IDENTIFIKASI SPESIES MIKROORGANISME SAMPEL

I. Tujuan Percobaan : Mampu menggunakan teknik pewarnaan, pengkulturan, dan uji biokimia yang telah didapat untuk menentukan genus kultur bakteri yang belum diketahui. II. Dasar Teori :

Spesies berasal dari bahasa Latin species yang merupakan tingkatan dalam taksonomi yang terkecil, biasanya digunakan untuk mengklasifikasi organisme baik yang hidup maupun organisme yang fosil. Dalam biologi, species adalah salah satu bentuk pengelompokan dalam klasifikasi makhluk hidup.. Dalam sistem tatanama binomial, nama suatu spesies makhluk hidup terdiri atas dua kata: nama genusnya (diawali dengan huruf kapital) dan nama penunjuk spesiesnya. Misalnya, dari gambar di samping,Panthera pardus, Nama Panthera merupakan nama genus atau marga sedangkan pardus merupakan nama species. Berikut penjelasan singkat mengenai 3 spesies sampel yang kelompok kami temukan. Ketiga spesies sampel kami antara lain adalah E. coli, Staphylococcus epidermis dan Proteus mirabilis. 1. E.coli Escherichia coli, atau biasa disingkat E. coli, adalah salah satu jenis spesies utama bakteri gram negatif. Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh Theodor Escherich ini hidup pada tinja, dan dapat menyebabkan masalah kesehatan pada

manusia, seperti diare, muntaber dan masalah pencernaan lainnya. E. coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika. Biasa digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan. E. coli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah dalam penanganannya. 2. Staphylococcus epidermis Staphylococcus epidermis merupakan bakteri non-motil, jenis coccus grampositive cocci, dan berbeda dengan Staphylococcus aureus, bakteri ini tidak memiliki enzim koagulase. Bakteri ini merupakan bakteri yang patogen dan aktif dalam aliran darah melalui luka, jarum dll. Infeksi dari bakter in berakibat pembengkakan pada daerah yang terinfeksi. 3.Proteus mirabilis Proteus mirabilis merpakan bakteri gram negative dan bakteri fakultatif anaerob. Bakteri ini memiliki kemampuan motalitas dan aktivitas urease. P.mirabilis menyebabkan 90% infeksi yang disebabkan oleh jenis ‘Proteus’. P.mirabilis dapat menggunakan urea dan citrate untuk produksi energi. Bakteri ini dapat memproduksi gas hydrogen sulfide dan membentuk zona bening pada media. P.mirabilis ini motil, memiliki peritrichous flagella yang diketahui sebagai penyebab pergerakan. Bakteri ini pada umumnya ditemukan pada intestinal manusia. P.mirabilis tidak pathogen pada guinea pigs atau ayam. Uji – uji biokimia pada P.mirabilis adalah sebagai berikut : *Indole negative dan reduksi nitrat positif (tidak ada gas yang diproduksi) *Metyl red positif dan Voges-Proskauer negatif *Catalase positif and Cytochrome Oxidase negatif Untuk mengidentifikasi spesies suatu bakteri, praktikan perlu melakukan serangkaian uji yang berurutan sesuai dengan hasil percobaan yang telah ada. Berikut adalah penjelasan berbagai uji yang harus dilakukan dalam mengidentifikasi spesies sampel : 1.Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram adalah suatu metode yang digunakan untuk membedakan mikroorganisme berdasarkan susunan & struktur dinding sel mikroorganisme. Metode pewarnaan gram membutuhkan 4 jenis reagen yaitu : crystal gentian violet (Gram I), iodine (Gram II), alkohol 95% (GramIII), dan saphranin (Gram IV). Dengan menggunakan metode pewarnaan gram, bakteri dapat digolongkan menjadi 2 kelompok, yaitu : bakteri gram (+) yang akan berwarna biru-ungu dan bakteri gram (-) yang berwarna merah.

Staphylcuococs (+)

E. coli (-)

Beberapa fungsi reagen dalam pewarnaan gram yang menentukan spesies sampel termasuk dalam gram (+) atau gram (-) adalah sebagai berikut: • • Pemberian kristal fiolet berfungsi untuk mewarnai semua sel. (baik Iodin berfungsi sebagai mordan. Di dalam sitoplasma iodin gram negatif maupun positif) membentuk komplek dengan kristal fiolet. Pembentukan kompleks mengakibatkan sel berwarna biru tua. • Pemberian alkohol memiliki 2 fungsi: – Pada gram positif alkohol mengakibatkan peptidoglikan terdehidrasi sehingga ukuran porinya mengecil. Ini mengakibatkan kristal violet tidak dapat keluar dari sitoplasma. – Pada gram negatif alkohol mencuci dinding sel dan meninggalkan lubang kecil pada peptidoglikan. Ini mengakibakan kristal violet tercuci keluar dan sel menjadi tidak berwarna.

Safranin berfungsi sebagai couter staining. Safranin akan

memberi warna pada gram negatif sehingga gram positif dan negatif akan terlihat berbeda secara jelas di bawah mikroskop. Dari hasil pewarnaan gram, selain dapat membedakan mikroorganisme berdasarkan susunan & struktur dinding sel mikroorganisme, praktikan juga dapat mengidentifikasi morfologi dari bakteri tersebut. Berikut gambar tentang berbagai bentuk morfologi dari bakteri sebagai berikut :

2.Uji Biokimia Biokimia adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui metabolisme dan reaksi yang dijalankan oleh suatu mikroorganisme. Jenis – jenis uji biokimia untuk mengidentifikasi spesies antara lain : a.Reaksi Litmus Milk Media yang digunakan Komposisi Media : litmus broth : - Litmus - Skim milk powder - Sodium sulfite Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (0,5 gr) (100 gr) (0,5 gr)

Penyusun susu terbesar yang digunakan sebagai dasar uji biokimia dalam media litmus milk adalah laktosa, protein susu yaitu kasein, lacto-albumin dan lactoglobulin.Untuk melihat adanya perubahan metabolisme yang diproduksi dalam medium, digunakan pH indicator yaitu oxidase-reduction

indicator litmus. Indicator ini akan menyatu dalam medium. Saat ini,litmus milk merupakan medium yang baik untuk mikroorganisme yang dapat mencerna substrat milk, tergantung dari komplemen enzimatik bakteri tersebut. Beberapa perubahan biokimia dalam litmus milk :  Fermentasi Laktosa Organisme mampu menggunakan laktosa sebagai sumber karbon untuk produksi energi, dengan menggunakan induksi enzim β -galactosidase. Degradasi laktosa dirumuskan sebagai berikut:

Adanya asam laktat dapat dengan mudah dideteksi karena litmus bewarna ungu pada pH netral dan berubah menjadi merah muda ketika medium menjadi asam yaitu pada pH sekitar 4.  Adanya gas + H2
.

