IDENTIFIKASI SPESIES MIKROORGANISME SAMPEL

I. Tujuan Percobaan : Mampu menggunakan teknik pewarnaan, pengkulturan, dan uji biokimia yang telah didapat untuk menentukan genus kultur bakteri yang belum diketahui. II. Dasar Teori :

Spesies berasal dari bahasa Latin species yang merupakan tingkatan dalam taksonomi yang terkecil, biasanya digunakan untuk mengklasifikasi organisme baik yang hidup maupun organisme yang fosil. Dalam biologi, species adalah salah satu bentuk pengelompokan dalam klasifikasi makhluk hidup.. Dalam sistem tatanama binomial, nama suatu spesies makhluk hidup terdiri atas dua kata: nama genusnya (diawali dengan huruf kapital) dan nama penunjuk spesiesnya. Misalnya, dari gambar di samping,Panthera pardus, Nama Panthera merupakan nama genus atau marga sedangkan pardus merupakan nama species. Berikut penjelasan singkat mengenai 3 spesies sampel yang kelompok kami temukan. Ketiga spesies sampel kami antara lain adalah E. coli, Staphylococcus epidermis dan Proteus mirabilis. 1. E.coli Escherichia coli, atau biasa disingkat E. coli, adalah salah satu jenis spesies utama bakteri gram negatif. Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh Theodor Escherich ini hidup pada tinja, dan dapat menyebabkan masalah kesehatan pada

manusia, seperti diare, muntaber dan masalah pencernaan lainnya. E. coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika. Biasa digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan. E. coli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah dalam penanganannya. 2. Staphylococcus epidermis Staphylococcus epidermis merupakan bakteri non-motil, jenis coccus grampositive cocci, dan berbeda dengan Staphylococcus aureus, bakteri ini tidak memiliki enzim koagulase. Bakteri ini merupakan bakteri yang patogen dan aktif dalam aliran darah melalui luka, jarum dll. Infeksi dari bakter in berakibat pembengkakan pada daerah yang terinfeksi. 3.Proteus mirabilis Proteus mirabilis merpakan bakteri gram negative dan bakteri fakultatif anaerob. Bakteri ini memiliki kemampuan motalitas dan aktivitas urease. P.mirabilis menyebabkan 90% infeksi yang disebabkan oleh jenis ‘Proteus’. P.mirabilis dapat menggunakan urea dan citrate untuk produksi energi. Bakteri ini dapat memproduksi gas hydrogen sulfide dan membentuk zona bening pada media. P.mirabilis ini motil, memiliki peritrichous flagella yang diketahui sebagai penyebab pergerakan. Bakteri ini pada umumnya ditemukan pada intestinal manusia. P.mirabilis tidak pathogen pada guinea pigs atau ayam. Uji – uji biokimia pada P.mirabilis adalah sebagai berikut : *Indole negative dan reduksi nitrat positif (tidak ada gas yang diproduksi) *Metyl red positif dan Voges-Proskauer negatif *Catalase positif and Cytochrome Oxidase negatif Untuk mengidentifikasi spesies suatu bakteri, praktikan perlu melakukan serangkaian uji yang berurutan sesuai dengan hasil percobaan yang telah ada. Berikut adalah penjelasan berbagai uji yang harus dilakukan dalam mengidentifikasi spesies sampel : 1.Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram adalah suatu metode yang digunakan untuk membedakan mikroorganisme berdasarkan susunan & struktur dinding sel mikroorganisme. Metode pewarnaan gram membutuhkan 4 jenis reagen yaitu : crystal gentian violet (Gram I), iodine (Gram II), alkohol 95% (GramIII), dan saphranin (Gram IV). Dengan menggunakan metode pewarnaan gram, bakteri dapat digolongkan menjadi 2 kelompok, yaitu : bakteri gram (+) yang akan berwarna biru-ungu dan bakteri gram (-) yang berwarna merah.

Staphylcuococs (+)

E. coli (-)

Beberapa fungsi reagen dalam pewarnaan gram yang menentukan spesies sampel termasuk dalam gram (+) atau gram (-) adalah sebagai berikut: • • Pemberian kristal fiolet berfungsi untuk mewarnai semua sel. (baik Iodin berfungsi sebagai mordan. Di dalam sitoplasma iodin gram negatif maupun positif) membentuk komplek dengan kristal fiolet. Pembentukan kompleks mengakibatkan sel berwarna biru tua. • Pemberian alkohol memiliki 2 fungsi: – Pada gram positif alkohol mengakibatkan peptidoglikan terdehidrasi sehingga ukuran porinya mengecil. Ini mengakibatkan kristal violet tidak dapat keluar dari sitoplasma. – Pada gram negatif alkohol mencuci dinding sel dan meninggalkan lubang kecil pada peptidoglikan. Ini mengakibakan kristal violet tercuci keluar dan sel menjadi tidak berwarna.

Safranin berfungsi sebagai couter staining. Safranin akan

memberi warna pada gram negatif sehingga gram positif dan negatif akan terlihat berbeda secara jelas di bawah mikroskop. Dari hasil pewarnaan gram, selain dapat membedakan mikroorganisme berdasarkan susunan & struktur dinding sel mikroorganisme, praktikan juga dapat mengidentifikasi morfologi dari bakteri tersebut. Berikut gambar tentang berbagai bentuk morfologi dari bakteri sebagai berikut :

2.Uji Biokimia Biokimia adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui metabolisme dan reaksi yang dijalankan oleh suatu mikroorganisme. Jenis – jenis uji biokimia untuk mengidentifikasi spesies antara lain : a.Reaksi Litmus Milk Media yang digunakan Komposisi Media : litmus broth : - Litmus - Skim milk powder - Sodium sulfite Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (0,5 gr) (100 gr) (0,5 gr)

Penyusun susu terbesar yang digunakan sebagai dasar uji biokimia dalam media litmus milk adalah laktosa, protein susu yaitu kasein, lacto-albumin dan lactoglobulin.Untuk melihat adanya perubahan metabolisme yang diproduksi dalam medium, digunakan pH indicator yaitu oxidase-reduction

indicator litmus. Indicator ini akan menyatu dalam medium. Saat ini,litmus milk merupakan medium yang baik untuk mikroorganisme yang dapat mencerna substrat milk, tergantung dari komplemen enzimatik bakteri tersebut. Beberapa perubahan biokimia dalam litmus milk :  Fermentasi Laktosa Organisme mampu menggunakan laktosa sebagai sumber karbon untuk produksi energi, dengan menggunakan induksi enzim β -galactosidase. Degradasi laktosa dirumuskan sebagai berikut:

Adanya asam laktat dapat dengan mudah dideteksi karena litmus bewarna ungu pada pH netral dan berubah menjadi merah muda ketika medium menjadi asam yaitu pada pH sekitar 4.  Adanya gas + H2
.

Produk akhir pada fermentasi laktosa adalah CO2

Adanya gas

ini mungkin dapat dilihat sebagai pemisahan ‘curd’ atau pembelahan dalam curd sebagai akibat adanya gas yang naik ke permukaan.  Reduksi Litmus Fermentasi adalah proses anaerobic yang meliputi biooksidasi yang terjadi karena tidak ada molekul oksigen. Oksidasi ini mungkin akan terlihat sebagai perpindahan hydrogen (dehydrogenation) dari substrat.Karena ion hidrogen tidak dapat dalam bentuk bebas/melayanglayang,hydrogen memerlukan akseptor elektron yang dapat mengikat ion hydrogen jika hal tersebut tidak terjadi maka reaksi reduksi-oksidasi tidak akan berjalan dan produksi energy tidak dapat dihasilkan. Pada tes litmus milk, litmus berperan sebagai akseptor. Saat berada dalam kondisi oksidasi, litmus berwarna ungu; ketika litmus menerima

selain itu adanya calcium ion diubah menjadi calcium paracaseinate dan membentuk gumpalan yang tidak larut. enzim yang berperan mengubah casein menjadi bentuk paracasein.  Proteolysis (Peptonization) Ketidakmampuan beberapa mikroorganisme untuk menghasilkan energi melalui jalur fermentasi laktosa menandakan bahwa mikroorganisme tersebut harus menggunakan sumber nutrisi lainnya sebagai protein untuk menghasilkan energi. Curd yang terbentuk bergantung pada mekanisme biokimia yang membentuk curd tersebut Ada 2 jenis curd yang mungkin terbentuk yaitu : -Acid curd Asam laktat atau asam organic lain menyebabkan pengendapan milk protein casein sebagai calcium caseinate menjadi bentuk gumpalan yang tidak larut. -Rennet curd Beberapa organisme menghasilkan rennin.  Terbentuknya Curd Aktivitas biokimia dari mikroorganisme yang berbeda ditumbuhkan pada litmus milk menghasilkan produksi 2 tipe curd (clots) yang berbeda. Oksidasi laktosa ini memproduksi asam laktat. Tidak seperti acid curd. curd jenis ini berupa gumpalan semisolid yang lembut.hydrogen dari substrat. yang menyebabkan perubahan menjadi putih dan menandakan bahwa laktosa tereduksi. gas CO2 dan gas H2. asam butirat. Gumpalan ini akan mengalir perlahan saat tabung dimiringkan. Lactose Glucose Pyruvic acid -Lactic acid -Butyric acid -CO2 + h2 Gas hydrogen dikenal sebagai hydrogen litmus acceptor. Dengan menggunakan enzim proteolitik. litmus akan tereduksi dan berubah menjadi putih atau warna putih susu. .

Proteolysis of casein F. terutama casein. mannitol broth : . Acid/Reduction/Curd B. Alkaline Reaction b.Casein peptone (10 gr) . Proses pencernaan protein disertai dengan perubahan sejumlah besar ammonia yang dihasilkan dalam medium dengan alkaline pH. glucose. Uninoculated Control D.organisme menghidrolisis milk protein.Fermentasi Karbohidrat Media yang digunakan Komposisi Media : phenol red lactose. dengan disertai pelepasan produk akhir alkaline yang menyebabkan perubahan warna. menjadi bentuk dasarnya yaitu asam amino. Acid Formation E. Litmus berubah warna menjadi lapisan ungu yang berada di atas/ permukaan dari tabung. Beberapa kemungkinan hasil yang diperoleh dari uji Litmus Milk : Keterangan gambar :A. fructose. Reduction/Curd (arrow denotes gas pocket) C. reaksi sedangkan bagian bawahnya kehilangan strukturnya dan membentuk cairan kecoklatan  Reaksi Alkaline Reaksi alkaline dibuktikan ketika warna pada medium tidak berubah atau berubah menjadi biru. Reaksi ini mengindikasikan partial degradation dari casein menjadi rantai polipeptida yang lebih pendek.

-Lactose/fructose/glucose/mannitol . Degradasi fermentasi secara anaerob mengambil tube broth fermentasi yang mengandung tabung Durham. Fermentasi digambarkan dengan baik lewat degradasi glukosa melalui jalur Embden-Meyerhof. yang merah pada pH netral (7) dan kuning bila sedikit asam (pH 6.48 jam pada 370C (5 gr) (5 gr) (0. -pH indicator phenol red. Beberapa organisme mampu memfermentasikan gula seperti glukosa secara anaerob. yang berguna untuk mendeteksi gas yang dihasilkan. tergantung pada komplemen enzimnya. atau asam asetat) yang disertai adanya gas seperti hydrogen atau karbondioksida. menjadi .018 gr) Kebanyakan organisme memperoleh energi melalui suatu urutan reaksi enzimatis tertentu dan terintegrasi.8). Medium fermentasi karbohidrat mengandung : -Nutrient broth untuk pertumbuhan semua organisme -Karbohidrat spesifik yang berfungsi sebagai substrat untuk determinasi kemampuan fermentasi organisme-organisme. Pada fermentasi. dan variasi produk akhir menunjukkan kemampuan fermentasi mereka yang berbeda. format. Organisme menggunakan karbohidrat secara berbeda.Phenol red Lama inkubasi : 24 . substrat-substrat seperti karbohidrat dan alkohol mengalami disimilasi secara anaerob dan menghasilkan asam organik (sebagi contoh : laktat. yang mana merupakan senyawa intermediet utama yang dihasilkan dari degradasi glukosa.yang mengarah pada biooksidasi substrat. sedangkan yang lain dengan aerob. yang dikenal dengan jalur glikolisis.Sodium chloride . Hasil metabolisme asam piruvat lebih lanjut tidak sama untuk semua organisme. Anaerob fakultatif mampu melakukan keduanya sedangkan beberapa organisme justru tidak mampu mengoksidasi glukosa secara anareob maupun aerob. Satu mol glukosa dikonversi menjadi dua mol asam piruvat. seringkali karbohidrat.

Casein peptone .5 gr) (0. dan tabung tetap warna merah. yang menimbulkan warna merah tua. Reaksi tersebut membebaskan ammonia hidroksida (NH4OH) dan menghasilkan lingkungan alkalin.Meat peptone . Kultur yang tidak mampu memfermentasi substrat karbohidrat tidak akan merubah warna indicator. c. yang mengindikasikan reaksi positif. Asam ketoamino tersebut lalu dimetabolisme lewat siklus Krebs untuk menghasilkan energi. serta tidak ada gas pada tabung Durham. Setelah inkubasi.Sodium thiosulfate Lama inkubasi Terdapat dua jalur : 24 – 48 jam pada 370C fermentasi utama yang mana beberapa (3. Di antara nutrien tersebut adalah pepton yang ada pada nutrient broth. selain karbohidrat. Ini merupakan reaksi negatif.Produksi H2S Media yang digunakan Komposisi Media : SIM agar deep tubes : .2 gr) (20 gr) (6. Pada beberapa kasus. Organisme menggunakan nutrien lain dalam medium sebagai sumber energi.1 gr) (0. Pepton dapat didegradasi oleh enzim mikrobial menjadi asam amino yang secara enzimatis dikonversi menjadi asam ketoamino lewat deaminasi oksidatif. karbohidrat yang telah difermentasi dengan hasil sampingan asam akan menyebabkan phenol red menjadi kuning. Kekurangan fermentasi karbohidrat oleh beberapa organisme tidak dapat diartikan sebagai ketiadaan pertumbuhan. produksi asam disertai produksi gas (CO2) yang terlihat sebagai gelembung pada tabung Durham.Inkubasi dilakukan dalam waktu 48 jam.2 gr) mikroorganisme mampu memproduksi hydrogen sulfide (H2S) : .Bacteriological agar . Inkubasi yang berlebih dapat menutupi reaksi produksi asam oleh produksi alkali yang disebabkan kegiatan enzimatik pada substrat.Ferric ammonium sulfate .

