P. 1
laporan praktikum RFLP

laporan praktikum RFLP

|Views: 784|Likes:
Published by Jenry Reyes Trispa

More info:

Published by: Jenry Reyes Trispa on Jul 03, 2011
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOCX, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

05/15/2015

pdf

text

original

RFLP (Reaction Fragment Length Polymorphism

)

I.

Tujuan Melakukan analisis DNA dengan metode RFLP untuk menemukan DNA yang sama dengan bukti DNA di CS sampel DNA beberapa terangka.

II. 2.1.

Dasar Teori DNA, Informasi Genetik dan Polymorphism Informasi genetik suatu sel hidup tersimpan di dalam makromolekul biologis asam nukleat, terutama dalam bentuk asam deoksiribonukleat (DNA- Deoxyribonukleat Acid). Kode yang menyimpan informasi genetik disimpan dalam bentuk sekuens basa nitrogen yang bervariasi pada setiap nukleotida. DNA dan RNa adalah dua jenis asam nukleat yang ada pada setiap makhluk hidup. [erbedaan anatara DNA dan RNA adalah pada gula intinya. DNA menggunakan gula deoksiribosa sebagai inti nukleotida sementara RNA menggunakan gula ribosa. DNA ;ebih nerperan sebagai penyimpan informasi genetik sementara RNA berperan dalam penerjemah materi genetik tersebut menjadi suatu sifat genetik. 1,2 DNA adalah makromolekul herediter pembawa informasi genetik. DNA merupakan polimer asama nukleat yang memiliki monomer nukleotida. Nukleotida terdiri dari gula dengan atom karbon 5, deoksiribosa, dengan fosfat teresterifikasi pada atom karbon 5¶ dan basa nitrogen pada pada atom karbon 1¶. Dua tipe basa nitrogen yang tersedia adalah purin, basa nitrogen dengan dua cincin, yang terdiri dari Adenin dan Guanin, dan pirimidin, basa nitrogen dengan cincin tunggal, yang anggotanya adalah Timin dan

2 Variasi susunan sekuens basa nitrogen akan membentuk kode informasi genetik pada tiap sel hidup.1. Istilah polimorfisme biasanya digunakan untuk varian genetik yang dimiliki oleh setidaknya satu persen dari populasi. Molekul DNA terdiri dari dua untai tunggal yang berikatan dengan ikatan hydrogen anatara basa nitrogen membentuk struktur double helix antiparalel dimana orientasi anatara kedua untai berjalan kea rah yang berbeda. sebuah gen terdiri dari kodon-kodon. Sifat tersebut muncul dari protein yang terkode oleh setiap gen. Penyebab utama dari polimorfisme genetik adalah akumulasi mutasi titik yang selektif dimana mutan. Nukleotida berikatan kovalen dengan nukleotida lain membentuk polimer linier berbentuk untai yang terhubung dengan ikatan 3¶-5¶ fosfodiester antara gugus fosfat pada C5¶ satu nuukleotida dengan gugus OH pada C3¶ milik nukleotida lainnya.Sitosin. Basa nitrogen Timin selalu berikatan dengan Adenin dengan 2 ikatan hydrogen sementara Guanin selalu berikatan dengan Citosin dengan 3 ikatan hydrogen. Sekuens asam nukleat sangatlah bervariasi antar makhluk hidup yang berbeda. Untai yang satu tersusun dengan orientasi 5¶-3¶ sememntara yang lainnya berorientasi 3¶-5¶. bahkan di dalam satu spesies. individu hasil mutasi. dapat bertahan hidup dan mewariskan materi genetik muatannya kepada . Satu sifat genetik dikodekan di satu bagian khusus pada DNA yang memiliki sekuens nukleotida yang khusus dengan panjang tertentu. Ikatan hydrogen yang terbentuk dari basa nitrogennya terjadi secara eksklusif. Dimana tiap kodon mengkode suatu asam amino. yaitu triplet sekuens basa nitrogen. Variasi antar individu yang berbeda ini dinamakan polimorfisme genetik. Variasi antar kodon akan menyebabkan variasi antar asam amino yang menyusun setiap protein sehingga susunan asam amino tersebut akan memberikan karakteristik unik untuk protein yang dihasilkan.

Perbedaan panjang fragmen akan terlihat setelah dilakukan elektroforesis gel. diantaranya pemeriksaan forensic. Individu dengan DNA yang berbeda akan menghasilkan pola yang berbeda. terutama yang berhubungan dengan analisis DNA. diagnosis penyakit dan tes paternitas.2.2.keturunannya. Hasil dari RFLP adalah profil pita-pita berdasarkan panjang fragmen.3. asal dan evolusi suatu spesies. Teknik RFLP didasarkan pada aktivitas suatu enzim restriksi yang memotong DNA menjadi fragmen-fragmen spesifik.1.2.3 2. hubungan kekerabatan.4 .4 Aplikasi terbaik RFLP digunakan untuk berbagai macam kegunaan. Polimorfisme pada manusia dapat berupa variasi antar individu dengan perbedaan satu nukleotida (SNP-Single Nucleotida Polymorphisme) maupun variasi pada sekuens nukleotida yang lebih banyak. Perbedaan sekuens DNA antar individu akan mempengaruhi titik potong restriksi endonuklease sehingga fragmen yang terpotong akan memiliki panjang yang bervariasi. 1. hibridisasi dan visualisasi. isolasi gen khusus dan konstruksi perpustakaan DNA. RFLP digunakan sebagai metode untuk mencocokkan bukti DNA CS dengan sampel DNA tersangka sehingga dapat diketahui siapa pelaku kejahatan dari beberapa orang pelaku tersangka. RFLP Salah satu teknik pertama yang digunakan secara luas untuk mendeteksi variasi dan polimorfisme pada sekuens DNA adalah teknik Restriction Fragmen Length Polymorphism (RFLP). identifikasi korban. genetik drift. Beberapa contoh aplikasi RFLP adalah untuk mendeteksi diversitas genetik. Polimorfisme antar individu adalah subjek analisis dan pemeriksaan DNA dimana perbedaan sekuens DNA antar individu bisa digunakan untuk berbagai keperluan.1. sejarah domestikasi. genom mapping. Dalam proses RFLP yang akan dilakukan.

Hibridisasi DNA. Isolasi DNA.2. Transfer DNA dengan southern blotting. 2. Sel sampel DNA kemudian diproses dengan diterjen untuk melakukan lisis membrane sel dan inti sel. b. 3. . 2. DNA akan mengendap dan terpisah dari senyawa lain.4 RFLP memerlukan DNA yang murni dan bebas dari kontaminan dengan berat molekul yang tinggi. 2. termasuk debris sel dengan sentrifugasi. DNA patah-patah selama proses isolasi. lalu pemisahan DNA dari komponen sel lain.1. 4. Hal yang dapat mengganggu kemurnian DNA hasil isolasi adalah : 4 a. Selain DNA.3. Setelah ektraksi DNA dilakukan presipitasi DNA dengan isopropanol 100%.3 Langkah-langkah RFLP Langkah-langkah untuk melakukan analisis RFLP di laboratorium adalah4 : 1. Isolasi DNA Langkah pertama dalam melakukan analisis variasi individual dalam gen (fragmen DNA) adalah isolasi gen yang mengandung urutan sekuens nukleotida yang bervariasi untuk memperoleh jumlah DNA yang adekuat untuk penelitian. 3 Isolasi DNA dilakukan dengan megambil sampel sel berinti yang memiliki DNA dari organism. Pemotongan dengan enzim retriksi (digesti retriksi) dan elektroforesis gel. DNA terdegradasi oleh enzim nuclease. bahan lain akan larut di dalam alkohol tersebut sehingga saat dilakukan sentrifugasi.

2. Hasil potongan DNA dapat berupa untai tumpul/blunt (ujung fragmen untai ganda) maupun lengket/sticky ( ujung fragmen untai tunggal).2. DNA murni hasil isolasi kemudian akan dipotong dengan enzim restriksi endonuklease membentuk potongan DNA spesifik. Variasi panjang fragmen inilah yang menjadi dasar analisis RFLP. Terjadi kontaminasi oleh polisakarida.3 . Adanya mutasi tertentu pada lokasi pemotongan akan menyebabkan DNA tidak terpotong seperti biasa dan terbentuk fragmen DNA yang lebih panjang. d. enzim restriksi akan mengenali sekuens pendek yang spesifik dan khusus sepanjang 4-7 basa.c. Enzim restriksi tersebut memotong DNA dalam sekuens di dalam molekul (bukan di ujung molekul seperti enzim eksonuklease) dengan sekuens DNA yang spesifik.5 Enzim restriksi endonuklease ini ditemukan pada berbagai jenis bacteria dan bertindaj sebagai mekanisme pertahanan bakteri dari molekul DNA asing.2. 1. misalnya enzim ecoRI berasal dari E.3. 1.Coli. Pemotongan fragmen DNA dengan enzim restriksi (digesti restriksi). Enzim ini hanya memotong DNA pada sekuens yang khusus tidak seperti metode lain yang meotong DNA secara random. Fragmen sticky lebih berguna dan mudah digunakan untuk proses ligase pada rekombinan DNA. Enzim tersebut dinamakan berdasarkan nama bakteri yang memilikinya. Sifat utama enzim ini adalah spesifitasnya dimana enzim yang sama akan selalu memutuskan DNA pada urutan tertentu. Metabolit sekunder ikut terisolasi.

Gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang memiliki perbedaan ukuran lebih besar. akan terbentuk potongan fragmen DNA dalam berbagai ukuran. Fragmen restriksi biasanya diidentifikasi lebih lanjut dengan hibridisasi dan visualisasi dengan probe. Gel elktroforesis akan memisahkan molekul berdasarkan ukuran dengan menggunakan medan listrik. Pola tersebut dapat dilihat dengan berbagai teknik. Gel yang digunakan tergantung dari utjuan dan aplikasinya. mengacu kepada nama penemu teknik tersebut yaitu E. Southern (1975).3 Gel elektroforesis Setelah dilakukan pemotongan sampel DNA oleh enzim restriksi. semakin jauh fragmen tersebut berjalan menginfiltrasi gel. misalnya dengan pewarnaan etidium bromide akan menghasilkan flurosensi jingga di bawah sinar UV.M. 2. Transfer DNA disebut ³Southern Blotting´. Semakin pendek fragmen DNA. Gel poliakrilamid dapat memisahkan molekul DNA dengan perbedaan panjang satu nukleotida saja. digunakan untuk DNA sequencing.7 .2. Perbedaan kecil antara fragmen restriksi tersebut dapat dideteksi dan dipisahkan dengan melakukan elektroforesis gel.6 Hasil elektroforesis gel akan memberikan pita-pita yang membentuk pola khusus untuk setiap individu. DNA memiliki gugus fosfat yang bermuatan negative sehingga molekul DNA akan berjalan kea rah elektroda positif pada elektroforesis.3. 3.3.4 Transfer DNA Southern Blotting Proses hibridisasi dan visualisasi diawali dengan transfer DNA dari sel agarosa ke nilon berpori atau membrane nitroselulosa.

b. Lima teknik laboratorium yang digunakan anatara lain7 : a. memindahkan DNA ke kertas tersebut serta mendenaturasinya dalam proses tersebut. dan probe ini dilekatkan ke fragmen restriksi yang mengandung urutan komplementer dengan cara berpasangan basa. Probe ini merupakan DNA untai tunggal yang komplementer terhadap urutan DNA yang diinginkan. Hibridisasi dengan probe radioaktif Blot kertas dipaparkan pada larutan yang mengandung probe berlabel radioaktif. Elektroforesis Campuran fragmen restriksi dari setiap sampel dipisahkan dengan elektroforesis. e. Autodiografi . Blotting Aksi kapiler menarik larutan alkali ke atas melewati gel dan melewati selembar kertas nitroselulosa yang diletakkan di atasnya. kemudian enzim restriksi ditambahkan untuk menghasilkan fragmen restriksi. Untai tunggal DNA melekat pada kertas yang ditempatkan dalam pita tepat seperti pada gel. dan memungkinkan para peneliti untuk dapat mendeteksi dan menganalisis urutan DNA tertentu. d. Setiap sampel membentuk suatu pola pita yang khas.Prosedur metode ini mengkombinasi lima teknik laboratorium. Penyiapan fragmen restriksi Sampel DAN yang akan diuji dipersiapkan dari sumber yang tepat. c.

Radioaktivitas pada probe yang terikat mempaar film untuk membentuk bayangan yang sesuai dengan pita DNA yang spesifik-pita yang mengadung DNA yang berpasangan basa dengan probe itu.3 Mutasi dan perbedaan genotip akan menghasilkan sisi pengenalan enzim yang berbeda pada suatu sekuens DNA. film sinar-X tersebut akan terpajan oleh electron hasil disintegrasi atom radioaktif tepat di atas probe sehingga membentuk pola sesuai pita DNA yang ada. Proses hibridisasi akan menyatukan kembali (Reannealing) probe dengan DNA untai tunggal pada nitroselulosa. .3.Selembar film fotografik diletakkan di atas kertas. Hasil dari teknik RFLP adalah pola pita DNA yang dideteksi dengan ada tidaknya fragmen DNA dengan panjang tertentu. 2. Probe dapat juga dilabeli dengan senyawa kimia tambahan misalnya fluorofhores yang dapat dideteksi dengan fluorosens. Dibuat autodiogram dengan membungkus bahan yang mengandung probe hybrid dengan kertas sinar-X.5.6 Probe pada umumnya berasal dari cDNA (dari hasil reverse transcriptase ke RNA). Tidak semua probe berikatan dengan label radioaktif. fragmen DNA genom (diputuskan dari genom oleh enzim restriksi). Biasanya probe membawa label radioaktif misalnya 35 P. Probe adalah DNA untai tunggal yang komplementer terhadap DNA pada nitroselulosa.2. Hibridisasi dan Visualisasi DNA yang telah ditransfer ke lembar nitroselulosa akan dihibridisasi dengan probe.2.3. oligonukleotida sintetik atau kadang RNA. probe dapat dideteksi dengan autodiografi.

tidak diperlukan informasi sekuens DNA target. spesies. Metodologi . 2. Kekurangan RFLP adalah dibutuhkannya DNA dengan kemurnian tinggi dalam jumlah banyak.4. RFLP merupakan teknik yang sederhana apabila probe tersedia. tidak mungkin dilakukan automatisasi. dan area target berdasarkan homologi sekuens sehingga direkomendasikan untuk analisis filogenik anatar spesies ujung berkerabat. RFLP bersifat kodominan sehingga dapat mendeteksi heterozigositas. mendeteksi lokus yang sedikit. RFLP cocok digunakan untuk pembuatan peta linkage. serta membutuhkan waktu dan tenaga yang banyak 3. Kelebihan dan kekurangan RFLP RFLP merupakan metode yang mempunyai akurasi yang tinggi dan mudah ditransfer antar laboratorium. dan mempunyai kemampuan pemisahan yang tinggi baik pada tingkat populasi. atau individual.Perbedaan antar genotip dari individu berbeda akan divisualisasikan sebagai pola fragmen restriksi yang berbeda. sulit digunakan pada beberapa spesies dengan tingkat polimorfisme rendah. merupakan marker lokus yang spesifik. memerlukan perpustakaan probe yang sesuai.

orange.Digesti Retriksi 3. 2-20 L sebanyak 1 buah  Tabung tes mikro yang telah diwarnai (hijau. 2-200 L sebanyak 15 tip  Mikro pipet. casting tray.1 Alat dan Bahan a. 8-well comb) 1 buah. Bahan . red. biru. Alat  Sistem eletrokforesis sel agarosa (electrophoresis chamber.  Pipet tips. violet. yellow masingmasing 1 buah)  Permanent marker 1 buah  Tempat sampah 1 buah  Busa mikro test tube holder 1 buah  Laboratory tape  Inkubator atau 37o waterbath (optional)  Mikrosentrifuge b.

DNA tersangka 4. Dengan menggunakan tip yang baru. dan DNA tersangka 5. DNA tersangka 2. 3. Beri label pada tabung reaksi dengan ketentuan : Tabung hijau :pelaku (CS) Tabung biru Tabung orange :tersangka 1 (S1) :tersangka 2 (S2) Tabung violet :tersangka 3 (S3) Tabung merah :tersangka 4 (S4) Tabung kuning :tersangka 5 (S5) Simpan tabung-tabung tersebut ke busa penyimpanan tabung tes mikro. ecoRI / PstI enzyme mix 80 L  DNA pelaku. 4. Jika di laboratorium terdapat sentrifuge. pindahkan 10 L masing-masing DNA ke tabung yang sesuai. Beri label ³EN2´ pada tabung tes mikro yang mengandung campuran enzim restriksi. Campurkan komponen-komponen dengan menjentikkan tabung secara hati-hati dengan menggunakan jari. 5. Kombinasi dan reaksikan.  Agarose 1% yang dicairkan dalam TAE 3. 2. getarkan tabung selama 2 detik untuk memaksa cairan ke dasar tabung dan membuat reaktan tercampur dan terkombinasi . DNA tersangka 3. Gunakan pipet tip baru untuk tiap sampel. DNA tersangka 1. Tutup semua tabung dengan rapat.2 langkah kerja 1. pipet 10 L campuran enzim ³EN2´ ke dalam setiap tabung reaksi.

meletakkan tabung-tabung pada busa microtube holder dan menginkubasinya pada suhu 37oC selama 45 menit. DAFTAR PUSTAKA . tabung dikocok sekali dengan cepat. Jika tidak terdapat sentrifuge di laboratorium. Pilihan alternatif yang dapat dilakukan adalah dengan menginkubasi tabung pada air yang dipanaskan sampai suhu 37Oc dalam jumlah banyak. Mengetukkan tabung ke meja juga dapat membantu proses pencampuran dan kombinasi isi tabung. 6.(pastikan gaar susunan tabung diletakkan seimbang di baling-baling). Tabung dan air diinkubasi semalaman dan suhu air akan mencapai suhu ruangan secara perlahan. Penginkubasian sampel. Setelah inkubasi. DNA digest dapat disimpan di lemari pendingin sampai proses RFLP dilanjutkan.

N.1) Murray.A. 3) Marks. 5th Edition. et all. dan Lawrence G. 2006.. Robert K. Hoboken: Willey at Sons. 2000. Jane B. 2006. Lubert. 2006. 2) Korp. Gerald. Jakarta: EGC. 4) Fatchiyah dan Estilaras Arumingtyas. .M. ed. 7) Campbell. 6) Stryer. Jakarta : Bagian Kedokteran Forensik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. 1997. Jakarta : Erlangga. Dawn B. 2002. Biokimia Kedokteran Dasar. 2000. Ilmu Kedokteran Forensik.5. Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiment. Malang: Laboratorium Biologi Molekular dan Selular Universitas Brawijaya. Manipulasi Gen dan RFLP Analysis. 5) Budiyanto. Jakarta: EGC. Biokimia. Biologi : Jilid 1. et all.. 27th Edition. Arif et all.R. New York: Mc Graw Hill. Harper¶s Illustrated Biochemistry.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->