Produk akhir pada fermentasi laktosa adalah CO2

Adanya gas

ini mungkin dapat dilihat sebagai pemisahan ‘curd’ atau pembelahan dalam curd sebagai akibat adanya gas yang naik ke permukaan.  Reduksi Litmus Fermentasi adalah proses anaerobic yang meliputi biooksidasi yang terjadi karena tidak ada molekul oksigen. Oksidasi ini mungkin akan terlihat sebagai perpindahan hydrogen (dehydrogenation) dari substrat.Karena ion hidrogen tidak dapat dalam bentuk bebas/melayanglayang,hydrogen memerlukan akseptor elektron yang dapat mengikat ion hydrogen jika hal tersebut tidak terjadi maka reaksi reduksi-oksidasi tidak akan berjalan dan produksi energy tidak dapat dihasilkan. Pada tes litmus milk, litmus berperan sebagai akseptor. Saat berada dalam kondisi oksidasi, litmus berwarna ungu; ketika litmus menerima

Oksidasi laktosa ini memproduksi asam laktat. Lactose Glucose Pyruvic acid -Lactic acid -Butyric acid -CO2 + h2 Gas hydrogen dikenal sebagai hydrogen litmus acceptor. Dengan menggunakan enzim proteolitik. Curd yang terbentuk bergantung pada mekanisme biokimia yang membentuk curd tersebut Ada 2 jenis curd yang mungkin terbentuk yaitu : -Acid curd Asam laktat atau asam organic lain menyebabkan pengendapan milk protein casein sebagai calcium caseinate menjadi bentuk gumpalan yang tidak larut. selain itu adanya calcium ion diubah menjadi calcium paracaseinate dan membentuk gumpalan yang tidak larut.hydrogen dari substrat. Gumpalan ini akan mengalir perlahan saat tabung dimiringkan. Tidak seperti acid curd. curd jenis ini berupa gumpalan semisolid yang lembut. litmus akan tereduksi dan berubah menjadi putih atau warna putih susu. yang menyebabkan perubahan menjadi putih dan menandakan bahwa laktosa tereduksi. -Rennet curd Beberapa organisme menghasilkan rennin.  Proteolysis (Peptonization) Ketidakmampuan beberapa mikroorganisme untuk menghasilkan energi melalui jalur fermentasi laktosa menandakan bahwa mikroorganisme tersebut harus menggunakan sumber nutrisi lainnya sebagai protein untuk menghasilkan energi. gas CO2 dan gas H2.  Terbentuknya Curd Aktivitas biokimia dari mikroorganisme yang berbeda ditumbuhkan pada litmus milk menghasilkan produksi 2 tipe curd (clots) yang berbeda. . enzim yang berperan mengubah casein menjadi bentuk paracasein. asam butirat.

dengan disertai pelepasan produk akhir alkaline yang menyebabkan perubahan warna. Acid Formation E. Alkaline Reaction b. terutama casein.organisme menghidrolisis milk protein. Litmus berubah warna menjadi lapisan ungu yang berada di atas/ permukaan dari tabung. Acid/Reduction/Curd B. menjadi bentuk dasarnya yaitu asam amino. reaksi sedangkan bagian bawahnya kehilangan strukturnya dan membentuk cairan kecoklatan  Reaksi Alkaline Reaksi alkaline dibuktikan ketika warna pada medium tidak berubah atau berubah menjadi biru. mannitol broth : . Uninoculated Control D. Proses pencernaan protein disertai dengan perubahan sejumlah besar ammonia yang dihasilkan dalam medium dengan alkaline pH. Reduction/Curd (arrow denotes gas pocket) C. glucose.Fermentasi Karbohidrat Media yang digunakan Komposisi Media : phenol red lactose.Casein peptone (10 gr) . fructose. Proteolysis of casein F. Reaksi ini mengindikasikan partial degradation dari casein menjadi rantai polipeptida yang lebih pendek. Beberapa kemungkinan hasil yang diperoleh dari uji Litmus Milk : Keterangan gambar :A.

yang mengarah pada biooksidasi substrat. Medium fermentasi karbohidrat mengandung : -Nutrient broth untuk pertumbuhan semua organisme -Karbohidrat spesifik yang berfungsi sebagai substrat untuk determinasi kemampuan fermentasi organisme-organisme.8). Satu mol glukosa dikonversi menjadi dua mol asam piruvat. Anaerob fakultatif mampu melakukan keduanya sedangkan beberapa organisme justru tidak mampu mengoksidasi glukosa secara anareob maupun aerob. Hasil metabolisme asam piruvat lebih lanjut tidak sama untuk semua organisme. seringkali karbohidrat. -pH indicator phenol red. substrat-substrat seperti karbohidrat dan alkohol mengalami disimilasi secara anaerob dan menghasilkan asam organik (sebagi contoh : laktat. Degradasi fermentasi secara anaerob mengambil tube broth fermentasi yang mengandung tabung Durham.Sodium chloride . atau asam asetat) yang disertai adanya gas seperti hydrogen atau karbondioksida.Phenol red Lama inkubasi : 24 . Fermentasi digambarkan dengan baik lewat degradasi glukosa melalui jalur Embden-Meyerhof. Pada fermentasi. dan variasi produk akhir menunjukkan kemampuan fermentasi mereka yang berbeda. Beberapa organisme mampu memfermentasikan gula seperti glukosa secara anaerob. yang berguna untuk mendeteksi gas yang dihasilkan. tergantung pada komplemen enzimnya. yang mana merupakan senyawa intermediet utama yang dihasilkan dari degradasi glukosa. yang merah pada pH netral (7) dan kuning bila sedikit asam (pH 6.018 gr) Kebanyakan organisme memperoleh energi melalui suatu urutan reaksi enzimatis tertentu dan terintegrasi. format. sedangkan yang lain dengan aerob.-Lactose/fructose/glucose/mannitol . menjadi . Organisme menggunakan karbohidrat secara berbeda.48 jam pada 370C (5 gr) (5 gr) (0. yang dikenal dengan jalur glikolisis.

Bacteriological agar . yang menimbulkan warna merah tua. Inkubasi yang berlebih dapat menutupi reaksi produksi asam oleh produksi alkali yang disebabkan kegiatan enzimatik pada substrat.5 gr) (0. selain karbohidrat. Setelah inkubasi.Inkubasi dilakukan dalam waktu 48 jam. Di antara nutrien tersebut adalah pepton yang ada pada nutrient broth. Organisme menggunakan nutrien lain dalam medium sebagai sumber energi.2 gr) (20 gr) (6. Pepton dapat didegradasi oleh enzim mikrobial menjadi asam amino yang secara enzimatis dikonversi menjadi asam ketoamino lewat deaminasi oksidatif. produksi asam disertai produksi gas (CO2) yang terlihat sebagai gelembung pada tabung Durham. Kultur yang tidak mampu memfermentasi substrat karbohidrat tidak akan merubah warna indicator. Kekurangan fermentasi karbohidrat oleh beberapa organisme tidak dapat diartikan sebagai ketiadaan pertumbuhan. Ini merupakan reaksi negatif.2 gr) mikroorganisme mampu memproduksi hydrogen sulfide (H2S) : .Meat peptone .1 gr) (0.Casein peptone . c. Pada beberapa kasus. Reaksi tersebut membebaskan ammonia hidroksida (NH4OH) dan menghasilkan lingkungan alkalin.Produksi H2S Media yang digunakan Komposisi Media : SIM agar deep tubes : . yang mengindikasikan reaksi positif. karbohidrat yang telah difermentasi dengan hasil sampingan asam akan menyebabkan phenol red menjadi kuning. dan tabung tetap warna merah.Ferric ammonium sulfate .Sodium thiosulfate Lama inkubasi Terdapat dua jalur : 24 – 48 jam pada 370C fermentasi utama yang mana beberapa (3. serta tidak ada gas pada tabung Durham. Asam ketoamino tersebut lalu dimetabolisme lewat siklus Krebs untuk menghasilkan energi.

Ketiadaaan endapan menunjukkan reaksi negative. Ferrous ammonium sulfat gas. Asam amino ini dengan keberadaan sistein desulfurase. atau sulfit (SO32-). Jalur I : gas H2S dapat diproduksi oleh reduksi (hidrogenasi) sulfur organic yang ada di asam amino sistein.  Jalur II : gas H2S dapat dihasilkan dari reduksi senyawa sulfur anorganik seperti thiosulfat (S2O32-). yang mana merupakan komponen peptone yang terdapat pada medium. dan Agar untuk membuat medium menjadi semisolid dan mendorong respirasi anaerob. sulfat (SO42-). Atom sulfur bertindak sebagai akseptor hydrogen selama oksidasi senyawa anorganik seperti ditunjukkan sebagai berikut : Pada percobaan digunakan SIM medium yang mengandung peptone dan sodium thiosulfat sebagai substrat sulfur. Medium yang mengandung sodium thiosulfat. ferro sulfat (FeSO4) sebagai indicator H2S. Pepton tersebut didegradasi oleh enzim microbial menjadi asam amino. meliputi sistein. dengan mikroorganisme tertentu dapat direduksi menjadi sulfite dengan pembebasan H2S. SIM agar juga dapat digunakan untuk mendeteksi motilitas organisme. yang mengindikasikan terbentuknya H2S. Motilitas disadari saat . membentuk endapan tak larut ferrous sulfide berwarna hitam yang dapat dilihat di sepanjang tusukan inokulasi. kehilangan atom sulfur dan direduksi dengan penambahan hydrogen dari air untuk membentuk H2S.

:24 – 48 jam pada 370C Reduksi nitrat oleh beberapa mikroorganisme aerobik dan fakultatif anaerobik terjadi dengan adanya molekul oksigen yaitu proses anaerobik.Peptone from casein . Pada respirasi organisme anaerobic merupakan proses oksidatif karena itu .pertumbuhan kultur dari organisme berflagellata tidak sesuai dengan garis inokulasi.Solution B (αnaphthylamine) dan bubuk Zn.Agar Reagen yang diperlukan Lama inkubasi (10 gr) (3 gr) (12 gr) :Solution A (asam sulfanilat).Meat extract .Reduksi Nitrat Media yang digunakan Kompisisi Media :Nutrient Agar : . Pertumbuhan organisme nonmotil sesuai dengan garis inokulasi ditunjukkan sebagai berikut : d.

1% agar. Dapat ditambahkan agar medium menjadi semisolid yaitu dengan penambahan 0. Perubahan nitrat menjadi nitrit dapat dilihat dari reaksi di bawah ini: Nitrat NO3 + 2H + 2e Nitrat + - Reduktase NO2. Adanya proses reduksi dengan penambahan Larutan A dan B akan menghasilkan warna cherry red.sel menggunakan substrat inorganic seperti nitrat (NO3.medium mengandung nutrient broth bersupplemen 0.) atau sulfat (SO42-) untuk suplai oksigen yang kemudian menjadi akseptor hydrogen akhir selam pembentukan energi. NO2Nitrit 2NO3. Pada dasarnya.1% kalium nitrat (KNO3) sebagai substrat nitrat. diikuti dengan pemberian Larutan B yaitu α-naphthylamine.+ Nitrit H2O Air Hydrogen electron Beberapa organisme mempunyai kapasitas enzimatik untuk mengurangi jumlah nitrit menjadi ammonia (NH3+) atau molekul nitrogen (N2). Kondisi agar yang semisolid akan menyebabkan difusi oksigen ke dalam medium menjadi sedikit sehingga bakteri anaerob akan melakukan reduksi nitrat Setelah kultur diinkubasi.+ 12H+ + 10eNitrat NH3+ Ammonia N2 + 6H2O Gas Nitrogen Reduksi nitrat dapat diterangkan dengan mengkultivasi organisme dalam medium nitrat broth. kemampuan organisme untuk mengurangi nitrat atau nitrit dapat dibuktikan dengan penambahan 2 reagen: Larutan A yaitu asam sulfanilat. Nitrat NO3Reduktase NO2- .

Bila setelah penambahan besi tidak ada perubahan warna. Bila ada perubahan menjadi warna merah maka membuktikan nitrat tidak direduksi menjadi nitrit oleh organisme.Produksi Indol Media yang digunakan Kompisisi Media : SIM agar deep tubes : .Meat peptone . Ini adalah reaksi yang positif. Jika nitrat tidak direduksi.1 gr) (0.Sodium thiosulfate Reagen yang diperlukan Lama inkubasi : Kovac’s reagent : 24 – 48 jam pada 370C (3. reaksi reduksi nitrat dikatakan negatif. Besi mereduksi nitrat menjadi nitrit.Ferric ammonium sulfate (0.Kultur yang tidak memproduksi perubahan warna seperti yang tertera di atas memiliki 2 kemungkinan : *Nitrat tidak direduksi oleh organisme.Bacteriological agar .2 gr) . mak nitrat pada medium direduksi melalui nitrit menjadi ammonia dan gas nitrogen. atau *Organisme mempunyai semacam potensi enzim nitrate reductase yaitu nitrat secara cepat direduksi melalui nitrit menjadi ammonia atau bahkan menjadi molekul nitrogen.5 gr) (20 gr) (6. e.bubuk besi ditambahkan sedikit ke kultur yang telah diberi Larutan A dan B.Casein peptone .2 gr) . Untuk membuktikan ada tidaknya nitrat yang direduksi melalui terbetuknya nitrite.

Ketidakhadiran warna merah ceri mengindikasikan bahwa substrat tryptophan tidak terhidrolisis dan mengindikasikan reaksi indol negative.Triptofan adalah asam amino esensial yang dapat mengalami oksidasi melalui beberapa aktifitas enzimatik bakteri. Keberadaan indol dideteksi dengan menambahkan reagen Kovac yang menyebabkan lapisan reagen yang ada di atas agar deep menjadi berwarna merah ceri.Potassium phosphate . Reaksinya sebagai berikut : Kemampuan hidolisis triptofan dan produksi indol bukan karakteristik mikroorganisme dan oleh sebab itu dapat berfungsi sebagai penanda biokimia. Kultur yang menghasilkan lapisan reagen yang berwarna merah ceri setelah ditambah dengan reagen Kovac mengindikasikan indol positif. Konfersi triptofan menjadi produk metabolit dilakukan oleh enzim triptofanase.Tes metil merah (MR) Media yang digunakan Komposisi media : MR-VP broth : . f.Peptone mixture . Dalam uji ini digunakan agar SIM (Sulphite Indole Motility) yang mengandung substrat trytophan.Dextrose Reagen yang diperlukan : Metyl red indicator (7 gr) (5 gr) (5 gr) . Indol diekstrak dari medium ke lapisan reagen oleh komponen butyl alcohol yang diasamkan dengan asam klorida (HCl) dan membentuk kompleks dengan pdimetilaminobenzaldehid yang menghasilkan warna merah ceri.

Meskipun semua mikroorganisme enteric memfermentasi glukosa dengan menghasilkan asam organik. Selama inkubasi selanjutnya.0) Uji +  ditunjukkan dengan warna media yang menjadi merah. areogenes diperkuat dengan uji Voges-Proskauer.Potassium phosphate (7 gr) (5 gr) . uji ini berguna dalam pemisahan E. Kedua organisme ini menghasilkan produk akhir asam organik selama masa inkubasi awal. Indikator metal red pada pH sekitar 4 akan berwarna merah yang mengindikasikan bahwa hasil uji positif.3-butanadiol dan acetoin (asetilmetil-karbinol) yang menghasilkan pH sekitar 6. g. Derajat keasaman yang rendah (pH = 4) distabilisasi dan diatur oleh E.coli pada akhir masa inkubasi.Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C Glukosa heksosa adalah substrat utama yang dioksidasi oleh seluruh organisme enteric untuk produksi energi.aerogenes.aerogenes secara enzimatik mengubah asam ini ke hasil akhir yang tidak asam seperti 2. Reaksinya sebagi berikut: Glukosa + H2O  Asam laktat Asam Asetat Asam format + CO2 + H2 (pH 4. Produksi dan deteksi produk akhir non asam dari fermentasi glukosa E. E. Pada uji ini indicator methyl red mendeteksi keberadaan konsentrasi asam yang besar pada hasil akhir dengan media MRVP Agar. Produk akhir dari reaksi ini dapat bervariasi tergantung reaksi enzimatik spesifik yang ada dalam bakteri. Pada pH sekitar 6 masih tetap mengindikasikan keberadaan asam tapi pada konsentrasi ion hydrogen yang lebih rendah.coli dan E.Peptone mixture . Indikator berubah warna jadi kuning dan mengindikasikan hasil uji yang negatif.Tes Voges-Proskauer Media yang digunakan Komposisi media : MR-VP broth : .

Reaksi ini terjadi pada keberadaan katalis α-naphthol dan grup guanidine yang ada pada peptone pada medium MRVP.2 gr) OH + 40% KOH Oksidasi C CH3 Diasetil O CH3 C O + C NH2 NH NH-R Guanidin Kompleks berwarna Pink .magnesium sulfate (5 gr) (2 gr) (0.sodium citrate .dipotassium hydrogen phospate (1 gr) .Penggunaan Sitrat Media yang digunakan Komposisi media : Simmons citrate agar slant : . Deteksi acetylmethylcarbinol membutuhkan hasil akhir ini untuk dioksidasi menjadi senyawa diasetil. CH3 OH C O CH CH3 Asetilmetilkarbinol α -naftol Reaksi Asetilmetilkarbinol dengan reagen Barrit h. Keberadaan warna mawar tua pada kultur setelah penambahan reagen Barritt mengindikasikan keberadaan acetylmethylcarbinol dan merupakan hasil positif. dan bila tidak ada berarti hasilnya negatif. sebagai warna mawar pada medium. Reagen yang digunakan dalam uji ini adalah reagen Barrit yang mengandung campuran α-naphthol alkoholik dan larutan 40% potassium hydroxide (KOH).sodium chloride .Dextrose 3 Reagen yang diperlukan Asetilmetilkarbinol α -naftol Lama inkubasi : Barritt’s reagent A dan B Diasetil Guanidin 0 : 24 – 48 jam pada 37 C Uji Voges-Proskauer menentukan Reaksi Asetilmetilkarbinol dengan reagen Barrit kemampuan beberapa organisme untuk memproduksi produk akhir non asam atau netral seperti asetilmetil -karbinol yang berasal dari metabolisme glukosa. Sebagai hasil.ammonium dihydrogen phosphate (1 gr) .CH3 C CH CH3 O OH + OH 40% KOH Oksidasi CH3 C C O O + C NH2 NH NH-R (5 gr) Kompleks berwarna Pink CH . kompleks pink terbentuk.

CO2 + 2Na+ + H2O  Na2CO3  Alkaline pH  perubahan warna dari hijau ke menjadi biru . beberapa mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai sumber karbon untuk produksi energi mereka.. menghasilkan asam oksalaasetat dan asetat. sedangkan negatif bila tanpa pertumbuhan dan medium tetap berwarna hijau. medium menjadi alkalin-karbondioksida yang dihasilkan berkombinasi dengan sodium dan air membentuk sodium carbonate.bacterological agar Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (0. Kehadiran sodium carbonate mengubah indicator bromthymol biru pada medium dari hijau menjadi biru tua Prussia. Produk tersebut kemudian secara enzimatis diubah menjadi asam piruvat dan karbondioksida.08 gr) (15 gr) Pada ketiadaan glukosa atau laktosa yang dapat difermentasi. Kemampuan ini tergantung pada keberadaan enzim sitrat permease yang memfasilitasi transport sitrat dalam sel. 1. Sitrat positif ditunjukkan pertumbuhan pada permukaan slant yang diikuti warna biru. dengan keberadaan enzim sitrase. Sitrat merupakan senyawa intermediet utama dalam sel dan diproduksi dengan kondensasi asetil aktif dengan asam oksalaasetat. Selama reaksi. Sitrat.bromthymol blue . sebuah produk alkalin. COOH CH2 HO C CH2 COOH C itrate COOH COOH Citras C O e + CH2 COOH COOH Oxaloaseti c acid CH3 COOH COOH C O + CO2 CH3 COOH Pyruvic acid Excess carbon dioxide Acetic acid 2.

j. Hal ini menunjukkan reaksi positif terhadap adanya urease. Ketika substrat urea dipisahkan dari produknya.1 gr) (20 gr) (0.adanya ammonia membuat lingkungan alkaline yang menyebabkan phenol red berubah menjadi deep pink. Kegagalan perubahan warna menjadi deep pink membuktikan reaksi negatif.urea .Aktifitas urease Media yang digunakan Komposisi media : Urea broth : .dipotassium phosphate .1 gr) Urease yang diproduksi oleh beberapa mikroorganisme merupakan enzim yang secara khusus membantu mengidentifikasi Proteus vulgaris.1 gr) .monopotassium phosphate (9. Adanya urease dapat dideteksi ketika organisme ditumbuhkan dalam urea broth medium yang mengandung pH indicator phenol red.phenol red . Walaupun organisme lain mungkin menghasilkan urease. peran mereka pada substrat lebih lambat jika dibandingkan dengan spesies Proteus.i. Urease adalah enzim hydrolitik yang menyerang ikatan nitrogen n karbon pada komponen amida misalnya urea dan membentuk alkaline yang produk akhirnya adalah ammonia . tes ini dapat dengan cepat membedakan anggota dari genus ini dari mikroorganisme lain yang tidak memfermentasi laktosa.5 gr) (0.Aktivitas katalase Media yang digunakan :Nutrient Agar .yeast extract Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (9. Oleh karena itu.

hasil akhir dari superoxide dismutase adalah H2O2.Kompisisi Media : . Produksi katalase dapat ditentukan dengan penambahan substrat H2O2 pada tryticase soy agar slant culture yang telah diinkubasi. Bila enzim – enzim di atas tidak ada maka menyebabkan konsentrasi zat toksik dari H2O2 tidak dapat didegradasi ketika organisme tersebut ditumbuhkan disertai adanya oksigen. Ketidakmampuan strict anaerob untuk mensintesis katalase. Hal ini menunjukkan tes . facultative anaerob.Agar (10 gr) (3 gr) (12 gr) Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C Selama respirasi aerobik. atau superoxide dismutase mungkin menjelaskan mengapa oksigen menjadi beracun untuk mikroorganisme. Diperkirakan substansi ini akan dihasilkan dari organisme yang mati jika tidak mereka dapat didegradasi secara enzimatik. selama proses degradasi karbohidrat untuk produksi energi.Meat extract . peroxidase. Substansi ini diproduksi ketika bakteri aerob. Jika ada katalase. seperti yang telah disebutkan pada reaksi kimia diindikasikan oleh gelembung dari gas oksigen yang ‘terbebas’. Organisme yang mampu memproduksi katalase secara cepat mendegradasi hydrogen peroksida berdasarkan reaksi berikut : 2H2O2 2H2O Air Hidrogen Peroksida Oksigen bebas + O2 (g) Organisme aerobic yang kekurangan katalase dapat mendegradasi toxic superoxide secara khusus menggunakan enzim superoxide dismutase. secara ekstrem menghasilkan toxic superoxide. mikroorganisme memproduksi hydrogen peroksida dan dalam beberapa kasus.Peptone from casein .di mana oksigen merupakan akseptor electron terakhir. dan mikroaerophile menggunakan jalur respirasi aerobic. tetapi H2O2 kurang berbahaya bagi sel bakteri jika dibandingkan dengan superoksida.

Selain itu. ada golongan nonenterococci seperti S.5% NaCl Broth : brain – heart infusion broth NaCl 6. l.Uji 6. ada golongan nonenterococci seperti S. Group ini meliputi enterococcus seperti Enterococcus faecalis. Group D streptococcus menunjukkan α atau γ -hemolysis pada blood agar plates.5% : 24 – 48 jam pada 370C Media ini digunakan untuk mengidentifikasi group D streptococcus. Bovis. Bile esculin test : Dengan adanya bile. Selain itu.katalase positif. sedangkan tidak terbentuknya gelembung adalah tes katalase negative. Bovis. Group ini meliputi enterococcus seperti Enterococcus faecalis.5% sodium chloride broth Media yang digunakan Komposisi media Lama inkubasi : 6. Bila tidak terdapat warna hitam tidak mengidentifikasi organisme Group D streptococci. Group D streptococci menghidrolisis glycoside esculin menjadi 6.Uji Bile Esculin Media yang digunakan Lama inkubasi : Bile esculin agar : 24 – 48 jam pada 370C Media ini digunakan untuk mengidentifikasi group D streptococcus. m. Group D streptococcus menunjukkan α atau γ -hemolysis pada blood agar plates. Enterococcus memiliki kemampuan antibiotik resisten dan yang lebih jarang sebagai vancomycin. Hal ini menyebabkan timbulnya warna cokelat – hitam pada medium setelah diinkubasi. yang digunakan dalam pengobatan manusia menggunakan laser. yang mungkin menjadi penyebab infeksi pada urine.7-dihydroxy-coumarin yang bereaksi dengan iron salt yang terkandung dalam medium. yang digunakan dalam pengobatan manusia . yang mungkin menjadi penyebab infeksi pada urine.

Darah steril Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (15 gr) (2.liver digest . γ -hemolytic streptococci bersifat avirulent.proteose peptone .5% sodium chloride broth : Group D enterococci dapat diidentifikasi dengan kemampuannya tumbuh pada medium ini jika dibandingkan dengan non enterococci.(β ) Beta-hemolysis merupakan penghancuran sel darah merah dengan sempurna.5 gr) (5 gr) (5 gr) (12 gr) (5%) Aktivitas hemolytic ini adalah salah satu cara untuk mengidentifikasi adanya streptococci.Aktivitas hemolytic Media yang digunakan Komposisi media : blood agar base : . Streptococcus viridans merupakan bakteri yang tidak patogen. Streptococcus mampu memproduksi β -hemolysins dan bersimbiosis dengan bakteri patogen. memiliki kemampuan untuk menyebabkan infeksi pada manusia seperti subacute endocarditis dan gagal jantung.(α ) Alpha-hemolysis merupakan bentuk hemolisis yang tidak sempurna.yeast extract .NaCl . .(γ ) Gamma-hemolysis diindikasikan dengan tidak adanya hemolysis di sekitar koloni.4 kali diameter koloni. 6. Ditandai dengan terbentuknya zona bening sekitar 2 . Sebagian besar. α -hemolytic streptococci. n.Agar . ada 3 tipe reaksi hemolytic pada blood agar yaitu: . Sedangkan yang lain. . Enterococcus memiliki kemampuan antibiotik resisten dan yang lebih jarang sebagai vancomycin. Dari hasil penelitian. Ditandai dengan adanya zona berwarna hijau di sekitar koloni. .menggunakan laser.

inoculating loop.Agar Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C (10 gr) (3 gr) (12 gr) Pada uji pigmen ini. lens paper dan mikroskop .o. Uji Pigmen Media yang digunakan Kompisisi Media : Nutrient Agar : . Sedangan bila ditemukan warna yang lain berarti menandakan bahwa uji pigment positif. ada juga yang membutuhkan pewarnaan spora untuk mengidentifikasi lebih lajut. Pewarnaan spora Peralatan yang diperlukan : Bunsen.Peptone from casein .apabila pada medium nutrient agar tidak terlihat warna selain warna koloni. hotplate. menyebabkan dinding sel pneumococcus mengalami lisis. biakan yang larut dalam bile akan tampak jernih sedangkan yang tidak larut dalam bile akan tampak keruh. Berikut adalah penjelasan tentang pewarnaan spora. p. maka hal itu menandakan bahwa uji pigmen negatif. glass slides.Meat extract . Selain α -hemolytic streptococci tidak akan mengalami lisis oleh agen tadi dan tidak larut dalam bile. bibulous paper. Setelah diinkubasi. Uji Bile Solubility Media yang digunakan Reagen yang digunakan Lama inkubasi : Bile solubility : Na-deoksikolat : 24 – 48 jam pada 370C Adanya surface-active agents seperti bile dan bile salts (sodium desoxycholate atau sodium dodecyl sulfate). Selain dilakukan pewarnaan gram dan uji – uji biokimia. staining tray.

terminal F: circular. subterminal D: rectangular.masing . Struktur ini tidak dapat diwarnai dengan metode pewarnan sederhana maupun gram. terminal C: rectangular.Reagen yang dibutuhkan Endospora : Malachite green dan safranin Lama inkubasi untuk biakan : 48 . dorman. central E: circular.72 jam pada media agar slant merupakan struktur yang bersifat resisten. central G: inflated spore Pedoman yang digunakan oleh praktikan dalam mengidentifikasi spesies suatu sampel adalah pohon filogenik. dan berfungsi untuk melindungi lingkungan bakteri yang dari tidak menguntungkan. Metode yang umum digunakan adalah Scaeffer-Fulton endospore stain. Metode ini menggunakan malakit hijau sebagai pewarna primer (primer stain) dan safranin sebagai caounterstain.Gambar tentang berbagai bentuk spora sebagai berikut : A: oval. Hal ini disebabkan masing. terminal B: rectangular.

Berikut skema pohon filogenik : .spesies memiliki jalur yang berbeda dalam proses pengidentifikasiannya.

maka dilakukan uji biokimia yaitu uji katalase.Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya cocci Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Micrococcus spp.Penjelasan tentang pohon filogenik sebagai berikut : Setelah praktikan dapat mengidentifikasi bakteri berdasarkan pewarnaan gram dan morfologi bakteri.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Staphylococcus spp dan Streptococcus spp. 1b. dan Lactobacillus spp. 1c.Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya cocci . maka dapat disimpulkan sebagai berikut : 1a. maka dilakukan pewarnaan spora.Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya Bacilli Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Corynebacterium spp. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.

Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Uji Bile Esculin 3c. maka dilakukan uji bile esculin... dan Staphylococcus spp. dan Pseudomonas spp. maka dilakukan uji mannitol. S. Proteus spp. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Streptococcus spp.Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya Bacilli Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Citrobacter spp. Bila uji katalase menunjukkan positif.bovis.luteus. maka dilakukan Uji Pigment. 2b. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.. maka dilakukan uji pada 6. Bila uji Mannitol menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Staphylococcus aureus. Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya cocci Uji Katalase 2a. Escherichia spp. dan Neisseria spp. Uji Mannittol 3a.Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Branhamella spp. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Micrococcus spp. Bila uji Bile Esculin menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. 1d.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. 3b. maka dilakukan uji biokimia yaitu uji laktosa.varians. M. . Faecalis dan S. Bila uji Mannitol menunjukkan negatif. M.5% NaCl Broth.. Bila uji katalase menunjukkan negatif.epidermis. Saprophyticus.. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. Moraxella spp. Enterobacter spp. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Klebsiella spp. maka dilakukan uji biokimia yaitu uji glukosa. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.

Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M. 4f. Uji Fermentasi Fruktosa . 5b.pyogenes. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M. maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa. Bila uji Pigment menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M.pyogenes. Bila uji Hemolysis menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. varians. maka dilakukan Uji Bile Solubility. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah alpha hemolysis yaitu S.3d. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. varians. Uji Hemolysis 4e. maka dilakukan Uji Fermentasi Fruktosa.epidermis.5% NaCl Broth menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. Uji pada 6. Bila uji Bile Esculin menunjukkan negatif.mitis dan S. Bila uji pada 6.5% NaCl Broth 4c.pneumoniae. Saprophyticus dan S. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. 4d.mitis. Bila uji Hemolysis menunjukkan negatif. Bila uji Pigment menunjukkan negatif.bovis. 4b. Faecalis.luteus dan M. maka dilakukan Uji Hemolysis. S. luteus. Uji Fermentasi Glukosa 5a. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Uji Pigment 4a. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.pneumoniae dan S.5% NaCl Broth menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. Bila uji pada 6.

Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. maka dilakukan uji katalase. Bila tidak ditemukan adanya spora. . 2b. 3b. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Uji mannitol 3a. Bila uji katalase menunjukkan positif. Bila uji mannitol menunjukkan negatif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B. Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya Bacilli 2a Bila terdapat spora dalam sampel. mitis. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Bacillus spp.subtilis. maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.5c. saprophyticus.Bila uji Bile Solubility menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Uji Bile Solubility 5e.. maka dilakukan uji mannitol.pneumoniae. 5d. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Corynebacterium spp. epidermis. Bila uji mannitol menunjukkan positif. Megaterium dan B. 5b. Uji katalase 3c. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B. dan Lactobacillus spp. Bila uji Bile Solubility menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah S. cercus. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Corynebacterium spp. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka dilakukan Uji Voges-Proskauer.

Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif (hanya terbentuk asam). Bila uji mannitol menunjukkan positif. casei 5b. delbrueckii Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. delbrueckii. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C.subtilis. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. . Kutscheri. 5a. Uji Fermentasi Glukosa 4e. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B. 4f. Uji Voges-Proskauer dalam sampel adalah B. casei dan L. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L.3d. Megaterium. maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif (terbentuk asam dan gas). Bila uji katalase menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya cocci Uji Fermentasi Glukosa 4a. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. Bila uji katalase menunjukkan negatif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Lactobaciillus spp. Uji Reduksi Nitrat 4c. 4b. Bila uji mannitol menunjukkan positif. xerosis. Bila uji Fermentasi Mannitol menunjukkan negatif.fermentum. Bila uji Fermentasi Mannitol menunjukkan positif. Uji Fermentasi Mannitol. maka kemungkinan bakteri yang ada . 4d. maka dilakukan Uji Fermentasi Mannitol. Bila uji katalase menunjukkan positif.

Escherichia spp. Bila uji Fermentasi Laktosa menunjukkan negatif.catarrhalis 3d. 3b. Bila uji produksi indol menunjukkan positif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Citrobacter spp. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Neisseria spp . maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Branhamella spp dan Moraxella spp. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan positif.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.2a... maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Proteus spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah M. bovis Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya Bacilli Uji Fermenatasi Laktosa 2a. coli.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif. Bila uji Fermentasi Laktosa menunjukkan positif. mucosa . maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. dan Pseudomonas spp. Uji Reduksi Nitrat 3a. 2b. 3c. dan Klebsiella spp. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah B. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah N. maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa Uji Produksi Indole 3a. Intermedius dan E. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif. Enterobacter spp. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan negatif. maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat. 2b.Untuk mengetahui . Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan positif. maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat . Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan negatif.sicca . maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah N.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka dilakukan Uji Produksi Indole .

maka dilakukan Uji aktivitas urease. maka dilakukan Uji Reduksi Nitrate. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E.Bila uji produksi indol menunjukkan negatif. Bila uji Metyl Red menunjukkan negatif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C.. Uji Penggunaan Citrate 4a.ozaenae. maka dilakukan Uji Produksi Indole. dan Klebsiella spp. Pneumoniae. (I) 4d. maka dilakukan Uji Penggunaan Citrate .Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. freundii. Bila uji Metyl Red menunjukkan positif. coli. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Pseudomonas spp. 3d. maka dilakukan Uji Metyl Red . Bila uji Penggunaan Citrate menunjukkan negatif. Enterobacter spp. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Uji Metyl Red 4c. Uji Fermentasi Glukosa 3c. ( I ) Uji Produksi Indole . Aerogenes dan K.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif. Escherichia spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. Intermedius 4b. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah Proteus spp. Bila uji Penggunaan Citrate menunjukkan positif.lebih detail tentang spesies sampel kita. 3b.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. maka dilakukan Uji Produksi H2S. freundii dan K.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.

maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. Bila uji Produksi H2S menunjukkan negatif. Bila uji Produksi Indole menunjukkan positif. Bila uji Produksi Indole menunjukkan negatif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah K. Bila uji aktivitas urease menunjukkan positif. Pneumoniae.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. vulgaris.rettgeri. mirabilis dan P.rettgeri. Uji Produksi H2S( I ) 5a. . maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah K. maka dilakukan Uji Litmus Milk. Uji Produksi H2S( II ) 5e. freundii 5b.aeruginosa dan P. Bila uji Produksi Indole menunjukkan negatif. ( II ) Uji Reduksi Nitrate 4g. 5d.4e.ozaenae. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah E. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. vulgaris dan P. Aerogenes.mallei.Bila uji Reduksi Nitrate menunjukkan negatif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah C. inconstans. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. ( II ) 4f. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. maka dilakukan Uji aktivitas urease .fluorescens. Bila uji aktivitas urease menunjukkan negatif. Uji aktivitas urease( I ) 5c.. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. 5f.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. Bila uji Produksi Indole menunjukkan positif. maka dilakukan Uji Produksi H2S. 4h. Bila uji Produksi H2S menunjukkan positif.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita.Bila uji Reduksi Nitrate menunjukkan positif.

aeruginosa yang mengalami peptonization 5j. Alat dan Bahan : 1.Hotplate stirrer .Jarum ose . Uji Litmus Milk 5i. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P. 5h.Objek glass . Bila uji aktivitas urease menunjukkan negatif. maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah P.Beker glass .Lampu spiritus .fluorescens yang mengalami reaksi alkaline.Erlemeyer . Bila uji aktivitas urease menunjukkan positif.Cawan petri . III.Uji aktivitas urease( II ) 5g. mirabilis.Tabung .Bila uji Litmus Milk menunjukkan positif.Pipet . inconstans.Alat : .Bila uji Litmus Milk menunjukkan positif.

e.Pewarnaan Gram: a.Barrit A dan Barrit B .H2O2 3% .Phenol Red Sucrose Broth .Nitrate Broth IV. Membilas .Nutrien Gelatin Broth . membiarkan selama 3 menit.MRVP Broth . b.Crystal violet (Gram I) .Menetesi preparat dengan larutan lugol (Gram II) beberapa tetes.Medium SIM Agar . 3) .Starch Agar .2.Phenol Red Dextrose Broth .Safranin (Gram IV) .Gram’s iodine (Gram II) .Phenol Red Lactose Broth . Mencuci dengan larutan Gram III (alkohol 96%) dengan cara memiringkan preparat kemudian menetesi perlahan. Membiarkan selama 1 menit. c.Etanol 95% (Gram III) .Urea Broth . 2.Menetesi preparat olesan bakteri yang telah difiksasi dengan beberapa dengan air.Medium TSA . Membilas dengan air.lahan dengan Gram III hingga tidak ada pewarna yang terlunturkan.Sampel bakteri (Sampel 1.Simmon’s Citrate Agar . Membilas preparat secara hati-hati dnegan air tetes larutan karbolgentian violet (Gram I).Reagen kovac’s . d.Bahan : . Cara Kerja : 1.Medium Litmus Milk .

Pembuatan Media untuk Uji Biokimia a.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis. h. Mendiamkan selama 3 menit. menanam pada media tersebut.Litmus Milk (100 gr/L) Cara pembuatan media : -Menimbang litmus milk kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Litmus Milk Broth 2.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C. Membilas preparat dengan air. Kemudian mengeringkan di udara atau dengan cara menyerap kelebihan air dengan tissue. 2. Langkah inokulasi ke media : 1.Phenol Red Lactose Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red lactose broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest . Menetesi preparat dengan larutan fuchsin (Gram IV) beberapa tetes. g. -Memiringkan tabung agar terbentuk media slant 3. b. Pembuatan Media untuk Stock Culture(Peremajaan) TSA slant (40 gr/L) -Menimbang TSA kemudian melarutkannya ke dalam aquades -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave. 3. Mengamati preparat di mikroskop dan mencatat hasilnya.f.

2.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi media dengan berbagai macam karbohidrat : phenol red lactose broth. dan phenol red dextrose broth.SIM Agar Deep Tube (30 gr/L) -Menimbang SIM medium kemudian melarutkannya ke dalam aquadest .Phenol Red Mannitol Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red mannitol broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave Langkah inokulasi ke media fermentasi : 1.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis.-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave.Phenol Red Fructose Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red fructose broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave. 3. e.Phenol Red Glucose Broth (20 gr/L) -Menimbang phenol red glucose broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave e.48 jam pada suhu 370C. c. menanam pada media – media pada bagian 1. d. phenol red sucrose broth.Menginkubasi selama 24 .

Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis.5 gr/L) -Menimbang SCA kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Simmons citrate agar slants 2.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C g.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi SIM agar deep tubes 2.Simmon Citrate Agar Slant (22.Untuk tes produksi Indol ditambahkan reagen Kovac 3-5 tetes pada medium yang telah diinkubasi. .5 gr/L) -Menimbang urea broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Mensterilkan campuran dengan memfiltrasinya -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung Langkah inokulasi pada media : 1.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis.Urea Broth (38. Langkah inokulasi pada media : 1. 3.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Urea Broth 2. -Memiringkan tabung agar terbentuk media slant Langkah inokulasi pada media : 1. 3. 4.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis.-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer -Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian diautoclave. menanam pada media SIM dengan menusukkan ke dalam agar. f. menanam pada media tersebut dengan cara menggores zig-zag pada bagian yang miring. menanam pada media tersebut.

Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Nutrient Agar slant 2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis.Menginkubasi selama 24-48 jam pada suhu 370C i. Langkah inokulasi pada medium : 1.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C h.Menyiapkan plate berisi TSA 2. menanam pada media tersebut dengan men-strict medium 3. Langkah inokulasi pada medium : 1. menanam pada media tersebut dengan cara menggores zig-zag pada bagian yang miring.Nutrient Agar -Menimbang Nutrient Agar kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer kemudian diautoclave -Memasukkan campuran ke dalam cawan petri steril dan membiarkannya memadat.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C 4.Untuk membuktikan adanya aktivitas katalase ditambahkan reagen H2O2 3% pada medium yang tlah diinkubasi. 3.Tryptycase Soy Agar (TSA) Plate (40 gr/L) -Menimbang medium TSA kemudian melarutkannya ke dalam aquadest -Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer kemudian diautoclave -Memasukkan campuran ke dalam cawan petri steril dan membiarkannya memadat. .3.

Pewarnaan gram 1a.coli .V. Hasil Percobaan : 1.Pewarnaan gram E.

1b.Pewarnaan gram Staphylococcus epidermis 1c.Pewarnaan gram Proteus mirabilis .

Uji Biokimia 2.2.Uji Biokimia 2a.coli -Uji Laktosa -Uji Indol -Uji Citrat .Uji Biokimia E.

b.Uji Biokimia Staphylococcus epidermis -Uji Katalase -Uji Mannitol -Uji Pigment .

Uji Biokimia Proteus mirabilis -Uji Laktosa .-Uji Fruktosa c.

-Uji Glukosa -Uji Indole -Uji Urea .

Tabel Hasil Percobaan 3a. Tabel Hasil Percobaan Staphylococcus epidermis Macam Uji Pewarnaan Gram Morfologi Aktivitas katalase Fermentasi mannnitol Pigment Fermentasi Fruktosa Hasil Uji positif coccus + + 3c.coli Macam Uji Pewarnaan Gram Morfologi Fermentasi Laktosa Produksi Indol (SIM medium) Penggunaan sitrat Hasil Uji negative coccobacill + + - 3b.3. Tabel Hasil Percobaan E. Tabel Hasil Percobaan Proteus mirabilis Macam Uji Pewarnaan Gram Morfologi Fermentasi laktosa Fermentasi glukosa Produksi Indol (SIM medium) Hasil Uji negative bacill + - .

Aktivitas Urease + VI. Bakteri tersebut berwarna merah setelah diwarnai dengan pewarnaan gram.Sampel A 1a. Hal ini disebabkan oleh.Pewarnaan Gram & Morfologi Hasil uji morfologi pada sampel A menunjukkan bahwa bakteri pada sampel A termasuk ke dalam golongan bakteri gram negatif dengan bentuk coccobacill. lapisan lipopolisakarida pada bakteri .Pembahasan 1.

dari hasil pewarnaan gram dan morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel A merupakan bakteri gram negatif dan bentuknya coccobacill sehingga untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi laktosa. Hasil uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. Oleh karena itu.Uji Fermentasi Laktosa Uji Fermentasi Laktosa ini dilakukan pada medium phenol red lactosa broth.Uji Produksi Indol Uji Produksi Indol ini dilakukan pada medium SIM dengan bantuan penambahan reagen Kovac akan terlihat cincin pink pada medium.Pada uji ini. bakteri sampel A tidak dapat memfermentasi laktosa. 1b.ini lebih sedikit sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya akan luntur bersama dengan lapisan lipopolisakaridanya ketika dicucci dengan gram III (alkohol) sehingga yang tersisa hanya warna merah dari safranin yang merupakan pewarna tandingan. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji Produksi Indol. 1c. Oleh karena itu. bakteri sampel A menunjukkan hasil positif yaitu terbetuk cincin pink setelah penambahan reagen Kovac. Hal ini berarti bakteri sampel A memiliki enzim triptofanase untuk memecah triptofan sesuai dengan reaksi berikut : . Pada uji ini.

dapat disimpulkan berdasrkan pohon filogenik bahwa bakteri sampel A adalah E. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji penggunaan citrat..coli. Oleh karena itu. . bakteri sampel A menunjukkan hasil negatif yang ditandai dengan tidak berubahnya warna medium dari hijau menjadi biru.Pewarnaan Gram & Morfologi Hasil uji morfologi pada sampel B menunjukkan bahwa bakteri pada sampel B termasuk ke dalam golongan bakteri gram positif dengan bentuk coccus. Hal ini berarti bakteri sampel A tidak memiliki enzim citrase untuk mengubah sitrat menjadi oksaloasetat dan asam asetat yang selanjutnya akan dirubah menjadi asam piruvat dan CO2 .Sampel B 2a. 2. Pada uji ini.Uji Penggunaan Citrat Uji penggunaan sitrat menggunakan medium Simmon’s Citrate Agar yang mengandung sitrat sebagai satu – satunya sumber karbon. 1d. Oleh karena itu.

Bakteri tersebut berwarna biru-ungu setelah diwarnai dengan pewarnaan gram. Hal ini berarti bakteri sampel B dapat memecah hidrogen peroksida menjadi air dan karbondioksida sesuai reaksi berikut Oleh karena itu.Pada uji ini. Hasil uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. dari hasil pewarnaan gram dan morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel B merupakan bakteri gram positif dan bentuknya coccus sehingga untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji aktivitas katalase.Uji Fermentasi Mannitol Uji Fermentasi Mannitol ini dilakukan pada medium phenol red mannitol broth.Uji Pigment .Uji Aktivitas Katalase Uji aktifitas katalase dilakukan dengan menggunakan medium TSA dan selanjutnya dilakukan penambahan reagen berupa H2O2 3%. 2d. Oleh karena itu. bakteri sampel B tidak dapat memfermentasi mannitol. 2c. lapisan lipopolisakarida pada bakteri ini cukup tebal sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya tidak bisa luntur ketika dicuci dengan gram III (alkohol) sehingga yang tersisa adalah warna biru-ungu oleh reagen kristal-violet. Bakteri sampel B menunjukkan hasil positif pada uji ini yang artinya bakteri sampel B memiliki enzim katalase. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi mannitol. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji pigment. 2b. Hal ini disebabkan oleh. Hasil positif tersebut ditunjukkan dengan adanya gelembung – gelembung gas pada permukaan koloni ketika ditetesi dengan H2O2 3%. Oleh karena itu.

Uji Pigment ini dilakukan pada medium nutrient agar. lapisan lipopolisakarida pada bakteri ini lebih sedikit sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya akan luntur bersama dengan lapisan lipopolisakaridanya ketika dicucci dengan gram III (alkohol) sehingga yang tersisa hanya warna merah dari safranin yang merupakan pewarna tandingan. bakteri sampel B tidak menampakkan warna yang lain selain warna koloni yaitu putih mengkilap. bakteri sampel B dapat memfermentasi fruktosa sehingga hasilnya positif.Oleh karena itu. Pada uji ini.Oleh karena itu. Bakteri tersebut berwarna merah setelah diwarnai dengan pewarnaan gram.Uji Fermentasi Laktosa . Hasil uji positif pada fermentasi laktosa ditandai dengan berubahnya warna medium menjadi kuning yang disebabkan oleh adanya produk akhir fermentasi yang bersifat asam. 3. 3b.Uji Fermentasi Fruktosa Uji Fermentasi Fruktosa ini dilakukan pada medium phenol red fructosa broth. Hal ini disebabkan oleh. Hal itu berarti hasil uji pigment adalah negatif. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi fruktosa 2e.Sampel C 3a.Pewarnaan Gram & Morfologi Hasil uji morfologi pada sampel C menunjukkan bahwa bakteri pada sampel C termasuk ke dalam golongan bakteri gram negatif dengan bentuk bacill.Pada uji ini. dan juga adanya gas. dari hasil pewarnaan gram dan morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel C merupakan bakteri gram negatif dan bentuknya bacill sehingga untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi laktosa. dapat disimpulkan berdasarkan pohon filogenik bahwa bakteri sampel B adalah Staphylococcus epidermis. Oleh karena itu.

Uji aktivitas urease. Hasil uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. bakteri sampel C tidak dapat memfermentasi laktosa. bila hasilnya positif. pada bakteri sampel C tidak menunjukkan terbentuknya cicncin pink setelah penambahan reagen Kovac sehingga hasilnya negatif. Pada uji ini. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji aktivitas urease. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi glukosa. Oleh karena itu. Hasil uji positif pada fermentasi laktosa ditandai dengan berubahnya warna medium menjadi kuning yang disebabkan oleh adanya produk akhir fermentasi yang bersifat asam. Oleh karena itu.Uji Produksi Indol Uji Produksi Indol ini dilakukan pada medium SIM dengan bantuan penambahan reagen Kovac akan terlihat cincin pink pada medium. bakteri sampel C berubah warna menjad deep pink yang menandakan bahwa uji aktivitas urease positif.Hal ini menandakan bahwa Ketika substrat urea dipisahkan dari . ini dilakukan pada medium urea broth yang mengandung pH indicator phenol red. dan juga adanya gas. 3c.Uji Fermentasi Glukosa Uji Fermentasi Glukosa ini dilakukan pada medium phenol red glukosa broth. Oleh karena itu. 3e.Hal ini berarti bakteri sampel A tidak memiliki enzim triptofanase untuk memecah triptofan. Akan tetapi.Uji aktivitas urease. bakteri sampel C dapat memfermentasi glukkosa sehingga hasilnya positif.Uji Fermentasi Laktosa ini dilakukan pada medium phenol red lactosa broth. 3d. untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji Produksi Indol. Pada uji ini. Pada uji ini.

sampel kami berurutan dari adalah Escherichia coli. Benjamin Cummings. 2005.edu:82/hurlbert/micro101/pages/101lab9.edu/~cbwilso/250cho. Funke.html .slic2. James G. Hal in disebabkan karena masing – masing spesies memiliki jalur yang berbeda baik dalam pewarnaan gram/morfologi atau metabolismenya. Selain itu. Natalie Sherman. Cappuccino.produknya. Kegagalan perubahan warna menjadi deep pink membuktikan reaksi negatif.Case.siue. Kesimpulan : Dalam melakukan identifikasi spesies dilakukan uji morfologi dan uji biokimia. Daftar Pustaka Tortora. Oleh karena itu. Gerard J. seventh edition. Berdell R. VII. “Microbiology – A Laboratory Manual”.htm http://www. VIII. http://www. Staphylococcus epidermis dan Proteus mirabilis. yang menjadi pedoman utama dalam pengidentifkasian spesies adalah penggunaan pohon filogenik. San Francisco. Benjamin Cummings. dapat disimpulkan berdasarkan pohon filogenik bahwa bakteri sampel C adalah Proteus mirabilis.wsu. Christine L. San Francisco. Microbiology-An Introduction. Hal ini menunjukkan reaksi positif terhadap adanya urease. 2001.adanya ammonia membuat lingkungan alkaline yang menyebabkan phenol red berubah menjadi deep pink. Reaksinya sebagai berikut : Oleh karena itu.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful