Mikroteknik A.

Mikroteknik Mikroteknik adalah ilmu yang mempersiapkan organ, jaringan atau bagian jaringan agar dapat diamati dan ditelaah. Organ dan jaringan dapat berasal dari hewan maupun tumbuhan. Jaringan hewan dapat diambil dari hewan tersebut selagi masih dalam keadaan hidup, setelah mengalami pembiusan maupun yang baru saja mati dan sesegera mungkin dimasukkan dalam larutan fiksatif. Jaringan tumbuhan dapat diambil dari tumbuhan yang sedang tumbuh dengan terlebih dahulu disimpan dalam air dan disayat setipis mungkin, berwarna untuk dapat dilihat serta bersifat langgeng, baru kemudian dilakukan fiksatif. Bahan pembius yang umum digunakan adalah kloroform, eter, dan alkohol. B. Metoda Mikroteknik Metoda yang umum digunakan dalam mikroteknik adalah sediaan utuh, sediaan irisan, sediaan uraian, sediaan ulasan, sediaan rentang, sediaan gosok dan sediaan supravital. 1. Sediaan Utuh (Whole Mounts) Melalui metode ini, dipersiapkan sediaan yang terdiri atas keseluruhan organism secara utuh. Melalui metode ini diusahakan agar kita mendapat kesan bentuk aslinya dengan mempertahankan format tiga dimensinya. Pada metode ini dihasilkan sediaan dengan ketebalan 0,2 mm ± 0,5 mm dengan tingkat perbesaran 100 kali. 2. Sediaan Irisan (Sectioning) Metode ini dianggap sebagai teknik rutin bagi penyiapan spesimen. Suatu metode pembuatan sediaan dengan jalan membuat suatu irisan dengan tebal tertentu sehingga dapat diamati melalui mikroskop. Tebal-tipisnya sayatan bergantung pada tujuan pengambilan spesimen. Umumnya bersikat antara 6-15 mikron (1 mikron ± 0,001 mm). Ukuran sayatan biasanya terbatas pada ukuran panjang dan lebar yaitu 3 x 2 cm. Ada 2 macam metode irisan yaitu : a. Metode irisan dengan menggunakan tangan Pada beberapa macam jaringan, terutama dalam lapangan botani, pembuatan sediaan dengan cara ini masih dapat dipakai misalnya melihat susunan daun segar. Dengan mempelajari sediaan seperti ini dapat diperoleh beberapa keterangan mengenai luas maupun tipe fibrosis didalam jaringan yang patologis. b. Metode irisan dengan menggunakan mikrotom yang mempunyai keuntungan yaitu tebal irisan dapat diatur menurut tujuan dan kehendak pengguna.

b. Misalnya darah diteteskan pada salah satu kaca preparat pada bagian ujungnya. May Grunwald (larutan eosin-methylen blue dalam methyl alcohol). Ujung kaca preparat lainnya menyentuh tetesan darah untuk kemudian ditarik dengan posisi 45 sehingga darah akan rata pada permukaan kaca preparat c. Sediaan Gosok . Sediaan Rentang Yaitu suatu metode pembuatan sediaan dengan cara merentangkan suatu jaringan pada permukaan object glass sehingga dapat diamati dengan mikroskop. Hematoksilin dan Azure II-Eosin. Bahan pewarnaan yang biasa digunakan adalah pewarnaan Mallory Acid Fuchsin. 6. Teknik jenis sediaan natif Teknik ini menggunakan ulasan darah yang tipis pada gelas preparat ataupun pada kaca penutupnya. Contoh untuk metode ini adalah penguraian guna mendemontrasikan struktur serta hubungan ujung-ujung syaraf. Teknik mendapatkan hasil tebal Teknik ini digunakan untuk mengamati parasit yang terdapat dalam darah. 5. Beberapa pewarnaan yang biasa digunakan adalah Giemsa. Bahan yang sering digunakan dalam metode ini adalah darah. kemudian difiksasi. dan lain-lain. Kesukaran dalam penyiapan darah tebal adalah sulit menghindarkan agar darah tidak mengalir keluar kaca preparat. 4. Yang diurai adalah komponen maupun struktur tertentu sehingga memungkinkan pengamatan dengan lebih sempurna.Mikroteknik 3. Pada metode sediaan ulasan ini mempunyai beberapa teknik yaitu : a. mesenterium. misalnya parasit malaria. peritoneum. Sediaan Ulasan (Smearing) Yaitu suatu pembuatan sediaan dengan jalan mengoles dari substansi yang berupa cairan maupun bukan cairan diatas kaca object yang bersih dan bebas lemas. Sediaan Uraian Yaitu suatu metode yang ³diuraikan´ dengan menggunakan jarum pengurai. Darah pada bagian tengah kaca penutup secepatnya digeserkan sehingga darah menyebar rata pada permukaan kedua kaca penutup dengan menarik ujung-ujungnya yang bebas. diwarnai dan ditutu dengan cover glass. perikardium. Pappenheim dan Wright. Bahan yang dibuat adalah jaringan yang tipis misalnya pleura. Teknik sediaan ulas Teknik ini memerlukan dua kaca preparat.

Pencucian . Fiksatif dapat dikelompokkan menjadi cairan fiksatif tunggal yaitu formalin. alkohol. Pewarna yang biasa digunakan adalah Janus Green. Neutral Red. Metode ini digunakan untuk jaringan yang sel-selnya mudah lepas misalnya lien. 4. 2. 3. Sediaan Supravital Yaitu metode untuk mendapatkan sediaan dari sel-jaringan yang hidup. Pencet (Squash) Yaitu metode untuk mendapatkan suatu sediaan dengan cara memencet suatu potongan jaringan atau suatu organism secara keseluruhan sehingga didapatkan suatu sediaan yang tipis dan dapat diamati dengan mikroskop. Pencucian dilakukan pada air yang mengalir. Pewarna yang biasa digunakan adalah larutan carmine. asam asetat dan asam pikrat. Pencucian (washing) Tujuannya adalah menghilangkan cairan maupun bahan yang masih tertinggal pada jaringan. Jaringan dipotong-potong kemudian digosok pada batu gosok hingga cukup tipis untuk dapat diamati. diperlukan beberapa tahapan yaitu : 1. Larutan yang biasa digunakan pada fiksasi adalah larutan fisiologis NaCl dan larutan ringer. dan fiksatif majemuk yaitu larutan bouin dan formol saline. Methylen Blue dengan konsentrasi tertentu. Pembius yang biasa digunakan adalah eter. Dalam membuat siapan melalui metoda paraffin untuk jaringan. kloroform. C. dan kuku. aseton. Pembiusan (narcose) Pembiusan dilakukan tergantung dari jenis hewan yang akan dijadikan preparat. Pengambilan jaringan (diseksi) Pengambilan jaringan umumnya menggunakan pinset dengan dibantu dengan gunting bedah. prokain. 7. Fiksasi Fiksasi bertujuan untuk memberikan perlakuan tertentu terhadap jaringan sehingga dapat diawetkan dalam kondisi yang mendekati keadaan aslinya. dan sumsum tulang. 8. mencegah autolisis dan menaikkan daya pewarnaan. morfin dan metan. Metoda Parafin Metoda paraffin termasuk metoda irisan yang merupakan metoda rutin. gigi.Mikroteknik Yaitu metode pembuatan sediaan untuk jenis jaringan yang keras sifatnya seperti tulang.

Proses dehidrasi umumnya dilakukan dua kali yaitu setelah proses fiksasi dan pencucian serta setelah proses pewarnaan. Larutan yang lain adalah dioksan. kertas atau aluminium. N-butyl alkohol dan aniline oil. 7. 8. Proses infiltrasi dilaksanakan dalam oven. 10. Afiksing Yaitu proses pelekatan sayatan jaringan pada kaca preparat dengan bantuan media perekat tertentu. Kekurangannya jika terlalu lama di xylol maka menyebabkan jaringan menjadi kering.Mikroteknik dilakukan sebelum proses fiksasi. Penyayatan (section) Penyayatan dilakukan agar menghasilkan sayatan tipis. Penjernihan (clearing) Tujuannya adalah menggantikan tempat alkohol dalam jaringan. 6. yaitu albumin diatas hot plate. 5. Penanaman (embedding) Yaitu proses memasukkan atau menanam jaringan ke dalam blok-blok paraffin sehingga memudahkan pada proses penyayatan. sesudah proses fiksasi dan setelah proses pewarnaan. Larutan yang umum digunakan adalah xylol karena murah. rapuh dan getas. membuat jaringan cepat menjadi transparan dan cepat menyingkirkan dan menggantikan kedudukan alkohol dari proses dehidrasi. bekerja cepat. Syarat larutan yang digunakan dalam dehidrasi adalah : a) Harus dapat menggantikan kedudukan air dalam jaringan b) Dapat digantikan oleh medium penjerbih c) Tidak merusak jaringan Larutan yang biasa digunakan adalah alkohol. Blok-blok menggunakan cetakan yang terbuat dari timah. Infiltrasi Yaitu usaha menyusupkan media penanaman ke dalam jaringan dengan jalan menggantikan kedudukan dehidran dan bahan penjernih. Media yang umum digunakan adalah paraffin. Dehidrasi Yaitu proses mengeluarkan air dari dalam jaringan dengan menggunakan bahan kimia tertentu. Pewarnaan (staining) . 9. 11. Penyayatan umumnya menggunakan mikrotom. Deparafinasi 12.

Tujuan penggunaan pewarna ganda bertujuan agar terjadi kekontarsan pewarnaan sehingga pengenalan bagian tertentu dapat lebih cepat dan jelas terlihat. maka selanjutnya eosin digunakan. pewarna ganda misalnya hematoksilin-eosin. Zat warna dapat dibedakan berdasarkan : a) Berdasarkan sifatnya. Pada pewarnaan ganda. Hematoksilin-Eosin umumnya digunakan untuk pewarnaan jaringan hewan. namun untuk jaringan tumbuhan tidak lazim diwarnai dengan paduan warna tersebut. Kombinasi yang umum digunakan adalah zat warna berwarna biru dengan merah. . Hematoksilin selalu digunakan lebih dahulu dan setelah proses diferensiasi. contohnya Hematoksilin-Eosin. zat warna dibedakan menjadi zat warna alami yang diperoleh dari alam seperti Hematoxilin dan zat warna sintesis yang dibuat di pabrik seperti basic fuchsin. c) Berdasarkan kemampuan mewarnai jaringan. Alat ini digunakan untuk menyayat jaringan sebelum ditempelkan ke atas permukann object glass. zat warna dibedakan menjadi zat warna asam berupa garam garam dari sodium dan zat warna basa berupa sulfat basa organik. Mikrotom Yaitu instrument ilmiah yang memotong iris tipis sesuatu untuk pemeriksaan mikroskopis atau suatu alat berpresisi tinggi sehingga harus diperlakukan secara hati-hati.Mikroteknik Tujuannya agar dapat mempertajam atau memperjelas berbagai elemen jaringan sehingga dapat dibedakan dan ditelaah dengan mikroskop. biasanya digunakan pewarna Erythrosin B. Umumnya yang digunakan adalah pewarnaan dengan pewarna ganda. Hal ini dikarenakan eosin tampak kurang efektif bagi jaringan tumbuhan. D. yaitu pewarna tunggal missal Gentian violet. yaitu zat warna substantif yang mampu mewarnai jaringan secara langsung misalnya Neutral red dan zat warna ajektif yang mampu mewarnai jaringan dengan bantuan mordan misalnya Hematoksilin. Untuk jaringan tumbuhan. umumnya pewarna yang digunakan adalah yang bersifat asam dan basa sehingga menyebabkan bagian-bagian jaringan yang bersifat asidotilik danbasotilik dapat ditonjolkan. pewarna rangkap tiga misalnya formula Marllory triple stain dan pewarna rangkap empat. d) Berdasarkan komposisi warna. b) Berdasarkan asalnya.

4. Pengatur jarak berfungsi untuk mengatur blok jaringan dengan mata pisau. Pisau bikonkaf sering digunakan untuk menyayat blok paraffin. merupakan komponen yang menghubungkan mikrotom dengan blok jaringan yang hendak disayat. blok jaringan yang hendak disayat tetap diam di tempatnya sementara pisau melewati blok paraffin tersebut. biasanya digunakan untuk sayatan beku dan blok paraffin. Mikrotom Schantz Yaitu mikrotom dimana pada saat menyayat. Pisau yang biasa digunakan pada mikrotom adalah: 1. Skala ini dapat digeser ke kiri dan ke kanan sesuai dengan ketebalan sayatan yang diinginkan. 3. 3. karena jika tidak maka akan menimbulkan korosi. Mikrotom Spencer Yaitu mikrotom dimana pada saat menyayat dapat menghasilkan pita sayatan yang panjang sehingga cocok untuk pembuatan preparat sayatan serial. 5. suatu mikrotom memiliki bagian-bagian terpenting yaitu : 1. Skala pengatur ketebalan sayatan. 4.Mikroteknik Secara umum. 2. Sebelum melakukan pemotongan. Pisau konkaf. biasanya terdapat di bagian kanan atas badan mikrotom. jenis-jenis mikrotom yang umum dikenal dan digunakan dalam mikroteknik adalah : 1. 3. 2. Posisi kedudukan pisau tetap sementara jaringan yang dilekatkan pada holder bergerak turun naik sehingga diperoleh sayatan yang umumnya berbentuk pita. Mikrotom sorong Sering digunakan pada metode paraffin dan umumnya digunakan dalam celloidin. Pisau mikrotom harus selalu dibersihkan setelah selesai dipakai. 2. Cara kerja mikrotom adalah proses pemotongan blok preparat dengan menggunakan mikrotom. Kedudukan jaringan diam sementara pisau bergerak maju mundur. Pegangan blok jaringan. merupakan komponen yang bisa menentukan kualitas sayatan. Pisau plane-edge (simple wedge razor). biasa digunakan untuk sayatan blok celloidin dan plastic. Dari beberapa jenis mikrotom yang ada. Mikrotom putar Umumnya dipakai pada metode paraffin. Pisau mikrotom. Mikrotom beku Digunakan untuk penyayatan yang tidak ditanam dalam paraffin maupun celloidin namun dibekukan dengan karbon dioksida ataupun Freon. yang harus dilakukan adalah .

Tempat duduk blok parafin beserta blok parafinnya kemudian diletakkan pada pemegangnya (holder) pada mikrotom dan dikunci dengan kuat. Letakkan kaca objek yang berisi pita parafin di atas hotplate dengan temperatur 4045C. Setelah melekat kaca objek digerakkan keluar dari waterbath dengan hati-hati agar pita parafin tidak melipat. Rekatkan blok paraffin pada holder dengan menggunakan spatula.. Persiapan Kaca Objek Kaca objek yang akan direkatkan preparat harus telah dicoated (disalut) dengan zat perekat seperti albumin (putih telur). simpan kaca objek berisi potongan parafin dan jaringan sampai saatnya untuk diwarnai. Setelah air kering dan pita parafin telah melekat dengan kuat. Persiapan sengkelit atau kuas. tempelkan pita parafin tersebut pada kaca objek yang telah dicoated dengan cara memasukkan kaca objek itu kedalam waterbath dan menggerakkannya ke arah pita parafin. Cara lainnya adalah dengan melewatkan kaca objek di atas api sehingga pita parafin melekat erat di atas kaca objek. Biasanya sudut kemiringan berkisar 20-30 derajat. Gerakkan blok preparat ke arah pisau sedekat mungkin dan potonglah blok preparat secara teratur dan ritmis. 6. 5. 2. Pisau mikrotom kemudian diletakkan pada tempatnya di mikrotom dengan sudut tertentu. Teknik pemotongan parafin yang mengandung preparat adalah sebagai berikut 1. 2. . 7. Persiapan Waterbath atau wadah berisi air hangat dengan temperatur 37-400C 4.Mikroteknik 1. biarkan selama beberapa jam. 3. gelatin atau tespa 3. Pita parafin yang mengandung jaringan lalu dipindahkan secara hati-hati menggunakan sengkelit atau kuas kedalam waterbath yang temperaturnya diatur 3740C dan biarkan beberapa saat hingga poita parafin tersebut mengembang. 8. Letak pisau mikrotom pada tempatnya dan atur sudut kemiringannya. Atur ketebalan potongan yang diinginkan. biasanya dipakai ketebalan antara 5-7 mikrometer. Letakkan tempat duduk blok paraffin beserta blok preparat pada tempatnya di mikrotom. Dengan menggunakan sengkelit atau kuas pita parafin ditempelkan pada kaca objek. Buang pita-pita parafin yang awal tanpa jaringan hingga kita mendapatkan potongan yang mengandung preparat jaringan. Setelah pita parafin terkembang dengan baik. Rekatkan blok parafin yang mengandung preparat pada tempat duduknya di mikrotom. Persiapan pisau mikrotom Pisau mikrotom harus diasah sebelum dipakai agar jaringan dapat dipotong dengan baik dan tidak koyak sehingga didapatkan jaringan yang baik. 4.

Mikrotom harus selalu diminyaki untuk mencegah keausan dan kemacetan.Mikroteknik Mikrotom sebaiknya ditutup dengan plastik. sebaiknya mikrotom dibersihkan dari serpihan parafin dengan cara melap dengan kain lap yang telah dibasahi dengan xilol. karena dapat menggangu akurasinya. Jangan memindahkan mikrotom dengan cara memegang bagian yang dapat bergerak. atau dimasukkan ke kotaknya jika tidak sedang digunakan. . Sebelum dan sesudah digunakan.