Motilitas disadari saat . kehilangan atom sulfur dan direduksi dengan penambahan hydrogen dari air untuk membentuk H2S. Ketiadaaan endapan menunjukkan reaksi negative. yang mana merupakan komponen peptone yang terdapat pada medium. dengan mikroorganisme tertentu dapat direduksi menjadi sulfite dengan pembebasan H2S. Pepton tersebut didegradasi oleh enzim microbial menjadi asam amino. Ferrous ammonium sulfat gas. ferro sulfat (FeSO4) sebagai indicator H2S. Jalur I : gas H2S dapat diproduksi oleh reduksi (hidrogenasi) sulfur organic yang ada di asam amino sistein. Asam amino ini dengan keberadaan sistein desulfurase. sulfat (SO42-). dan Agar untuk membuat medium menjadi semisolid dan mendorong respirasi anaerob. SIM agar juga dapat digunakan untuk mendeteksi motilitas organisme. membentuk endapan tak larut ferrous sulfide berwarna hitam yang dapat dilihat di sepanjang tusukan inokulasi. Medium yang mengandung sodium thiosulfat. yang mengindikasikan terbentuknya H2S.  Jalur II : gas H2S dapat dihasilkan dari reduksi senyawa sulfur anorganik seperti thiosulfat (S2O32-). meliputi sistein. Atom sulfur bertindak sebagai akseptor hydrogen selama oksidasi senyawa anorganik seperti ditunjukkan sebagai berikut : Pada percobaan digunakan SIM medium yang mengandung peptone dan sodium thiosulfat sebagai substrat sulfur. atau sulfit (SO32-).

:24 – 48 jam pada 370C Reduksi nitrat oleh beberapa mikroorganisme aerobik dan fakultatif anaerobik terjadi dengan adanya molekul oksigen yaitu proses anaerobik. Pertumbuhan organisme nonmotil sesuai dengan garis inokulasi ditunjukkan sebagai berikut : d.pertumbuhan kultur dari organisme berflagellata tidak sesuai dengan garis inokulasi.Solution B (αnaphthylamine) dan bubuk Zn. Pada respirasi organisme anaerobic merupakan proses oksidatif karena itu .Peptone from casein .Meat extract .Reduksi Nitrat Media yang digunakan Kompisisi Media :Nutrient Agar : .Agar Reagen yang diperlukan Lama inkubasi (10 gr) (3 gr) (12 gr) :Solution A (asam sulfanilat).

sel menggunakan substrat inorganic seperti nitrat (NO3.medium mengandung nutrient broth bersupplemen 0. Pada dasarnya. Kondisi agar yang semisolid akan menyebabkan difusi oksigen ke dalam medium menjadi sedikit sehingga bakteri anaerob akan melakukan reduksi nitrat Setelah kultur diinkubasi.) atau sulfat (SO42-) untuk suplai oksigen yang kemudian menjadi akseptor hydrogen akhir selam pembentukan energi.+ 12H+ + 10eNitrat NH3+ Ammonia N2 + 6H2O Gas Nitrogen Reduksi nitrat dapat diterangkan dengan mengkultivasi organisme dalam medium nitrat broth.+ Nitrit H2O Air Hydrogen electron Beberapa organisme mempunyai kapasitas enzimatik untuk mengurangi jumlah nitrit menjadi ammonia (NH3+) atau molekul nitrogen (N2). kemampuan organisme untuk mengurangi nitrat atau nitrit dapat dibuktikan dengan penambahan 2 reagen: Larutan A yaitu asam sulfanilat. NO2Nitrit 2NO3. Adanya proses reduksi dengan penambahan Larutan A dan B akan menghasilkan warna cherry red. Nitrat NO3Reduktase NO2- .1% agar. Dapat ditambahkan agar medium menjadi semisolid yaitu dengan penambahan 0.1% kalium nitrat (KNO3) sebagai substrat nitrat. Perubahan nitrat menjadi nitrit dapat dilihat dari reaksi di bawah ini: Nitrat NO3 + 2H + 2e Nitrat + - Reduktase NO2. diikuti dengan pemberian Larutan B yaitu α-naphthylamine.

Ini adalah reaksi yang positif.Bacteriological agar .Sodium thiosulfate Reagen yang diperlukan Lama inkubasi : Kovac’s reagent : 24 – 48 jam pada 370C (3. Bila ada perubahan menjadi warna merah maka membuktikan nitrat tidak direduksi menjadi nitrit oleh organisme. Bila setelah penambahan besi tidak ada perubahan warna. e.2 gr) . Jika nitrat tidak direduksi. mak nitrat pada medium direduksi melalui nitrit menjadi ammonia dan gas nitrogen.Ferric ammonium sulfate (0.Kultur yang tidak memproduksi perubahan warna seperti yang tertera di atas memiliki 2 kemungkinan : *Nitrat tidak direduksi oleh organisme.2 gr) .Produksi Indol Media yang digunakan Kompisisi Media : SIM agar deep tubes : .Meat peptone .Casein peptone .bubuk besi ditambahkan sedikit ke kultur yang telah diberi Larutan A dan B. Besi mereduksi nitrat menjadi nitrit. atau *Organisme mempunyai semacam potensi enzim nitrate reductase yaitu nitrat secara cepat direduksi melalui nitrit menjadi ammonia atau bahkan menjadi molekul nitrogen.1 gr) (0.5 gr) (20 gr) (6. reaksi reduksi nitrat dikatakan negatif. Untuk membuktikan ada tidaknya nitrat yang direduksi melalui terbetuknya nitrite.

Reaksinya sebagai berikut : Kemampuan hidolisis triptofan dan produksi indol bukan karakteristik mikroorganisme dan oleh sebab itu dapat berfungsi sebagai penanda biokimia. Ketidakhadiran warna merah ceri mengindikasikan bahwa substrat tryptophan tidak terhidrolisis dan mengindikasikan reaksi indol negative.Dextrose Reagen yang diperlukan : Metyl red indicator (7 gr) (5 gr) (5 gr) .Peptone mixture .Triptofan adalah asam amino esensial yang dapat mengalami oksidasi melalui beberapa aktifitas enzimatik bakteri. Indol diekstrak dari medium ke lapisan reagen oleh komponen butyl alcohol yang diasamkan dengan asam klorida (HCl) dan membentuk kompleks dengan pdimetilaminobenzaldehid yang menghasilkan warna merah ceri. Konfersi triptofan menjadi produk metabolit dilakukan oleh enzim triptofanase. f.Tes metil merah (MR) Media yang digunakan Komposisi media : MR-VP broth : .Potassium phosphate . Keberadaan indol dideteksi dengan menambahkan reagen Kovac yang menyebabkan lapisan reagen yang ada di atas agar deep menjadi berwarna merah ceri. Dalam uji ini digunakan agar SIM (Sulphite Indole Motility) yang mengandung substrat trytophan. Kultur yang menghasilkan lapisan reagen yang berwarna merah ceri setelah ditambah dengan reagen Kovac mengindikasikan indol positif.

E. uji ini berguna dalam pemisahan E. Produksi dan deteksi produk akhir non asam dari fermentasi glukosa E. Produk akhir dari reaksi ini dapat bervariasi tergantung reaksi enzimatik spesifik yang ada dalam bakteri. Pada pH sekitar 6 masih tetap mengindikasikan keberadaan asam tapi pada konsentrasi ion hydrogen yang lebih rendah. Meskipun semua mikroorganisme enteric memfermentasi glukosa dengan menghasilkan asam organik.aerogenes secara enzimatik mengubah asam ini ke hasil akhir yang tidak asam seperti 2.Peptone mixture .Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C Glukosa heksosa adalah substrat utama yang dioksidasi oleh seluruh organisme enteric untuk produksi energi. Pada uji ini indicator methyl red mendeteksi keberadaan konsentrasi asam yang besar pada hasil akhir dengan media MRVP Agar.3-butanadiol dan acetoin (asetilmetil-karbinol) yang menghasilkan pH sekitar 6. Kedua organisme ini menghasilkan produk akhir asam organik selama masa inkubasi awal.Tes Voges-Proskauer Media yang digunakan Komposisi media : MR-VP broth : .coli dan E.Potassium phosphate (7 gr) (5 gr) . Derajat keasaman yang rendah (pH = 4) distabilisasi dan diatur oleh E. Selama inkubasi selanjutnya. Indikator berubah warna jadi kuning dan mengindikasikan hasil uji yang negatif. g.aerogenes.coli pada akhir masa inkubasi. Reaksinya sebagi berikut: Glukosa + H2O  Asam laktat Asam Asetat Asam format + CO2 + H2 (pH 4.0) Uji +  ditunjukkan dengan warna media yang menjadi merah. Indikator metal red pada pH sekitar 4 akan berwarna merah yang mengindikasikan bahwa hasil uji positif. areogenes diperkuat dengan uji Voges-Proskauer.

Dextrose 3 Reagen yang diperlukan Asetilmetilkarbinol α -naftol Lama inkubasi : Barritt’s reagent A dan B Diasetil Guanidin 0 : 24 – 48 jam pada 37 C Uji Voges-Proskauer menentukan Reaksi Asetilmetilkarbinol dengan reagen Barrit kemampuan beberapa organisme untuk memproduksi produk akhir non asam atau netral seperti asetilmetil -karbinol yang berasal dari metabolisme glukosa.sodium chloride .2 gr) OH + 40% KOH Oksidasi C CH3 Diasetil O CH3 C O + C NH2 NH NH-R Guanidin Kompleks berwarna Pink . Keberadaan warna mawar tua pada kultur setelah penambahan reagen Barritt mengindikasikan keberadaan acetylmethylcarbinol dan merupakan hasil positif.sodium citrate . kompleks pink terbentuk. Reagen yang digunakan dalam uji ini adalah reagen Barrit yang mengandung campuran α-naphthol alkoholik dan larutan 40% potassium hydroxide (KOH). Reaksi ini terjadi pada keberadaan katalis α-naphthol dan grup guanidine yang ada pada peptone pada medium MRVP.dipotassium hydrogen phospate (1 gr) . sebagai warna mawar pada medium. dan bila tidak ada berarti hasilnya negatif.magnesium sulfate (5 gr) (2 gr) (0. CH3 OH C O CH CH3 Asetilmetilkarbinol α -naftol Reaksi Asetilmetilkarbinol dengan reagen Barrit h. Sebagai hasil.CH3 C CH CH3 O OH + OH 40% KOH Oksidasi CH3 C C O O + C NH2 NH NH-R (5 gr) Kompleks berwarna Pink CH .Penggunaan Sitrat Media yang digunakan Komposisi media : Simmons citrate agar slant : . Deteksi acetylmethylcarbinol membutuhkan hasil akhir ini untuk dioksidasi menjadi senyawa diasetil.ammonium dihydrogen phosphate (1 gr) .

Sitrat. 1.bacterological agar Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (0. beberapa mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai sumber karbon untuk produksi energi mereka.bromthymol blue .. CO2 + 2Na+ + H2O  Na2CO3  Alkaline pH  perubahan warna dari hijau ke menjadi biru . medium menjadi alkalin-karbondioksida yang dihasilkan berkombinasi dengan sodium dan air membentuk sodium carbonate. Sitrat merupakan senyawa intermediet utama dalam sel dan diproduksi dengan kondensasi asetil aktif dengan asam oksalaasetat. Kemampuan ini tergantung pada keberadaan enzim sitrat permease yang memfasilitasi transport sitrat dalam sel. Kehadiran sodium carbonate mengubah indicator bromthymol biru pada medium dari hijau menjadi biru tua Prussia.08 gr) (15 gr) Pada ketiadaan glukosa atau laktosa yang dapat difermentasi. dengan keberadaan enzim sitrase. menghasilkan asam oksalaasetat dan asetat. sedangkan negatif bila tanpa pertumbuhan dan medium tetap berwarna hijau. COOH CH2 HO C CH2 COOH C itrate COOH COOH Citras C O e + CH2 COOH COOH Oxaloaseti c acid CH3 COOH COOH C O + CO2 CH3 COOH Pyruvic acid Excess carbon dioxide Acetic acid 2. Selama reaksi. sebuah produk alkalin. Sitrat positif ditunjukkan pertumbuhan pada permukaan slant yang diikuti warna biru. Produk tersebut kemudian secara enzimatis diubah menjadi asam piruvat dan karbondioksida.

Oleh karena itu. j.yeast extract Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (9.monopotassium phosphate (9.1 gr) Urease yang diproduksi oleh beberapa mikroorganisme merupakan enzim yang secara khusus membantu mengidentifikasi Proteus vulgaris. Walaupun organisme lain mungkin menghasilkan urease.urea .phenol red . Adanya urease dapat dideteksi ketika organisme ditumbuhkan dalam urea broth medium yang mengandung pH indicator phenol red. Hal ini menunjukkan reaksi positif terhadap adanya urease.Aktivitas katalase Media yang digunakan :Nutrient Agar . Kegagalan perubahan warna menjadi deep pink membuktikan reaksi negatif.5 gr) (0. Ketika substrat urea dipisahkan dari produknya.dipotassium phosphate .adanya ammonia membuat lingkungan alkaline yang menyebabkan phenol red berubah menjadi deep pink. Urease adalah enzim hydrolitik yang menyerang ikatan nitrogen n karbon pada komponen amida misalnya urea dan membentuk alkaline yang produk akhirnya adalah ammonia . peran mereka pada substrat lebih lambat jika dibandingkan dengan spesies Proteus. tes ini dapat dengan cepat membedakan anggota dari genus ini dari mikroorganisme lain yang tidak memfermentasi laktosa.1 gr) .1 gr) (20 gr) (0.Aktifitas urease Media yang digunakan Komposisi media : Urea broth : .i.

seperti yang telah disebutkan pada reaksi kimia diindikasikan oleh gelembung dari gas oksigen yang ‘terbebas’.Peptone from casein .Agar (10 gr) (3 gr) (12 gr) Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C Selama respirasi aerobik. dan mikroaerophile menggunakan jalur respirasi aerobic. tetapi H2O2 kurang berbahaya bagi sel bakteri jika dibandingkan dengan superoksida. Diperkirakan substansi ini akan dihasilkan dari organisme yang mati jika tidak mereka dapat didegradasi secara enzimatik. Substansi ini diproduksi ketika bakteri aerob.Meat extract . Jika ada katalase. Hal ini menunjukkan tes . hasil akhir dari superoxide dismutase adalah H2O2. facultative anaerob.di mana oksigen merupakan akseptor electron terakhir. Ketidakmampuan strict anaerob untuk mensintesis katalase.Kompisisi Media : . Bila enzim – enzim di atas tidak ada maka menyebabkan konsentrasi zat toksik dari H2O2 tidak dapat didegradasi ketika organisme tersebut ditumbuhkan disertai adanya oksigen. secara ekstrem menghasilkan toxic superoxide. Organisme yang mampu memproduksi katalase secara cepat mendegradasi hydrogen peroksida berdasarkan reaksi berikut : 2H2O2 2H2O Air Hidrogen Peroksida Oksigen bebas + O2 (g) Organisme aerobic yang kekurangan katalase dapat mendegradasi toxic superoxide secara khusus menggunakan enzim superoxide dismutase. atau superoxide dismutase mungkin menjelaskan mengapa oksigen menjadi beracun untuk mikroorganisme. Produksi katalase dapat ditentukan dengan penambahan substrat H2O2 pada tryticase soy agar slant culture yang telah diinkubasi. peroxidase. selama proses degradasi karbohidrat untuk produksi energi. mikroorganisme memproduksi hydrogen peroksida dan dalam beberapa kasus.

Bila tidak terdapat warna hitam tidak mengidentifikasi organisme Group D streptococci. sedangkan tidak terbentuknya gelembung adalah tes katalase negative. Bile esculin test : Dengan adanya bile. l. Group D streptococci menghidrolisis glycoside esculin menjadi 6.Uji 6. Selain itu. Bovis.Uji Bile Esculin Media yang digunakan Lama inkubasi : Bile esculin agar : 24 – 48 jam pada 370C Media ini digunakan untuk mengidentifikasi group D streptococcus. yang mungkin menjadi penyebab infeksi pada urine.7-dihydroxy-coumarin yang bereaksi dengan iron salt yang terkandung dalam medium. Hal ini menyebabkan timbulnya warna cokelat – hitam pada medium setelah diinkubasi. yang mungkin menjadi penyebab infeksi pada urine. Selain itu. ada golongan nonenterococci seperti S. Group ini meliputi enterococcus seperti Enterococcus faecalis.5% sodium chloride broth Media yang digunakan Komposisi media Lama inkubasi : 6.5% : 24 – 48 jam pada 370C Media ini digunakan untuk mengidentifikasi group D streptococcus. yang digunakan dalam pengobatan manusia menggunakan laser. Group ini meliputi enterococcus seperti Enterococcus faecalis. Group D streptococcus menunjukkan α atau γ -hemolysis pada blood agar plates. yang digunakan dalam pengobatan manusia . Group D streptococcus menunjukkan α atau γ -hemolysis pada blood agar plates. ada golongan nonenterococci seperti S. Enterococcus memiliki kemampuan antibiotik resisten dan yang lebih jarang sebagai vancomycin. m.5% NaCl Broth : brain – heart infusion broth NaCl 6. Bovis.katalase positif.

Enterococcus memiliki kemampuan antibiotik resisten dan yang lebih jarang sebagai vancomycin.5 gr) (5 gr) (5 gr) (12 gr) (5%) Aktivitas hemolytic ini adalah salah satu cara untuk mengidentifikasi adanya streptococci.liver digest .(γ ) Gamma-hemolysis diindikasikan dengan tidak adanya hemolysis di sekitar koloni. memiliki kemampuan untuk menyebabkan infeksi pada manusia seperti subacute endocarditis dan gagal jantung. Streptococcus mampu memproduksi β -hemolysins dan bersimbiosis dengan bakteri patogen.menggunakan laser. n. Streptococcus viridans merupakan bakteri yang tidak patogen. Sedangkan yang lain. Ditandai dengan adanya zona berwarna hijau di sekitar koloni. .proteose peptone . α -hemolytic streptococci.Darah steril Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (15 gr) (2. .NaCl .4 kali diameter koloni. Sebagian besar. γ -hemolytic streptococci bersifat avirulent.(β ) Beta-hemolysis merupakan penghancuran sel darah merah dengan sempurna. ada 3 tipe reaksi hemolytic pada blood agar yaitu: .Agar . Dari hasil penelitian. 6.yeast extract . Ditandai dengan terbentuknya zona bening sekitar 2 .5% sodium chloride broth : Group D enterococci dapat diidentifikasi dengan kemampuannya tumbuh pada medium ini jika dibandingkan dengan non enterococci.(α ) Alpha-hemolysis merupakan bentuk hemolisis yang tidak sempurna. .Aktivitas hemolytic Media yang digunakan Komposisi media : blood agar base : .

lens paper dan mikroskop . glass slides. Sedangan bila ditemukan warna yang lain berarti menandakan bahwa uji pigment positif. Setelah diinkubasi. inoculating loop. maka hal itu menandakan bahwa uji pigmen negatif. ada juga yang membutuhkan pewarnaan spora untuk mengidentifikasi lebih lajut. Pewarnaan spora Peralatan yang diperlukan : Bunsen. Uji Bile Solubility Media yang digunakan Reagen yang digunakan Lama inkubasi : Bile solubility : Na-deoksikolat : 24 – 48 jam pada 370C Adanya surface-active agents seperti bile dan bile salts (sodium desoxycholate atau sodium dodecyl sulfate). Selain dilakukan pewarnaan gram dan uji – uji biokimia. Selain α -hemolytic streptococci tidak akan mengalami lisis oleh agen tadi dan tidak larut dalam bile.Agar Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (10 gr) (3 gr) (12 gr) Pada uji pigmen ini.apabila pada medium nutrient agar tidak terlihat warna selain warna koloni. bibulous paper.Meat extract . menyebabkan dinding sel pneumococcus mengalami lisis.Peptone from casein . biakan yang larut dalam bile akan tampak jernih sedangkan yang tidak larut dalam bile akan tampak keruh.o. Uji Pigmen Media yang digunakan Kompisisi Media : Nutrient Agar : . staining tray. p. Berikut adalah penjelasan tentang pewarnaan spora. hotplate.

Metode ini menggunakan malakit hijau sebagai pewarna primer (primer stain) dan safranin sebagai caounterstain. terminal B: rectangular.masing . dorman. central E: circular. Metode yang umum digunakan adalah Scaeffer-Fulton endospore stain.Gambar tentang berbagai bentuk spora sebagai berikut : A: oval. Hal ini disebabkan masing. terminal F: circular.72 jam pada media agar slant merupakan struktur yang bersifat resisten. Struktur ini tidak dapat diwarnai dengan metode pewarnan sederhana maupun gram. subterminal D: rectangular. dan berfungsi untuk melindungi lingkungan bakteri yang dari tidak menguntungkan. central G: inflated spore Pedoman yang digunakan oleh praktikan dalam mengidentifikasi spesies suatu sampel adalah pohon filogenik. terminal C: rectangular.Reagen yang dibutuhkan Endospora : Malachite green dan safranin Lama inkubasi untuk biakan : 48 .

Berikut skema pohon filogenik : .spesies memiliki jalur yang berbeda dalam proses pengidentifikasiannya.

maka dilakukan pewarnaan spora.Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya cocci . Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya cocci Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Micrococcus spp. 1c. 1b. dan Lactobacillus spp.Penjelasan tentang pohon filogenik sebagai berikut : Setelah praktikan dapat mengidentifikasi bakteri berdasarkan pewarnaan gram dan morfologi bakteri. Staphylococcus spp dan Streptococcus spp.Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya Bacilli Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Corynebacterium spp. maka dilakukan uji biokimia yaitu uji katalase.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka dapat disimpulkan sebagai berikut : 1a.

Saprophyticus.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Bila uji Mannitol menunjukkan negatif. dan Neisseria spp. 2b.Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Branhamella spp. Moraxella spp. maka dilakukan uji biokimia yaitu uji glukosa. Bila uji katalase menunjukkan positif.. Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya cocci Uji Katalase 2a. 1d. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Streptococcus spp.bovis.varians. 3b. M. Faecalis dan S. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya Bacilli Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Citrobacter spp.luteus. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. ..Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.epidermis. Bila uji katalase menunjukkan negatif. maka dilakukan uji mannitol. S... Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Klebsiella spp. dan Staphylococcus spp. Uji Mannittol 3a..5% NaCl Broth. maka dilakukan uji bile esculin. M. Enterobacter spp. Escherichia spp. Uji Bile Esculin 3c. maka dilakukan Uji Pigment. Bila uji Mannitol menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Staphylococcus aureus. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. Proteus spp. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Micrococcus spp. dan Pseudomonas spp. Bila uji Bile Esculin menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. maka dilakukan uji biokimia yaitu uji laktosa. maka dilakukan uji pada 6.

Bila uji Hemolysis menunjukkan negatif. Bila uji Pigment menunjukkan negatif.epidermis. Uji Fermentasi Glukosa 5a. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. maka dilakukan Uji Fermentasi Fruktosa. luteus. Saprophyticus dan S.pyogenes. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Uji Pigment 4a. 4d.mitis dan S. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. varians. Bila uji pada 6. Uji Hemolysis 4e. maka dilakukan Uji Hemolysis. Bila uji pada 6. S. Uji Fermentasi Fruktosa . Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah alpha hemolysis yaitu S.pneumoniae dan S. Bila uji Bile Esculin menunjukkan negatif.5% NaCl Broth 4c. 4b. Faecalis. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M.pneumoniae.5% NaCl Broth menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E.bovis. 5b. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.mitis. Bila uji Hemolysis menunjukkan positif. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka dilakukan Uji Bile Solubility. varians. Bila uji Pigment menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M.luteus dan M. Uji pada 6.pyogenes.3d. maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa. 4f. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.5% NaCl Broth menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S.

Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. 3b. Bila uji mannitol menunjukkan negatif. epidermis. Uji mannitol 3a. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka dilakukan uji katalase. .subtilis. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. mitis.pneumoniae. Bila uji Bile Solubility menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. 5d. 2b. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Corynebacterium spp. cercus. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. dan Lactobacillus spp. maka dilakukan uji mannitol. Bila uji katalase menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Corynebacterium spp. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B. maka dilakukan Uji Voges-Proskauer.. Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya Bacilli 2a Bila terdapat spora dalam sampel. Uji Bile Solubility 5e. Uji katalase 3c. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Bacillus spp.5c. saprophyticus. Bila uji mannitol menunjukkan positif. Megaterium dan B. 5b.Bila uji Bile Solubility menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B. Bila tidak ditemukan adanya spora. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat.

. maka dilakukan Uji Fermentasi Mannitol. 4f. Uji Fermentasi Glukosa 4e. maka kemungkinan bakteri yang ada . 4b. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. delbrueckii.fermentum. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B. Megaterium. Bila uji mannitol menunjukkan positif. Kutscheri. casei dan L. Bila uji katalase menunjukkan positif. Uji Reduksi Nitrat 4c. Bila uji Fermentasi Mannitol menunjukkan positif. Bila uji Fermentasi Mannitol menunjukkan negatif. 4d. xerosis.3d. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. Bila uji katalase menunjukkan positif. 5a. Bila uji katalase menunjukkan negatif. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif (hanya terbentuk asam). Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya cocci Uji Fermentasi Glukosa 4a. Bila uji mannitol menunjukkan positif. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif (terbentuk asam dan gas). Uji Voges-Proskauer dalam sampel adalah B. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa. Uji Fermentasi Mannitol. delbrueckii Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.subtilis. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Lactobaciillus spp. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. casei 5b.

Enterobacter spp. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Neisseria spp .Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Proteus spp. maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa Uji Produksi Indole 3a. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Citrobacter spp. Bila uji Fermentasi Laktosa menunjukkan negatif. 3c. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan negatif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Branhamella spp dan Moraxella spp. dan Pseudomonas spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Bila uji Fermentasi Laktosa menunjukkan positif. maka dilakukan Uji Produksi Indole .Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. 2b. Bila uji produksi indol menunjukkan positif. maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat . Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan negatif.catarrhalis 3d. Uji Reduksi Nitrat 3a.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan positif.. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan positif. 3b. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah N. Intermedius dan E.Untuk mengetahui .sicca .. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah N. maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B. mucosa . 2b. bovis Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya Bacilli Uji Fermenatasi Laktosa 2a. coli.2a. dan Klebsiella spp. Escherichia spp. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C.

maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. Pneumoniae. Bila uji Metyl Red menunjukkan positif. (I) 4d. maka dilakukan Uji Metyl Red . Uji Penggunaan Citrate 4a.. Aerogenes dan K. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. Bila uji Penggunaan Citrate menunjukkan negatif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Proteus spp. freundii dan K.Bila uji produksi indol menunjukkan negatif. 3b.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. dan Klebsiella spp. maka dilakukan Uji Penggunaan Citrate . coli.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Bila uji Penggunaan Citrate menunjukkan positif. Escherichia spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka dilakukan Uji Produksi Indole. Intermedius 4b.. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Pseudomonas spp. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. 3d.lebih detail tentang spesies sampel kita.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka dilakukan Uji Reduksi Nitrate. maka dilakukan Uji Produksi H2S. Uji Fermentasi Glukosa 3c.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif. Uji Metyl Red 4c. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif. ( I ) Uji Produksi Indole . maka dilakukan Uji aktivitas urease. Enterobacter spp. Bila uji Metyl Red menunjukkan negatif. freundii.ozaenae.

4h. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah K. Bila uji Produksi Indole menunjukkan positif. Bila uji Produksi Indole menunjukkan negatif.rettgeri. mirabilis dan P. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. Bila uji aktivitas urease menunjukkan negatif.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. Uji Produksi H2S( II ) 5e. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. maka dilakukan Uji aktivitas urease . Bila uji Produksi Indole menunjukkan positif.aeruginosa dan P.Bila uji Reduksi Nitrate menunjukkan positif. 5f. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah K.Bila uji Reduksi Nitrate menunjukkan negatif. Aerogenes. . Bila uji Produksi Indole menunjukkan negatif.rettgeri.mallei. inconstans.. vulgaris. 5d. freundii 5b. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. Uji Produksi H2S( I ) 5a.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Bila uji Produksi H2S menunjukkan positif. maka dilakukan Uji Produksi H2S. vulgaris dan P.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Bila uji aktivitas urease menunjukkan positif. Uji aktivitas urease( I ) 5c.fluorescens. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. Bila uji Produksi H2S menunjukkan negatif. Pneumoniae. ( II ) Uji Reduksi Nitrate 4g.ozaenae. maka dilakukan Uji Litmus Milk. ( II ) 4f.4e. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E.

Bila uji aktivitas urease menunjukkan negatif.aeruginosa yang mengalami peptonization 5j.Jarum ose .Alat : . 5h.Erlemeyer .Beker glass .Uji aktivitas urease( II ) 5g.Bila uji Litmus Milk menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. Alat dan Bahan : 1.fluorescens yang mengalami reaksi alkaline.Pipet . maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. III. Uji Litmus Milk 5i.Cawan petri . inconstans.Lampu spiritus .Bila uji Litmus Milk menunjukkan positif.Hotplate stirrer . Bila uji aktivitas urease menunjukkan positif.Objek glass . mirabilis.Tabung . maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P.

Membilas . 2.Nutrien Gelatin Broth .Medium Litmus Milk .Pewarnaan Gram: a. c. Membilas preparat secara hati-hati dnegan air tetes larutan karbolgentian violet (Gram I). membiarkan selama 3 menit.H2O2 3% .2.Menetesi preparat olesan bakteri yang telah difiksasi dengan beberapa dengan air.Safranin (Gram IV) .Barrit A dan Barrit B .Medium SIM Agar . Membiarkan selama 1 menit.Sampel bakteri (Sampel 1. 3) .Urea Broth .Medium TSA .Etanol 95% (Gram III) .Bahan : .Phenol Red Sucrose Broth .MRVP Broth .Phenol Red Dextrose Broth . Cara Kerja : 1. e.lahan dengan Gram III hingga tidak ada pewarna yang terlunturkan.Phenol Red Lactose Broth .Menetesi preparat dengan larutan lugol (Gram II) beberapa tetes.Simmon’s Citrate Agar . Membilas dengan air.Reagen kovac’s .Nitrate Broth IV. d.Crystal violet (Gram I) . Mencuci dengan larutan Gram III (alkohol 96%) dengan cara memiringkan preparat kemudian menetesi perlahan.Starch Agar . b.Gram’s iodine (Gram II) .

Mendiamkan selama 3 menit. Pembuatan Media untuk Stock Culture(Peremajaan) TSA slant (40 gr/L) -Menimbang TSA kemudian melarutkannya ke dalam aquades -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Litmus Milk Broth 2. -Memiringkan tabung agar terbentuk media slant 3. Membilas preparat dengan air. Menetesi preparat dengan larutan fuchsin (Gram IV) beberapa tetes. 2.Phenol Red Lactose Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red lactose broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest .Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis.Litmus Milk (100 gr/L) Cara pembuatan media : -Menimbang litmus milk kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave. Langkah inokulasi ke media : 1. Kemudian mengeringkan di udara atau dengan cara menyerap kelebihan air dengan tissue. Mengamati preparat di mikroskop dan mencatat hasilnya. g. menanam pada media tersebut.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C.Pembuatan Media untuk Uji Biokimia a.f. 3. h. b.

c. d.-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave. e. phenol red sucrose broth.Phenol Red Fructose Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red fructose broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi media dengan berbagai macam karbohidrat : phenol red lactose broth.Phenol Red Mannitol Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red mannitol broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave Langkah inokulasi ke media fermentasi : 1.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis.Menginkubasi selama 24 .SIM Agar Deep Tube (30 gr/L) -Menimbang SIM medium kemudian melarutkannya ke dalam aquadest . 2. menanam pada media – media pada bagian 1.48 jam pada suhu 370C.Phenol Red Glucose Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red glucose broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave e. dan phenol red dextrose broth. 3.

Menyiapkan tabung reaksi yang berisi SIM agar deep tubes 2. . 3.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis.Simmon Citrate Agar Slant (22.-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave. 3. Langkah inokulasi pada media : 1. 4.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C. menanam pada media tersebut.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C g.Untuk tes produksi Indol ditambahkan reagen Kovac 3-5 tetes pada medium yang telah diinkubasi.Urea Broth (38.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Urea Broth 2. menanam pada media SIM dengan menusukkan ke dalam agar.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Simmons citrate agar slants 2.5 gr/L) -Menimbang urea broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Mensterilkan campuran dengan memfiltrasinya -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung Langkah inokulasi pada media : 1.5 gr/L) -Menimbang SCA kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis. menanam pada media tersebut dengan cara menggores zig-zag pada bagian yang miring. f. -Memiringkan tabung agar terbentuk media slant Langkah inokulasi pada media : 1.

Untuk membuktikan adanya aktivitas katalase ditambahkan reagen H2O2 3% pada medium yang tlah diinkubasi.Nutrient Agar -Menimbang Nutrient Agar kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer kemudian diautoclave -Memasukkan campuran ke dalam cawan petri steril dan membiarkannya memadat. Langkah inokulasi pada medium : 1.Menginkubasi selama 24-48 jam pada suhu 370C i.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C 4.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C h.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis. . Langkah inokulasi pada medium : 1.3.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis. menanam pada media tersebut dengan cara menggores zig-zag pada bagian yang miring.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Nutrient Agar slant 2. menanam pada media tersebut dengan men-strict medium 3.Menyiapkan plate berisi TSA 2.Tryptycase Soy Agar (TSA) Plate (40 gr/L) -Menimbang medium TSA kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer kemudian diautoclave -Memasukkan campuran ke dalam cawan petri steril dan membiarkannya memadat. 3.

Pewarnaan gram E.Pewarnaan gram 1a.V.coli . Hasil Percobaan : 1.

Pewarnaan gram Proteus mirabilis .1b.Pewarnaan gram Staphylococcus epidermis 1c.

coli -Uji Laktosa -Uji Indol -Uji Citrat .Uji Biokimia E.Uji Biokimia 2.Uji Biokimia 2a.2.

Uji Biokimia Staphylococcus epidermis -Uji Katalase -Uji Mannitol -Uji Pigment .b.

Uji Biokimia Proteus mirabilis -Uji Laktosa .-Uji Fruktosa c.

-Uji Glukosa -Uji Indole -Uji Urea .

3. Tabel Hasil Percobaan 3a. Tabel Hasil Percobaan Staphylococcus epidermis Macam Uji Pewarnaan Gram Morfologi Aktivitas katalase Fermentasi mannnitol Pigment Fermentasi Fruktosa Hasil Uji positif coccus + + 3c. Tabel Hasil Percobaan Proteus mirabilis Macam Uji Pewarnaan Gram Morfologi Fermentasi laktosa Fermentasi glukosa Produksi Indol (SIM medium) Hasil Uji negative bacill + - . Tabel Hasil Percobaan E.coli Macam Uji Pewarnaan Gram Morfologi Fermentasi Laktosa Produksi Indol (SIM medium) Penggunaan sitrat Hasil Uji negative coccobacill + + - 3b.

Pembahasan 1. Hal ini disebabkan oleh. Bakteri tersebut berwarna merah setelah diwarnai dengan pewarnaan gram.Pewarnaan Gram & Morfologi Hasil uji morfologi pada sampel A menunjukkan bahwa bakteri pada sampel A termasuk ke dalam golongan bakteri gram negatif dengan bentuk coccobacill.Sampel A 1a.Aktivitas Urease + VI. lapisan lipopolisakarida pada bakteri .

Oleh karena itu. 1b. Oleh karena itu. dari hasil pewarnaan gram dan morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel A merupakan bakteri gram negatif dan bentuknya coccobacill sehingga untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi laktosa.Pada uji ini.Uji Fermentasi Laktosa Uji Fermentasi Laktosa ini dilakukan pada medium phenol red lactosa broth. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji Produksi Indol. Pada uji ini.ini lebih sedikit sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya akan luntur bersama dengan lapisan lipopolisakaridanya ketika dicucci dengan gram III (alkohol) sehingga yang tersisa hanya warna merah dari safranin yang merupakan pewarna tandingan. bakteri sampel A tidak dapat memfermentasi laktosa. Hal ini berarti bakteri sampel A memiliki enzim triptofanase untuk memecah triptofan sesuai dengan reaksi berikut : . Hasil uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik.Uji Produksi Indol Uji Produksi Indol ini dilakukan pada medium SIM dengan bantuan penambahan reagen Kovac akan terlihat cincin pink pada medium. 1c. bakteri sampel A menunjukkan hasil positif yaitu terbetuk cincin pink setelah penambahan reagen Kovac.

untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji penggunaan citrat. 2. Oleh karena itu. Hal ini berarti bakteri sampel A tidak memiliki enzim citrase untuk mengubah sitrat menjadi oksaloasetat dan asam asetat yang selanjutnya akan dirubah menjadi asam piruvat dan CO2 .Pewarnaan Gram & Morfologi Hasil uji morfologi pada sampel B menunjukkan bahwa bakteri pada sampel B termasuk ke dalam golongan bakteri gram positif dengan bentuk coccus. Pada uji ini.coli.Uji Penggunaan Citrat Uji penggunaan sitrat menggunakan medium Simmon’s Citrate Agar yang mengandung sitrat sebagai satu – satunya sumber karbon.. Oleh karena itu. bakteri sampel A menunjukkan hasil negatif yang ditandai dengan tidak berubahnya warna medium dari hijau menjadi biru.Sampel B 2a. . 1d. dapat disimpulkan berdasrkan pohon filogenik bahwa bakteri sampel A adalah E.

Uji Fermentasi Mannitol Uji Fermentasi Mannitol ini dilakukan pada medium phenol red mannitol broth. Hasil uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi mannitol.Pada uji ini. bakteri sampel B tidak dapat memfermentasi mannitol.Uji Pigment . Oleh karena itu. Hasil positif tersebut ditunjukkan dengan adanya gelembung – gelembung gas pada permukaan koloni ketika ditetesi dengan H2O2 3%.Bakteri tersebut berwarna biru-ungu setelah diwarnai dengan pewarnaan gram. Hal ini berarti bakteri sampel B dapat memecah hidrogen peroksida menjadi air dan karbondioksida sesuai reaksi berikut Oleh karena itu.Uji Aktivitas Katalase Uji aktifitas katalase dilakukan dengan menggunakan medium TSA dan selanjutnya dilakukan penambahan reagen berupa H2O2 3%. 2b. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji pigment. Hal ini disebabkan oleh. 2d. Oleh karena itu. 2c. lapisan lipopolisakarida pada bakteri ini cukup tebal sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya tidak bisa luntur ketika dicuci dengan gram III (alkohol) sehingga yang tersisa adalah warna biru-ungu oleh reagen kristal-violet. dari hasil pewarnaan gram dan morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel B merupakan bakteri gram positif dan bentuknya coccus sehingga untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji aktivitas katalase. Bakteri sampel B menunjukkan hasil positif pada uji ini yang artinya bakteri sampel B memiliki enzim katalase.

Oleh karena itu. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi fruktosa 2e.Sampel C 3a. dapat disimpulkan berdasarkan pohon filogenik bahwa bakteri sampel B adalah Staphylococcus epidermis. lapisan lipopolisakarida pada bakteri ini lebih sedikit sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya akan luntur bersama dengan lapisan lipopolisakaridanya ketika dicucci dengan gram III (alkohol) sehingga yang tersisa hanya warna merah dari safranin yang merupakan pewarna tandingan. dan juga adanya gas.Uji Fermentasi Fruktosa Uji Fermentasi Fruktosa ini dilakukan pada medium phenol red fructosa broth. Hal ini disebabkan oleh. Hal itu berarti hasil uji pigment adalah negatif. Oleh karena itu. Bakteri tersebut berwarna merah setelah diwarnai dengan pewarnaan gram.Oleh karena itu. bakteri sampel B dapat memfermentasi fruktosa sehingga hasilnya positif. Hasil uji positif pada fermentasi laktosa ditandai dengan berubahnya warna medium menjadi kuning yang disebabkan oleh adanya produk akhir fermentasi yang bersifat asam. Pada uji ini. 3.Pada uji ini.Uji Fermentasi Laktosa .Pewarnaan Gram & Morfologi Hasil uji morfologi pada sampel C menunjukkan bahwa bakteri pada sampel C termasuk ke dalam golongan bakteri gram negatif dengan bentuk bacill. dari hasil pewarnaan gram dan morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel C merupakan bakteri gram negatif dan bentuknya bacill sehingga untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi laktosa.Uji Pigment ini dilakukan pada medium nutrient agar. bakteri sampel B tidak menampakkan warna yang lain selain warna koloni yaitu putih mengkilap. 3b.

Hasil uji positif pada fermentasi laktosa ditandai dengan berubahnya warna medium menjadi kuning yang disebabkan oleh adanya produk akhir fermentasi yang bersifat asam.Uji Fermentasi Glukosa Uji Fermentasi Glukosa ini dilakukan pada medium phenol red glukosa broth.Hal ini berarti bakteri sampel A tidak memiliki enzim triptofanase untuk memecah triptofan.Hal ini menandakan bahwa Ketika substrat urea dipisahkan dari . Oleh karena itu. Pada uji ini. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji aktivitas urease.Uji Produksi Indol Uji Produksi Indol ini dilakukan pada medium SIM dengan bantuan penambahan reagen Kovac akan terlihat cincin pink pada medium. bakteri sampel C berubah warna menjad deep pink yang menandakan bahwa uji aktivitas urease positif. bila hasilnya positif. dan juga adanya gas. Oleh karena itu. bakteri sampel C dapat memfermentasi glukkosa sehingga hasilnya positif. Oleh karena itu. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji Produksi Indol. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi glukosa.Uji aktivitas urease. Uji aktivitas urease. 3e. bakteri sampel C tidak dapat memfermentasi laktosa. 3d. 3c. Pada uji ini. Akan tetapi. Pada uji ini. Hasil uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. pada bakteri sampel C tidak menunjukkan terbentuknya cicncin pink setelah penambahan reagen Kovac sehingga hasilnya negatif. ini dilakukan pada medium urea broth yang mengandung pH indicator phenol red.Uji Fermentasi Laktosa ini dilakukan pada medium phenol red lactosa broth.

produknya. Selain itu. Benjamin Cummings. Staphylococcus epidermis dan Proteus mirabilis. seventh edition. Berdell R. yang menjadi pedoman utama dalam pengidentifkasian spesies adalah penggunaan pohon filogenik.edu/~cbwilso/250cho. San Francisco. San Francisco. Gerard J. Hal in disebabkan karena masing – masing spesies memiliki jalur yang berbeda baik dalam pewarnaan gram/morfologi atau metabolismenya. Funke. 2005.wsu. James G.slic2.sampel kami berurutan dari adalah Escherichia coli. Benjamin Cummings. Microbiology-An Introduction. VIII. Kegagalan perubahan warna menjadi deep pink membuktikan reaksi negatif.Case. 2001.edu:82/hurlbert/micro101/pages/101lab9.adanya ammonia membuat lingkungan alkaline yang menyebabkan phenol red berubah menjadi deep pink. Hal ini menunjukkan reaksi positif terhadap adanya urease. Kesimpulan : Dalam melakukan identifikasi spesies dilakukan uji morfologi dan uji biokimia. Daftar Pustaka Tortora. “Microbiology – A Laboratory Manual”. Natalie Sherman. Christine L.htm http://www. VII. Oleh karena itu. dapat disimpulkan berdasarkan pohon filogenik bahwa bakteri sampel C adalah Proteus mirabilis.siue. Reaksinya sebagai berikut : Oleh karena itu. Cappuccino.html . http://www.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful