Laporan Praktikum Kultur Jaringan

Hari / Jam : Senin, 13.00-16.00 Asisten : Zainati Fakhrina G34054029

KULTUR JARINGAN

Disusun Oleh : 1. Linda Sugiarti G34070053 2. Ikra Alma Khudra G34070065

DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS ILMU PENGETAHUAN ALAM DAN MATEMATIKA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010

Pendahuluan Kultur jaringan adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti sekelompok sel atau jaringan yang ditumbuhkan dengan kondisi aseptik di dalam botol kultur dengan medium dan kondisi tertentu, sehingga bagian tanaman tersebut dapat memperbanyak diri tumbuh menjadi tanaman lengkap kembali. Yang menjadi dasar kultur jaringan ini adalah teori totipotensi sel dimana setiap sel organ tanaman akan mampu tumbuh menjadi tanaman yang sempurna jika ditempatkan di lingkungan yang sesuai. Metode perbanyakan tanaman secara in vitro dapat dilakukan melalui tiga cara, yaitu melalui perbanyakan tunas dari mata tunas apikal, melalui pembentukan tunas adventif, dan embriogenesis somatik, baik secara langsung maupun melalui tahap pembentukan kalus. jaringan yang digunakan sebagai eksplan dalam pengerjaan kultur jaringan adalah jaringan muda yang belum mengalami diferensiasi dan masih aktif membelah (meristematik) sehingga memiliki kemampuan regenerasi yang tinggi ditemukan pada tunas apikal, tunas aksiler, bagian tepi daun, ujung akar, maupun kambium batang. Selain itu bisa juga jaringan parenkima, yaitu jaringan penyusun tanaman muda yang sudah mengalami diferensiasi dan menjalankan fungsinya. Contoh jaringan tersebut adalah jaringan daun yang sudah berfotosintesis dan jaringan batang atau akar yang berfungsi sebagai tempat cadangan makanan. Meode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman khusunya untuk tanaman yang sulit dikembangkan secara generatif. Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga tidak terlalu membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang relatif singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan konvesional.

Tujuan Tujuan dari praktikum ini antara lain adalah mengetahui cara pembuatan kultur (murashige - skoog), mempelajari metode kultur kalus embrio padi dengan media MS + 2,4D (2ppm), mengetahui cara sterilisasi eksplan ruas batang jarak (Jatropa curcas) dan daun tembakau (Nicotina tabacum), mengetahui subkultur tanaman anggrek (Jika contoh tumbuhan anggrek atau nenas), dan mengetahui stek batang tanaman Krisan. Alat dan Bahan Alat yang digunakan adalah LAFC, peralatan kutur, bunsen, cawan petri, dan korek api. Bahan yang digunakan pada praktikum yang ada adalah media MS+2,4D, MS+BAP 0,5 mg / l, media MS+IAA/NAA 0,1 mg/l. Bahan eksplan yang dipakai adalah tanaman nenas, tiga bulir padi, daun tembakau dan batang tanaman krisan.

Metode Pembuatan Medium Murashige dan Skoog (MS). Labu ukur 1 liter diisi sepertiganya dengan aquades, lalu satu per satu larutan baku ditambahkan sebanyak yang tercantum dalam tabel. Campuran diaduk setiap kali penambahan larutan baku. Sukrosa dan bahan lainnya ditimbang sesuai keperluan dan ditambahkan ke dalam labu ukur kemudian diaduk sampai larut seluruhnya. Aquades ditambahkan sampai volume total mencapai 1 liter. Campuran dipindahkan ke dalam Erlenmeyer besar kemudian sambil diaduk ditetesi dengan larutan NaOH hingga tercapai kisaran pH 5,6-5,8. Setelah campuran medium diukur pH-nya ditambahkan agar 6-8 gr/l medium dan diaduk sampai merata kemudian dipanaskan sampai mendidih sambil diaduk. Medium dituangkan ke dalam botol kultur sebanyak yang diperlukan. Botol ditutup dengan plastik dan diikat dengan karet. Setelah itu, botol dimasukkan ke dalam autoklaf untuk disterilisasi selama 30 menit pada suhu 121oC, tekana 15 psi. Kemudian, media

didinginkan di suhu ruangan dan disimpan dalam lemari di ruang khusus sampai saatnya diperlukan untuk digunakan. Induksi kalus Padi dengan media MS+2,4-D. Embrio padi dikupas kulitnya kemudian disterilisasi dengan campuran bayclin, aquades dan tween. Eksplan direndam dalam campuran bayclin sebanyak 80 mL, aquades sebanyak 20 mL dan tween sebanyak 2 tetes selama 20 menit. Kemudian eksplan dicuci dengan aquades steril sebanyak tiga kali. Sterilisasi dilakukan didalam LAFC (Laminar Air Flow Cabinet)yang telah di beri sinar UV. Embrio padi yang sudah disterilisasi kemudian dimasukan dalam media yang telah disiapkan. Kemudian disimpan dalam ruang kultur dan diamati induksi kalus yang terjadi selama 4 minggu. Sterilisasi Daun Tembakau. Eksplan berupa daun tembakau dicuci dengan air hingga bersih. Sehelai daun tembakau dibagi menjadi tiga bagian. Setiap potongan direndam dalam detergen dalam 100 mL air selama 5 menit, kumudian cuci dengan air kran. Setelah itu rendam lagi dalam campuran larutan agrept 0,5 gr dan dithane 0,5 gr dalam 500 mL air. Kemudian dibilas dengan air kran di dalam laminar potongan daun direndam dalam bayclin 5 % selama 5 menit kemudian dibilas dengan aquades steril sebanyak 3 kali. Direndam lagi dalam bayclin 10% selama 10 menit. Potong eksplan 1 x 1 cm dan ditaruh dalam media dengan posisi bagian bawah daun menempel pada permukaan media. Teknik subkultur Anggrek. Tanaman anggrek yang sebelumnya telah ditanam dengan teknik kultur jaringan disiapkan dalam laminar. Tanaman anggrek tersebut dipotong sebanyak yang diperlukan kemudian dipindahkan ke dalam media baru yaitu media MS + BAP 0,5 + IAA 0,1. Pekerjaan dilakukan diruang laminar. Kemudian tanaman disimpan dalam ruang kultur dan diamati pertumbuhan serta perkembangannya selama 4 minggu. Efek zat pengatur tumbuh Auksin (IAA dan NAA) terhadap pertumbuhan krisan. Media MS yang sudah ditambahkan zat pengatur tumbuh IAA atau NAA disiapkan. Satu ruas batang tanaman krisan dengan satu cabang dipotong dan ditanam dalam media yang diberi IAA atau NAA. Pekerjaan dilakukan di ruang laminar. Kemudian tanaman disimpan dalam ruang kultur dan diamati pertumbuhan serta perkembangannya selama 4 minggu.

Efek zat pengatur tumbuh Sitokinin (Kinetin dan BAP) terhadap pertumbuhan krisan. Media MS yang sudah ditambahkan zat pengatur tumbuh Kinetin atau BAP disiapkan. Satu ruas batang tanaman krisan dengan satu cabang dipotong dan ditanam dalam media yang diberi Kinetin atau BAP. Pekerjaan dilakukan di ruang laminar. Kemudian tanaman disimpan dalam ruang kultur dan diamati pertumbuhan serta perkembangannya selama 4 minggu.

Hasil

Gbr.1 Tanaman padi

Gbr 2. Tanaman nanas

Gbr 3. Tanaman Tembakau

Gbr 4. Tanaman Krisan dengan penambahan auksin

Gbr 5. Tanaman Krisan dengan penambahan BAP Pembahasan Komposisi media yang digunakan dalam kultur jaringan dapat berbeda komposisinya. Perbedaan komposisi media dapat mengakibatkan perbedaan pertumbuhan dan perkembangan eksplan yang ditumbuhkan secara in vitro. Media Murashige dan Skoog (MS) sering digunakan karena cukup memenuhi unsur hara makro, mikro dan vitamin untuk pertumbuhan tanaman. Nutrien yang tersedia di media berguna untuk metabolisme, dan vitamin pada media dibutuhkan oleh organisme dalam jumlah sedikit untuk regulasi. Pada media MS, tidak terdapat zat pengatur tumbuh (ZPT) oleh karena itu ZPT ditambahkan pada media (eksogen). ZPT atau hormon tumbuhan berpengaruh pada pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Interaksi dan keseimbangan antara ZPT yang diberikan dalam media (eksogen) dan yang diproduksi oleh sel secara endogen menentukan arah perkembangan suatu kultur. Penambahan hormon tumbuhan atau zat pengatur tumbuh pada jaringan parenkim dapat mengembalikan jaringan ini menjadi meristematik kembali dan berkembang menjadi jaringan adventif tempat pucuk, tunas, akar maupun daun pada lokasi yang tidak semestinya. Proses ini dikenal dengan peristiwa dediferensiasi. Dediferensiasi ditandai dengan peningkatan aktivitas pembelahan, pembesaran sel, dan perkembangan jaringan. Embrio pada prinsipnya berada dalam keadaan steril. Hal ini disebabkan karena embrio berada di dalam buah (di dalam biji) terlindung oleh jaringanjaringan buah dan biji yang berada di luar embrio, antara lain oleh kulit buah, daging buah dan kulit biji. Keadaan ini menyebabkan sterilisasi embrio tidak perlu dilakukan. Sterilisasi permukaan perlu dilakukan pada buah ataupun biji untuk

mensterilkan permukaan buah/biji sehingga pada waktu isolasi embrio tidak terdapat sumber kontaminan. Karena embrio berada di dalam, sterilisasi dapat dilakukan dengan pembakaran buah/biji atau dengan sterilan kimia seperti sodium hypochlorite dengan konsentrasi cukup tinggi (>2 %). Percobaan pertama menggunakan eksplan tanaman padi untuk menumbuhkan embrio dari bulir padi yang dikulturkan. Percobaan berhasil dilakukan, dimana seminggu setelah percobaan didapatkan embrio padi yang telah tumbuh. Foto hasil percobaan memperlihatkan dari tiga eksplan bulir padi yang dikulturkan, dua diantaranya tumbuh dengan baik sementara eksplan yang terakhir mengalami kontaminasi. Hal ini disebabkan karena beberapa hal, antara lain karena adanya organisme kecil yang masuk ke dalam media, Botol kultur atau alat-alat tanam yang kurang steril, Lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor (spora di udara), Kecerobohan dalam pelaksanaan. Kalus adalah suatu jaringan yang tersusun oleh sel-sel terdediferensiasi yang umumnya dihasilkan oleh jaringan yang luka atau kultur jaringan pada media yang berisi auksin tertentu atau Pertubuhan aktif massa sel yang belum dan terdiferensiasi dan tidak terorganisir yang berkembang dari jaringan luka atau kultur jaringan yang ditanam pada media dengan tambahan zat pengatur tumbuh. Kultur kalus (callus culture), merupakan kultur yang menggunakan jaringan (sekumpulan sel) biasanya berupa jaringan parenkim sebagai bahan eksplannya. Pucuk-pucuk yang terbentuk dari jaringan kalus, terutama yang sudah mengalami subkultur, dapat bervariasi. Sel-sel penyusun kalus berupa sel parenkim yang mempunyai ikatan yang renggang dengan sel-sel lain. Kalus mempunyai pertumbuhan yang abnormal dan berpotensi untuk berkembang menjadi akar, tunas dan embrioid yang nantinya akan dapat membentuk plantlet. Keseimbangan nutrisi dalam media tumbuh sangat mempengaruhi pertumbuhan kalus maupun diferensiasinya membentuk tunas (Purnamaningsih 2006). Percobaan selanjutnya menggunakan tembakau dan batang jarak sebagai eksplan untuk menginduksi pertumbuhan kalus. Namun, dalam percobaan ini yang digunakan oleh kelompok kami hanyalah daun tembakau. Daun tembakau terlebih dahulu harus disterilisasi karena banyaknya mikroorganisme yang berasal dari udara. Hasil dari percobaan

ini menunjukan adanya kontaminasi yang disebabkan oleh proses sterilisasi yang kurang sempurna. Percobaan ketiga adalah multifikasi tunas dengan menggunakan tanaman nenas sebagai eksplan. Hasil percobaan menujukkan terdapat pertumbuhan tunas aksilar pada eksplan. Hal ini menunjukkan bahwa percobaan berhasil dilakukan. Multifikasi ini bertujuan untuk menggandakan propagul atau bahan tanaman yang diperbanyak seperti tunas atau embrio. Kemampuan multifikasi akan meningkat apabila biakan disubkultur berulang kali, namun subkultur juga dapat meningkatkan terjadinya mutasi. Untuk itu biakan perlu diistirahatkan pada media tanpa zat pengatur tumbuh. Zat pengatur tumbuh adalah senyawa organik komplek alami yang disintesis oleh tanaman tingkat tinggi, yang berpengaruh pada pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Dalam kultur jaringan, ada dua golongan zat pengatur tumbuh yang sangat penting adalah sitokinin dan auksin. Zat pengatur tumbuh ini mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur sel, jaringan dan organ (Wattimena, G.A. 1992). Auksin digunakan secara luas dalam kultur jaringan untuk merangsang kalus, suspensi sel dan organ. Auksin alamiah adalah Indola Acetic Acid (IAA), Level auksin dalam eksplan, tergantung dari bagian tanaman yang diambil dan jenis tanamannya. Selain itu juga dipengaruhi oleh musim dan umur tanamannya. Dalam kultur in vitro ada sel-sel yang dapat tumbuh dan berkembang tanpa auksin seperti sel-sel tumor. Sel-Sel ini disebut sel-sel yang habituated. Percobaan selanjutnya mengenai pengaruh efek auksin (IAA dan NAA) pada tanaman krisan. Hasil foto menunjukkan keberhasilan dalam percobaan ini, dimana tanaman krisan tumbuh tanpa adanya kontaminasi. Pengaruh IAA maupun NAA merangsang pemanjangan sel. Sel-sel meristem pada kultur kalus dan kultur organ juga tumbuh berkat pengruh auksin, namun auksin yang dibentuk pada meristem apikal dan ditransport dibawah menghambat perkembangan tunas ketiak atau lateral. Golongan sitokinin adalah turunan dari adenine. Golongan ini sangat penting dalam pengaturan pembelahan sel dan morfogenesis. Seperti juga auksin, sitokinin ada yang alamiah dan sintetis. Sitokinin yang ditambahkan ke dalam media untuk krisan, merangsang pembelahan sel dan differensiasi sel. Hal ini

terlihat dari hasil percobaan terakhir yang menggunakan BAP dan Kinetin pada tanaman krisan. Eksplan yang dikulturkan pada media menggunakan BAP menghasilkan tunas dalam jumlah banyak jika dibandingkan dengan eksplan yang ditumbuhkan pada media yang mengandung kinetin. Pada perlakuan ini eksplan berhasil membentuk batang dalam beberapa jumlah daun tetapi tidak membentuk akar. Sitokinin mempunyai dua peran yang penting untuk propagasi secara in vitro yaitu merupakan perangsang pembelahan sel dalam jaringan yang dibuat eksplan dan merangsang pertumbuhan tunas daun, namun demikian, kadar sitokinin yang optimal untuk pertumbuhan tunas, dapat menghambat pertumbuhan dan pembentukan akar. Karena itu, konsentrasi dari sitokinin yang dipakai harus sesuai sehingga tidak menghambat pertumbuhan dari eksplan (Wetherel 1988). Simpulan Teknik kultur jaringan secara in vitro dapat digunakan sebagai cara untuk mendapatkan atau memperbanyak tanaman. Tingkat keberhasilan kultur jaringan ditentukan oleh bagian tanaman yang digunakan, medium yang digunakan serta pemberian zat pengatur tumbuh. Percobaan pertumbuhan embrio padi, multifikasi tunas nenas, dan pengaruh IAA & NAA dan BAP & kinetin pada krisan berhasil dilakukan dan tidak terdapat kontaminasi, sementara pada eksplan daun tembakau terjadi kontaminasi. Saran Saran yang dapat diberikan untuk praktikum ini antara lain praktikan seharusnya dapat menjaga keaseptikan selama bekerja dengan LAF dan ketika masuk ke dalam ruangan agar eksplan-eksplan yang dikulturkan dapat tumbuh dengan baik dan tidak mengalami kontaminasi. Selain itu ketika praktikum dilaksanakan sering terdapat bahan-bahan atau alat yang tidak memadai seperti alkohol untuk desinfektan dan silk penutup eksplan yang tidak ada.

Daftar Pustaka Purnamaningsih, R. 2006. Induksi Kalus dan Optimasi Regenerasi Empat Varietas Padi melalui Kultur In Vitro. Jurnal AgroBiogen 2(2):74-80. Wattimena, G.A. 1992. Zat Pengatur Tumbuh Tanaman. Bogor: Laboratorium Kultur Jaringan PAU Bioteknologi. IPB. Wetherel, D.F. 2008. Propagasi Tanaman Secara In Vitro. New Jersey: Avery Publishing Group Inc.