Mikroum…Pewarnaan Gram

Posted by: Qiqi on: 17 Oktober, 2008

• In: Laporan
• Comment!

BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang
berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil
pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi
monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya
mirip buah anggur. Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak
melengkung.
Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut
dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan
ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008). Hal ini bertujuan untuk
memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada
endospore yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang
stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan
sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008).
Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan
identifikasi data apakah gram positif atau gram negatif sehingga diperlukan adanya praktikum ini
dilakukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaan gram.

1.2 Perumusan Masalah

Rumusan masalah adalah faktor-faktor apa sajakah yang berpengaruh terhadap keberlangsungan
pewarnaan pada bakteri dan endospora, bagaimanakah karakteristik dari ketiga spesimen, serta
bagaimana teknik pengecatan
1.3 Tujuan
Tujuan praktikum adalah mempelajari proses pewarnaan struktur sel bakteri, mempelajari
bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri dan memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur
pewarnaan dan memahami reaksi kimia di dalam prosedur tersebut

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884. Dengan
metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan gram
negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat
bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa
dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma
sp. (Tryana, S.T, 2008).
Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu:
1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri)
Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan
2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu)
Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora

Gambar Struktur Dasar Bakteri

Gambar Bakteri Gram Positip dan Bakteri Gram Negatif

(Edukasi, 2008).
Staphylococcus adalah bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni
dan berbentu seperti buah buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada dua jenis
warna staphylococci yaitu: Staphylococcus Aureus yang berwarna kuning dan Staphylococcus
albus yang berwarna putih. Beberapa karakterististik yang dimiliki Staphylococcus Aureus
diantaranya hemolytic pada darah agar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh pada
suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl pada konsentrasi tinggi hingga 15
persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selain itu,biasanya S. Aureus merupakan patogen
seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru, radang kelenjar dada,
radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan endocarditis serta menyebabkan
keracunan makanan yaitu dengan melepakan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi
toksik dengan melepasan superantigens ke dalam aliran darah (Kenneath, 2008).
Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering
ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu berkisar
25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di
bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti
kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol
Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set kromosom. DNAnya
berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen protein. Beberapa keunggulan
dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam jumlah besar ke luar dari sel
(Scetzer, 2006).
Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang
termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar
di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari
bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang
menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan
yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level
pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella
typhi. (Mikrolibrary, 2008). Endospore adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang
stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan
sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008).
Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut
dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan
ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008).
PEMBUATAN PREPARAT BAKTERI DAN PEWARNAAN TUNGGAL
PEMBUATAN PREPARAT BAKTERI
DAN
PEWARNAAN TUNGGAL
Dalam pembuatan preparat native alat dan bahan yang digunakan yaitu mikroskop, objek glass,
cover glas, kawat ose, bunsen, pipet tetes, koloni mikroba agar miring ( bakteri, kapang, dan
khamir ), alkohol 95% dan aquades. Proses pembuatan preparat native bakteri yaitu kawat ose
dipijarkan di atas api bunsen, setelah itu ambil koloni bakteri pada agar miring PCA ( Plate
Count Agar ) secara hati – hati, lalu taruh koloni bakteri tersebut di atas objek glass.
Penempatan koloni bakteri tersebut tidak boleh terlalu tebal karena untuk memudahkan
pengamatan. Setelah itu tambahkan aquades 1 tetes dengan pipet tetes pada koloni bakteri
tersebut lalu ditutup dengan cover glass, lalu diamati di bawah mikroskop dan digambar. proses
pembuatan preparat native kapang sistemnya sama yaitu kawat ose dipijarkan di atas api
bunsen, setelah itu ambil koloni kapang pada agar miring PDA ( Potatoes Dextrose Agar )
secara hati – hati, lalu taruh koloni kapang tersebut di atas objek glass. Penempatan koloni
kapang tersebut tidak boleh terlalu tebal karena untuk memudahkan pengamatan. Setelah itu
tambahkan aquades 1 tetes dengan pipet tetes pada koloni kapang tersebut lalu ditutup dengan
cover glass, lalu diamati di bawah mikroskop dan digambar.
(http://masrurenstein.blogspot.com/2009/05/mikrobiologi-umum.html)(23/10/2009).
Dalam pembuatan preparat ulas alat dan bahan yang digunakan yaitu mikroskop, objek glass,
kawat ose, bunsen, pipet tetes, koloni mikroba agar miring ( bakteri, kapang, dan khamir ),
alkohol 95% dan metilen biru. Proses pembuatan preparat ulas bakteri yaitu kawat ose
dipijarkan di atas api bunsen, setelah itu ambil koloni bakteri pada agar miring PCA ( Plate
Count Agar ) secara hati – hati, lalu taruh koloni bakteri tersebut di atas objek glass.
Penempatan koloni bakteri tersebut tidak boleh terlalu tebal karena untuk memudahkan
pengamatan. Setelah itu tambahkan metilen biru 1 tetes dengan pipet tetes pada koloni bakteri
tersebut dan didimakan selama 1 menit, lalu difiksasi dimana fungsi fiksasi yaitu melekatkan
mikroba pada obyek glass, memperjelas pengamatan dibawah mikroskop, dan membunuh
mikroba. Setelah itu diamati di bawah mikroskop dan digambar. Proses pembuatan preparat
ulas kapang yaitu kawat ose dipijarkan di atas api bunsen, setelah itu ambil koloni khamir pada
agar miring PDA (Potatoes Dextrose Agar) secara hati – hati, lalu taruh koloni kapang tersebut
di atas objek glass. Penempatan koloni kapang tersebut tidak boleh terlalu tebal karena untuk
memudahkan pengamatan. Setelah itu tambahkan metilen biru 1 tetes dengan pipet tetes pada
koloni kapang tersebut dan didimakan selama 1 menit, lalu difiksasi dimana fungsi fiksasi yaitu
melekatkan mikroba pada obyek glass, memperjelas pengamatan dibawah mikroskop, dan
membunuh mikroba. Setelah itu diamati di bawah mikroskop dan digambar. Proses pembuatan
preparat ulas khamir yaitu kawat ose dipijarkan di atas api bunsen, setelah itu ambil koloni
khamir pada agar miring PDA (Potatoes Dextrose Agar) secara hati – hati, lalu taruh koloni
khamir tersebut di atas objek glass. Penempatan koloni khamir tersebut tidak boleh terlalu tebal
karena untuk memudahkan pengamatan. Setelah itu tambahkan metilen biru 1 tetes dengan
pipet tetes pada koloni khamir tersebut dan didimakan selama 1 menit, lalu difiksasi. Setelah itu
diamati di bawah mikroskop dan digambar.
(http://masrurenstein.blogspot.com/2009/05/mikrobiologi-umum.html)(23/10/2009).
Mikroorganisme yang ada dialam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas,
begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air,
dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel
bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan.
Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding
sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Dwidjoseputro, 1994; Assani, 1994).
Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop,
memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri
seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada
bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Volk
& Wheeler, 1993).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna.
Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini
berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan
memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan
bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna
terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat
pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue,
safranin, netral red, dan lain-lain. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat
bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah
bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor
seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna
penutup (http://blogkita.info/my-kampuz/my-kuliah/mikrobiologi/pembuatan-preparat-
pengecatannya/)(23/10/2009)
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat
dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat
diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja.
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena
sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan
untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan
positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna ,
substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang
sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna
terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri
seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu
spesies (Dwidjoseputro, 1994).
Kebanyakan bakteri dapat diwarnai dengan pengecatan sederhana atau pengecatan gram,
tetapi beberapa genus anggota dari genus Mycobakterium, bersifat resisten dan hanya dapat
dilihat dengan metode tahan asam. Karena M. taberculosis dan M. leprae bakteri yang
patogenik bagi manusia, maka pengecatan itu bernilai diagnosa dalam mengidentifikasi
mikroorganisme tersebut. Perbedaan sifat antara mycobacterium dengan mikroorganisme
lainnya adalah dengan adanya suatu dinding tebal yang berlilin (lipoidal) yang menyebabkan
penetrasi oleh zat warna menjadi sulit. Akan tetapi, apabila zat warna sudah dapat masuk, zat
warna terssebut jadi tidak mudah dibuang meskipun dengan penggunaan asam alcohol yang
kuat sebagai zat pelarutnya. Dengan sifat yang demikian, mikroorganisme yang demikian
disebut mikroorganisme tahan-asam dan mokroorganisme lainnya yaitu yang mudah dilarutkan
dengan asam alcohol disebut mikroorganisme tidak tahan asam. Metode ini mengunakan tiga
macam zat kimia yang berbeda. 1) zat warna primer, yaitu karbon Fuchin, 2) zat peluntur
warna, 3) counterstain, yaitu metilen biru (Subandu, 2009).
Teknik pewarnaan Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan.
Disebut demikian karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme.
Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya
bersifat basofil (suka akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana
umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat positif). Pewarnaan sederhana ini
memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, vibrio,
basillus, dsb) dari bahan-bahan lainnya yang ada pasa olesan yang diwarnai (Hadiotomo,
1990).
Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar
belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan
(tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada
pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-
bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga
penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau
tinta cina (http://firebiology07.wordpress.com/2009/04/19/teknik-pewarnaan-mikroorganisme/)
(23/10/2009)

PEMBUATAN PREPARAT BAKTERI, PEWARNAAN TUNGGAL DAN

PEWARNAAN MAJEMUK
PEMBUATAN PREPARAT BAKTERI, PEWARNAAN TUNGGAL
DAN
PEWARNAAN MAJEMUK

Tujuan : Mampu mempersiapkan sediaan/film bakteri secara benar.

: Mampu melakukan pewarnaan bakteri dengan zat satu macam warna.
: Mampu melakukan pewarnaan bakteri dengan zat banyak macam warna.
: Mengamati dan menggambar bakteri yang telah diwarnai

A. PENDAHULUAN
Ilmu yang mempelajari bentuk, sifat, kehidupan, penyebaran dan manfaat jasad hidup termasuk
mikroba yang lebih lazim disebut dengan mikrobiologi yang di dalamnya mencakup satu
kelompok besar jasad hidup yang mempunyai bentuk dan ukuran sangat kecil, serta sifat hidup
yang berbeda dengan jasad lain umumnya. Seperti bakteri yang memiliki salah satu sifat penting
adalah kemampuan beberapa jenis bakteri untuk memproduksi struktur internal yaitu
endospora. Endospora ini umumnya terbentuk secara tunggal dalam sel guna menanggulangi
keadaan lingkungan yang kurang baik. Spora yang sudah masak dilepas oleh sel ke alam
sekitarnya. Spora-spora ini dapat dilihat di bawah mikroskop fase kontras dan tampak sebagai
bagian yang bercahaya terang baik di dalam atau di luar sel. Spora-spora ini tahan terhadap
keadaan fisik atau kimia yang ekstrim seperti suhu, kekeringan, dan bahan-bahan kimia
pembasmi kuman dan dapat bertahan dalam keadaan tidur untuk beberapa tahun. Pada saat
kondisi memungkinkan, spora-spora tersebut tumbuh menjadi sel-sel vegetatif yang normal.
Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi bakteri, fungi, dan khamir dengan
menggunakan metode gores, metode tuang, metode sebar, metode pengenceran serta
micromanipulator. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah tekhnik cawan tuang
dan cawan gores. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan
organisme sedemikian rupa sehingga individu spesies individu spesies dapat dipisahkan dari
lainnya.
Pemahaman mengenai teknik dasar dalam praktikum mikrobiologi, seperti pengenalan ose serta
cara menggunakannya, dan teknik plating sehingga seorang praktikan dapat melakukan
praktikum mikrobiologi yang sesuai dengan kaidah serta ketentuan yang berlaku merupakan hal
yang terpenting. Berbagai jenis ose yang dikenal serta penggunaannya disesuaikan dengan
mikroorganisme yang akan diteliti, baik dalam hal pemindahan maupun pemilihan dari suatu
koloni. Teknik plating dan ose merupakan satu kesatuan sehingga keduanya memiliki keterkaitan
satu sama lainnya (karena teknik plating dilakukan dengan menggunakan ose). (Hadioetomo,
1993).
Dalam pembuatan preparat native alat dan bahan yang digunakan yaitu mikroskop, objek glass,
cover glas, kawat ose, bunsen, pipet tetes, koloni mikroba agar miring ( bakteri, kapang, dan
khamir ), alkohol 95% dan aquades. Proses pembuatan preparat native bakteri yaitu kawat ose
dipijarkan di atas api bunsen, setelah itu ambil koloni bakteri pada agar miring PCA ( Plate Count
Agar ) secara hati – hati, lalu taruh koloni bakteri tersebut di atas objek glass. Penempatan
koloni bakteri tersebut tidak boleh terlalu tebal karena untuk memudahkan pengamatan. Setelah
itu tambahkan aquades 1 tetes dengan pipet tetes pada koloni bakteri tersebut lalu ditutup
dengan cover glass, lalu diamati di bawah mikroskop dan digambar. proses pembuatan preparat
native kapang sistemnya sama yaitu kawat ose dipijarkan di atas api bunsen, setelah itu ambil
koloni kapang pada agar miring PDA ( Potatoes Dextrose Agar ) secara hati – hati, lalu taruh
koloni kapang tersebut di atas objek glass. Penempatan koloni kapang tersebut tidak boleh
terlalu tebal karena untuk memudahkan pengamatan. Setelah itu tambahkan aquades 1 tetes
dengan pipet tetes pada koloni kapang tersebut lalu ditutup dengan cover glass, lalu diamati di
bawah mikroskop dan digambar. (http://masrurenstein.blogspot.com/2009/05/mikrobiologi-
umum.html)(23/10/2009).
Dalam pembuatan preparat ulas alat dan bahan yang digunakan yaitu mikroskop, objek glass,
kawat ose, bunsen, pipet tetes, koloni mikroba agar miring ( bakteri, kapang, dan khamir ),
alkohol 95% dan metilen biru. Proses pembuatan preparat ulas bakteri yaitu kawat ose
dipijarkan di atas api bunsen, setelah itu ambil koloni bakteri pada agar miring PCA ( Plate Count
Agar ) secara hati – hati, lalu taruh koloni bakteri tersebut di atas objek glass. Penempatan
koloni bakteri tersebut tidak boleh terlalu tebal karena untuk memudahkan pengamatan. Setelah
itu tambahkan metilen biru 1 tetes dengan pipet tetes pada koloni bakteri tersebut dan
didimakan selama 1 menit, lalu difiksasi dimana fungsi fiksasi yaitu melekatkan mikroba pada
obyek glass, memperjelas pengamatan dibawah mikroskop, dan membunuh mikroba. Setelah itu
diamati di bawah mikroskop dan digambar. Proses pembuatan preparat ulas kapang yaitu kawat
ose dipijarkan di atas api bunsen, setelah itu ambil koloni khamir pada agar miring PDA
(Potatoes Dextrose Agar) secara hati – hati, lalu taruh koloni kapang tersebut di atas objek
glass. Penempatan koloni kapang tersebut tidak boleh terlalu tebal karena untuk memudahkan
pengamatan. Setelah itu tambahkan metilen biru 1 tetes dengan pipet tetes pada koloni kapang
tersebut dan didimakan selama 1 menit, lalu difiksasi dimana fungsi fiksasi yaitu melekatkan
mikroba pada obyek glass, memperjelas pengamatan dibawah mikroskop, dan membunuh
mikroba. Setelah itu diamati di bawah mikroskop dan digambar. Proses pembuatan preparat ulas
khamir yaitu kawat ose dipijarkan di atas api bunsen, setelah itu ambil koloni khamir pada agar
miring PDA (Potatoes Dextrose Agar) secara hati – hati, lalu taruh koloni khamir tersebut di atas
objek glass. Penempatan koloni khamir tersebut tidak boleh terlalu tebal karena untuk
memudahkan pengamatan. Setelah itu tambahkan metilen biru 1 tetes dengan pipet tetes pada
koloni khamir tersebut dan didimakan selama 1 menit, lalu difiksasi. Setelah itu diamati di bawah
mikroskop dan digambar.
(http://masrurenstein.blogspot.com/2009/05/mikrobiologi-umum.html)(23/10/2009).
Mikroorganisme yang ada dialam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas,
begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air,
dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel
bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan.
Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding
sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Dwidjoseputro, 1989)
Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop,
memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri
seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada
bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Volk
& Wheeler, 1993).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam
terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna
untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna
berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna
dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif
dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka
disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan
lain-lain. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan
bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel.
Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat,
intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (http://blogkita.info/my-
kampuz/my-kuliah/mikrobiologi/pembuatan-preparat-pengecatannya/) (23/10/2009)
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan
dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam
mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri
mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik
(suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana
umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang
mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi
pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat
warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya
terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan
bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro,
1989).
Kebanyakan bakteri dapat diwarnai dengan pengecatan sederhana atau pengecatan gram, tetapi
beberapa genus anggota dari genus Mycobakterium, bersifat resisten dan hanya dapat dilihat
dengan metode tahan asam. Karena M. taberculosis dan M. leprae bakteri yang patogenik bagi
manusia, maka pengecatan itu bernilai diagnosa dalam mengidentifikasi mikroorganisme
tersebut. Perbedaan sifat antara mycobacterium dengan mikroorganisme lainnya adalah dengan
adanya suatu dinding tebal yang berlilin (lipoidal) yang menyebabkan penetrasi oleh zat warna
menjadi sulit. Akan tetapi, apabila zat warna sudah dapat masuk, zat warna terssebut jadi tidak
mudah dibuang meskipun dengan penggunaan asam alcohol yang kuat sebagai zat pelarutnya.
Dengan sifat yang demikian, mikroorganisme yang demikian disebut mikroorganisme tahan-
asam dan mokroorganisme lainnya yaitu yang mudah dilarutkan dengan asam alcohol disebut
mikroorganisme tidak tahan asam. Metode ini mengunakan tiga macam zat kimia yang berbeda.
1) zat warna primer, yaitu karbon Fuchin, 2) zat peluntur warna, 3) counterstain, yaitu metilen
biru (Subandi, 2009).
Teknik pewarnaan Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan.
Disebut demikian karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme.
Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya
bersifat basofil (suka akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana
umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat positif). Pewarnaan sederhana ini
memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, vibrio,
basillus, dsb) dari bahan-bahan lainnya yang ada pasa olesan yang diwarnai (Hadiotomo, 1990).
Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya
menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus
pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini
olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia,
maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat
diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina
(http://firebiology07.wordpress.com/2009/04/19/teknik-pewarnaan-mikroorganisme/)
(23/10/2009)

B. ALAT DAN BAHAN

1. Pembuatan Preparat Bakteri

No Alat No Bahan
1 Mikroskop 1 Fuchsin
2 Kaca objek 2 Metylen blue
3 Jarum ose 3 Alkohol 75%
4 Bunsen
5 Baki
6 Tisu
2. Pewarnaan Tungga
No Alat No Bahan
1 Mikroskop 1 Preparat bakteri Bacillus dan Sarcina
2 Kaca objek 2 Fuchsin
3 Jarum ose 3 Gentian violet
4 Pipet tetes 4 Methylene blue
5 Aquades
6 Alcohol
7 Kertas hisap

3. Pewarnaan Majemuk
No Alat No Bahan
1 Mikroskop 1 Preparat bakteri Bacillus dan Sarcina
2 Kaca objek 2 Fuchsin / safranin
3 Jarum ose 3 Gentian violet
4 Pipet tetes 4 Methylene blue
5 Aquades
6 Alkohol
7 Kertas hisap
8 Larutan lugol
9 Minyak imersi
C. CARA KERJA
1. Pembuatan Preparat Bakteri Dan Pewarnaan Tunggal
Bersihka atau sterilkan objek glas pakai alkohol

Nyalakan Bunsen dan pijarkan jarum ose

Ambil kultur bakteri sedikit saja

Gesekan pada objek glas

Kalau menggumpal tetesi dengan air dan hisap pake kertas hisap

Fiksasi (dibilas dengan api 3x)

Diamkan sampai kering

Beri pewarnaan (fuchsin atau metylene blue) 20 detik

Bilas dengan air untuk menghilangkan zat warna yang lebih

Amati di mikroskop

2. Pembuatan Pewarnaan Majemuk

1. Preparat bakteri tetesi dengan Gentian violet (30 detik)

Bilas aquades

2. Larutan lugol (30 detik)

Bilas aquades
Alkohol 95 % (15 detik)
3. Safranin / Fuchsin (30 detik)

Bilas aquades
Keterangan : Gram (+) Ungu, Gram (-) Merah

D. HASIL PENGAMATAN
a. Pembuatan Preparat Bakteri

Objek Gelas Bacillus Subtillis

Methylene blue
b. Pewarnaan Tunggal
Bakteri Basilus Subtilis
Gambar Pengamata di bawah Mikroskop Gambar Sumber Literatur

(http://www.microbelibrary.org/microbelibrary/files/ccImages/Articleimages/Chamberlain/Bacillu
s%20subtilis%20spores%20fig1.jpg) (26/11/2009)

c. Pewarnaan Majemuk
Bakteri Basilus Subtilis
Gambar Pengamata di bawah Mikroskop Gambar Sumber Literatur

(http://www.surrey.ac.uk/SBMS/ACADEMICS_homepage/mcfadden_johnjoe/img/bacillus_anthra
cis_spore_forming.jpg) (26/11/2009)

E. PEMBAHASAN
Membuat preparat bakteri
Pada praktikum ini kita membuat preparat bakteri, sebelum membuat preparat bakteri usahakan
semua alat dan media yang digunakan tersebut harus steril. Sebelum memindahkan bakteri ke
kaca objek kita harus memijarkan dulu jarum ose dan tabung reaksi bakteri, setelah itu ambil
sedikit saja bakteri dari biakan induk bakteri lalu gesekan pada kaca objek secara hati- hati.
Kalau bakteri terlalu tebal tetesi dengan air, dan sebarkan secara merata.
Ose (lup inokulasi) merupakan alat dasar dalam praktikum mikrobiologi yang terbuat dari bahan
tertentu seperti kawat platina, namun yang lebih umum digunakan di laboratorium pengajaran
dan lebih murah harganya ialah kawat nikrom (nichrome) dengan diameter lingkaran pada ujung
lup berkisar antara 2 sampai 4 mm (Hadioetomo, 1993).
Sel bakteri berukuran sangat kecil dan tebal lapisan air tipis diantara cover glass dan object
glass masih bisa menampung beberapa bakteri bacillus yang ditumpuk vertikal, artinya tebal
tersebut masih bisa digunakan sel untuk berenang ke atas dan ke bawah. Jangan menganggap
gambar yang terlihat pada mikroskop adalah gambar datar. Kontrol sangatlah penting, meskipun
kita sulit untuk mendapatkannya. Akan tetapi lebih baik jika bakteri yang dilihat dapat
dibandingkan dengan bakteri lain yang telah diketahui bentuknya dengan pasti (http://ekmon-
saurus.blogspot.com/2008/09/kunci-awal-identifikasi-bakteri.html) (23/10/2009)
Teknik yang digunakan dalam pembuatan preparat ada berbagai macam tergantung pada
spesimen dan penelitian yang dibutuhkan, antara lain :
1. Kriofiksasi yaitu suatu metode persiapan dengan menggunakan teknik pembekuan spesimen
dengan cepat yang menggunakan nitrogen cair ataupun helium cair, dimana air yang ada akan
membentuk kristal-kristal yang menyerupai kaca. Suatu bidang ilmu yang disebut mikroskopi
cryo-elektron (cryo-electron microscopy) telah dikembangkan berdasarkan tehnik ini. Dengan
pengembangan dari Mikroskopi cryo-elektron dari potongan menyerupai kaca (vitreous) atau
disebut cryo-electron microscopy of vitreous sections (CEMOVIS), maka sekarang telah
dimungkinkan untuk melakukan penelitian secara virtual terhadap specimen biologi dalam
keadaan aslinya.
2. Fiksasi yaitu suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik
(seperti kenyataannya ) dengan menggunakan glutaraldehid dan osmium tetroksida.
3. Dehidrasi yaitu suatu metode persiapan dengan cara menggantikan air dengan bahan pelarut
organik seperti misalnya ethanol atau aceton.
4. Penanaman (Embedding) yaitu suatu metode persiapan dengan cara menginfiltrasi jaringan
dengan resin seperti misalnya araldit atau epoksi untuk pemisahan bagian
(http://id.wikipedia.org/wiki/Mikroskop_elektron#Teknik_pembuatan_preparat_yang_digunakan
_pada_mikroskop_elektron) (23/11/2009).
Bacillus adalah contoh-contoh organisme yang mempunyai kapasitas untuk pertahanan, salah
satunya adalah sel vegetatif yang aktif secara metabolik, tipe-tipe sel inaktif secara metabolik
disebut spora. Kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan untuk keberlangsungan aktivitas
sel vegetatif, biasanya pada saat kurangnya sumber nutrisi karbon, sel ini mempunyai kapasitas
untuk mengalami sporogenesis dan memberikan reaksi untuk pembentukan struktur intraseluler
baru (endospora) yang dilindungi oleh lapisan yang tidak dapat ditembus air (tahan penetrasi)
dikenal sebagai jaket spora (spore coats) (Cappuccino & Sherman, 1983).

Klasifikasi :

Bacillus subtilis
Kingdom : Bacteria
Phylum : Firmicutes
Class : Bacilli
Order : Bacillales
Family : Bacillaceae
Genus : Bacillus
Species : Bacillus subtilis

Sarcina Basil
Kingdom : Bacteria
Filum : Firmicutes
Kelas : Bacilli
Ordo : Lactobacilales
Family : Sarcinacaceae
Genus : Sarcina
Spesies : Sarcina basil

(http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis) (15/11/2009)

Membuat pewarnaan tunggal dan pewarnaan majemuk

Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri denagn mikroskop,
memperjelas bentuk dan ukuran bakteri seperti dinding sel dan vakuol, menghasilkan sifat- sifat
fisik dan kimia yang khas dari pada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras
mikroorganisme dengan sekitarnya.
Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu : fiksasi, peluntur warna,
substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pewaranaan gram
pertama kali mulai dikembangkan pada tahun 1884 oleh ahli histology yaitu Cristian gram
(Capucino dan Sherman.1983)
Pengecatan Gram
Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium
mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik
mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu
(pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Pemeriksaan ini dapat dilakukan
dengan cepat dan biaya murah serta, dalam kasus tertentu, dapat membantu dokter untuk
memulai terapi suatu penyakit tanpa menunggu hasil kultur. Metode pengecatan tersebut
pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode pengecatan
Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif
berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut
ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa
dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp
(Dwidjoseputro, 1994).
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan
fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark
Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. (http: www.wikipedia.
Pewarnaan gram. Com) (23/11/09).
Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan
identifikasi data apakah gram positif atau gram negatif sehingga diperlukan adanya praktikum ini
dilakukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaan gram.
Pewarnaan bakteri dilakukan pada isolat staphylococcus aereus adalah gram positif yang
berbentuk kokus atau lingkaran sterik dengan diameter sel mencapai 1µm, koloninya berbentuk
seperti buah anggur (Textbook, 2008). Pada bacillus subtilis, koloninya bergerombol sedikit
erpisah-pisah bahkan membentuk rantai panjang (hasil pengamatan). Pada Eschericia coli,
koloninya tersusun rantai memanjang. Pada bakteri ini tidak ditemukan endospora, pada saat
diwarnai menunujukkan warna merah.
(http://qi206.wordpress.com/2008/10/17/mikroumpewarnaan-gram/) (23/11/2009).
F. DAFTAR PUSTAKA

Capuccino. J.G & Natalie S. 1983. Microbiologi A laboratory manual Addison- Dwidjoseputro, D.,
1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Malang.
Hadiotomo, Ratna Siri., 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia: Jakarta.
Volk, Wesley A dan Margareth F. Wheeler., 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Wesky- Publishing
Company. New york
Subandi. 2009. Dasar-dasar Mikrobiologi.Gunung Djati Press : Bandung.
Erlangga: Jakarta.
(http://masrurenstein.blogspot.com/2009/05/mikrobiologi-umum.html) (23/10/2009).
(http://blogkita.info/my-kampuz/my-kuliah/mikrobiologi/pembuatan-preparat-pengecatannya/)
(23/10/2009)
(http://firebiology07.wordpress.com/2009/04/19/teknik-pewarnaan-mikroorganisme/)
(23/10/2009)
(http: www.wikipedia. Pewarnaan gram. Com) (23/11/09).
(http://qi206.wordpress.com/2008/10/17/mikroumpewarnaan-gram/) (23/11/2009).
(http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis) (15/11/2009)
(http://id.wikipedia.org/wiki/Mikroskop_elektron#Teknik_pembuatan_preparat_
http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/09/kunci-awal-identifikasi-bakteri.html) (23/10/2009)