Tugas Makalah Praktikum Biologi Sel dan Molekuler

Prosedur Praktikum Biologi Sel dan Molekuler untuk Prodi Pendidikan Biologi S2
Oleh:

Weni Astari Widia Ningsih Yovanna M.Daniel

8116174017 8116174018 8116174019 8116173011

Pendidikan Biologi B

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS NEGERI MEDAN 2011

i

DAFTAR ISI

Daftar isi ...................................................................................................... i Kata Pengantar……………………………………………………………..ii BAB I Pendahulan ..................................................................................... 1 BAB II Prosedur Praktikum Biologi Sel Dan Molekuler ........................ 2 A. Hubungan Struktur dan Fungsi Sel ................................................. 2 B. Komponen Sel ................................................................................. 3 C. Pengamatan Pembelahan Mitosis.................................................... 4 D. Isolasi DNA Plasmid ....................................................................... 6 E. Retriksi DNA Plasmid .................................................................... 10 F. Elekrtroforesis Gel Agragosa .......................................................... 14 G. Transformasi Sel E.Coli JM 109 ..................................................... 17 BAB III Penutup ......................................................................................... 21 Daftar Pustaka ............................................................................................. 22

Akhirnya. Oleh karena itu penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada ibu Dra. mudah-mudahan amal kebaikan kita semua diterima oleh Allah SWT. baik terkait dengan studi literatur atau pustaka sebagai pendahuluan. M. sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas makalah mata kuliah Praktikum Biologi Sel dan Molekuler mengenai “Praktikum Biologi Sel dan Molekuler mengenai Prodi Pendidikan Biologi S2”. Penulis . yang telah memberikan Taufik dan hidayah-Nya.Si selaku dosen pembimbing mata kuliah : Praktikum Biologi Sel dan Molekuler dan teman-teman PPs Pendidikan Biologi Angkatan 2011. Amin. Uswatun Hasanah. Adapun informasi ilmiah yang mendukung penyusunan makalah ini.ii KATA PENGANTAR Syukur Alhamdulillah. penulis sampaikan puji dengan syukur kehadirat Allah SWT. Namun penulis pada akhirnya menyadari bahwa tugas akhir ini belum sempurna banyak sekali keterbatasannya. dihimpun dari sejumlah referensi meliputi hal-hal yang berkaitan dengan teknologi dalam biologi molekuler dan segala aspek yang berkaitan dengan hal tersebut. maupun teori dan metodologi yang masih terbatas.

Elektroforesis Gel Agragosa. Pada praktikum biologi molekuler ini menggunakan teknik.teknik tersebut dengan teknik dan gagasan dari genetika dan biokimia. dan biologi molekuler itu sendiri telaah dalam skala molekul atas proses replikasi.proses vital yang berlangsung pada makhluk hidup. Semakin banyak bidang biologi laiinnya yang memfokuskan diri pada molekul . Genetika. Pengamatan Pembelahan Mitosis. transkripsi.BAB I PENDAHULUAN Praktikum Biologi Sel dan Molekuler di peroleh Mahasiswa S2 Prodi Pendidikan Biologi pada semester pertama sebagai mata kuliah wajib yang seiring berjalan dengan mata kuliah teori Biologi Sel dan Molekuler.disiplin ilmu ini seperti sebelumnya.telaah zat kimia dan proses. . dan translasi bahan genetik. Tidak terdapat lagi garis tegas yang memisahkan disiplin. Komponen sel. Isolasi DNA Plasmid.telaah atas efek perbedaan genetic pada makhluk hidup (misalnya telaah mengenai mutan).Coli JM 109. Secara umum keterkaitan bidang.bidang tersebut dapat digambarkan ssebagai berikut.cirri historis populasi atau spesies) seperti pada genetika populasi dan filogenetika. Retriksi DNA Plasmid.teknik khusus yang khas pada biologi molekuler. baik secara langsung mempelajari interaksi molecular dalam bidang mereka sendiri seperti pada biologi sel dan biologi perkembangan. maupun secara tidak langsung (misalnya dengan menggunakan teknik biologi molekuler untuk menyimpulkan cirri. namun kini semakin memadukan teknik.. Transformasi Sel E. Biokimia. Adapun materi praktikum Biologi Sel dan Molekuler ini meliputi pengamatan terhadap Hubungan Fungsi dan Struktur Sel.

Dari kupu-kupu hingga kanguru.Sel meskipun memiliki ukuran sangat kecil. Namun sel pada setiap makhluk hidup tidaklah sama.sel penyusun jaringan dari Akar.BAB II PROSEDUR PRAKTIKUM BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER A. dan daun Zea mays Menganalisis hubungan struktur dan fungsi sel. dan ada makhluk hidup yang tersusun lebih dari satu sel. 2. HUBUNGAN STRUKTUR DAN FUNGSI SEL 1.ciri seperti makhluk hidup juga dapat tumbuh. dan daun Zea mays . Sel hidup memiliki ciri.masing organ berbeda.kupu. Sel adalah unit struktural dan fungsional terkecil dari makhluk hidup.masing organ pada tumbuhan mempunyai struktur yag berbeda. menghasilkan energi.lumba dengan sel mawar? dan apa perbedaannya. bahkan mereka sangat berbeda. disebut organisme multiseluler. Masing. batang. Sebagai bahan pertimbangan apakah bakteri memiliki kesamaan dengan sel kupu. disebut organisme uniseluler. batang. hal ini karena fungsi dari masing. sel dikatakan sebagai unit dasar kehidupan. Makhluk hidup ada yang tersusun dari satu sel saja. Fungsi dari suatu bagian sel atau jaringan dapat di indikasikan dari struktur sel/ jaringan pada suatu organ tersebut. metabolism. sel lumba. reproduksi. merespon terhadap lingkungan mereka dan seterusnya.beda. dari pohon kelapa hingga cemara semua tersusun atas sel. sel tergolong luar biasa. Tujuan Mengamati struktur anatomi preparat dari Akar. Landasan Teori Semua makhluk terdiri dari sel.

susunan. Sel bagian hidujuga dikatakan sebagai kesatuan struktur fisiologi yang terkecil dari organism hidup. Pada dasarnya sel tumbuhan terdiri dari protoplas yang dikelilingi dinding sel. Komponen protoplasmic ada yang bersifat cair yaitu sitoplasma Sitoplasma metupakan substansi setengah cair lebih pekat (viscous) dari air dan bening (tembus cahaya: transculent). 1980). Biasanya dinding sel di anggap bagian mati sedangkan protoplas adalah bagian hidup dari sel. Sitoplasma memenuhi . didalamnya terjadi reaksi. Landasan Teori Sel merupakan unit dasar umum dari struktur organic. parenkim.3. KOMPONEN SEL 1. jaingan penguat) b) Analisis mengenai struktur dan fungsi sel-sel penyusun jaringan di atas B. Sel tumbuhan diartikan sebagai suatu kehidupan kecil yang membatasi batas nyata atau dinding sel. batang. Alat dan Bahan Alat a) Mikroskop b) Silet Bahan a) Akar.reaksi kimia yang rumit (Pandey. Prosedur Kerja 1) Membuat irisan penampang melintang dari semua bahan 2) Mengamati struktur anatomi ketiga preparat : a) Bentuk. Protoplas terdi dari komponen protoplasmic dan non protoplasmic. ciri khas dari sel-sel penyusun setiap jaringan pada preparat tersebut (epidermis. sehingga sukar dilihat oleh mata meskipun telah menggunakan mikroskop. jaringan pengangkut. dan daun Zea mays 4.

metafase. batang bayam.bahan hasil meabolisme sel (Suryani. Fase. dan telofase.ruangan sel hidup dan didalamnya terdapat organel. garam. Landasan Teori Mitosis adalah proses pembelahan sel yang terjadi baik pada sel hewan maupun sel tumbuhan. 2. Ujung bagian akar bawah terbagi tiga daerah yaitu: daerah meristem perpanjangan sel dan daerah diferensiasi. Pembelahan ini penting untuk pertumbuhan serta menjaga agar jumlah kromososm sel induk sama dengan sel anak (2n-2n). dan zat pewarna. alkaloid. Alat dan Bahan : Alat a) Mikroskop b) Silet Bahan c) Umbi kentang.bahan ergastik. yaitu bahan. Pada akar Allium cepa yaitu pada bagian ujungnya. protein. Di dalam vakuola bisa terlarut berbagai zat seperti gula. Bahan. Prosedur Kerja 1) Buat irisan penampang melintang pada semua bahan 2) Amati beberapa buah sel pada setiap jaringan penyusun organ tumbuhan 3) Amati komponen-komponen sel yang terlihat dengan mikroskop yang ada C.bahan yang terdapat di dalam vakuola digolongkan sebagai bahan. PENGAMATAN PEMBELAHAN MITOSIS 1. 2008).fase pembelahan mitosis dapat dilihat pada daerah meristem ujung akar Allium cepa. .organel serta vakuola. daun bunga pukul empat 4. bila diwarnai dapat diliha beberapa stadium pembelahan mitosis yaitu propase. Tujuan Mengamati komponen sel baik komponen yang hidup atau yang tidak hidup dalam sebuah sel 3.

Mikroskop 2. 2. Kertas Hisap 4. Fenil Lakto Fenol 4. Pembakar bunsen / lampu spiritus 8. Prosedur Kerja 1. Pindahkan potongan aakar bawang yang sudah dipanaskan ke gelas objek dan beri satu tetes asetokarmin biarkanlah lebih kurang 30 menit. Asam Klorida (HCl) 3. tetapi jangan sampai mendidih 4. Cawan petri 6. Potong akar bawang sepanjang 1 cm kemudian rendam pada asetokarmin dan HCl dengan perbandingan 9 : 1 3. Silet Bahan 1. Gelas piala 500 ml 7. . Panaskan preparat tersebu di atas api bunsen atau lampu spiritus sampai menguap. Gelas objek 3. 3. Hisaplah kelebihan asetokarmin dengan kertas hisap. Tujuan Mengetahui kedudukan kromosom pada fase. Asetokarmin 2. Alat dan Bahan Alat 1.fase pembelahan mitosis pada akar Allium cepa. Akar bawang 5. Tetesi preparat tersebut dengan polienil alkohol (Fenil Lakto Fenol) di sampingnya (jangan kena preparat). Jarum preparat 5. 6. Gelas penutup 4. Rendam bawang pada air dalam gelas biarkan selama 2-3 hari. 5.2.

Bunsen burner 2. interferon. 2. D. Landasan Teori Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot.). Tujuan Melihat cara kerja isolasi DNA plasmid 3. DNA plasmid mengalami duplikasi sebelum pembelahan sel inang. sehingga dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. coli sebagai host. Penggunaan plasmid dalam DNA rekombinan dilakukan karena plasmid memiliki tiga region yang berperan penting untuk DNA kloning. dan berbagai enzim. ISOLASI DNA PLASMID 1.7. Plasmid biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan menggunakan E.hati gelas penutup jangan sampai pecah) 8. Tutup dengan gelas penutup kemudian di tekan dengan menggunakan pensil sampai preparat pipih (hati. Cawan petri . Alat dan Bahan Alat 1. yaitu : a replication origin. tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri. khususnya bakteri dan sel eukariotik tingkat rendah misalnya yeast. marker yang memungkinkan adanya seleksi (biasanya gen resisten antibiotik) dan region yang mampu disisipi oleh fragmen DNA dari luar (Lodish et al. Amati di bawah mikroskop 9. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin.

DNA vektor pUC19 diisolasi menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen. Ampisilin 2. USA). Pelet sel bakteri diresuspensi dengan 250 µl Buffer P1 sampai homogen. Kultur bakteri hasil inkubasi 16 jam sebanyak 3 ml diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5. Tip micropipette segala ukuran (Bio=Rad dan Axygen Scientific). Erlenmeyer 100 ml 7. Medium Luria Bertani (LB) agar dan LB cair. Refrigerator 10. Jarum ose 6. QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen. Freezer 4. Prosedur Kerja 1. Micropipette segala ukuran 9. 4. Es batu 4. 5. 5. 2.700 x g selama 5 menit. E. Spidol marker 12.Coli JM109 yang mengandung plasmid pUC19 3. Pelet sel diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dan disentrifugasi dengan kecepatan 5. Glove 5. Microcentrifuges 5415D (Eppendorf) 8.3. Koloni tunggal bakteri JM transforman pUC19 dinokulasikan ke 25 ml medium LB cair dan diinkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (semalam). . Shaker incubator 11. Tube microsentrifuge Bahan 1. 3. 13. USA) 4.700 x g selama 5 menit.

Cairan yang melewati QIAprep spin column dibuang. 10. dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi pertama).900 x g) selama 10 menit. Suspensi selanjutnya ditambah 350 µl N3 dan diresuspensi dengan cara yang sama sehingga warna suspensi kembali seperti warna awal. QIAprep spin column dicuci dengan 500 μl PB dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit. 7. Suspensi yang dihasilkan akan berubah warnanya menjadi biru. dan ke dalam QIAprep spin column ditambahkan kembali 750 μl buffer PE. . Supernatan yang dihasilkan dipindah dengan cara memipet ke dalam collection tube yang dilengkapi dengan QIAprep spin column dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000 rpm (17. Tabung mikrosentrifuga beserta QIAprep spin column disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi kedua). 15. 8. Cairan yang melewati membran dibuang dan QIAprep spin column dimasukkan kembali ke dalam tabung mikrosentrifuga. 16. 13.5 ml yang lain dan ditambah dengan 50 μl buffer EB. Tahap selanjutnya tabung mikrosentrifuga disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm (17.900 x g) selama satu menit. Cairan yang melewati QIAprep spin column kembali dibuang dan disentrifugasi ulang untuk menghilangkan sisa buffer pencuci. 14. Suspensi ditambah 250 µl Buffer P2 dan diresuspensi kembali dengan cara dibolak-balik sebanyak 4-6 kali.5 ml baru dan ditambah dengan 50 μl buffer EB. dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1. 9.6. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1. 12. 11.

shaker 150 rpm.000 rpm. 1' 13.Skema kerja Isolasi DNA Plasmid menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen.000 rpm.000 rpm. 1' .000 rpm. 1' Sp dipinda h Sentrifugasi 13.coli transforman pUC19 25 ml LB Inkubasi 370C. 16 jam 1 Cairan dibuan g Sp dibuan g Sentrifugasi 5. 5' Kolom pindah + 500 µl Buffer PB Sentrifugasi + 50 µl Buffer EB Sentrifugasi 13. + 1 ml STE resuspensi 5' Sentrifuga si 5000 rpm. 5' Sentrifugasi 13.000 rpm. 1' Sentrifugasi 13. USA) @ 3 ml E. bolak balik + 250 µl Buffer P2 Bolak-balik sebentar Warna mjd BIRU + 350 µl Buffer N3 Bolak-balik sebentar Warna BIRU hilang + 750 µl Buffer PE Sentrifugasi DNA plasmid Cairan dibuan g 13. 1' Sp dibuan g Cairan dibuan gg + 250 µl Buffer P1 Resuspensi (vortex.700xg (5000 rpm).000 rpm.

GAATTC merupakan sisi pengenalan EcoRI. EcoRI dan PstI dapat memotong masing-masing strand DNA. Molekul DNA rekombinan dapat diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang memiliki daerah pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom. Enzim restriksi dengan sekuens . Sisi restriksi tersebut biasanya berupa pas. kompatibiliti terhadap kondisi reaksi. Enzim – enzim restriksi yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan berasal dari beberapa bakteri. Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian dapat berasosiasi dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain yang juga telah dipotong dengan enzim restriksi.). yaitu : ukuran fragmen. Enzim restriksi akan mengenali sisi restriksi suatu fragmen DNA yang biasanya terdiri atas 4 – 8 pasang basa. Pemilihan enzim restriksi untuk pemotongan fragmen DNA pada suatu teknologi DNA rekombinan didasarkan pada beberapa hal. RESTRIKSI DNA PLASMID 1. Landasan Teori Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu organisme dalam jumlah besar. Manipulasi pemotongan DNA dilakukan oleh enzim yang disebut endonuklease restriksi.angan basa palindrom. misalnya BamHI yang diperoleh dari Bacillus amyloliquefaciens memiliki sisi pengenalan yang akan memotong pada basa G nomor 2 dari tepi masing – masing strand (Lodish et al. Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA).E. namun biasanya enzim restriksi akan memotong pada ujung yang berbeda pada 2 strand sehingga menghasilkan sisi lengket (sticky ended). Beberapa enzim seperti BamHI. sensitivitas terhadap metilasi. AGCT merupakan sisi pengenalan AluI. Sisi pengenalan enzim restriksi tersebut berbeda – beda pada suatu fragmen DNA. blunt-ended atau sticky-ended fragment. Enzim restriksi akan memotong fragmen DNA di ujung yang sama pada 2 strand (blunt ended).

Apabila terdapat 2 enzim yang cocok untuk suatu reaksi yang sama maka kedua enzim ini dapat ditambahkan pada reaksi dengan reaksi bufer dan suhu yang sama (Anonim. Komponen enzim ditambahkan terakhir pada saat pembuatan master mix (Anonim. buffer dan enzim. Metilasi biasanya terjadi pada DNA mahluk hidup dan bervariasi polanya sehingga dibutuhkan enzim restriksi yang cocok untuk DNA yang mengalami metilasi dengan pola tertentu. Korea) . Spidol marker 6.pengenal lebih pendek akan menghasilkan lebih banyak potongan fragmen DNA. Alat dan Bahan Alat 1. Glove 3. Volume di bawah 10 µL tidak dianjurkan karena memiliki kemungkinan yang sangat besar untuk terjadinya kesalahan pipeting. 2007). Pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH. Sticky ended biasanya lebih efisien dalam ligasi sedangkan blunt ended biasanya dikenali oleh enzi khusus yang cocok dengan tipe pemotongan blunt ended. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 7. Tube microsentrifuge 8. Tujuan Melihat cara kerja pemotongan DNA plasmid 3. Microsentrifuge 5415D (Eppendorf) 5. Komponen reaksi (master mix)restriksi terdiri dari : air. Freezer 2. Volume akhir untuk komponen reaksi biasanya 10 – 50 µL. Micropipette segala ukuran 4. 2. DNA. 2007).

Prosedur Kerja 1. DNA plasmid pUC19 6. Campuran reaksi dihomogenkan sebentar menggunakan mikrosentrifuga selama 1-2 detik.Bahan 1. Pst I 4. 6. Optimasi reaksi restriksi sebelumya dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan DNA dapat terpotong sempurna dengan kondisi optimasi tersebut. ddH2O 5. larutan DNA hasil restriksi disimpan di dalam Freezer. 2. BSA 2. BSA sebayak 0. dan PstI sebayak 2 µl untuk vinal volume 50 µl. Hal ini dilakukan untuk inaktifasi enzim restriksi.5 µl. dengan komposisi Buffer E. Buffer H 4. 4. DNA dan PstI 3. DNA pUC19 sebayak 20 µl. Restriction enzyme of Hind III. Tabung mikrosentrifuga diketuk sebentar untuk memastikan campuran sudah tersuspensi. Es batu 7. BSA. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml sesuai dengan hasil optimasi reaksi restriksi. yaitu enzim PstI. Tabung mikrosentrifuga yang berisi campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu 37 0C selama 4 jam menggunakan pemanas air (Water Bath). Misalkan reaksi restriksi bekerja secara optimum dengan komposisi Buffer E sebanyak 5 µl. EcoRI. Buffer E 3. 7. tabung mikrosentrifuga selanjutnya diinkubasi pada suhu 70 0C selama 10 menit menggunakan Water Bath. 5. . Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml. Vektor pUC19 dipotong dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotongan DNA genom.

dg Water bath selama 4 jam Simpan di frezer Inaktifasi. 10 menit .Skema Kerja Restriksi DNA plasmid 1 2 3 4 5 6 7 P1 P2 P3 Spin sebentar. suhu 700C dg waterbath. 2” Ketuk-ketuk Inkubasi 37 0C.

Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. makin rendah laju migrasinya. ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA 1.000 pasang basa (bp). Landasan Teori Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Sarung tangan 5. Gelas Ukur 1000 ml 2. Tujuan Melihat cara kerja elektroforesis gel agarosa 3. 2010). Labu Erlenmeyer 50 ml 3. Kertas parafilm . Elektroforesis gel agarosa biasanya digunaka untuk analisis ukuran dan konformasi sampel DNA. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). 2.F. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Tabung mikrosentrifuga 4. Makin besar ukuran molekulnya. kuantifikasi DNA. pemisahan dan ekstraksi fragmen DNA (Anonim. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20. Alat dan Bahan Alat 1. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 6.

UV transluminator 10.7. 3. misalnya DNA λ yang dipotong dengan HindIII 6. Loading dye 6x (0.25% bromophenol blue. Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base.1 g asam asetat glacial. b. DNA plasmid hasil isolasi (uncut) c. misalnya : a. Akuades 5. DNA plasmid hasil restriksi (cut) 4. Agarosa 3. DNA kromosom bakteri. Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir menyentuh dasar baki . Larutan Etidium Bromid (EtBr) 2. Seperangkat alat elektroforesis 8. DNA marker. Sampel DNA. 0. Kaca mata UV 11. lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masingmasing ujung baki) 4. 57.25% xylene cyalol. EDTA 120 mM) 9. 15% ficoll tipe 4000. Kamera digital Bahan 1. Prosedur Kerja 1.5 M pH 8. 2. dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml) 4. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0. Buat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245 ml akuades. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna.2 g untuk dilarutkan ke dalam bufer TAE 1x hingga volume 20 ml. 100 ml EDTA 0. Siapkan baki gel agarosa.

13. 17. siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis.5. 6. aturlah voltase dan waktu running hingga diperoleh angka 70 V dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus. nyalakan UV transluminator. 9. nyalakan sumber arus. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis. 12. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar. keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas UV transluminator). ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya). 15. 8. masukkan 10 µl sampel DNA dan 2 µl loading dye 6x ke dalam sumuran gel agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet. biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat. 14. yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran. kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel agarosa. 10. 16. ambil sisir dengan hati-hati. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan. tambahkan 1 µl etidium bromid (PERINGATAN KERAS!!. jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60 0C. 11. 7. lepaskan selotip dari ujung-ujung baki. elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis. masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE). . gunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik). amati pita-pita DNA yang tervisualisasi. buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan. jika tidak demikian. jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus.

Strain E. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf) 6. coli tersebut akan berubah karena mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. TRANSFORMASI SEL E. termometer 3. coli hasil transforman mengandung plasmid dan salah satu ciri sel yang disisipi plasmid adalah resisten terhadap antibiotik (ampisilin). 2. coli disisipi vektor DNA rekombinan yang disisipkan ke dalam plasmid. maka untuk mendapatkan sel transforman cukup mudah yaitu dengan menumbuhkan sel hasil transformasi pada media yang mengandung ampisilin. E. Setelah diinkubasi. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 5. herbisida.G. sel tersebut akan memperbanyak diri sehingga jumlahnya menjadi banyak. pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH. karena fenotip strain E. shaker-incubator 2. coli JM109 1. Korea) . Teknologi ini digunakan dalam usaha memperoleh tanaman yang tahan terhadap infeksi bakteri. coli 3.coli. Apabila vektor DNA rekombinan telah terintegrasi dengan sel inang maka sel tersebut dapat dikatakan telah ditransformasi. Alat dan Bahan Alat 1. jamur. Transformasi dilakukan dengan menggunakan sel kompeten. coli biasanya digunakan sebagai sel kompeten. Sel E. Landasan Teori Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang bakteri misalnya bakteri E. Transformasi merupakan hal yang penting karena menghasilkan organisme rekombinan sesuai dengan gen yang disipkan pada vektor. Tujuan Praktikum ini bertujuan untuk melakukan transformasi pada sel E. Tabung mikrosentrifuga 4. Sel kompeten merupakan sel yang memiliki kemampuan untuk disisipi DNA dari luar.

coli JM 109 2. Prosedur Kerja 1. cawan Petri 10. es batu 4. Ltd. Inkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (semalam).700 x g selama 5 menit. Sebanyak 1. 2. coli JM 109 ke dalam media LB cair 25 ml. strain E. media LB cair 3. batang drugalsky 9. atau dengan kata lain perbandingan antara volume media dan volume kultur 10:1. Kultur semalam strain E. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 μl CaCl2 dingin.5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5. media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG 5.) 12. media cawan LB ampisilin dan media cawan LB tanpa ampisilin 4.700 x g selama 5 menit.7. . coli JM 109 hasil inkubasi semalam ke media LB cair 25 ml dengan cara mengambil 250 μl kultur E. Erlenmeyer 11. coli JM 109 dikultivasi ke media LB cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni strain E. coli JM 109 ke media LB cair. Bahan 1. 4. shaker-incubator tipe EFM-60 (Seiwa Rico. 3. jarum ose 8. kemudian dilakukan inkubasi dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm selama 120 menit (2 jam) pada suhu 37oC. kamera digital. Pindahkan kultur E. diresuspensi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5.

5 jam. 7. Sementara itu. dua diantaranya untuk inkubasi 2 jam dan 3 lainnya untuk inkubasi 16 jam. . Kedua tabung diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit. 11. sedangkan tabung nomor 2 tidak ditambah dengan palsmid. Inkubasi dilakukan selama 16 jam pada suhu 37oC. 6. dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37oC dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 1. ke dalam tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 16 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten. Selain itu. Tabung mikrosentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah inkubasi 10 menit.5. Dalam perlakuan ini terdapat lima tabung mikrosentrifuga. 8. dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator selama 1. 9. diresuspensi dan diinkubasi dalam es. Ketiga tabung mikrosentrifuga diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit dan diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik pada suhu 42oC dan segera dipindahkan ke es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit. ditambahkan 10 μl vektor pUC19 sirkuler untuk penentuan efisiensi transformasi (tabung nomor 3). salah satunya atau tabung nomor 1 ditambah dengan 10 μl palsmid pUC19 sirkuler.5 jam pada suhu 37oC. Tabung mikrosentrifuga selanjutnya ditambahkan dengan media LB hingga 1 ml. sebanyak 50 μl hasil inkubasi pada tabung nomor 2 ditumbuhkan juga pada media LB tanpa ampisilin. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten. Sebanyak 100 μl hasil inkubasi ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp untuk kedua tabung. kemudian diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik dengan suhu 42oC dan segera dipindahkan ke dalam es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit. 12. Supernatan dibuang kembali dan ke dalam tabung ditambahkan kembali 200 μl CaCl2 dingin. 10. 2 μl vektor pUC19 rekombinan (tabung nomor 4) dan tidak ditambahkan apapun (tabung nomor 5).

Efisiensi transformasi dihitung dengan cara sebagai berikut Dimana. 15. 18. Disiapkan media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG dengan cara menambahkan 50 μl X-Gal dan 100 μl IPTG ke media cawan LB/Amp. dan kemudian ditumbuhkan dengan cara plating ke media LB/Amp/X-Gal/IPTG. 16. Hasil inkubasi pada tabung no. coli dengan pUC19 sirkuler dilakukan penjumlahan koloni untuk diketahui efisiensi transformasinya. 14.700 x g selama 5 menit.13.5 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp sebanyak 100 μl dan ke media cawan LB sebanyak 50 μl. Hasil inkubasi tabung nomor 3 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG sebanyak 100 μl. Σkoloni = jumlah koloni putih (dalam cfu) [pUC19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng) . dilanjutkan dengan inkubasi selama 16 jam pada suhu 37oC. Tabung nomor 4 disentrifugasi dengan kecepatan 5. Supernatan dibuang hingga tersisa 100 μl. Untuk cawan yang berisi E. 17. lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama lebih kurang 30 menit.

dan Transformasi Sel E. . Retriksi DNA Plasmid. Hal tersebut menjadi kendala untuk dilaksanakan praktikum tersebut. Komponen Sel dan Pengamatan Pembelahan Mitosis. karena alat dan bahan merupakan faktot utama sebagai indikator berhasil atau tidakkah suatu praktikum. Adapun judul pengamatan Isolasi DNA Plasmid. Adapun judul praktikum yang dapat dilaksanakan yaitu Hubungan Struktur dan Fungsi Sel. Elektroforesis Gel Agragosa. karena jika salah satu alat/ bahan tidak ada maka paraktikum itu akan gagal secara keseluruhan. Setelah dilakukan konfirmasi dengan laboran banyak alat dan bahan yang tidak ada di laboratorium biologi S1.BAB III PENUTUP Pada praktikum Biologi Sel dan Molekuler ini.Coli JM 109 tidak dapat dilaksanakan karena kurang terfasilitasi alat dan bahan yang ada dilaboraotium Biologi S1. diperlukan alat dan bahan yang memadai di laboratorium.

Cicik. Praktikum Struktur Pertumbuhan II. Praktikum Genetika. 2008. 2010. 2009. (Bahan Referensi) Tim Biologi UNIMED. Laporan praktikum Biologi sel dan Molekuler S2 Bologi UNSOED.DAFTAR PUSTAKA Kurniawan. Soedirman . Suryani. Purwokerto: Program Pasca Sarjana Universitas Jenderal . Medan: FMIPA UNIMED. Medan: FMIPA UNIMED.

0   .07.907-..3203.355093 4254303032/9.3 . 803.2-. 70.2 209..3 5.3 .9  032 .7.8.9 /9.880/.8-:107/.703. 40 03 :8:8 . /03. 202 02:33.82/   ./.3 032  '4:20 ..3.7 .74803971:0 5503/471    $5/42..75.2-.. 03/0/ -.3.0-503/0.4 :39: 8:.8. 8.8.92745509-08079..8 2.3.953.32.8.3 .4..: /:5 /.9.5.7.3 70.317.8.3 950 5024943. /-:9:.9.8 /03.38::./3.5024943. 907.      . 032 3 /.9/.3 0.3.9 950    % 470. 3432    425430370. 0/:.8907 2 708978907/7 /.9: 70.3.3 203.3.707   $0507.8 -.3 032 708978 .50303.89072 3432      %::...3 ..38.303$.3 54.2.4 /03.9   70007   4.8 /03.7   -:1107 /..54943. 907/.38.4 :39:  .8 -.::7.7.3 . /.74803971:0   !02.9502-:.    %:-02. 9079039:  5. 4 #.4.2 .      a  '4:20 / -.35.3 8.  2.7 :39: 4254303 70.8 .3:7.-..3.3 -07.3.//.7 :39:907./.3 .30--.3...3./.0391.7455099080./ 5. 2.2.5.08.3 -:39 03/0/-.0- 01803 /.3   .4.8 54.203  $9.3907.3 -:39 03/0/  09.9 -08.  a9/.8.3.

3  2 808:..91.3.-:3 274803971:.907.3.32 /03.2.8 70.8 90780-:9  #0.89..7 .:.8 708978 -007.89.3 032 708978 ..8 4592. /03.8 5.3 /.8::  80.5./.907.:. 4592:2 /03.9    9.3 .25:7.7...8.8032 708978    .2 9..3:39:3.25:7.30342 ..3.-:3 274803971:.3 5024943.3 425488 :1107  80-.9 .2.   '0947 5& /54943 /03..9:   #0897.-:3274803971:.3//.7 203:3. 80.3.8:: 80. /03. /03.3 !8980-. a  5& 80-...2203:3.7:9.:: :39: 202.8 70..3/.8 708978 80-0:2.2 9.25:7.3502.3  /. -07::7.8 708978 /5078.  a  $ 80-. a:39: ..9430320413/ .80.3 43/8 4592.8 /42403.8708978/825.3. a  /.3 70..8 90780-:9 /3:-.9078:85038    %..4# !89    !7480/:707./.-:3 274803971:.270007  .  2039203:3. /09: 80-039.5./3:-..9 90754943 8025:73.-:3 274803971:.5.38:/.   /09  %.2..4:20 a    .85. /.3:93.3   $   :1107   :1107   //    5.8 708978 /5078.7 :39: 202.8 708978  8. -07::7.82/5&   8-.3 -078 .2.3425488:1107 $ /.3 9070- /.3 80-039.3!89   #0.3.9:032!89    592.3 8. 80.3 274803971:.. .3 /.3 70.370.

3/ 17007 3.82/         9 9 9               3:-.980.91.8  /.2 $5380-039.8 8:: /.07.#089785.7    09: 09:          $25.907-.$02..907-.2.9  2039 .

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

900974147088   4.3 -:1107%  978 -. 0 ..83::3-. 2032-.3 9/.  /03.8..  0.  2% 5/.. .2.748./.  7424842-.235:7../.8.:.8. 203.7:9.257203039:/.3..4950 % 2    &'97../08    :.250 28. 80495 200. 5.7:9.7:98025:73.4:20 2 .   . ///.7. :-.3...:9     !7480/:707.3/.9.8708978 .9   2 .748.3 . .2.3 -:1107 %  /03.   :39: /.748.33..4  1. 8..    $..207./083.7:9.3 5.3 887 00974147088 / 8.9: ::3 -.809. 2.748.   :..884.3  2 % 0/.89.3 5488.947  ..748.5.9 :.748..:. .&'  ..9 /.  ..7:9.22..3.80    ..  5. 0 .82/.3 80495 /9.:9  .9.38:23..9 0 .907  -  5. /03. 2    :.707 28.7:9.8 :3.    !.3 -.82/.3/54943/03.2-:107%3./9. 0 ./08   2.7.5 ::3 -.9 .748..30/....83 2.2.7:9..3.3 .39/:2742/ 97    ./3 /0   -74245034 -:0  030 .33/   $.7-.  $0507.3 .9.3   .3 -.

 2030250./02.8::.703.39078... .8:.9    .7    9..38. -.8.7:9./03.7.3 070320070 9.3.3 -:107 %  5.3 5.3 /. .280:7:3. -./..89.079.9.    2.-0780.3 00974147088 5.250  .783403    . / /0.7:9./3/00/.3 0/:. 203.7:9.7.3-07:-.7.3 0 /.9 05.3 80-039.3 .9 ..7  02:/..250/.28:2:7...3.3.::80.3.3 .3 0 .8:. 0.2%    8.7.-0 /..9.3 ./..7..3 90..89.3 20303./. 34247 8:2:7.3   :-:3.32745509   -:.7:9.5488-.748.300974147088 .3 .2-.29. -0781.9.748..748.3.12//0.3 9:...2 -.5.3 -.85.7:9.3.3 a8.3a 09/:2-742/ !#%#$ :3.2-887/03.7.2-:3 0 :9:- 30..9.7::3 ::3-.9 8:2:7.5...3 .300974147088   2. 203.748.3 3.3 :-.390..207.0/.7:8 0 9.99.3.  !078.809.2079.3 038 8.3 90780-:9 9070- /.25:7.380495/.7 8:2-07 .3 -. ..8:.3 .8:/.748. 0 90703/.3 . /03.9..-0 .12203:3..3-.7:39. /42403.91 -07.9/.3809.8::3.9:7:33../ 0 .3a4./..85.3 /2.7. /8 /03.

3.3942-47:3 5.8  .3.7.3.3.3 0 /.8 &' 97.3942-4 ./50740 .3.9:7:3333.9.49.300974147088 .-.8&'97.947 09.959.3 /909..9: .80-../.3 808:.7.8. .9.3 8:/.38:23.-.7:8   00974147088 .3/.38:23. 40 . .7.38:23.3907.9:7.-8  ./.3 8:2-07 .5.00.300974147088   0:.3 80:-:3 .   ' /....3 /9. 8:2-07.3  2039 /03.8:2-07.947   3.:.7:8 /.7:8 .5.8:.80/..3..../.3 . -:3 . 59...2030.2/.2030.38:2-07.9.3 09.3&'97.79.3.9.3 -07039 .7..   3./. 5.9.3.72  .3 /..947 .2...7:8   .37:333 /03.

4-./:3./-.3 8097..3:39:20.3 203:2-:.::5 2:/.8  %7.8 97.381472.3 80 .381472.:39: 203/. 203/.381472.380-.947   9072420907   %.907-.    .   $0507.953.4   .3 .3 80 3.4    .3.3.8.381472.350393 .303$.3 90. .3 203. 20250740 9.3 /03.25:.8.-. 20/..8.82/ /.5./.9/.703.9:23-079::.:2.9: .2583  2.3 202507-.3/:3 .85..8 /.  %#$ #$$ .3.09477042-3.8 207:5.9.3.38107 240:  0 /..2583  $97.7: .3 !7./.3 8.3 2.5. /97.3 80 .74803971:.0947  %0344 3 /:3..5.907 .82/./7803.9:/03. 5503/471    502. 4 #..38207042-3.7 80 . .9.4 .3-. 8.3 :39: /885  /.3./.907 . 40 240:  90780-:9  5.3 203:3. 203.381472.2:7 07-8/.3.3.3 ..9 950    % 470.4/885.-.3/:3 5.7088903907.381472.9.3 ..7 :.0947  7042-3.3 /.3808:.3907..3 0 /.381472.7 .39.303 .9 /..3..3  .3.7  .203.8  80 90780-:9 ..8 /03.3 /-.//..8 5.2.3 03 03 503..80 90780-:9 /.3/ -.703.80 .90728.4 90780-:9 .3 5..3   .07 3. . 9073907.3 903 97.5./03.3 /885 5./.92745509-08079.3 90.703.2 80 3.397.-:3274803971:.3%047 %7.3 /885..3 203. /3:-.103495897.2 5..:.3 202 02.3 /85.  %7. .897.4 $0 .:-.82/   $090.3 80 4250903  $0 4250903 207:5./.381472.3 47.3 .3 -07:-.2 :8..0391.39-49 ./..  .9   8..3..3/.8 207:5.8..53108-. ..:.804250903    %::.

3.2583   20/.#..  .3!097  7032007  8.3 ..9..4 9/   .7   20/.8   ..320/.3/7:....3.39.2583/.:-.......3   897.947950   $0.07 3..207.  ..7:2480   -.35.4    20/./9.

25.

 ..

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

.8 02-..2 8.2.2/.8.:9.9.8/9:2-:.2-. 3:-.3:9/.7.3 /-07 0:9 5..3 /03.3..    . .05.07 3.3749./9.  80.8 3:-.2 08   .82/    0/:. /53/.-:3/3:-.947 5.92.3:9.2 507.:...3 /3:-.:39:3:-. /33  /708:85038 /.  $:5073.-:334247/9..3 /-:.3 .-:3 274803971:.  2 8090.2-.8.3 0 /.9:3.82/5&87:07 80/. 2039 02:/..33907/.33. /.8 75280.2.8  .2 08 :39: /3:-.9.2 . .9 84.-:3342479/.5.  3.. 80.7.20880./.39.39.9.   2039    %.3..9.93020/.5.2    %.   /09 /03..8 /. .30.3 0 /.:39: 3:-.2    $0-.35. /03.3.2 9.:-.83 -078  804250903 8.83:-.3 02-..3 02-.3  5.8::4/03.3.8   2039  /. /:.3/03..3 2.3 3:-.3 8007.-:3274803971:.8 /./03.80-.8.2.3.3 8:: 4 /.9.3 20/.83 2. ..2-.3.-:3 /9.2.-:3 274803971:. /9.8 0.2-./.

-:3 34247   ..3008:39:/3:-../9.09475&7042-3.  2  /.8 3:-.  .2 9.3 :.8::4 /.8 /.0947 5& 87:07:39: 503039:..3 /03. .:-..8 0.07 3.8  .2.3.5:3 9..38007.2.  2039/.5. 9. 20/./3:-.39/. .2583 3:-.83 2..2./.     .802-.3 .  9..-:334247   09..8/.8::4   $02039.2-.80-.3.3 9:  80-.381472.-:3   $0.2 8.20880.-:3 274803971:./53/.25.3 01803897./. 9:  0 /.8::4  . /9.-:3 34247  /9:2-:.3/-070:95./.7. 9.-:3 274803971:.32.947 80. 2039   %.2.3 /03.9.3 20/.83-078 804250903 /9.3:9/. /095.:.2 .25.8 9.8 5. 5. 80.8 3:-.9 84.-:334247 /.-:3 274803971:.3 9.2-.  3.2.380.80.3:9././.35.3 .2-.3 3:-.25 :39: 0/:.3:93. 80.

 8..320/.3...5.

25.

. .

 ..3     .. /.3.2-..203.7.3    !% 0 20/..3 .!%/03.

2.: /3:-.89..8::480. ..0-:7.5.25  .83:-..8 5.-:334247/9:2-:.3.3.3/03./.3 2039   .93020/.7.

25.

. .

2.05.!%80-.7.3..3 /9:2-:.  2039   $:5073.3 /-:.93020/.3 02:/.3 0.9.-:3 34247  /803971:.3      80.8 /03.3.    %. 90788.3 3.5.9.     /.3/03..

25.

. .

..3 .93 0 20/. 9./.3.!%   .-:3 34  /9:2-:.8 3:-..7..3 /03. 5.8 5.

85& /.:01803897.2.3:9.3.3.25.3020/../..-07:9 2..3 503:2..880.4435:9 /.83.  Ð443 :2.3.3/03.3 ..80-.2580-.381472..3443:39:/09..8::4   &39: .1:  5&(4380397.380-.3.   1803897.23          ..33:-.3 -078   .8/9:3/03.7.:.4 /03.381472.2.   /....3 5& 87:07 /. /.

703. !&%&!    !. 8..9 /..9.3..3 -./..-47.. .3 202.9. . / .3 .8 .9:2  ..703.949 :9. 8. 80-.9/../..947 -07.9:2 44$0/. 3/.340:073 /507:.947:2  .9: .3 207:5.3-.3 1..57.9: 57. 8:.2.: 9/.

9:2 90780-:9  /.3.9.9 /.947:2 -44 $  .5:3 :/: 503.3 .3./..3 !03..49:2 44$     .3 /.3 .3 9071.8.5.82/  #0978  !.9:29:. /.-47. :39: /../..80. 90780-:9 203...8  !.3-.3-.8.3.5.3 $97:9:7 /..080:7:.82/  0974147088 0 7.-.7./ 03/.48.8/03.9.703.5..3   $090.7.9/.-47...3.3.9:2 .3 .381472.39488   /.8./.3 57.3 :38 $0  4254303 $0 /.:.9: :-:3.3... . / .343172.2.8 $0  4    9/.3 9/.5:3 :/: 57.2..-47.9 /..  /..2.3.9 /.3 %7.3 84./. /.39/. :7.89..8 .3 .3 -.3!02-0.

8. $..3 57.9:2 44 80 /.8 03/07.9:2 $97:9:7 !079:2-:.3   0/.547.7.9:20309..3  .     !7.3#0107038  %244&   !7. $40/72.3 ! &  .3 40:07 $ 44 &$    !:740794 !747.3!&    ..%#!&$%  :73.3. &3.0789.3  $:7. 0/.3     .2 !.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful