RFLP (Reaction Fragment Length Polymorphism)

I.

Tujuan Melakukan analisis DNA dengan metode RFLP untuk menemukan DNA yang sama dengan bukti DNA di CS sampel DNA beberapa terangka.

II. 2.1.

Dasar Teori DNA, Informasi Genetik dan Polymorphism Informasi genetik suatu sel hidup tersimpan di dalam makromolekul biologis asam nukleat, terutama dalam bentuk asam deoksiribonukleat (DNA- Deoxyribonukleat Acid). Kode yang menyimpan informasi genetik disimpan dalam bentuk sekuens basa nitrogen yang bervariasi pada setiap nukleotida. DNA dan RNa adalah dua jenis asam nukleat yang ada pada setiap makhluk hidup. [erbedaan anatara DNA dan RNA adalah pada gula intinya. DNA menggunakan gula deoksiribosa sebagai inti nukleotida sementara RNA menggunakan gula ribosa. DNA ;ebih nerperan sebagai penyimpan informasi genetik sementara RNA berperan dalam penerjemah materi genetik tersebut menjadi suatu sifat genetik. 1,2 DNA adalah makromolekul herediter pembawa informasi genetik. DNA merupakan polimer asama nukleat yang memiliki monomer nukleotida. Nukleotida terdiri dari gula dengan atom karbon 5, deoksiribosa, dengan fosfat teresterifikasi pada atom karbon 5 dan basa nitrogen pada pada atom karbon 1. Dua tipe basa nitrogen yang tersedia adalah purin, basa nitrogen dengan dua cincin, yang terdiri dari Adenin dan Guanin, dan pirimidin, basa nitrogen dengan cincin tunggal, yang anggotanya adalah Timin dan

Sitosin. Nukleotida berikatan kovalen dengan nukleotida lain membentuk polimer linier berbentuk untai yang terhubung dengan ikatan 3-5 fosfodiester antara gugus fosfat pada C5 satu nuukleotida dengan gugus OH pada C3 milik nukleotida lainnya. Molekul DNA terdiri dari dua untai tunggal yang berikatan dengan ikatan hydrogen anatara basa nitrogen membentuk struktur double helix antiparalel dimana orientasi anatara kedua untai berjalan kea rah yang berbeda. Untai yang satu tersusun dengan orientasi 5-3 sememntara yang lainnya berorientasi 3-5. Ikatan hydrogen yang terbentuk dari basa nitrogennya terjadi secara eksklusif. Basa nitrogen Timin selalu berikatan dengan Adenin dengan 2 ikatan hydrogen sementara Guanin selalu berikatan dengan Citosin dengan 3 ikatan hydrogen.1,2 Variasi susunan sekuens basa nitrogen akan membentuk kode informasi genetik pada tiap sel hidup. Satu sifat genetik dikodekan di satu bagian khusus pada DNA yang memiliki sekuens nukleotida yang khusus dengan panjang tertentu. Sifat tersebut muncul dari protein yang terkode oleh setiap gen. sebuah gen terdiri dari kodon-kodon, yaitu triplet sekuens basa nitrogen. Dimana tiap kodon mengkode suatu asam amino. Variasi antar kodon akan menyebabkan variasi antar asam amino yang menyusun setiap protein sehingga susunan asam amino tersebut akan memberikan karakteristik unik untuk protein yang dihasilkan. Sekuens asam nukleat sangatlah bervariasi antar makhluk hidup yang berbeda, bahkan di dalam satu spesies. Variasi antar individu yang berbeda ini dinamakan polimorfisme genetik. Istilah polimorfisme biasanya digunakan untuk varian genetik yang dimiliki oleh setidaknya satu persen dari populasi. Penyebab utama dari polimorfisme genetik adalah akumulasi mutasi titik yang selektif dimana mutan, individu hasil mutasi, dapat bertahan hidup dan mewariskan materi genetik muatannya kepada

keturunannya. Polimorfisme pada manusia dapat berupa variasi antar individu dengan perbedaan satu nukleotida (SNP-Single Nucleotida Polymorphisme) maupun variasi pada sekuens nukleotida yang lebih banyak. Polimorfisme antar individu adalah subjek analisis dan pemeriksaan DNA dimana perbedaan sekuens DNA antar individu bisa digunakan untuk berbagai keperluan, diantaranya pemeriksaan forensic, identifikasi korban, diagnosis penyakit dan tes paternitas. 1,2,3 2.2. RFLP Salah satu teknik pertama yang digunakan secara luas untuk mendeteksi variasi dan polimorfisme pada sekuens DNA adalah teknik Restriction Fragmen Length Polymorphism (RFLP). Teknik RFLP didasarkan pada aktivitas suatu enzim restriksi yang memotong DNA menjadi fragmen-fragmen spesifik. Perbedaan sekuens DNA antar individu akan mempengaruhi titik potong restriksi endonuklease sehingga fragmen yang terpotong akan memiliki panjang yang bervariasi. Perbedaan panjang fragmen akan terlihat setelah dilakukan elektroforesis gel, hibridisasi dan visualisasi. Hasil dari RFLP adalah profil pita-pita berdasarkan panjang fragmen. Individu dengan DNA yang berbeda akan menghasilkan pola yang berbeda.1,2,3,4 Aplikasi terbaik RFLP digunakan untuk berbagai macam kegunaan, terutama yang berhubungan dengan analisis DNA. Beberapa contoh aplikasi RFLP adalah untuk mendeteksi diversitas genetik, hubungan kekerabatan, sejarah domestikasi, asal dan evolusi suatu spesies, genetik drift, genom mapping, isolasi gen khusus dan konstruksi perpustakaan DNA. Dalam proses RFLP yang akan dilakukan, RFLP digunakan sebagai metode untuk mencocokkan bukti DNA CS dengan sampel DNA tersangka sehingga dapat diketahui siapa pelaku kejahatan dari beberapa orang pelaku tersangka.1,4

2.3

Langkah-langkah RFLP Langkah-langkah untuk melakukan analisis RFLP di laboratorium adalah4 : 1. Isolasi DNA. 2. Pemotongan dengan enzim retriksi (digesti retriksi) dan elektroforesis gel. 3. Transfer DNA dengan southern blotting. 4. Hibridisasi DNA.

2.3.1. Isolasi DNA Langkah pertama dalam melakukan analisis variasi individual dalam gen (fragmen DNA) adalah isolasi gen yang mengandung urutan sekuens nukleotida yang bervariasi untuk memperoleh jumlah DNA yang adekuat untuk penelitian. 3 Isolasi DNA dilakukan dengan megambil sampel sel berinti yang memiliki DNA dari organism. Sel sampel DNA kemudian diproses dengan diterjen untuk melakukan lisis membrane sel dan inti sel, lalu pemisahan DNA dari komponen sel lain, termasuk debris sel dengan sentrifugasi. Setelah ektraksi DNA dilakukan presipitasi DNA dengan isopropanol 100%. Selain DNA, bahan lain akan larut di dalam alkohol tersebut sehingga saat dilakukan sentrifugasi, DNA akan mengendap dan terpisah dari senyawa lain. 2,4 RFLP memerlukan DNA yang murni dan bebas dari kontaminan dengan berat molekul yang tinggi. Hal yang dapat mengganggu kemurnian DNA hasil isolasi adalah : 4 a. DNA patah-patah selama proses isolasi. b. DNA terdegradasi oleh enzim nuclease.

c. Terjadi kontaminasi oleh polisakarida. d. Metabolit sekunder ikut terisolasi.

2.3.2. Pemotongan fragmen DNA dengan enzim restriksi (digesti restriksi). DNA murni hasil isolasi kemudian akan dipotong dengan enzim restriksi endonuklease membentuk potongan DNA spesifik. Enzim restriksi tersebut memotong DNA dalam sekuens di dalam molekul (bukan di ujung molekul seperti enzim eksonuklease) dengan sekuens DNA yang spesifik. Enzim ini hanya memotong DNA pada sekuens yang khusus tidak seperti metode lain yang meotong DNA secara random. Adanya mutasi tertentu pada lokasi pemotongan akan menyebabkan DNA tidak terpotong seperti biasa dan terbentuk fragmen DNA yang lebih panjang. Variasi panjang fragmen inilah yang menjadi dasar analisis RFLP. 1.5 Enzim restriksi endonuklease ini ditemukan pada berbagai jenis bacteria dan bertindaj sebagai mekanisme pertahanan bakteri dari molekul DNA asing. Enzim tersebut dinamakan berdasarkan nama bakteri yang memilikinya, misalnya enzim ecoRI berasal dari E.Coli. enzim restriksi akan mengenali sekuens pendek yang spesifik dan khusus sepanjang 4-7 basa. Sifat utama enzim ini adalah spesifitasnya dimana enzim yang sama akan selalu memutuskan DNA pada urutan tertentu. Hasil potongan DNA dapat berupa untai tumpul/blunt (ujung fragmen untai ganda) maupun lengket/sticky ( ujung fragmen untai tunggal). Fragmen sticky lebih berguna dan mudah digunakan untuk proses ligase pada rekombinan DNA. 1,2,3

2.3.3 Gel elektroforesis Setelah dilakukan pemotongan sampel DNA oleh enzim restriksi, akan terbentuk potongan fragmen DNA dalam berbagai ukuran. Perbedaan kecil antara fragmen restriksi tersebut dapat dideteksi dan dipisahkan dengan melakukan elektroforesis gel. Gel elktroforesis akan memisahkan molekul berdasarkan ukuran dengan menggunakan medan listrik. Semakin pendek fragmen DNA, semakin jauh fragmen tersebut berjalan menginfiltrasi gel. DNA memiliki gugus fosfat yang bermuatan negative sehingga molekul DNA akan berjalan kea rah elektroda positif pada elektroforesis. Gel yang digunakan tergantung dari utjuan dan aplikasinya. Gel poliakrilamid dapat memisahkan molekul DNA dengan perbedaan panjang satu nukleotida saja, digunakan untuk DNA sequencing. Gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang memiliki perbedaan ukuran lebih besar. 3,6 Hasil elektroforesis gel akan memberikan pita-pita yang membentuk pola khusus untuk setiap individu. Pola tersebut dapat dilihat dengan berbagai teknik, misalnya dengan pewarnaan etidium bromide akan menghasilkan flurosensi jingga di bawah sinar UV. Fragmen restriksi biasanya diidentifikasi lebih lanjut dengan hibridisasi dan visualisasi dengan probe. 2.3.4 Transfer DNA Southern Blotting Proses hibridisasi dan visualisasi diawali dengan transfer DNA dari sel agarosa ke nilon berpori atau membrane nitroselulosa. Transfer DNA disebut Southern Blotting, mengacu kepada nama penemu teknik tersebut yaitu E.M. Southern (1975).7

Prosedur metode ini mengkombinasi lima teknik laboratorium, dan memungkinkan para peneliti untuk dapat mendeteksi dan menganalisis urutan DNA tertentu. Lima teknik laboratorium yang digunakan anatara lain7 : a. Penyiapan fragmen restriksi Sampel DAN yang akan diuji dipersiapkan dari sumber yang tepat, kemudian enzim restriksi ditambahkan untuk menghasilkan fragmen restriksi. b. Elektroforesis Campuran fragmen restriksi dari setiap sampel dipisahkan dengan elektroforesis. Setiap sampel membentuk suatu pola pita yang khas. c. Blotting Aksi kapiler menarik larutan alkali ke atas melewati gel dan melewati selembar kertas nitroselulosa yang diletakkan di atasnya, memindahkan DNA ke kertas tersebut serta mendenaturasinya dalam proses tersebut. Untai tunggal DNA melekat pada kertas yang ditempatkan dalam pita tepat seperti pada gel. d. Hibridisasi dengan probe radioaktif Blot kertas dipaparkan pada larutan yang mengandung probe berlabel radioaktif. Probe ini merupakan DNA untai tunggal yang komplementer terhadap urutan DNA yang diinginkan, dan probe ini dilekatkan ke fragmen restriksi yang mengandung urutan komplementer dengan cara berpasangan basa. e. Autodiografi

Selembar film fotografik diletakkan di atas kertas. Radioaktivitas pada probe yang terikat mempaar film untuk membentuk bayangan yang sesuai dengan pita DNA yang spesifik-pita yang mengadung DNA yang berpasangan basa dengan probe itu.

2.3.5. Hibridisasi dan Visualisasi DNA yang telah ditransfer ke lembar nitroselulosa akan dihibridisasi dengan probe. Probe adalah DNA untai tunggal yang komplementer terhadap DNA pada nitroselulosa. Proses hibridisasi akan menyatukan kembali (Reannealing) probe dengan DNA untai tunggal pada nitroselulosa. Biasanya probe membawa label radioaktif misalnya
35

P, probe dapat dideteksi dengan

autodiografi. Dibuat autodiogram dengan membungkus bahan yang mengandung probe hybrid dengan kertas sinar-X. film sinar-X tersebut akan terpajan oleh electron hasil disintegrasi atom radioaktif tepat di atas probe sehingga membentuk pola sesuai pita DNA yang ada.2,3,6 Probe pada umumnya berasal dari cDNA (dari hasil reverse transcriptase ke RNA), fragmen DNA genom (diputuskan dari genom oleh enzim restriksi), oligonukleotida sintetik atau kadang RNA. Tidak semua probe berikatan dengan label radioaktif. Probe dapat juga dilabeli dengan senyawa kimia tambahan misalnya fluorofhores yang dapat dideteksi dengan fluorosens.2,3 Mutasi dan perbedaan genotip akan menghasilkan sisi pengenalan enzim yang berbeda pada suatu sekuens DNA. Hasil dari teknik RFLP adalah pola pita DNA yang dideteksi dengan ada tidaknya fragmen DNA dengan panjang tertentu.

Perbedaan antar genotip dari individu berbeda akan divisualisasikan sebagai pola fragmen restriksi yang berbeda.

2.4.

Kelebihan dan kekurangan RFLP RFLP merupakan metode yang mempunyai akurasi yang tinggi dan mudah ditransfer

antar laboratorium, RFLP bersifat kodominan sehingga dapat mendeteksi heterozigositas, tidak diperlukan informasi sekuens DNA target, dan area target berdasarkan homologi sekuens sehingga direkomendasikan untuk analisis filogenik anatar spesies ujung berkerabat. RFLP cocok digunakan untuk pembuatan peta linkage, merupakan marker lokus yang spesifik, dan mempunyai kemampuan pemisahan yang tinggi baik pada tingkat populasi, spesies, atau individual. RFLP merupakan teknik yang sederhana apabila probe tersedia. Kekurangan RFLP adalah dibutuhkannya DNA dengan kemurnian tinggi dalam jumlah banyak, tidak mungkin dilakukan automatisasi, sulit digunakan pada beberapa spesies dengan tingkat polimorfisme rendah, mendeteksi lokus yang sedikit, memerlukan perpustakaan probe yang sesuai, serta membutuhkan waktu dan tenaga yang banyak

3.

Metodologi

Digesti Retriksi 3.1 Alat dan Bahan a. Alat  Sistem eletrokforesis sel agarosa (electrophoresis chamber, casting tray, 8-well comb) 1 buah.  Pipet tips, 2-200 L sebanyak 15 tip  Mikro pipet, 2-20 L sebanyak 1 buah  Tabung tes mikro yang telah diwarnai (hijau, biru, orange, violet, red, yellow masingmasing 1 buah)  Permanent marker 1 buah  Tempat sampah 1 buah  Busa mikro test tube holder 1 buah  Laboratory tape  Inkubator atau 37o waterbath (optional)  Mikrosentrifuge

b. Bahan

 ecoRI / PstI enzyme mix 80 L  DNA pelaku, DNA tersangka 1, DNA tersangka 2, DNA tersangka 3, DNA tersangka 4, dan DNA tersangka 5.  Agarose 1% yang dicairkan dalam TAE 3.2 langkah kerja 1. Beri label pada tabung reaksi dengan ketentuan : Tabung hijau :pelaku (CS) Tabung biru Tabung orange :tersangka 1 (S1) :tersangka 2 (S2)

Tabung violet :tersangka 3 (S3) Tabung merah :tersangka 4 (S4) Tabung kuning :tersangka 5 (S5)

Simpan tabung-tabung tersebut ke busa penyimpanan tabung tes mikro. 2. Beri label EN2 pada tabung tes mikro yang mengandung campuran enzim restriksi. 3. Dengan menggunakan tip yang baru, pindahkan 10 L masing-masing DNA ke tabung yang sesuai. 4. Kombinasi dan reaksikan. Gunakan pipet tip baru untuk tiap sampel, pipet 10 L campuran enzim EN2 ke dalam setiap tabung reaksi. 5. Tutup semua tabung dengan rapat. Campurkan komponen-komponen dengan menjentikkan tabung secara hati-hati dengan menggunakan jari. Jika di laboratorium terdapat sentrifuge, getarkan tabung selama 2 detik untuk memaksa cairan ke dasar tabung dan membuat reaktan tercampur dan terkombinasi

(pastikan gaar susunan tabung diletakkan seimbang di baling-baling). Jika tidak terdapat sentrifuge di laboratorium, tabung dikocok sekali dengan cepat. Mengetukkan tabung ke meja juga dapat membantu proses pencampuran dan kombinasi isi tabung. 6. Penginkubasian sampel, meletakkan tabung-tabung pada busa microtube holder dan menginkubasinya pada suhu 37oC selama 45 menit. Pilihan alternatif yang dapat dilakukan adalah dengan menginkubasi tabung pada air yang dipanaskan sampai suhu 37Oc dalam jumlah banyak. Tabung dan air diinkubasi semalaman dan suhu air akan mencapai suhu ruangan secara perlahan. Setelah inkubasi, DNA digest dapat disimpan di lemari pendingin sampai proses RFLP dilanjutkan.

DAFTAR PUSTAKA

1) Murray, Robert K. et all. 2006. Harpers Illustrated Biochemistry, 27th Edition. New York: Mc Graw Hill. 2) Korp, Gerald. 2006. Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiment. 5th Edition. Hoboken: Willey at Sons. 3) Marks, Dawn B. et all. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar. Jakarta: EGC. 4) Fatchiyah dan Estilaras Arumingtyas. 2006. Manipulasi Gen dan RFLP Analysis. Malang: Laboratorium Biologi Molekular dan Selular Universitas Brawijaya. 5) Budiyanto, Arif et all. 1997. Ilmu Kedokteran Forensik. Jakarta : Bagian Kedokteran Forensik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. 6) Stryer, Lubert. 2000. Biokimia. Jakarta: EGC. 7) Campbell, N.A., Jane B.R., dan Lawrence G.M. 2002. Biologi : Jilid 1, ed.5. Jakarta : Erlangga.