IDENTIFIKASI SPESIES MIKROORGANISME SAMPEL

I. Tujuan Percobaan : Mampu menggunakan teknik pewarnaan, pengkulturan, dan uji biokimia yang telah didapat untuk menentukan genus kultur bakteri yang belum diketahui. II. Dasar Teori :

Spesies berasal dari bahasa Latin species yang merupakan tingkatan dalam taksonomi yang terkecil, biasanya digunakan untuk mengklasifikasi organisme baik yang hidup maupun organisme yang fosil. Dalam biologi, species adalah salah satu bentuk pengelompokan dalam klasifikasi makhluk hidup.. Dalam sistem tatanama binomial, nama suatu spesies makhluk hidup terdiri atas dua kata: nama genusnya (diawali dengan huruf kapital) dan nama penunjuk spesiesnya. Misalnya, dari gambar di samping,Panthera pardus, Nama Panthera merupakan nama genus atau marga sedangkan pardus merupakan nama species. Berikut penjelasan singkat mengenai 3 spesies sampel yang kelompok kami temukan. Ketiga spesies sampel kami antara lain adalah E. coli, Staphylococcus epidermis dan Proteus mirabilis. 1. E.coli Escherichia coli, atau biasa disingkat E. coli, adalah salah satu jenis spesies utama bakteri gram negatif. Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh Theodor Escherich ini hidup pada tinja, dan dapat menyebabkan masalah kesehatan pada

manusia, seperti diare, muntaber dan masalah pencernaan lainnya. E. coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika. Biasa digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan. E. coli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah dalam penanganannya. 2. Staphylococcus epidermis Staphylococcus epidermis merupakan bakteri non-motil, jenis coccus grampositive cocci, dan berbeda dengan Staphylococcus aureus, bakteri ini tidak memiliki enzim koagulase. Bakteri ini merupakan bakteri yang patogen dan aktif dalam aliran darah melalui luka, jarum dll. Infeksi dari bakter in berakibat pembengkakan pada daerah yang terinfeksi. 3.Proteus mirabilis Proteus mirabilis merpakan bakteri gram negative dan bakteri fakultatif anaerob. Bakteri ini memiliki kemampuan motalitas dan aktivitas urease. P.mirabilis menyebabkan 90% infeksi yang disebabkan oleh jenis ‘Proteus’. P.mirabilis dapat menggunakan urea dan citrate untuk produksi energi. Bakteri ini dapat memproduksi gas hydrogen sulfide dan membentuk zona bening pada media. P.mirabilis ini motil, memiliki peritrichous flagella yang diketahui sebagai penyebab pergerakan. Bakteri ini pada umumnya ditemukan pada intestinal manusia. P.mirabilis tidak pathogen pada guinea pigs atau ayam. Uji – uji biokimia pada P.mirabilis adalah sebagai berikut : *Indole negative dan reduksi nitrat positif (tidak ada gas yang diproduksi) *Metyl red positif dan Voges-Proskauer negatif *Catalase positif and Cytochrome Oxidase negatif Untuk mengidentifikasi spesies suatu bakteri, praktikan perlu melakukan serangkaian uji yang berurutan sesuai dengan hasil percobaan yang telah ada. Berikut adalah penjelasan berbagai uji yang harus dilakukan dalam mengidentifikasi spesies sampel : 1.Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram adalah suatu metode yang digunakan untuk membedakan mikroorganisme berdasarkan susunan & struktur dinding sel mikroorganisme. Metode pewarnaan gram membutuhkan 4 jenis reagen yaitu : crystal gentian violet (Gram I), iodine (Gram II), alkohol 95% (GramIII), dan saphranin (Gram IV). Dengan menggunakan metode pewarnaan gram, bakteri dapat digolongkan menjadi 2 kelompok, yaitu : bakteri gram (+) yang akan berwarna biru-ungu dan bakteri gram (-) yang berwarna merah.

Staphylcuococs (+)

E. coli (-)

Beberapa fungsi reagen dalam pewarnaan gram yang menentukan spesies sampel termasuk dalam gram (+) atau gram (-) adalah sebagai berikut: • • Pemberian kristal fiolet berfungsi untuk mewarnai semua sel. (baik Iodin berfungsi sebagai mordan. Di dalam sitoplasma iodin gram negatif maupun positif) membentuk komplek dengan kristal fiolet. Pembentukan kompleks mengakibatkan sel berwarna biru tua. • Pemberian alkohol memiliki 2 fungsi: – Pada gram positif alkohol mengakibatkan peptidoglikan terdehidrasi sehingga ukuran porinya mengecil. Ini mengakibatkan kristal violet tidak dapat keluar dari sitoplasma. – Pada gram negatif alkohol mencuci dinding sel dan meninggalkan lubang kecil pada peptidoglikan. Ini mengakibakan kristal violet tercuci keluar dan sel menjadi tidak berwarna.

Safranin berfungsi sebagai couter staining. Safranin akan

memberi warna pada gram negatif sehingga gram positif dan negatif akan terlihat berbeda secara jelas di bawah mikroskop. Dari hasil pewarnaan gram, selain dapat membedakan mikroorganisme berdasarkan susunan & struktur dinding sel mikroorganisme, praktikan juga dapat mengidentifikasi morfologi dari bakteri tersebut. Berikut gambar tentang berbagai bentuk morfologi dari bakteri sebagai berikut :

2.Uji Biokimia Biokimia adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui metabolisme dan reaksi yang dijalankan oleh suatu mikroorganisme. Jenis – jenis uji biokimia untuk mengidentifikasi spesies antara lain : a.Reaksi Litmus Milk Media yang digunakan Komposisi Media : litmus broth : - Litmus - Skim milk powder - Sodium sulfite Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (0,5 gr) (100 gr) (0,5 gr)

Penyusun susu terbesar yang digunakan sebagai dasar uji biokimia dalam media litmus milk adalah laktosa, protein susu yaitu kasein, lacto-albumin dan lactoglobulin.Untuk melihat adanya perubahan metabolisme yang diproduksi dalam medium, digunakan pH indicator yaitu oxidase-reduction

indicator litmus. Indicator ini akan menyatu dalam medium. Saat ini,litmus milk merupakan medium yang baik untuk mikroorganisme yang dapat mencerna substrat milk, tergantung dari komplemen enzimatik bakteri tersebut. Beberapa perubahan biokimia dalam litmus milk :  Fermentasi Laktosa Organisme mampu menggunakan laktosa sebagai sumber karbon untuk produksi energi, dengan menggunakan induksi enzim β -galactosidase. Degradasi laktosa dirumuskan sebagai berikut:

Adanya asam laktat dapat dengan mudah dideteksi karena litmus bewarna ungu pada pH netral dan berubah menjadi merah muda ketika medium menjadi asam yaitu pada pH sekitar 4.  Adanya gas + H2
.

Produk akhir pada fermentasi laktosa adalah CO2

Adanya gas

ini mungkin dapat dilihat sebagai pemisahan ‘curd’ atau pembelahan dalam curd sebagai akibat adanya gas yang naik ke permukaan.  Reduksi Litmus Fermentasi adalah proses anaerobic yang meliputi biooksidasi yang terjadi karena tidak ada molekul oksigen. Oksidasi ini mungkin akan terlihat sebagai perpindahan hydrogen (dehydrogenation) dari substrat.Karena ion hidrogen tidak dapat dalam bentuk bebas/melayanglayang,hydrogen memerlukan akseptor elektron yang dapat mengikat ion hydrogen jika hal tersebut tidak terjadi maka reaksi reduksi-oksidasi tidak akan berjalan dan produksi energy tidak dapat dihasilkan. Pada tes litmus milk, litmus berperan sebagai akseptor. Saat berada dalam kondisi oksidasi, litmus berwarna ungu; ketika litmus menerima

Dengan menggunakan enzim proteolitik. litmus akan tereduksi dan berubah menjadi putih atau warna putih susu. curd jenis ini berupa gumpalan semisolid yang lembut. Oksidasi laktosa ini memproduksi asam laktat. Tidak seperti acid curd. -Rennet curd Beberapa organisme menghasilkan rennin.hydrogen dari substrat. gas CO2 dan gas H2. yang menyebabkan perubahan menjadi putih dan menandakan bahwa laktosa tereduksi. enzim yang berperan mengubah casein menjadi bentuk paracasein. . selain itu adanya calcium ion diubah menjadi calcium paracaseinate dan membentuk gumpalan yang tidak larut. Curd yang terbentuk bergantung pada mekanisme biokimia yang membentuk curd tersebut Ada 2 jenis curd yang mungkin terbentuk yaitu : -Acid curd Asam laktat atau asam organic lain menyebabkan pengendapan milk protein casein sebagai calcium caseinate menjadi bentuk gumpalan yang tidak larut.  Terbentuknya Curd Aktivitas biokimia dari mikroorganisme yang berbeda ditumbuhkan pada litmus milk menghasilkan produksi 2 tipe curd (clots) yang berbeda.  Proteolysis (Peptonization) Ketidakmampuan beberapa mikroorganisme untuk menghasilkan energi melalui jalur fermentasi laktosa menandakan bahwa mikroorganisme tersebut harus menggunakan sumber nutrisi lainnya sebagai protein untuk menghasilkan energi. Gumpalan ini akan mengalir perlahan saat tabung dimiringkan. Lactose Glucose Pyruvic acid -Lactic acid -Butyric acid -CO2 + h2 Gas hydrogen dikenal sebagai hydrogen litmus acceptor. asam butirat.

menjadi bentuk dasarnya yaitu asam amino. glucose.organisme menghidrolisis milk protein. Reaksi ini mengindikasikan partial degradation dari casein menjadi rantai polipeptida yang lebih pendek. reaksi sedangkan bagian bawahnya kehilangan strukturnya dan membentuk cairan kecoklatan  Reaksi Alkaline Reaksi alkaline dibuktikan ketika warna pada medium tidak berubah atau berubah menjadi biru. Litmus berubah warna menjadi lapisan ungu yang berada di atas/ permukaan dari tabung. dengan disertai pelepasan produk akhir alkaline yang menyebabkan perubahan warna.Fermentasi Karbohidrat Media yang digunakan Komposisi Media : phenol red lactose. Proses pencernaan protein disertai dengan perubahan sejumlah besar ammonia yang dihasilkan dalam medium dengan alkaline pH. Alkaline Reaction b. Acid Formation E.Casein peptone (10 gr) . Uninoculated Control D. Proteolysis of casein F. terutama casein. Reduction/Curd (arrow denotes gas pocket) C. fructose. Beberapa kemungkinan hasil yang diperoleh dari uji Litmus Milk : Keterangan gambar :A. Acid/Reduction/Curd B. mannitol broth : .

-pH indicator phenol red. Satu mol glukosa dikonversi menjadi dua mol asam piruvat. Fermentasi digambarkan dengan baik lewat degradasi glukosa melalui jalur Embden-Meyerhof. substrat-substrat seperti karbohidrat dan alkohol mengalami disimilasi secara anaerob dan menghasilkan asam organik (sebagi contoh : laktat.yang mengarah pada biooksidasi substrat. seringkali karbohidrat. dan variasi produk akhir menunjukkan kemampuan fermentasi mereka yang berbeda. Anaerob fakultatif mampu melakukan keduanya sedangkan beberapa organisme justru tidak mampu mengoksidasi glukosa secara anareob maupun aerob. yang dikenal dengan jalur glikolisis.8). atau asam asetat) yang disertai adanya gas seperti hydrogen atau karbondioksida. yang berguna untuk mendeteksi gas yang dihasilkan. Medium fermentasi karbohidrat mengandung : -Nutrient broth untuk pertumbuhan semua organisme -Karbohidrat spesifik yang berfungsi sebagai substrat untuk determinasi kemampuan fermentasi organisme-organisme.Sodium chloride . Degradasi fermentasi secara anaerob mengambil tube broth fermentasi yang mengandung tabung Durham.48 jam pada 370C (5 gr) (5 gr) (0. yang merah pada pH netral (7) dan kuning bila sedikit asam (pH 6.-Lactose/fructose/glucose/mannitol . tergantung pada komplemen enzimnya. yang mana merupakan senyawa intermediet utama yang dihasilkan dari degradasi glukosa. Organisme menggunakan karbohidrat secara berbeda. sedangkan yang lain dengan aerob. format. Beberapa organisme mampu memfermentasikan gula seperti glukosa secara anaerob. Pada fermentasi. Hasil metabolisme asam piruvat lebih lanjut tidak sama untuk semua organisme.018 gr) Kebanyakan organisme memperoleh energi melalui suatu urutan reaksi enzimatis tertentu dan terintegrasi. menjadi .Phenol red Lama inkubasi : 24 .

Produksi H2S Media yang digunakan Komposisi Media : SIM agar deep tubes : .Ferric ammonium sulfate . Setelah inkubasi. Reaksi tersebut membebaskan ammonia hidroksida (NH4OH) dan menghasilkan lingkungan alkalin. Di antara nutrien tersebut adalah pepton yang ada pada nutrient broth.Meat peptone .Bacteriological agar . karbohidrat yang telah difermentasi dengan hasil sampingan asam akan menyebabkan phenol red menjadi kuning.Sodium thiosulfate Lama inkubasi Terdapat dua jalur : 24 – 48 jam pada 370C fermentasi utama yang mana beberapa (3. Inkubasi yang berlebih dapat menutupi reaksi produksi asam oleh produksi alkali yang disebabkan kegiatan enzimatik pada substrat. Organisme menggunakan nutrien lain dalam medium sebagai sumber energi. Pepton dapat didegradasi oleh enzim mikrobial menjadi asam amino yang secara enzimatis dikonversi menjadi asam ketoamino lewat deaminasi oksidatif. c. yang mengindikasikan reaksi positif. Asam ketoamino tersebut lalu dimetabolisme lewat siklus Krebs untuk menghasilkan energi. Kultur yang tidak mampu memfermentasi substrat karbohidrat tidak akan merubah warna indicator. selain karbohidrat. produksi asam disertai produksi gas (CO2) yang terlihat sebagai gelembung pada tabung Durham.2 gr) (20 gr) (6. yang menimbulkan warna merah tua. dan tabung tetap warna merah.5 gr) (0.Inkubasi dilakukan dalam waktu 48 jam. serta tidak ada gas pada tabung Durham.Casein peptone . Kekurangan fermentasi karbohidrat oleh beberapa organisme tidak dapat diartikan sebagai ketiadaan pertumbuhan.2 gr) mikroorganisme mampu memproduksi hydrogen sulfide (H2S) : .1 gr) (0. Ini merupakan reaksi negatif. Pada beberapa kasus.

sulfat (SO42-). SIM agar juga dapat digunakan untuk mendeteksi motilitas organisme. kehilangan atom sulfur dan direduksi dengan penambahan hydrogen dari air untuk membentuk H2S. Pepton tersebut didegradasi oleh enzim microbial menjadi asam amino. membentuk endapan tak larut ferrous sulfide berwarna hitam yang dapat dilihat di sepanjang tusukan inokulasi. Jalur I : gas H2S dapat diproduksi oleh reduksi (hidrogenasi) sulfur organic yang ada di asam amino sistein. Motilitas disadari saat . dan Agar untuk membuat medium menjadi semisolid dan mendorong respirasi anaerob. meliputi sistein. Ferrous ammonium sulfat gas. yang mana merupakan komponen peptone yang terdapat pada medium. Medium yang mengandung sodium thiosulfat.  Jalur II : gas H2S dapat dihasilkan dari reduksi senyawa sulfur anorganik seperti thiosulfat (S2O32-). atau sulfit (SO32-). Asam amino ini dengan keberadaan sistein desulfurase. Ketiadaaan endapan menunjukkan reaksi negative. yang mengindikasikan terbentuknya H2S. Atom sulfur bertindak sebagai akseptor hydrogen selama oksidasi senyawa anorganik seperti ditunjukkan sebagai berikut : Pada percobaan digunakan SIM medium yang mengandung peptone dan sodium thiosulfat sebagai substrat sulfur. ferro sulfat (FeSO4) sebagai indicator H2S. dengan mikroorganisme tertentu dapat direduksi menjadi sulfite dengan pembebasan H2S.

Meat extract . Pada respirasi organisme anaerobic merupakan proses oksidatif karena itu .Solution B (αnaphthylamine) dan bubuk Zn.Agar Reagen yang diperlukan Lama inkubasi (10 gr) (3 gr) (12 gr) :Solution A (asam sulfanilat).Peptone from casein . :24 – 48 jam pada 370C Reduksi nitrat oleh beberapa mikroorganisme aerobik dan fakultatif anaerobik terjadi dengan adanya molekul oksigen yaitu proses anaerobik.Reduksi Nitrat Media yang digunakan Kompisisi Media :Nutrient Agar : . Pertumbuhan organisme nonmotil sesuai dengan garis inokulasi ditunjukkan sebagai berikut : d.pertumbuhan kultur dari organisme berflagellata tidak sesuai dengan garis inokulasi.

) atau sulfat (SO42-) untuk suplai oksigen yang kemudian menjadi akseptor hydrogen akhir selam pembentukan energi.+ Nitrit H2O Air Hydrogen electron Beberapa organisme mempunyai kapasitas enzimatik untuk mengurangi jumlah nitrit menjadi ammonia (NH3+) atau molekul nitrogen (N2).1% kalium nitrat (KNO3) sebagai substrat nitrat.1% agar. diikuti dengan pemberian Larutan B yaitu α-naphthylamine. kemampuan organisme untuk mengurangi nitrat atau nitrit dapat dibuktikan dengan penambahan 2 reagen: Larutan A yaitu asam sulfanilat. Kondisi agar yang semisolid akan menyebabkan difusi oksigen ke dalam medium menjadi sedikit sehingga bakteri anaerob akan melakukan reduksi nitrat Setelah kultur diinkubasi.medium mengandung nutrient broth bersupplemen 0. NO2Nitrit 2NO3. Dapat ditambahkan agar medium menjadi semisolid yaitu dengan penambahan 0. Adanya proses reduksi dengan penambahan Larutan A dan B akan menghasilkan warna cherry red.sel menggunakan substrat inorganic seperti nitrat (NO3.+ 12H+ + 10eNitrat NH3+ Ammonia N2 + 6H2O Gas Nitrogen Reduksi nitrat dapat diterangkan dengan mengkultivasi organisme dalam medium nitrat broth. Nitrat NO3Reduktase NO2- . Perubahan nitrat menjadi nitrit dapat dilihat dari reaksi di bawah ini: Nitrat NO3 + 2H + 2e Nitrat + - Reduktase NO2. Pada dasarnya.

bubuk besi ditambahkan sedikit ke kultur yang telah diberi Larutan A dan B.1 gr) (0.Ferric ammonium sulfate (0. reaksi reduksi nitrat dikatakan negatif. atau *Organisme mempunyai semacam potensi enzim nitrate reductase yaitu nitrat secara cepat direduksi melalui nitrit menjadi ammonia atau bahkan menjadi molekul nitrogen. mak nitrat pada medium direduksi melalui nitrit menjadi ammonia dan gas nitrogen.Bacteriological agar .Casein peptone . Untuk membuktikan ada tidaknya nitrat yang direduksi melalui terbetuknya nitrite. Jika nitrat tidak direduksi.Kultur yang tidak memproduksi perubahan warna seperti yang tertera di atas memiliki 2 kemungkinan : *Nitrat tidak direduksi oleh organisme.2 gr) . e.Sodium thiosulfate Reagen yang diperlukan Lama inkubasi : Kovac’s reagent : 24 – 48 jam pada 370C (3.2 gr) .5 gr) (20 gr) (6. Ini adalah reaksi yang positif.Meat peptone . Besi mereduksi nitrat menjadi nitrit. Bila setelah penambahan besi tidak ada perubahan warna.Produksi Indol Media yang digunakan Kompisisi Media : SIM agar deep tubes : . Bila ada perubahan menjadi warna merah maka membuktikan nitrat tidak direduksi menjadi nitrit oleh organisme.

Dalam uji ini digunakan agar SIM (Sulphite Indole Motility) yang mengandung substrat trytophan. Ketidakhadiran warna merah ceri mengindikasikan bahwa substrat tryptophan tidak terhidrolisis dan mengindikasikan reaksi indol negative. Reaksinya sebagai berikut : Kemampuan hidolisis triptofan dan produksi indol bukan karakteristik mikroorganisme dan oleh sebab itu dapat berfungsi sebagai penanda biokimia.Potassium phosphate .Peptone mixture . Indol diekstrak dari medium ke lapisan reagen oleh komponen butyl alcohol yang diasamkan dengan asam klorida (HCl) dan membentuk kompleks dengan pdimetilaminobenzaldehid yang menghasilkan warna merah ceri. Konfersi triptofan menjadi produk metabolit dilakukan oleh enzim triptofanase.Tes metil merah (MR) Media yang digunakan Komposisi media : MR-VP broth : . f. Keberadaan indol dideteksi dengan menambahkan reagen Kovac yang menyebabkan lapisan reagen yang ada di atas agar deep menjadi berwarna merah ceri.Triptofan adalah asam amino esensial yang dapat mengalami oksidasi melalui beberapa aktifitas enzimatik bakteri.Dextrose Reagen yang diperlukan : Metyl red indicator (7 gr) (5 gr) (5 gr) . Kultur yang menghasilkan lapisan reagen yang berwarna merah ceri setelah ditambah dengan reagen Kovac mengindikasikan indol positif.

coli pada akhir masa inkubasi. Pada uji ini indicator methyl red mendeteksi keberadaan konsentrasi asam yang besar pada hasil akhir dengan media MRVP Agar.aerogenes secara enzimatik mengubah asam ini ke hasil akhir yang tidak asam seperti 2. g. Selama inkubasi selanjutnya.Potassium phosphate (7 gr) (5 gr) . Pada pH sekitar 6 masih tetap mengindikasikan keberadaan asam tapi pada konsentrasi ion hydrogen yang lebih rendah. Meskipun semua mikroorganisme enteric memfermentasi glukosa dengan menghasilkan asam organik.aerogenes.3-butanadiol dan acetoin (asetilmetil-karbinol) yang menghasilkan pH sekitar 6. Indikator metal red pada pH sekitar 4 akan berwarna merah yang mengindikasikan bahwa hasil uji positif. Indikator berubah warna jadi kuning dan mengindikasikan hasil uji yang negatif. uji ini berguna dalam pemisahan E. Reaksinya sebagi berikut: Glukosa + H2O  Asam laktat Asam Asetat Asam format + CO2 + H2 (pH 4. Produksi dan deteksi produk akhir non asam dari fermentasi glukosa E.Tes Voges-Proskauer Media yang digunakan Komposisi media : MR-VP broth : . Derajat keasaman yang rendah (pH = 4) distabilisasi dan diatur oleh E. Produk akhir dari reaksi ini dapat bervariasi tergantung reaksi enzimatik spesifik yang ada dalam bakteri.coli dan E. areogenes diperkuat dengan uji Voges-Proskauer. Kedua organisme ini menghasilkan produk akhir asam organik selama masa inkubasi awal.Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C Glukosa heksosa adalah substrat utama yang dioksidasi oleh seluruh organisme enteric untuk produksi energi. E.0) Uji +  ditunjukkan dengan warna media yang menjadi merah.Peptone mixture .

Keberadaan warna mawar tua pada kultur setelah penambahan reagen Barritt mengindikasikan keberadaan acetylmethylcarbinol dan merupakan hasil positif. CH3 OH C O CH CH3 Asetilmetilkarbinol α -naftol Reaksi Asetilmetilkarbinol dengan reagen Barrit h. Sebagai hasil. kompleks pink terbentuk. dan bila tidak ada berarti hasilnya negatif.sodium citrate .Penggunaan Sitrat Media yang digunakan Komposisi media : Simmons citrate agar slant : .dipotassium hydrogen phospate (1 gr) . Reagen yang digunakan dalam uji ini adalah reagen Barrit yang mengandung campuran α-naphthol alkoholik dan larutan 40% potassium hydroxide (KOH).ammonium dihydrogen phosphate (1 gr) .CH3 C CH CH3 O OH + OH 40% KOH Oksidasi CH3 C C O O + C NH2 NH NH-R (5 gr) Kompleks berwarna Pink CH . Deteksi acetylmethylcarbinol membutuhkan hasil akhir ini untuk dioksidasi menjadi senyawa diasetil.sodium chloride . sebagai warna mawar pada medium. Reaksi ini terjadi pada keberadaan katalis α-naphthol dan grup guanidine yang ada pada peptone pada medium MRVP.magnesium sulfate (5 gr) (2 gr) (0.Dextrose 3 Reagen yang diperlukan Asetilmetilkarbinol α -naftol Lama inkubasi : Barritt’s reagent A dan B Diasetil Guanidin 0 : 24 – 48 jam pada 37 C Uji Voges-Proskauer menentukan Reaksi Asetilmetilkarbinol dengan reagen Barrit kemampuan beberapa organisme untuk memproduksi produk akhir non asam atau netral seperti asetilmetil -karbinol yang berasal dari metabolisme glukosa.2 gr) OH + 40% KOH Oksidasi C CH3 Diasetil O CH3 C O + C NH2 NH NH-R Guanidin Kompleks berwarna Pink .

Sitrat. menghasilkan asam oksalaasetat dan asetat.08 gr) (15 gr) Pada ketiadaan glukosa atau laktosa yang dapat difermentasi. COOH CH2 HO C CH2 COOH C itrate COOH COOH Citras C O e + CH2 COOH COOH Oxaloaseti c acid CH3 COOH COOH C O + CO2 CH3 COOH Pyruvic acid Excess carbon dioxide Acetic acid 2. Sitrat merupakan senyawa intermediet utama dalam sel dan diproduksi dengan kondensasi asetil aktif dengan asam oksalaasetat.bacterological agar Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (0. beberapa mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai sumber karbon untuk produksi energi mereka. Kehadiran sodium carbonate mengubah indicator bromthymol biru pada medium dari hijau menjadi biru tua Prussia. Sitrat positif ditunjukkan pertumbuhan pada permukaan slant yang diikuti warna biru. medium menjadi alkalin-karbondioksida yang dihasilkan berkombinasi dengan sodium dan air membentuk sodium carbonate. Produk tersebut kemudian secara enzimatis diubah menjadi asam piruvat dan karbondioksida. Selama reaksi. sedangkan negatif bila tanpa pertumbuhan dan medium tetap berwarna hijau.bromthymol blue . dengan keberadaan enzim sitrase. Kemampuan ini tergantung pada keberadaan enzim sitrat permease yang memfasilitasi transport sitrat dalam sel. sebuah produk alkalin. 1. CO2 + 2Na+ + H2O  Na2CO3  Alkaline pH  perubahan warna dari hijau ke menjadi biru ..

j. Walaupun organisme lain mungkin menghasilkan urease.urea . tes ini dapat dengan cepat membedakan anggota dari genus ini dari mikroorganisme lain yang tidak memfermentasi laktosa.monopotassium phosphate (9.Aktifitas urease Media yang digunakan Komposisi media : Urea broth : . Urease adalah enzim hydrolitik yang menyerang ikatan nitrogen n karbon pada komponen amida misalnya urea dan membentuk alkaline yang produk akhirnya adalah ammonia .phenol red . Adanya urease dapat dideteksi ketika organisme ditumbuhkan dalam urea broth medium yang mengandung pH indicator phenol red.1 gr) Urease yang diproduksi oleh beberapa mikroorganisme merupakan enzim yang secara khusus membantu mengidentifikasi Proteus vulgaris.1 gr) (20 gr) (0.adanya ammonia membuat lingkungan alkaline yang menyebabkan phenol red berubah menjadi deep pink.1 gr) . peran mereka pada substrat lebih lambat jika dibandingkan dengan spesies Proteus. Kegagalan perubahan warna menjadi deep pink membuktikan reaksi negatif.yeast extract Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (9.5 gr) (0. Hal ini menunjukkan reaksi positif terhadap adanya urease. Ketika substrat urea dipisahkan dari produknya.Aktivitas katalase Media yang digunakan :Nutrient Agar . Oleh karena itu.dipotassium phosphate .i.

di mana oksigen merupakan akseptor electron terakhir. seperti yang telah disebutkan pada reaksi kimia diindikasikan oleh gelembung dari gas oksigen yang ‘terbebas’. Produksi katalase dapat ditentukan dengan penambahan substrat H2O2 pada tryticase soy agar slant culture yang telah diinkubasi. secara ekstrem menghasilkan toxic superoxide. selama proses degradasi karbohidrat untuk produksi energi. dan mikroaerophile menggunakan jalur respirasi aerobic. mikroorganisme memproduksi hydrogen peroksida dan dalam beberapa kasus. Hal ini menunjukkan tes . Ketidakmampuan strict anaerob untuk mensintesis katalase. atau superoxide dismutase mungkin menjelaskan mengapa oksigen menjadi beracun untuk mikroorganisme. tetapi H2O2 kurang berbahaya bagi sel bakteri jika dibandingkan dengan superoksida. Diperkirakan substansi ini akan dihasilkan dari organisme yang mati jika tidak mereka dapat didegradasi secara enzimatik. Organisme yang mampu memproduksi katalase secara cepat mendegradasi hydrogen peroksida berdasarkan reaksi berikut : 2H2O2 2H2O Air Hidrogen Peroksida Oksigen bebas + O2 (g) Organisme aerobic yang kekurangan katalase dapat mendegradasi toxic superoxide secara khusus menggunakan enzim superoxide dismutase. Bila enzim – enzim di atas tidak ada maka menyebabkan konsentrasi zat toksik dari H2O2 tidak dapat didegradasi ketika organisme tersebut ditumbuhkan disertai adanya oksigen.Peptone from casein .Agar (10 gr) (3 gr) (12 gr) Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C Selama respirasi aerobik. hasil akhir dari superoxide dismutase adalah H2O2. Substansi ini diproduksi ketika bakteri aerob. facultative anaerob. peroxidase.Kompisisi Media : . Jika ada katalase.Meat extract .

ada golongan nonenterococci seperti S.7-dihydroxy-coumarin yang bereaksi dengan iron salt yang terkandung dalam medium. Enterococcus memiliki kemampuan antibiotik resisten dan yang lebih jarang sebagai vancomycin. sedangkan tidak terbentuknya gelembung adalah tes katalase negative. l. yang mungkin menjadi penyebab infeksi pada urine. yang mungkin menjadi penyebab infeksi pada urine.Uji 6.katalase positif. Group D streptococcus menunjukkan α atau γ -hemolysis pada blood agar plates. Bile esculin test : Dengan adanya bile. Group D streptococci menghidrolisis glycoside esculin menjadi 6.Uji Bile Esculin Media yang digunakan Lama inkubasi : Bile esculin agar : 24 – 48 jam pada 370C Media ini digunakan untuk mengidentifikasi group D streptococcus. Bila tidak terdapat warna hitam tidak mengidentifikasi organisme Group D streptococci. Group ini meliputi enterococcus seperti Enterococcus faecalis. yang digunakan dalam pengobatan manusia menggunakan laser. Group D streptococcus menunjukkan α atau γ -hemolysis pada blood agar plates. Bovis. yang digunakan dalam pengobatan manusia . Selain itu.5% sodium chloride broth Media yang digunakan Komposisi media Lama inkubasi : 6.5% NaCl Broth : brain – heart infusion broth NaCl 6. ada golongan nonenterococci seperti S. Hal ini menyebabkan timbulnya warna cokelat – hitam pada medium setelah diinkubasi.5% : 24 – 48 jam pada 370C Media ini digunakan untuk mengidentifikasi group D streptococcus. Group ini meliputi enterococcus seperti Enterococcus faecalis. Bovis. m. Selain itu.

5% sodium chloride broth : Group D enterococci dapat diidentifikasi dengan kemampuannya tumbuh pada medium ini jika dibandingkan dengan non enterococci. Sebagian besar. . Ditandai dengan adanya zona berwarna hijau di sekitar koloni. Streptococcus mampu memproduksi β -hemolysins dan bersimbiosis dengan bakteri patogen. Sedangkan yang lain.menggunakan laser. α -hemolytic streptococci.yeast extract . Streptococcus viridans merupakan bakteri yang tidak patogen. memiliki kemampuan untuk menyebabkan infeksi pada manusia seperti subacute endocarditis dan gagal jantung. Dari hasil penelitian.Aktivitas hemolytic Media yang digunakan Komposisi media : blood agar base : .Agar . .4 kali diameter koloni.NaCl .(γ ) Gamma-hemolysis diindikasikan dengan tidak adanya hemolysis di sekitar koloni. Ditandai dengan terbentuknya zona bening sekitar 2 . n.(α ) Alpha-hemolysis merupakan bentuk hemolisis yang tidak sempurna.Darah steril Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (15 gr) (2.proteose peptone . γ -hemolytic streptococci bersifat avirulent.5 gr) (5 gr) (5 gr) (12 gr) (5%) Aktivitas hemolytic ini adalah salah satu cara untuk mengidentifikasi adanya streptococci.liver digest . 6. . ada 3 tipe reaksi hemolytic pada blood agar yaitu: . Enterococcus memiliki kemampuan antibiotik resisten dan yang lebih jarang sebagai vancomycin.(β ) Beta-hemolysis merupakan penghancuran sel darah merah dengan sempurna.

maka hal itu menandakan bahwa uji pigmen negatif. inoculating loop.Peptone from casein . p. biakan yang larut dalam bile akan tampak jernih sedangkan yang tidak larut dalam bile akan tampak keruh. lens paper dan mikroskop .Meat extract . hotplate. Selain dilakukan pewarnaan gram dan uji – uji biokimia. menyebabkan dinding sel pneumococcus mengalami lisis. Uji Bile Solubility Media yang digunakan Reagen yang digunakan Lama inkubasi : Bile solubility : Na-deoksikolat : 24 – 48 jam pada 370C Adanya surface-active agents seperti bile dan bile salts (sodium desoxycholate atau sodium dodecyl sulfate). Sedangan bila ditemukan warna yang lain berarti menandakan bahwa uji pigment positif. Selain α -hemolytic streptococci tidak akan mengalami lisis oleh agen tadi dan tidak larut dalam bile. Setelah diinkubasi. staining tray. bibulous paper. Uji Pigmen Media yang digunakan Kompisisi Media : Nutrient Agar : . glass slides.apabila pada medium nutrient agar tidak terlihat warna selain warna koloni.Agar Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (10 gr) (3 gr) (12 gr) Pada uji pigmen ini. Pewarnaan spora Peralatan yang diperlukan : Bunsen. ada juga yang membutuhkan pewarnaan spora untuk mengidentifikasi lebih lajut.o. Berikut adalah penjelasan tentang pewarnaan spora.

central G: inflated spore Pedoman yang digunakan oleh praktikan dalam mengidentifikasi spesies suatu sampel adalah pohon filogenik. terminal F: circular.72 jam pada media agar slant merupakan struktur yang bersifat resisten. terminal B: rectangular. dorman.masing . Metode ini menggunakan malakit hijau sebagai pewarna primer (primer stain) dan safranin sebagai caounterstain. Metode yang umum digunakan adalah Scaeffer-Fulton endospore stain.Reagen yang dibutuhkan Endospora : Malachite green dan safranin Lama inkubasi untuk biakan : 48 . terminal C: rectangular. Struktur ini tidak dapat diwarnai dengan metode pewarnan sederhana maupun gram. subterminal D: rectangular. central E: circular.Gambar tentang berbagai bentuk spora sebagai berikut : A: oval. Hal ini disebabkan masing. dan berfungsi untuk melindungi lingkungan bakteri yang dari tidak menguntungkan.

Berikut skema pohon filogenik : .spesies memiliki jalur yang berbeda dalam proses pengidentifikasiannya.

Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya cocci . maka dapat disimpulkan sebagai berikut : 1a. 1c. Staphylococcus spp dan Streptococcus spp.Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya cocci Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Micrococcus spp. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka dilakukan uji biokimia yaitu uji katalase.Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya Bacilli Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Corynebacterium spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.Penjelasan tentang pohon filogenik sebagai berikut : Setelah praktikan dapat mengidentifikasi bakteri berdasarkan pewarnaan gram dan morfologi bakteri. maka dilakukan pewarnaan spora. 1b. dan Lactobacillus spp.

maka dilakukan uji bile esculin. Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya cocci Uji Katalase 2a. dan Staphylococcus spp. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Streptococcus spp. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Branhamella spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka dilakukan uji biokimia yaitu uji glukosa. maka dilakukan uji biokimia yaitu uji laktosa.. M. Bila uji Bile Esculin menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. Klebsiella spp. Moraxella spp. Bila uji Mannitol menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Staphylococcus aureus. Uji Mannittol 3a. maka dilakukan uji pada 6. Enterobacter spp. 2b. Escherichia spp. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Bila uji katalase menunjukkan positif.varians. maka dilakukan Uji Pigment.bovis. dan Neisseria spp. 3b.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita..epidermis. Bila uji katalase menunjukkan negatif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Micrococcus spp. M. S. Faecalis dan S.luteus.. Proteus spp. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. dan Pseudomonas spp. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S.Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya Bacilli Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Citrobacter spp... . Saprophyticus.5% NaCl Broth. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Bila uji Mannitol menunjukkan negatif. maka dilakukan uji mannitol. 1d. Uji Bile Esculin 3c.

maka dilakukan Uji Fermentasi Fruktosa. varians.pneumoniae. Bila uji Hemolysis menunjukkan negatif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah alpha hemolysis yaitu S. 4f. Bila uji pada 6. Bila uji Pigment menunjukkan negatif. maka dilakukan Uji Bile Solubility. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. Bila uji Hemolysis menunjukkan positif. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M. varians. Uji Fermentasi Glukosa 5a.pyogenes.5% NaCl Broth 4c. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Bila uji Pigment menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M. Uji Pigment 4a. 5b. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.mitis dan S. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. Uji Fermentasi Fruktosa . Faecalis. maka dilakukan Uji Hemolysis.pneumoniae dan S. luteus.epidermis.3d.5% NaCl Broth menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S.luteus dan M. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S.mitis. 4b. Uji pada 6. S. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa.5% NaCl Broth menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M. Bila uji pada 6. 4d. Saprophyticus dan S. Uji Hemolysis 4e. Bila uji Bile Esculin menunjukkan negatif.pyogenes.bovis.

maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Bacillus spp. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. saprophyticus. 5b. mitis. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B.Bila uji Bile Solubility menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. .Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. Uji Bile Solubility 5e. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Bila uji katalase menunjukkan positif. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Bila uji mannitol menunjukkan positif. cercus. maka dilakukan Uji Voges-Proskauer. dan Lactobacillus spp. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Corynebacterium spp. epidermis..5c. Bila uji mannitol menunjukkan negatif. 2b.pneumoniae. 5d. Uji mannitol 3a. maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B.subtilis. Bila tidak ditemukan adanya spora. Uji katalase 3c. Megaterium dan B. Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya Bacilli 2a Bila terdapat spora dalam sampel. maka dilakukan uji katalase. maka dilakukan uji mannitol. Bila uji Bile Solubility menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. 3b. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Corynebacterium spp.

maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B. Bila uji mannitol menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya cocci Uji Fermentasi Glukosa 4a.fermentum. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. maka dilakukan Uji Fermentasi Mannitol. Uji Fermentasi Glukosa 4e. casei dan L. delbrueckii. Uji Reduksi Nitrat 4c. delbrueckii Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Megaterium. . Bila uji katalase menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. Uji Voges-Proskauer dalam sampel adalah B. Bila uji katalase menunjukkan negatif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. Uji Fermentasi Mannitol. 4b. Bila uji Fermentasi Mannitol menunjukkan negatif. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. 4f. xerosis. 5a.subtilis. maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif (hanya terbentuk asam). maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. Bila uji Fermentasi Mannitol menunjukkan positif.3d. Bila uji mannitol menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada . Bila uji katalase menunjukkan positif. 4d. Kutscheri. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Lactobaciillus spp. casei 5b. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif (terbentuk asam dan gas).

Enterobacter spp. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Proteus spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. dan Klebsiella spp. 2b. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Branhamella spp dan Moraxella spp. maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B. Bila uji Fermentasi Laktosa menunjukkan positif. 2b. 3b. maka dilakukan Uji Produksi Indole . Bila uji Fermentasi Laktosa menunjukkan negatif.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. mucosa . Escherichia spp. bovis Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya Bacilli Uji Fermenatasi Laktosa 2a. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Citrobacter spp. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Neisseria spp .. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M. maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat . maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C.catarrhalis 3d. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan negatif. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan positif. Intermedius dan E. coli. Bila uji produksi indol menunjukkan positif. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan positif.Untuk mengetahui . maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah N. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan negatif.sicca . maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa Uji Produksi Indole 3a.. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah N. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif. 3c. dan Pseudomonas spp.2a. Uji Reduksi Nitrat 3a.

. Intermedius 4b. 3d. Bila uji Metyl Red menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Pseudomonas spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif. Aerogenes dan K. Pneumoniae. 3b. dan Klebsiella spp. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.Bila uji produksi indol menunjukkan negatif. Bila uji Penggunaan Citrate menunjukkan negatif.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.lebih detail tentang spesies sampel kita. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. ( I ) Uji Produksi Indole . freundii dan K. maka dilakukan Uji Produksi Indole. Uji Penggunaan Citrate 4a. Uji Fermentasi Glukosa 3c. maka dilakukan Uji aktivitas urease. freundii.ozaenae. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. maka dilakukan Uji Penggunaan Citrate . maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Proteus spp. Bila uji Penggunaan Citrate menunjukkan positif.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. coli. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. Uji Metyl Red 4c. Enterobacter spp. maka dilakukan Uji Metyl Red . maka dilakukan Uji Produksi H2S.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. (I) 4d.. Escherichia spp. Bila uji Metyl Red menunjukkan negatif. maka dilakukan Uji Reduksi Nitrate.

maka dilakukan Uji Produksi H2S. 4h. . Bila uji Produksi Indole menunjukkan positif.ozaenae. Bila uji Produksi Indole menunjukkan negatif. vulgaris. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P.4e. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Aerogenes. maka dilakukan Uji aktivitas urease . Bila uji Produksi H2S menunjukkan positif. Bila uji aktivitas urease menunjukkan positif. vulgaris dan P.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. 5f. 5d.aeruginosa dan P. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah K.Bila uji Reduksi Nitrate menunjukkan negatif.Bila uji Reduksi Nitrate menunjukkan positif. Uji Produksi H2S( I ) 5a. Uji Produksi H2S( II ) 5e. Bila uji aktivitas urease menunjukkan negatif.rettgeri. Uji aktivitas urease( I ) 5c. maka dilakukan Uji Litmus Milk.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. ( II ) 4f. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. Bila uji Produksi Indole menunjukkan negatif. freundii 5b.rettgeri. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah K.mallei. Bila uji Produksi Indole menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. inconstans. Bila uji Produksi H2S menunjukkan negatif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. Pneumoniae. ( II ) Uji Reduksi Nitrate 4g.fluorescens. mirabilis dan P.

maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. inconstans.Cawan petri .fluorescens yang mengalami reaksi alkaline.Pipet . Bila uji aktivitas urease menunjukkan negatif.Uji aktivitas urease( II ) 5g.aeruginosa yang mengalami peptonization 5j.Lampu spiritus . III.Alat : .Tabung .Jarum ose . Bila uji aktivitas urease menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P.Bila uji Litmus Milk menunjukkan positif.Bila uji Litmus Milk menunjukkan positif.Erlemeyer . maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. Alat dan Bahan : 1. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P.Objek glass . mirabilis.Beker glass . Uji Litmus Milk 5i. 5h.Hotplate stirrer .

Sampel bakteri (Sampel 1.H2O2 3% .Starch Agar .Phenol Red Dextrose Broth . 3) .Menetesi preparat dengan larutan lugol (Gram II) beberapa tetes.Nitrate Broth IV. Membilas dengan air.Safranin (Gram IV) . Cara Kerja : 1.Reagen kovac’s .2. Membiarkan selama 1 menit. Mencuci dengan larutan Gram III (alkohol 96%) dengan cara memiringkan preparat kemudian menetesi perlahan. d.lahan dengan Gram III hingga tidak ada pewarna yang terlunturkan.Medium TSA .MRVP Broth . Membilas . 2.Simmon’s Citrate Agar . e.Menetesi preparat olesan bakteri yang telah difiksasi dengan beberapa dengan air.Medium SIM Agar .Crystal violet (Gram I) .Barrit A dan Barrit B .Nutrien Gelatin Broth .Phenol Red Lactose Broth .Gram’s iodine (Gram II) . c.Medium Litmus Milk . membiarkan selama 3 menit.Urea Broth .Phenol Red Sucrose Broth .Pewarnaan Gram: a. Membilas preparat secara hati-hati dnegan air tetes larutan karbolgentian violet (Gram I).Bahan : .Etanol 95% (Gram III) . b.

b. Mengamati preparat di mikroskop dan mencatat hasilnya. h.Phenol Red Lactose Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red lactose broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest . Pembuatan Media untuk Stock Culture(Peremajaan) TSA slant (40 gr/L) -Menimbang TSA kemudian melarutkannya ke dalam aquades -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave. 2. 3. Kemudian mengeringkan di udara atau dengan cara menyerap kelebihan air dengan tissue. Langkah inokulasi ke media : 1. Menetesi preparat dengan larutan fuchsin (Gram IV) beberapa tetes. g. menanam pada media tersebut. Membilas preparat dengan air.Litmus Milk (100 gr/L) Cara pembuatan media : -Menimbang litmus milk kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave. -Memiringkan tabung agar terbentuk media slant 3.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Litmus Milk Broth 2.Pembuatan Media untuk Uji Biokimia a.f.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis. Mendiamkan selama 3 menit.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C.

Menyiapkan tabung reaksi yang berisi media dengan berbagai macam karbohidrat : phenol red lactose broth.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis. 3. menanam pada media – media pada bagian 1. c.Phenol Red Glucose Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red glucose broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave e. phenol red sucrose broth.Phenol Red Mannitol Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red mannitol broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave Langkah inokulasi ke media fermentasi : 1.48 jam pada suhu 370C. e. 2.SIM Agar Deep Tube (30 gr/L) -Menimbang SIM medium kemudian melarutkannya ke dalam aquadest .-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave. d.Menginkubasi selama 24 . dan phenol red dextrose broth.Phenol Red Fructose Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red fructose broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave.

menanam pada media tersebut dengan cara menggores zig-zag pada bagian yang miring. menanam pada media SIM dengan menusukkan ke dalam agar.-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Urea Broth 2. . 3.Urea Broth (38.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C g. 3.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis.5 gr/L) -Menimbang SCA kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave. Langkah inokulasi pada media : 1. 4.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Simmons citrate agar slants 2.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C. menanam pada media tersebut.5 gr/L) -Menimbang urea broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Mensterilkan campuran dengan memfiltrasinya -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung Langkah inokulasi pada media : 1.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis. f. -Memiringkan tabung agar terbentuk media slant Langkah inokulasi pada media : 1.Untuk tes produksi Indol ditambahkan reagen Kovac 3-5 tetes pada medium yang telah diinkubasi.Simmon Citrate Agar Slant (22.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi SIM agar deep tubes 2.

menanam pada media tersebut dengan cara menggores zig-zag pada bagian yang miring. Langkah inokulasi pada medium : 1.Tryptycase Soy Agar (TSA) Plate (40 gr/L) -Menimbang medium TSA kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer kemudian diautoclave -Memasukkan campuran ke dalam cawan petri steril dan membiarkannya memadat.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C 4. Langkah inokulasi pada medium : 1.Nutrient Agar -Menimbang Nutrient Agar kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer kemudian diautoclave -Memasukkan campuran ke dalam cawan petri steril dan membiarkannya memadat.Menyiapkan plate berisi TSA 2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis. 3.3.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C h.Untuk membuktikan adanya aktivitas katalase ditambahkan reagen H2O2 3% pada medium yang tlah diinkubasi.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Nutrient Agar slant 2.Menginkubasi selama 24-48 jam pada suhu 370C i.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis. . menanam pada media tersebut dengan men-strict medium 3.

V.coli . Hasil Percobaan : 1.Pewarnaan gram 1a.Pewarnaan gram E.

Pewarnaan gram Proteus mirabilis .1b.Pewarnaan gram Staphylococcus epidermis 1c.

coli -Uji Laktosa -Uji Indol -Uji Citrat .2.Uji Biokimia E.Uji Biokimia 2.Uji Biokimia 2a.

b.Uji Biokimia Staphylococcus epidermis -Uji Katalase -Uji Mannitol -Uji Pigment .

Uji Biokimia Proteus mirabilis -Uji Laktosa .-Uji Fruktosa c.

-Uji Glukosa -Uji Indole -Uji Urea .

Tabel Hasil Percobaan E.3. Tabel Hasil Percobaan Staphylococcus epidermis Macam Uji Pewarnaan Gram Morfologi Aktivitas katalase Fermentasi mannnitol Pigment Fermentasi Fruktosa Hasil Uji positif coccus + + 3c.coli Macam Uji Pewarnaan Gram Morfologi Fermentasi Laktosa Produksi Indol (SIM medium) Penggunaan sitrat Hasil Uji negative coccobacill + + - 3b. Tabel Hasil Percobaan 3a. Tabel Hasil Percobaan Proteus mirabilis Macam Uji Pewarnaan Gram Morfologi Fermentasi laktosa Fermentasi glukosa Produksi Indol (SIM medium) Hasil Uji negative bacill + - .

Pembahasan 1. Bakteri tersebut berwarna merah setelah diwarnai dengan pewarnaan gram. Hal ini disebabkan oleh. lapisan lipopolisakarida pada bakteri .Sampel A 1a.Pewarnaan Gram & Morfologi Hasil uji morfologi pada sampel A menunjukkan bahwa bakteri pada sampel A termasuk ke dalam golongan bakteri gram negatif dengan bentuk coccobacill.Aktivitas Urease + VI.

Hal ini berarti bakteri sampel A memiliki enzim triptofanase untuk memecah triptofan sesuai dengan reaksi berikut : . Oleh karena itu. 1c.Uji Fermentasi Laktosa Uji Fermentasi Laktosa ini dilakukan pada medium phenol red lactosa broth. 1b. Hasil uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik.Pada uji ini. dari hasil pewarnaan gram dan morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel A merupakan bakteri gram negatif dan bentuknya coccobacill sehingga untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi laktosa.ini lebih sedikit sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya akan luntur bersama dengan lapisan lipopolisakaridanya ketika dicucci dengan gram III (alkohol) sehingga yang tersisa hanya warna merah dari safranin yang merupakan pewarna tandingan. bakteri sampel A tidak dapat memfermentasi laktosa. Oleh karena itu. Pada uji ini. bakteri sampel A menunjukkan hasil positif yaitu terbetuk cincin pink setelah penambahan reagen Kovac.Uji Produksi Indol Uji Produksi Indol ini dilakukan pada medium SIM dengan bantuan penambahan reagen Kovac akan terlihat cincin pink pada medium. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji Produksi Indol.

Pada uji ini. Oleh karena itu.Uji Penggunaan Citrat Uji penggunaan sitrat menggunakan medium Simmon’s Citrate Agar yang mengandung sitrat sebagai satu – satunya sumber karbon. Hal ini berarti bakteri sampel A tidak memiliki enzim citrase untuk mengubah sitrat menjadi oksaloasetat dan asam asetat yang selanjutnya akan dirubah menjadi asam piruvat dan CO2 . bakteri sampel A menunjukkan hasil negatif yang ditandai dengan tidak berubahnya warna medium dari hijau menjadi biru. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji penggunaan citrat. 2..coli.Pewarnaan Gram & Morfologi Hasil uji morfologi pada sampel B menunjukkan bahwa bakteri pada sampel B termasuk ke dalam golongan bakteri gram positif dengan bentuk coccus.Sampel B 2a. Oleh karena itu. dapat disimpulkan berdasrkan pohon filogenik bahwa bakteri sampel A adalah E. 1d. .

Uji Aktivitas Katalase Uji aktifitas katalase dilakukan dengan menggunakan medium TSA dan selanjutnya dilakukan penambahan reagen berupa H2O2 3%.Uji Fermentasi Mannitol Uji Fermentasi Mannitol ini dilakukan pada medium phenol red mannitol broth.Bakteri tersebut berwarna biru-ungu setelah diwarnai dengan pewarnaan gram. bakteri sampel B tidak dapat memfermentasi mannitol. Oleh karena itu. dari hasil pewarnaan gram dan morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel B merupakan bakteri gram positif dan bentuknya coccus sehingga untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji aktivitas katalase. lapisan lipopolisakarida pada bakteri ini cukup tebal sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya tidak bisa luntur ketika dicuci dengan gram III (alkohol) sehingga yang tersisa adalah warna biru-ungu oleh reagen kristal-violet. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji pigment. Hal ini disebabkan oleh. Hal ini berarti bakteri sampel B dapat memecah hidrogen peroksida menjadi air dan karbondioksida sesuai reaksi berikut Oleh karena itu.Pada uji ini. Hasil positif tersebut ditunjukkan dengan adanya gelembung – gelembung gas pada permukaan koloni ketika ditetesi dengan H2O2 3%.Uji Pigment . 2b. 2c. Hasil uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. Oleh karena itu. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi mannitol. Bakteri sampel B menunjukkan hasil positif pada uji ini yang artinya bakteri sampel B memiliki enzim katalase. 2d.

lapisan lipopolisakarida pada bakteri ini lebih sedikit sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya akan luntur bersama dengan lapisan lipopolisakaridanya ketika dicucci dengan gram III (alkohol) sehingga yang tersisa hanya warna merah dari safranin yang merupakan pewarna tandingan.Oleh karena itu. Hal itu berarti hasil uji pigment adalah negatif. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi fruktosa 2e. Bakteri tersebut berwarna merah setelah diwarnai dengan pewarnaan gram.Pada uji ini. Hal ini disebabkan oleh. Pada uji ini.Uji Pigment ini dilakukan pada medium nutrient agar.Sampel C 3a. bakteri sampel B dapat memfermentasi fruktosa sehingga hasilnya positif. dari hasil pewarnaan gram dan morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel C merupakan bakteri gram negatif dan bentuknya bacill sehingga untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi laktosa. Hasil uji positif pada fermentasi laktosa ditandai dengan berubahnya warna medium menjadi kuning yang disebabkan oleh adanya produk akhir fermentasi yang bersifat asam.Pewarnaan Gram & Morfologi Hasil uji morfologi pada sampel C menunjukkan bahwa bakteri pada sampel C termasuk ke dalam golongan bakteri gram negatif dengan bentuk bacill.Oleh karena itu. dapat disimpulkan berdasarkan pohon filogenik bahwa bakteri sampel B adalah Staphylococcus epidermis. dan juga adanya gas.Uji Fermentasi Laktosa . bakteri sampel B tidak menampakkan warna yang lain selain warna koloni yaitu putih mengkilap. Oleh karena itu. 3b.Uji Fermentasi Fruktosa Uji Fermentasi Fruktosa ini dilakukan pada medium phenol red fructosa broth. 3.

Akan tetapi. Oleh karena itu. Hasil uji positif pada fermentasi laktosa ditandai dengan berubahnya warna medium menjadi kuning yang disebabkan oleh adanya produk akhir fermentasi yang bersifat asam. Oleh karena itu. Oleh karena itu. pada bakteri sampel C tidak menunjukkan terbentuknya cicncin pink setelah penambahan reagen Kovac sehingga hasilnya negatif. bakteri sampel C berubah warna menjad deep pink yang menandakan bahwa uji aktivitas urease positif. bakteri sampel C tidak dapat memfermentasi laktosa. Pada uji ini. dan juga adanya gas. Uji aktivitas urease. Pada uji ini.Uji Produksi Indol Uji Produksi Indol ini dilakukan pada medium SIM dengan bantuan penambahan reagen Kovac akan terlihat cincin pink pada medium. 3c.Uji Fermentasi Laktosa ini dilakukan pada medium phenol red lactosa broth. Hasil uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. bakteri sampel C dapat memfermentasi glukkosa sehingga hasilnya positif. 3d.Hal ini berarti bakteri sampel A tidak memiliki enzim triptofanase untuk memecah triptofan. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi glukosa.Hal ini menandakan bahwa Ketika substrat urea dipisahkan dari . bila hasilnya positif. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji aktivitas urease.Uji Fermentasi Glukosa Uji Fermentasi Glukosa ini dilakukan pada medium phenol red glukosa broth. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji Produksi Indol.Uji aktivitas urease. Pada uji ini. 3e. ini dilakukan pada medium urea broth yang mengandung pH indicator phenol red.

Christine L. “Microbiology – A Laboratory Manual”.adanya ammonia membuat lingkungan alkaline yang menyebabkan phenol red berubah menjadi deep pink. Oleh karena itu. VII. Natalie Sherman.produknya. Kegagalan perubahan warna menjadi deep pink membuktikan reaksi negatif. James G. http://www. 2005. Berdell R. seventh edition.edu/~cbwilso/250cho. VIII. dapat disimpulkan berdasarkan pohon filogenik bahwa bakteri sampel C adalah Proteus mirabilis. San Francisco. yang menjadi pedoman utama dalam pengidentifkasian spesies adalah penggunaan pohon filogenik. Benjamin Cummings. Hal ini menunjukkan reaksi positif terhadap adanya urease. Hal in disebabkan karena masing – masing spesies memiliki jalur yang berbeda baik dalam pewarnaan gram/morfologi atau metabolismenya. Selain itu.htm http://www. Kesimpulan : Dalam melakukan identifikasi spesies dilakukan uji morfologi dan uji biokimia. Daftar Pustaka Tortora.siue. Staphylococcus epidermis dan Proteus mirabilis.sampel kami berurutan dari adalah Escherichia coli. 2001. Cappuccino. Reaksinya sebagai berikut : Oleh karena itu. Benjamin Cummings.slic2.Case. Microbiology-An Introduction.html . Funke.edu:82/hurlbert/micro101/pages/101lab9. Gerard J.wsu. San Francisco.