IDENTIFIKASI SPESIES MIKROORGANISME SAMPEL

I. Tujuan Percobaan : Mampu menggunakan teknik pewarnaan, pengkulturan, dan uji biokimia yang telah didapat untuk menentukan genus kultur bakteri yang belum diketahui. II. Dasar Teori :

Spesies berasal dari bahasa Latin species yang merupakan tingkatan dalam taksonomi yang terkecil, biasanya digunakan untuk mengklasifikasi organisme baik yang hidup maupun organisme yang fosil. Dalam biologi, species adalah salah satu bentuk pengelompokan dalam klasifikasi makhluk hidup.. Dalam sistem tatanama binomial, nama suatu spesies makhluk hidup terdiri atas dua kata: nama genusnya (diawali dengan huruf kapital) dan nama penunjuk spesiesnya. Misalnya, dari gambar di samping,Panthera pardus, Nama Panthera merupakan nama genus atau marga sedangkan pardus merupakan nama species. Berikut penjelasan singkat mengenai 3 spesies sampel yang kelompok kami temukan. Ketiga spesies sampel kami antara lain adalah E. coli, Staphylococcus epidermis dan Proteus mirabilis. 1. E.coli Escherichia coli, atau biasa disingkat E. coli, adalah salah satu jenis spesies utama bakteri gram negatif. Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh Theodor Escherich ini hidup pada tinja, dan dapat menyebabkan masalah kesehatan pada

manusia, seperti diare, muntaber dan masalah pencernaan lainnya. E. coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika. Biasa digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan. E. coli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah dalam penanganannya. 2. Staphylococcus epidermis Staphylococcus epidermis merupakan bakteri non-motil, jenis coccus grampositive cocci, dan berbeda dengan Staphylococcus aureus, bakteri ini tidak memiliki enzim koagulase. Bakteri ini merupakan bakteri yang patogen dan aktif dalam aliran darah melalui luka, jarum dll. Infeksi dari bakter in berakibat pembengkakan pada daerah yang terinfeksi. 3.Proteus mirabilis Proteus mirabilis merpakan bakteri gram negative dan bakteri fakultatif anaerob. Bakteri ini memiliki kemampuan motalitas dan aktivitas urease. P.mirabilis menyebabkan 90% infeksi yang disebabkan oleh jenis Proteus. P.mirabilis dapat menggunakan urea dan citrate untuk produksi energi. Bakteri ini dapat memproduksi gas hydrogen sulfide dan membentuk zona bening pada media. P.mirabilis ini motil, memiliki peritrichous flagella yang diketahui sebagai penyebab pergerakan. Bakteri ini pada umumnya ditemukan pada intestinal manusia. P.mirabilis tidak pathogen pada guinea pigs atau ayam. Uji uji biokimia pada P.mirabilis adalah sebagai berikut : *Indole negative dan reduksi nitrat positif (tidak ada gas yang diproduksi) *Metyl red positif dan Voges-Proskauer negatif *Catalase positif and Cytochrome Oxidase negatif Untuk mengidentifikasi spesies suatu bakteri, praktikan perlu melakukan serangkaian uji yang berurutan sesuai dengan hasil percobaan yang telah ada. Berikut adalah penjelasan berbagai uji yang harus dilakukan dalam mengidentifikasi spesies sampel : 1.Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram adalah suatu metode yang digunakan untuk membedakan mikroorganisme berdasarkan susunan & struktur dinding sel mikroorganisme. Metode pewarnaan gram membutuhkan 4 jenis reagen yaitu : crystal gentian violet (Gram I), iodine (Gram II), alkohol 95% (GramIII), dan saphranin (Gram IV). Dengan menggunakan metode pewarnaan gram, bakteri dapat digolongkan menjadi 2 kelompok, yaitu : bakteri gram (+) yang akan berwarna biru-ungu dan bakteri gram (-) yang berwarna merah.

Staphylcuococs (+)

E. coli (-)

Beberapa fungsi reagen dalam pewarnaan gram yang menentukan spesies sampel termasuk dalam gram (+) atau gram (-) adalah sebagai berikut: Pemberian kristal fiolet berfungsi untuk mewarnai semua sel. (baik Iodin berfungsi sebagai mordan. Di dalam sitoplasma iodin gram negatif maupun positif) membentuk komplek dengan kristal fiolet. Pembentukan kompleks mengakibatkan sel berwarna biru tua. Pemberian alkohol memiliki 2 fungsi: Pada gram positif alkohol mengakibatkan peptidoglikan terdehidrasi sehingga ukuran porinya mengecil. Ini mengakibatkan kristal violet tidak dapat keluar dari sitoplasma. Pada gram negatif alkohol mencuci dinding sel dan meninggalkan lubang kecil pada peptidoglikan. Ini mengakibakan kristal violet tercuci keluar dan sel menjadi tidak berwarna.

Safranin berfungsi sebagai couter staining. Safranin akan

memberi warna pada gram negatif sehingga gram positif dan negatif akan terlihat berbeda secara jelas di bawah mikroskop. Dari hasil pewarnaan gram, selain dapat membedakan mikroorganisme berdasarkan susunan & struktur dinding sel mikroorganisme, praktikan juga dapat mengidentifikasi morfologi dari bakteri tersebut. Berikut gambar tentang berbagai bentuk morfologi dari bakteri sebagai berikut :

2.Uji Biokimia Biokimia adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui metabolisme dan reaksi yang dijalankan oleh suatu mikroorganisme. Jenis jenis uji biokimia untuk mengidentifikasi spesies antara lain : a.Reaksi Litmus Milk Media yang digunakan Komposisi Media : litmus broth : - Litmus - Skim milk powder - Sodium sulfite Lama inkubasi : 24 48 jam pada 370C (0,5 gr) (100 gr) (0,5 gr)

Penyusun susu terbesar yang digunakan sebagai dasar uji biokimia dalam media litmus milk adalah laktosa, protein susu yaitu kasein, lacto-albumin dan lactoglobulin.Untuk melihat adanya perubahan metabolisme yang diproduksi dalam medium, digunakan pH indicator yaitu oxidase-reduction

indicator litmus. Indicator ini akan menyatu dalam medium. Saat ini,litmus milk merupakan medium yang baik untuk mikroorganisme yang dapat mencerna substrat milk, tergantung dari komplemen enzimatik bakteri tersebut. Beberapa perubahan biokimia dalam litmus milk : Fermentasi Laktosa Organisme mampu menggunakan laktosa sebagai sumber karbon untuk produksi energi, dengan menggunakan induksi enzim -galactosidase. Degradasi laktosa dirumuskan sebagai berikut:

Adanya asam laktat dapat dengan mudah dideteksi karena litmus bewarna ungu pada pH netral dan berubah menjadi merah muda ketika medium menjadi asam yaitu pada pH sekitar 4. Adanya gas + H2
.

