Tugas Makalah Praktikum Biologi Sel dan Molekuler

Prosedur Praktikum Biologi Sel dan Molekuler untuk Prodi Pendidikan Biologi S2
Oleh:

Weni Astari Widia Ningsih Yovanna M.Daniel

8116174017 8116174018 8116174019 8116173011

Pendidikan Biologi B

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS NEGERI MEDAN 2011

i

DAFTAR ISI

Daftar isi ...................................................................................................... i Kata Pengantar……………………………………………………………..ii BAB I Pendahulan ..................................................................................... 1 BAB II Prosedur Praktikum Biologi Sel Dan Molekuler ........................ 2 A. Hubungan Struktur dan Fungsi Sel ................................................. 2 B. Komponen Sel ................................................................................. 3 C. Pengamatan Pembelahan Mitosis.................................................... 4 D. Isolasi DNA Plasmid ....................................................................... 6 E. Retriksi DNA Plasmid .................................................................... 10 F. Elekrtroforesis Gel Agragosa .......................................................... 14 G. Transformasi Sel E.Coli JM 109 ..................................................... 17 BAB III Penutup ......................................................................................... 21 Daftar Pustaka ............................................................................................. 22

yang telah memberikan Taufik dan hidayah-Nya.ii KATA PENGANTAR Syukur Alhamdulillah. Penulis . penulis sampaikan puji dengan syukur kehadirat Allah SWT. Akhirnya. Oleh karena itu penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada ibu Dra. baik terkait dengan studi literatur atau pustaka sebagai pendahuluan. Uswatun Hasanah. mudah-mudahan amal kebaikan kita semua diterima oleh Allah SWT. sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas makalah mata kuliah Praktikum Biologi Sel dan Molekuler mengenai “Praktikum Biologi Sel dan Molekuler mengenai Prodi Pendidikan Biologi S2”.Si selaku dosen pembimbing mata kuliah : Praktikum Biologi Sel dan Molekuler dan teman-teman PPs Pendidikan Biologi Angkatan 2011. M. Amin. dihimpun dari sejumlah referensi meliputi hal-hal yang berkaitan dengan teknologi dalam biologi molekuler dan segala aspek yang berkaitan dengan hal tersebut. Adapun informasi ilmiah yang mendukung penyusunan makalah ini. Namun penulis pada akhirnya menyadari bahwa tugas akhir ini belum sempurna banyak sekali keterbatasannya. maupun teori dan metodologi yang masih terbatas.

dan biologi molekuler itu sendiri telaah dalam skala molekul atas proses replikasi.disiplin ilmu ini seperti sebelumnya. Isolasi DNA Plasmid.telaah atas efek perbedaan genetic pada makhluk hidup (misalnya telaah mengenai mutan). transkripsi. Retriksi DNA Plasmid.proses vital yang berlangsung pada makhluk hidup.teknik tersebut dengan teknik dan gagasan dari genetika dan biokimia. Transformasi Sel E. Komponen sel.telaah zat kimia dan proses. Tidak terdapat lagi garis tegas yang memisahkan disiplin. dan translasi bahan genetik. Genetika.cirri historis populasi atau spesies) seperti pada genetika populasi dan filogenetika. Pengamatan Pembelahan Mitosis. Semakin banyak bidang biologi laiinnya yang memfokuskan diri pada molekul . Elektroforesis Gel Agragosa. maupun secara tidak langsung (misalnya dengan menggunakan teknik biologi molekuler untuk menyimpulkan cirri. namun kini semakin memadukan teknik.BAB I PENDAHULUAN Praktikum Biologi Sel dan Molekuler di peroleh Mahasiswa S2 Prodi Pendidikan Biologi pada semester pertama sebagai mata kuliah wajib yang seiring berjalan dengan mata kuliah teori Biologi Sel dan Molekuler.teknik khusus yang khas pada biologi molekuler.. Biokimia. baik secara langsung mempelajari interaksi molecular dalam bidang mereka sendiri seperti pada biologi sel dan biologi perkembangan.bidang tersebut dapat digambarkan ssebagai berikut.Coli JM 109. . Adapun materi praktikum Biologi Sel dan Molekuler ini meliputi pengamatan terhadap Hubungan Fungsi dan Struktur Sel. Pada praktikum biologi molekuler ini menggunakan teknik. Secara umum keterkaitan bidang.

Sel adalah unit struktural dan fungsional terkecil dari makhluk hidup.Sel meskipun memiliki ukuran sangat kecil. Namun sel pada setiap makhluk hidup tidaklah sama. dari pohon kelapa hingga cemara semua tersusun atas sel. dan ada makhluk hidup yang tersusun lebih dari satu sel. batang. disebut organisme uniseluler. disebut organisme multiseluler.ciri seperti makhluk hidup juga dapat tumbuh.sel penyusun jaringan dari Akar. sel dikatakan sebagai unit dasar kehidupan. Sebagai bahan pertimbangan apakah bakteri memiliki kesamaan dengan sel kupu. Fungsi dari suatu bagian sel atau jaringan dapat di indikasikan dari struktur sel/ jaringan pada suatu organ tersebut.masing organ berbeda. merespon terhadap lingkungan mereka dan seterusnya. batang.beda. dan daun Zea mays Menganalisis hubungan struktur dan fungsi sel. 2. Landasan Teori Semua makhluk terdiri dari sel. HUBUNGAN STRUKTUR DAN FUNGSI SEL 1.kupu. reproduksi. menghasilkan energi. bahkan mereka sangat berbeda. Dari kupu-kupu hingga kanguru. Masing. sel lumba.lumba dengan sel mawar? dan apa perbedaannya. sel tergolong luar biasa. metabolism.masing organ pada tumbuhan mempunyai struktur yag berbeda. Tujuan Mengamati struktur anatomi preparat dari Akar.BAB II PROSEDUR PRAKTIKUM BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER A. dan daun Zea mays . Sel hidup memiliki ciri. Makhluk hidup ada yang tersusun dari satu sel saja. hal ini karena fungsi dari masing.

Protoplas terdi dari komponen protoplasmic dan non protoplasmic. sehingga sukar dilihat oleh mata meskipun telah menggunakan mikroskop. Pada dasarnya sel tumbuhan terdiri dari protoplas yang dikelilingi dinding sel. Alat dan Bahan Alat a) Mikroskop b) Silet Bahan a) Akar.3. jaingan penguat) b) Analisis mengenai struktur dan fungsi sel-sel penyusun jaringan di atas B. Prosedur Kerja 1) Membuat irisan penampang melintang dari semua bahan 2) Mengamati struktur anatomi ketiga preparat : a) Bentuk. Sitoplasma memenuhi . batang.reaksi kimia yang rumit (Pandey. didalamnya terjadi reaksi. susunan. Sel tumbuhan diartikan sebagai suatu kehidupan kecil yang membatasi batas nyata atau dinding sel. jaringan pengangkut. Sel bagian hidujuga dikatakan sebagai kesatuan struktur fisiologi yang terkecil dari organism hidup. Biasanya dinding sel di anggap bagian mati sedangkan protoplas adalah bagian hidup dari sel. ciri khas dari sel-sel penyusun setiap jaringan pada preparat tersebut (epidermis. dan daun Zea mays 4. 1980). KOMPONEN SEL 1. parenkim. Landasan Teori Sel merupakan unit dasar umum dari struktur organic. Komponen protoplasmic ada yang bersifat cair yaitu sitoplasma Sitoplasma metupakan substansi setengah cair lebih pekat (viscous) dari air dan bening (tembus cahaya: transculent).

dan zat pewarna. garam.organel serta vakuola. Bahan. metafase. bila diwarnai dapat diliha beberapa stadium pembelahan mitosis yaitu propase. alkaloid. . Tujuan Mengamati komponen sel baik komponen yang hidup atau yang tidak hidup dalam sebuah sel 3. Fase. Pada akar Allium cepa yaitu pada bagian ujungnya. Alat dan Bahan : Alat a) Mikroskop b) Silet Bahan c) Umbi kentang.ruangan sel hidup dan didalamnya terdapat organel. Pembelahan ini penting untuk pertumbuhan serta menjaga agar jumlah kromososm sel induk sama dengan sel anak (2n-2n). batang bayam. Ujung bagian akar bawah terbagi tiga daerah yaitu: daerah meristem perpanjangan sel dan daerah diferensiasi. yaitu bahan.fase pembelahan mitosis dapat dilihat pada daerah meristem ujung akar Allium cepa. Landasan Teori Mitosis adalah proses pembelahan sel yang terjadi baik pada sel hewan maupun sel tumbuhan.bahan yang terdapat di dalam vakuola digolongkan sebagai bahan.bahan ergastik. Di dalam vakuola bisa terlarut berbagai zat seperti gula. 2008). daun bunga pukul empat 4. PENGAMATAN PEMBELAHAN MITOSIS 1. protein. 2. dan telofase. Prosedur Kerja 1) Buat irisan penampang melintang pada semua bahan 2) Amati beberapa buah sel pada setiap jaringan penyusun organ tumbuhan 3) Amati komponen-komponen sel yang terlihat dengan mikroskop yang ada C.bahan hasil meabolisme sel (Suryani.

Kertas Hisap 4. Mikroskop 2. Pembakar bunsen / lampu spiritus 8. Asetokarmin 2. Cawan petri 6.2. Jarum preparat 5. Alat dan Bahan Alat 1. 5. 3. tetapi jangan sampai mendidih 4. Asam Klorida (HCl) 3. 6. Hisaplah kelebihan asetokarmin dengan kertas hisap. Tetesi preparat tersebut dengan polienil alkohol (Fenil Lakto Fenol) di sampingnya (jangan kena preparat). Fenil Lakto Fenol 4. Akar bawang 5. Silet Bahan 1. Tujuan Mengetahui kedudukan kromosom pada fase. Gelas penutup 4. Gelas objek 3.fase pembelahan mitosis pada akar Allium cepa. 2. Panaskan preparat tersebu di atas api bunsen atau lampu spiritus sampai menguap. Rendam bawang pada air dalam gelas biarkan selama 2-3 hari. . Potong akar bawang sepanjang 1 cm kemudian rendam pada asetokarmin dan HCl dengan perbandingan 9 : 1 3. Pindahkan potongan aakar bawang yang sudah dipanaskan ke gelas objek dan beri satu tetes asetokarmin biarkanlah lebih kurang 30 menit. Gelas piala 500 ml 7. Prosedur Kerja 1.

coli sebagai host. marker yang memungkinkan adanya seleksi (biasanya gen resisten antibiotik) dan region yang mampu disisipi oleh fragmen DNA dari luar (Lodish et al. Alat dan Bahan Alat 1. sehingga dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Plasmid biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan menggunakan E. D.). dan berbagai enzim. interferon.hati gelas penutup jangan sampai pecah) 8. Bunsen burner 2. Tujuan Melihat cara kerja isolasi DNA plasmid 3. DNA plasmid mengalami duplikasi sebelum pembelahan sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri. khususnya bakteri dan sel eukariotik tingkat rendah misalnya yeast. Cawan petri . tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Landasan Teori Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot. ISOLASI DNA PLASMID 1. Amati di bawah mikroskop 9. yaitu : a replication origin.7. 2. Penggunaan plasmid dalam DNA rekombinan dilakukan karena plasmid memiliki tiga region yang berperan penting untuk DNA kloning. Tutup dengan gelas penutup kemudian di tekan dengan menggunakan pensil sampai preparat pipih (hati.

Pelet sel bakteri diresuspensi dengan 250 µl Buffer P1 sampai homogen. Shaker incubator 11.700 x g selama 5 menit. Refrigerator 10. DNA vektor pUC19 diisolasi menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen. Spidol marker 12. Kultur bakteri hasil inkubasi 16 jam sebanyak 3 ml diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5. Glove 5. Es batu 4. Microcentrifuges 5415D (Eppendorf) 8. Freezer 4. USA) 4. Koloni tunggal bakteri JM transforman pUC19 dinokulasikan ke 25 ml medium LB cair dan diinkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (semalam). USA). Medium Luria Bertani (LB) agar dan LB cair. Erlenmeyer 100 ml 7. E. 3.3.Coli JM109 yang mengandung plasmid pUC19 3. Pelet sel diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dan disentrifugasi dengan kecepatan 5. Micropipette segala ukuran 9. 5. Prosedur Kerja 1. 5. 13. 4. 2.700 x g selama 5 menit. Ampisilin 2. Jarum ose 6. . QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen. Tube microsentrifuge Bahan 1. Tip micropipette segala ukuran (Bio=Rad dan Axygen Scientific).

dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit. dan ke dalam QIAprep spin column ditambahkan kembali 750 μl buffer PE. 10. Suspensi selanjutnya ditambah 350 µl N3 dan diresuspensi dengan cara yang sama sehingga warna suspensi kembali seperti warna awal.5 ml baru dan ditambah dengan 50 μl buffer EB. Cairan yang melewati membran dibuang dan QIAprep spin column dimasukkan kembali ke dalam tabung mikrosentrifuga. 9. Tabung mikrosentrifuga beserta QIAprep spin column disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi kedua). Tahap selanjutnya tabung mikrosentrifuga disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm (17. 11.900 x g) selama 10 menit. Cairan yang melewati QIAprep spin column kembali dibuang dan disentrifugasi ulang untuk menghilangkan sisa buffer pencuci. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1. 14. . Cairan yang melewati QIAprep spin column dibuang. 7. QIAprep spin column dicuci dengan 500 μl PB dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit. dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi pertama).5 ml yang lain dan ditambah dengan 50 μl buffer EB.6. 15. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1. 8.900 x g) selama satu menit. 12. Suspensi ditambah 250 µl Buffer P2 dan diresuspensi kembali dengan cara dibolak-balik sebanyak 4-6 kali. 13. 16. Suspensi yang dihasilkan akan berubah warnanya menjadi biru. Supernatan yang dihasilkan dipindah dengan cara memipet ke dalam collection tube yang dilengkapi dengan QIAprep spin column dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000 rpm (17.

700xg (5000 rpm). shaker 150 rpm. bolak balik + 250 µl Buffer P2 Bolak-balik sebentar Warna mjd BIRU + 350 µl Buffer N3 Bolak-balik sebentar Warna BIRU hilang + 750 µl Buffer PE Sentrifugasi DNA plasmid Cairan dibuan g 13.000 rpm. 5' Kolom pindah + 500 µl Buffer PB Sentrifugasi + 50 µl Buffer EB Sentrifugasi 13. + 1 ml STE resuspensi 5' Sentrifuga si 5000 rpm.Skema kerja Isolasi DNA Plasmid menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen.000 rpm. USA) @ 3 ml E.000 rpm.000 rpm.000 rpm. 1' Sp dipinda h Sentrifugasi 13. 1' . 1' Sp dibuan g Cairan dibuan gg + 250 µl Buffer P1 Resuspensi (vortex. 1' 13.coli transforman pUC19 25 ml LB Inkubasi 370C. 16 jam 1 Cairan dibuan g Sp dibuan g Sentrifugasi 5.000 rpm. 5' Sentrifugasi 13. 1' Sentrifugasi 13.

Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA). EcoRI dan PstI dapat memotong masing-masing strand DNA. Enzim restriksi akan mengenali sisi restriksi suatu fragmen DNA yang biasanya terdiri atas 4 – 8 pasang basa. Beberapa enzim seperti BamHI. Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian dapat berasosiasi dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain yang juga telah dipotong dengan enzim restriksi.E. Pemilihan enzim restriksi untuk pemotongan fragmen DNA pada suatu teknologi DNA rekombinan didasarkan pada beberapa hal. AGCT merupakan sisi pengenalan AluI. Manipulasi pemotongan DNA dilakukan oleh enzim yang disebut endonuklease restriksi. yaitu : ukuran fragmen. Sisi pengenalan enzim restriksi tersebut berbeda – beda pada suatu fragmen DNA. misalnya BamHI yang diperoleh dari Bacillus amyloliquefaciens memiliki sisi pengenalan yang akan memotong pada basa G nomor 2 dari tepi masing – masing strand (Lodish et al.). Enzim – enzim restriksi yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan berasal dari beberapa bakteri. Landasan Teori Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu organisme dalam jumlah besar. GAATTC merupakan sisi pengenalan EcoRI. namun biasanya enzim restriksi akan memotong pada ujung yang berbeda pada 2 strand sehingga menghasilkan sisi lengket (sticky ended). Enzim restriksi akan memotong fragmen DNA di ujung yang sama pada 2 strand (blunt ended). Molekul DNA rekombinan dapat diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang memiliki daerah pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom. Sisi restriksi tersebut biasanya berupa pas. sensitivitas terhadap metilasi.angan basa palindrom. blunt-ended atau sticky-ended fragment. RESTRIKSI DNA PLASMID 1. Enzim restriksi dengan sekuens . kompatibiliti terhadap kondisi reaksi.

Volume akhir untuk komponen reaksi biasanya 10 – 50 µL. Micropipette segala ukuran 4.pengenal lebih pendek akan menghasilkan lebih banyak potongan fragmen DNA. Freezer 2. buffer dan enzim. Korea) . Glove 3. Tujuan Melihat cara kerja pemotongan DNA plasmid 3. Spidol marker 6. Microsentrifuge 5415D (Eppendorf) 5. Tube microsentrifuge 8. Metilasi biasanya terjadi pada DNA mahluk hidup dan bervariasi polanya sehingga dibutuhkan enzim restriksi yang cocok untuk DNA yang mengalami metilasi dengan pola tertentu. Sticky ended biasanya lebih efisien dalam ligasi sedangkan blunt ended biasanya dikenali oleh enzi khusus yang cocok dengan tipe pemotongan blunt ended. Pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH. Komponen reaksi (master mix)restriksi terdiri dari : air. DNA. Komponen enzim ditambahkan terakhir pada saat pembuatan master mix (Anonim. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 7. Alat dan Bahan Alat 1. Volume di bawah 10 µL tidak dianjurkan karena memiliki kemungkinan yang sangat besar untuk terjadinya kesalahan pipeting. 2007). 2007). Apabila terdapat 2 enzim yang cocok untuk suatu reaksi yang sama maka kedua enzim ini dapat ditambahkan pada reaksi dengan reaksi bufer dan suhu yang sama (Anonim. 2.

tabung mikrosentrifuga selanjutnya diinkubasi pada suhu 70 0C selama 10 menit menggunakan Water Bath. EcoRI.5 µl. Buffer E 3. ddH2O 5. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml sesuai dengan hasil optimasi reaksi restriksi. BSA 2. 4. BSA. dengan komposisi Buffer E. Vektor pUC19 dipotong dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotongan DNA genom. Misalkan reaksi restriksi bekerja secara optimum dengan komposisi Buffer E sebanyak 5 µl. Hal ini dilakukan untuk inaktifasi enzim restriksi. Pst I 4. dan PstI sebayak 2 µl untuk vinal volume 50 µl. 7. 2.Bahan 1. Tabung mikrosentrifuga yang berisi campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu 37 0C selama 4 jam menggunakan pemanas air (Water Bath). yaitu enzim PstI. Prosedur Kerja 1. Buffer H 4. BSA sebayak 0. 6. DNA plasmid pUC19 6. . DNA pUC19 sebayak 20 µl. Tabung mikrosentrifuga diketuk sebentar untuk memastikan campuran sudah tersuspensi. Optimasi reaksi restriksi sebelumya dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan DNA dapat terpotong sempurna dengan kondisi optimasi tersebut. DNA dan PstI 3. Campuran reaksi dihomogenkan sebentar menggunakan mikrosentrifuga selama 1-2 detik. 5. larutan DNA hasil restriksi disimpan di dalam Freezer. Restriction enzyme of Hind III. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml. Es batu 7.

suhu 700C dg waterbath. 2” Ketuk-ketuk Inkubasi 37 0C. 10 menit . dg Water bath selama 4 jam Simpan di frezer Inaktifasi.Skema Kerja Restriksi DNA plasmid 1 2 3 4 5 6 7 P1 P2 P3 Spin sebentar.

Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. kuantifikasi DNA. Sarung tangan 5. Labu Erlenmeyer 50 ml 3. Tujuan Melihat cara kerja elektroforesis gel agarosa 3. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 6. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20. Makin besar ukuran molekulnya. Gelas Ukur 1000 ml 2. Kertas parafilm . pemisahan dan ekstraksi fragmen DNA (Anonim. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet. 2. makin rendah laju migrasinya. Landasan Teori Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Elektroforesis gel agarosa biasanya digunaka untuk analisis ukuran dan konformasi sampel DNA. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA 1. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa.F. 2010).000 pasang basa (bp). Tabung mikrosentrifuga 4. Alat dan Bahan Alat 1.

DNA marker. Prosedur Kerja 1. Agarosa 3.1 g asam asetat glacial. UV transluminator 10. b. EDTA 120 mM) 9. 57. Buat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245 ml akuades. Sampel DNA. 3. misalnya DNA λ yang dipotong dengan HindIII 6. Akuades 5.2 g untuk dilarutkan ke dalam bufer TAE 1x hingga volume 20 ml. dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml) 4. 15% ficoll tipe 4000. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0. lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masingmasing ujung baki) 4. Siapkan baki gel agarosa. DNA plasmid hasil isolasi (uncut) c. Loading dye 6x (0. Kaca mata UV 11. 100 ml EDTA 0.7. Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base. Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir menyentuh dasar baki . 2. Kamera digital Bahan 1. Larutan Etidium Bromid (EtBr) 2. DNA plasmid hasil restriksi (cut) 4. DNA kromosom bakteri.5 M pH 8.25% bromophenol blue. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna. misalnya : a.25% xylene cyalol. 0. Seperangkat alat elektroforesis 8.

amati pita-pita DNA yang tervisualisasi. 11. biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat. masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE). 17. siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis. . ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya). nyalakan UV transluminator. 16. 9. aturlah voltase dan waktu running hingga diperoleh angka 70 V dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus. jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus. kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel agarosa. masukkan 10 µl sampel DNA dan 2 µl loading dye 6x ke dalam sumuran gel agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet. lepaskan selotip dari ujung-ujung baki. ambil sisir dengan hati-hati. 6. 14. 8. nyalakan sumber arus. 12. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar. keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas UV transluminator). yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. 7. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis. hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran. jika tidak demikian. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan. 13. tambahkan 1 µl etidium bromid (PERINGATAN KERAS!!. jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60 0C. elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis. gunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik). 10. buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan.5. 15.

herbisida. Sel E. coli disisipi vektor DNA rekombinan yang disisipkan ke dalam plasmid.G. Apabila vektor DNA rekombinan telah terintegrasi dengan sel inang maka sel tersebut dapat dikatakan telah ditransformasi. coli JM109 1. Sel kompeten merupakan sel yang memiliki kemampuan untuk disisipi DNA dari luar. coli hasil transforman mengandung plasmid dan salah satu ciri sel yang disisipi plasmid adalah resisten terhadap antibiotik (ampisilin). Strain E. E. coli tersebut akan berubah karena mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. maka untuk mendapatkan sel transforman cukup mudah yaitu dengan menumbuhkan sel hasil transformasi pada media yang mengandung ampisilin. TRANSFORMASI SEL E.coli. Teknologi ini digunakan dalam usaha memperoleh tanaman yang tahan terhadap infeksi bakteri. termometer 3. sel tersebut akan memperbanyak diri sehingga jumlahnya menjadi banyak. Landasan Teori Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang bakteri misalnya bakteri E. coli 3. Transformasi merupakan hal yang penting karena menghasilkan organisme rekombinan sesuai dengan gen yang disipkan pada vektor. Transformasi dilakukan dengan menggunakan sel kompeten. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 5. jamur. Alat dan Bahan Alat 1. pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH. shaker-incubator 2. Korea) . karena fenotip strain E. 2. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf) 6. Tujuan Praktikum ini bertujuan untuk melakukan transformasi pada sel E. Tabung mikrosentrifuga 4. coli biasanya digunakan sebagai sel kompeten. Setelah diinkubasi.

atau dengan kata lain perbandingan antara volume media dan volume kultur 10:1. coli JM 109 2. coli JM 109 ke media LB cair. es batu 4. . coli JM 109 dikultivasi ke media LB cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni strain E. media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG 5. Ltd. 4. Sebanyak 1.) 12. diresuspensi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5. Inkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (semalam). shaker-incubator tipe EFM-60 (Seiwa Rico. kamera digital. Prosedur Kerja 1. strain E. Bahan 1. cawan Petri 10. jarum ose 8. Kultur semalam strain E. media LB cair 3. media cawan LB ampisilin dan media cawan LB tanpa ampisilin 4. coli JM 109 hasil inkubasi semalam ke media LB cair 25 ml dengan cara mengambil 250 μl kultur E.700 x g selama 5 menit.7.5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5. kemudian dilakukan inkubasi dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm selama 120 menit (2 jam) pada suhu 37oC. coli JM 109 ke dalam media LB cair 25 ml. 3. Pindahkan kultur E. 2.700 x g selama 5 menit. Erlenmeyer 11. batang drugalsky 9. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 μl CaCl2 dingin.

5 jam pada suhu 37oC. dua diantaranya untuk inkubasi 2 jam dan 3 lainnya untuk inkubasi 16 jam.5 jam. kemudian diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik dengan suhu 42oC dan segera dipindahkan ke dalam es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit. 9. Ketiga tabung mikrosentrifuga diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit dan diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik pada suhu 42oC dan segera dipindahkan ke es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit. salah satunya atau tabung nomor 1 ditambah dengan 10 μl palsmid pUC19 sirkuler. Supernatan dibuang kembali dan ke dalam tabung ditambahkan kembali 200 μl CaCl2 dingin. dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator selama 1. Dalam perlakuan ini terdapat lima tabung mikrosentrifuga. Sementara itu. Kedua tabung diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit. diresuspensi dan diinkubasi dalam es.5. ditambahkan 10 μl vektor pUC19 sirkuler untuk penentuan efisiensi transformasi (tabung nomor 3). sedangkan tabung nomor 2 tidak ditambah dengan palsmid. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten. Inkubasi dilakukan selama 16 jam pada suhu 37oC. 8. 7. Tabung mikrosentrifuga selanjutnya ditambahkan dengan media LB hingga 1 ml. ke dalam tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 16 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten. Selain itu. sebanyak 50 μl hasil inkubasi pada tabung nomor 2 ditumbuhkan juga pada media LB tanpa ampisilin. 2 μl vektor pUC19 rekombinan (tabung nomor 4) dan tidak ditambahkan apapun (tabung nomor 5). 12. Tabung mikrosentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah inkubasi 10 menit. 11. 10. dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37oC dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 1. 6. Sebanyak 100 μl hasil inkubasi ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp untuk kedua tabung. .

5 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp sebanyak 100 μl dan ke media cawan LB sebanyak 50 μl. Hasil inkubasi tabung nomor 3 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG sebanyak 100 μl. Disiapkan media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG dengan cara menambahkan 50 μl X-Gal dan 100 μl IPTG ke media cawan LB/Amp. Tabung nomor 4 disentrifugasi dengan kecepatan 5. Hasil inkubasi pada tabung no. 18. Σkoloni = jumlah koloni putih (dalam cfu) [pUC19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng) . 16. 14. Supernatan dibuang hingga tersisa 100 μl. coli dengan pUC19 sirkuler dilakukan penjumlahan koloni untuk diketahui efisiensi transformasinya. Efisiensi transformasi dihitung dengan cara sebagai berikut Dimana. dilanjutkan dengan inkubasi selama 16 jam pada suhu 37oC.700 x g selama 5 menit. 17.13. 15. lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama lebih kurang 30 menit. Untuk cawan yang berisi E. dan kemudian ditumbuhkan dengan cara plating ke media LB/Amp/X-Gal/IPTG.

Coli JM 109 tidak dapat dilaksanakan karena kurang terfasilitasi alat dan bahan yang ada dilaboraotium Biologi S1. karena alat dan bahan merupakan faktot utama sebagai indikator berhasil atau tidakkah suatu praktikum. karena jika salah satu alat/ bahan tidak ada maka paraktikum itu akan gagal secara keseluruhan. dan Transformasi Sel E. Retriksi DNA Plasmid. Adapun judul pengamatan Isolasi DNA Plasmid. Komponen Sel dan Pengamatan Pembelahan Mitosis. Setelah dilakukan konfirmasi dengan laboran banyak alat dan bahan yang tidak ada di laboratorium biologi S1. Hal tersebut menjadi kendala untuk dilaksanakan praktikum tersebut. . Elektroforesis Gel Agragosa. diperlukan alat dan bahan yang memadai di laboratorium. Adapun judul praktikum yang dapat dilaksanakan yaitu Hubungan Struktur dan Fungsi Sel.BAB III PENUTUP Pada praktikum Biologi Sel dan Molekuler ini.

Suryani. Medan: FMIPA UNIMED.DAFTAR PUSTAKA Kurniawan. Praktikum Struktur Pertumbuhan II. Purwokerto: Program Pasca Sarjana Universitas Jenderal . 2010. Laporan praktikum Biologi sel dan Molekuler S2 Bologi UNSOED. (Bahan Referensi) Tim Biologi UNIMED. 2009. Praktikum Genetika. 2008. Cicik. Medan: FMIPA UNIMED. Soedirman .

7 :39:907.: /:5 /.2./..317.3 .5..4 /03.3 5.0-503/0.      a  '4:20 / -.3 950 5024943.0391.355093 4254303032/9.08. 907/..703.8 .3.7 :39: 4254303 70.7.89072 3432      %::.4 :39: 8:.3:7..3 .9./.3..92745509-08079.0- 01803 /.8907 2 708978907/7 /.9   70007   4.3 0.880/..    %:-02. 40 03 :8:8 .9 950    % 470. 907.32.3 -07.4 :39:  . 03/0/ -.907-.3 . /03.0   .8.8 -.953.707   $0507.9: 70.3 70.      .8 -.5.8.50303.4.3 032  '4:20 .. /.2./.30--.2-.3.2-.7.8 54. 803.5024943.3 .9/. 032 3 /.38. /-:9:.8.35..203  $9.54943.3 . 8.303$.74803971:0 5503/471    $5/42.//.82/   .7.8.8-:107/.9.8./3.9  032 . 2.9502-:.8.. 0/:.38::.3 203.75.3..3 -:39 03/0/-.3 .7   -:1107 /.3 032 708978 .3.4.3.3203.3 -:39 03/0/  09.3907.8 /03.  a9/.2 .07. 3432    425430370.3 54..::7..38.7455099080.-./ 5.8 /03.3 8..4.3. 9079039:  5. 4 #. 202 02:33.3   ..3.9 -08.  2.2 209.9 /9.3.7 .3. 70.3.74803971:0   !02.8 2.

 80..370.8 90780-:9 /3:-..8 708978 80-0:2.3 425488 :1107  80-.3.4# !89    !7480/:707. -07::7.3 -078 .9:   #0897.2203:3.9    9.8 4592.9:032!89    592.:.3 70.4:20 a    .9078:85038    %.8 708978 /5078.89.907.3.3. /03.3 80-039..-:3 274803971:.8 90780-:9  #0.3//..3425488:1107 $ /.3   $   :1107   :1107   //    5.2.8../.8:: 80.8 708978 /5078.7 . a:39: .9 90754943 8025:73.3 43/8 4592.9430320413/ .8 /42403.3.   /09  %.3 .3:93. .5.3/.3 /.25:7.2 9.907.8::  80..38:/.3  2 808:..3 274803971:.25:7.2.5.3..89.25:7.3.7:9.3 8...8 5./3:-.270007  .32 /03.7 :39: 202. /. 80.:: :39: 202.  a  $ 80-..2.8 708978  8.8032 708978    .80. /09: 80-039.-:3 274803971:.3  /. -07::7.82/5&   8-..3 032 708978 .7 203:3.3 /..3!89   #0. 4592:2 /03..30342 ..3:39:3../.8 708978 -007.-:3 274803971:.2.8708978/825..7.3 9070- /.:.3 !8980-.3502.2 9. a  5& 80-.8 70.-:3274803971:.-:3 274803971:.3 70.85.   '0947 5& /54943 /03.91.9 .8 70.3 5024943.5. /03. /03. a  /.  2039203:3.

07.907-.3/ 17007 3.#089785..8 8:: /.$02.8  /.2 $5380-039.7    09: 09:          $25.9  2039 .980.91.907-.2.82/         9 9 9               3:-.

7:9.8   5028.: 27..3 ::7.3. /:3.  07.:. /09.748.8:.  0974147088 0 .250 -07/. .3.9/.3 /..8..9.5.9.3 /03.   5.820.3897:9:718 240:3.3 90.9.3903:39: 2028.8 17..3 0897.3:39: 20.9.39.   .2-.: 27..3%047 0974147088 207:5.3 703/.303$.. /.3/.92745509-08079..817..85.3 /.3 -07.7:9.953.8./.7:39.8..9 /5077.5.5....    079. :39: .8.8&:7 2   .3 ..883.7.7.-:3274803971:.203 3432    40:  -072:.7  2.9:8 3.91803. 0 ..0/703/.2/ /..9. -5  0974147088 0 .3 ..009741470880.203 17.3 :39: 2028.8.7.3.748.9 /.: ::7.7.2 20/. / /.707  .7:97.//.:: 0 /.3/3.  '8:8.88 ::7.07.9   0.3 83.7.203 240:  89.3 431472.-:7032007 2   %.748.250  /03.3   $0507.34/0 .3 897..3 202-.2.83.7::7.. 5.5.8.250   :.9.0391.3-08. /:3.3 .7 -0-07.8.3 09/:2-742/ .33.409 8090.   $.3.7.9: 17.83.3 8.391.3 -.:2.3 -0727.. -.3 / -..3/.203  /.3/.9 240: /.9780203:::9:-54891 .2 502-:.3:93.3 . 9070- /.3 30.3 .7 :97. 7. /.3 -. .8.309/:2-742/80-0:2/5.409    %::. /9.3 240:3.88.  %#  #$$# $   ..  2. /03.3.9 240: 8:..38..3 .8::7.3 /.3.: 27.748. 4 #.:.8  80.5.12 .3 0.7.33.

748.9. ///.7:9.3 .2.   :39: /.8.3 5..  $0507.748.33/   $./.947  .4:20 2 .7:9.3.3./3 /0   -74245034 -:0  030 ..235:7.3 -:1107 %  /03..33./083...748.7.3 -.  /03.   :.884.  .3 5488.9 . 0 . 203.89.   .83::3-.4950 % 2    &'97.. 0 ..900974147088   4.  7424842-. 2..7:9..82/. /03.257203039:/. 8.7-...7:98025:73./08   2... 0 .7:9. 2032-.707 28. .9.907  -  5..9 :. 5. :-.3 887 00974147088 / 8..2..8.38:23. ..207..8 :3.3.3 -:1107%  978 -.83 2.    $.748.8708978 . .9: ::3 -.:9  .:...7:9.30/..748.3  2 % 0/.9 0 .  2% 5/.3 .80    .3.7./.809.7:9.22.250 28.  0.3 9/.3 . 80495 200..9 /.82/.3/.748.&'  ../08    :..5 ::3 -.8.748.2-:107%3. 2    :.9./9.4  1.  5.9   2 .5.3 80495 /9.:9     !7480/:707.3/54943/03.3 -.:.2.39/:2742/ 97    .3   .    !.

.91 -07..9.3 .783403    .12//0. -.3a 09/:2-742/ !#%#$ :3.748.3.9 8:2:7.8:. -.3 90780-:9 9070- /. 0 90703/./03.3 90.3-07:-..3 ..3 -.3.3 -.5488-.9.3.3 ..3.39078.2%    8.3 5.3.-0780.2079.9/. /42403.85.9.3 20303.3 0 ./.7:9.3.3 :-..3 0/:..3   :-:3. .250  .12203:3.3..2 -..3 -:107 %  5..079.8::.8:/..25:7.::80./.8:.-0 .7. 203..9.8:.7.7:9.7.99./02.9 05.7:9.8::3.  !078. 34247 8:2:7.7:8 0 9.29. /03..703.3809.3a4.89.748.    2.3 3..89..3 a8./3/00/.32745509   -:.250/.3 . .7.748.9:7:33.3 /2.8.-0 /.2-:3 0 :9:- 30.748.3 ..9 . /8 /03.748. ..3 80-039.3 070320070 9.9    .3 .300974147088 .3 0 /.7  02:/..2-. 2030250.5.28:2:7.390.3 00974147088 5.7:9..9. 0.3 9:.7.809.3 .0/.207.7..5.7    9./.3 /.2-887/03...280:7:3.7././ 0 .. -0781.38.300974147088   2.85..7::3 ::3-.7:9.3-.7:39. 203. / /0.3 038 8.7 8:2-07 .380495/.

7:8   00974147088 .8:2-07.3942-4 . 5.49.9.80-.9.3 -07039 .00./50740 .72  .3.7:8   .3 0 /..8 &' 97.79.947   3...7.3 8:2-07 ./.7./.9.9:7:3333.3.9: .8.3 8:/.9:7..2.-.3.3 ..3.9.7. 40 .-8  .37:333 /03. .3  2039 /03.3 /909.3/. -:3 .3 09.3.300974147088 .3 80:-:3 .7:8 /./.8&'97.38:23.3.5.38:23...5..3&'97..:.3907. 59.3 /.80/.   3.3.-.38:23..7.3 808:./.947 09.2030.8:. ...3942-47:3 5.   ' /.38:2-07.959.7:8 . 8:2-07..2030.947 .8  .9.300974147088   0:...3.2/.3 /9.

:.9/.::5 2:/. /97.3 8. .9.381472.3:39:20.897.703.9 /.85.8 5.3 80 .2 80 3.2 :8.703.80 .350393 .9:/03. 9073907..3 /885 5.8 207:5.907 .3 .. 20250740 9.381472.0947  7042-3..3 .3/:3 .3 80 3.3 80 4250903  $0 4250903 207:5.3 !7./:3..9:23-079::./... 40 240:  90780-:9  5.2.:2.0391.5..397.381472.7088903907.53108-.5.-:3274803971:.. 203.303$..3 47.3.8 207:5.82/   $090.3.3. 20/.:.804250903    %::.907 .381472.953..82/.3 202507-.9. 4 #.381472.103495897.3 /885.  .92745509-08079.80 90780-:9 /./.3 2.07 3..3.381472.3 8097.203..38107 240:  0 /.3 203:2-:.7 :. 5503/471    502.3.82/ /..4 90780-:9 ..8  80 90780-:9 .39.3/ -./.3 203..3  .0947  %0344 3 /:3.    .:-.3   .3 03 03 503.3 0 /.3907.9 950    % 470.947   9072420907   %.3%047 %7.2:7 07-8/.3 90..3 202 02.3./.2583  2.380-.3.  %#$ #$$ .   $0507./.7 .8 /.25:..8.3 903 97.74803971:. /3:-.7: ./7803.3/.90728.8.4    .8  %7.2 5.9: .09477042-3.3/:3 5.5.303 .3. .8.3 :39: /885  /. .8 /03././/.38207042-3.-..3 80 . .4/885.3 -07:-.703.7  .7 80 .3.. 203/..:39: 203/.3 90.3 .3 .3 /-.3 203.3 /.3-.9.4   .5.381472..8.4-.3 5.9   8.. 8.4 $0 .3 /85.3 /03.  %7./03./-.907-.2583  $97.39-49 .8 97. .381472.4 .-.3.3 203:3.3808:..

...:-.  ...3.320/.2583   20/.9.35..3.3   897...4 9/   .7   20/.3!097  7032007  8..8   ..3/7:.#.7:2480   -../9.207..07 3..  .3 .39.4    20/..2583/.947950   $0..

25.

. .

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

3 02-.3 0 /.92.2-.-:3/3:-.2 08 :39: /3:-./03.8 /. .5.3749..9./9..5. 3:-.3 /-07 0:9 5..7.3.2.  $:5073.-:3 274803971:.35.2 507.2 08   .8 3:-. /9. /53/.:.2/.3 20/.7.:9.80-. 80.3 3:-.2.   /09 /03.8.8 75280.20880.   2039    %.  3.93020/.:-.  80.8.39.2    %.947 5../.  2 8090.3 8:: 4 /.-:3342479/.3:9/.2    $0-. .3.3  5. 2039 02:/.33907/..:39:3:-.9:3.83:-. /:.. .9..9 84.2.8 0. /33  /708:85038 /.33.-:334247/9..8   2039  /.82/    0/:.39.2-.30.    .07 3..3.3.2 8./.9.8 /.83 2.2-.83 -078  804250903 8.3 0 /. /.3. /03.2..-:3 274803971:.3 2.. .:39: 3:-.3 /03.-:3 /9.2 ..8.3 .3 8007.8 02-.8::4/03.3.82/5&87:07 80/.9.2 9..8  .3:9.3 /-:.9.-:3274803971:.3 02-.05.3 /3:-.3/03.8/9:2-:..2-.

3 /03.3.2-..39/.2 9.2 .-:3 274803971:.  2  /.25 :39: 0/:. .3 ./9.:-.09475&7042-3.  3.9.2-.80-.5:3 9.8/.8 5./53/. 20/.  2039/.     .2.3 3:-.83-078 804250903 /9.3008:39:/3:-. 9:  0 /.2 8.3 ..80.0947 5& 87:07:39: 503039:..38007.381472./.-:3   $0./3:-.802-.8 9. 9.:./.8::4 /.3.380.9 84.  .-:3 34247   ./.07 3.-:334247 /.3:93.2.947 80.7.8  ..2-.-:3 274803971:.3 /03.8::4  .3 9:  80-. 2039   %.3 :..-:3 34247  /9:2-:. .5.8 0.3/-070:95. 5.-:334247   09.25.8::4   $02039.20880..2.3:9/.3:9.  9.2583 3:-.32. 9..8 3:-.2.25..3 20/.8 /.3 01803897.8 3:-.2./.83 2.-:3 274803971:. 80.35. 80. /9. /095./.3 9.

.320/..3..5. 8.

25.

. .

2-.7.3.!%/03. .3    !% 0 20/.203..3     . /....3 .

5..8 5.0-:7.3.7.2./.8::480. ..83:-.3.93020/.: /3:-.89.25  .3/03..-:334247/9:2-:.3 2039   .

25.

 ..

3 0.3.93020/. 90788.     /.2.3 /9:2-:.05..9.    %.!%80-.9.  2039   $:5073.3.3 02:/.3 3.7.3/03.-:3 34247  /803971:.5.3 /-:.8 /03.3      80..

25.

 ..

3 /03.-:3 34  /9:2-:. 5./.3 .. 9..7.3...93 0 20/.!%   .8 3:-.8 5.

.  Ð443 :2.3.23          ..2.3 5& 87:07 /.3 503:2.3/03..3 .3.:.2.7. /.3020/.83.:01803897.   /..4 /03./.8/9:3/03...3:9.3 -078   ...   1803897..4435:9 /.3.8::4   &39: .-07:9 2.2580-.3.381472..33:-.381472.880.80-.85& /.3443:39:/09.1:  5&(4380397..25.380-.

3 -.. 80-.9:2 44$0/. 8.949 :9.947:2  .3 1.. 8.9/.3 ..2.9: 57.: 9/..3.3-. !&%&!    !.703.9 /. 8:.9.9:2  ..703..340:073 /507:.9: .-47.3 207:5./.947 -07.8 .3 202. / . . ..57../.9.. 3/.

8  !./.947:2 -44 $  .7.89..3 .9 /.82/  #0978  !.5.3 -..9 /.8/03./.381472.-47.3.3.3 9071.3 84. /.3-.9:2 90780-:9  /..2. /.:.3 ...3 %7.3 .8 $0  4    9/.5.3 !03.3-./. :7. / .3..9.3 9/.7.82/  0974147088 0 7.3 57. 90780-:9 203.3 /./ 03/.9/.703.3 $97:9:7 /..2.9:29:.3 :38 $0  4254303 $0 /..8.-47..  /.9:2 .-.3 .39488   /.080:7:.343172.3   $090.80.5:3 :/: 57.3.3.9: :-:3.8.9./..3... :39: /.8.9 /.2..8 .48.3..5.39/.49:2 44$     .-47... .3!02-0.5:3 :/: 503.

3#0107038  %244&   !7.547.9:20309. &3.3 40:07 $ 44 &$    !:740794 !747.3  $:7. $.3     . $40/72. 0/.     !7.3!&    .8 03/07..3   0/.3.7.8.%#!&$%  :73..3 57..3 ! &  .3  .0789.9:2 44 80 /.9:2 $97:9:7 !079:2-:.2 !.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful