PENGARUH BAHAN PENGENCER TERHADAP PERSENTASE MOTILITAS SPERMATOZOA SEMEN CAIR SAPI DAN DOMBA, PENGARUH POSISI STRAW

SEMEN CAIR DOMBA SERTA PENGARUH SUHU THAWING TERHADAP MOTILITAS SPERMATOZOA

Disusun oleh: Bakhtiar Hidayat H, S.KH B94104206

PROGRAM PENDIDIKAN PROFESI DOKTER HEWAN BAGIAN REPRODUKSI DAN KEBIDANAN FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2011 PENDAHULUAN

Latar Belakang Inseminasi Buatan (IB) adalah salah satu bentuk bioteknologi dalam bidang reproduksi yang memungkinkan manusia mengawinkan hewan betina tanpa perlu seekor pejantan utuh. Inseminasi buatan sebagai teknologi merupakan suatu rangkaian proses yang terencana dan terprogram karena akan menyangkut kualitas genetik hewan di masa yang akan datang (Kartasudjana 2001). Inseminasi buatan (IB) merupakan salah satu upaya pemanfaatan bibit pejantan unggul secara maksimal dalam rangka perbaikan mutu genetik ternak. Prinsip dari pelaksanaan inseminasi buatan yaitu pencurahan semen ke dalam saluran reproduksi hewan betina pada saat estrus dengan maksud agar sel telur yang diovulasikan hewan betina dapat dibuahi oleh sperma sehingga hewan betina menjadi bunting dan melahirkan anak. Menurut Sugoro (2009), pada perkembangan lebih lanjut, program IB tidak hanya mencakup pemasukan penampungan, penilaian, pengenceran, semen ke dalam saluran atau pengawetan reproduksi betina, tetapi juga menyangkut seleksi dan pemeliharaan pejantan, penyimpanan (pendinginan dan pembekuan) dan pengangkutan semen, inseminasi, pencatatan dan penentuan hasil inseminasi pada hewan betina. Dengan demikian pengertian IB menjadi lebih luas yang mencakup aspek reproduksi dan pemuliaan, sehingga istilahnya menjadi artificial breeding (perkawinan buatan). Faktor utama yang mempengaruhi keberhasilan IB ialah mutu semen beku. Faktor lain yang ikut mempengaruhi yaitu reproduksi ternak betina dan keterampilan petugasnya. Ketepatan dan pelaporan deteksi berahi serta pemeliharaan ternak betina. Oleh sebab itu untuk terjaminnya mutu semen beku sapi yang beredar, perlu ditetapkan standar semen beku sapi. Mutu semen beku sapi yang memenuhi standar harus didukung oleh penanganan yang baik dan benar agar mutu semen beku sapi dapat dipertahankan hingga siap untuk diinseminasikan. Kegiatan inseminasi buatan (IB) pada ternak dapat dikatakan berhasil dengan tidak hanya bergantung pada kualitas dan kuantitas semen yang diejakulasikan oleh pejantan tetapi juga bergantung pada kesanggupan untuk memperbanyak volume semen dan mempertahankan kualitasnya untuk jangka waktu tertentu setelah ejakulasi sehingga lebih banyak betina akseptor yang dapat diinseminasi.

Usaha untuk memperbanyak hasil sebuah ejakulasi dari pejantan unggul dan mempertahankan kualitas semen tersebut adalah dengan melakukan pengenceran menggunakan beberapa bahan pengencer. Bahan- bahan pengencer ini harus mengandung sumber nutrisi, buffer, bahan anti cold shock, antibiotik, maupun krioprotektan yang dapat melindungi spermatozoa selama proses pembekuan dan thawing (semen beku). Sumber nutrisi yang paling banyak digunakan adalah karbohidrat terutama fruktosa yang paling mudah dimetabolisasi oleh spermatozoa (Toelihere 1993). Buffer berfungsi sebagai pengatur tekanan osmotik dan juga menetralisir asam laktat yang dihasilkan dari sisa metabolisme spermatozoa. Buffer yang paling umum digunakan adalah tris (hydroxymethyl) aminomethan yang mempunyai kemampuan sebagai penyangga yang baik dengan toksisitas yang rendah dalam konsentrasi yang tinggi. Bahan anti cold shock yang ditambahkan adalah kuning telur atau kacang kedelai (Aboagla & Terada 2004) yang dapat melindungi spermatozoa pada saat perubahan suhu. Setiap bahan pengencer yang baik harus dapat memperlihatkan kemampuannya dalam memperkecil tingkat penurunan nilai motilitas (gerak progresif sperma) sehingga pada akhirnya memperpanjang lama waktu penyimpanan pasca pengenceran. Tujuan Tujuan dari praktikum ini antara lain:
1.

Melatih keterampilan mahasiswa program Pendidikan Profesi Dokter Hewan (PPDH) dalam melakukan prosedur koleksi semen sapi dan domba yang baik dan benar.

2. 3. 4. 5. 6.

Melatih keterampilan mahasiswa PPDH dalam pembuatan berbagai larutan pengencer semen cair dan semen beku. Mengetahui cara mengevaluasi kualitas semen segar sapi dan domba. Memperoleh data kualitas semen sapi dan domba yang sudah dilakukan pengenceran, serta mengetahui kualitas larutan pengencer. Mengetahui metode penyimpanan yang baik untuk semen cair sapi yang disimpan di dalam poll dan straw. Mempelajari cara penyimpanan straw yang paling baik bagi semen cair serta pengaruh suhu dan lamanya thawing pada semen beku sapi..

7. 8.

Mengetahui pengaruh berbagai teknik dan suhu thawing terhadap kualitas semen beku sapi Mengetahui bahan pengencer yang tepat dan dapat mempertahankan daya hidup spermatozoa dalam jangka waktu yang lama.

BAHAN DAN METODE

A. Pembuatan Bahan Pengencer Semen Cair Sitrat Kuning Telur

Alat dan Bahan: Cawan petri Kertas saring Erlenmeyer Natrium sitrat

 Gelas ukur Timbangan 1. Gelas piala Persiapan Kuning Telur

Telur ayam Kapas dan Aquades

Alkohol 70%

Telur dibersihkan dengan menggunakan alkohol 70% dengan cara memutar dari bagian lancip ke bawah kemudian dibiarkan mengering. Kulit telur dipecahkan pada bagian ujung lancipnya menggunakan pinset. Putih telur dikeluarkan pada cawan petri agar terpisah dengan kuning telur. Kuning telur yang masih terbungkus membran vitelin digulirkan di atas kertas saring agar sisa putih telur dapat terserap seluruhnya.

Membran vitelin dipecahkan dengan cover glass kemudian kuning telur dimasukkan ke dalam gelas ukur.

Gambar 1 Persiapan kuning telur 2. Pembuatan Bahan Pengencer Sitrat Kuning Telur

Natrium sitrat ditimbang sebanyak 1,45 gram kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan dilarutkan dengan aquades 50 ml. Larutan sitrat dicampur kuning telur dengan perbandingan 4 bagian larutan sitrat dan 1 bagian kuning telur di dalam gelas ukur. Larutan diaduk sampai homogen.

A. Pembuatan Bahan Pengencer Semen Cair Sitrat Fruktosa Kuning

Telur Sapi Alat dan Bahan: Cawan petri Kertas saring Gelas ukur Timbangan 1. Gelas piala Persiapan Kuning Telur Erlenmeyer Natrium sitrat

Telur ayam Kapas dan Aquades

Alkohol 70%

Telur dibersihkan dengan menggunakan alkohol 70% dengan cara memutar dari bagian lancip ke bawah kemudian dibiarkan mengering. Kulit telur dipecahkan pada bagian ujung lancipnya menggunakan pinset. Putih telur dikeluarkan pada cawan petri agar terpisah dengan kuning telur. Kuning telur yang masih terbungkus membran vitelin digulirkan di atas kertas saring agar sisa putih telur dapat terserap seluruhnya.

Membran vitelin dipecahkan dengan cover glass kemudian kuning telur dimasukkan ke dalam gelas ukur.
1. Pembuatan Bahan Pengencer Sitrat Fruktosa Kuning Telur

Prosedur Kerja :

Natrium sitrat ditimbang sebanyak 1,16 gram dan 0,625 gram fruktosa dicampurkan di dalam gelas erlenmeyer dan kemudian dilarutkan dengan akuades 50 ml.

Larutan sitrat dicampur kuning telur dengan perbandingan 4 bagian larutan sitrat dan 1 bagian kuning telur di dalam erlenmeyer. Larutan diaduk sampai homogen.

A. Pembuatan Pengencer Semen Cair Tris Kuning Telur

Alat dan Bahan:

 Cawan petri Kertas saring Gelas ukur Timbangan Gelas piala Erlenmeyer 1. Persiapan Kuning Telur

Tris aminomethan Telur ayam Asam sitrat Fruktosa Kapas dan Aquades Alkohol 70%

Telur dibersihkan dengan menggunakan alkohol 70% dengan cara memutar dari bagian lancip ke bawah kemudian dibiarkan mengering. Kulit telur dipecahkan pada bagian ujung lancipnya menggunakan pinset. Putih telur dikeluarkan pada cawan petri agar terpisah dengan kuning telur. Kuning telur yang masih terbungkus membran vitelin digulirkan di atas kertas saring agar sisa putih telur dapat terserap seluruhnya.

Membran vitelin dipecahkan dengan cover glass kemudian kuning telur dimasukkan ke dalam gelas ukur.

1.

Pembuatan Larutan Tris Sapi

Sebanyak 1,514 gram Tris aminomethan, 0,05 gram asam sitrat dan

0,625 gram fruktosa dicampurkan di dalam gelas erlenmeyer dan ditambahkan dengan 50 ml akuades. Larutan diaduk sampai homogen. 1. Pembuatan Larutan Tris Domba
Sebanyak 1,49 gram Tris aminomethan, 0,825 gram asam sitrat dan 1 gram

fruktosa dicampurkan di dalam gelas erlenmeyer dan ditambahkan dengan aquades 50 ml. Larutan diaduk sampai homogen. 1. Pembuatan Pengencer Tris Kuning Telur Sapi
Larutan Tris sapi yang telah dibuat dicampur kuning telur dengan

perbandingan 4 bagian larutan tris dan 1 bagian kuning telur di dalam erlenmeyer. Larutan diaduk sampai homogen.
1. Pembuatan Pengencer Tris kuning telur Domba Larutan Tris domba yang telah dibuat dicampur kuning telur dengan

perbandingan 4 bagian larutan tris dan 1 bagian kuning telur di dalam erlenmeyer. Larutan diaduk sampai homogen.
A. Pembuatan Bahan Pengencer Semen Cair Susu Skim

Alat dan Bahan : Cawan petri Kertas saring Gelas ukur Timbangan Gelas piala Erlenmeyer 1. Persiapan Kuning Telur Telur dibersihkan dengan menggunakan alkohol 70% dengan cara memutar dari bagian lancip ke bawah kemudian dibiarkan mengering. Kulit telur dipecahkan pada bagian ujung lancipnya menggunakan pinset. Putih telur dikeluarkan pada cawan petri agar terpisah dengan kuning telur. Kuning telur yang masih terbungkus membran vitelin digulirkan di atas kertas saring agar sisa putih telur dapat terserap seluruhnya.

Waterbath
Termometer Susu bubuk skim Akuades Alkohol 70%

Membran vitelin dipecahkan dengan cover glass kemudian kuning telur dimasukkan ke dalam gelas ukur.

1.

Pembuatan Larutan Susu Skim

Susu bubuk skim ditimbang sebanyak 4 gram, dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Kemudian dilarutkan dengan aquades 50 ml. Larutan susu skim dipanaskan dengan waterbath yang suhunya 92C selama 10 menit. Larutan susu skim didinginkan dengan air kran mengalir hingga suhunya mencapai 32C.

Gambar 2 Berbagai macam bahan pengencer

A. Pembuatan Bahan Pengencer Semen Beku Sapi

Alat dan Bahan: Cawan petri Kertas saring Gelas ukur Timbangan Gelas piala Erlenmeyer Gliserol 1. Persiapan Kuning Telur Telur dibersihkan dengan menggunakan alkohol 70% dengan cara memutar dari bagian lancip ke bawah kemudian dibiarkan mengering. Kulit telur dipecahkan pada bagian ujung lancipnya menggunakan pinset. Putih telur dikeluarkan pada cawan petri agar terpisah dengan kuning telur. Kuning telur yang masih terbungkus membran vitelin digulirkan di atas kertas saring agar sisa putih telur dapat terserap seluruhnya.

Tris Telur ayam Asam sitrat Fruktosa Kapas dan Aquades Alkohol 70%

Membran vitelin dipecahkan dengan cover glass kemudian kuning telur dimasukkan ke dalam gelas ukur.

1.

Pembuatan Buffer

Sebanyak 3,028 gram tris, 1,7 gram asam sitrat, dan 1,25 gram fruktosa dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Kemudian dilarutkan dengan aquades 50 ml. Sebanyak 7,4 ml buffer dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Kemudian ditambahkan 0,6 ml gliserol dan 2 ml kuning telur.

1.

Pembuatan Bahan Pengancer Semen Beku

Campuran larutan tersebut diaduk hingga homogen. A. Penampungan Semen 1. Persiapan Vagina Buatan

Vagina buatan disiapkan dengan cara memasang inner liner (karet tipis) di dalam selongsong outer liner (karet tebal), dan diikat kuat dengan karet pengikat pada kedua ujungnya. Setelah itu corong karet dipasang pada ujung vagina buatan yang paling dekat dengan klep air panas. Selanjutnya tabung penampung dipasang dengan cara mengikat kuat tabung penampung dengan pangkal corong karet pada vagina buatan. Kemudian air bersuhu 50-55oC dimasukkan melalui klep vagina buatan, setelah air penuh klep ditutup kemudian udara dipompakan melalui klep udara sampai bagian dalam vagina buatan menggembung.

Gambar 3 Persiapan vagina buatan Bagian dalam vagina buatan dioles menggunakan gel dan diukur suhunya menggunakan termometer. Apabila suhu telah mencapai kisaran 42C-44C maka penampungan dapat segera dilaksanakan. Saat menampung tabung penampung harus dilindungi dengan menggunakan kain agar semen tidak terpapar cahaya matahari langsung. 2. Penampungan Semen Sapi Sapi betina dimasukkan dalam kandang jepit kemudian sapi jantan didekatkan agar dapat mencumbu sapi betina. Pada saat sapi jantan menaiki betina (mounting) pertama, penis dicegah masuk ke dalam alat kelamin betina dan hasil ejakulat tidak ditampung. Pada saat mounting kedua, preputium dipegang dan penis diarahkan ke dalam vagina buatan (terjadi intromisi) sampai ejakulasi. Setelah proses kopulasi selesai, jantan akan turun dari betina (dismounting) dan hasil penampungan semen dibawa ke laboratorium. 3. Penampungan Semen Domba Domba betina disiapkan, kemudian domba jantan didekatkan agar dapat mencumbu domba betina. Pada saat domba jantan menaiki domba betina

(mounting), preputium dipegang dan penis diarahkan ke dalam vagina buatan. Jika terasa ada gerakan ejakulasi ikuti domba jantan hingga turun dari domba betina (dismounting). Vagina buatan diayun dengan gerakan memutar membentuk angka delapan agar semen yang berada pada dinding vagina buatan dapat turun ke dalam tabung. Tabung penampung diperiksa, apabila semen sudah cukup, hasil penampungan semen dapat dibawa langsung ke laboratorium.

Gambar 4 Penampungan semen domba B. Evaluasi Semen Segar 1. Pemeriksaan Makroskopis Evaluasi dilakukan dengan melihat volume, konsistensi, pH dan warna. Volume dihitung dengan melihat angka yang terdapat pada tabung penampung, konsistensi dilihat dengan melihat kekentalannya, dan pemeriksaan pH dilakukan dengan menggunakan pH indicator paper. 2. Pemeriksaan Mikroskopis Gerakan Massa Gerakan Massa (aktivitas gerakan keseluruhan) dilihat dengan cara meneteskan satu tetes semen di atas object glass, lalu diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran 10 x 10. Hasil interpretasi terdiri dari (+++) gelombang tebal, cepat berpindah, celah gumpalan rapat, aktif dan motilitas sangat baik; (++) gelombang sedang, cepat, awan agak terang; (+) sperma bergerak sendiri, tidak ada awan; (-) tidak ada gelombang. Motilitas Motilitas (gerakan spermatozoa secara individual) dilihat dengan cara mencampurkan 3-4 tetes NaCl fisiologis dengan 1 tetes semen untuk sapi dan 8-

10 tetes NaCl fisiologis dengan 1 tetes semen untuk domba, lalu dihomogenkan. Setelah itu preparat diperoleh dengan mengambil satu tetes campuran semen dengan NaCl tadi, kemudian diletakkan pada object glass yang lain dan ditutup cover glass. Selanjutnya diamati di bawah mikroskop dengan pembesaram 4010. Motilitas diukur secara kualitatif dengan mengamati pergerakan spermatozoa hidup yang progresif kemudian dibandingkan dengan spermatozoa yang tidak progresif (sirkuler, diam, reverse dan vibrator). Penilaian yang diberikan dari angka 0% (mati semua) sampai 100% (motil semua). Konsentrasi Spermatozoa Pengamatan dilakukan dengan dua cara, yaitu secara langsung dengan menghitung jarak antar 2 kepala spermatozoa dan menggunakan kamar hitung Neubauwer. Secara langsung dilakukan dengan meneteskan 1 tetes semen diatas object glass dan ditutup dengan cover glass. Setelah itu jarak antar kepala spermatozoa diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1010 atau 4010. Hasil : Densum Rarum : >1000.106 sel/ml. Bila jarak kurang dari 1 kepala : 200-500.106 sel /ml. Bila jarak lebih dari 1,5 kepala 1 kepala dan ekor Oligospermia : < 200. 106 sel /ml. Bila jarak lebih dari 1 spermatozoa. Azoospermia : tidak ada spermatozoa dalam semen. Pengamatan dengan Neubauwer dilakukan dengan memipet 5 l semen ke dalam 995 l formal saline untuk pengamatan pada semen sapi. Sedangkan untuk semen domba dilakukan dengan menambahkan 2 l semen ke dalam 998 l formal saline. Larutan yang sudah diperoleh baik untuk domba dan sapi ditempatkan ke kamar hitung dengan meneteskan larutan ke dalam kamar hitung Neubauwer dan ditutup dengan cover glass. Kemudian diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 4010 dan dihitung jumlah spermatozoa yang terdapat di dalam 5 kamar hitung. Hasil spermatozoa yang dihitung dikalikan dengan 107 spermatozoa per ml untuk sapi dan dikalikan dengan 25106 spermatozoa per ml untuk domba. Rasio Hidup Mati dan Abnormalitas Sperma Semidensum : 500-1000.106 sel /ml. Bila jarak 1-1,5 kepala

Rasio hidup mati dilakukan dengan cara meneteskan 2 tetes eosin 2% dan ditambah sedikit sperma lalu diaduk hingga homogen. Setelah homogen dibuat preparat ulas dan difiksasi dengan pemanas. Fiksasi preparat ulas pada pemanas dilakukan selama kurang dari 15 detik tujuannya agar spermatozoa yang hidup ataupun mati dapat terlihat jelas. Spermatozoa yang hidup ditandai dengan kepala yang tidak berwarna/transparan dan berwarna merah pada spermatozoa yang mati. Spermatozoa yang mati dan hidup dihitung sebanyak 10 lapang pandang dengan jumlah sel spermatozoa minimal 200 sel di bawah mikroskop pembesaran 4010. Lalu persentase spermatozoa yang hidup dihitung dengan rumus : Persentase spermatozoa hidup =
spermatozoa 100% jumlah spermatozoa hidupjumlah total

Setelah pengamatan persentase spermatozoa hidup, dilakukan pengamatan morfologi normal dan abnormal spermatozoa pada preparat yang sama. Spermatozoa yang normal dan abnormal dihitung sampai 10 lapang pandang dengan jumlah sel spermatozoa minimal 200 sel di bawah mikroskop pembesaran 40 x 10, dengan rumus : Persentase spermatozoa abnormal = jumlah spermatozoa abnormaljumlah
total spermatozoa 100%

C. Perhitungan Pengencer dan Antibiotik

Jumlah pengencer yang diperlukan: Vol. Total = Vol. Semen Konsentrasi Semen % Motilitas Vol. IB Konsentrasi IB Vol. Pengencer = Vol. Total Vol. Semen Jumlah antibiotik yang diperlukan: Berdasarkan perhitungan tersebut, dimasukkan sejumlah pengencer ke dalam tabung. Kemudian pengencer ditambahkan antibiotik penicilin dengan dosis 500 - 1000 IU dan streptomicin dengan dosis 0.5 - 1 mg. Perhitungan dosis antibiotik sebagai berikut:

Penicillin dalam kemasan 3106 IU diencerkan dengan 10 ml akuades, sehingga diperoleh stok penicillin =
3 x 10 6 IU = 3 x 10 5 IU ml 10 ml

Vol. yang dicampurkan = Volume Pengencer Stok penicillin

dosis penicillin

Streptomycin dalam kemasan 1000 mg diencerkan dengan 5 ml akuades, sehingga diperoleh stok streptomycin =

1000mg = 200mg ml 5 ml
Vol. yang dicampurkan = Volume Pengencer Stok streptomycin A. Pengolahan Semen Cair (Preservasi) Semen sapi dan domba setelah ditampung, dilakukan evaluasi, dan ditambahkan pengencer dan antibiotik. Setelah itu pada semen yang sudah ditambahkan pengencer dilakukan pengemasan yang nantinya untuk dilakukan penyimpanan. Penyimpanan semen cair domba dan sapi dilakukan dengan sistem pool. Sistem pool ini dilakukan dengan cara memasukkan tabung ke dalam bejana berisi air dan disimpan di dalam lemari es bersuhu 3-5 oC. Setelah itu dilakukan evaluasi dengan rentang waktu setiap 12 jam sampai motilitas spermatozoa menurun selama 5 hari. Semen cair sapi dengan bahan pengencer tris kuning telur juga dikemas dalam sistem straw dengan tujuan untuk melihat pengaruh beberapa metode penyimpanan straw di dalam lemari es terhadap daya tahan hidup spermatozoa. Pada evaluasi ini menggunakan 3 metode penyimpanan, yaitu

dosis streptomycin

Metode water jacket: straw diletakan dalam gelas piala yang telah diiisi air dengan posisi vertikal Metode free water jacket: sama seperti metode water jacket tetapi tidak diberi air (langsung diletakkan vertikal pada gelas piala). Metode horizontal: straw diletakkan di dalam kotak dengan posisi horizontal.

A. Pengolahan Semen Beku Sapi (Kriopreservasi)

Semen sapi yang sudah ditampung, kemudian dilakukan evaluasi, dan ditambahkan bahan pengencer untuk semen beku yang sudah ditambahkan antibiotik. Selanjutnya semen yang sudah ditambahkan bahan pengencer dikemas di dalam straw dengan volume 0,25 ml. Semen yang dikemas dalam straw berjumlah 30 buah. Prosedur pengemasan diawali dengan pengisisan semen cair ke dalam straw menggunakan spoit yang ujungnya dihubungkan dengan mikrotip. Kemudian salah satu ujung straw ditutup dengan menggunakan plastic seal. Setelah semen dikemas dalam straw, dilakukan ekuilibrasi pada suhu 3-5 oC selama 4 jam kemudian diuapkan diatas N2 cair (-130oC) selama 10 menit. Setelah itu dimasukkan ke dalam N2 cair (-196 oC). Selanjutnya dilakukan thawing menggunakan air dengan suhu yang berbeda-beda (Tabel 1). Setelah thawing motilitas sperma diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 4010. Tabel 1. Suhu dan lama thawing Suhu (oC) 27 (air kran) 37 50 70 Waktu 1 menit 30 detik 12 detik 8 detik HASIL DAN PEMBAHASAN Kualitas Semen Kualitas semen untuk sapi dan domba dapat diketahui dengan melakukan pemeriksaan makroskopis dan mikroskopis. Berdasarkan pemeriksaan terlihat bahwa semen sapi (Tabel 2) dan semen domba (Tabel 3) yang diperiksa masih dalam kisaran normal. Tabel 2. Hasil pemeriksaan semen sapi secara makroskopik dan mikroskopik
Parameter Sapi E1 Nama Pejantan Sapi E2 Makroskopis Volume 5,5 ml 5,2 ml 3 ml 58 Sapi Semen Beku (S3) Normal Sapi

Konsistensi pH Warna

Encer 6,4 putih krem

Encer 6,4 putih kuning

Kental 6,7 putih keruh

Sedang s/d kental 6,4 7,8 Putih s/d Krem ++ s/d +++ >70 600 2800

Mikroskopis Gerakan massa Sperma motil (%) Konsentrasi (juta/ml) 800 Photometer Neubauer (semi densum) 3030 71 95,5 4,5 27 500 (semi densum) 840 82,8 69,9 30,1 52,4 66,8 33,2 10 4 jam 10 menit < 25 77,8 7,5 1000 (densum) +++ 70 +++ 70 +++ 80

Sperma hidup (%) Sperma normal (%) Sperma abnormal (%) Jumlah pengencer (ml) Waktu equilibrasi Waktu pembekuan

Tabel 3. Hasil pemeriksaan semen domba secara makroskopik dan mikroskopik

Parameter Nama Pejantan Domba Ke- Domba Ke-2 Domba Ke-3 1 (D1) (D2) (D3) Makroskopis 1 Encer < 6,4 putih keruh 1 Encer <<< 6,4 putih keruh Mikroskopis Gerakan massa Sperma motil (%) Konsentrasi (juta/ml) Jarak antar kepala +++ 95 2000 (densum) +++ 95 2000 (densum) +++ 95 2000 (densum) ++ s/d +++ 74,17 2,04 1250 3000 2,25 Kental 6,4 putih keruh Normal Domba 0.7 3 Sedang s/d kental 5.9 7.3 Putih s/d Krem

Volume (ml) Konsistensi pH Warna

Neubauer

3325 77,6 90,35 9,65

2925 90,24 96,65 3,35

5600 82,9 74,05 25,95 3,3 < 15 85,67 2,25

Sperma hidup (%) Sperma normal (%) Sperma abnormal (%) Jumlah pengencer (ml)

1. Pemeriksaan Makroskopis Hasil pemeriksaan makroskopis menunjukkan volume semen sapi dari hasil penampungan adalah 5,5 ml pada ejakulat pertama dan 5,2 ml pada ejakulat kedua (Tabel 2) sedangkan volume semen domba 1 ml pada ejakulat domba pertama dan kedua serta 2,25 ml pada domba ketiga (Tabel 3). Volume ejakulasi sapi yang akan dibuat semen beku (S3) sebanyak 3 ml (Tabel 2). Menurut Toelihere (1980), kisaran normal volume ejakulat semen sapi adalah 5 8 ml dan pada domba 0,7 3 ml. Berdasarkan hal tersebut dapat disimpulkan bahwa jumlah volume ejakulat semen sapi dan domba yang diperoleh berada dalam kisaran normal. Semen yang diperoleh berwarna putih keruh untuk sapi dan domba dengan konsistensi encer untuk ejakulat pertama dan kedua pada sapi, kental pada S3, encer pada D1 dan D2, dan kental untuk D3. Hasil ini termasuk normal karena menurut Herdis (2005), semen normal berwana putih sampai dengan krem dengan konsistensi yang kental. Nilai derajat keasaman (pH) semen sapi E1, E2, dan S3 secara berturut-turut adalah 6,4, 6,4 dan 6,7, sedangkan pH semen domba yang diperoleh D1, D2, dan D3 berkisar 6,4. Hasil ini masih layak, karena kisaran layak pH untuk semen sapi menurut Toelihere (1980) yaitu 6,4 - 7,8 dan pada domba berkisar antara 5,9 7,3. Tabel 4 Volume, motilitas, dan konsentrasi semen berbagai spesies hewan Volume (ml) Motilitas (%) Sapi perah Breed kecil Breed besar Sapi potong 56 7-8 45 50 80 50 80 40 70 1000 1500 1000 1500 1000 3000 Konsentrasi (sperm/ml 106)

Domba&kambing Babi Kuda

0,75 3 150 300 75 100

60 80 50 70 40 70

1500 3000 100 150 100 - 150

1.

Pemeriksaan Mikroskopis Hasil pemeriksaan mikroskopis yang diperoleh untuk gerakan massa

berdasarkan skala - sampai dengan +++ adalah +++ untuk sapi dan domba. Menurut Herdis (2005) semakin tinggi skala gerakan massa, maka kualitas sperma semakin baik. Persentase sperma motil pada sapi 70% untuk E1, E2, 80% untuk S3 dan pada domba 95%. Angka ini termasuk layak, karena menurut Arthur et al. (1996) persentase sperma motil pada sapi > 70%, dan menurut Herdis (2005) persentase sperma motil pada domba adalah 74,17 2,04. Persentase sperma motil banyak digunakan sebagai dasar untuk menentukan kualitas dan kemampuan spermatozoa untuk membuahi sel telur. Konsentrasi sperma dihitung berdasarkan jarak antar kepala sperma. Konsentrasi sperma sapi E1 dan E2 diperoleh nilai semi densum yaitu jarak antar kepala sperma berkisar dari 1-1,5 kepala, dan diperkirakan jumlah spermatozoa adalah 500-1000 juta sel/ml. Sedangkan untuk S3 diperoleh nilai densum yaitu jarak antar kepala sperma lebih kecil dari satu kepala dan diperkirakan jumlah spermatozoa >1000 juta sel/ml. Pada domba diperoleh nilai densum yaitu jarak antar kepala sperma kurang dari 1 kepala, dan diperkirakan jumlah spermatozoa adalah 2000 juta sel/ml. Nilai konsentrasi sperma pada sapi dan domba termasuk layak. Menurut Arthur et al. (1996) konsentrasi sperma sapi adalah 600-2800 juta sel/ml dan domba 1250 3000 juta sel/ml. konsentrasi spermatozoa yang didapat dari hasil pengamatan photometer dan pengamatan menggunakan kamr hitung Neubauer terdapat perbedaan yang jauh. Menurut Partodihardjo (1992), pebedaan perhitungan yang berbeda jauh seringkali disebabkan oleh kesalahan teknik, seperti pada saat menghisap semen atau cairan pengencernya. Sperma hidup dan abnormal dihitung dalam satu preparat dengan menggunakan pewarnaan eosin 2%. Hasil yang diperoleh untuk semen sapi yang akan digunakan untuk membuat semen cair adalah 71% sperma hidup dan 4,5% sperma abnormal, sedangkan untuk semen sapi yang akan digunakan untuk membuat semen beku adalah 52,4% sperma hidup dan 33,2% sperma abnormal.

Persentase sperma hidup domba untuk membuat semen cair adalah 82,9% dan persentase sperma abnormal adalah 25,95%. Menurut Kaiin (2005) persentase layak untuk sperma hidup sapi adalah 77,8 7,5. Menurut Herdis (2005) persentase normal untuk sperma hidup domba adalah 85,67 2,25. Menurut Arthur et al (1996) persentase abnormalitas sperma sapi adalah kurang dari 25 dan domba kurang dari 15. Berdasarkan literatur tersebut persentase abnormalitas dan hidup mati sperma sapi untuk semen cair berada dalam kisaran layak, sedangkan untuk semen beku berada di bawah normal. Persentase abnormalitas dan hidup mati sperma domba berada dibawah normal, namun tidak terlalu berada di bawah normal. Hal ini dapat dikarenakan kualitas pakan yang kurang baik dan waktu pengambilan semen yang kurang tepat. Semen diambil pada siang hari, saat cuaca panas, sehingga dapat menurunkan kualitas sperma. Abnormalitas pada spermatozoa yang paling banyak yaitu ekor putus atau melingkar, hal ini dapat disebabkan karena kesalahan teknis, seperti pengambilan semen yang terlalu kasar atau tempat semen sering terguncang. 2. Kualitas Semen Cair Menurut Toelihere (1993), untuk mempertahankan kualitas hidup dan motilitas spermatozoa dalam waktu lama, maka perlu ditambahkan berbagai unsur ke dalam semen. Unsur-unsur ini terdapat dalam bahan pengencer yang berfungsi untuk: 1. Menyediakan zat makanan sebagai sumber energi bagi spermatozoa
2. Melindungi spermatozoa terhadap cold shock

3. Menyediakan suatu penyangga untuk mencegah perubahan pH akibat pembentukan asam laktat dari hasil metabolisme spermatozoa 4. Mempertahankan tekanan osmotik dan keseimbangan elektrolit yang sesuai 5. Mencegah pertumbuhan kuman 6. Memperbanyak volume semen sehingga lebih banyak hewan betina yang dapat diinseminasi Penilaian persentase motilitas spermatozoa dilakukan secara subyektif, oleh karena itu keakuratan penilaian terhadap parameter ini berbanding lurus dengan tingkat pengalaman (jam terbang) dan kemahiran seorang pemeriksa. Pemeriksaan dilakukan dengan membandingkan jumlah spermatozoa yang bergerak progresif dengan spermatozoa yang tidak bergerak secara progresif

melalui bantuan mikroskop dan dinyatakan dalam persen. Persentase motilitas spermatozoa sapi yang telah diencerkan dalam keempat jenis bahan pengencer (sitrat kuning telur, sitrat fruktosa kuning telur, tris kuning telur, dan susu skim) dan domba yang telah diencerkan dalam ketiga jenis bahan pengencer (sitrat kuning telur, tris kuning telur, dan susu skim) dapat dilihat pada Tabel 4 dan 5. Tabel 4 dan 5 menunjukan bahwa selama penyimpanan terlihat adanya penurunan pergerakan progresif (motilitas) spermatozoa. Hal ini diduga disebabkan oleh semakin bertambahnya jumlah spermatozoa yang rusak dan mati akibat suhu dingin, ketersediaan energi dalam bahan pengencer makin berkurang, semakin menuanya umur sperma dan meningkatnya tingkat keasamaan (pH) semen (Solihati & Kune 2009).

Tabel 5 Perbandingan motilitas spermatozoa sapi dalam 4 bahan pengencer Tris Kuning Telur (%) 70 30 2 0 Sitrat Kuning Telur (%) 70 65 60 60 60 55 55 55 50 40 Sitrat Fruktosa Kuning Telur (%) 70 70 65 60 60 60 55 55 55 40

Waktu (jam) 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108

Skim (%) 60 60 55 55 50 50 50 40 35 30

Penurunan persentase pergerakan progresif (motilitas) spermatozoa pada tiap pengencer tidak sama, dan terlihat bahwa semen sapi (Tabel 4) dalam 3

bahan pengencer yakni sitrat kuning telur (SKT), sitrat fruktosa kuning telur (SFKT), dan skim kuning telur masih memperlihatkan persentase pergerakan progresif diatas motilitas layak IB (diatas 40 %) hingga 72 jam pasca penyimpanan. Sedangkan semen dalam bahan pengencer tris kuning telur (TKT) bertahan hingga 24 jam pasca penyimpanan (Gambar 1). Pengencer sitrat kuning telur mengandung natrium sitrat yang merupakan buffer yang mampu mempertahankan kestabilan pH pengencer sehingga menguntungkan untuk kelangsungan hidup spermatozoa. Buffer sitrat juga memiliki kelebihan yaitu tidak menghalangi pemandangan di bawah mikroskop dan dapat bertahan lama jika disimpan dalam lemari es (Partodihardjo 1992). Natrium sitrat juga berfungsi mengikat kalsium atau logam berat dan menyebabkan larutnya butir lemak di dalam kuning telur sehingga sel sperma secara individual dapat diamati di bawah mikroskop (Toelihere 1993). Buffer sitrat dapat dipakai untuk mengencerkan semen setelah dicampur dengan kuning telur. Perbandingan pemakaian pengencer dan kuning telur adalah 4 : 1. Penambahan kuning telur pada pengencer sitrat diperlukan karena di dalam kuning telur mengandung lipoprotein dan lesitin yang melindungi integritas sel sperma pada suhu penyimpanan 50C dengan cara bekerja mempertahankan dan melindungi integritas selubung lipoprotein spermatozoa, selain itu glukosa dalam kuning telur menguntungkan spermatozoa karena adanya daya viskositas (Said et al. 2005). Data motilitas spermatozoa menunjukkan bahwa spermatozoa dalam pengencer natrium sitrat fruktosa kuning telur secara teknis layak dipakai untuk IB pada sapi dengan menggunakan semen cair sampai penyimpanan hari ke-5, karena memiliki persentase motilitas progresif di atas 40%. Penurunan motilitas kemungkinan dapat terjadi akibat adanya pengaruh metabolisme spermatozoa (Hafez 1993). Metabolisme spermatozoa akan menghasilkan asam laktat yang apabila berada dalam jumlah yang banyak, dapat menyebabkan perubahan berupa suasana semen yang menjadi asam yang berakibat pada percepatan proses kematian spermatozoa. Selain itu, penurunan motilitas spermatozoa setelah penyimpanan yang lama dapat terjadi karena menurunnya zat makanan spermatozoa dan pengaruh zat toksik dari hasil sampingan proses metabolisme spermatozoa (Setiadi & Julizar 2001), karena motilitas spermatozoa sangat

bergantung terhadap persediaan energi berupa adenosin triphosphate (ATP) hasil dari proses metabolisme sel (Rizal et al. 2002). Susu mengandung anti cekam dingin yang baim untuk sperma. Pemanasan susu dalam proses pembuatan bahan pengencer sangat diperlukan terutama untuk sterilisasi dan pengurangan kadar lemak susu. Mikroorganisme akan mati pada susu di atas 900C, selain itu juga menonaktifkan enzim dari mikroorganisme yang dapat mencerna lapis luar dari spermatozoa dan menyebabkan kematian spermatozoa dalam waktu singkat. Di dalam susu skim sudah terdapat bahan penyangga. Susu skim juga mempunyai tekana osmotik dan elektrolit yang berada dlam keadaan seimbang. Bahan penyangga berfungsi untuk mempertahankan pH semen sehingga penuruna pH akibat penimbunan asam laktat sebagai hasil akhir metabolisme spermatoza dapat dicegah. Penurunan motilitas dengan bahan pengencer susu skim kemungkinan besar diakibatkan susu skim yang berfungsi sebagai buffer tidak mampu mempertahankan pH akibat terbentuknya asam laktat sisa metabolisme (Solihati & Kune 2009). Susu skim memiliki kelebihan sebagai media isotonik dan antikejutan dingin karena banyak mengandung komponen yang menguntungkan untuk mempertahankan kelangsungan hidup spermatozoa (Gazali & Tambing 2001). Semen sapi lebih cocok menggunakan pengencer dasar susu skim (Gazali & Tambing 2001). Hal ini mengisyaratkan bahwa semen cair yang diencerkan dengan ketiga bahan pengencer tersebut sebaiknya dibatasi hanya dalam waktu 72 jam untuk pengencer SKT, SFKT, dan skim kuning telur, sedangkan 24 jam untuk pengencer TKT yang disimpan pada suhu 3-50C sebelum digunakan dalam kegiatan IB. Menurut Solihin dan Kune (2009), dalam pelaksanaan IB sebaiknya semen cair yang masih layak IB perlu dibatasi penggunaannya hanya pada semen yang lama penyimpanannya minus 24 jam untuk menghindari kemungkinan unsur subyektif yang digunakan dalam menentukan motilitas sperma.

Gambar 5 Grafik perbandingan motilitas spermatozoa sapi dalam beberapa bahan pengencer.

Tabel 5 dan Gambar 2 memperlihatkan bahwa bahan pengencer SKT dan TKT menunjukan daya tahan hidup sperma pada motilitas yang masih layak IB ( 40%) lebih lama yaitu 108 jam pasca penyimpanan kemudian diikuti oleh skim kuning telur yaitu 84 jam pasca penyimpanan. Pengamatan yang efektif dan efisien adalah hanya sampai pada waktu dimana spermatozoa yang dipertahankan dalam bahan pengencer tersebut masih berada pada motilitas layak IB, yakni minimal 40 % dan hal ini hanya dapat dicapai pada penyimpanan yang tidak lebih dari 4 hari setelah diencerkan. Hasil penelitian penggunaan ketiga jenis pengencer pada semen domba ini bervariasi (Tabel 5). Hal ini mungkin disebabkan ketiga jenis pengencer ini mempunyai peranan yang berbeda-beda. Tris berperan sebagai bahan penyangga yang dapat digunakan untuk mempertahankan pH semen secara fisiologik. Hafez (1993) mengemukakan bahwa kelebihan Tris terletak pada kandungan garam dan asam amino yang dikandungnya yang berperan mempertahankan osmolaritas. Tris Aminomethan berfungsi sebagai buffer dan mempertahankan tekanan osmotik dan keseimbangan elektrolit. Fruktosa menyediakan makanan dan kuning telur berfungsi melindungi spermatozoa terhadap shock dingin dan sebagai sumber energi. Hasil pengamatan motilitas spermatozoa domba dengan pengencer susu skim menunjukkan bahwa selama empat hari susu skim mampu mempertahankan kualitas semen domba agar tetap dapat digunakan untuk IB. Susu skim dapat digunakan sebagai pengencer semen cair domba karena susu skim merupakan medium isotonik yang mengandung komponen yang menguntungkan untuk memelihara kelangsungan hidup spermatozoa dan digunakan secara intensif oleh peneliti terdahulu untuk pengenceran semen. Komponen dengan berat molekul tinggi seperti susu dapat berperan dalam melindungi sel spermatozoa terhadap kerusakan karena kejutan dingin (cold shock). Hal itu terjadi karena susu skim mengandung protein susu yaitu kasein yang merupakan agen pencegah cold shock (Herdis 2005). Namun asam glutamate yang terkandung dalam susu skim menyebabkan perubahan pH pada saat penyimpanan yang lama sehingga motilitas sperma yang dapat digunakan untuk IB hanya bertahan hingga empat hari (Herdis 2005). Tabel 6 Perbandingan motilitas spermatozoa domba dalam tiga bahan pengencer

Waktu (Jam) 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108

Sitrat Kuning Telur (%) 95 90 85 75 75 70 70 65 60 50

Tris Kuning Telur (%) 90 80 80 80 75 70 65 55 50 45

Skim (%) 85 70 70 65 50 45 45 45 35 30

Gambar 6 Grafik perbandingan motilitas spermatozoa domba dalam beberapa bahan pengencer. Data pengamatan menunjukkan bahwa penyimpanan semen cair domba dalam staw dengan posisi water jacket dan horizontal memiliki tingkat motilitas paling tinggi jika dibandingkan dengan posisi vertikal tanpa air (Tabel 6 dan Gambar 3). Hal ini disebabkan karena pada penyimpanan dengan cara berdiri (water jacket) akan membatasi ruang gerak sehingga metabolisme sperma akan menurun, selain itu dengan adanya water jacket pada penyimpanan semen cair dalam staw dengan posisi berdiri berguna untuk menjaga suhu sehingga metabolisme spermatozoa akan rendah, akibatnya motilitas spermatozoa akan lebih tinggi. Berbeda dengan kemasan straw, pada kemasan pool motilitas spermatozoa dapat dipertahankan hingga 24 jam, meskipun dibawah 40%. Hal ini terjadi karena pada kemasan pool jumlah nutrisi lebih banyak dibandingkan dalam kemasan straw meskipun jumlah spermatozoanya sama. Tabel 7 Persentase motilitas spermatozoa sapi dalam Pengencer Tris Kuning Telur pada posisi penyimpanan yang berbeda

Waktu (jam) 0 12 24 36

Pool (%) 70 30 2 0

Vertikal dengan air (water jacket) (%) 70 50 0 0

Vertikal tanpa air (free water) jacket (%) 70 30 0 0

Horizontal (lying) (%) 70 50 0 0

Gambar 7 Persentase motilitas spermatozoa sapi pada tiga posisi penyimpanan yang berbeda. Berdasarkan hasil pengamatan motilitas spermatozoa post thawing dengan suhu yang berbeda, menunjukkan bahwa persentase motilitas spermatozoa tertinggi yaitu pada suhu 37oC selama 30 detik (Tabel 7 dan Gambar 4). Hal ini sesuai dengan pernyataan Surmalin (2003) bahwa thawing dengan menggunakan air pada suhu 37oC selama 30 detik merupakan metode thawing yang paling optimum. Salah satu penyebab terjadinya kematian sperma selama proses pembekuan dan thawing adalah terjadinya peroksidasi lipid, yang menyebabkan terjadinya perubahan atau kerusakan pada struktur spermatozoa, seperti membran plasma dan tudung akrosom (Tambing et al. 2000). Peroksidasi lipid dapat menurunkan daya pembuahan spermatozoa. Kerusakan tersebut dapat dicegah dengan penambahan antioksidan seperti vitamin C. Menurut Tambing et al. (2000) menunjukkan bahwa penambahan vitamin C dapat mempertahankan keutuhan membran plasma dan keutuhan tudung akrosom spermatozoa dari pengaruh kerusakan oleh adanya peroksidasi lipid. Tabel 7. Persentase motilitas spermatozoa semen beku sapi dalam berbagai metode thawing. Suhu thawing 70 C 50 C 37 C Waktu thawing 8 detik 12 detik 30 detik Motilitas rata-rata (%) 13 68 73

Air kran (27C)

60 detik

53

Gambar 8 Diagram persentase motilitas spermatozoa semen beku sapi dengan berbagai metode thawing. Berdasarkan hasil pengamatan, maka untuk pembekuan semen sebaiknya bahan pengencer ditambah gliserol untuk meminimalkan kristal-kristal es yang terbentuk. Sitoplasma spermatozoa yang hanya sedikit akan mempermudah pembentukan kristal es pada suhu yang rendah. Gliserol berperan mencegah efek merugikan akibat adanya pembentukan kristal-kristal es dan perubahan konsentrasi elektrolit serta mampu mencegah pengeluaran air yang berlebihlebihan dari dalam sel spermatozoa. Gliserol akan digunakan oleh spermatozoa untuk metabolisme oksidatif dan menurunkan konsentrasi elektrolit intraseluler. Penambahan gliserol 6% dalam pengencer tris akan memberikan daya perlindungan yang optimal.

KESIMPULAN Hasil pengamatan semen segar sapi dan domba, dapatkan disimpulkan bahwa:
1. Secara makroskopis dan mikroskopis semen segar sapi dan domba cukup baik. 2. Pengencer sitrat kuning telur dan sitrat fruktosa kuning telur paling baik

digunakan sebagai bahan pengencer semen sapi.

3. Pengencer sitrat kuning telur paling baik digunakan sebagai bahan pengencer

semen domba.
4. Penyimpanan straw semen sapi untuk tetap mempertahankan motilitasnya

adalah dengan cara water jacket dan horizontal.

5. Metode thawing terbaik yaitu pada suhu 37o selama 30 detik.

DAFTAR PUSTAKA Aboagla EM-E, Terada T. 2004. Effect of egg yolk during the freezing step of cryopreservation on the viability of goat spermatozoa. Theriogenology 62:1160-1172. Arthur GH, DE Noakes, H Pearson, TJ Parkinson. 1996. Veterinary Reproduction and Obstetrics. Edisi ke-7. London: Saunders. Gazali M, Tambing SN. 2001. Kriopreservasi Sel Spermatozoa. Jurnal Hayati. 9:27-32 Hafez ESE. 1993. Reproduction in Farm Animals. Edisi ke-6. Philadelphia: Lea and Febiger. Herdis. 2005. Optimalisasi jenis pengencer dan dosis gliserol pada proses pembekuan semen domba garut (Ovis aries). Di dalam: Optimalisasi

Inseminasi Buatan melalui Aplikasi Teknologi Laserpunktur pada Domba Garut (Ovis aries). {Disertasi}. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Kaiin. 2005. Kualitas Sperma Hasil Pemisahan yang Dibekukan Menggunakan Rak Dinamis dan Statis. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Kartasudjana R. 2001. Teknik Inseminasi Buatan. Jakarta: Departemen pendidikan Nasional. Partodihardjo. 1992. Ilmu Reproduksi Hewan. Jakarta: Mutiara Sumber Widya. Rizal M, Toelihere MR, Yusuf TL, Purwantara B, Situmorang. 2002. Kualitas semen beku domba garut dalam berbagai dosis gliserol. JITV. 7(3):194 199. Said S. 2005. Daya tahan hidup sperma cair sapi simmental yang disimpan dalam straw pada temperatur 50C. Seminar Nasional Teknologi dan Peternakan: 87 90. Setiadi MA, Julizar. 2001. Prediksi kesuburan spermatozoa domba melalui uji penembusan lendir estrus. Prosiding Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Bogor: Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Solihati N & Kune P. 2009. Pengaruh Jenis Pengencer Terhadap Motilitas dan Daya Tahan Hidup Spermatozoa Semen Cair Sapi Simmental. Laporan Penelitian. Sugoro I. 2009. Pemanfaatan Inseminasi Buatan (IB) untuk Peningkatan Produktivitas Sapi. Bandung: Sekolah Tinggi dan Ilmu Hayati ITB. Sumarlin T. 2003. Perbedaan Kualitas Spermatozoa dari Semen Beku Sapi PO setelah Thawing dengan Metode yang berbeda. {Skripsi}. Bogor. Program Sarjana FKH-IPB. Tambing S, Mozes RT, Tuty LY, Bambang P, IKetut S, Polimerz S. 2000. Kualitas Semen Beku Kambing Saanen pada Berbagai Jenis Pengencer Semen. Hayati. Vol. 10. No. 4 : 146-150. Toelihere MR. 1993. Inseminasi Buatan pada Ternak. Bandung: Angkasa.