IDENTIFIKASI SPESIES MIKROORGANISME SAMPEL

I. Tujuan Percobaan : Mampu menggunakan teknik pewarnaan, pengkulturan, dan uji biokimia yang telah didapat untuk menentukan genus kultur bakteri yang belum diketahui. II. Dasar Teori :

Spesies berasal dari bahasa Latin species yang merupakan tingkatan dalam taksonomi yang terkecil, biasanya digunakan untuk mengklasifikasi organisme baik yang hidup maupun organisme yang fosil. Dalam biologi, species adalah salah satu bentuk pengelompokan dalam klasifikasi makhluk hidup.. Dalam sistem tatanama binomial, nama suatu spesies makhluk hidup terdiri atas dua kata: nama genusnya (diawali dengan huruf kapital) dan nama penunjuk spesiesnya. Misalnya, dari gambar di samping,Panthera pardus, Nama Panthera merupakan nama genus atau marga sedangkan pardus merupakan nama species. Berikut penjelasan singkat mengenai 3 spesies sampel yang kelompok kami temukan. Ketiga spesies sampel kami antara lain adalah E. coli, Staphylococcus epidermis dan Proteus mirabilis. 1. E.coli Escherichia coli, atau biasa disingkat E. coli, adalah salah satu jenis spesies utama bakteri gram negatif. Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh Theodor Escherich ini hidup pada tinja, dan dapat menyebabkan masalah kesehatan pada

manusia, seperti diare, muntaber dan masalah pencernaan lainnya. E. coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika. Biasa digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan. E. coli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah dalam penanganannya. 2. Staphylococcus epidermis Staphylococcus epidermis merupakan bakteri non-motil, jenis coccus grampositive cocci, dan berbeda dengan Staphylococcus aureus, bakteri ini tidak memiliki enzim koagulase. Bakteri ini merupakan bakteri yang patogen dan aktif dalam aliran darah melalui luka, jarum dll. Infeksi dari bakter in berakibat pembengkakan pada daerah yang terinfeksi. 3.Proteus mirabilis Proteus mirabilis merpakan bakteri gram negative dan bakteri fakultatif anaerob. Bakteri ini memiliki kemampuan motalitas dan aktivitas urease. P.mirabilis menyebabkan 90% infeksi yang disebabkan oleh jenis ‘Proteus’. P.mirabilis dapat menggunakan urea dan citrate untuk produksi energi. Bakteri ini dapat memproduksi gas hydrogen sulfide dan membentuk zona bening pada media. P.mirabilis ini motil, memiliki peritrichous flagella yang diketahui sebagai penyebab pergerakan. Bakteri ini pada umumnya ditemukan pada intestinal manusia. P.mirabilis tidak pathogen pada guinea pigs atau ayam. Uji – uji biokimia pada P.mirabilis adalah sebagai berikut : *Indole negative dan reduksi nitrat positif (tidak ada gas yang diproduksi) *Metyl red positif dan Voges-Proskauer negatif *Catalase positif and Cytochrome Oxidase negatif Untuk mengidentifikasi spesies suatu bakteri, praktikan perlu melakukan serangkaian uji yang berurutan sesuai dengan hasil percobaan yang telah ada. Berikut adalah penjelasan berbagai uji yang harus dilakukan dalam mengidentifikasi spesies sampel : 1.Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram adalah suatu metode yang digunakan untuk membedakan mikroorganisme berdasarkan susunan & struktur dinding sel mikroorganisme. Metode pewarnaan gram membutuhkan 4 jenis reagen yaitu : crystal gentian violet (Gram I), iodine (Gram II), alkohol 95% (GramIII), dan saphranin (Gram IV). Dengan menggunakan metode pewarnaan gram, bakteri dapat digolongkan menjadi 2 kelompok, yaitu : bakteri gram (+) yang akan berwarna biru-ungu dan bakteri gram (-) yang berwarna merah.

Staphylcuococs (+)

E. coli (-)

Beberapa fungsi reagen dalam pewarnaan gram yang menentukan spesies sampel termasuk dalam gram (+) atau gram (-) adalah sebagai berikut: • • Pemberian kristal fiolet berfungsi untuk mewarnai semua sel. (baik Iodin berfungsi sebagai mordan. Di dalam sitoplasma iodin gram negatif maupun positif) membentuk komplek dengan kristal fiolet. Pembentukan kompleks mengakibatkan sel berwarna biru tua. • Pemberian alkohol memiliki 2 fungsi: – Pada gram positif alkohol mengakibatkan peptidoglikan terdehidrasi sehingga ukuran porinya mengecil. Ini mengakibatkan kristal violet tidak dapat keluar dari sitoplasma. – Pada gram negatif alkohol mencuci dinding sel dan meninggalkan lubang kecil pada peptidoglikan. Ini mengakibakan kristal violet tercuci keluar dan sel menjadi tidak berwarna.

Safranin berfungsi sebagai couter staining. Safranin akan

memberi warna pada gram negatif sehingga gram positif dan negatif akan terlihat berbeda secara jelas di bawah mikroskop. Dari hasil pewarnaan gram, selain dapat membedakan mikroorganisme berdasarkan susunan & struktur dinding sel mikroorganisme, praktikan juga dapat mengidentifikasi morfologi dari bakteri tersebut. Berikut gambar tentang berbagai bentuk morfologi dari bakteri sebagai berikut :

2.Uji Biokimia Biokimia adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui metabolisme dan reaksi yang dijalankan oleh suatu mikroorganisme. Jenis – jenis uji biokimia untuk mengidentifikasi spesies antara lain : a.Reaksi Litmus Milk Media yang digunakan Komposisi Media : litmus broth : - Litmus - Skim milk powder - Sodium sulfite Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (0,5 gr) (100 gr) (0,5 gr)

Penyusun susu terbesar yang digunakan sebagai dasar uji biokimia dalam media litmus milk adalah laktosa, protein susu yaitu kasein, lacto-albumin dan lactoglobulin.Untuk melihat adanya perubahan metabolisme yang diproduksi dalam medium, digunakan pH indicator yaitu oxidase-reduction

indicator litmus. Indicator ini akan menyatu dalam medium. Saat ini,litmus milk merupakan medium yang baik untuk mikroorganisme yang dapat mencerna substrat milk, tergantung dari komplemen enzimatik bakteri tersebut. Beberapa perubahan biokimia dalam litmus milk :  Fermentasi Laktosa Organisme mampu menggunakan laktosa sebagai sumber karbon untuk produksi energi, dengan menggunakan induksi enzim β -galactosidase. Degradasi laktosa dirumuskan sebagai berikut:

Adanya asam laktat dapat dengan mudah dideteksi karena litmus bewarna ungu pada pH netral dan berubah menjadi merah muda ketika medium menjadi asam yaitu pada pH sekitar 4.  Adanya gas + H2
.

Produk akhir pada fermentasi laktosa adalah CO2

Adanya gas

ini mungkin dapat dilihat sebagai pemisahan ‘curd’ atau pembelahan dalam curd sebagai akibat adanya gas yang naik ke permukaan.  Reduksi Litmus Fermentasi adalah proses anaerobic yang meliputi biooksidasi yang terjadi karena tidak ada molekul oksigen. Oksidasi ini mungkin akan terlihat sebagai perpindahan hydrogen (dehydrogenation) dari substrat.Karena ion hidrogen tidak dapat dalam bentuk bebas/melayanglayang,hydrogen memerlukan akseptor elektron yang dapat mengikat ion hydrogen jika hal tersebut tidak terjadi maka reaksi reduksi-oksidasi tidak akan berjalan dan produksi energy tidak dapat dihasilkan. Pada tes litmus milk, litmus berperan sebagai akseptor. Saat berada dalam kondisi oksidasi, litmus berwarna ungu; ketika litmus menerima

enzim yang berperan mengubah casein menjadi bentuk paracasein. curd jenis ini berupa gumpalan semisolid yang lembut.hydrogen dari substrat. Curd yang terbentuk bergantung pada mekanisme biokimia yang membentuk curd tersebut Ada 2 jenis curd yang mungkin terbentuk yaitu : -Acid curd Asam laktat atau asam organic lain menyebabkan pengendapan milk protein casein sebagai calcium caseinate menjadi bentuk gumpalan yang tidak larut. gas CO2 dan gas H2.  Proteolysis (Peptonization) Ketidakmampuan beberapa mikroorganisme untuk menghasilkan energi melalui jalur fermentasi laktosa menandakan bahwa mikroorganisme tersebut harus menggunakan sumber nutrisi lainnya sebagai protein untuk menghasilkan energi. Lactose Glucose Pyruvic acid -Lactic acid -Butyric acid -CO2 + h2 Gas hydrogen dikenal sebagai hydrogen litmus acceptor. Dengan menggunakan enzim proteolitik. Oksidasi laktosa ini memproduksi asam laktat.  Terbentuknya Curd Aktivitas biokimia dari mikroorganisme yang berbeda ditumbuhkan pada litmus milk menghasilkan produksi 2 tipe curd (clots) yang berbeda. selain itu adanya calcium ion diubah menjadi calcium paracaseinate dan membentuk gumpalan yang tidak larut. . Gumpalan ini akan mengalir perlahan saat tabung dimiringkan. yang menyebabkan perubahan menjadi putih dan menandakan bahwa laktosa tereduksi. -Rennet curd Beberapa organisme menghasilkan rennin. litmus akan tereduksi dan berubah menjadi putih atau warna putih susu. Tidak seperti acid curd. asam butirat.

Acid Formation E. Reaksi ini mengindikasikan partial degradation dari casein menjadi rantai polipeptida yang lebih pendek. Uninoculated Control D.organisme menghidrolisis milk protein. glucose. mannitol broth : . Alkaline Reaction b. Proses pencernaan protein disertai dengan perubahan sejumlah besar ammonia yang dihasilkan dalam medium dengan alkaline pH.Casein peptone (10 gr) . fructose. Beberapa kemungkinan hasil yang diperoleh dari uji Litmus Milk : Keterangan gambar :A. dengan disertai pelepasan produk akhir alkaline yang menyebabkan perubahan warna. menjadi bentuk dasarnya yaitu asam amino. Litmus berubah warna menjadi lapisan ungu yang berada di atas/ permukaan dari tabung. terutama casein. Proteolysis of casein F. reaksi sedangkan bagian bawahnya kehilangan strukturnya dan membentuk cairan kecoklatan  Reaksi Alkaline Reaksi alkaline dibuktikan ketika warna pada medium tidak berubah atau berubah menjadi biru.Fermentasi Karbohidrat Media yang digunakan Komposisi Media : phenol red lactose. Reduction/Curd (arrow denotes gas pocket) C. Acid/Reduction/Curd B.

dan variasi produk akhir menunjukkan kemampuan fermentasi mereka yang berbeda. Fermentasi digambarkan dengan baik lewat degradasi glukosa melalui jalur Embden-Meyerhof.Phenol red Lama inkubasi : 24 . substrat-substrat seperti karbohidrat dan alkohol mengalami disimilasi secara anaerob dan menghasilkan asam organik (sebagi contoh : laktat. seringkali karbohidrat. atau asam asetat) yang disertai adanya gas seperti hydrogen atau karbondioksida.8). Medium fermentasi karbohidrat mengandung : -Nutrient broth untuk pertumbuhan semua organisme -Karbohidrat spesifik yang berfungsi sebagai substrat untuk determinasi kemampuan fermentasi organisme-organisme.Sodium chloride . Hasil metabolisme asam piruvat lebih lanjut tidak sama untuk semua organisme. menjadi . Organisme menggunakan karbohidrat secara berbeda. Beberapa organisme mampu memfermentasikan gula seperti glukosa secara anaerob. format. Satu mol glukosa dikonversi menjadi dua mol asam piruvat. -pH indicator phenol red. yang merah pada pH netral (7) dan kuning bila sedikit asam (pH 6. sedangkan yang lain dengan aerob. Anaerob fakultatif mampu melakukan keduanya sedangkan beberapa organisme justru tidak mampu mengoksidasi glukosa secara anareob maupun aerob. Pada fermentasi.yang mengarah pada biooksidasi substrat.-Lactose/fructose/glucose/mannitol .48 jam pada 370C (5 gr) (5 gr) (0. yang mana merupakan senyawa intermediet utama yang dihasilkan dari degradasi glukosa. yang berguna untuk mendeteksi gas yang dihasilkan. tergantung pada komplemen enzimnya. yang dikenal dengan jalur glikolisis. Degradasi fermentasi secara anaerob mengambil tube broth fermentasi yang mengandung tabung Durham.018 gr) Kebanyakan organisme memperoleh energi melalui suatu urutan reaksi enzimatis tertentu dan terintegrasi.

1 gr) (0. serta tidak ada gas pada tabung Durham.Meat peptone . yang mengindikasikan reaksi positif. dan tabung tetap warna merah. Kultur yang tidak mampu memfermentasi substrat karbohidrat tidak akan merubah warna indicator. Pada beberapa kasus. c. Reaksi tersebut membebaskan ammonia hidroksida (NH4OH) dan menghasilkan lingkungan alkalin. Pepton dapat didegradasi oleh enzim mikrobial menjadi asam amino yang secara enzimatis dikonversi menjadi asam ketoamino lewat deaminasi oksidatif. Di antara nutrien tersebut adalah pepton yang ada pada nutrient broth.Ferric ammonium sulfate .Produksi H2S Media yang digunakan Komposisi Media : SIM agar deep tubes : .Sodium thiosulfate Lama inkubasi Terdapat dua jalur : 24 – 48 jam pada 370C fermentasi utama yang mana beberapa (3. Asam ketoamino tersebut lalu dimetabolisme lewat siklus Krebs untuk menghasilkan energi.Inkubasi dilakukan dalam waktu 48 jam.2 gr) (20 gr) (6. yang menimbulkan warna merah tua. produksi asam disertai produksi gas (CO2) yang terlihat sebagai gelembung pada tabung Durham. karbohidrat yang telah difermentasi dengan hasil sampingan asam akan menyebabkan phenol red menjadi kuning. Organisme menggunakan nutrien lain dalam medium sebagai sumber energi. Ini merupakan reaksi negatif. Setelah inkubasi. Inkubasi yang berlebih dapat menutupi reaksi produksi asam oleh produksi alkali yang disebabkan kegiatan enzimatik pada substrat.5 gr) (0.Bacteriological agar . selain karbohidrat. Kekurangan fermentasi karbohidrat oleh beberapa organisme tidak dapat diartikan sebagai ketiadaan pertumbuhan.Casein peptone .2 gr) mikroorganisme mampu memproduksi hydrogen sulfide (H2S) : .

yang mana merupakan komponen peptone yang terdapat pada medium. Atom sulfur bertindak sebagai akseptor hydrogen selama oksidasi senyawa anorganik seperti ditunjukkan sebagai berikut : Pada percobaan digunakan SIM medium yang mengandung peptone dan sodium thiosulfat sebagai substrat sulfur. Motilitas disadari saat . atau sulfit (SO32-). kehilangan atom sulfur dan direduksi dengan penambahan hydrogen dari air untuk membentuk H2S. Pepton tersebut didegradasi oleh enzim microbial menjadi asam amino. SIM agar juga dapat digunakan untuk mendeteksi motilitas organisme. meliputi sistein. Medium yang mengandung sodium thiosulfat. Jalur I : gas H2S dapat diproduksi oleh reduksi (hidrogenasi) sulfur organic yang ada di asam amino sistein. Ketiadaaan endapan menunjukkan reaksi negative. yang mengindikasikan terbentuknya H2S. membentuk endapan tak larut ferrous sulfide berwarna hitam yang dapat dilihat di sepanjang tusukan inokulasi. Ferrous ammonium sulfat gas. ferro sulfat (FeSO4) sebagai indicator H2S. dengan mikroorganisme tertentu dapat direduksi menjadi sulfite dengan pembebasan H2S. sulfat (SO42-).  Jalur II : gas H2S dapat dihasilkan dari reduksi senyawa sulfur anorganik seperti thiosulfat (S2O32-). Asam amino ini dengan keberadaan sistein desulfurase. dan Agar untuk membuat medium menjadi semisolid dan mendorong respirasi anaerob.

pertumbuhan kultur dari organisme berflagellata tidak sesuai dengan garis inokulasi. Pertumbuhan organisme nonmotil sesuai dengan garis inokulasi ditunjukkan sebagai berikut : d. Pada respirasi organisme anaerobic merupakan proses oksidatif karena itu .Reduksi Nitrat Media yang digunakan Kompisisi Media :Nutrient Agar : . :24 – 48 jam pada 370C Reduksi nitrat oleh beberapa mikroorganisme aerobik dan fakultatif anaerobik terjadi dengan adanya molekul oksigen yaitu proses anaerobik.Peptone from casein .Agar Reagen yang diperlukan Lama inkubasi (10 gr) (3 gr) (12 gr) :Solution A (asam sulfanilat).Meat extract .Solution B (αnaphthylamine) dan bubuk Zn.

sel menggunakan substrat inorganic seperti nitrat (NO3. Kondisi agar yang semisolid akan menyebabkan difusi oksigen ke dalam medium menjadi sedikit sehingga bakteri anaerob akan melakukan reduksi nitrat Setelah kultur diinkubasi.+ Nitrit H2O Air Hydrogen electron Beberapa organisme mempunyai kapasitas enzimatik untuk mengurangi jumlah nitrit menjadi ammonia (NH3+) atau molekul nitrogen (N2).) atau sulfat (SO42-) untuk suplai oksigen yang kemudian menjadi akseptor hydrogen akhir selam pembentukan energi.1% kalium nitrat (KNO3) sebagai substrat nitrat.1% agar.medium mengandung nutrient broth bersupplemen 0. diikuti dengan pemberian Larutan B yaitu α-naphthylamine. NO2Nitrit 2NO3. kemampuan organisme untuk mengurangi nitrat atau nitrit dapat dibuktikan dengan penambahan 2 reagen: Larutan A yaitu asam sulfanilat. Nitrat NO3Reduktase NO2- . Perubahan nitrat menjadi nitrit dapat dilihat dari reaksi di bawah ini: Nitrat NO3 + 2H + 2e Nitrat + - Reduktase NO2. Dapat ditambahkan agar medium menjadi semisolid yaitu dengan penambahan 0.+ 12H+ + 10eNitrat NH3+ Ammonia N2 + 6H2O Gas Nitrogen Reduksi nitrat dapat diterangkan dengan mengkultivasi organisme dalam medium nitrat broth. Pada dasarnya. Adanya proses reduksi dengan penambahan Larutan A dan B akan menghasilkan warna cherry red.

e. Besi mereduksi nitrat menjadi nitrit.1 gr) (0.Casein peptone .Produksi Indol Media yang digunakan Kompisisi Media : SIM agar deep tubes : . Jika nitrat tidak direduksi.Sodium thiosulfate Reagen yang diperlukan Lama inkubasi : Kovac’s reagent : 24 – 48 jam pada 370C (3. mak nitrat pada medium direduksi melalui nitrit menjadi ammonia dan gas nitrogen. reaksi reduksi nitrat dikatakan negatif.Ferric ammonium sulfate (0. Untuk membuktikan ada tidaknya nitrat yang direduksi melalui terbetuknya nitrite.bubuk besi ditambahkan sedikit ke kultur yang telah diberi Larutan A dan B. Ini adalah reaksi yang positif. Bila ada perubahan menjadi warna merah maka membuktikan nitrat tidak direduksi menjadi nitrit oleh organisme.2 gr) .2 gr) . atau *Organisme mempunyai semacam potensi enzim nitrate reductase yaitu nitrat secara cepat direduksi melalui nitrit menjadi ammonia atau bahkan menjadi molekul nitrogen. Bila setelah penambahan besi tidak ada perubahan warna.5 gr) (20 gr) (6.Meat peptone .Bacteriological agar .Kultur yang tidak memproduksi perubahan warna seperti yang tertera di atas memiliki 2 kemungkinan : *Nitrat tidak direduksi oleh organisme.

Potassium phosphate . Keberadaan indol dideteksi dengan menambahkan reagen Kovac yang menyebabkan lapisan reagen yang ada di atas agar deep menjadi berwarna merah ceri.Triptofan adalah asam amino esensial yang dapat mengalami oksidasi melalui beberapa aktifitas enzimatik bakteri. Konfersi triptofan menjadi produk metabolit dilakukan oleh enzim triptofanase. Indol diekstrak dari medium ke lapisan reagen oleh komponen butyl alcohol yang diasamkan dengan asam klorida (HCl) dan membentuk kompleks dengan pdimetilaminobenzaldehid yang menghasilkan warna merah ceri.Peptone mixture . f.Dextrose Reagen yang diperlukan : Metyl red indicator (7 gr) (5 gr) (5 gr) . Ketidakhadiran warna merah ceri mengindikasikan bahwa substrat tryptophan tidak terhidrolisis dan mengindikasikan reaksi indol negative. Reaksinya sebagai berikut : Kemampuan hidolisis triptofan dan produksi indol bukan karakteristik mikroorganisme dan oleh sebab itu dapat berfungsi sebagai penanda biokimia. Kultur yang menghasilkan lapisan reagen yang berwarna merah ceri setelah ditambah dengan reagen Kovac mengindikasikan indol positif.Tes metil merah (MR) Media yang digunakan Komposisi media : MR-VP broth : . Dalam uji ini digunakan agar SIM (Sulphite Indole Motility) yang mengandung substrat trytophan.

Produksi dan deteksi produk akhir non asam dari fermentasi glukosa E.aerogenes.Tes Voges-Proskauer Media yang digunakan Komposisi media : MR-VP broth : . Indikator metal red pada pH sekitar 4 akan berwarna merah yang mengindikasikan bahwa hasil uji positif. Pada uji ini indicator methyl red mendeteksi keberadaan konsentrasi asam yang besar pada hasil akhir dengan media MRVP Agar. Reaksinya sebagi berikut: Glukosa + H2O  Asam laktat Asam Asetat Asam format + CO2 + H2 (pH 4. Meskipun semua mikroorganisme enteric memfermentasi glukosa dengan menghasilkan asam organik. uji ini berguna dalam pemisahan E.aerogenes secara enzimatik mengubah asam ini ke hasil akhir yang tidak asam seperti 2.0) Uji +  ditunjukkan dengan warna media yang menjadi merah. E. Derajat keasaman yang rendah (pH = 4) distabilisasi dan diatur oleh E.Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C Glukosa heksosa adalah substrat utama yang dioksidasi oleh seluruh organisme enteric untuk produksi energi. Produk akhir dari reaksi ini dapat bervariasi tergantung reaksi enzimatik spesifik yang ada dalam bakteri. Kedua organisme ini menghasilkan produk akhir asam organik selama masa inkubasi awal.coli pada akhir masa inkubasi. Selama inkubasi selanjutnya. Pada pH sekitar 6 masih tetap mengindikasikan keberadaan asam tapi pada konsentrasi ion hydrogen yang lebih rendah. Indikator berubah warna jadi kuning dan mengindikasikan hasil uji yang negatif. areogenes diperkuat dengan uji Voges-Proskauer. g.Peptone mixture .coli dan E.Potassium phosphate (7 gr) (5 gr) .3-butanadiol dan acetoin (asetilmetil-karbinol) yang menghasilkan pH sekitar 6.

sebagai warna mawar pada medium.magnesium sulfate (5 gr) (2 gr) (0.2 gr) OH + 40% KOH Oksidasi C CH3 Diasetil O CH3 C O + C NH2 NH NH-R Guanidin Kompleks berwarna Pink .sodium citrate . dan bila tidak ada berarti hasilnya negatif.ammonium dihydrogen phosphate (1 gr) . Reaksi ini terjadi pada keberadaan katalis α-naphthol dan grup guanidine yang ada pada peptone pada medium MRVP. CH3 OH C O CH CH3 Asetilmetilkarbinol α -naftol Reaksi Asetilmetilkarbinol dengan reagen Barrit h.Dextrose 3 Reagen yang diperlukan Asetilmetilkarbinol α -naftol Lama inkubasi : Barritt’s reagent A dan B Diasetil Guanidin 0 : 24 – 48 jam pada 37 C Uji Voges-Proskauer menentukan Reaksi Asetilmetilkarbinol dengan reagen Barrit kemampuan beberapa organisme untuk memproduksi produk akhir non asam atau netral seperti asetilmetil -karbinol yang berasal dari metabolisme glukosa.CH3 C CH CH3 O OH + OH 40% KOH Oksidasi CH3 C C O O + C NH2 NH NH-R (5 gr) Kompleks berwarna Pink CH .dipotassium hydrogen phospate (1 gr) . Deteksi acetylmethylcarbinol membutuhkan hasil akhir ini untuk dioksidasi menjadi senyawa diasetil.sodium chloride . Keberadaan warna mawar tua pada kultur setelah penambahan reagen Barritt mengindikasikan keberadaan acetylmethylcarbinol dan merupakan hasil positif. kompleks pink terbentuk. Sebagai hasil. Reagen yang digunakan dalam uji ini adalah reagen Barrit yang mengandung campuran α-naphthol alkoholik dan larutan 40% potassium hydroxide (KOH).Penggunaan Sitrat Media yang digunakan Komposisi media : Simmons citrate agar slant : .

08 gr) (15 gr) Pada ketiadaan glukosa atau laktosa yang dapat difermentasi. COOH CH2 HO C CH2 COOH C itrate COOH COOH Citras C O e + CH2 COOH COOH Oxaloaseti c acid CH3 COOH COOH C O + CO2 CH3 COOH Pyruvic acid Excess carbon dioxide Acetic acid 2. Sitrat. Kehadiran sodium carbonate mengubah indicator bromthymol biru pada medium dari hijau menjadi biru tua Prussia. medium menjadi alkalin-karbondioksida yang dihasilkan berkombinasi dengan sodium dan air membentuk sodium carbonate. dengan keberadaan enzim sitrase.bromthymol blue . CO2 + 2Na+ + H2O  Na2CO3  Alkaline pH  perubahan warna dari hijau ke menjadi biru . Sitrat positif ditunjukkan pertumbuhan pada permukaan slant yang diikuti warna biru. sedangkan negatif bila tanpa pertumbuhan dan medium tetap berwarna hijau.bacterological agar Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (0. Selama reaksi. 1. sebuah produk alkalin.. menghasilkan asam oksalaasetat dan asetat. Produk tersebut kemudian secara enzimatis diubah menjadi asam piruvat dan karbondioksida. Sitrat merupakan senyawa intermediet utama dalam sel dan diproduksi dengan kondensasi asetil aktif dengan asam oksalaasetat. Kemampuan ini tergantung pada keberadaan enzim sitrat permease yang memfasilitasi transport sitrat dalam sel. beberapa mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai sumber karbon untuk produksi energi mereka.

1 gr) (20 gr) (0. peran mereka pada substrat lebih lambat jika dibandingkan dengan spesies Proteus. Walaupun organisme lain mungkin menghasilkan urease. Kegagalan perubahan warna menjadi deep pink membuktikan reaksi negatif.Aktivitas katalase Media yang digunakan :Nutrient Agar .phenol red . Urease adalah enzim hydrolitik yang menyerang ikatan nitrogen n karbon pada komponen amida misalnya urea dan membentuk alkaline yang produk akhirnya adalah ammonia . j. Ketika substrat urea dipisahkan dari produknya.i. Adanya urease dapat dideteksi ketika organisme ditumbuhkan dalam urea broth medium yang mengandung pH indicator phenol red.adanya ammonia membuat lingkungan alkaline yang menyebabkan phenol red berubah menjadi deep pink.1 gr) . Hal ini menunjukkan reaksi positif terhadap adanya urease.Aktifitas urease Media yang digunakan Komposisi media : Urea broth : .1 gr) Urease yang diproduksi oleh beberapa mikroorganisme merupakan enzim yang secara khusus membantu mengidentifikasi Proteus vulgaris.urea . tes ini dapat dengan cepat membedakan anggota dari genus ini dari mikroorganisme lain yang tidak memfermentasi laktosa.5 gr) (0.monopotassium phosphate (9. Oleh karena itu.yeast extract Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (9.dipotassium phosphate .

Substansi ini diproduksi ketika bakteri aerob. Hal ini menunjukkan tes . Produksi katalase dapat ditentukan dengan penambahan substrat H2O2 pada tryticase soy agar slant culture yang telah diinkubasi. Organisme yang mampu memproduksi katalase secara cepat mendegradasi hydrogen peroksida berdasarkan reaksi berikut : 2H2O2 2H2O Air Hidrogen Peroksida Oksigen bebas + O2 (g) Organisme aerobic yang kekurangan katalase dapat mendegradasi toxic superoxide secara khusus menggunakan enzim superoxide dismutase. atau superoxide dismutase mungkin menjelaskan mengapa oksigen menjadi beracun untuk mikroorganisme. Bila enzim – enzim di atas tidak ada maka menyebabkan konsentrasi zat toksik dari H2O2 tidak dapat didegradasi ketika organisme tersebut ditumbuhkan disertai adanya oksigen.Peptone from casein .di mana oksigen merupakan akseptor electron terakhir. facultative anaerob. selama proses degradasi karbohidrat untuk produksi energi. secara ekstrem menghasilkan toxic superoxide.Kompisisi Media : . Jika ada katalase. Diperkirakan substansi ini akan dihasilkan dari organisme yang mati jika tidak mereka dapat didegradasi secara enzimatik.Meat extract . peroxidase. tetapi H2O2 kurang berbahaya bagi sel bakteri jika dibandingkan dengan superoksida. dan mikroaerophile menggunakan jalur respirasi aerobic.Agar (10 gr) (3 gr) (12 gr) Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C Selama respirasi aerobik. Ketidakmampuan strict anaerob untuk mensintesis katalase. seperti yang telah disebutkan pada reaksi kimia diindikasikan oleh gelembung dari gas oksigen yang ‘terbebas’. mikroorganisme memproduksi hydrogen peroksida dan dalam beberapa kasus. hasil akhir dari superoxide dismutase adalah H2O2.

ada golongan nonenterococci seperti S.Uji Bile Esculin Media yang digunakan Lama inkubasi : Bile esculin agar : 24 – 48 jam pada 370C Media ini digunakan untuk mengidentifikasi group D streptococcus. l.Uji 6. Bovis. yang digunakan dalam pengobatan manusia menggunakan laser. Bovis. Bila tidak terdapat warna hitam tidak mengidentifikasi organisme Group D streptococci. Group ini meliputi enterococcus seperti Enterococcus faecalis. Group D streptococcus menunjukkan α atau γ -hemolysis pada blood agar plates. m. Selain itu.5% sodium chloride broth Media yang digunakan Komposisi media Lama inkubasi : 6. yang digunakan dalam pengobatan manusia . Group D streptococci menghidrolisis glycoside esculin menjadi 6.7-dihydroxy-coumarin yang bereaksi dengan iron salt yang terkandung dalam medium.katalase positif. Enterococcus memiliki kemampuan antibiotik resisten dan yang lebih jarang sebagai vancomycin. yang mungkin menjadi penyebab infeksi pada urine. ada golongan nonenterococci seperti S. Bile esculin test : Dengan adanya bile. Group ini meliputi enterococcus seperti Enterococcus faecalis.5% : 24 – 48 jam pada 370C Media ini digunakan untuk mengidentifikasi group D streptococcus.5% NaCl Broth : brain – heart infusion broth NaCl 6. Selain itu. Group D streptococcus menunjukkan α atau γ -hemolysis pada blood agar plates. yang mungkin menjadi penyebab infeksi pada urine. sedangkan tidak terbentuknya gelembung adalah tes katalase negative. Hal ini menyebabkan timbulnya warna cokelat – hitam pada medium setelah diinkubasi.

proteose peptone . Sebagian besar.5 gr) (5 gr) (5 gr) (12 gr) (5%) Aktivitas hemolytic ini adalah salah satu cara untuk mengidentifikasi adanya streptococci.(β ) Beta-hemolysis merupakan penghancuran sel darah merah dengan sempurna. Ditandai dengan adanya zona berwarna hijau di sekitar koloni.5% sodium chloride broth : Group D enterococci dapat diidentifikasi dengan kemampuannya tumbuh pada medium ini jika dibandingkan dengan non enterococci.Aktivitas hemolytic Media yang digunakan Komposisi media : blood agar base : .4 kali diameter koloni.Agar .liver digest . Streptococcus viridans merupakan bakteri yang tidak patogen. .yeast extract . Enterococcus memiliki kemampuan antibiotik resisten dan yang lebih jarang sebagai vancomycin. n.menggunakan laser. Sedangkan yang lain.(γ ) Gamma-hemolysis diindikasikan dengan tidak adanya hemolysis di sekitar koloni. . . α -hemolytic streptococci. 6.(α ) Alpha-hemolysis merupakan bentuk hemolisis yang tidak sempurna. Streptococcus mampu memproduksi β -hemolysins dan bersimbiosis dengan bakteri patogen. ada 3 tipe reaksi hemolytic pada blood agar yaitu: . Ditandai dengan terbentuknya zona bening sekitar 2 .Darah steril Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (15 gr) (2. memiliki kemampuan untuk menyebabkan infeksi pada manusia seperti subacute endocarditis dan gagal jantung.NaCl . Dari hasil penelitian. γ -hemolytic streptococci bersifat avirulent.

Meat extract . hotplate.Peptone from casein . p. ada juga yang membutuhkan pewarnaan spora untuk mengidentifikasi lebih lajut. Selain α -hemolytic streptococci tidak akan mengalami lisis oleh agen tadi dan tidak larut dalam bile. Uji Pigmen Media yang digunakan Kompisisi Media : Nutrient Agar : . inoculating loop. Sedangan bila ditemukan warna yang lain berarti menandakan bahwa uji pigment positif.apabila pada medium nutrient agar tidak terlihat warna selain warna koloni. biakan yang larut dalam bile akan tampak jernih sedangkan yang tidak larut dalam bile akan tampak keruh. Pewarnaan spora Peralatan yang diperlukan : Bunsen. glass slides. Uji Bile Solubility Media yang digunakan Reagen yang digunakan Lama inkubasi : Bile solubility : Na-deoksikolat : 24 – 48 jam pada 370C Adanya surface-active agents seperti bile dan bile salts (sodium desoxycholate atau sodium dodecyl sulfate). menyebabkan dinding sel pneumococcus mengalami lisis. bibulous paper. Berikut adalah penjelasan tentang pewarnaan spora. Setelah diinkubasi. Selain dilakukan pewarnaan gram dan uji – uji biokimia.o. staining tray. lens paper dan mikroskop . maka hal itu menandakan bahwa uji pigmen negatif.Agar Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (10 gr) (3 gr) (12 gr) Pada uji pigmen ini.

Hal ini disebabkan masing. dan berfungsi untuk melindungi lingkungan bakteri yang dari tidak menguntungkan. central G: inflated spore Pedoman yang digunakan oleh praktikan dalam mengidentifikasi spesies suatu sampel adalah pohon filogenik.Reagen yang dibutuhkan Endospora : Malachite green dan safranin Lama inkubasi untuk biakan : 48 . Metode yang umum digunakan adalah Scaeffer-Fulton endospore stain.72 jam pada media agar slant merupakan struktur yang bersifat resisten.Gambar tentang berbagai bentuk spora sebagai berikut : A: oval. central E: circular. terminal C: rectangular.masing . terminal B: rectangular. subterminal D: rectangular. dorman. Struktur ini tidak dapat diwarnai dengan metode pewarnan sederhana maupun gram. terminal F: circular. Metode ini menggunakan malakit hijau sebagai pewarna primer (primer stain) dan safranin sebagai caounterstain.

Berikut skema pohon filogenik : .spesies memiliki jalur yang berbeda dalam proses pengidentifikasiannya.

Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka dapat disimpulkan sebagai berikut : 1a. maka dilakukan pewarnaan spora. maka dilakukan uji biokimia yaitu uji katalase.Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya Bacilli Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Corynebacterium spp.Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya cocci Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Micrococcus spp.Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya cocci . 1c.Penjelasan tentang pohon filogenik sebagai berikut : Setelah praktikan dapat mengidentifikasi bakteri berdasarkan pewarnaan gram dan morfologi bakteri. dan Lactobacillus spp. Staphylococcus spp dan Streptococcus spp. 1b.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.

1d. Bila uji katalase menunjukkan positif. maka dilakukan uji biokimia yaitu uji glukosa. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. 2b. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Faecalis dan S. maka dilakukan Uji Pigment. Bila uji Bile Esculin menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Micrococcus spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.. dan Staphylococcus spp. 3b.. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. Enterobacter spp. S. Klebsiella spp. maka dilakukan uji bile esculin.Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya Bacilli Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Citrobacter spp.epidermis. . Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Uji Mannittol 3a. maka dilakukan uji biokimia yaitu uji laktosa. Moraxella spp. Proteus spp. Saprophyticus.bovis. Bila uji katalase menunjukkan negatif. Uji Bile Esculin 3c. Bila uji Mannitol menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Staphylococcus aureus. Bila uji Mannitol menunjukkan negatif. Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya cocci Uji Katalase 2a. maka dilakukan uji pada 6. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Streptococcus spp.. dan Pseudomonas spp. Escherichia spp. dan Neisseria spp..Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Branhamella spp.5% NaCl Broth. maka dilakukan uji mannitol.varians.. M.luteus. M.

varians. Bila uji Bile Esculin menunjukkan negatif. 4f. Bila uji Hemolysis menunjukkan negatif. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.5% NaCl Broth menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Saprophyticus dan S. Bila uji pada 6.pyogenes.mitis dan S.mitis. Uji Fermentasi Fruktosa . S. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M. maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa. Faecalis. maka dilakukan Uji Bile Solubility. Bila uji Pigment menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M. 4d. 5b.3d. Uji Hemolysis 4e. maka dilakukan Uji Hemolysis.epidermis. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M. Bila uji pada 6.pyogenes.luteus dan M. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.bovis.5% NaCl Broth 4c. maka dilakukan Uji Fermentasi Fruktosa.5% NaCl Broth menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. Uji Pigment 4a. luteus.pneumoniae dan S. Bila uji Hemolysis menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah alpha hemolysis yaitu S. Uji Fermentasi Glukosa 5a. Bila uji Pigment menunjukkan negatif. varians. 4b. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Uji pada 6. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S.pneumoniae.

saprophyticus. . Megaterium dan B.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. 5d. 2b. maka dilakukan Uji Voges-Proskauer. Bila uji mannitol menunjukkan negatif. Bila uji mannitol menunjukkan positif. 5b. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. Bila uji Bile Solubility menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S.5c.. 3b. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka dilakukan uji mannitol. Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya Bacilli 2a Bila terdapat spora dalam sampel.pneumoniae. Bila tidak ditemukan adanya spora. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Bacillus spp. Uji katalase 3c. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. epidermis. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Corynebacterium spp. maka dilakukan uji katalase. dan Lactobacillus spp. maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat. mitis. Uji mannitol 3a.Bila uji Bile Solubility menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. Bila uji katalase menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Corynebacterium spp. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.subtilis. cercus. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B. Uji Bile Solubility 5e.

. Uji Fermentasi Mannitol.fermentum. Bila uji katalase menunjukkan positif. casei 5b.3d. maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa. Bila uji Fermentasi Mannitol menunjukkan negatif. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif (terbentuk asam dan gas). maka dilakukan Uji Fermentasi Mannitol. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. Megaterium. delbrueckii. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. Bila uji katalase menunjukkan positif. Bila uji Fermentasi Mannitol menunjukkan positif. 4f. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B.subtilis. Uji Reduksi Nitrat 4c. maka kemungkinan bakteri yang ada . Kutscheri. delbrueckii Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Bila uji mannitol menunjukkan positif. Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya cocci Uji Fermentasi Glukosa 4a. 5a. 4d. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. Uji Fermentasi Glukosa 4e. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. Bila uji katalase menunjukkan negatif. xerosis. casei dan L. Bila uji mannitol menunjukkan positif. 4b. Uji Voges-Proskauer dalam sampel adalah B. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Lactobaciillus spp. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif (hanya terbentuk asam).

3c. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan positif. Bila uji Fermentasi Laktosa menunjukkan negatif.. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Neisseria spp . coli. 2b. Bila uji Fermentasi Laktosa menunjukkan positif.catarrhalis 3d. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Proteus spp. Intermedius dan E.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan negatif.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat.Untuk mengetahui . dan Klebsiella spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.2a. maka dilakukan Uji Produksi Indole . Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif. 2b. maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa Uji Produksi Indole 3a.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah N. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Branhamella spp dan Moraxella spp. bovis Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya Bacilli Uji Fermenatasi Laktosa 2a. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M. Escherichia spp. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B. 3b. mucosa . Bila uji produksi indol menunjukkan positif. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan negatif.sicca . maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Citrobacter spp. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah N. maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat . Enterobacter spp. Uji Reduksi Nitrat 3a. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif. dan Pseudomonas spp..

Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif. ( I ) Uji Produksi Indole . 3d. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. Bila uji Penggunaan Citrate menunjukkan negatif. Uji Fermentasi Glukosa 3c.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. freundii dan K. Bila uji Metyl Red menunjukkan positif. maka dilakukan Uji Produksi H2S. Intermedius 4b.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Proteus spp. dan Klebsiella spp.. Bila uji Metyl Red menunjukkan negatif. Aerogenes dan K. 3b. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C.lebih detail tentang spesies sampel kita. maka dilakukan Uji Penggunaan Citrate .Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. freundii. maka dilakukan Uji Metyl Red .Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Enterobacter spp. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Pseudomonas spp. maka dilakukan Uji Produksi Indole. Escherichia spp.. (I) 4d. Uji Metyl Red 4c. Bila uji Penggunaan Citrate menunjukkan positif. Pneumoniae. maka dilakukan Uji aktivitas urease. coli. maka dilakukan Uji Reduksi Nitrate. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. Uji Penggunaan Citrate 4a.ozaenae. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.Bila uji produksi indol menunjukkan negatif.

Uji Produksi H2S( II ) 5e. Bila uji aktivitas urease menunjukkan negatif. Bila uji Produksi H2S menunjukkan negatif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah K.Bila uji Reduksi Nitrate menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. vulgaris dan P. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.. Uji aktivitas urease( I ) 5c. maka dilakukan Uji aktivitas urease . mirabilis dan P. maka dilakukan Uji Litmus Milk.mallei. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P.rettgeri.rettgeri. freundii 5b. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Uji Produksi H2S( I ) 5a. Bila uji Produksi Indole menunjukkan negatif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah K. ( II ) 4f. Aerogenes. Bila uji Produksi Indole menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. 4h. maka dilakukan Uji Produksi H2S. Bila uji Produksi Indole menunjukkan negatif.fluorescens.ozaenae. 5d.4e. ( II ) Uji Reduksi Nitrate 4g. vulgaris. Bila uji Produksi Indole menunjukkan positif. . Bila uji aktivitas urease menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. inconstans. Bila uji Produksi H2S menunjukkan positif. Pneumoniae.Bila uji Reduksi Nitrate menunjukkan negatif. 5f.aeruginosa dan P.

Jarum ose .Uji aktivitas urease( II ) 5g.Objek glass .Beker glass .Bila uji Litmus Milk menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P.Cawan petri . 5h.Pipet .Lampu spiritus .Alat : .Bila uji Litmus Milk menunjukkan positif.Erlemeyer . inconstans. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P.fluorescens yang mengalami reaksi alkaline. mirabilis. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. Bila uji aktivitas urease menunjukkan positif. Bila uji aktivitas urease menunjukkan negatif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. Alat dan Bahan : 1.Hotplate stirrer .Tabung .aeruginosa yang mengalami peptonization 5j. Uji Litmus Milk 5i. III.

Phenol Red Lactose Broth .Simmon’s Citrate Agar . 3) .Bahan : .Etanol 95% (Gram III) . membiarkan selama 3 menit. 2.Menetesi preparat dengan larutan lugol (Gram II) beberapa tetes.Gram’s iodine (Gram II) . d. Membiarkan selama 1 menit.Pewarnaan Gram: a. Membilas dengan air. Membilas preparat secara hati-hati dnegan air tetes larutan karbolgentian violet (Gram I). Cara Kerja : 1.Phenol Red Sucrose Broth . e.Safranin (Gram IV) .Starch Agar .MRVP Broth . Membilas .lahan dengan Gram III hingga tidak ada pewarna yang terlunturkan.Medium TSA .Sampel bakteri (Sampel 1.Phenol Red Dextrose Broth .Barrit A dan Barrit B .Nitrate Broth IV. c.Crystal violet (Gram I) .Menetesi preparat olesan bakteri yang telah difiksasi dengan beberapa dengan air.Reagen kovac’s .Medium Litmus Milk .Urea Broth .Nutrien Gelatin Broth . b.H2O2 3% .Medium SIM Agar . Mencuci dengan larutan Gram III (alkohol 96%) dengan cara memiringkan preparat kemudian menetesi perlahan.2.

Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Litmus Milk Broth 2. Menetesi preparat dengan larutan fuchsin (Gram IV) beberapa tetes. g.Phenol Red Lactose Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red lactose broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest . b.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis.f. Mendiamkan selama 3 menit. h. Kemudian mengeringkan di udara atau dengan cara menyerap kelebihan air dengan tissue. -Memiringkan tabung agar terbentuk media slant 3. Membilas preparat dengan air. menanam pada media tersebut. 3. Mengamati preparat di mikroskop dan mencatat hasilnya.Litmus Milk (100 gr/L) Cara pembuatan media : -Menimbang litmus milk kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave. Pembuatan Media untuk Stock Culture(Peremajaan) TSA slant (40 gr/L) -Menimbang TSA kemudian melarutkannya ke dalam aquades -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave. 2. Langkah inokulasi ke media : 1.Pembuatan Media untuk Uji Biokimia a.

Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis. dan phenol red dextrose broth. phenol red sucrose broth. menanam pada media – media pada bagian 1.SIM Agar Deep Tube (30 gr/L) -Menimbang SIM medium kemudian melarutkannya ke dalam aquadest . 2.48 jam pada suhu 370C. 3.Phenol Red Glucose Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red glucose broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave e.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi media dengan berbagai macam karbohidrat : phenol red lactose broth. e. d.Menginkubasi selama 24 . c.Phenol Red Fructose Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red fructose broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave.Phenol Red Mannitol Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red mannitol broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave Langkah inokulasi ke media fermentasi : 1.-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave.

-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave. -Memiringkan tabung agar terbentuk media slant Langkah inokulasi pada media : 1. Langkah inokulasi pada media : 1.5 gr/L) -Menimbang SCA kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave.Urea Broth (38.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis.5 gr/L) -Menimbang urea broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Mensterilkan campuran dengan memfiltrasinya -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung Langkah inokulasi pada media : 1.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi SIM agar deep tubes 2. .Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C g. 4.Simmon Citrate Agar Slant (22. menanam pada media SIM dengan menusukkan ke dalam agar.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Simmons citrate agar slants 2. menanam pada media tersebut dengan cara menggores zig-zag pada bagian yang miring.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Urea Broth 2. 3. f.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C.Untuk tes produksi Indol ditambahkan reagen Kovac 3-5 tetes pada medium yang telah diinkubasi. menanam pada media tersebut. 3.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis.

Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C 4.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis. menanam pada media tersebut dengan cara menggores zig-zag pada bagian yang miring.3.Nutrient Agar -Menimbang Nutrient Agar kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer kemudian diautoclave -Memasukkan campuran ke dalam cawan petri steril dan membiarkannya memadat. menanam pada media tersebut dengan men-strict medium 3.Menginkubasi selama 24-48 jam pada suhu 370C i.Menyiapkan plate berisi TSA 2. 3.Untuk membuktikan adanya aktivitas katalase ditambahkan reagen H2O2 3% pada medium yang tlah diinkubasi.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Nutrient Agar slant 2.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C h. . Langkah inokulasi pada medium : 1.Tryptycase Soy Agar (TSA) Plate (40 gr/L) -Menimbang medium TSA kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer kemudian diautoclave -Memasukkan campuran ke dalam cawan petri steril dan membiarkannya memadat. Langkah inokulasi pada medium : 1.

Pewarnaan gram E. Hasil Percobaan : 1.V.Pewarnaan gram 1a.coli .

Pewarnaan gram Proteus mirabilis .1b.Pewarnaan gram Staphylococcus epidermis 1c.

coli -Uji Laktosa -Uji Indol -Uji Citrat .Uji Biokimia 2.Uji Biokimia E.Uji Biokimia 2a.2.

Uji Biokimia Staphylococcus epidermis -Uji Katalase -Uji Mannitol -Uji Pigment .b.

-Uji Fruktosa c.Uji Biokimia Proteus mirabilis -Uji Laktosa .

-Uji Glukosa -Uji Indole -Uji Urea .

Tabel Hasil Percobaan 3a.3. Tabel Hasil Percobaan Proteus mirabilis Macam Uji Pewarnaan Gram Morfologi Fermentasi laktosa Fermentasi glukosa Produksi Indol (SIM medium) Hasil Uji negative bacill + - . Tabel Hasil Percobaan E. Tabel Hasil Percobaan Staphylococcus epidermis Macam Uji Pewarnaan Gram Morfologi Aktivitas katalase Fermentasi mannnitol Pigment Fermentasi Fruktosa Hasil Uji positif coccus + + 3c.coli Macam Uji Pewarnaan Gram Morfologi Fermentasi Laktosa Produksi Indol (SIM medium) Penggunaan sitrat Hasil Uji negative coccobacill + + - 3b.

Pembahasan 1.Pewarnaan Gram & Morfologi Hasil uji morfologi pada sampel A menunjukkan bahwa bakteri pada sampel A termasuk ke dalam golongan bakteri gram negatif dengan bentuk coccobacill.Aktivitas Urease + VI.Sampel A 1a. Bakteri tersebut berwarna merah setelah diwarnai dengan pewarnaan gram. lapisan lipopolisakarida pada bakteri . Hal ini disebabkan oleh.

Uji Fermentasi Laktosa Uji Fermentasi Laktosa ini dilakukan pada medium phenol red lactosa broth. dari hasil pewarnaan gram dan morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel A merupakan bakteri gram negatif dan bentuknya coccobacill sehingga untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi laktosa.ini lebih sedikit sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya akan luntur bersama dengan lapisan lipopolisakaridanya ketika dicucci dengan gram III (alkohol) sehingga yang tersisa hanya warna merah dari safranin yang merupakan pewarna tandingan. bakteri sampel A tidak dapat memfermentasi laktosa.Uji Produksi Indol Uji Produksi Indol ini dilakukan pada medium SIM dengan bantuan penambahan reagen Kovac akan terlihat cincin pink pada medium. 1c. 1b. Pada uji ini. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji Produksi Indol. Hal ini berarti bakteri sampel A memiliki enzim triptofanase untuk memecah triptofan sesuai dengan reaksi berikut : . Oleh karena itu.Pada uji ini. bakteri sampel A menunjukkan hasil positif yaitu terbetuk cincin pink setelah penambahan reagen Kovac. Hasil uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. Oleh karena itu.

2. Oleh karena itu. bakteri sampel A menunjukkan hasil negatif yang ditandai dengan tidak berubahnya warna medium dari hijau menjadi biru. dapat disimpulkan berdasrkan pohon filogenik bahwa bakteri sampel A adalah E.Uji Penggunaan Citrat Uji penggunaan sitrat menggunakan medium Simmon’s Citrate Agar yang mengandung sitrat sebagai satu – satunya sumber karbon.. Pada uji ini. Hal ini berarti bakteri sampel A tidak memiliki enzim citrase untuk mengubah sitrat menjadi oksaloasetat dan asam asetat yang selanjutnya akan dirubah menjadi asam piruvat dan CO2 .Pewarnaan Gram & Morfologi Hasil uji morfologi pada sampel B menunjukkan bahwa bakteri pada sampel B termasuk ke dalam golongan bakteri gram positif dengan bentuk coccus. Oleh karena itu.Sampel B 2a. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji penggunaan citrat. .coli. 1d.

untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi mannitol. Hal ini disebabkan oleh. 2d. dari hasil pewarnaan gram dan morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel B merupakan bakteri gram positif dan bentuknya coccus sehingga untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji aktivitas katalase.Uji Aktivitas Katalase Uji aktifitas katalase dilakukan dengan menggunakan medium TSA dan selanjutnya dilakukan penambahan reagen berupa H2O2 3%. Bakteri sampel B menunjukkan hasil positif pada uji ini yang artinya bakteri sampel B memiliki enzim katalase.Bakteri tersebut berwarna biru-ungu setelah diwarnai dengan pewarnaan gram. Hasil uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. Oleh karena itu. bakteri sampel B tidak dapat memfermentasi mannitol. Hal ini berarti bakteri sampel B dapat memecah hidrogen peroksida menjadi air dan karbondioksida sesuai reaksi berikut Oleh karena itu. 2c. Hasil positif tersebut ditunjukkan dengan adanya gelembung – gelembung gas pada permukaan koloni ketika ditetesi dengan H2O2 3%. Oleh karena itu. lapisan lipopolisakarida pada bakteri ini cukup tebal sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya tidak bisa luntur ketika dicuci dengan gram III (alkohol) sehingga yang tersisa adalah warna biru-ungu oleh reagen kristal-violet.Pada uji ini.Uji Fermentasi Mannitol Uji Fermentasi Mannitol ini dilakukan pada medium phenol red mannitol broth. 2b. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji pigment.Uji Pigment .

dan juga adanya gas. dari hasil pewarnaan gram dan morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel C merupakan bakteri gram negatif dan bentuknya bacill sehingga untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi laktosa. dapat disimpulkan berdasarkan pohon filogenik bahwa bakteri sampel B adalah Staphylococcus epidermis. 3. Hal itu berarti hasil uji pigment adalah negatif.Oleh karena itu.Pada uji ini. Pada uji ini. Hasil uji positif pada fermentasi laktosa ditandai dengan berubahnya warna medium menjadi kuning yang disebabkan oleh adanya produk akhir fermentasi yang bersifat asam.Uji Fermentasi Fruktosa Uji Fermentasi Fruktosa ini dilakukan pada medium phenol red fructosa broth. bakteri sampel B tidak menampakkan warna yang lain selain warna koloni yaitu putih mengkilap. Oleh karena itu. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi fruktosa 2e. Hal ini disebabkan oleh.Uji Pigment ini dilakukan pada medium nutrient agar. Bakteri tersebut berwarna merah setelah diwarnai dengan pewarnaan gram. lapisan lipopolisakarida pada bakteri ini lebih sedikit sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya akan luntur bersama dengan lapisan lipopolisakaridanya ketika dicucci dengan gram III (alkohol) sehingga yang tersisa hanya warna merah dari safranin yang merupakan pewarna tandingan. bakteri sampel B dapat memfermentasi fruktosa sehingga hasilnya positif. 3b.Uji Fermentasi Laktosa .Oleh karena itu.Pewarnaan Gram & Morfologi Hasil uji morfologi pada sampel C menunjukkan bahwa bakteri pada sampel C termasuk ke dalam golongan bakteri gram negatif dengan bentuk bacill.Sampel C 3a.

ini dilakukan pada medium urea broth yang mengandung pH indicator phenol red. Akan tetapi. Oleh karena itu. dan juga adanya gas. Oleh karena itu.Uji aktivitas urease. Hasil uji positif pada fermentasi laktosa ditandai dengan berubahnya warna medium menjadi kuning yang disebabkan oleh adanya produk akhir fermentasi yang bersifat asam. 3e. Uji aktivitas urease. bila hasilnya positif. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji aktivitas urease. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi glukosa. Pada uji ini. bakteri sampel C tidak dapat memfermentasi laktosa. Oleh karena itu.Hal ini berarti bakteri sampel A tidak memiliki enzim triptofanase untuk memecah triptofan.Hal ini menandakan bahwa Ketika substrat urea dipisahkan dari . untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji Produksi Indol. bakteri sampel C berubah warna menjad deep pink yang menandakan bahwa uji aktivitas urease positif. Pada uji ini.Uji Produksi Indol Uji Produksi Indol ini dilakukan pada medium SIM dengan bantuan penambahan reagen Kovac akan terlihat cincin pink pada medium. bakteri sampel C dapat memfermentasi glukkosa sehingga hasilnya positif.Uji Fermentasi Laktosa ini dilakukan pada medium phenol red lactosa broth. Pada uji ini.Uji Fermentasi Glukosa Uji Fermentasi Glukosa ini dilakukan pada medium phenol red glukosa broth. Hasil uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. pada bakteri sampel C tidak menunjukkan terbentuknya cicncin pink setelah penambahan reagen Kovac sehingga hasilnya negatif. 3d. 3c.

San Francisco. Christine L. Funke. Benjamin Cummings. dapat disimpulkan berdasarkan pohon filogenik bahwa bakteri sampel C adalah Proteus mirabilis. Natalie Sherman.html . yang menjadi pedoman utama dalam pengidentifkasian spesies adalah penggunaan pohon filogenik.adanya ammonia membuat lingkungan alkaline yang menyebabkan phenol red berubah menjadi deep pink. Reaksinya sebagai berikut : Oleh karena itu. James G. VII. Benjamin Cummings. 2005. Hal ini menunjukkan reaksi positif terhadap adanya urease. VIII.wsu. Oleh karena itu.edu/~cbwilso/250cho. Selain itu.edu:82/hurlbert/micro101/pages/101lab9. Kesimpulan : Dalam melakukan identifikasi spesies dilakukan uji morfologi dan uji biokimia. Kegagalan perubahan warna menjadi deep pink membuktikan reaksi negatif. “Microbiology – A Laboratory Manual”.htm http://www. Cappuccino. seventh edition.sampel kami berurutan dari adalah Escherichia coli.produknya. Microbiology-An Introduction. Daftar Pustaka Tortora. Gerard J.slic2. Hal in disebabkan karena masing – masing spesies memiliki jalur yang berbeda baik dalam pewarnaan gram/morfologi atau metabolismenya.siue.Case. 2001. http://www. San Francisco. Berdell R. Staphylococcus epidermis dan Proteus mirabilis.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful