P. 1
Tugas Makalah Praktikum Biologi Sel Dan Molekuler

Tugas Makalah Praktikum Biologi Sel Dan Molekuler

|Views: 508|Likes:
Published by widia ningsih

More info:

Published by: widia ningsih on Oct 20, 2011
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOCX, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

04/21/2013

pdf

text

original

Tugas Makalah Praktikum Biologi Sel dan Molekuler

Prosedur Praktikum Biologi Sel dan Molekuler untuk Prodi Pendidikan Biologi S2
Oleh:

Weni Astari Widia Ningsih Yovanna M.Daniel

8116174017 8116174018 8116174019 8116173011

Pendidikan Biologi B

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS NEGERI MEDAN 2011

i

DAFTAR ISI

Daftar isi ...................................................................................................... i Kata Pengantar……………………………………………………………..ii BAB I Pendahulan ..................................................................................... 1 BAB II Prosedur Praktikum Biologi Sel Dan Molekuler ........................ 2 A. Hubungan Struktur dan Fungsi Sel ................................................. 2 B. Komponen Sel ................................................................................. 3 C. Pengamatan Pembelahan Mitosis.................................................... 4 D. Isolasi DNA Plasmid ....................................................................... 6 E. Retriksi DNA Plasmid .................................................................... 10 F. Elekrtroforesis Gel Agragosa .......................................................... 14 G. Transformasi Sel E.Coli JM 109 ..................................................... 17 BAB III Penutup ......................................................................................... 21 Daftar Pustaka ............................................................................................. 22

Adapun informasi ilmiah yang mendukung penyusunan makalah ini. yang telah memberikan Taufik dan hidayah-Nya. mudah-mudahan amal kebaikan kita semua diterima oleh Allah SWT. sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas makalah mata kuliah Praktikum Biologi Sel dan Molekuler mengenai “Praktikum Biologi Sel dan Molekuler mengenai Prodi Pendidikan Biologi S2”. maupun teori dan metodologi yang masih terbatas. Oleh karena itu penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada ibu Dra. Penulis . baik terkait dengan studi literatur atau pustaka sebagai pendahuluan. penulis sampaikan puji dengan syukur kehadirat Allah SWT. Akhirnya. Namun penulis pada akhirnya menyadari bahwa tugas akhir ini belum sempurna banyak sekali keterbatasannya.Si selaku dosen pembimbing mata kuliah : Praktikum Biologi Sel dan Molekuler dan teman-teman PPs Pendidikan Biologi Angkatan 2011. M. dihimpun dari sejumlah referensi meliputi hal-hal yang berkaitan dengan teknologi dalam biologi molekuler dan segala aspek yang berkaitan dengan hal tersebut. Uswatun Hasanah.ii KATA PENGANTAR Syukur Alhamdulillah. Amin.

Komponen sel. Semakin banyak bidang biologi laiinnya yang memfokuskan diri pada molekul .cirri historis populasi atau spesies) seperti pada genetika populasi dan filogenetika. baik secara langsung mempelajari interaksi molecular dalam bidang mereka sendiri seperti pada biologi sel dan biologi perkembangan. Transformasi Sel E. maupun secara tidak langsung (misalnya dengan menggunakan teknik biologi molekuler untuk menyimpulkan cirri. Elektroforesis Gel Agragosa.proses vital yang berlangsung pada makhluk hidup.BAB I PENDAHULUAN Praktikum Biologi Sel dan Molekuler di peroleh Mahasiswa S2 Prodi Pendidikan Biologi pada semester pertama sebagai mata kuliah wajib yang seiring berjalan dengan mata kuliah teori Biologi Sel dan Molekuler. namun kini semakin memadukan teknik. Tidak terdapat lagi garis tegas yang memisahkan disiplin. Pengamatan Pembelahan Mitosis. Retriksi DNA Plasmid.disiplin ilmu ini seperti sebelumnya. . Biokimia. Secara umum keterkaitan bidang. Adapun materi praktikum Biologi Sel dan Molekuler ini meliputi pengamatan terhadap Hubungan Fungsi dan Struktur Sel. dan translasi bahan genetik. Isolasi DNA Plasmid.telaah zat kimia dan proses. dan biologi molekuler itu sendiri telaah dalam skala molekul atas proses replikasi.teknik tersebut dengan teknik dan gagasan dari genetika dan biokimia. Pada praktikum biologi molekuler ini menggunakan teknik.teknik khusus yang khas pada biologi molekuler.telaah atas efek perbedaan genetic pada makhluk hidup (misalnya telaah mengenai mutan). Genetika.Coli JM 109.bidang tersebut dapat digambarkan ssebagai berikut.. transkripsi.

Namun sel pada setiap makhluk hidup tidaklah sama. Landasan Teori Semua makhluk terdiri dari sel. Dari kupu-kupu hingga kanguru. reproduksi. sel lumba. Sel hidup memiliki ciri. metabolism. hal ini karena fungsi dari masing. Tujuan Mengamati struktur anatomi preparat dari Akar.beda. menghasilkan energi. batang.Sel meskipun memiliki ukuran sangat kecil. Makhluk hidup ada yang tersusun dari satu sel saja.lumba dengan sel mawar? dan apa perbedaannya. dan daun Zea mays . Sebagai bahan pertimbangan apakah bakteri memiliki kesamaan dengan sel kupu.sel penyusun jaringan dari Akar. sel dikatakan sebagai unit dasar kehidupan.kupu. HUBUNGAN STRUKTUR DAN FUNGSI SEL 1. disebut organisme uniseluler. sel tergolong luar biasa.masing organ berbeda.masing organ pada tumbuhan mempunyai struktur yag berbeda. merespon terhadap lingkungan mereka dan seterusnya. dan daun Zea mays Menganalisis hubungan struktur dan fungsi sel. dari pohon kelapa hingga cemara semua tersusun atas sel. Masing. 2. disebut organisme multiseluler. bahkan mereka sangat berbeda.ciri seperti makhluk hidup juga dapat tumbuh.BAB II PROSEDUR PRAKTIKUM BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER A. batang. Fungsi dari suatu bagian sel atau jaringan dapat di indikasikan dari struktur sel/ jaringan pada suatu organ tersebut. Sel adalah unit struktural dan fungsional terkecil dari makhluk hidup. dan ada makhluk hidup yang tersusun lebih dari satu sel.

parenkim. sehingga sukar dilihat oleh mata meskipun telah menggunakan mikroskop. Prosedur Kerja 1) Membuat irisan penampang melintang dari semua bahan 2) Mengamati struktur anatomi ketiga preparat : a) Bentuk. Sel bagian hidujuga dikatakan sebagai kesatuan struktur fisiologi yang terkecil dari organism hidup. jaringan pengangkut. batang. Landasan Teori Sel merupakan unit dasar umum dari struktur organic. Pada dasarnya sel tumbuhan terdiri dari protoplas yang dikelilingi dinding sel. jaingan penguat) b) Analisis mengenai struktur dan fungsi sel-sel penyusun jaringan di atas B. Alat dan Bahan Alat a) Mikroskop b) Silet Bahan a) Akar. Biasanya dinding sel di anggap bagian mati sedangkan protoplas adalah bagian hidup dari sel. Protoplas terdi dari komponen protoplasmic dan non protoplasmic. Sel tumbuhan diartikan sebagai suatu kehidupan kecil yang membatasi batas nyata atau dinding sel.3. dan daun Zea mays 4.reaksi kimia yang rumit (Pandey. KOMPONEN SEL 1. ciri khas dari sel-sel penyusun setiap jaringan pada preparat tersebut (epidermis. didalamnya terjadi reaksi. 1980). Komponen protoplasmic ada yang bersifat cair yaitu sitoplasma Sitoplasma metupakan substansi setengah cair lebih pekat (viscous) dari air dan bening (tembus cahaya: transculent). Sitoplasma memenuhi . susunan.

bahan ergastik. Prosedur Kerja 1) Buat irisan penampang melintang pada semua bahan 2) Amati beberapa buah sel pada setiap jaringan penyusun organ tumbuhan 3) Amati komponen-komponen sel yang terlihat dengan mikroskop yang ada C. yaitu bahan. bila diwarnai dapat diliha beberapa stadium pembelahan mitosis yaitu propase. 2. Di dalam vakuola bisa terlarut berbagai zat seperti gula. dan telofase. alkaloid. Fase.organel serta vakuola. Pada akar Allium cepa yaitu pada bagian ujungnya. . daun bunga pukul empat 4. Bahan. protein.fase pembelahan mitosis dapat dilihat pada daerah meristem ujung akar Allium cepa. 2008).bahan yang terdapat di dalam vakuola digolongkan sebagai bahan. dan zat pewarna. Tujuan Mengamati komponen sel baik komponen yang hidup atau yang tidak hidup dalam sebuah sel 3. PENGAMATAN PEMBELAHAN MITOSIS 1. garam. batang bayam.bahan hasil meabolisme sel (Suryani. Pembelahan ini penting untuk pertumbuhan serta menjaga agar jumlah kromososm sel induk sama dengan sel anak (2n-2n). Landasan Teori Mitosis adalah proses pembelahan sel yang terjadi baik pada sel hewan maupun sel tumbuhan. Alat dan Bahan : Alat a) Mikroskop b) Silet Bahan c) Umbi kentang.ruangan sel hidup dan didalamnya terdapat organel. metafase. Ujung bagian akar bawah terbagi tiga daerah yaitu: daerah meristem perpanjangan sel dan daerah diferensiasi.

Fenil Lakto Fenol 4. Tetesi preparat tersebut dengan polienil alkohol (Fenil Lakto Fenol) di sampingnya (jangan kena preparat). . Silet Bahan 1. Akar bawang 5. Jarum preparat 5. Asam Klorida (HCl) 3. Hisaplah kelebihan asetokarmin dengan kertas hisap. Rendam bawang pada air dalam gelas biarkan selama 2-3 hari. Gelas penutup 4. Asetokarmin 2. Panaskan preparat tersebu di atas api bunsen atau lampu spiritus sampai menguap. Mikroskop 2. Pembakar bunsen / lampu spiritus 8.fase pembelahan mitosis pada akar Allium cepa. Potong akar bawang sepanjang 1 cm kemudian rendam pada asetokarmin dan HCl dengan perbandingan 9 : 1 3. Gelas objek 3. Tujuan Mengetahui kedudukan kromosom pada fase. Alat dan Bahan Alat 1. 6. Cawan petri 6.2. Prosedur Kerja 1. Kertas Hisap 4. 3. 2. Gelas piala 500 ml 7. Pindahkan potongan aakar bawang yang sudah dipanaskan ke gelas objek dan beri satu tetes asetokarmin biarkanlah lebih kurang 30 menit. 5. tetapi jangan sampai mendidih 4.

marker yang memungkinkan adanya seleksi (biasanya gen resisten antibiotik) dan region yang mampu disisipi oleh fragmen DNA dari luar (Lodish et al. dan berbagai enzim. Amati di bawah mikroskop 9. sehingga dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. yaitu : a replication origin. D. DNA plasmid mengalami duplikasi sebelum pembelahan sel inang. Penggunaan plasmid dalam DNA rekombinan dilakukan karena plasmid memiliki tiga region yang berperan penting untuk DNA kloning. Cawan petri . Tutup dengan gelas penutup kemudian di tekan dengan menggunakan pensil sampai preparat pipih (hati. interferon. 2. Bunsen burner 2. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri. khususnya bakteri dan sel eukariotik tingkat rendah misalnya yeast. coli sebagai host.). Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin. Tujuan Melihat cara kerja isolasi DNA plasmid 3. Plasmid biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan menggunakan E.7. Landasan Teori Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot. Alat dan Bahan Alat 1.hati gelas penutup jangan sampai pecah) 8. ISOLASI DNA PLASMID 1. tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik.

Medium Luria Bertani (LB) agar dan LB cair. Glove 5.3.Coli JM109 yang mengandung plasmid pUC19 3. Erlenmeyer 100 ml 7. Koloni tunggal bakteri JM transforman pUC19 dinokulasikan ke 25 ml medium LB cair dan diinkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (semalam). Pelet sel diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dan disentrifugasi dengan kecepatan 5. . Shaker incubator 11.700 x g selama 5 menit. 13. E. Refrigerator 10. 3. Tube microsentrifuge Bahan 1. DNA vektor pUC19 diisolasi menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen. Prosedur Kerja 1. 5. USA) 4. QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen. Micropipette segala ukuran 9. 5.700 x g selama 5 menit. Es batu 4. Jarum ose 6. Microcentrifuges 5415D (Eppendorf) 8. Kultur bakteri hasil inkubasi 16 jam sebanyak 3 ml diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5. USA). Spidol marker 12. 4. Pelet sel bakteri diresuspensi dengan 250 µl Buffer P1 sampai homogen. 2. Tip micropipette segala ukuran (Bio=Rad dan Axygen Scientific). Freezer 4. Ampisilin 2.

15. 13. 7. . Cairan yang melewati membran dibuang dan QIAprep spin column dimasukkan kembali ke dalam tabung mikrosentrifuga. Cairan yang melewati QIAprep spin column dibuang. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1. Supernatan yang dihasilkan dipindah dengan cara memipet ke dalam collection tube yang dilengkapi dengan QIAprep spin column dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000 rpm (17. 10. Suspensi yang dihasilkan akan berubah warnanya menjadi biru. 12.900 x g) selama satu menit. 16. 11. QIAprep spin column dicuci dengan 500 μl PB dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit.5 ml yang lain dan ditambah dengan 50 μl buffer EB. Suspensi selanjutnya ditambah 350 µl N3 dan diresuspensi dengan cara yang sama sehingga warna suspensi kembali seperti warna awal. Tahap selanjutnya tabung mikrosentrifuga disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm (17. Tabung mikrosentrifuga beserta QIAprep spin column disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi kedua).6. 9. dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi pertama). Cairan yang melewati QIAprep spin column kembali dibuang dan disentrifugasi ulang untuk menghilangkan sisa buffer pencuci.5 ml baru dan ditambah dengan 50 μl buffer EB. 8. dan ke dalam QIAprep spin column ditambahkan kembali 750 μl buffer PE. dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit. 14.900 x g) selama 10 menit. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1. Suspensi ditambah 250 µl Buffer P2 dan diresuspensi kembali dengan cara dibolak-balik sebanyak 4-6 kali.

5' Sentrifugasi 13.000 rpm. 16 jam 1 Cairan dibuan g Sp dibuan g Sentrifugasi 5.coli transforman pUC19 25 ml LB Inkubasi 370C. 1' 13. 1' Sp dibuan g Cairan dibuan gg + 250 µl Buffer P1 Resuspensi (vortex. 5' Kolom pindah + 500 µl Buffer PB Sentrifugasi + 50 µl Buffer EB Sentrifugasi 13.000 rpm.000 rpm. 1' .700xg (5000 rpm). 1' Sp dipinda h Sentrifugasi 13.000 rpm. shaker 150 rpm.Skema kerja Isolasi DNA Plasmid menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen. 1' Sentrifugasi 13. + 1 ml STE resuspensi 5' Sentrifuga si 5000 rpm. bolak balik + 250 µl Buffer P2 Bolak-balik sebentar Warna mjd BIRU + 350 µl Buffer N3 Bolak-balik sebentar Warna BIRU hilang + 750 µl Buffer PE Sentrifugasi DNA plasmid Cairan dibuan g 13.000 rpm. USA) @ 3 ml E.000 rpm.

namun biasanya enzim restriksi akan memotong pada ujung yang berbeda pada 2 strand sehingga menghasilkan sisi lengket (sticky ended). Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian dapat berasosiasi dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain yang juga telah dipotong dengan enzim restriksi. GAATTC merupakan sisi pengenalan EcoRI.angan basa palindrom. Beberapa enzim seperti BamHI. Manipulasi pemotongan DNA dilakukan oleh enzim yang disebut endonuklease restriksi. Sisi restriksi tersebut biasanya berupa pas.E. Sisi pengenalan enzim restriksi tersebut berbeda – beda pada suatu fragmen DNA. Enzim restriksi akan mengenali sisi restriksi suatu fragmen DNA yang biasanya terdiri atas 4 – 8 pasang basa. Enzim – enzim restriksi yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan berasal dari beberapa bakteri. EcoRI dan PstI dapat memotong masing-masing strand DNA. yaitu : ukuran fragmen. Enzim restriksi akan memotong fragmen DNA di ujung yang sama pada 2 strand (blunt ended). misalnya BamHI yang diperoleh dari Bacillus amyloliquefaciens memiliki sisi pengenalan yang akan memotong pada basa G nomor 2 dari tepi masing – masing strand (Lodish et al. sensitivitas terhadap metilasi. blunt-ended atau sticky-ended fragment. AGCT merupakan sisi pengenalan AluI. kompatibiliti terhadap kondisi reaksi. Enzim restriksi dengan sekuens . Pemilihan enzim restriksi untuk pemotongan fragmen DNA pada suatu teknologi DNA rekombinan didasarkan pada beberapa hal. RESTRIKSI DNA PLASMID 1.). Landasan Teori Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu organisme dalam jumlah besar. Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA). Molekul DNA rekombinan dapat diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang memiliki daerah pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom.

Komponen reaksi (master mix)restriksi terdiri dari : air.pengenal lebih pendek akan menghasilkan lebih banyak potongan fragmen DNA. Volume di bawah 10 µL tidak dianjurkan karena memiliki kemungkinan yang sangat besar untuk terjadinya kesalahan pipeting. 2. Korea) . Glove 3. Sticky ended biasanya lebih efisien dalam ligasi sedangkan blunt ended biasanya dikenali oleh enzi khusus yang cocok dengan tipe pemotongan blunt ended. Spidol marker 6. Metilasi biasanya terjadi pada DNA mahluk hidup dan bervariasi polanya sehingga dibutuhkan enzim restriksi yang cocok untuk DNA yang mengalami metilasi dengan pola tertentu. 2007). Komponen enzim ditambahkan terakhir pada saat pembuatan master mix (Anonim. Alat dan Bahan Alat 1. Freezer 2. Volume akhir untuk komponen reaksi biasanya 10 – 50 µL. 2007). buffer dan enzim. Pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH. Tujuan Melihat cara kerja pemotongan DNA plasmid 3. Micropipette segala ukuran 4. Tube microsentrifuge 8. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 7. DNA. Apabila terdapat 2 enzim yang cocok untuk suatu reaksi yang sama maka kedua enzim ini dapat ditambahkan pada reaksi dengan reaksi bufer dan suhu yang sama (Anonim. Microsentrifuge 5415D (Eppendorf) 5.

Optimasi reaksi restriksi sebelumya dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan DNA dapat terpotong sempurna dengan kondisi optimasi tersebut. . 4. Buffer H 4. dengan komposisi Buffer E. 7. yaitu enzim PstI. dan PstI sebayak 2 µl untuk vinal volume 50 µl. Es batu 7. DNA pUC19 sebayak 20 µl. Buffer E 3. EcoRI. Campuran reaksi dihomogenkan sebentar menggunakan mikrosentrifuga selama 1-2 detik. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml. larutan DNA hasil restriksi disimpan di dalam Freezer. Vektor pUC19 dipotong dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotongan DNA genom. 6. DNA dan PstI 3. Restriction enzyme of Hind III. 5. BSA.5 µl. DNA plasmid pUC19 6. Hal ini dilakukan untuk inaktifasi enzim restriksi. Prosedur Kerja 1. BSA sebayak 0. Pst I 4. Tabung mikrosentrifuga yang berisi campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu 37 0C selama 4 jam menggunakan pemanas air (Water Bath). ddH2O 5. 2. BSA 2. Misalkan reaksi restriksi bekerja secara optimum dengan komposisi Buffer E sebanyak 5 µl. Tabung mikrosentrifuga diketuk sebentar untuk memastikan campuran sudah tersuspensi. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml sesuai dengan hasil optimasi reaksi restriksi.Bahan 1. tabung mikrosentrifuga selanjutnya diinkubasi pada suhu 70 0C selama 10 menit menggunakan Water Bath.

2” Ketuk-ketuk Inkubasi 37 0C. dg Water bath selama 4 jam Simpan di frezer Inaktifasi.Skema Kerja Restriksi DNA plasmid 1 2 3 4 5 6 7 P1 P2 P3 Spin sebentar. suhu 700C dg waterbath. 10 menit .

Elektroforesis gel agarosa biasanya digunaka untuk analisis ukuran dan konformasi sampel DNA. Landasan Teori Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya.F. Alat dan Bahan Alat 1. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet. Makin besar ukuran molekulnya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20. Tujuan Melihat cara kerja elektroforesis gel agarosa 3. makin rendah laju migrasinya. ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA 1. Labu Erlenmeyer 50 ml 3. Sarung tangan 5. 2. pemisahan dan ekstraksi fragmen DNA (Anonim. Tabung mikrosentrifuga 4. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. 2010). kuantifikasi DNA. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 6. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Kertas parafilm .000 pasang basa (bp). Gelas Ukur 1000 ml 2.

7. 100 ml EDTA 0. 15% ficoll tipe 4000. DNA plasmid hasil restriksi (cut) 4. DNA plasmid hasil isolasi (uncut) c. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna. 57. lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masingmasing ujung baki) 4. Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base. 2. Loading dye 6x (0.25% xylene cyalol. Prosedur Kerja 1. Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir menyentuh dasar baki . misalnya : a.5 M pH 8. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0. 3. UV transluminator 10. DNA marker. Siapkan baki gel agarosa. misalnya DNA λ yang dipotong dengan HindIII 6. Agarosa 3. EDTA 120 mM) 9. DNA kromosom bakteri. dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml) 4. b.25% bromophenol blue.2 g untuk dilarutkan ke dalam bufer TAE 1x hingga volume 20 ml. Sampel DNA. Buat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245 ml akuades.1 g asam asetat glacial. Akuades 5. 0. Seperangkat alat elektroforesis 8. Kaca mata UV 11. Kamera digital Bahan 1. Larutan Etidium Bromid (EtBr) 2.

15. jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus. lepaskan selotip dari ujung-ujung baki. 8. 17. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis. 11. nyalakan UV transluminator. elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis. masukkan 10 µl sampel DNA dan 2 µl loading dye 6x ke dalam sumuran gel agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet. 13. amati pita-pita DNA yang tervisualisasi. jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60 0C.5. 9. buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan. masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE). 12. keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas UV transluminator). . ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya). siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis. nyalakan sumber arus. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan. yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. aturlah voltase dan waktu running hingga diperoleh angka 70 V dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus. ambil sisir dengan hati-hati. jika tidak demikian. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar. 7. 16. gunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik). tambahkan 1 µl etidium bromid (PERINGATAN KERAS!!. 6. 10. kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel agarosa. 14. biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat. hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran.

Korea) . karena fenotip strain E. Apabila vektor DNA rekombinan telah terintegrasi dengan sel inang maka sel tersebut dapat dikatakan telah ditransformasi. termometer 3. Sel E. Strain E. coli disisipi vektor DNA rekombinan yang disisipkan ke dalam plasmid.G. Setelah diinkubasi.coli. Sel kompeten merupakan sel yang memiliki kemampuan untuk disisipi DNA dari luar. jamur. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 5. maka untuk mendapatkan sel transforman cukup mudah yaitu dengan menumbuhkan sel hasil transformasi pada media yang mengandung ampisilin. herbisida. Transformasi merupakan hal yang penting karena menghasilkan organisme rekombinan sesuai dengan gen yang disipkan pada vektor. coli hasil transforman mengandung plasmid dan salah satu ciri sel yang disisipi plasmid adalah resisten terhadap antibiotik (ampisilin). Landasan Teori Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang bakteri misalnya bakteri E. pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH. sel tersebut akan memperbanyak diri sehingga jumlahnya menjadi banyak. coli biasanya digunakan sebagai sel kompeten. shaker-incubator 2. TRANSFORMASI SEL E. Alat dan Bahan Alat 1. Transformasi dilakukan dengan menggunakan sel kompeten. Tabung mikrosentrifuga 4. coli 3. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf) 6. Tujuan Praktikum ini bertujuan untuk melakukan transformasi pada sel E. E. Teknologi ini digunakan dalam usaha memperoleh tanaman yang tahan terhadap infeksi bakteri. coli JM109 1. coli tersebut akan berubah karena mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. 2.

shaker-incubator tipe EFM-60 (Seiwa Rico. 2. . Prosedur Kerja 1.5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5. media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG 5.7. Erlenmeyer 11. coli JM 109 2. atau dengan kata lain perbandingan antara volume media dan volume kultur 10:1. media LB cair 3. es batu 4. 3. Bahan 1.) 12. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 μl CaCl2 dingin. Sebanyak 1. Inkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (semalam).700 x g selama 5 menit. coli JM 109 dikultivasi ke media LB cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni strain E. Ltd. Pindahkan kultur E. batang drugalsky 9. media cawan LB ampisilin dan media cawan LB tanpa ampisilin 4. coli JM 109 hasil inkubasi semalam ke media LB cair 25 ml dengan cara mengambil 250 μl kultur E. cawan Petri 10. kemudian dilakukan inkubasi dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm selama 120 menit (2 jam) pada suhu 37oC. jarum ose 8. coli JM 109 ke media LB cair. coli JM 109 ke dalam media LB cair 25 ml.700 x g selama 5 menit. Kultur semalam strain E. 4. kamera digital. strain E. diresuspensi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5.

Supernatan dibuang kembali dan ke dalam tabung ditambahkan kembali 200 μl CaCl2 dingin. Dalam perlakuan ini terdapat lima tabung mikrosentrifuga. Sementara itu. sedangkan tabung nomor 2 tidak ditambah dengan palsmid. . 10. salah satunya atau tabung nomor 1 ditambah dengan 10 μl palsmid pUC19 sirkuler. Ketiga tabung mikrosentrifuga diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit dan diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik pada suhu 42oC dan segera dipindahkan ke es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit. Inkubasi dilakukan selama 16 jam pada suhu 37oC. Kedua tabung diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit.5. 2 μl vektor pUC19 rekombinan (tabung nomor 4) dan tidak ditambahkan apapun (tabung nomor 5). 6. 11. dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator selama 1. dua diantaranya untuk inkubasi 2 jam dan 3 lainnya untuk inkubasi 16 jam. 7. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten. Tabung mikrosentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah inkubasi 10 menit. ditambahkan 10 μl vektor pUC19 sirkuler untuk penentuan efisiensi transformasi (tabung nomor 3). 8.5 jam. kemudian diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik dengan suhu 42oC dan segera dipindahkan ke dalam es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit. Selain itu. 12. sebanyak 50 μl hasil inkubasi pada tabung nomor 2 ditumbuhkan juga pada media LB tanpa ampisilin. Sebanyak 100 μl hasil inkubasi ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp untuk kedua tabung. Tabung mikrosentrifuga selanjutnya ditambahkan dengan media LB hingga 1 ml.5 jam pada suhu 37oC. dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37oC dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 1. ke dalam tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 16 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten. diresuspensi dan diinkubasi dalam es. 9.

13. Supernatan dibuang hingga tersisa 100 μl. dilanjutkan dengan inkubasi selama 16 jam pada suhu 37oC. 16. coli dengan pUC19 sirkuler dilakukan penjumlahan koloni untuk diketahui efisiensi transformasinya.5 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp sebanyak 100 μl dan ke media cawan LB sebanyak 50 μl. lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama lebih kurang 30 menit. Σkoloni = jumlah koloni putih (dalam cfu) [pUC19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng) . 14. Disiapkan media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG dengan cara menambahkan 50 μl X-Gal dan 100 μl IPTG ke media cawan LB/Amp. 15. Hasil inkubasi pada tabung no. dan kemudian ditumbuhkan dengan cara plating ke media LB/Amp/X-Gal/IPTG. Efisiensi transformasi dihitung dengan cara sebagai berikut Dimana. 17.700 x g selama 5 menit. Hasil inkubasi tabung nomor 3 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG sebanyak 100 μl. Tabung nomor 4 disentrifugasi dengan kecepatan 5. Untuk cawan yang berisi E. 18.

Komponen Sel dan Pengamatan Pembelahan Mitosis.BAB III PENUTUP Pada praktikum Biologi Sel dan Molekuler ini. Adapun judul pengamatan Isolasi DNA Plasmid. . karena alat dan bahan merupakan faktot utama sebagai indikator berhasil atau tidakkah suatu praktikum. Hal tersebut menjadi kendala untuk dilaksanakan praktikum tersebut. diperlukan alat dan bahan yang memadai di laboratorium. Retriksi DNA Plasmid. Setelah dilakukan konfirmasi dengan laboran banyak alat dan bahan yang tidak ada di laboratorium biologi S1. Elektroforesis Gel Agragosa.Coli JM 109 tidak dapat dilaksanakan karena kurang terfasilitasi alat dan bahan yang ada dilaboraotium Biologi S1. dan Transformasi Sel E. Adapun judul praktikum yang dapat dilaksanakan yaitu Hubungan Struktur dan Fungsi Sel. karena jika salah satu alat/ bahan tidak ada maka paraktikum itu akan gagal secara keseluruhan.

Praktikum Struktur Pertumbuhan II. 2009. Praktikum Genetika. Medan: FMIPA UNIMED. Cicik. 2010. Suryani. Purwokerto: Program Pasca Sarjana Universitas Jenderal . Soedirman . Medan: FMIPA UNIMED. 2008. Laporan praktikum Biologi sel dan Molekuler S2 Bologi UNSOED. (Bahan Referensi) Tim Biologi UNIMED.DAFTAR PUSTAKA Kurniawan.

0- 01803 /.7 .8.7. 803.8.9502-:.5.2 209.07.0-503/0.30--.4 :39:  . 907.3 032  '4:20 .::7.9/.  2.7.2.2-.-..8.9 -08.203  $9...  a9/. 907/.8 54.9  032 ..3 . 9079039:  5.5. 202 02:33.08.3 70...3.89072 3432      %::.9   70007   4.0   ./3.8 /03.3:7..3907.3 8.54943.82/   .3 950 5024943.953.9.2.3.7 :39: 4254303 70.8 2. 03/0/ -..7455099080.3.4 /03.3 .8 -.3 .7   -:1107 /.355093 4254303032/9.5024943.8 /03.    %:-02..3 .4.907-.880/.3.8 .3 . /-:9:.4.: /:5 /.703.92745509-08079. 4 #.3. /.8.3 -:39 03/0/  09.3 032 708978 .      .3.3.3 -07.2 ./.8907 2 708978907/7 /.//.3 . /03.3 0.9: 70.8 -.8.9 950    % 470.32.74803971:0 5503/471    $5/42.      a  '4:20 / -.8.9 /9.50303..35.3. 0/:.4 :39: 8:..75.7.38./.3 203. 8.3.38.9.3203.303$.74803971:0   !02./.3 -:39 03/0/-./ 5.38::.3 5.7 :39:907.0391...8-:107/.3. 032 3 /.317.3.2-.707   $0507.4. 40 03 :8:8 . 2.3 54. 70. 3432    425430370.3   ..

 -07::7.89..3 8.3 80-039.7..7:9.3:93.82/5&   8-. 80.32 /03.91.89.8 70.8 70.3  2 808:.2 9.8 90780-:9 /3:-.85./3:-... -07::7.3 9070- /.4:20 a    .8:: 80.3.8 90780-:9  #0.3 425488 :1107  80-.8 708978  8.3   $   :1107   :1107   //    5.   /09  %.2... .9:   #0897.-:3274803971:. /..370.5.8 708978 80-0:2..2 9.9078:85038    %.9430320413/ .8::  80.38:/.3//.3/.9 .3:39:3.:: :39: 202.3..3 70./.8 /42403.4# !89    !7480/:707.25:7.3.9:032!89    592.  a  $ 80-.907.3 /.80.8 708978 /5078....8.3 70.8032 708978    .-:3 274803971:.7 :39: 202./.25:7.25:7.. a:39: ..8708978/825.270007  .3!89   #0.9 90754943 8025:73.. /03. a  /.3.5.3 5024943.-:3 274803971:.   '0947 5& /54943 /03.. 80.8 4592.3502. 4592:2 /03. a  5& 80-.3 43/8 4592. /03.8 708978 -007.:.2. /03.3 032 708978 .3 274803971:.2.7 .-:3 274803971:.3 -078 .3 /.7 203:3.3 .8 5.3.9    9.2..5.:.8 708978 /5078.2203:3.907.-:3 274803971:.3. /09: 80-039.30342 .3 !8980-.3  /.3425488:1107 $ /.  2039203:3.

7    09: 09:          $25.8  /.9  2039 .8 8:: /.980.3/ 17007 3.2 $5380-039.#089785.907-.2.91.$02..82/         9 9 9               3:-.907-.07.

.7. -5  0974147088 0 .3:39: 20.3 0897.8&:7 2   .3%047 0974147088 207:5.3 83. /9.88 ::7.3 90.  0974147088 0 .817.  %#  #$$# $   .3 /.3903:39: 2028.748.88.2...12 .: 27.3 30.0/703/.5.3 .5. 7.7  2.3.3 . .7.203 17.5.8::7.9:8 3.3 .409 8090. /. 9070- /. /.2 502-:.9.3 431472.  '8:8.7.:: 0 /.3.9 240: /.34/0 .3.5. /:3.3 / -.: 27.-:7032007 2   %.7.3   $0507.8..92745509-08079.  07.83.7.2 20/.883.9.9.91803...3..3/3..0391.203 240:  89.   $. 0 .3 .83.8:.707  . 4 #.9   0.33.7:9.3 :39: 2028.../.7:97.3:93.203  /.9.9.2-.9/.3/.3 703/.3 ..: ::7.38. /03. /:3.3 8..3 -.391.9 /5077.8  80.3 .303$.//.2/ /.8.3 ::7..748.3-08..009741470880.   .7::7. 5..3/.8.-:3274803971:.409    %::.3 0.:2.8.748.9.:.3 897.8 17.9 240: 8:.:.3.7 :97.33.250  /03.    079.3 /03. -.3 /.3 202-..8.   5.07.3 -07. :39: .8..3..7:39.3897:9:718 240:3.3 /.309/:2-742/80-0:2/5.7:9.85.9 /. . /09.8   5028..250   :.3 -0727.203 3432    40:  -072:.3 240:3..5.9: 17.7.250 -07/...953.3/.  2.8.7 -0-07.7.3 09/:2-742/ .8.9780203:::9:-54891 .820. / /.: 27.3 -..748.39.

884.82/.3 -:1107%  978 -..  /03...33.2-:107%3.707 28..7:9.  5..3 -.30/.748..9.3  2 % 0/.3 -:1107 %  /03.2.38:23.3 887 00974147088 / 8..947  . 0 .9 :.3 .207.748.748.257203039:/.3. ///.  $0507.7:9. 0 . :-.3 5.5 ::3 -.7-.89. 0 .:9     !7480/:707..7:9.  . . 2    :.7:98025:73.7:9..748..    !.:.250 28.5.9..3/54943/03. 5. 2.3 .8.9 /.80    ..748. 80495 200.9: ::3 -./9.748.9 0 ./08   2.:...2.3 9/./.3 -. ..   :..9   2 .8 :3.3/.3.   .  7424842-.../08    :. 8./.7.235:7.9.83::3-..4  1./3 /0   -74245034 -:0  030 .3. /03.   :39: /. .3 5488.4950 % 2    &'97..22./083.7:9...3 80495 /9.  2% 5/.8708978 .9 .7.7:9.900974147088   4. 2032-.39/:2742/ 97    .  0. 203.83 2.    $.4:20 2 .907  -  5.3   .809.3.8.748.2..82/.3 ..:9  .8.&'  .33/   $.

.8::3.3 /2.3 9:./...-0780.748.3 80-039.38.9..3 :-.3 .85.250  .3.3 . /42403.../.9.9..25:7.3 .    2./02.8::.12//0.9 8:2:7.3 a8.  !078.28:2:7.3.7. / /0.2079.5488-.0/.250/.7  02:/.3..3 20303..7    9.7. .9 05. -0781.7.91 -07..9    ..7./03..7:8 0 9.99./.7::3 ::3-.3.207. 0 90703/.3 .85.3 0 .5.748.2 -.300974147088   2.2-:3 0 :9:- 30.3 90780-:9 9070- /.7:9..300974147088 .8:. 203.3 ..3-.3.3a 09/:2-742/ !#%#$ :3.9:7:33. 34247 8:2:7. 203.9.3 -.9 .7:9.::80.29.7..9.89.9/.3 0/:..3 038 8./ 0 .. /8 /03.3 070320070 9...3809.-0 /.. -.3 0 /.809.3 -:107 %  5.3.3 .3 . .7..8:. .3 00974147088 5./3/00/.2-887/03.-0 .3 /.7:9.7 8:2-07 .3 3..079.390. 0.3.3a4.3 -.. -.32745509   -:.7.380495/.8:.39078.7:9.3 5.2-./.3-07:-.. /03.3 90.748.783403    .703.7:9.748.8.8:/.2%    8.280:7:3.3   :-:3.5.12203:3.748.7:39. 2030250.89.

2030.49. .7..3 0 /.3907...3 80:-:3 .72  .3 .3 /909./.3 -07039 .959.3 /.00.8 &' 97.9.3/.947   3./.9:7:3333..80/.7:8 . -:3 .3.38:23. 40 .8:2-07.38:23.7.9: .3 8:2-07 . 8:2-07.38:2-07.8.7:8   .80-.300974147088 ..3 808:..3..8&'97..8  .-8  .2/. 5.3.   ' /.3942-47:3 5. .:.3.3  2039 /03.-.3.7:8   00974147088 ..9.79.3.9.7:8 /.5.2.9..947 09./.37:333 /03.2030.3942-4 ../50740 .3.300974147088   0:.   3...9:7.38:23.3.3 8:/.8:.-.5..3 09.7. 59.7.9./..3 /9.947 .3&'97.

3/:3 .9.    .4 .3  ../.. 20/.381472.:39: 203/.381472.3 .92745509-08079.74803971:..8 97..381472.3 903 97.9: .3 03 03 503.3 202 02. /3:-.   $0507.-. /97.9..9 950    % 470.7  . 20250740 9.8  %7.3 /885. .7 .4   .8.703.:.3/.3.8 5.3 80 .3-. ..3 8097.3 /-.3 0 /.3.4 $0 .3907.3:39:20.07 3.39. 203/.350393 ../.8 /.3 80 .  %7.8.380-.3. 5503/471    502.947   9072420907   %.3 203.3 47.203.103495897.303 .3 5.//.3 -07:-.7: ../.5..897.3.:-.907 .0947  7042-3.3 /03. .  .4    .381472.7 :.381472..:2..381472.::5 2:/.3 8.38207042-3..5.7 80 .3 ./-.39-49 .804250903    %::.9.3808:.3. 9073907.3.3 80 4250903  $0 4250903 207:5.8 207:5..9 /...3/:3 5.3 :39: /885  /.82/   $090.2.3 !7.4/885..-.907-.09477042-3.953.2583  $97.3 /.4-.:./:3.3.5. .3.3 90..25:.8 207:5.3 /85.9   8.703.381472...3 .3 .80 ..2:7 07-8/.3 2.53108-.4 90780-:9 .38107 240:  0 /.8  80 90780-:9 .907 ./.3 203:3.3 202507-.2 5.90728..5. 8. .8.3.703./.3 /885 5.3%047 %7.82/.303$.3.3/ -.8 /03.9:/03.0947  %0344 3 /:3. 40 240:  90780-:9  5.3 203.3   . 203.3 80 3.7088903907.3 90.2 :8.9:23-079::..-:3274803971:.3 203:2-:./03. 4 #.2 80 3.85.8.0391.9/.  %#$ #$$ .80 90780-:9 /./7803.82/ /.2583  2.381472..397./.

.2583/.3.  .....207..9.3 ./9.:-.3.4 9/   .2583   20/.320/..07 3.7:2480   -.8   ..947950   $0...4    20/.7   20/..35..3   897.39..3/7:..3!097  7032007  8.  .#..

25.

. .

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

 80.9.-:3/3:-.5..3 20/.3 2. .:.9:3.93020/.07 3.8 0.05.33.82/    0/:.3749.30...2. /53/.-:3274803971:.2. .2..20880./.3 /03.82/5&87:07 80/.:-.-:3 274803971:.-:334247/9.. /:.8.5./03.3:9/..8 /.    .3.2    $0-.2-.-:3342479/.3  5.9 84.2 9.  $:5073.2 507.9.2/.3/03.  2 8090.8/9:2-:. .3.3 0 /.8   2039  /.2 8.3 3:-.:39:3:-.  3.   2039    %.9.8::4/03.. /9.8  .2-.3.-:3 274803971:.2 08   .9.:9.947 5.2    %..   /09 /03.3.9. 2039 02:/.3 02-..80-.2.83:-.3 02-.3.83 2.:39: 3:-.3 ./9.83 -078  804250903 8.8 /.3 /-07 0:9 5.7.2-.39.8 02-.2-.8.3:9. /..3.-:3 /9.2 08 :39: /3:-.8 3:-..3 /-:. /03.35.33907/.2 . ./.39.8 75280.7.92..  80. /33  /708:85038 /.3 8007.3 0 /.3 /3:-.3 8:: 4 /. 3:-...8.

/.8 3:-.     .3.. 9:  0 /.3 /03.5:3 9.8 5.2-.2-.8 0.  3./3:-.381472.8 3:-.80-./.3008:39:/3:-.2.8::4   $02039. 9.2 8.2.3.2.  2039/.. 2039   %.8::4 /. /095.3:9/./9.8  .3 20/.80.07 3.25./.2./.2 ..947 80.8/.8 9.380.-:3 34247   .-:334247 /.:-.3 9:  80-. 5.3 9. 80. 9.-:3   $0..2.2 9.8 /. .  9.0947 5& 87:07:39: 503039:./. ..2583 3:-.  2  /.7.. 20/.9 84.9.20880.25 :39: 0/:..-:3 34247  /9:2-:..39/.25.2-.32. 80.83-078 804250903 /9.3 .3 01803897.-:3 274803971:.09475&7042-3.5.-:3 274803971:.3 /03.3:9. /9.-:334247   09.3 :.3 .8::4  .35.-:3 274803971:.83 2.3:93.3 3:-./53/.802-.3/-070:95.38007.  .:.

5.320/..3... 8.

25.

 ..

!%/03.3     .3.3 ..2-.3    !% 0 20/. /. .203...7..

 .25  .7.83:-.0-:7.8::480.5.-:334247/9:2-:.3.3/03.3 2039   .8 5..3.89./...2.: /3:-.93020/.

25.

. .

    %.93020/.  2039   $:5073.8 /03.3 /-:.3.5.!%80-. 90788.3 02:/.05.3 0.7.3 /9:2-:.2.     /.9.3/03.9.3 3.3      80..3.-:3 34247  /803971:..

25.

. .

7.93 0 20/.-:3 34  /9:2-:.8 5..!%   .. 9.3 .8 3:-../.3 /03.3. 5..

2580-..4 /03.380-./.-07:9 2..3 .8/9:3/03...7.33:-.381472.3:9.23          .3..2.83...85& /..  Ð443 :2.880.:01803897.   1803897.8::4   &39: .3020/.1:  5&(4380397.3 5& 87:07 /.:.   /.3443:39:/09.4435:9 /.2.381472..3.80-.. /.25.3.3 -078   ..3/03.3 503:2.3.

340:073 /507:. 8:.3 202.9:2  .947:2  ..947 -07..9: 57.949 :9. !&%&!    !../.3 . 80-.8 ./...9:2 44$0/.2. 8.9: .3.9/.9 /.3 1.57.3-... .9.3 -.703. .-47.9..3 207:5.703. 8. / .: 9/. 3/..

9 /.9:29:.2.3 -.3.8/03. / ..3 /. .3-.80.9.9 /. /.703..8 .-..3. :39: /.947:2 -44 $  ..8..-47..9: :-:3.:.5.3!02-0.3 9/.82/  #0978  !.3 .  /..82/  0974147088 0 7.3 .3 !03.3   $090..5./...3.8.5.3 84.3 .3 :38 $0  4254303 $0 /. 90780-:9 203.3.3 57.9/.3 $97:9:7 /./.8.8  !..-47.48.3.9.39488   /.3-.9:2 .89.9:2 90780-:9  /.080:7:.. :7./.343172.2..7.2.39/.5:3 :/: 503.3 %7.5:3 :/: 57.3.49:2 44$     .7.-47./ 03/. /.8 $0  4    9/...3.3 9071..9 /./.3 .381472.

     !7.3     .0789..8. $40/72.3 ! &  .3.8 03/07.3   0/.3 40:07 $ 44 &$    !:740794 !747.3!&    .3  ..%#!&$%  :73.9:2 $97:9:7 !079:2-:.9:2 44 80 /.2 !. $.3  $:7.547. 0/.3 57. &3.7..3#0107038  %244&   !7.9:20309.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->