IDENTIFIKASI SPESIES MIKROORGANISME SAMPEL

I. Tujuan Percobaan : Mampu menggunakan teknik pewarnaan, pengkulturan, dan uji biokimia yang telah didapat untuk menentukan genus kultur bakteri yang belum diketahui. II. Dasar Teori :

Spesies berasal dari bahasa Latin species yang merupakan tingkatan dalam taksonomi yang terkecil, biasanya digunakan untuk mengklasifikasi organisme baik yang hidup maupun organisme yang fosil. Dalam biologi, species adalah salah satu bentuk pengelompokan dalam klasifikasi makhluk hidup.. Dalam sistem tatanama binomial, nama suatu spesies makhluk hidup terdiri atas dua kata: nama genusnya (diawali dengan huruf kapital) dan nama penunjuk spesiesnya. Misalnya, dari gambar di samping,Panthera pardus, Nama Panthera merupakan nama genus atau marga sedangkan pardus merupakan nama species. Berikut penjelasan singkat mengenai 3 spesies sampel yang kelompok kami temukan. Ketiga spesies sampel kami antara lain adalah E. coli, Staphylococcus epidermis dan Proteus mirabilis. 1. E.coli Escherichia coli, atau biasa disingkat E. coli, adalah salah satu jenis spesies utama bakteri gram negatif. Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh Theodor Escherich ini hidup pada tinja, dan dapat menyebabkan masalah kesehatan pada

manusia, seperti diare, muntaber dan masalah pencernaan lainnya. E. coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika. Biasa digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan. E. coli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah dalam penanganannya. 2. Staphylococcus epidermis Staphylococcus epidermis merupakan bakteri non-motil, jenis coccus grampositive cocci, dan berbeda dengan Staphylococcus aureus, bakteri ini tidak memiliki enzim koagulase. Bakteri ini merupakan bakteri yang patogen dan aktif dalam aliran darah melalui luka, jarum dll. Infeksi dari bakter in berakibat pembengkakan pada daerah yang terinfeksi. 3.Proteus mirabilis Proteus mirabilis merpakan bakteri gram negative dan bakteri fakultatif anaerob. Bakteri ini memiliki kemampuan motalitas dan aktivitas urease. P.mirabilis menyebabkan 90% infeksi yang disebabkan oleh jenis ‘Proteus’. P.mirabilis dapat menggunakan urea dan citrate untuk produksi energi. Bakteri ini dapat memproduksi gas hydrogen sulfide dan membentuk zona bening pada media. P.mirabilis ini motil, memiliki peritrichous flagella yang diketahui sebagai penyebab pergerakan. Bakteri ini pada umumnya ditemukan pada intestinal manusia. P.mirabilis tidak pathogen pada guinea pigs atau ayam. Uji – uji biokimia pada P.mirabilis adalah sebagai berikut : *Indole negative dan reduksi nitrat positif (tidak ada gas yang diproduksi) *Metyl red positif dan Voges-Proskauer negatif *Catalase positif and Cytochrome Oxidase negatif Untuk mengidentifikasi spesies suatu bakteri, praktikan perlu melakukan serangkaian uji yang berurutan sesuai dengan hasil percobaan yang telah ada. Berikut adalah penjelasan berbagai uji yang harus dilakukan dalam mengidentifikasi spesies sampel : 1.Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram adalah suatu metode yang digunakan untuk membedakan mikroorganisme berdasarkan susunan & struktur dinding sel mikroorganisme. Metode pewarnaan gram membutuhkan 4 jenis reagen yaitu : crystal gentian violet (Gram I), iodine (Gram II), alkohol 95% (GramIII), dan saphranin (Gram IV). Dengan menggunakan metode pewarnaan gram, bakteri dapat digolongkan menjadi 2 kelompok, yaitu : bakteri gram (+) yang akan berwarna biru-ungu dan bakteri gram (-) yang berwarna merah.

Staphylcuococs (+)

E. coli (-)

Beberapa fungsi reagen dalam pewarnaan gram yang menentukan spesies sampel termasuk dalam gram (+) atau gram (-) adalah sebagai berikut: • • Pemberian kristal fiolet berfungsi untuk mewarnai semua sel. (baik Iodin berfungsi sebagai mordan. Di dalam sitoplasma iodin gram negatif maupun positif) membentuk komplek dengan kristal fiolet. Pembentukan kompleks mengakibatkan sel berwarna biru tua. • Pemberian alkohol memiliki 2 fungsi: – Pada gram positif alkohol mengakibatkan peptidoglikan terdehidrasi sehingga ukuran porinya mengecil. Ini mengakibatkan kristal violet tidak dapat keluar dari sitoplasma. – Pada gram negatif alkohol mencuci dinding sel dan meninggalkan lubang kecil pada peptidoglikan. Ini mengakibakan kristal violet tercuci keluar dan sel menjadi tidak berwarna.

Safranin berfungsi sebagai couter staining. Safranin akan

memberi warna pada gram negatif sehingga gram positif dan negatif akan terlihat berbeda secara jelas di bawah mikroskop. Dari hasil pewarnaan gram, selain dapat membedakan mikroorganisme berdasarkan susunan & struktur dinding sel mikroorganisme, praktikan juga dapat mengidentifikasi morfologi dari bakteri tersebut. Berikut gambar tentang berbagai bentuk morfologi dari bakteri sebagai berikut :

2.Uji Biokimia Biokimia adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui metabolisme dan reaksi yang dijalankan oleh suatu mikroorganisme. Jenis – jenis uji biokimia untuk mengidentifikasi spesies antara lain : a.Reaksi Litmus Milk Media yang digunakan Komposisi Media : litmus broth : - Litmus - Skim milk powder - Sodium sulfite Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (0,5 gr) (100 gr) (0,5 gr)

Penyusun susu terbesar yang digunakan sebagai dasar uji biokimia dalam media litmus milk adalah laktosa, protein susu yaitu kasein, lacto-albumin dan lactoglobulin.Untuk melihat adanya perubahan metabolisme yang diproduksi dalam medium, digunakan pH indicator yaitu oxidase-reduction

indicator litmus. Indicator ini akan menyatu dalam medium. Saat ini,litmus milk merupakan medium yang baik untuk mikroorganisme yang dapat mencerna substrat milk, tergantung dari komplemen enzimatik bakteri tersebut. Beberapa perubahan biokimia dalam litmus milk :  Fermentasi Laktosa Organisme mampu menggunakan laktosa sebagai sumber karbon untuk produksi energi, dengan menggunakan induksi enzim β -galactosidase. Degradasi laktosa dirumuskan sebagai berikut:

Adanya asam laktat dapat dengan mudah dideteksi karena litmus bewarna ungu pada pH netral dan berubah menjadi merah muda ketika medium menjadi asam yaitu pada pH sekitar 4.  Adanya gas + H2
.

Produk akhir pada fermentasi laktosa adalah CO2

Adanya gas

ini mungkin dapat dilihat sebagai pemisahan ‘curd’ atau pembelahan dalam curd sebagai akibat adanya gas yang naik ke permukaan.  Reduksi Litmus Fermentasi adalah proses anaerobic yang meliputi biooksidasi yang terjadi karena tidak ada molekul oksigen. Oksidasi ini mungkin akan terlihat sebagai perpindahan hydrogen (dehydrogenation) dari substrat.Karena ion hidrogen tidak dapat dalam bentuk bebas/melayanglayang,hydrogen memerlukan akseptor elektron yang dapat mengikat ion hydrogen jika hal tersebut tidak terjadi maka reaksi reduksi-oksidasi tidak akan berjalan dan produksi energy tidak dapat dihasilkan. Pada tes litmus milk, litmus berperan sebagai akseptor. Saat berada dalam kondisi oksidasi, litmus berwarna ungu; ketika litmus menerima

enzim yang berperan mengubah casein menjadi bentuk paracasein. yang menyebabkan perubahan menjadi putih dan menandakan bahwa laktosa tereduksi. gas CO2 dan gas H2. litmus akan tereduksi dan berubah menjadi putih atau warna putih susu. Curd yang terbentuk bergantung pada mekanisme biokimia yang membentuk curd tersebut Ada 2 jenis curd yang mungkin terbentuk yaitu : -Acid curd Asam laktat atau asam organic lain menyebabkan pengendapan milk protein casein sebagai calcium caseinate menjadi bentuk gumpalan yang tidak larut.  Proteolysis (Peptonization) Ketidakmampuan beberapa mikroorganisme untuk menghasilkan energi melalui jalur fermentasi laktosa menandakan bahwa mikroorganisme tersebut harus menggunakan sumber nutrisi lainnya sebagai protein untuk menghasilkan energi. Lactose Glucose Pyruvic acid -Lactic acid -Butyric acid -CO2 + h2 Gas hydrogen dikenal sebagai hydrogen litmus acceptor. Gumpalan ini akan mengalir perlahan saat tabung dimiringkan.  Terbentuknya Curd Aktivitas biokimia dari mikroorganisme yang berbeda ditumbuhkan pada litmus milk menghasilkan produksi 2 tipe curd (clots) yang berbeda. Tidak seperti acid curd. selain itu adanya calcium ion diubah menjadi calcium paracaseinate dan membentuk gumpalan yang tidak larut.hydrogen dari substrat. Dengan menggunakan enzim proteolitik. -Rennet curd Beberapa organisme menghasilkan rennin. Oksidasi laktosa ini memproduksi asam laktat. curd jenis ini berupa gumpalan semisolid yang lembut. asam butirat. .

glucose. menjadi bentuk dasarnya yaitu asam amino. dengan disertai pelepasan produk akhir alkaline yang menyebabkan perubahan warna. Proteolysis of casein F. terutama casein. Uninoculated Control D. Alkaline Reaction b. mannitol broth : . Acid/Reduction/Curd B. fructose. Litmus berubah warna menjadi lapisan ungu yang berada di atas/ permukaan dari tabung.Fermentasi Karbohidrat Media yang digunakan Komposisi Media : phenol red lactose. Acid Formation E. Proses pencernaan protein disertai dengan perubahan sejumlah besar ammonia yang dihasilkan dalam medium dengan alkaline pH.Casein peptone (10 gr) . reaksi sedangkan bagian bawahnya kehilangan strukturnya dan membentuk cairan kecoklatan  Reaksi Alkaline Reaksi alkaline dibuktikan ketika warna pada medium tidak berubah atau berubah menjadi biru. Reaksi ini mengindikasikan partial degradation dari casein menjadi rantai polipeptida yang lebih pendek. Reduction/Curd (arrow denotes gas pocket) C.organisme menghidrolisis milk protein. Beberapa kemungkinan hasil yang diperoleh dari uji Litmus Milk : Keterangan gambar :A.

yang berguna untuk mendeteksi gas yang dihasilkan. format. Beberapa organisme mampu memfermentasikan gula seperti glukosa secara anaerob. Anaerob fakultatif mampu melakukan keduanya sedangkan beberapa organisme justru tidak mampu mengoksidasi glukosa secara anareob maupun aerob. seringkali karbohidrat.8). Hasil metabolisme asam piruvat lebih lanjut tidak sama untuk semua organisme. Fermentasi digambarkan dengan baik lewat degradasi glukosa melalui jalur Embden-Meyerhof. menjadi . yang mana merupakan senyawa intermediet utama yang dihasilkan dari degradasi glukosa.yang mengarah pada biooksidasi substrat. Satu mol glukosa dikonversi menjadi dua mol asam piruvat. Pada fermentasi.Phenol red Lama inkubasi : 24 . dan variasi produk akhir menunjukkan kemampuan fermentasi mereka yang berbeda.018 gr) Kebanyakan organisme memperoleh energi melalui suatu urutan reaksi enzimatis tertentu dan terintegrasi. yang merah pada pH netral (7) dan kuning bila sedikit asam (pH 6. substrat-substrat seperti karbohidrat dan alkohol mengalami disimilasi secara anaerob dan menghasilkan asam organik (sebagi contoh : laktat. yang dikenal dengan jalur glikolisis.-Lactose/fructose/glucose/mannitol . Degradasi fermentasi secara anaerob mengambil tube broth fermentasi yang mengandung tabung Durham. Organisme menggunakan karbohidrat secara berbeda. atau asam asetat) yang disertai adanya gas seperti hydrogen atau karbondioksida. tergantung pada komplemen enzimnya. sedangkan yang lain dengan aerob. Medium fermentasi karbohidrat mengandung : -Nutrient broth untuk pertumbuhan semua organisme -Karbohidrat spesifik yang berfungsi sebagai substrat untuk determinasi kemampuan fermentasi organisme-organisme.Sodium chloride . -pH indicator phenol red.48 jam pada 370C (5 gr) (5 gr) (0.

Bacteriological agar . Kekurangan fermentasi karbohidrat oleh beberapa organisme tidak dapat diartikan sebagai ketiadaan pertumbuhan. Inkubasi yang berlebih dapat menutupi reaksi produksi asam oleh produksi alkali yang disebabkan kegiatan enzimatik pada substrat. Pada beberapa kasus. Di antara nutrien tersebut adalah pepton yang ada pada nutrient broth.Meat peptone . produksi asam disertai produksi gas (CO2) yang terlihat sebagai gelembung pada tabung Durham.Ferric ammonium sulfate . Ini merupakan reaksi negatif. karbohidrat yang telah difermentasi dengan hasil sampingan asam akan menyebabkan phenol red menjadi kuning. yang mengindikasikan reaksi positif.2 gr) mikroorganisme mampu memproduksi hydrogen sulfide (H2S) : . dan tabung tetap warna merah.Casein peptone . Reaksi tersebut membebaskan ammonia hidroksida (NH4OH) dan menghasilkan lingkungan alkalin. yang menimbulkan warna merah tua. Setelah inkubasi.2 gr) (20 gr) (6. selain karbohidrat. Organisme menggunakan nutrien lain dalam medium sebagai sumber energi.5 gr) (0.1 gr) (0. serta tidak ada gas pada tabung Durham.Sodium thiosulfate Lama inkubasi Terdapat dua jalur : 24 – 48 jam pada 370C fermentasi utama yang mana beberapa (3. Asam ketoamino tersebut lalu dimetabolisme lewat siklus Krebs untuk menghasilkan energi.Produksi H2S Media yang digunakan Komposisi Media : SIM agar deep tubes : . c. Kultur yang tidak mampu memfermentasi substrat karbohidrat tidak akan merubah warna indicator.Inkubasi dilakukan dalam waktu 48 jam. Pepton dapat didegradasi oleh enzim mikrobial menjadi asam amino yang secara enzimatis dikonversi menjadi asam ketoamino lewat deaminasi oksidatif.

Motilitas disadari saat . sulfat (SO42-). dan Agar untuk membuat medium menjadi semisolid dan mendorong respirasi anaerob. Ketiadaaan endapan menunjukkan reaksi negative. ferro sulfat (FeSO4) sebagai indicator H2S. Medium yang mengandung sodium thiosulfat. Asam amino ini dengan keberadaan sistein desulfurase. membentuk endapan tak larut ferrous sulfide berwarna hitam yang dapat dilihat di sepanjang tusukan inokulasi. atau sulfit (SO32-). Pepton tersebut didegradasi oleh enzim microbial menjadi asam amino. Jalur I : gas H2S dapat diproduksi oleh reduksi (hidrogenasi) sulfur organic yang ada di asam amino sistein. kehilangan atom sulfur dan direduksi dengan penambahan hydrogen dari air untuk membentuk H2S. Ferrous ammonium sulfat gas. Atom sulfur bertindak sebagai akseptor hydrogen selama oksidasi senyawa anorganik seperti ditunjukkan sebagai berikut : Pada percobaan digunakan SIM medium yang mengandung peptone dan sodium thiosulfat sebagai substrat sulfur. dengan mikroorganisme tertentu dapat direduksi menjadi sulfite dengan pembebasan H2S. SIM agar juga dapat digunakan untuk mendeteksi motilitas organisme. meliputi sistein. yang mengindikasikan terbentuknya H2S.  Jalur II : gas H2S dapat dihasilkan dari reduksi senyawa sulfur anorganik seperti thiosulfat (S2O32-). yang mana merupakan komponen peptone yang terdapat pada medium.

:24 – 48 jam pada 370C Reduksi nitrat oleh beberapa mikroorganisme aerobik dan fakultatif anaerobik terjadi dengan adanya molekul oksigen yaitu proses anaerobik.Peptone from casein .pertumbuhan kultur dari organisme berflagellata tidak sesuai dengan garis inokulasi.Meat extract .Reduksi Nitrat Media yang digunakan Kompisisi Media :Nutrient Agar : . Pada respirasi organisme anaerobic merupakan proses oksidatif karena itu . Pertumbuhan organisme nonmotil sesuai dengan garis inokulasi ditunjukkan sebagai berikut : d.Solution B (αnaphthylamine) dan bubuk Zn.Agar Reagen yang diperlukan Lama inkubasi (10 gr) (3 gr) (12 gr) :Solution A (asam sulfanilat).

kemampuan organisme untuk mengurangi nitrat atau nitrit dapat dibuktikan dengan penambahan 2 reagen: Larutan A yaitu asam sulfanilat. Kondisi agar yang semisolid akan menyebabkan difusi oksigen ke dalam medium menjadi sedikit sehingga bakteri anaerob akan melakukan reduksi nitrat Setelah kultur diinkubasi. Pada dasarnya.1% kalium nitrat (KNO3) sebagai substrat nitrat.sel menggunakan substrat inorganic seperti nitrat (NO3. Dapat ditambahkan agar medium menjadi semisolid yaitu dengan penambahan 0.medium mengandung nutrient broth bersupplemen 0. Adanya proses reduksi dengan penambahan Larutan A dan B akan menghasilkan warna cherry red.1% agar.+ Nitrit H2O Air Hydrogen electron Beberapa organisme mempunyai kapasitas enzimatik untuk mengurangi jumlah nitrit menjadi ammonia (NH3+) atau molekul nitrogen (N2). NO2Nitrit 2NO3. Nitrat NO3Reduktase NO2- . diikuti dengan pemberian Larutan B yaitu α-naphthylamine.) atau sulfat (SO42-) untuk suplai oksigen yang kemudian menjadi akseptor hydrogen akhir selam pembentukan energi. Perubahan nitrat menjadi nitrit dapat dilihat dari reaksi di bawah ini: Nitrat NO3 + 2H + 2e Nitrat + - Reduktase NO2.+ 12H+ + 10eNitrat NH3+ Ammonia N2 + 6H2O Gas Nitrogen Reduksi nitrat dapat diterangkan dengan mengkultivasi organisme dalam medium nitrat broth.

mak nitrat pada medium direduksi melalui nitrit menjadi ammonia dan gas nitrogen. Bila setelah penambahan besi tidak ada perubahan warna. Ini adalah reaksi yang positif. Besi mereduksi nitrat menjadi nitrit.Casein peptone .Ferric ammonium sulfate (0. Jika nitrat tidak direduksi.bubuk besi ditambahkan sedikit ke kultur yang telah diberi Larutan A dan B. e.Sodium thiosulfate Reagen yang diperlukan Lama inkubasi : Kovac’s reagent : 24 – 48 jam pada 370C (3.Bacteriological agar .Produksi Indol Media yang digunakan Kompisisi Media : SIM agar deep tubes : . reaksi reduksi nitrat dikatakan negatif. Bila ada perubahan menjadi warna merah maka membuktikan nitrat tidak direduksi menjadi nitrit oleh organisme.Kultur yang tidak memproduksi perubahan warna seperti yang tertera di atas memiliki 2 kemungkinan : *Nitrat tidak direduksi oleh organisme. atau *Organisme mempunyai semacam potensi enzim nitrate reductase yaitu nitrat secara cepat direduksi melalui nitrit menjadi ammonia atau bahkan menjadi molekul nitrogen.5 gr) (20 gr) (6.2 gr) .2 gr) . Untuk membuktikan ada tidaknya nitrat yang direduksi melalui terbetuknya nitrite.1 gr) (0.Meat peptone .

Kultur yang menghasilkan lapisan reagen yang berwarna merah ceri setelah ditambah dengan reagen Kovac mengindikasikan indol positif. f. Keberadaan indol dideteksi dengan menambahkan reagen Kovac yang menyebabkan lapisan reagen yang ada di atas agar deep menjadi berwarna merah ceri. Indol diekstrak dari medium ke lapisan reagen oleh komponen butyl alcohol yang diasamkan dengan asam klorida (HCl) dan membentuk kompleks dengan pdimetilaminobenzaldehid yang menghasilkan warna merah ceri.Tes metil merah (MR) Media yang digunakan Komposisi media : MR-VP broth : .Dextrose Reagen yang diperlukan : Metyl red indicator (7 gr) (5 gr) (5 gr) .Peptone mixture .Triptofan adalah asam amino esensial yang dapat mengalami oksidasi melalui beberapa aktifitas enzimatik bakteri.Potassium phosphate . Dalam uji ini digunakan agar SIM (Sulphite Indole Motility) yang mengandung substrat trytophan. Reaksinya sebagai berikut : Kemampuan hidolisis triptofan dan produksi indol bukan karakteristik mikroorganisme dan oleh sebab itu dapat berfungsi sebagai penanda biokimia. Konfersi triptofan menjadi produk metabolit dilakukan oleh enzim triptofanase. Ketidakhadiran warna merah ceri mengindikasikan bahwa substrat tryptophan tidak terhidrolisis dan mengindikasikan reaksi indol negative.

g. Kedua organisme ini menghasilkan produk akhir asam organik selama masa inkubasi awal.Peptone mixture . Meskipun semua mikroorganisme enteric memfermentasi glukosa dengan menghasilkan asam organik. Produksi dan deteksi produk akhir non asam dari fermentasi glukosa E.Tes Voges-Proskauer Media yang digunakan Komposisi media : MR-VP broth : . Pada uji ini indicator methyl red mendeteksi keberadaan konsentrasi asam yang besar pada hasil akhir dengan media MRVP Agar. Produk akhir dari reaksi ini dapat bervariasi tergantung reaksi enzimatik spesifik yang ada dalam bakteri.coli dan E. Selama inkubasi selanjutnya. Pada pH sekitar 6 masih tetap mengindikasikan keberadaan asam tapi pada konsentrasi ion hydrogen yang lebih rendah.Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C Glukosa heksosa adalah substrat utama yang dioksidasi oleh seluruh organisme enteric untuk produksi energi. uji ini berguna dalam pemisahan E.aerogenes secara enzimatik mengubah asam ini ke hasil akhir yang tidak asam seperti 2. Reaksinya sebagi berikut: Glukosa + H2O  Asam laktat Asam Asetat Asam format + CO2 + H2 (pH 4. areogenes diperkuat dengan uji Voges-Proskauer. E. Indikator berubah warna jadi kuning dan mengindikasikan hasil uji yang negatif. Derajat keasaman yang rendah (pH = 4) distabilisasi dan diatur oleh E.aerogenes.coli pada akhir masa inkubasi. Indikator metal red pada pH sekitar 4 akan berwarna merah yang mengindikasikan bahwa hasil uji positif.0) Uji +  ditunjukkan dengan warna media yang menjadi merah.Potassium phosphate (7 gr) (5 gr) .3-butanadiol dan acetoin (asetilmetil-karbinol) yang menghasilkan pH sekitar 6.

Reagen yang digunakan dalam uji ini adalah reagen Barrit yang mengandung campuran α-naphthol alkoholik dan larutan 40% potassium hydroxide (KOH). CH3 OH C O CH CH3 Asetilmetilkarbinol α -naftol Reaksi Asetilmetilkarbinol dengan reagen Barrit h. kompleks pink terbentuk. Deteksi acetylmethylcarbinol membutuhkan hasil akhir ini untuk dioksidasi menjadi senyawa diasetil. Sebagai hasil. Keberadaan warna mawar tua pada kultur setelah penambahan reagen Barritt mengindikasikan keberadaan acetylmethylcarbinol dan merupakan hasil positif.sodium citrate .Penggunaan Sitrat Media yang digunakan Komposisi media : Simmons citrate agar slant : .dipotassium hydrogen phospate (1 gr) .2 gr) OH + 40% KOH Oksidasi C CH3 Diasetil O CH3 C O + C NH2 NH NH-R Guanidin Kompleks berwarna Pink . Reaksi ini terjadi pada keberadaan katalis α-naphthol dan grup guanidine yang ada pada peptone pada medium MRVP.ammonium dihydrogen phosphate (1 gr) .magnesium sulfate (5 gr) (2 gr) (0.sodium chloride .CH3 C CH CH3 O OH + OH 40% KOH Oksidasi CH3 C C O O + C NH2 NH NH-R (5 gr) Kompleks berwarna Pink CH . dan bila tidak ada berarti hasilnya negatif.Dextrose 3 Reagen yang diperlukan Asetilmetilkarbinol α -naftol Lama inkubasi : Barritt’s reagent A dan B Diasetil Guanidin 0 : 24 – 48 jam pada 37 C Uji Voges-Proskauer menentukan Reaksi Asetilmetilkarbinol dengan reagen Barrit kemampuan beberapa organisme untuk memproduksi produk akhir non asam atau netral seperti asetilmetil -karbinol yang berasal dari metabolisme glukosa. sebagai warna mawar pada medium.

COOH CH2 HO C CH2 COOH C itrate COOH COOH Citras C O e + CH2 COOH COOH Oxaloaseti c acid CH3 COOH COOH C O + CO2 CH3 COOH Pyruvic acid Excess carbon dioxide Acetic acid 2. sebuah produk alkalin.. sedangkan negatif bila tanpa pertumbuhan dan medium tetap berwarna hijau. Kemampuan ini tergantung pada keberadaan enzim sitrat permease yang memfasilitasi transport sitrat dalam sel. Sitrat merupakan senyawa intermediet utama dalam sel dan diproduksi dengan kondensasi asetil aktif dengan asam oksalaasetat.08 gr) (15 gr) Pada ketiadaan glukosa atau laktosa yang dapat difermentasi. Selama reaksi. beberapa mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai sumber karbon untuk produksi energi mereka. Sitrat positif ditunjukkan pertumbuhan pada permukaan slant yang diikuti warna biru. Sitrat.bacterological agar Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (0. 1. medium menjadi alkalin-karbondioksida yang dihasilkan berkombinasi dengan sodium dan air membentuk sodium carbonate.bromthymol blue . Produk tersebut kemudian secara enzimatis diubah menjadi asam piruvat dan karbondioksida. dengan keberadaan enzim sitrase. CO2 + 2Na+ + H2O  Na2CO3  Alkaline pH  perubahan warna dari hijau ke menjadi biru . Kehadiran sodium carbonate mengubah indicator bromthymol biru pada medium dari hijau menjadi biru tua Prussia. menghasilkan asam oksalaasetat dan asetat.

i.1 gr) . Adanya urease dapat dideteksi ketika organisme ditumbuhkan dalam urea broth medium yang mengandung pH indicator phenol red.1 gr) Urease yang diproduksi oleh beberapa mikroorganisme merupakan enzim yang secara khusus membantu mengidentifikasi Proteus vulgaris.dipotassium phosphate . j.adanya ammonia membuat lingkungan alkaline yang menyebabkan phenol red berubah menjadi deep pink. Hal ini menunjukkan reaksi positif terhadap adanya urease. tes ini dapat dengan cepat membedakan anggota dari genus ini dari mikroorganisme lain yang tidak memfermentasi laktosa. Walaupun organisme lain mungkin menghasilkan urease. Ketika substrat urea dipisahkan dari produknya.Aktifitas urease Media yang digunakan Komposisi media : Urea broth : .yeast extract Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (9. Urease adalah enzim hydrolitik yang menyerang ikatan nitrogen n karbon pada komponen amida misalnya urea dan membentuk alkaline yang produk akhirnya adalah ammonia .5 gr) (0.1 gr) (20 gr) (0.urea . Oleh karena itu.phenol red . Kegagalan perubahan warna menjadi deep pink membuktikan reaksi negatif.monopotassium phosphate (9. peran mereka pada substrat lebih lambat jika dibandingkan dengan spesies Proteus.Aktivitas katalase Media yang digunakan :Nutrient Agar .

secara ekstrem menghasilkan toxic superoxide. Hal ini menunjukkan tes . Organisme yang mampu memproduksi katalase secara cepat mendegradasi hydrogen peroksida berdasarkan reaksi berikut : 2H2O2 2H2O Air Hidrogen Peroksida Oksigen bebas + O2 (g) Organisme aerobic yang kekurangan katalase dapat mendegradasi toxic superoxide secara khusus menggunakan enzim superoxide dismutase.Peptone from casein . facultative anaerob.Agar (10 gr) (3 gr) (12 gr) Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C Selama respirasi aerobik. selama proses degradasi karbohidrat untuk produksi energi. Ketidakmampuan strict anaerob untuk mensintesis katalase. seperti yang telah disebutkan pada reaksi kimia diindikasikan oleh gelembung dari gas oksigen yang ‘terbebas’. tetapi H2O2 kurang berbahaya bagi sel bakteri jika dibandingkan dengan superoksida.di mana oksigen merupakan akseptor electron terakhir. hasil akhir dari superoxide dismutase adalah H2O2. peroxidase. mikroorganisme memproduksi hydrogen peroksida dan dalam beberapa kasus. dan mikroaerophile menggunakan jalur respirasi aerobic. Bila enzim – enzim di atas tidak ada maka menyebabkan konsentrasi zat toksik dari H2O2 tidak dapat didegradasi ketika organisme tersebut ditumbuhkan disertai adanya oksigen. Produksi katalase dapat ditentukan dengan penambahan substrat H2O2 pada tryticase soy agar slant culture yang telah diinkubasi. atau superoxide dismutase mungkin menjelaskan mengapa oksigen menjadi beracun untuk mikroorganisme. Diperkirakan substansi ini akan dihasilkan dari organisme yang mati jika tidak mereka dapat didegradasi secara enzimatik.Kompisisi Media : . Substansi ini diproduksi ketika bakteri aerob. Jika ada katalase.Meat extract .

yang mungkin menjadi penyebab infeksi pada urine.Uji Bile Esculin Media yang digunakan Lama inkubasi : Bile esculin agar : 24 – 48 jam pada 370C Media ini digunakan untuk mengidentifikasi group D streptococcus. Bile esculin test : Dengan adanya bile. Group D streptococcus menunjukkan α atau γ -hemolysis pada blood agar plates.5% : 24 – 48 jam pada 370C Media ini digunakan untuk mengidentifikasi group D streptococcus.7-dihydroxy-coumarin yang bereaksi dengan iron salt yang terkandung dalam medium. ada golongan nonenterococci seperti S. Group D streptococci menghidrolisis glycoside esculin menjadi 6. l. m. Group ini meliputi enterococcus seperti Enterococcus faecalis. Enterococcus memiliki kemampuan antibiotik resisten dan yang lebih jarang sebagai vancomycin. yang digunakan dalam pengobatan manusia . Hal ini menyebabkan timbulnya warna cokelat – hitam pada medium setelah diinkubasi.5% sodium chloride broth Media yang digunakan Komposisi media Lama inkubasi : 6. Selain itu. yang mungkin menjadi penyebab infeksi pada urine.Uji 6. yang digunakan dalam pengobatan manusia menggunakan laser. Bovis.5% NaCl Broth : brain – heart infusion broth NaCl 6. Group ini meliputi enterococcus seperti Enterococcus faecalis. Bila tidak terdapat warna hitam tidak mengidentifikasi organisme Group D streptococci. Group D streptococcus menunjukkan α atau γ -hemolysis pada blood agar plates.katalase positif. Selain itu. Bovis. ada golongan nonenterococci seperti S. sedangkan tidak terbentuknya gelembung adalah tes katalase negative.

menggunakan laser. 6. . Dari hasil penelitian. Enterococcus memiliki kemampuan antibiotik resisten dan yang lebih jarang sebagai vancomycin.Agar . . Streptococcus viridans merupakan bakteri yang tidak patogen. α -hemolytic streptococci. Sedangkan yang lain.5% sodium chloride broth : Group D enterococci dapat diidentifikasi dengan kemampuannya tumbuh pada medium ini jika dibandingkan dengan non enterococci.(γ ) Gamma-hemolysis diindikasikan dengan tidak adanya hemolysis di sekitar koloni. Sebagian besar.Aktivitas hemolytic Media yang digunakan Komposisi media : blood agar base : .(β ) Beta-hemolysis merupakan penghancuran sel darah merah dengan sempurna. memiliki kemampuan untuk menyebabkan infeksi pada manusia seperti subacute endocarditis dan gagal jantung.5 gr) (5 gr) (5 gr) (12 gr) (5%) Aktivitas hemolytic ini adalah salah satu cara untuk mengidentifikasi adanya streptococci.NaCl .liver digest . . Ditandai dengan terbentuknya zona bening sekitar 2 . Streptococcus mampu memproduksi β -hemolysins dan bersimbiosis dengan bakteri patogen. Ditandai dengan adanya zona berwarna hijau di sekitar koloni.yeast extract .4 kali diameter koloni.proteose peptone .Darah steril Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (15 gr) (2. ada 3 tipe reaksi hemolytic pada blood agar yaitu: . γ -hemolytic streptococci bersifat avirulent. n.(α ) Alpha-hemolysis merupakan bentuk hemolisis yang tidak sempurna.

apabila pada medium nutrient agar tidak terlihat warna selain warna koloni. lens paper dan mikroskop . p. Selain dilakukan pewarnaan gram dan uji – uji biokimia. Pewarnaan spora Peralatan yang diperlukan : Bunsen. maka hal itu menandakan bahwa uji pigmen negatif. Uji Pigmen Media yang digunakan Kompisisi Media : Nutrient Agar : . inoculating loop. glass slides. Sedangan bila ditemukan warna yang lain berarti menandakan bahwa uji pigment positif. Uji Bile Solubility Media yang digunakan Reagen yang digunakan Lama inkubasi : Bile solubility : Na-deoksikolat : 24 – 48 jam pada 370C Adanya surface-active agents seperti bile dan bile salts (sodium desoxycholate atau sodium dodecyl sulfate).Meat extract . Setelah diinkubasi.Peptone from casein .o. bibulous paper. ada juga yang membutuhkan pewarnaan spora untuk mengidentifikasi lebih lajut.Agar Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (10 gr) (3 gr) (12 gr) Pada uji pigmen ini. Selain α -hemolytic streptococci tidak akan mengalami lisis oleh agen tadi dan tidak larut dalam bile. Berikut adalah penjelasan tentang pewarnaan spora. menyebabkan dinding sel pneumococcus mengalami lisis. hotplate. biakan yang larut dalam bile akan tampak jernih sedangkan yang tidak larut dalam bile akan tampak keruh. staining tray.

Reagen yang dibutuhkan Endospora : Malachite green dan safranin Lama inkubasi untuk biakan : 48 . Metode ini menggunakan malakit hijau sebagai pewarna primer (primer stain) dan safranin sebagai caounterstain.masing . subterminal D: rectangular. terminal F: circular. central G: inflated spore Pedoman yang digunakan oleh praktikan dalam mengidentifikasi spesies suatu sampel adalah pohon filogenik. terminal C: rectangular. Hal ini disebabkan masing. Metode yang umum digunakan adalah Scaeffer-Fulton endospore stain. central E: circular. dan berfungsi untuk melindungi lingkungan bakteri yang dari tidak menguntungkan. Struktur ini tidak dapat diwarnai dengan metode pewarnan sederhana maupun gram.72 jam pada media agar slant merupakan struktur yang bersifat resisten. dorman. terminal B: rectangular.Gambar tentang berbagai bentuk spora sebagai berikut : A: oval.

spesies memiliki jalur yang berbeda dalam proses pengidentifikasiannya.Berikut skema pohon filogenik : .

Staphylococcus spp dan Streptococcus spp. maka dilakukan pewarnaan spora.Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya Bacilli Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Corynebacterium spp. 1c. 1b. dan Lactobacillus spp. maka dilakukan uji biokimia yaitu uji katalase.Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya cocci Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Micrococcus spp. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya cocci .Penjelasan tentang pohon filogenik sebagai berikut : Setelah praktikan dapat mengidentifikasi bakteri berdasarkan pewarnaan gram dan morfologi bakteri. maka dapat disimpulkan sebagai berikut : 1a.

maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Streptococcus spp. maka dilakukan uji bile esculin.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. dan Neisseria spp. Bila uji katalase menunjukkan negatif.Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Branhamella spp. 3b. S. 1d. Enterobacter spp. 2b. Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya cocci Uji Katalase 2a. Bila uji Bile Esculin menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E.epidermis. maka dilakukan Uji Pigment. Saprophyticus. Moraxella spp.Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya Bacilli Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Citrobacter spp.5% NaCl Broth. . Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.. dan Pseudomonas spp.luteus. Klebsiella spp. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Uji Bile Esculin 3c.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka dilakukan uji biokimia yaitu uji glukosa. Faecalis dan S. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka dilakukan uji pada 6.bovis. Uji Mannittol 3a. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. M. Proteus spp. maka dilakukan uji biokimia yaitu uji laktosa... Escherichia spp. M.. maka dilakukan uji mannitol. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Micrococcus spp. dan Staphylococcus spp.varians. Bila uji Mannitol menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Staphylococcus aureus. Bila uji katalase menunjukkan positif. Bila uji Mannitol menunjukkan negatif..

4b. maka dilakukan Uji Hemolysis. 5b.mitis dan S. varians.epidermis. 4d. Bila uji Bile Esculin menunjukkan negatif. maka dilakukan Uji Fermentasi Fruktosa. Bila uji Hemolysis menunjukkan positif. Bila uji Hemolysis menunjukkan negatif. Uji Fermentasi Fruktosa .5% NaCl Broth menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E.pneumoniae dan S. Uji Hemolysis 4e. Bila uji Pigment menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M. Uji Pigment 4a. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S.3d.mitis.luteus dan M. luteus. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.5% NaCl Broth 4c. Uji Fermentasi Glukosa 5a. varians. Uji pada 6. S.pyogenes. Saprophyticus dan S. Faecalis. maka dilakukan Uji Bile Solubility. 4f. Bila uji Pigment menunjukkan negatif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S.5% NaCl Broth menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S.pyogenes. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah alpha hemolysis yaitu S. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S.pneumoniae.bovis. Bila uji pada 6. Bila uji pada 6. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M.

maka dilakukan Uji Voges-Proskauer.Bila uji Bile Solubility menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Bacillus spp. maka dilakukan uji katalase. maka dilakukan uji mannitol. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Corynebacterium spp. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Corynebacterium spp. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. cercus. mitis. dan Lactobacillus spp. 5b.subtilis. Uji katalase 3c. Bila uji mannitol menunjukkan positif. Bila tidak ditemukan adanya spora. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B. Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya Bacilli 2a Bila terdapat spora dalam sampel. 3b. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Uji Bile Solubility 5e. 2b. epidermis. 5d. Megaterium dan B.pneumoniae. Bila uji mannitol menunjukkan negatif. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. saprophyticus. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. Uji mannitol 3a. . maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat. Bila uji Bile Solubility menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. Bila uji katalase menunjukkan positif..5c. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.

casei 5b.subtilis. maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B. delbrueckii. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif (terbentuk asam dan gas). Bila uji mannitol menunjukkan positif. . 4b. Kutscheri. 4d. casei dan L. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Bila uji katalase menunjukkan negatif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. 5a. Bila uji Fermentasi Mannitol menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. Uji Voges-Proskauer dalam sampel adalah B.3d. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif (hanya terbentuk asam). Megaterium. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. delbrueckii Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka kemungkinan bakteri yang ada . Bila uji katalase menunjukkan positif. Uji Fermentasi Glukosa 4e. xerosis. Bila uji mannitol menunjukkan positif. Uji Fermentasi Mannitol.fermentum. maka dilakukan Uji Fermentasi Mannitol. 4f. Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya cocci Uji Fermentasi Glukosa 4a. Bila uji Fermentasi Mannitol menunjukkan negatif. Uji Reduksi Nitrat 4c. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. Bila uji katalase menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Lactobaciillus spp.

maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat . maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa Uji Produksi Indole 3a. bovis Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya Bacilli Uji Fermenatasi Laktosa 2a. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan negatif. maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M. Bila uji Fermentasi Laktosa menunjukkan positif. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan positif. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan negatif. Intermedius dan E. Escherichia spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.Untuk mengetahui ..sicca . 2b. Enterobacter spp. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Proteus spp. 2b. dan Klebsiella spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. mucosa . Bila uji produksi indol menunjukkan positif. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Branhamella spp dan Moraxella spp. 3b. coli.2a. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah N.catarrhalis 3d. dan Pseudomonas spp. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Citrobacter spp. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif. Bila uji Fermentasi Laktosa menunjukkan negatif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah N. maka dilakukan Uji Produksi Indole . Uji Reduksi Nitrat 3a. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Neisseria spp . Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan positif.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. 3c. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B.

( I ) Uji Produksi Indole . maka dilakukan Uji Produksi Indole. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Pseudomonas spp. Uji Fermentasi Glukosa 3c. Escherichia spp. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif. dan Klebsiella spp. maka dilakukan Uji Reduksi Nitrate. maka dilakukan Uji Produksi H2S. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. Intermedius 4b. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Proteus spp. Uji Penggunaan Citrate 4a.Bila uji produksi indol menunjukkan negatif. Pneumoniae. maka dilakukan Uji Penggunaan Citrate . maka dilakukan Uji Metyl Red . freundii dan K. Bila uji Penggunaan Citrate menunjukkan negatif. Aerogenes dan K. coli. Bila uji Metyl Red menunjukkan positif.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. freundii. (I) 4d. Bila uji Penggunaan Citrate menunjukkan positif.ozaenae.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.lebih detail tentang spesies sampel kita. Enterobacter spp. Bila uji Metyl Red menunjukkan negatif.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita..Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.. Uji Metyl Red 4c. 3b. maka dilakukan Uji aktivitas urease. 3d. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E.

maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. Bila uji Produksi Indole menunjukkan negatif. ( II ) 4f. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. Bila uji Produksi H2S menunjukkan negatif. Bila uji Produksi Indole menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. Bila uji Produksi Indole menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. mirabilis dan P. inconstans. maka dilakukan Uji Produksi H2S. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P.. Bila uji Produksi Indole menunjukkan negatif.rettgeri. Uji Produksi H2S( II ) 5e. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. Bila uji aktivitas urease menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah K.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. 5d. . vulgaris dan P. 5f.rettgeri. vulgaris. Uji aktivitas urease( I ) 5c. freundii 5b.ozaenae. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. Aerogenes. Pneumoniae.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Bila uji Produksi H2S menunjukkan positif. ( II ) Uji Reduksi Nitrate 4g.aeruginosa dan P. maka dilakukan Uji Litmus Milk.Bila uji Reduksi Nitrate menunjukkan positif.Bila uji Reduksi Nitrate menunjukkan negatif. Bila uji aktivitas urease menunjukkan negatif.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka dilakukan Uji aktivitas urease . maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah K.4e. Uji Produksi H2S( I ) 5a. 4h.fluorescens.mallei.

Uji Litmus Milk 5i.Erlemeyer . maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P.Alat : . Alat dan Bahan : 1.Beker glass . III. inconstans. Bila uji aktivitas urease menunjukkan negatif.Lampu spiritus .Hotplate stirrer . maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P.Jarum ose .Tabung .Cawan petri .Objek glass .Pipet . maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. mirabilis. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P.Bila uji Litmus Milk menunjukkan positif.aeruginosa yang mengalami peptonization 5j.fluorescens yang mengalami reaksi alkaline. 5h.Uji aktivitas urease( II ) 5g. Bila uji aktivitas urease menunjukkan positif.Bila uji Litmus Milk menunjukkan positif.

lahan dengan Gram III hingga tidak ada pewarna yang terlunturkan. b. Membilas preparat secara hati-hati dnegan air tetes larutan karbolgentian violet (Gram I). c.Crystal violet (Gram I) .Gram’s iodine (Gram II) . e.Menetesi preparat olesan bakteri yang telah difiksasi dengan beberapa dengan air. Membiarkan selama 1 menit. Cara Kerja : 1. Mencuci dengan larutan Gram III (alkohol 96%) dengan cara memiringkan preparat kemudian menetesi perlahan.Nutrien Gelatin Broth .Bahan : .Sampel bakteri (Sampel 1.Phenol Red Dextrose Broth . Membilas .Barrit A dan Barrit B .Medium Litmus Milk .Starch Agar .Phenol Red Lactose Broth .Medium SIM Agar . d.Nitrate Broth IV.Reagen kovac’s . membiarkan selama 3 menit. 3) .Etanol 95% (Gram III) .H2O2 3% . 2.Phenol Red Sucrose Broth .Pewarnaan Gram: a.Urea Broth .Simmon’s Citrate Agar . Membilas dengan air.Medium TSA .Safranin (Gram IV) .2.MRVP Broth .Menetesi preparat dengan larutan lugol (Gram II) beberapa tetes.

-Memiringkan tabung agar terbentuk media slant 3. menanam pada media tersebut. g. Membilas preparat dengan air.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C. 3.Phenol Red Lactose Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red lactose broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest .Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Litmus Milk Broth 2. Kemudian mengeringkan di udara atau dengan cara menyerap kelebihan air dengan tissue. Mendiamkan selama 3 menit.f. Pembuatan Media untuk Stock Culture(Peremajaan) TSA slant (40 gr/L) -Menimbang TSA kemudian melarutkannya ke dalam aquades -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis. b.Pembuatan Media untuk Uji Biokimia a. Langkah inokulasi ke media : 1. h. 2. Menetesi preparat dengan larutan fuchsin (Gram IV) beberapa tetes. Mengamati preparat di mikroskop dan mencatat hasilnya.Litmus Milk (100 gr/L) Cara pembuatan media : -Menimbang litmus milk kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave.

dan phenol red dextrose broth.-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi media dengan berbagai macam karbohidrat : phenol red lactose broth.Phenol Red Mannitol Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red mannitol broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave Langkah inokulasi ke media fermentasi : 1. phenol red sucrose broth.Menginkubasi selama 24 .Phenol Red Glucose Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red glucose broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave e.Phenol Red Fructose Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red fructose broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave. d.SIM Agar Deep Tube (30 gr/L) -Menimbang SIM medium kemudian melarutkannya ke dalam aquadest . 3.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis. c. menanam pada media – media pada bagian 1. e.48 jam pada suhu 370C. 2.

Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis. -Memiringkan tabung agar terbentuk media slant Langkah inokulasi pada media : 1.5 gr/L) -Menimbang SCA kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave.Untuk tes produksi Indol ditambahkan reagen Kovac 3-5 tetes pada medium yang telah diinkubasi.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Simmons citrate agar slants 2.Simmon Citrate Agar Slant (22.Urea Broth (38.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C. 4. 3. .5 gr/L) -Menimbang urea broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Mensterilkan campuran dengan memfiltrasinya -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung Langkah inokulasi pada media : 1. f.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi SIM agar deep tubes 2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis. menanam pada media SIM dengan menusukkan ke dalam agar.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Urea Broth 2. 3.-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave. menanam pada media tersebut. Langkah inokulasi pada media : 1.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C g. menanam pada media tersebut dengan cara menggores zig-zag pada bagian yang miring.

menanam pada media tersebut dengan cara menggores zig-zag pada bagian yang miring. Langkah inokulasi pada medium : 1.Menginkubasi selama 24-48 jam pada suhu 370C i.Untuk membuktikan adanya aktivitas katalase ditambahkan reagen H2O2 3% pada medium yang tlah diinkubasi. menanam pada media tersebut dengan men-strict medium 3. Langkah inokulasi pada medium : 1.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Nutrient Agar slant 2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis.Nutrient Agar -Menimbang Nutrient Agar kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer kemudian diautoclave -Memasukkan campuran ke dalam cawan petri steril dan membiarkannya memadat.Menyiapkan plate berisi TSA 2. 3.3. .Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C 4.Tryptycase Soy Agar (TSA) Plate (40 gr/L) -Menimbang medium TSA kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer kemudian diautoclave -Memasukkan campuran ke dalam cawan petri steril dan membiarkannya memadat.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C h.

Pewarnaan gram E.V. Hasil Percobaan : 1.Pewarnaan gram 1a.coli .

Pewarnaan gram Proteus mirabilis .1b.Pewarnaan gram Staphylococcus epidermis 1c.

Uji Biokimia 2.Uji Biokimia E.coli -Uji Laktosa -Uji Indol -Uji Citrat .Uji Biokimia 2a.2.

Uji Biokimia Staphylococcus epidermis -Uji Katalase -Uji Mannitol -Uji Pigment .b.

-Uji Fruktosa c.Uji Biokimia Proteus mirabilis -Uji Laktosa .

-Uji Glukosa -Uji Indole -Uji Urea .

Tabel Hasil Percobaan Staphylococcus epidermis Macam Uji Pewarnaan Gram Morfologi Aktivitas katalase Fermentasi mannnitol Pigment Fermentasi Fruktosa Hasil Uji positif coccus + + 3c. Tabel Hasil Percobaan 3a. Tabel Hasil Percobaan Proteus mirabilis Macam Uji Pewarnaan Gram Morfologi Fermentasi laktosa Fermentasi glukosa Produksi Indol (SIM medium) Hasil Uji negative bacill + - . Tabel Hasil Percobaan E.coli Macam Uji Pewarnaan Gram Morfologi Fermentasi Laktosa Produksi Indol (SIM medium) Penggunaan sitrat Hasil Uji negative coccobacill + + - 3b.3.

Hal ini disebabkan oleh.Aktivitas Urease + VI. lapisan lipopolisakarida pada bakteri .Pewarnaan Gram & Morfologi Hasil uji morfologi pada sampel A menunjukkan bahwa bakteri pada sampel A termasuk ke dalam golongan bakteri gram negatif dengan bentuk coccobacill. Bakteri tersebut berwarna merah setelah diwarnai dengan pewarnaan gram.Pembahasan 1.Sampel A 1a.

untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji Produksi Indol.Uji Produksi Indol Uji Produksi Indol ini dilakukan pada medium SIM dengan bantuan penambahan reagen Kovac akan terlihat cincin pink pada medium.Uji Fermentasi Laktosa Uji Fermentasi Laktosa ini dilakukan pada medium phenol red lactosa broth. 1b. Oleh karena itu.Pada uji ini. 1c. Pada uji ini.ini lebih sedikit sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya akan luntur bersama dengan lapisan lipopolisakaridanya ketika dicucci dengan gram III (alkohol) sehingga yang tersisa hanya warna merah dari safranin yang merupakan pewarna tandingan. Hal ini berarti bakteri sampel A memiliki enzim triptofanase untuk memecah triptofan sesuai dengan reaksi berikut : . bakteri sampel A tidak dapat memfermentasi laktosa. dari hasil pewarnaan gram dan morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel A merupakan bakteri gram negatif dan bentuknya coccobacill sehingga untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi laktosa. Hasil uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. bakteri sampel A menunjukkan hasil positif yaitu terbetuk cincin pink setelah penambahan reagen Kovac. Oleh karena itu.

