set kromosom.

PRAKTIKUM II
Mengamati Morfologi Bakteri dengan Pengecatan Spora dan
Kapsul

PENDAHULUAN

Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri.
Endospora merupakan organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang
nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi
menjadi baik (Ncbi, 2008). Karena kandungan air endospora sangat rendah bila
dibandingkan dengan sel vegetatifnya, maka endospora berbentuk sangat padat dan
sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop. Struktur endospora mungkin bervariasi
untuk setiap jenis spesies, tapi umumnya hampir sama. Endospora bakteri merupakan
struktur yang tahan terhadap keadaan lingkungan yang ekstrim misalnya kering,
pemanasan, dan keadaan asam. Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna
pada umumnya, sehingga harus digunakan pewarna spesifik, tetapi sekali diwarnai zat
warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan
spora secara umum. Bakteri yang tidak berspora cenderung tidak tahan pengecatan
karena hanya memiliki sel vegetatif.

Beberapa endospora mempunyai diameter lebih besar daripada sel, dimana sel tersebut
akan nampak menggembang pada letak endosporanya (Ncbi, 2008). Letak endospora
yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi. Tipe utama
diantara terminal, subterminal dan sentral. Tipe sentral atau tengah merupakan lokasi dari
sel vegetatif yang letaknya tepat di tengah. Tipe terminal memiliki pengertian letak sel
vegetatif diantara ujung dan pinggir dari sel vegetatif. Tipe subterminal berarti lokasi
endosporanya diantara tengah dan pinggir dari sel vegetatif. Endospora dapat berukuran
lebih besar ataupun kecil dari sel vegetatif yang terdiri dari lapisan protein yang terbuat
dari keratin. Spora ini memiliki resistensi yang tinggi terhadap pewarnaan.
2.1. PENGECATAN SPORA BAKTERI (METODE KLEIN DAN
METODE WIRTZ)

Alat dan bahan :

Biakan murni Bacillus subtilis/ Pseudomonas sp.
Zat kimia/ warna carbol fuchsin, methylene blue, malachite green, safranin
Asam sulfat, alcohol
Tabung reaksi, gelas objek, ose
Penangas air, termometer
Mikroskop

Prosedur kerja :

A. Metode Klein I
1) Mencampurkan suspensi bakteri dengan carbol fuchsindalam tabung reaksi (1:1)
2) Memanaskan dalam penangas air selama 10 menit pada temperatur 800 C
3) Membuat film dari campuran suspensi di atas
4) Mencelupkan ke dalam asam sulfat selama 1-2 detik
5) Mencuci dengan air lalu menambahkan methylene blue selama 3 menit
6) Mencuci dengan air dan mengeringkan dengan kertas saring
7) Mengamati dengan perbesaran kuat
8) Mencatat dan menggambar morfologi dan warna sel.

B. Metode Klein II
1) Membuat film dari suspensi bakteri
2) Menambahkan carbol fuchsin kemudian memanaskan sampai keluar uap (800 C)
3) Langkah-langkah selanjutnya sama seperti metode Klein I

C. Metode Wirtz
1) Membuat film dari suspensi bakteri
 2) Menambahkan malachite green kemudian memanaskan sampai menguap kurang
lebih selama 2 menit
3) Mencuci dengan air lalu menambahkan safranin selama 30 detik
4) Mencuci dengan air dan mengeringkan dengan kertas saring
5) Mengamati dengan perbesaran kuat
6) Mencatat dan menggambar morfologi selnya

Hasil dan Kesimpulan :

Hasil
Malachite green merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam
endospora. Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup
dengan cat safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan
warna merah muda pada sel vegetatifnya. Saat diwarnai oleh malachite, sel vegetatif
dapat mengikat warna tetapi dapat luntur setelah dilunturkan karena ikatannya tidak kuat.
Setelah pewarnaan selanjutnya dengan safranin, sel vegetatif mudah mengikat warna
kembali. Oleh karena itu, hasil pewarnaan akhir adalah merah muda dari safranin. B.
Subtilis akan berwarna hijau setelah pengecatan. Bacillus pada umumnya bersifat aerobic.
Hal ini berarti B. Subtilis memiliki endospora. Endospora lebih tahan lama meski dalam
keadaan linghkungan ekstrim seperti kering, panas, atau bahan kimia yang beracun.
Selain itu, endospora juga lebih tahan terhadap pewarnaan. Sekali berhasil diwarnai,
spora sangat sukar untuk melepaskan zat warna sehingga saat diberi warna dari safranin
tetap berwarna hijau karena spora sudah mengikat malachite dan sulit mengikat warna
yang diberikan kemudian.
Eschericia coli setelah pengecatan akan berwarna merah muda dari safranin. E.coli
berarti tidak memiliki endospora, hanya memiliki sel vegetatif. Karena E.coli hanya
memiliki sel vegetatif, sel vegetatif tidak tahan terhadap pewarnaan. Saat diwarnai denga
malachite, sel vegetatif tidak dapat mengikat malachite sehingga saat dilunturkan, warna
malachite dapat hilang. Kemudian saat diberi safranin, sel vegetatif dapat mengikat
warna kembali sehingga warna sel menjadi merah muda. prosedur pewarnaan dengan
malakit hijau adalah dengan pemanasan. Bacillus subtilis memiliki endospora yang
terletk di subterminal (Ncbi, 2008). Hasil pengamatan pada endospora Bacillus subtilis
berbeda dengan literatur karena terdapat kesalahan pengamatan dan pengidentifikasian.
Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur
warna, subtrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Prinsip yang
selalu harus diingat dan dipatuhi adalah (Edukasi, 2008) :
Selalu mensterilkan ose, pada saat akan dipakai dan setelah dipakai.
Letakkan ose pada tempatnya, jangan diletakkan di sembarang tempat (misal di atas
meja)Jangan memegang mata (ujung) ose dengan tangan.
Usahakan tidak banyak bicara pada saat kerja
2.2. PENGECATAN KAPSUL BAKTERI (METODE BURRI-GINS
DAN METODE MANEVAL)

Teori :
Pada bagian sebelah luar dari dinding sel beberapa jenis bakteri, terdapat suatu
eksopolisakarida seperti lendir (gum). Zat tersebut terdapat mengelilingi bakteri dan
menyerupai kapsul, maka struktur demikian disebut kapsul yang melekat kuat di dinding
sel. Struktur kapsul sangat tipis atau tebal tergantung pada jenis bakteri dan jenis bahan
makanan yang terkandung dalam media atau substrat. Kapsul merupakan ekskresi
dinding sel bakteri yang berfungsi sebagai pelindung. Adanya kapsul pada bakteri
patogen mempunyai hubungan erat dengan virulensi bakteri. Bakteri dengan kapsul yang
tebal mempunyai virulensi lebih tinggi daripada bakteri dengan kapsul yang tipis atau
dengan yang tidak memiliki kapsul sama sekali. Pengecatan kapsul bakteri disebut juga
pengecatan negatif, karena yang diwarnai adalah latar belakangnya, sedangkan objek
(kapsul) tidak diberi warna.

Pada metode Burri-Gins, tinta cina digunakan sebagai latar belakangnya, sedangkan
untuk mewarnai badan bakteri digunakan fuchsin, sehingga badan bakteri berwarna
merah dan kapsul tidak berwarna (transparan) pada latar belakang yang hitam. Pada
metode Maneval, untuk mewarnai badan bakteri digunakan Congo red, sedangkan cat
Maneval gigunakan sebagai latar belakangnya. Badan bakteri akan berwarna merah,
sedangkan kapsul tidak berwarna pada latar belakang hijau.

Alat dan bahan :

Biakan murni Azotobacter chroococcum
Tinta cina, cat Maneval, dan media cair
Zat kimia/ warna larut fuchsin, Congo red
Gelas objek, ose, kertas saring, minyak imersi
Lampu spirtus
Mikroskop
Prosedur kerja :

A. Metode Burri-Gins
1) Meneteskan satu ose suspensi bakteri pada bagian ujung gelas objek
2) Meneteskan 1-2 ose tinta cina di dekatnya lalu dicampurkan
3) Membuat preparat hapus dengan cara mendorong ke depan menggunakan gelas
objek lain
4) Mengeringkan di udara
5) Menambahkan carbol fuchsin selama 1-2 menit
6) Mengeringkan dengan kertas saring
7) Mengamati dengan perbesaran kuat
8) Mencatat dan mengamati apa yang terlihat

B. Metode Klein II
1) Meneteskan 5-6 ose Congo red pada gelas objek
2) Mencampurkan satu ose suspensi bakteri dengan Congo red, lalu buat film setipis
mungkin
3) Mengeringkan di udara
4) Menambahkan cat Maneval selama 1 menit
5) Mencuci dengan air lalu mengeringkannya dengan kertas saring
6) Mengamati dengan perbesaran kuat
7) Mencatat dan mengamati apa yang terlihat

Hasil dan Kesimpulan :

PRAKTIKUM III
PENGENALAN STRUKTUR MIKROSKOPIS JAMUR

PENDAHULUAN

Jamur adalah organisme yang sel-selnya berinti sejati atau eukariotik, berbentuk benang,
bercabang-cabang, tidak berklorofil, dinding selnya mengandung khitin atau selulosa atau
keduanya, heterotrof, absortif dan sebagian besar tubuhnya terdiri dari bagian vegetatif
berupa hifa dan generatif yaitu spora.

Alat dan bahan :

Beberapa spesies jamur yang ditumbuhkan di media Potato Dextrose Agar (PDA),
dan jamur-jamur konsumsi
Jamur preparat
Objek glass dan cover glass
Mikroskop

Prosedur kerja :

A. Metode Klein I
1) Mengambil potongan kecil dari biakan murni dan meletakkan pada gelas objek
yang telah diberi satu tetes lactophenol cotton blue atau laptophenol
2) Potongan biakan dapat langsung diamati di bawah streoscopic microscope
3) Menutup biakan dengan gelas penutup agar bentuk sporangiofor/konidiofor dan
pelekatannya pada sporangium/konidia dapat terlihat lebih detail
4) Mengatur jarak lensa objek agar memperoleh focus yang baik, dengan
menggunakan perbesaran 10x dan untuk memperjelas detail dari objek dapat
digunakan lensa dengan perbesaran 40x
 5) Mengamati secara mikroskopis karakteristik spora/konidia, ujung konidiofor dan
pelekatan antara konidia dengan konidiofor
6) Menentukan genus jamur berdasarkan karakteristik koloni mikroskopisnya
7) Menjelaskan klasifikasi dari genus tersebut
8) Menjelaskan peranan-peranan yang dilakukan oleh jamur tersebut di bidang
pertanian

Hasil dan Kesimpulan :

Pengamatan morfologi jamur
PRAKTIKUM IV
ISOLASI DAN PENENTUAN POPULASI BAKTERI DAN
JAMUR DARI RIZOSFIR, FILOSFIR DAN SPERMOSFIR

PENDAHULUAN

Teori :
Hubungan mikroorganisme dengan tanaman dapat menguntungkan maupun maupun
merugikan tanaman. Bagian tanaman yang berasosiasi spesifik dengan mikroorganisme
adalah filosfir, rizosfir, dan spermosfir.

Rizosfir adalah zona kontak antara akar dan tanah yang langsung mempengaruhi
metabolisme akar. Zona ini mengandung mikroorganisme lebih banyak daripada zona di
luarnya karena mengandung sejumlah eksudat akar sebagai sumber nutrisi
mikroorganisme.

Filosfir adalah daerah permukaan tanaman yang berhubungan langsung dengan udara
atmosfer yang meliputi daun, pucuk daun, helai bunga, dan kuntum bunga. Spermosfir
adalah daerah yang melingkupi permukaan biji (benih) yang sedang bergeminasi. Isolasi
mikroba dapat dilakukan dengan tiga metode, yaitu:

a) Metode Gores (Streak plate method)

Pada metode ini, satu ose suspensi sumber isolat digoreskan ke atas permukaan plat
agar. Penggoresan dilakukan beberapa kali dalam satu plat agar dengan tujuan
mendapatkan koloni terpisah. Plat agar tersebut diinkubasikan satu sampai dua hari
untuk memberikan kesempatan pada mikroba membentuk koloni. Setiap satu koloni
dianggap berasal dari satu sel mikroba.
 Setelah masa inkubasi satu atau dua hari, plat agar akan ditumbuhi berbagai jenis
koloni dengan pola pertumbuhan koloni sesuai dengan alur goresan kultur. Dengan
metode ini, koloni terpisah pindahkan ke media agar miring untuk dimurnikan dan
memperoleh biakan murni. Metode ini tidak dapat menghitung populasi mikroba
dalam suatu substrat.

b) Metode Tuang (Pour Method) atau metode pengenceran plat

(Dilution Plate method)

Pada metode ini media agar steril yang belum membeku (temperature tidak lebih
dari 450C) ke dalam cawan Petri steril yang mengandung suspensi mikroba pada
volume dan pengenceran tertentu. Pada suhu ini agar belum membeku dan mikroba
tidak mati. Cawan Petri yang berisi suspensi mikroba dan media agar digerakkan ke
kiri, ke kanan dan diputarkan beberapa kali agar suspensi bakteri tersebar merata
dalam media biarkan membeku, kemudian inkubasikan selama 1-2 hari dengan
petridish diletakkan terbalik.

Setelah inkubasi akan terlihat beberapa jenis koloni mikroba yang tumbuh
menyebar. Populasi mikroba dihitung berdasarkan jumlah koloni yang terbentuk.
Koloni yang terpisah dapat dimurniakan untuk memperoleh biakan murni.

Pengenceran
Pengenceran suatu sumber isolat dilakukan untuk menurunkan konsentrasi sel
mikroorganisme di dalam substrat/sumber isolat sehingga dengan metode tuang
akan didapatkan koloni terpisah di atas plat agar dengan jumlah antara 30-300 per
plat agar.

c) Metode Replika Bahan Tanaman

Pada metode ini kita menempelkan bahan tanaman seperti daun, batang, atau benih
ke atas plat agar selama 5 menit. Mikroba yang menempel di atas plat akan tumbuh
setelah masa inkubasi 1-3 hari.
 isolat bakteri
Nutrisi yang berada di dalam media biakan digunakan untuk pertumbuhan, sintesis sel,
keperluan energi dalam metabolisme, dan pergerakan. Pada umumnya nutrisi atau
kandungan unsur dalam media biakan yang dibutuhkan oleh bakteri adalah sumber
energi, karbon, nitrogen, sulfur, fosfor, unsur-unsur logam, vitamin dan air. Macam
kondisi fisik lingkungan yang dibutuhkan untuk pertumbuhan optimum bakteri adalah
suhu, gas atmosfer, dan pH.

HasiL dan Pembahasan PRAKTIKUM I Bag : 1.2.

Proses perwarnaan dilakukan dengan membersihkan gelas objek dan gelas penutup
dengan alkohol 70% untuk sterilisasi agar tidak kontaminasi. Gram A mengandung
kristal violet yang berwarna ungu merupakan cat primer yang akan mewarnai
bakteri, pewarnaan dilakukan 1 menit agar cat ini dapat melekat sempurna pada dinding
bakteri. Gram D mengandung safranin sehingga bewarna merah yang merupakan cat
sekunder atau kontras berfungsi untuk memberikan warna bakteri non target, dilakukan
selama 30 detik agar bakteri yang catnya telah luntur dapat terwarnai (Heritage, 2000).

Pencucian dengan air mengalir dimaksudkan agar cat dapat hilang secara sempurna dan
tidak tersisa, dikeringanginkan bertujuan agar warna melekat pada bakteri dan segera
kering sehingga bila diwarnai lagi warna sebelumnya tidak tercampur dengan warna yang
baru. Kemudian dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 x agar dapat
mengamati bentuk dan warna sel bakteri. Bakteri gram positif akan berwarna ungu,
sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah. Pewarnaaan dengan safrani
(1-2 menit) bertujuan sebagai counterstain yang digunakan untuk melumuri bagian warna
dari sel yang lain daripada endospora (Prescot, 2002). Kemudian dicuci dengan air
mengalir agar warna safranin luntur dan dikeringanginkan agar warna cepat kering.

Analisis Hasil
Pewarnaan bakteri dilakukan pada isolat staphylococcus aereus adalah gram positif yang
berbentuk kokus atau lingkaran sterik dengan diameter sel mencapai 1µm, koloninya
berbentuk seperti buah anggur (Textbook, 2008). Pada bacillus subtilis, koloninya
bergerombol sedikit erpisah-pisah bahkan membentuk rantai panjang (hasil pengamatan).
Pada Eschericia coli, koloninya tersusun rantai memanjang. Pada bakteri ini tidak
ditemukan endospora, pada saat diwarnai menunujukkan warna merah.
Staphylococcus aereus pada pewarnaan gram diketahui berwarna ungu sehingga
termasuk bakteri gram positif. Bakteri ini berbentuk basil. Koloninya tersususn berjajar
seperti rantai memenjang. Jenis ini memiliki endospora yang terletak pada sentral.
Staphylacoccus aereus adalah gram positif yang berbentuk kokus atau lingkaran seperti
sterik dengan diameter sel mencapai 1 µm, dan koloninya seperti buah anggur. Perananya
adalah dapat menghasilkan racun sebagai penyebab sindrom trauma yang diderita oleh
pria, wanita dan anak-anak. Sindrom racun trauma tersebut berupa kejang, pingsan,
turunnnya tekanan darah (Textbook, 2008).
Klasifikasi Staphylococcus aureus.
Kingdom : Bakteri
Filum : Firmicutes
Kelas : Cocci
Famili : Staphylococcaaceae
Genus : Staphylacoccus
Spesies : Staphylacoccus aereus (it is, 2008)

Pada pengamatan dengan menggunakan mikroskop nampak Bacillus subtilis berbentuk

basil (batang) dan merupakan bakteri gram positif. Jenis ini memiliki endospora yang
letaknya di tengah. Bacillus subtilis merupakan bakteri yang berbentuk batang yang
Gram-positif (Perez 2000). Bakteri ini tersusun atas peptidoglycan, yang merupakan
polimer dari sugars dan asam amino. Peptidoglycan yang yang ditemukan di bakteri yang
dikenal sebagai murein. Sel membentuk tembok penghalang antara lingkungan dan
bakteri sel yang berguna untuk mempertahankan bentuk sel dan withstanding sel yang
tinggi internal tekanan turgor (Schaechter 2006).
Habitat endospora bakteri ini adalah tanah. Mikroba tersebut dalam bentuk spora yang
kekurangan nutrisi. Organisme ini dapat menghasilkan antibiotik selama sporulation.
Contohnya polymyxin, difficidin, subtilin, dan mycobacillin. Banyak dari mikroba
Bacillus dapat menurunkan Polymers seperti protein, pati, dan pektin, sehingga bakteri
ini merupakan penyumbang penting kepada siklus karbon dan nitrogen. Akan tetapi
apabila terkontaminasi, dapat menyebabkan pembusukan. Berdasarkan pewarnaan sel
vegetatif didapatkan warna kemerahan dan warna endosporanya adalah hijau (Schaechter
2006).
Klasifikasi Bacillus subtilis.
Kingdom : Bakteri
Filum : Firmicutes
Kelas : Bacilli
Order : Bacillales
Famili : Bacillaceae
Genus : Bacillus
Spesies : Bacillus subtilis (itis, 2008)

Berdasarkan hasil pengamatan bakteri Eschericia coli. Berbentuk basil (batang) yang
pendek. Bakteri tersebut pada saat diwarnai menunjukkan warna merah. Koloninya
tersusun seperti rantai memanjang. Pada bakteri ini tidak ditemukan endospora. Menurut
Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang
termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam
jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan
melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan
patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta
hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan
limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses
manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008).
Klasifikasi Escherichia coli.
Kingdom : Bakteria
Filum : Proteobacteria
Kelas : Gamma Proteobacteria
Order : Enterobacteriales
Famili : Enterobacteriaceae
Genus : Escheriachia
Spesies : E. coli (itis, 2008)

Kesimpulan
Teknik pembuatan sediaan apusan (preparat) dapat dilakukan dengan mensuspesikan
biakan bakteri dengan aquades, kemudian difiksasi. Pewarnaan struktur sel bakteri
dilakukan dengan cat gram A, gram B, gram C, dan gram D. pewarnaan endospora
dengan menggunakan malakit. Bentuk sel bakteri yang ditemukan adalah basil (Bacillus
subtilis., Escherichia coli., Staphylococcus aereus), dan kokus (tidak ada). Bakteri yang
termasuk gram positif adalah Bacillus subtillis. dan gram negartif Eschericia coli dan
Staphylococcus aereus. Lama pewarnaan dan langkah-langkah urutan pewarnaan harus
diperhatikan. Etanol terhindin adap bakteri dapat menyebabkan tereksistasinya lapisan
lipid sehingga memperbesar daya serap atau permiabilitas dinding sel gram negatif. Jadi
kompleks ungu kristal iodium yang telah memasuki dinding sel selama langkah awal
dalam proses pewarnaan dapat tereksistasi. Karena itu organisme gram negatif pewarnaan
kehilangan warna tersebut, disebabkan kandungan lipidnya yang lebih rendah, dinding sel
bakteri gram positif menjadi terdehidrasi selama perlakuan dengan etanol.

PRAKTIKUM II
Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar
belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan
transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan
ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang
keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar
kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini

menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Hadiotomo, 1990).

Struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang khas dibentuk oleh spesies ini disebut
endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan
terhadap panas, kekeringan, radiasi UV serta bahan-bahan kimia. Ketahanan tersebut
disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras. Sifat-sifat ini menyebabkan
dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Hanya bila diperlukan panas
yang cukup, pewarna yang sesuai dapat menembus endospora. Tetapi sekali pewarna
memasuki endospora, sukar untuk dihilangkan. Ukuran dan letak endospora di dalam sel
merupakan ciri-ciri yang digunakan untuk membedakan spesies-spesies bakteri yang
Membentuknya (Dwidjoseputro, 1989).
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu (Hadiotomo, 1990) :
- Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
- Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat
didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak
mengandung asam tekoat.
- Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
- Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
- Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
- Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu (Hadiotomo, 1990) :
- Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
- Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang
sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan.
Mengandung asam tekoat.
- Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
- Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
- Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
- Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

Pengecatan Sederhana
Pengecatan sederhana digunakan untuk memperlihatkan atau memperjelas kontras antara
sel dan latar belakangnya sehingga dapat mempertajam bentuk dari sel-sel mikroba itu
sendiri, dengan cara mewarnai sel-sel mikroba dengan zat warna khususnya warna Kristal
violet. Pada pengecatan sederhana digunakan bakteri Bacillus cereus dan Salmonella
typii. Setelah pengecatan diperoleh bakteri tersebut berwarna ungu, yang berarti bakteri
tersebut menyerap zat warna cat tersebut sehingga Nampak pada mikroskop. Zat warna
yang umunya digunakan yakni yang bersifat alkalin (kromatofornya bermuatan +).
B. Pengecatan Negatif
Pada pengecatan ini digunakan cat asam nirosin (tinta cina). Pengecatan ini dilakukan
untuk mewarnai latar belakang preparat sedangkan bakteri sendiri tidak terwarnai serta
untuk mengamati ukuran, bentuk, dan tata letak sel. Setelah pengamatan dibawah
mikroskop diperoleh preparat mikroba berwarna hitam sedangkan bakteri sendiri tidak
berwarna (berwarna putih) dan berbentuk basil (batang).
C. Pengecatan Gram
Pengecatan gram termasuk pengecatan diferensial yang digunakan untuk membedakan
bakteri gram negative dan bakteri gram positif. Pada pengecatn ini digunakan 3 jenis
bakteri yaitu Bacillus cereus, Salmonella typii dan Eshericia coli.. Pengecatan ini
menggunakan 4 jenis larutan yaitu Kristal violet sebagai cat utama, larutan iodine sebagai
pengintensifan cat utama, alcohol asam untuk pencucian dan safranin sebagai cat
penutup. Berdasarkan percobaan diperoleh Bacillus cereus dan Salmonella typii bersifat
gram positif yang berarti bakteri dapat mengikat dengan kuat cat utama cristal violet
berwarna ungu, pada saat bakteri Gram positif ditambahkan dengan kristal violet maka
gram positif akan mengabsorbsi larutan tersebut hanya pada dinding sel, dengan
pemberian larutan lugol maka kristal violet akan masuk sampai ke inti sel, pemberian
alkohol menyebabkan pori-pori dinding sel mengecil sehingga warna ungu tertahan di
dalam sel disebabkan oleh rendahnya kandungan lipid. Sedangkan bakteri Eschericia coli
bersifat gram negative karena tidak dapat mengikat kuat cat utama dan dapat diwarnai
oleh cat lawan yakni merah dari pewarna safranin.

BAB V
PENUTUP
V.1 Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa :
- Pewarnaan mikroorganisme dapat dilakukan dengan cara yaitu dengan pengecatan
gram, pengecatan sederhana dan pengecatan negative.
- Pewarnaan sederhana digunakan untuk melihat bentuk dan struktur sel bakteri dengan
menggunakan satu jenis pewarna seperti safranin atau kristal violet, pewarnaan gram
digunakan untuk membedakan antara bakteri gram (+) dan gram (-) dengan lebih dari
satu zat warna sedangkan pewarnaan negative berguna untuk mewarnai latar belakang
preparat dan bakteri sendiri tidak terwarnai.
- Bakteri gram negatif pada teknik pewarnaan akan menghasilkan warna merah dan
bakteri gram positif akan menghasilkan warna ungu.
V.2 Saran
Saran untuk laboratorium agar percobaan berikutnya keanekaragaman bakteri yang
digunakan dapat bertambah lagi sehingga hasil yang diperoleh dapat bervariasi.

Teknik pewarnaan asam basa ini hanya menggunakan satu jenis senyawa pewarna,
teknik ini disebut pewarna sederhana. Pewarnaan sederhana ini diperlukan untuk
mengamati morfologi, baik bentukmaupun susunan sel. Teknik pewarnaan yang
lain adalah pewarnaan diferensial, yang menggunakan senyawa pewarna yang lebih
dari satu jenis. Diperlukan untuk mengelompokkan bakteri misalnya, bakteri gram
positif dan bakteri gram negatif atau bakteri tahan asam dan tidak tahan asam.
Juga diperlukan untuk mengamati struktur bakteri seperti flagela, kapsula, spora
dan nukleus.