Produk akhir pada fermentasi laktosa adalah CO2

Adanya gas

ini mungkin dapat dilihat sebagai pemisahan curd atau pembelahan dalam curd sebagai akibat adanya gas yang naik ke permukaan. Reduksi Litmus Fermentasi adalah proses anaerobic yang meliputi biooksidasi yang terjadi karena tidak ada molekul oksigen. Oksidasi ini mungkin akan terlihat sebagai perpindahan hydrogen (dehydrogenation) dari substrat.Karena ion hidrogen tidak dapat dalam bentuk bebas/melayanglayang,hydrogen memerlukan akseptor elektron yang dapat mengikat ion hydrogen jika hal tersebut tidak terjadi maka reaksi reduksi-oksidasi tidak akan berjalan dan produksi energy tidak dapat dihasilkan. Pada tes litmus milk, litmus berperan sebagai akseptor. Saat berada dalam kondisi oksidasi, litmus berwarna ungu; ketika litmus menerima

hydrogen dari substrat, litmus akan tereduksi dan berubah menjadi putih atau warna putih susu. Oksidasi laktosa ini memproduksi asam laktat, asam butirat, gas CO2 dan gas H2. Lactose Glucose Pyruvic acid -Lactic acid -Butyric acid -CO2 + h2

Gas hydrogen dikenal sebagai hydrogen litmus acceptor, yang menyebabkan perubahan menjadi putih dan menandakan bahwa laktosa tereduksi. Terbentuknya Curd Aktivitas biokimia dari mikroorganisme yang berbeda ditumbuhkan pada litmus milk menghasilkan produksi 2 tipe curd (clots) yang berbeda. Curd yang terbentuk bergantung pada mekanisme biokimia yang membentuk curd tersebut Ada 2 jenis curd yang mungkin terbentuk yaitu : -Acid curd Asam laktat atau asam organic lain menyebabkan pengendapan milk protein casein sebagai calcium caseinate menjadi bentuk gumpalan yang tidak larut. -Rennet curd Beberapa organisme menghasilkan rennin, enzim yang berperan mengubah casein menjadi bentuk paracasein, selain itu adanya calcium ion diubah menjadi calcium paracaseinate dan membentuk gumpalan yang tidak larut. Tidak seperti acid curd, curd jenis ini berupa gumpalan semisolid yang lembut. Gumpalan ini akan mengalir perlahan saat tabung dimiringkan. Proteolysis (Peptonization) Ketidakmampuan beberapa mikroorganisme untuk menghasilkan energi melalui jalur fermentasi laktosa menandakan bahwa mikroorganisme tersebut harus menggunakan sumber nutrisi lainnya sebagai protein untuk menghasilkan energi. Dengan menggunakan enzim proteolitik,

organisme menghidrolisis milk protein, terutama casein, menjadi bentuk dasarnya yaitu asam amino. Proses pencernaan protein disertai dengan perubahan sejumlah besar ammonia yang dihasilkan dalam medium dengan alkaline pH. Litmus berubah warna menjadi lapisan ungu yang berada di atas/ permukaan dari tabung. reaksi sedangkan bagian bawahnya kehilangan strukturnya dan membentuk cairan kecoklatan Reaksi Alkaline Reaksi alkaline dibuktikan ketika warna pada medium tidak berubah atau berubah menjadi biru. Reaksi ini mengindikasikan partial degradation dari casein menjadi rantai polipeptida yang lebih pendek, dengan disertai pelepasan produk akhir alkaline yang menyebabkan perubahan warna. Beberapa kemungkinan hasil yang diperoleh dari uji Litmus Milk :

Keterangan gambar :A. Acid/Reduction/Curd B. Reduction/Curd (arrow denotes gas pocket) C. Uninoculated Control D. Acid Formation E. Proteolysis of casein F. Alkaline Reaction b.Fermentasi Karbohidrat Media yang digunakan Komposisi Media : phenol red lactose, fructose, glucose, mannitol broth : - Casein peptone (10 gr)

-Lactose/fructose/glucose/mannitol - Sodium chloride - Phenol red Lama inkubasi : 24 - 48 jam pada 370C

(5 gr) (5 gr) (0,018 gr)

Kebanyakan organisme memperoleh energi melalui suatu urutan reaksi enzimatis tertentu dan terintegrasi,yang mengarah pada biooksidasi substrat, seringkali karbohidrat. Organisme menggunakan karbohidrat secara berbeda, tergantung pada komplemen enzimnya. Beberapa organisme mampu memfermentasikan gula seperti glukosa secara anaerob, sedangkan yang lain dengan aerob. Anaerob fakultatif mampu melakukan keduanya sedangkan beberapa organisme justru tidak mampu mengoksidasi glukosa secara anareob maupun aerob. Pada fermentasi, substrat-substrat seperti karbohidrat dan alkohol mengalami disimilasi secara anaerob dan menghasilkan asam organik (sebagi contoh : laktat, format, atau asam asetat) yang disertai adanya gas seperti hydrogen atau karbondioksida. Fermentasi digambarkan dengan baik lewat degradasi glukosa melalui jalur Embden-Meyerhof, yang dikenal dengan jalur glikolisis. Satu mol glukosa dikonversi menjadi dua mol asam piruvat, yang mana merupakan senyawa intermediet utama yang dihasilkan dari degradasi glukosa. Hasil metabolisme asam piruvat lebih lanjut tidak sama untuk semua organisme, dan variasi produk akhir menunjukkan kemampuan fermentasi mereka yang berbeda. Degradasi fermentasi secara anaerob mengambil tube broth fermentasi yang mengandung tabung Durham, yang berguna untuk mendeteksi gas yang dihasilkan. Medium fermentasi karbohidrat mengandung : -Nutrient broth untuk pertumbuhan semua organisme -Karbohidrat spesifik yang berfungsi sebagai substrat untuk determinasi kemampuan fermentasi organisme-organisme. -pH indicator phenol red, yang merah pada pH netral (7) dan kuning bila sedikit asam (pH 6,8). menjadi

Inkubasi dilakukan dalam waktu 48 jam. Inkubasi yang berlebih dapat menutupi reaksi produksi asam oleh produksi alkali yang disebabkan kegiatan enzimatik pada substrat, selain karbohidrat. Setelah inkubasi, karbohidrat yang telah difermentasi dengan hasil sampingan asam akan menyebabkan phenol red menjadi kuning, yang mengindikasikan reaksi positif. Pada beberapa kasus, produksi asam disertai produksi gas (CO2) yang terlihat sebagai gelembung pada tabung Durham. Kultur yang tidak mampu memfermentasi substrat karbohidrat tidak akan merubah warna indicator, dan tabung tetap warna merah, serta tidak ada gas pada tabung Durham. Ini merupakan reaksi negatif. Kekurangan fermentasi karbohidrat oleh beberapa organisme tidak dapat diartikan sebagai ketiadaan pertumbuhan. Organisme menggunakan nutrien lain dalam medium sebagai sumber energi. Di antara nutrien tersebut adalah pepton yang ada pada nutrient broth. Pepton dapat didegradasi oleh enzim mikrobial menjadi asam amino yang secara enzimatis dikonversi menjadi asam ketoamino lewat deaminasi oksidatif. Asam ketoamino tersebut lalu dimetabolisme lewat siklus Krebs untuk menghasilkan energi. Reaksi tersebut membebaskan ammonia hidroksida (NH4OH) dan menghasilkan lingkungan alkalin, yang menimbulkan warna merah tua. c.Produksi H2S Media yang digunakan Komposisi Media : SIM agar deep tubes : - Bacteriological agar - Ferric ammonium sulfate - Casein peptone - Meat peptone - Sodium thiosulfate Lama inkubasi Terdapat dua jalur : 24 48 jam pada 370C fermentasi utama yang mana beberapa (3,5 gr) (0,2 gr) (20 gr) (6,1 gr) (0,2 gr)

mikroorganisme mampu memproduksi hydrogen sulfide (H2S) :

Jalur I : gas H2S dapat diproduksi oleh reduksi (hidrogenasi) sulfur

organic yang ada di asam amino sistein, yang mana merupakan komponen peptone yang terdapat pada medium. Pepton tersebut didegradasi oleh enzim microbial menjadi asam amino, meliputi sistein. Asam amino ini dengan keberadaan sistein desulfurase, kehilangan atom sulfur dan direduksi dengan penambahan hydrogen dari air untuk membentuk H2S.

Jalur II : gas H2S dapat dihasilkan dari reduksi senyawa sulfur

anorganik seperti thiosulfat (S2O32-), sulfat (SO42-), atau sulfit (SO32-). Medium yang mengandung sodium thiosulfat, dengan mikroorganisme tertentu dapat direduksi menjadi sulfite dengan pembebasan H2S. Atom sulfur bertindak sebagai akseptor hydrogen selama oksidasi senyawa anorganik seperti ditunjukkan sebagai berikut :

Pada percobaan digunakan SIM medium yang mengandung peptone dan sodium thiosulfat sebagai substrat sulfur, ferro sulfat (FeSO4) sebagai indicator H2S, dan Agar untuk membuat medium menjadi semisolid dan mendorong respirasi anaerob. Ferrous ammonium sulfat gas, membentuk endapan tak larut ferrous sulfide berwarna hitam yang dapat dilihat di sepanjang tusukan inokulasi, yang mengindikasikan terbentuknya H2S. Ketiadaaan endapan menunjukkan reaksi negative. SIM agar juga dapat digunakan untuk mendeteksi motilitas organisme. Motilitas disadari saat

pertumbuhan kultur dari organisme berflagellata tidak sesuai dengan garis inokulasi. Pertumbuhan organisme nonmotil sesuai dengan garis inokulasi ditunjukkan sebagai berikut :

d.Reduksi Nitrat Media yang digunakan Kompisisi Media :Nutrient Agar : - Peptone from casein - Meat extract - Agar Reagen yang diperlukan Lama inkubasi (10 gr) (3 gr) (12 gr)

:Solution A (asam sulfanilat),Solution B (naphthylamine) dan bubuk Zn. :24 48 jam pada 370C

Reduksi nitrat oleh beberapa mikroorganisme aerobik dan fakultatif anaerobik terjadi dengan adanya molekul oksigen yaitu proses anaerobik. Pada respirasi organisme anaerobic merupakan proses oksidatif karena itu

sel menggunakan substrat inorganic seperti nitrat (NO3- ) atau sulfat (SO42-) untuk suplai oksigen yang kemudian menjadi akseptor hydrogen akhir selam pembentukan energi. Perubahan nitrat menjadi nitrit dapat dilihat dari reaksi di bawah ini: Nitrat NO3 + 2H + 2e Nitrat
+ -

Reduktase

NO2- + Nitrit

H2O Air

Hydrogen electron

Beberapa organisme mempunyai kapasitas enzimatik untuk mengurangi jumlah nitrit menjadi ammonia (NH3+) atau molekul nitrogen (N2). NO2Nitrit 2NO3- + 12H+ + 10eNitrat NH3+ Ammonia N2 + 6H2O Gas Nitrogen

Reduksi nitrat dapat diterangkan dengan mengkultivasi organisme dalam medium nitrat broth. Pada dasarnya,medium mengandung nutrient broth bersupplemen 0,1% kalium nitrat (KNO3) sebagai substrat nitrat. Dapat ditambahkan agar medium menjadi semisolid yaitu dengan penambahan 0,1% agar. Kondisi agar yang semisolid akan menyebabkan difusi oksigen ke dalam medium menjadi sedikit sehingga bakteri anaerob akan melakukan reduksi nitrat Setelah kultur diinkubasi, kemampuan organisme untuk mengurangi nitrat atau nitrit dapat dibuktikan dengan penambahan 2 reagen: Larutan A yaitu asam sulfanilat, diikuti dengan pemberian Larutan B yaitu -naphthylamine. Adanya proses reduksi dengan penambahan Larutan A dan B akan menghasilkan warna cherry red. Nitrat NO3Reduktase NO2-

Kultur yang tidak memproduksi perubahan warna seperti yang tertera di atas memiliki 2 kemungkinan : *Nitrat tidak direduksi oleh organisme, atau *Organisme mempunyai semacam potensi enzim nitrate reductase yaitu nitrat secara cepat direduksi melalui nitrit menjadi ammonia atau bahkan menjadi molekul nitrogen. Untuk membuktikan ada tidaknya nitrat yang direduksi melalui terbetuknya nitrite,bubuk besi ditambahkan sedikit ke kultur yang telah diberi Larutan A dan B. Besi mereduksi nitrat menjadi nitrit. Bila ada perubahan menjadi warna merah maka membuktikan nitrat tidak direduksi menjadi nitrit oleh organisme. Jika nitrat tidak direduksi, reaksi reduksi nitrat dikatakan negatif. Bila setelah penambahan besi tidak ada perubahan warna, mak nitrat pada medium direduksi melalui nitrit menjadi ammonia dan gas nitrogen. Ini adalah reaksi yang positif.

e.Produksi Indol Media yang digunakan Kompisisi Media : SIM agar deep tubes : - Bacteriological agar - Casein peptone - Meat peptone - Sodium thiosulfate Reagen yang diperlukan Lama inkubasi : Kovacs reagent : 24 48 jam pada 370C (3,5 gr) (20 gr) (6,1 gr) (0,2 gr) - Ferric ammonium sulfate (0,2 gr)

Triptofan adalah asam amino esensial yang dapat mengalami oksidasi melalui beberapa aktifitas enzimatik bakteri. Konfersi triptofan menjadi produk metabolit dilakukan oleh enzim triptofanase. Reaksinya sebagai berikut :

Kemampuan hidolisis triptofan dan produksi indol bukan karakteristik mikroorganisme dan oleh sebab itu dapat berfungsi sebagai penanda biokimia. Dalam uji ini digunakan agar SIM (Sulphite Indole Motility) yang mengandung substrat trytophan. Keberadaan indol dideteksi dengan menambahkan reagen Kovac yang menyebabkan lapisan reagen yang ada di atas agar deep menjadi berwarna merah ceri. Indol diekstrak dari medium ke lapisan reagen oleh komponen butyl alcohol yang diasamkan dengan asam klorida (HCl) dan membentuk kompleks dengan pdimetilaminobenzaldehid yang menghasilkan warna merah ceri. Kultur yang menghasilkan lapisan reagen yang berwarna merah ceri setelah ditambah dengan reagen Kovac mengindikasikan indol positif. Ketidakhadiran warna merah ceri mengindikasikan bahwa substrat tryptophan tidak terhidrolisis dan mengindikasikan reaksi indol negative. f.Tes metil merah (MR) Media yang digunakan Komposisi media : MR-VP broth : - Peptone mixture - Potassium phosphate - Dextrose Reagen yang diperlukan : Metyl red indicator (7 gr) (5 gr) (5 gr)

Lama inkubasi

: 24 48 jam pada 370C

Glukosa heksosa adalah substrat utama yang dioksidasi oleh seluruh organisme enteric untuk produksi energi. Produk akhir dari reaksi ini dapat bervariasi tergantung reaksi enzimatik spesifik yang ada dalam bakteri. Pada uji ini indicator methyl red mendeteksi keberadaan konsentrasi asam yang besar pada hasil akhir dengan media MRVP Agar. Meskipun semua mikroorganisme enteric memfermentasi glukosa dengan menghasilkan asam organik, uji ini berguna dalam pemisahan E.coli dan E.aerogenes. Kedua organisme ini menghasilkan produk akhir asam organik selama masa inkubasi awal. Derajat keasaman yang rendah (pH = 4) distabilisasi dan diatur oleh E.coli pada akhir masa inkubasi. Selama inkubasi selanjutnya, E.aerogenes secara enzimatik mengubah asam ini ke hasil akhir yang tidak asam seperti 2,3-butanadiol dan acetoin (asetilmetil-karbinol) yang menghasilkan pH sekitar 6. Reaksinya sebagi berikut: Glukosa + H2O Asam laktat Asam Asetat Asam format + CO2 + H2 (pH 4.0)

Uji + ditunjukkan dengan warna media yang menjadi merah. Indikator metal red pada pH sekitar 4 akan berwarna merah yang mengindikasikan bahwa hasil uji positif. Pada pH sekitar 6 masih tetap mengindikasikan keberadaan asam tapi pada konsentrasi ion hydrogen yang lebih rendah. Indikator berubah warna jadi kuning dan mengindikasikan hasil uji yang negatif. Produksi dan deteksi produk akhir non asam dari fermentasi glukosa E. areogenes diperkuat dengan uji Voges-Proskauer. g.Tes Voges-Proskauer Media yang digunakan Komposisi media : MR-VP broth : - Peptone mixture - Potassium phosphate (7 gr) (5 gr)

CH3 C CH CH3 O OH +

OH 40% KOH Oksidasi

CH3 C C O O + C

NH2 NH NH-R (5 gr) Kompleks berwarna Pink

CH - Dextrose 3

Reagen yang diperlukan Asetilmetilkarbinol -naftol Lama inkubasi

: Barritts reagent A dan B Diasetil Guanidin 0 : 24 48 jam pada 37 C

Uji Voges-Proskauer menentukan Reaksi Asetilmetilkarbinol dengan reagen Barrit kemampuan beberapa organisme untuk memproduksi produk akhir non asam atau netral seperti asetilmetil -karbinol yang berasal dari metabolisme glukosa. Reagen yang digunakan dalam uji ini adalah reagen Barrit yang mengandung campuran -naphthol alkoholik dan larutan 40% potassium hydroxide (KOH). Deteksi acetylmethylcarbinol membutuhkan hasil akhir ini untuk dioksidasi menjadi senyawa diasetil. Reaksi ini terjadi pada keberadaan katalis -naphthol dan grup guanidine yang ada pada peptone pada medium MRVP. Sebagai hasil, kompleks pink terbentuk, sebagai warna mawar pada medium. Keberadaan warna mawar tua pada kultur setelah penambahan reagen Barritt mengindikasikan keberadaan acetylmethylcarbinol dan merupakan hasil positif, dan bila tidak ada berarti hasilnya negatif. CH3 OH C O CH CH3 Asetilmetilkarbinol -naftol Reaksi Asetilmetilkarbinol dengan reagen Barrit h.Penggunaan Sitrat Media yang digunakan Komposisi media : Simmons citrate agar slant : - ammonium dihydrogen phosphate (1 gr) - dipotassium hydrogen phospate (1 gr) - sodium chloride - sodium citrate - magnesium sulfate (5 gr) (2 gr) (0,2 gr) OH + 40% KOH Oksidasi C CH3 Diasetil O CH3 C O + C

NH2 NH NH-R Guanidin Kompleks berwarna Pink

- bromthymol blue - bacterological agar Lama inkubasi : 24 48 jam pada 370C

(0,08 gr) (15 gr)

Pada ketiadaan glukosa atau laktosa yang dapat difermentasi, beberapa mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai sumber karbon untuk produksi energi mereka. Kemampuan ini tergantung pada keberadaan enzim sitrat permease yang memfasilitasi transport sitrat dalam sel. Sitrat merupakan senyawa intermediet utama dalam sel dan diproduksi dengan kondensasi asetil aktif dengan asam oksalaasetat. Sitrat, dengan keberadaan enzim sitrase, menghasilkan asam oksalaasetat dan asetat. Produk tersebut kemudian secara enzimatis diubah menjadi asam piruvat dan karbondioksida. Selama reaksi, medium menjadi alkalin-karbondioksida yang dihasilkan berkombinasi dengan sodium dan air membentuk sodium carbonate, sebuah produk alkalin. Kehadiran sodium carbonate mengubah indicator bromthymol biru pada medium dari hijau menjadi biru tua Prussia. Sitrat positif ditunjukkan pertumbuhan pada permukaan slant yang diikuti warna biru, sedangkan negatif bila tanpa pertumbuhan dan medium tetap berwarna hijau. 1. COOH CH2 HO C CH2 COOH C itrate COOH COOH Citras C O e + CH2 COOH COOH Oxaloaseti c acid CH3 COOH COOH C O + CO2 CH3 COOH Pyruvic acid Excess carbon dioxide

Acetic acid

2.

CO2 + 2Na+ + H2O Na2CO3 Alkaline pH perubahan warna dari hijau ke menjadi biru

i.Aktifitas urease Media yang digunakan Komposisi media : Urea broth : - dipotassium phosphate - phenol red - urea - yeast extract Lama inkubasi : 24 48 jam pada 370C (9,5 gr) (0,1 gr) (20 gr) (0,1 gr)

- monopotassium phosphate (9,1 gr)

Urease yang diproduksi oleh beberapa mikroorganisme merupakan enzim yang secara khusus membantu mengidentifikasi Proteus vulgaris. Walaupun organisme lain mungkin menghasilkan urease, peran mereka pada substrat lebih lambat jika dibandingkan dengan spesies Proteus. Oleh karena itu, tes ini dapat dengan cepat membedakan anggota dari genus ini dari mikroorganisme lain yang tidak memfermentasi laktosa. Urease adalah enzim hydrolitik yang menyerang ikatan nitrogen n karbon pada komponen amida misalnya urea dan membentuk alkaline yang produk akhirnya adalah ammonia . Adanya urease dapat dideteksi ketika organisme ditumbuhkan dalam urea broth medium yang mengandung pH indicator phenol red. Ketika substrat urea dipisahkan dari produknya,adanya ammonia membuat lingkungan alkaline yang menyebabkan phenol red berubah menjadi deep pink. Hal ini menunjukkan reaksi positif terhadap adanya urease. Kegagalan perubahan warna menjadi deep pink membuktikan reaksi negatif.

j.Aktivitas katalase Media yang digunakan :Nutrient Agar

Kompisisi Media

: - Peptone from casein - Meat extract - Agar

(10 gr) (3 gr) (12 gr)

Lama inkubasi

: 24 48 jam pada 370C

Selama respirasi aerobik, mikroorganisme memproduksi hydrogen peroksida dan dalam beberapa kasus, secara ekstrem menghasilkan toxic superoxide. Diperkirakan substansi ini akan dihasilkan dari organisme yang mati jika tidak mereka dapat didegradasi secara enzimatik. Substansi ini diproduksi ketika bakteri aerob, facultative anaerob, dan mikroaerophile menggunakan jalur respirasi aerobic,di mana oksigen merupakan akseptor electron terakhir, selama proses degradasi karbohidrat untuk produksi energi. Organisme yang mampu memproduksi katalase secara cepat mendegradasi hydrogen peroksida berdasarkan reaksi berikut : 2H2O2 2H2O
Air Hidrogen Peroksida Oksigen bebas

O2 (g)

Organisme aerobic yang kekurangan katalase dapat mendegradasi toxic superoxide secara khusus menggunakan enzim superoxide dismutase; hasil akhir dari superoxide dismutase adalah H2O2, tetapi H2O2 kurang berbahaya bagi sel bakteri jika dibandingkan dengan superoksida. Ketidakmampuan strict anaerob untuk mensintesis katalase, peroxidase, atau superoxide dismutase mungkin menjelaskan mengapa oksigen menjadi beracun untuk mikroorganisme. Bila enzim enzim di atas tidak ada maka menyebabkan konsentrasi zat toksik dari H2O2 tidak dapat didegradasi ketika organisme tersebut ditumbuhkan disertai adanya oksigen. Produksi katalase dapat ditentukan dengan penambahan substrat H2O2 pada tryticase soy agar slant culture yang telah diinkubasi. Jika ada katalase, seperti yang telah disebutkan pada reaksi kimia diindikasikan oleh gelembung dari gas oksigen yang terbebas. Hal ini menunjukkan tes

katalase positif; sedangkan tidak terbentuknya gelembung adalah tes katalase negative. l.Uji Bile Esculin Media yang digunakan Lama inkubasi : Bile esculin agar : 24 48 jam pada 370C

Media ini digunakan untuk mengidentifikasi group D streptococcus. Group D streptococcus menunjukkan atau -hemolysis pada blood agar plates. Group ini meliputi enterococcus seperti Enterococcus faecalis, yang mungkin menjadi penyebab infeksi pada urine. Selain itu, ada golongan nonenterococci seperti S. Bovis, yang digunakan dalam pengobatan manusia menggunakan laser. Enterococcus memiliki kemampuan antibiotik resisten dan yang lebih jarang sebagai vancomycin. Bile esculin test : Dengan adanya bile, Group D streptococci menghidrolisis glycoside esculin menjadi 6,7-dihydroxy-coumarin yang bereaksi dengan iron salt yang terkandung dalam medium. Hal ini menyebabkan timbulnya warna cokelat hitam pada medium setelah diinkubasi. Bila tidak terdapat warna hitam tidak mengidentifikasi organisme Group D streptococci. m.Uji 6.5% sodium chloride broth Media yang digunakan Komposisi media Lama inkubasi : 6,5% NaCl Broth : brain heart infusion broth NaCl 6,5% : 24 48 jam pada 370C Media ini digunakan untuk mengidentifikasi group D streptococcus. Group D streptococcus menunjukkan atau -hemolysis pada blood agar plates. Group ini meliputi enterococcus seperti Enterococcus faecalis, yang mungkin menjadi penyebab infeksi pada urine. Selain itu, ada golongan nonenterococci seperti S. Bovis, yang digunakan dalam pengobatan manusia

menggunakan laser. Enterococcus memiliki kemampuan antibiotik resisten dan yang lebih jarang sebagai vancomycin. 6.5% sodium chloride broth : Group D enterococci dapat diidentifikasi dengan kemampuannya tumbuh pada medium ini jika dibandingkan dengan non enterococci. n.Aktivitas hemolytic Media yang digunakan Komposisi media : blood agar base : - proteose peptone - liver digest - yeast extract - NaCl - Agar - Darah steril Lama inkubasi : 24 48 jam pada 370C (15 gr) (2,5 gr) (5 gr) (5 gr) (12 gr) (5%)

Aktivitas hemolytic ini adalah salah satu cara untuk mengidentifikasi adanya streptococci. Dari hasil penelitian, ada 3 tipe reaksi hemolytic pada blood agar yaitu: - ( ) Alpha-hemolysis merupakan bentuk hemolisis yang tidak sempurna. Ditandai dengan adanya zona berwarna hijau di sekitar koloni. -hemolytic streptococci, Streptococcus viridans merupakan bakteri yang tidak patogen. Sedangkan yang lain, memiliki kemampuan untuk menyebabkan infeksi pada manusia seperti subacute endocarditis dan gagal jantung. - ( ) Beta-hemolysis merupakan penghancuran sel darah merah dengan sempurna. Ditandai dengan terbentuknya zona bening sekitar 2 - 4 kali diameter koloni. Streptococcus mampu memproduksi -hemolysins dan bersimbiosis dengan bakteri patogen. - ( ) Gamma-hemolysis diindikasikan dengan tidak adanya hemolysis di sekitar koloni. Sebagian besar, -hemolytic streptococci bersifat avirulent.

o. Uji Bile Solubility Media yang digunakan Reagen yang digunakan Lama inkubasi : Bile solubility : Na-deoksikolat : 24 48 jam pada 370C

Adanya surface-active agents seperti bile dan bile salts (sodium desoxycholate atau sodium dodecyl sulfate), menyebabkan dinding sel pneumococcus mengalami lisis. Selain -hemolytic streptococci tidak akan mengalami lisis oleh agen tadi dan tidak larut dalam bile. Setelah diinkubasi, biakan yang larut dalam bile akan tampak jernih sedangkan yang tidak larut dalam bile akan tampak keruh. p. Uji Pigmen Media yang digunakan Kompisisi Media : Nutrient Agar : - Peptone from casein - Meat extract - Agar Lama inkubasi : 24 48 jam pada 370C (10 gr) (3 gr) (12 gr)

Pada uji pigmen ini,apabila pada medium nutrient agar tidak terlihat warna selain warna koloni, maka hal itu menandakan bahwa uji pigmen negatif. Sedangan bila ditemukan warna yang lain berarti menandakan bahwa uji pigment positif. Selain dilakukan pewarnaan gram dan uji uji biokimia, ada juga yang membutuhkan pewarnaan spora untuk mengidentifikasi lebih lajut. Berikut adalah penjelasan tentang pewarnaan spora. Pewarnaan spora Peralatan yang diperlukan : Bunsen, hotplate, staining tray, inoculating loop, glass slides, bibulous paper, lens paper dan mikroskop

Reagen yang dibutuhkan Endospora

: Malachite green dan safranin

Lama inkubasi untuk biakan : 48 - 72 jam pada media agar slant merupakan struktur yang bersifat resisten, dorman, dan berfungsi untuk melindungi lingkungan bakteri yang dari tidak

menguntungkan. Struktur ini tidak dapat diwarnai dengan metode pewarnan sederhana maupun gram. Metode yang umum digunakan adalah Scaeffer-Fulton endospore stain. Metode ini menggunakan malakit hijau sebagai pewarna primer (primer stain) dan safranin sebagai caounterstain.Gambar tentang berbagai bentuk spora sebagai berikut : A: oval, terminal B: rectangular, terminal C: rectangular, subterminal D: rectangular, central E: circular, terminal F: circular, central G: inflated spore

Pedoman yang digunakan oleh praktikan dalam mengidentifikasi spesies suatu sampel adalah pohon filogenik. Hal ini disebabkan masing- masing

spesies

memiliki

jalur

yang

berbeda

dalam

proses

pengidentifikasiannya.Berikut skema pohon filogenik :

Penjelasan tentang pohon filogenik sebagai berikut : Setelah praktikan dapat mengidentifikasi bakteri berdasarkan pewarnaan gram dan morfologi bakteri, maka dapat disimpulkan sebagai berikut : 1a.Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya cocci Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Micrococcus spp, Staphylococcus spp dan Streptococcus spp. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji biokimia yaitu uji katalase. 1b.Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya Bacilli Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Corynebacterium spp. dan Lactobacillus spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan pewarnaan spora. 1c.Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya cocci

Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Branhamella spp, Moraxella spp, dan Neisseria spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji biokimia yaitu uji glukosa. 1d.Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya Bacilli Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Citrobacter spp, Enterobacter spp., Escherichia spp., Klebsiella spp., Proteus spp., dan Pseudomonas spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji biokimia yaitu uji laktosa. Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya cocci Uji Katalase 2a. Bila uji katalase menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Micrococcus spp. dan Staphylococcus spp. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji mannitol. 2b. Bila uji katalase menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Streptococcus spp.. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji bile esculin. Uji Mannittol 3a. Bila uji Mannitol menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Staphylococcus aureus. 3b. Bila uji Mannitol menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. Saprophyticus, S.epidermis, M.luteus, M.varians. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Pigment. Uji Bile Esculin 3c. Bila uji Bile Esculin menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. Faecalis dan S.bovis. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji pada 6.5% NaCl Broth.

3d. Bila uji Bile Esculin menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S.pneumoniae, S.mitis dan S.pyogenes. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Hemolysis. Uji Pigment 4a. Bila uji Pigment menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M.luteus dan M. varians. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa. 4b. Bila uji Pigment menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. Saprophyticus dan S.epidermis. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Fermentasi Fruktosa. Uji pada 6.5% NaCl Broth 4c. Bila uji pada 6.5% NaCl Broth menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. Faecalis. 4d. Bila uji pada 6.5% NaCl Broth menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S.bovis. Uji Hemolysis 4e. Bila uji Hemolysis menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah alpha hemolysis yaitu S.pneumoniae dan S.mitis. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Bile Solubility. 4f. Bila uji Hemolysis menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S.pyogenes. Uji Fermentasi Glukosa 5a. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M. varians. 5b.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M. luteus. Uji Fermentasi Fruktosa

5c. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. epidermis. 5d.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. saprophyticus. Uji Bile Solubility 5e. Bila uji Bile Solubility menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S.pneumoniae. 5b.Bila uji Bile Solubility menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. mitis. Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya Bacilli 2a Bila terdapat spora dalam sampel, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Bacillus spp.. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji mannitol. 2b. Bila tidak ditemukan adanya spora, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Corynebacterium spp. dan Lactobacillus spp. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji katalase. Uji mannitol 3a. Bila uji mannitol menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B. Megaterium dan B.subtilis. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Voges-Proskauer. 3b. Bila uji mannitol menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B. cercus. Uji katalase 3c. Bila uji katalase menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Corynebacterium spp. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat.

3d. Bila uji katalase menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Lactobaciillus spp. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa. . Uji Voges-Proskauer dalam sampel adalah B.subtilis. 4b. Bila uji mannitol menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B. Megaterium. Uji Reduksi Nitrat 4c. Bila uji katalase menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. xerosis. 4d. Bila uji katalase menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. Kutscheri. Uji Fermentasi Glukosa 4e. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif (terbentuk asam dan gas), maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L.fermentum. 4f. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif (hanya terbentuk asam), maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. casei dan L. delbrueckii Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Fermentasi Mannitol. Uji Fermentasi Mannitol. 5a. Bila uji Fermentasi Mannitol menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. casei 5b. Bila uji Fermentasi Mannitol menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. delbrueckii. Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya cocci Uji Fermentasi Glukosa 4a. Bila uji mannitol menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada

2a. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Neisseria spp .Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat . 2b. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Branhamella spp dan Moraxella spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat. Uji Reduksi Nitrat 3a. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah N. mucosa . 3b. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah N.sicca . 3c. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B.catarrhalis 3d. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M. bovis Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya Bacilli Uji Fermenatasi Laktosa 2a. Bila uji Fermentasi Laktosa menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Citrobacter spp, Enterobacter spp., Escherichia spp. dan Klebsiella spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Produksi Indole . 2b. Bila uji Fermentasi Laktosa menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Proteus spp., dan Pseudomonas spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa Uji Produksi Indole 3a. Bila uji produksi indol menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. Intermedius dan E. coli.Untuk mengetahui

lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Penggunaan Citrate . 3b.Bila uji produksi indol menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. freundii, Enterobacter spp., Escherichia spp. dan Klebsiella spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Metyl Red . Uji Fermentasi Glukosa 3c.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Proteus spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Produksi Indole. 3d.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Pseudomonas spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Reduksi Nitrate. Uji Penggunaan Citrate 4a. Bila uji Penggunaan Citrate menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. Intermedius 4b. Bila uji Penggunaan Citrate menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. coli. Uji Metyl Red 4c. Bila uji Metyl Red menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. freundii dan K.ozaenae..Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Produksi H2S. (I) 4d. Bila uji Metyl Red menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. Aerogenes dan K. Pneumoniae.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji aktivitas urease. ( I ) Uji Produksi Indole

4e. Bila uji Produksi Indole menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. vulgaris dan P.rettgeri.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Produksi H2S. ( II ) 4f. Bila uji Produksi Indole menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. mirabilis dan P. inconstans.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji aktivitas urease . ( II ) Uji Reduksi Nitrate 4g.Bila uji Reduksi Nitrate menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P.aeruginosa dan P.fluorescens.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Litmus Milk. 4h.Bila uji Reduksi Nitrate menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P.mallei. Uji Produksi H2S( I ) 5a. Bila uji Produksi H2S menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. freundii 5b. Bila uji Produksi H2S menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah K.ozaenae.. Uji aktivitas urease( I ) 5c. Bila uji aktivitas urease menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah K. Pneumoniae. 5d. Bila uji aktivitas urease menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. Aerogenes. Uji Produksi H2S( II ) 5e. Bila uji Produksi Indole menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. vulgaris. 5f. Bila uji Produksi Indole menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P.rettgeri.

Uji aktivitas urease( II ) 5g. Bila uji aktivitas urease menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. mirabilis. 5h. Bila uji aktivitas urease menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. inconstans. Uji Litmus Milk 5i.Bila uji Litmus Milk menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P.aeruginosa yang mengalami peptonization 5j.Bila uji Litmus Milk menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P.fluorescens yang mengalami reaksi alkaline.

III. Alat dan Bahan : 1.Alat : - Tabung - Cawan petri - Objek glass - Jarum ose - Erlemeyer - Beker glass - Pipet - Hotplate stirrer - Lampu spiritus

2.Bahan : - Sampel bakteri (Sampel 1, 2, 3) - Crystal violet (Gram I) - Safranin (Gram IV) - Etanol 95% (Gram III) - Grams iodine (Gram II) - Barrit A dan Barrit B - Reagen kovacs - H2O2 3% - Medium TSA - Medium Litmus Milk - Phenol Red Lactose Broth - Phenol Red Dextrose Broth - Phenol Red Sucrose Broth - Medium SIM Agar - MRVP Broth - Simmons Citrate Agar - Urea Broth - Starch Agar - Nutrien Gelatin Broth - Nitrate Broth

IV. Cara Kerja : 1.Pewarnaan Gram: a.Menetesi preparat olesan bakteri yang telah difiksasi dengan beberapa dengan air. b.Menetesi preparat dengan larutan lugol (Gram II) beberapa tetes. Membiarkan selama 1 menit. c. Membilas dengan air. d. Mencuci dengan larutan Gram III (alkohol 96%) dengan cara memiringkan preparat kemudian menetesi perlahan- lahan dengan Gram III hingga tidak ada pewarna yang terlunturkan. e. Membilas preparat secara hati-hati dnegan air tetes larutan karbolgentian violet (Gram I), membiarkan selama 3 menit. Membilas

f.

Menetesi preparat dengan larutan fuchsin (Gram IV) beberapa tetes. Mendiamkan selama 3 menit.

g. Membilas preparat dengan air. Kemudian mengeringkan di udara atau dengan cara menyerap kelebihan air dengan tissue. h. Mengamati preparat di mikroskop dan mencatat hasilnya. 2. Pembuatan Media untuk Stock Culture(Peremajaan) TSA slant (40 gr/L) -Menimbang TSA kemudian melarutkannya ke dalam aquades -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave. -Memiringkan tabung agar terbentuk media slant 3.Pembuatan Media untuk Uji Biokimia a.Litmus Milk (100 gr/L) Cara pembuatan media : -Menimbang litmus milk kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave. Langkah inokulasi ke media : 1.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Litmus Milk Broth 2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada media tersebut. 3.Menginkubasi selama 24 48 jam pada suhu 370C. b.Phenol Red Lactose Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red lactose broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest

-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave. c.Phenol Red Fructose Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red fructose broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave. d.Phenol Red Glucose Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red glucose broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave e.Phenol Red Mannitol Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red mannitol broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave Langkah inokulasi ke media fermentasi : 1.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi media dengan berbagai macam karbohidrat : phenol red lactose broth, phenol red sucrose broth, dan phenol red dextrose broth. 2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada media media pada bagian 1. 3.Menginkubasi selama 24 - 48 jam pada suhu 370C. e.SIM Agar Deep Tube (30 gr/L) -Menimbang SIM medium kemudian melarutkannya ke dalam aquadest

-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave. Langkah inokulasi pada media : 1.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi SIM agar deep tubes 2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada media SIM dengan menusukkan ke dalam agar. 3.Menginkubasi selama 24 48 jam pada suhu 370C. 4.Untuk tes produksi Indol ditambahkan reagen Kovac 3-5 tetes pada medium yang telah diinkubasi. f.Simmon Citrate Agar Slant (22,5 gr/L) -Menimbang SCA kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave. -Memiringkan tabung agar terbentuk media slant Langkah inokulasi pada media : 1.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Simmons citrate agar slants 2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada media tersebut dengan cara menggores zig-zag pada bagian yang miring. 3.Menginkubasi selama 24 48 jam pada suhu 370C g.Urea Broth (38,5 gr/L) -Menimbang urea broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Mensterilkan campuran dengan memfiltrasinya -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung Langkah inokulasi pada media : 1.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Urea Broth 2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada media tersebut.

3.Menginkubasi selama 24 48 jam pada suhu 370C h.Tryptycase Soy Agar (TSA) Plate (40 gr/L) -Menimbang medium TSA kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer kemudian diautoclave -Memasukkan campuran ke dalam cawan petri steril dan membiarkannya memadat. Langkah inokulasi pada medium : 1.Menyiapkan plate berisi TSA 2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada media tersebut dengan men-strict medium 3.Menginkubasi selama 24-48 jam pada suhu 370C i.Nutrient Agar -Menimbang Nutrient Agar kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer kemudian diautoclave -Memasukkan campuran ke dalam cawan petri steril dan membiarkannya memadat. Langkah inokulasi pada medium : 1.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Nutrient Agar slant 2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada media tersebut dengan cara menggores zig-zag pada bagian yang miring. 3.Menginkubasi selama 24 48 jam pada suhu 370C 4.Untuk membuktikan adanya aktivitas katalase ditambahkan reagen H2O2 3% pada medium yang tlah diinkubasi.

V.

Hasil Percobaan : 1.Pewarnaan gram 1a.Pewarnaan gram E.coli

1b.Pewarnaan gram Staphylococcus epidermis

1c.Pewarnaan gram Proteus mirabilis

2.Uji Biokimia 2.Uji Biokimia 2a.Uji Biokimia E.coli -Uji Laktosa

-Uji Indol

-Uji Citrat

b.Uji Biokimia Staphylococcus epidermis -Uji Katalase

-Uji Mannitol

-Uji Pigment

-Uji Fruktosa

c.Uji Biokimia Proteus mirabilis -Uji Laktosa

-Uji Glukosa

-Uji Indole

-Uji Urea

3. Tabel Hasil Percobaan 3a. Tabel Hasil Percobaan E.coli Macam Uji Pewarnaan Gram Morfologi Fermentasi Laktosa Produksi Indol (SIM medium) Penggunaan sitrat Hasil Uji negative coccobacill + + -

3b. Tabel Hasil Percobaan Staphylococcus epidermis Macam Uji Pewarnaan Gram Morfologi Aktivitas katalase Fermentasi mannnitol Pigment Fermentasi Fruktosa Hasil Uji positif coccus + +

3c. Tabel Hasil Percobaan Proteus mirabilis Macam Uji Pewarnaan Gram Morfologi Fermentasi laktosa Fermentasi glukosa Produksi Indol (SIM medium) Hasil Uji negative bacill + -

Aktivitas Urease

VI.Pembahasan 1.Sampel A 1a.Pewarnaan Gram & Morfologi Hasil uji morfologi pada sampel A menunjukkan bahwa bakteri pada sampel A termasuk ke dalam golongan bakteri gram negatif dengan bentuk coccobacill. Bakteri tersebut berwarna merah setelah diwarnai dengan pewarnaan gram. Hal ini disebabkan oleh, lapisan lipopolisakarida pada bakteri

ini lebih sedikit sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya akan luntur bersama dengan lapisan lipopolisakaridanya ketika dicucci dengan gram III (alkohol) sehingga yang tersisa hanya warna merah dari safranin yang merupakan pewarna tandingan. Oleh karena itu, dari hasil pewarnaan gram dan morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel A merupakan bakteri gram negatif dan bentuknya coccobacill sehingga untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi laktosa. 1b.Uji Fermentasi Laktosa Uji Fermentasi Laktosa ini dilakukan pada medium phenol red lactosa broth.Pada uji ini, bakteri sampel A tidak dapat memfermentasi laktosa. Hasil uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. Oleh karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji Produksi Indol. 1c.Uji Produksi Indol Uji Produksi Indol ini dilakukan pada medium SIM dengan bantuan penambahan reagen Kovac akan terlihat cincin pink pada medium. Pada uji ini, bakteri sampel A menunjukkan hasil positif yaitu terbetuk cincin pink setelah penambahan reagen Kovac. Hal ini berarti bakteri sampel A memiliki enzim triptofanase untuk memecah triptofan sesuai dengan reaksi berikut :

. Oleh karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji penggunaan citrat. 1d.Uji Penggunaan Citrat Uji penggunaan sitrat menggunakan medium Simmons Citrate Agar yang mengandung sitrat sebagai satu satunya sumber karbon. Pada uji ini, bakteri sampel A menunjukkan hasil negatif yang ditandai dengan tidak berubahnya warna medium dari hijau menjadi biru. Hal ini berarti bakteri sampel A tidak memiliki enzim citrase untuk mengubah sitrat menjadi oksaloasetat dan asam asetat yang selanjutnya akan dirubah menjadi asam piruvat dan CO2 . Oleh karena itu, dapat disimpulkan berdasrkan pohon filogenik bahwa bakteri sampel A adalah E.coli. 2.Sampel B 2a.Pewarnaan Gram & Morfologi Hasil uji morfologi pada sampel B menunjukkan bahwa bakteri pada sampel B termasuk ke dalam golongan bakteri gram positif dengan bentuk coccus.

Bakteri tersebut berwarna biru-ungu setelah diwarnai dengan pewarnaan gram. Hal ini disebabkan oleh, lapisan lipopolisakarida pada bakteri ini cukup tebal sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya tidak bisa luntur ketika dicuci dengan gram III (alkohol) sehingga yang tersisa adalah warna biru-ungu oleh reagen kristal-violet. Oleh karena itu, dari hasil pewarnaan gram dan morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel B merupakan bakteri gram positif dan bentuknya coccus sehingga untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji aktivitas katalase. 2b.Uji Aktivitas Katalase Uji aktifitas katalase dilakukan dengan menggunakan medium TSA dan selanjutnya dilakukan penambahan reagen berupa H2O2 3%. Bakteri sampel B menunjukkan hasil positif pada uji ini yang artinya bakteri sampel B memiliki enzim katalase. Hasil positif tersebut ditunjukkan dengan adanya gelembung gelembung gas pada permukaan koloni ketika ditetesi dengan H2O2 3%. Hal ini berarti bakteri sampel B dapat memecah hidrogen peroksida menjadi air dan karbondioksida sesuai reaksi berikut Oleh karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi mannitol. 2c.Uji Fermentasi Mannitol Uji Fermentasi Mannitol ini dilakukan pada medium phenol red mannitol broth.Pada uji ini, bakteri sampel B tidak dapat memfermentasi mannitol. Hasil uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. Oleh karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji pigment. 2d.Uji Pigment

Uji Pigment ini dilakukan pada medium nutrient agar.Pada uji ini, bakteri sampel B tidak menampakkan warna yang lain selain warna koloni yaitu putih mengkilap. Hal itu berarti hasil uji pigment adalah negatif.Oleh karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi fruktosa 2e.Uji Fermentasi Fruktosa Uji Fermentasi Fruktosa ini dilakukan pada medium phenol red fructosa broth. Pada uji ini, bakteri sampel B dapat memfermentasi fruktosa sehingga hasilnya positif. Hasil uji positif pada fermentasi laktosa ditandai dengan berubahnya warna medium menjadi kuning yang disebabkan oleh adanya produk akhir fermentasi yang bersifat asam, dan juga adanya gas.Oleh karena itu, dapat disimpulkan berdasarkan pohon filogenik bahwa bakteri sampel B adalah Staphylococcus epidermis. 3.Sampel C 3a.Pewarnaan Gram & Morfologi Hasil uji morfologi pada sampel C menunjukkan bahwa bakteri pada sampel C termasuk ke dalam golongan bakteri gram negatif dengan bentuk bacill. Bakteri tersebut berwarna merah setelah diwarnai dengan pewarnaan gram. Hal ini disebabkan oleh, lapisan lipopolisakarida pada bakteri ini lebih sedikit sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya akan luntur bersama dengan lapisan lipopolisakaridanya ketika dicucci dengan gram III (alkohol) sehingga yang tersisa hanya warna merah dari safranin yang merupakan pewarna tandingan. Oleh karena itu, dari hasil pewarnaan gram dan morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel C merupakan bakteri gram negatif dan bentuknya bacill sehingga untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi laktosa. 3b.Uji Fermentasi Laktosa

Uji Fermentasi Laktosa ini dilakukan pada medium phenol red lactosa broth. Pada uji ini, bakteri sampel C tidak dapat memfermentasi laktosa. Hasil uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. Oleh karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi glukosa. 3c.Uji Fermentasi Glukosa Uji Fermentasi Glukosa ini dilakukan pada medium phenol red glukosa broth. Pada uji ini, bakteri sampel C dapat memfermentasi glukkosa sehingga hasilnya positif. Hasil uji positif pada fermentasi laktosa ditandai dengan berubahnya warna medium menjadi kuning yang disebabkan oleh adanya produk akhir fermentasi yang bersifat asam, dan juga adanya gas. Oleh karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji Produksi Indol. 3d.Uji Produksi Indol Uji Produksi Indol ini dilakukan pada medium SIM dengan bantuan penambahan reagen Kovac akan terlihat cincin pink pada medium, bila hasilnya positif. Akan tetapi, pada bakteri sampel C tidak menunjukkan terbentuknya cicncin pink setelah penambahan reagen Kovac sehingga hasilnya negatif.Hal ini berarti bakteri sampel A tidak memiliki enzim triptofanase untuk memecah triptofan. Oleh karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji aktivitas urease. 3e.Uji aktivitas urease. Uji aktivitas urease. ini dilakukan pada medium urea broth yang mengandung pH indicator phenol red. Pada uji ini, bakteri sampel C berubah warna menjad deep pink yang menandakan bahwa uji aktivitas urease positif.Hal ini menandakan bahwa Ketika substrat urea dipisahkan dari

produknya,adanya ammonia membuat lingkungan alkaline yang menyebabkan phenol red berubah menjadi deep pink. Hal ini menunjukkan reaksi positif terhadap adanya urease. Kegagalan perubahan warna menjadi deep pink membuktikan reaksi negatif. Reaksinya sebagai berikut :

Oleh karena itu, dapat disimpulkan berdasarkan pohon filogenik bahwa bakteri sampel C adalah Proteus mirabilis. VII. Kesimpulan : Dalam melakukan identifikasi spesies dilakukan uji morfologi dan uji biokimia. Selain itu, yang menjadi pedoman utama dalam pengidentifkasian spesies adalah penggunaan pohon filogenik. Hal in disebabkan karena masing masing spesies memiliki jalur yang berbeda baik dalam pewarnaan gram/morfologi atau metabolismenya. Oleh karena itu,sampel kami berurutan dari adalah Escherichia coli, Staphylococcus epidermis dan Proteus mirabilis. VIII. Daftar Pustaka Tortora, Gerard J, Berdell R. Funke, Christine L.Case, Microbiology-An Introduction, Benjamin Cummings, San Francisco, 2001. Cappuccino, James G, Natalie Sherman, Microbiology A Laboratory Manual, seventh edition, Benjamin Cummings, San Francisco, 2005. http://www.siue.edu/~cbwilso/250cho.htm http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/pages/101lab9.html