bakteri sampel A menunjukkan hasil negatif yang ditandai dengan tidak berubahnya warna medium dari hijau menjadi biru. Oleh karena itu. Oleh karena itu. 1d..Sampel B 2a. 2. . Hal ini berarti bakteri sampel A tidak memiliki enzim citrase untuk mengubah sitrat menjadi oksaloasetat dan asam asetat yang selanjutnya akan dirubah menjadi asam piruvat dan CO2 .Uji Penggunaan Citrat Uji penggunaan sitrat menggunakan medium Simmon’s Citrate Agar yang mengandung sitrat sebagai satu – satunya sumber karbon. Pada uji ini.Pewarnaan Gram & Morfologi Hasil uji morfologi pada sampel B menunjukkan bahwa bakteri pada sampel B termasuk ke dalam golongan bakteri gram positif dengan bentuk coccus.coli. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji penggunaan citrat. dapat disimpulkan berdasrkan pohon filogenik bahwa bakteri sampel A adalah E.

bakteri sampel B tidak dapat memfermentasi mannitol. Oleh karena itu. lapisan lipopolisakarida pada bakteri ini cukup tebal sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya tidak bisa luntur ketika dicuci dengan gram III (alkohol) sehingga yang tersisa adalah warna biru-ungu oleh reagen kristal-violet. 2d.Pada uji ini.Uji Aktivitas Katalase Uji aktifitas katalase dilakukan dengan menggunakan medium TSA dan selanjutnya dilakukan penambahan reagen berupa H2O2 3%. Bakteri sampel B menunjukkan hasil positif pada uji ini yang artinya bakteri sampel B memiliki enzim katalase. 2b. Hal ini disebabkan oleh. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji pigment. 2c.Bakteri tersebut berwarna biru-ungu setelah diwarnai dengan pewarnaan gram. Hasil positif tersebut ditunjukkan dengan adanya gelembung – gelembung gas pada permukaan koloni ketika ditetesi dengan H2O2 3%.Uji Fermentasi Mannitol Uji Fermentasi Mannitol ini dilakukan pada medium phenol red mannitol broth.Uji Pigment . Hal ini berarti bakteri sampel B dapat memecah hidrogen peroksida menjadi air dan karbondioksida sesuai reaksi berikut Oleh karena itu. dari hasil pewarnaan gram dan morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel B merupakan bakteri gram positif dan bentuknya coccus sehingga untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji aktivitas katalase. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi mannitol. Hasil uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. Oleh karena itu.

Sampel C 3a. 3.Uji Pigment ini dilakukan pada medium nutrient agar. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi fruktosa 2e. 3b.Pada uji ini. Pada uji ini.Oleh karena itu. dari hasil pewarnaan gram dan morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel C merupakan bakteri gram negatif dan bentuknya bacill sehingga untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi laktosa.Pewarnaan Gram & Morfologi Hasil uji morfologi pada sampel C menunjukkan bahwa bakteri pada sampel C termasuk ke dalam golongan bakteri gram negatif dengan bentuk bacill. Hasil uji positif pada fermentasi laktosa ditandai dengan berubahnya warna medium menjadi kuning yang disebabkan oleh adanya produk akhir fermentasi yang bersifat asam. lapisan lipopolisakarida pada bakteri ini lebih sedikit sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya akan luntur bersama dengan lapisan lipopolisakaridanya ketika dicucci dengan gram III (alkohol) sehingga yang tersisa hanya warna merah dari safranin yang merupakan pewarna tandingan.Oleh karena itu. dapat disimpulkan berdasarkan pohon filogenik bahwa bakteri sampel B adalah Staphylococcus epidermis. Bakteri tersebut berwarna merah setelah diwarnai dengan pewarnaan gram. dan juga adanya gas.Uji Fermentasi Laktosa . Oleh karena itu.Uji Fermentasi Fruktosa Uji Fermentasi Fruktosa ini dilakukan pada medium phenol red fructosa broth. bakteri sampel B tidak menampakkan warna yang lain selain warna koloni yaitu putih mengkilap. bakteri sampel B dapat memfermentasi fruktosa sehingga hasilnya positif. Hal itu berarti hasil uji pigment adalah negatif. Hal ini disebabkan oleh.

dan juga adanya gas. bakteri sampel C tidak dapat memfermentasi laktosa. Akan tetapi. Oleh karena itu. 3e.Hal ini berarti bakteri sampel A tidak memiliki enzim triptofanase untuk memecah triptofan.Hal ini menandakan bahwa Ketika substrat urea dipisahkan dari .Uji Fermentasi Laktosa ini dilakukan pada medium phenol red lactosa broth. Hasil uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik.Uji aktivitas urease.Uji Produksi Indol Uji Produksi Indol ini dilakukan pada medium SIM dengan bantuan penambahan reagen Kovac akan terlihat cincin pink pada medium. bila hasilnya positif. bakteri sampel C dapat memfermentasi glukkosa sehingga hasilnya positif. Pada uji ini. bakteri sampel C berubah warna menjad deep pink yang menandakan bahwa uji aktivitas urease positif. Hasil uji positif pada fermentasi laktosa ditandai dengan berubahnya warna medium menjadi kuning yang disebabkan oleh adanya produk akhir fermentasi yang bersifat asam. Oleh karena itu. ini dilakukan pada medium urea broth yang mengandung pH indicator phenol red. Oleh karena itu. Uji aktivitas urease.Uji Fermentasi Glukosa Uji Fermentasi Glukosa ini dilakukan pada medium phenol red glukosa broth. Pada uji ini. 3c. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi glukosa. Pada uji ini. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji aktivitas urease. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji Produksi Indol. 3d. pada bakteri sampel C tidak menunjukkan terbentuknya cicncin pink setelah penambahan reagen Kovac sehingga hasilnya negatif.

Natalie Sherman. Benjamin Cummings. http://www. San Francisco. Microbiology-An Introduction.produknya. Berdell R. San Francisco. VII.wsu.html . seventh edition.Case. Benjamin Cummings. Reaksinya sebagai berikut : Oleh karena itu.siue. James G. “Microbiology – A Laboratory Manual”. yang menjadi pedoman utama dalam pengidentifkasian spesies adalah penggunaan pohon filogenik. Staphylococcus epidermis dan Proteus mirabilis. 2001. Gerard J. Selain itu. Kesimpulan : Dalam melakukan identifikasi spesies dilakukan uji morfologi dan uji biokimia. Kegagalan perubahan warna menjadi deep pink membuktikan reaksi negatif.adanya ammonia membuat lingkungan alkaline yang menyebabkan phenol red berubah menjadi deep pink. Daftar Pustaka Tortora.slic2. 2005. Cappuccino.edu/~cbwilso/250cho. Oleh karena itu. Hal in disebabkan karena masing – masing spesies memiliki jalur yang berbeda baik dalam pewarnaan gram/morfologi atau metabolismenya. Hal ini menunjukkan reaksi positif terhadap adanya urease. dapat disimpulkan berdasarkan pohon filogenik bahwa bakteri sampel C adalah Proteus mirabilis.sampel kami berurutan dari adalah Escherichia coli. Funke.edu:82/hurlbert/micro101/pages/101lab9.htm http://www. Christine L. VIII.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful