Tugas Makalah Praktikum Biologi Sel dan Molekuler

Prosedur Praktikum Biologi Sel dan Molekuler untuk Prodi Pendidikan Biologi S2
Oleh:

Weni Astari Widia Ningsih Yovanna M.Daniel

8116174017 8116174018 8116174019 8116173011

Pendidikan Biologi B

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS NEGERI MEDAN 2011

i

DAFTAR ISI

Daftar isi ...................................................................................................... i Kata Pengantar……………………………………………………………..ii BAB I Pendahulan ..................................................................................... 1 BAB II Prosedur Praktikum Biologi Sel Dan Molekuler ........................ 2 A. Hubungan Struktur dan Fungsi Sel ................................................. 2 B. Komponen Sel ................................................................................. 3 C. Pengamatan Pembelahan Mitosis.................................................... 4 D. Isolasi DNA Plasmid ....................................................................... 6 E. Retriksi DNA Plasmid .................................................................... 10 F. Elekrtroforesis Gel Agragosa .......................................................... 14 G. Transformasi Sel E.Coli JM 109 ..................................................... 17 BAB III Penutup ......................................................................................... 21 Daftar Pustaka ............................................................................................. 22

maupun teori dan metodologi yang masih terbatas. M.ii KATA PENGANTAR Syukur Alhamdulillah. Amin. dihimpun dari sejumlah referensi meliputi hal-hal yang berkaitan dengan teknologi dalam biologi molekuler dan segala aspek yang berkaitan dengan hal tersebut. Uswatun Hasanah. penulis sampaikan puji dengan syukur kehadirat Allah SWT. baik terkait dengan studi literatur atau pustaka sebagai pendahuluan. Adapun informasi ilmiah yang mendukung penyusunan makalah ini. Penulis . sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas makalah mata kuliah Praktikum Biologi Sel dan Molekuler mengenai “Praktikum Biologi Sel dan Molekuler mengenai Prodi Pendidikan Biologi S2”. Akhirnya.Si selaku dosen pembimbing mata kuliah : Praktikum Biologi Sel dan Molekuler dan teman-teman PPs Pendidikan Biologi Angkatan 2011. mudah-mudahan amal kebaikan kita semua diterima oleh Allah SWT. yang telah memberikan Taufik dan hidayah-Nya. Oleh karena itu penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada ibu Dra. Namun penulis pada akhirnya menyadari bahwa tugas akhir ini belum sempurna banyak sekali keterbatasannya.

Secara umum keterkaitan bidang. Elektroforesis Gel Agragosa. baik secara langsung mempelajari interaksi molecular dalam bidang mereka sendiri seperti pada biologi sel dan biologi perkembangan. Komponen sel.. maupun secara tidak langsung (misalnya dengan menggunakan teknik biologi molekuler untuk menyimpulkan cirri. .cirri historis populasi atau spesies) seperti pada genetika populasi dan filogenetika. Tidak terdapat lagi garis tegas yang memisahkan disiplin.teknik tersebut dengan teknik dan gagasan dari genetika dan biokimia.teknik khusus yang khas pada biologi molekuler. Adapun materi praktikum Biologi Sel dan Molekuler ini meliputi pengamatan terhadap Hubungan Fungsi dan Struktur Sel.telaah zat kimia dan proses. Retriksi DNA Plasmid.proses vital yang berlangsung pada makhluk hidup.Coli JM 109.bidang tersebut dapat digambarkan ssebagai berikut. Biokimia.telaah atas efek perbedaan genetic pada makhluk hidup (misalnya telaah mengenai mutan).BAB I PENDAHULUAN Praktikum Biologi Sel dan Molekuler di peroleh Mahasiswa S2 Prodi Pendidikan Biologi pada semester pertama sebagai mata kuliah wajib yang seiring berjalan dengan mata kuliah teori Biologi Sel dan Molekuler. namun kini semakin memadukan teknik. Transformasi Sel E. Pengamatan Pembelahan Mitosis. Isolasi DNA Plasmid. Genetika. transkripsi. dan translasi bahan genetik.disiplin ilmu ini seperti sebelumnya. dan biologi molekuler itu sendiri telaah dalam skala molekul atas proses replikasi. Pada praktikum biologi molekuler ini menggunakan teknik. Semakin banyak bidang biologi laiinnya yang memfokuskan diri pada molekul .

reproduksi. dan ada makhluk hidup yang tersusun lebih dari satu sel. Masing.lumba dengan sel mawar? dan apa perbedaannya.masing organ berbeda.masing organ pada tumbuhan mempunyai struktur yag berbeda. hal ini karena fungsi dari masing. sel dikatakan sebagai unit dasar kehidupan. dan daun Zea mays Menganalisis hubungan struktur dan fungsi sel. Fungsi dari suatu bagian sel atau jaringan dapat di indikasikan dari struktur sel/ jaringan pada suatu organ tersebut. Tujuan Mengamati struktur anatomi preparat dari Akar. Sel adalah unit struktural dan fungsional terkecil dari makhluk hidup.beda.kupu. menghasilkan energi. batang. sel lumba. dari pohon kelapa hingga cemara semua tersusun atas sel. dan daun Zea mays . Namun sel pada setiap makhluk hidup tidaklah sama. sel tergolong luar biasa. Landasan Teori Semua makhluk terdiri dari sel. Sel hidup memiliki ciri. Sebagai bahan pertimbangan apakah bakteri memiliki kesamaan dengan sel kupu.BAB II PROSEDUR PRAKTIKUM BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER A. disebut organisme multiseluler. Makhluk hidup ada yang tersusun dari satu sel saja.ciri seperti makhluk hidup juga dapat tumbuh. bahkan mereka sangat berbeda. metabolism. disebut organisme uniseluler. merespon terhadap lingkungan mereka dan seterusnya. 2. batang.Sel meskipun memiliki ukuran sangat kecil. HUBUNGAN STRUKTUR DAN FUNGSI SEL 1. Dari kupu-kupu hingga kanguru.sel penyusun jaringan dari Akar.

ciri khas dari sel-sel penyusun setiap jaringan pada preparat tersebut (epidermis. Sitoplasma memenuhi . jaringan pengangkut. Sel tumbuhan diartikan sebagai suatu kehidupan kecil yang membatasi batas nyata atau dinding sel. Biasanya dinding sel di anggap bagian mati sedangkan protoplas adalah bagian hidup dari sel. Prosedur Kerja 1) Membuat irisan penampang melintang dari semua bahan 2) Mengamati struktur anatomi ketiga preparat : a) Bentuk. 1980). sehingga sukar dilihat oleh mata meskipun telah menggunakan mikroskop. Alat dan Bahan Alat a) Mikroskop b) Silet Bahan a) Akar.3. jaingan penguat) b) Analisis mengenai struktur dan fungsi sel-sel penyusun jaringan di atas B. parenkim. batang. KOMPONEN SEL 1. Protoplas terdi dari komponen protoplasmic dan non protoplasmic. didalamnya terjadi reaksi. Komponen protoplasmic ada yang bersifat cair yaitu sitoplasma Sitoplasma metupakan substansi setengah cair lebih pekat (viscous) dari air dan bening (tembus cahaya: transculent). susunan. Sel bagian hidujuga dikatakan sebagai kesatuan struktur fisiologi yang terkecil dari organism hidup. Pada dasarnya sel tumbuhan terdiri dari protoplas yang dikelilingi dinding sel.reaksi kimia yang rumit (Pandey. Landasan Teori Sel merupakan unit dasar umum dari struktur organic. dan daun Zea mays 4.

bahan hasil meabolisme sel (Suryani. Fase.ruangan sel hidup dan didalamnya terdapat organel. Di dalam vakuola bisa terlarut berbagai zat seperti gula. Alat dan Bahan : Alat a) Mikroskop b) Silet Bahan c) Umbi kentang.bahan ergastik. bila diwarnai dapat diliha beberapa stadium pembelahan mitosis yaitu propase. batang bayam. Tujuan Mengamati komponen sel baik komponen yang hidup atau yang tidak hidup dalam sebuah sel 3.organel serta vakuola. garam. PENGAMATAN PEMBELAHAN MITOSIS 1. Pembelahan ini penting untuk pertumbuhan serta menjaga agar jumlah kromososm sel induk sama dengan sel anak (2n-2n). dan telofase. Landasan Teori Mitosis adalah proses pembelahan sel yang terjadi baik pada sel hewan maupun sel tumbuhan. daun bunga pukul empat 4. protein. . Ujung bagian akar bawah terbagi tiga daerah yaitu: daerah meristem perpanjangan sel dan daerah diferensiasi. yaitu bahan.fase pembelahan mitosis dapat dilihat pada daerah meristem ujung akar Allium cepa. 2. alkaloid. Bahan. 2008).bahan yang terdapat di dalam vakuola digolongkan sebagai bahan. Prosedur Kerja 1) Buat irisan penampang melintang pada semua bahan 2) Amati beberapa buah sel pada setiap jaringan penyusun organ tumbuhan 3) Amati komponen-komponen sel yang terlihat dengan mikroskop yang ada C. Pada akar Allium cepa yaitu pada bagian ujungnya. metafase. dan zat pewarna.

Mikroskop 2. Gelas piala 500 ml 7. 3. Potong akar bawang sepanjang 1 cm kemudian rendam pada asetokarmin dan HCl dengan perbandingan 9 : 1 3. tetapi jangan sampai mendidih 4. Rendam bawang pada air dalam gelas biarkan selama 2-3 hari. Prosedur Kerja 1. 5. Panaskan preparat tersebu di atas api bunsen atau lampu spiritus sampai menguap. Tetesi preparat tersebut dengan polienil alkohol (Fenil Lakto Fenol) di sampingnya (jangan kena preparat).2. Pembakar bunsen / lampu spiritus 8. Asam Klorida (HCl) 3. Silet Bahan 1. Cawan petri 6. Jarum preparat 5. Pindahkan potongan aakar bawang yang sudah dipanaskan ke gelas objek dan beri satu tetes asetokarmin biarkanlah lebih kurang 30 menit. Fenil Lakto Fenol 4. Alat dan Bahan Alat 1. 2. 6. . Tujuan Mengetahui kedudukan kromosom pada fase. Akar bawang 5. Hisaplah kelebihan asetokarmin dengan kertas hisap. Gelas penutup 4. Kertas Hisap 4.fase pembelahan mitosis pada akar Allium cepa. Asetokarmin 2. Gelas objek 3.

Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri. marker yang memungkinkan adanya seleksi (biasanya gen resisten antibiotik) dan region yang mampu disisipi oleh fragmen DNA dari luar (Lodish et al. ISOLASI DNA PLASMID 1. tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. 2. Landasan Teori Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot. Amati di bawah mikroskop 9. Penggunaan plasmid dalam DNA rekombinan dilakukan karena plasmid memiliki tiga region yang berperan penting untuk DNA kloning. coli sebagai host. Cawan petri . Plasmid biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan menggunakan E. Tutup dengan gelas penutup kemudian di tekan dengan menggunakan pensil sampai preparat pipih (hati. Bunsen burner 2. DNA plasmid mengalami duplikasi sebelum pembelahan sel inang. sehingga dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang.7.). Tujuan Melihat cara kerja isolasi DNA plasmid 3. dan berbagai enzim. interferon. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin.hati gelas penutup jangan sampai pecah) 8. D. khususnya bakteri dan sel eukariotik tingkat rendah misalnya yeast. Alat dan Bahan Alat 1. yaitu : a replication origin.

DNA vektor pUC19 diisolasi menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen. 13. USA). Tip micropipette segala ukuran (Bio=Rad dan Axygen Scientific). Freezer 4. Shaker incubator 11. USA) 4. Spidol marker 12.700 x g selama 5 menit. E. 4.3. Kultur bakteri hasil inkubasi 16 jam sebanyak 3 ml diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5. Medium Luria Bertani (LB) agar dan LB cair. QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen.700 x g selama 5 menit. 5. Prosedur Kerja 1.Coli JM109 yang mengandung plasmid pUC19 3. Tube microsentrifuge Bahan 1. Microcentrifuges 5415D (Eppendorf) 8. 2. Erlenmeyer 100 ml 7. 3. Refrigerator 10. 5. Pelet sel bakteri diresuspensi dengan 250 µl Buffer P1 sampai homogen. Koloni tunggal bakteri JM transforman pUC19 dinokulasikan ke 25 ml medium LB cair dan diinkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (semalam). Micropipette segala ukuran 9. Jarum ose 6. Glove 5. Ampisilin 2. Es batu 4. . Pelet sel diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dan disentrifugasi dengan kecepatan 5.

Supernatan yang dihasilkan dipindah dengan cara memipet ke dalam collection tube yang dilengkapi dengan QIAprep spin column dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000 rpm (17. 12. 15. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1. 13. Tahap selanjutnya tabung mikrosentrifuga disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm (17. 10. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1. Cairan yang melewati membran dibuang dan QIAprep spin column dimasukkan kembali ke dalam tabung mikrosentrifuga.6. 16. Cairan yang melewati QIAprep spin column dibuang.900 x g) selama 10 menit. Suspensi selanjutnya ditambah 350 µl N3 dan diresuspensi dengan cara yang sama sehingga warna suspensi kembali seperti warna awal. QIAprep spin column dicuci dengan 500 μl PB dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit. 7.5 ml baru dan ditambah dengan 50 μl buffer EB.900 x g) selama satu menit. Cairan yang melewati QIAprep spin column kembali dibuang dan disentrifugasi ulang untuk menghilangkan sisa buffer pencuci. 9. Suspensi yang dihasilkan akan berubah warnanya menjadi biru. 8.5 ml yang lain dan ditambah dengan 50 μl buffer EB. Suspensi ditambah 250 µl Buffer P2 dan diresuspensi kembali dengan cara dibolak-balik sebanyak 4-6 kali. dan ke dalam QIAprep spin column ditambahkan kembali 750 μl buffer PE. 14. Tabung mikrosentrifuga beserta QIAprep spin column disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi kedua). . dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit. dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi pertama). 11.

+ 1 ml STE resuspensi 5' Sentrifuga si 5000 rpm.000 rpm. 5' Kolom pindah + 500 µl Buffer PB Sentrifugasi + 50 µl Buffer EB Sentrifugasi 13.000 rpm.coli transforman pUC19 25 ml LB Inkubasi 370C.Skema kerja Isolasi DNA Plasmid menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen.700xg (5000 rpm). 1' Sp dipinda h Sentrifugasi 13.000 rpm. 16 jam 1 Cairan dibuan g Sp dibuan g Sentrifugasi 5. USA) @ 3 ml E. 1' Sentrifugasi 13. 1' 13. 1' Sp dibuan g Cairan dibuan gg + 250 µl Buffer P1 Resuspensi (vortex. 1' . shaker 150 rpm.000 rpm. bolak balik + 250 µl Buffer P2 Bolak-balik sebentar Warna mjd BIRU + 350 µl Buffer N3 Bolak-balik sebentar Warna BIRU hilang + 750 µl Buffer PE Sentrifugasi DNA plasmid Cairan dibuan g 13. 5' Sentrifugasi 13.000 rpm.000 rpm.

Pemilihan enzim restriksi untuk pemotongan fragmen DNA pada suatu teknologi DNA rekombinan didasarkan pada beberapa hal.angan basa palindrom. GAATTC merupakan sisi pengenalan EcoRI. Manipulasi pemotongan DNA dilakukan oleh enzim yang disebut endonuklease restriksi.E. sensitivitas terhadap metilasi. Enzim restriksi akan mengenali sisi restriksi suatu fragmen DNA yang biasanya terdiri atas 4 – 8 pasang basa. Sisi pengenalan enzim restriksi tersebut berbeda – beda pada suatu fragmen DNA. Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian dapat berasosiasi dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain yang juga telah dipotong dengan enzim restriksi. Enzim – enzim restriksi yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan berasal dari beberapa bakteri. namun biasanya enzim restriksi akan memotong pada ujung yang berbeda pada 2 strand sehingga menghasilkan sisi lengket (sticky ended). EcoRI dan PstI dapat memotong masing-masing strand DNA. Enzim restriksi dengan sekuens . kompatibiliti terhadap kondisi reaksi. misalnya BamHI yang diperoleh dari Bacillus amyloliquefaciens memiliki sisi pengenalan yang akan memotong pada basa G nomor 2 dari tepi masing – masing strand (Lodish et al. Beberapa enzim seperti BamHI. RESTRIKSI DNA PLASMID 1. Landasan Teori Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu organisme dalam jumlah besar. Molekul DNA rekombinan dapat diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang memiliki daerah pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom. AGCT merupakan sisi pengenalan AluI. Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA).). blunt-ended atau sticky-ended fragment. yaitu : ukuran fragmen. Enzim restriksi akan memotong fragmen DNA di ujung yang sama pada 2 strand (blunt ended). Sisi restriksi tersebut biasanya berupa pas.

Glove 3.pengenal lebih pendek akan menghasilkan lebih banyak potongan fragmen DNA. Korea) . 2007). Volume akhir untuk komponen reaksi biasanya 10 – 50 µL. Volume di bawah 10 µL tidak dianjurkan karena memiliki kemungkinan yang sangat besar untuk terjadinya kesalahan pipeting. Sticky ended biasanya lebih efisien dalam ligasi sedangkan blunt ended biasanya dikenali oleh enzi khusus yang cocok dengan tipe pemotongan blunt ended. Komponen reaksi (master mix)restriksi terdiri dari : air. Microsentrifuge 5415D (Eppendorf) 5. Metilasi biasanya terjadi pada DNA mahluk hidup dan bervariasi polanya sehingga dibutuhkan enzim restriksi yang cocok untuk DNA yang mengalami metilasi dengan pola tertentu. Freezer 2. Micropipette segala ukuran 4. Tube microsentrifuge 8. Tujuan Melihat cara kerja pemotongan DNA plasmid 3. 2007). Spidol marker 6. Apabila terdapat 2 enzim yang cocok untuk suatu reaksi yang sama maka kedua enzim ini dapat ditambahkan pada reaksi dengan reaksi bufer dan suhu yang sama (Anonim. Alat dan Bahan Alat 1. Komponen enzim ditambahkan terakhir pada saat pembuatan master mix (Anonim. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 7. Pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH. buffer dan enzim. DNA. 2.

Optimasi reaksi restriksi sebelumya dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan DNA dapat terpotong sempurna dengan kondisi optimasi tersebut. Hal ini dilakukan untuk inaktifasi enzim restriksi. Tabung mikrosentrifuga diketuk sebentar untuk memastikan campuran sudah tersuspensi.Bahan 1. Campuran reaksi dihomogenkan sebentar menggunakan mikrosentrifuga selama 1-2 detik. dan PstI sebayak 2 µl untuk vinal volume 50 µl. Tabung mikrosentrifuga yang berisi campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu 37 0C selama 4 jam menggunakan pemanas air (Water Bath). Es batu 7. 2. BSA 2. 5. Buffer H 4. DNA dan PstI 3. BSA sebayak 0. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml. DNA pUC19 sebayak 20 µl. Buffer E 3. 4. larutan DNA hasil restriksi disimpan di dalam Freezer. dengan komposisi Buffer E. 6. 7. Vektor pUC19 dipotong dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotongan DNA genom. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml sesuai dengan hasil optimasi reaksi restriksi. yaitu enzim PstI. Restriction enzyme of Hind III. . ddH2O 5.5 µl. BSA. Pst I 4. tabung mikrosentrifuga selanjutnya diinkubasi pada suhu 70 0C selama 10 menit menggunakan Water Bath. EcoRI. Prosedur Kerja 1. Misalkan reaksi restriksi bekerja secara optimum dengan komposisi Buffer E sebanyak 5 µl. DNA plasmid pUC19 6.

dg Water bath selama 4 jam Simpan di frezer Inaktifasi.Skema Kerja Restriksi DNA plasmid 1 2 3 4 5 6 7 P1 P2 P3 Spin sebentar. 2” Ketuk-ketuk Inkubasi 37 0C. suhu 700C dg waterbath. 10 menit .

Landasan Teori Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Labu Erlenmeyer 50 ml 3. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). kuantifikasi DNA. Elektroforesis gel agarosa biasanya digunaka untuk analisis ukuran dan konformasi sampel DNA. Kertas parafilm . Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet. 2010). makin rendah laju migrasinya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA 1. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 6. Sarung tangan 5. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa.000 pasang basa (bp). Tabung mikrosentrifuga 4. Makin besar ukuran molekulnya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Tujuan Melihat cara kerja elektroforesis gel agarosa 3.F. Gelas Ukur 1000 ml 2. Alat dan Bahan Alat 1. 2. pemisahan dan ekstraksi fragmen DNA (Anonim.

25% xylene cyalol. UV transluminator 10.7. misalnya : a.2 g untuk dilarutkan ke dalam bufer TAE 1x hingga volume 20 ml. dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml) 4. Buat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245 ml akuades. Siapkan baki gel agarosa. DNA plasmid hasil isolasi (uncut) c.5 M pH 8. 15% ficoll tipe 4000. misalnya DNA λ yang dipotong dengan HindIII 6. lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masingmasing ujung baki) 4.1 g asam asetat glacial. Sampel DNA. Loading dye 6x (0. Akuades 5. Prosedur Kerja 1. b. DNA plasmid hasil restriksi (cut) 4. Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir menyentuh dasar baki . 0. 3. 2. DNA kromosom bakteri. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0. EDTA 120 mM) 9. Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base. Larutan Etidium Bromid (EtBr) 2. Seperangkat alat elektroforesis 8. 100 ml EDTA 0.25% bromophenol blue. Kaca mata UV 11. DNA marker. 57. Agarosa 3. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna. Kamera digital Bahan 1.

ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya). biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat. gunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik). . jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60 0C. 7. tambahkan 1 µl etidium bromid (PERINGATAN KERAS!!. 17. 9. jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus. nyalakan UV transluminator. masukkan 10 µl sampel DNA dan 2 µl loading dye 6x ke dalam sumuran gel agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet. yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. 13. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis. 14. 12. 16. buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan. aturlah voltase dan waktu running hingga diperoleh angka 70 V dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan. elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis. ambil sisir dengan hati-hati. kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel agarosa. amati pita-pita DNA yang tervisualisasi. 15. 6. 10. siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis. hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran. keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas UV transluminator). Larutan agarosa dihomogenkan sebentar. masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE). jika tidak demikian. lepaskan selotip dari ujung-ujung baki. nyalakan sumber arus. 8. 11.5.

Transformasi dilakukan dengan menggunakan sel kompeten. Alat dan Bahan Alat 1. Tujuan Praktikum ini bertujuan untuk melakukan transformasi pada sel E. coli 3. Sel kompeten merupakan sel yang memiliki kemampuan untuk disisipi DNA dari luar. coli JM109 1. Transformasi merupakan hal yang penting karena menghasilkan organisme rekombinan sesuai dengan gen yang disipkan pada vektor. termometer 3. herbisida. maka untuk mendapatkan sel transforman cukup mudah yaitu dengan menumbuhkan sel hasil transformasi pada media yang mengandung ampisilin. E. TRANSFORMASI SEL E. coli disisipi vektor DNA rekombinan yang disisipkan ke dalam plasmid. Sel E. shaker-incubator 2. Strain E. Landasan Teori Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang bakteri misalnya bakteri E. pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH. sel tersebut akan memperbanyak diri sehingga jumlahnya menjadi banyak. karena fenotip strain E. coli hasil transforman mengandung plasmid dan salah satu ciri sel yang disisipi plasmid adalah resisten terhadap antibiotik (ampisilin). Apabila vektor DNA rekombinan telah terintegrasi dengan sel inang maka sel tersebut dapat dikatakan telah ditransformasi.G. coli tersebut akan berubah karena mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. Korea) . coli biasanya digunakan sebagai sel kompeten. Tabung mikrosentrifuga 4. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf) 6. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 5. Setelah diinkubasi. Teknologi ini digunakan dalam usaha memperoleh tanaman yang tahan terhadap infeksi bakteri. jamur.coli. 2.

7. kamera digital. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 μl CaCl2 dingin. Bahan 1. atau dengan kata lain perbandingan antara volume media dan volume kultur 10:1. Erlenmeyer 11. Sebanyak 1.) 12. media LB cair 3. kemudian dilakukan inkubasi dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm selama 120 menit (2 jam) pada suhu 37oC. strain E. shaker-incubator tipe EFM-60 (Seiwa Rico. cawan Petri 10. jarum ose 8.700 x g selama 5 menit. 2. 4. coli JM 109 2. media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG 5. Kultur semalam strain E. Inkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (semalam). diresuspensi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5. batang drugalsky 9. coli JM 109 hasil inkubasi semalam ke media LB cair 25 ml dengan cara mengambil 250 μl kultur E. coli JM 109 ke media LB cair. Ltd. es batu 4.5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5. Pindahkan kultur E. coli JM 109 dikultivasi ke media LB cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni strain E.700 x g selama 5 menit. media cawan LB ampisilin dan media cawan LB tanpa ampisilin 4. 3. . Prosedur Kerja 1. coli JM 109 ke dalam media LB cair 25 ml.

11. 7. 8. . Ketiga tabung mikrosentrifuga diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit dan diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik pada suhu 42oC dan segera dipindahkan ke es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten. dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator selama 1. Tabung mikrosentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah inkubasi 10 menit. Kedua tabung diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit. Sementara itu. sebanyak 50 μl hasil inkubasi pada tabung nomor 2 ditumbuhkan juga pada media LB tanpa ampisilin. Inkubasi dilakukan selama 16 jam pada suhu 37oC. diresuspensi dan diinkubasi dalam es.5 jam pada suhu 37oC. 12. salah satunya atau tabung nomor 1 ditambah dengan 10 μl palsmid pUC19 sirkuler. sedangkan tabung nomor 2 tidak ditambah dengan palsmid. kemudian diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik dengan suhu 42oC dan segera dipindahkan ke dalam es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit. Selain itu. Sebanyak 100 μl hasil inkubasi ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp untuk kedua tabung.5 jam. 6. 10. 2 μl vektor pUC19 rekombinan (tabung nomor 4) dan tidak ditambahkan apapun (tabung nomor 5). ke dalam tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 16 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten. Dalam perlakuan ini terdapat lima tabung mikrosentrifuga. dua diantaranya untuk inkubasi 2 jam dan 3 lainnya untuk inkubasi 16 jam. ditambahkan 10 μl vektor pUC19 sirkuler untuk penentuan efisiensi transformasi (tabung nomor 3). dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37oC dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 1. Supernatan dibuang kembali dan ke dalam tabung ditambahkan kembali 200 μl CaCl2 dingin. 9.5. Tabung mikrosentrifuga selanjutnya ditambahkan dengan media LB hingga 1 ml.

Tabung nomor 4 disentrifugasi dengan kecepatan 5. Disiapkan media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG dengan cara menambahkan 50 μl X-Gal dan 100 μl IPTG ke media cawan LB/Amp.5 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp sebanyak 100 μl dan ke media cawan LB sebanyak 50 μl. Hasil inkubasi pada tabung no. 15. 18. lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama lebih kurang 30 menit. Supernatan dibuang hingga tersisa 100 μl. Σkoloni = jumlah koloni putih (dalam cfu) [pUC19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng) . 14. dan kemudian ditumbuhkan dengan cara plating ke media LB/Amp/X-Gal/IPTG. Untuk cawan yang berisi E. Efisiensi transformasi dihitung dengan cara sebagai berikut Dimana. coli dengan pUC19 sirkuler dilakukan penjumlahan koloni untuk diketahui efisiensi transformasinya.13. Hasil inkubasi tabung nomor 3 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG sebanyak 100 μl. 17. dilanjutkan dengan inkubasi selama 16 jam pada suhu 37oC. 16.700 x g selama 5 menit.

Retriksi DNA Plasmid. . dan Transformasi Sel E. karena jika salah satu alat/ bahan tidak ada maka paraktikum itu akan gagal secara keseluruhan. Hal tersebut menjadi kendala untuk dilaksanakan praktikum tersebut.Coli JM 109 tidak dapat dilaksanakan karena kurang terfasilitasi alat dan bahan yang ada dilaboraotium Biologi S1.BAB III PENUTUP Pada praktikum Biologi Sel dan Molekuler ini. Adapun judul praktikum yang dapat dilaksanakan yaitu Hubungan Struktur dan Fungsi Sel. diperlukan alat dan bahan yang memadai di laboratorium. karena alat dan bahan merupakan faktot utama sebagai indikator berhasil atau tidakkah suatu praktikum. Adapun judul pengamatan Isolasi DNA Plasmid. Elektroforesis Gel Agragosa. Komponen Sel dan Pengamatan Pembelahan Mitosis. Setelah dilakukan konfirmasi dengan laboran banyak alat dan bahan yang tidak ada di laboratorium biologi S1.

Purwokerto: Program Pasca Sarjana Universitas Jenderal . Medan: FMIPA UNIMED. Praktikum Genetika. 2009. Laporan praktikum Biologi sel dan Molekuler S2 Bologi UNSOED. Medan: FMIPA UNIMED. Cicik. Soedirman . Praktikum Struktur Pertumbuhan II. Suryani. (Bahan Referensi) Tim Biologi UNIMED. 2010.DAFTAR PUSTAKA Kurniawan. 2008.

8.. 4 #..4.3.9/. 2.4.82/   .    %:-02. 907/./.75.5024943.  2.3 .::7.. 03/0/ -.50303.3 .3..9 950    % 470.303$.0- 01803 /.9  032 .3   .9   70007   4../..7 :39:907.3 . 3432    425430370.3203./.0   . /-:9:.3.9 -08.3 -:39 03/0/-.07.4 :39: 8:.9 /9.2 .4./3.2.317. 202 02:33.74803971:0 5503/471    $5/42...9.7 :39: 4254303 70.8907 2 708978907/7 /. 70.      a  '4:20 / -.3.74803971:0   !02.3 .8.3. 907. 803./ 5.953.//.3 54.707   $0507.3 032 708978 . /03.      .9502-:.2-.3 .4 :39:  .89072 3432      %::.32..8 /03.3.8.8 /03.3:7.2.0391. 40 03 :8:8 .35.8 2. 9079039:  5.5..9.8.3 032  '4:20 .3 ..3 203.9: 70. 032 3 /.3.  a9/.355093 4254303032/9.8-:107/.30--.8.203  $9.92745509-08079.-.8 54.880/.7.54943.3 5. /..3 -:39 03/0/  09.3 8. 8.8..38.3.3 70.8 -.38::.907-.5.3.7.4 /03.3 -07.8 -..703.3907.3.: /:5 /.08.3.7455099080.0-503/0. 0/:.2 209.7   -:1107 /.8 .7 .38.2-.3 950 5024943.3 0.7.

3502.9    9.907...-:3 274803971:.3//.91.8 90780-:9  #0. a  5& 80-.8 70.907.270007  ..9 90754943 8025:73..8 708978 -007. /. /03.3 9070- /.8 90780-:9 /3:-.3!89   #0.2.8 5.:: :39: 202.3  2 808:. /09: 80-039.38:/.82/5&   8-.5.3 425488 :1107  80-.25:7.3.3 43/8 4592.9430320413/ .3.9:   #0897.4:20 a    ..5.  2039203:3.7 203:3..3.8 70.3 -078 .3.89.-:3 274803971:..2 9.... 80..9:032!89    592.3/.   '0947 5& /54943 /03.8 708978 /5078.3 8.9078:85038    %.3:93.2.3  /.25:7.:.3 032 708978 .8 708978 /5078.3 /.3   $   :1107   :1107   //    5.8032 708978    .8.8 4592.3 80-039..3 !8980-.7. a:39: ..3:39:3.-:3 274803971:.80. /03.7:9./.89.3.3 5024943.2.3 /.25:7.32 /03. 4592:2 /03. -07::7.7 .   /09  %.7 :39: 202..3425488:1107 $ /.8::  80.30342 .8:: 80.2 9.  a  $ 80-.2..5. /03.:.8 708978  8... -07::7./.3 .4# !89    !7480/:707.85.3 274803971:.9 . .3 70.3 70.-:3 274803971:.8 708978 80-0:2./3:-.370.8 /42403.8708978/825.3. 80.-:3274803971:. a  /.2203:3.

2 $5380-039.907-.91.#089785.7    09: 09:          $25.9  2039 ..8 8:: /.07.980.2.907-.3/ 17007 3.82/         9 9 9               3:-.$02.8  /.

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

707 28.3/54943/03.9 0 ..  2% 5/.257203039:/.3 -.7-. ./.&'  .. 8..   :.22.748. ..83 2.3 .. ..:.:.8708978 .:9  . :-.8. 80495 200. 0 .  7424842-.2-:107%3./9.3 -.. 2..33.82/.80    ...5..7:9.3   .748.3 9/.9 . /03.39/:2742/ 97    .  /03./08   2.947  .9.8.7:9.9.4  1.900974147088   4.  $0507./083.4:20 2 .83::3-.7:98025:73.3.3 80495 /9.    $.2.9 :.30/.7:9.33/   $./3 /0   -74245034 -:0  030 .884.3 .. 203.9..748.7.3 .207.89..3 -:1107 %  /03.3  2 % 0/.3 -:1107%  978 -./08    :.    !.2. 0 . ///.235:7.  .250 28.3/.  0.   .   :39: /.5 ::3 -.7...7:9..3.4950 % 2    &'97..2.7:9.9 /. 5.748. 0 . 2032-.8. 2    :.38:23.3.9   2 ..8 :3./.809.3 5488.907  -  5.3 887 00974147088 / 8..9: ::3 -...7:9.748.3.3 5.748.748...82/.:9     !7480/:707.  5.

 0. .2-.3 0/:.99.9.380495/..3 .29..3-. -. 2030250.3 5./03. 0 90703/.3 90780-:9 9070- /.2%    8.8:.3.-0780.-0 .2-:3 0 :9:- 30.300974147088   2. /03.7    9.7.3.7:9.85.250/../02.3 -:107 %  5. -.3 .8::3./.3 0 /. / /0.250  .3 80-039. .9.8:.91 -07.::80.8:.7.3 .748.3 038 8..8::.207.3809.3.3   :-:3.2079.9:7:33.2 -.783403    ...3 .7.7.7..38.8:/. .32745509   -:.7:9.3.89.7.5.3 -.7:9.748.5.3 -..3 070320070 9.3a4.7:8 0 9.9..3 .3.3./ 0 .3-07:-..9 8:2:7.7.. /42403..079.3 20303..7:9./.85.7::3 ::3-. -0781.25:7..12//0.9.9 05.280:7:3.39078.3 /2.9/.3 /./. /8 /03.390..3 .. 34247 8:2:7.9..3 :-..5488-.3 3./3/00/..3a 09/:2-742/ !#%#$ :3.703.748. 203./. 203.8.748.3.3 0 .7 8:2-07 .3 9:..7:39.3 00974147088 5.12203:3.  !078.7  02:/.300974147088 .-0 /..3 90.0/.28:2:7.3 a8.7:9.809.748.    2..9    .89.3 .2-887/03...9 .

 .00....8.7.5.3.9.8:2-07.38:2-07.3/.80-.959.3 09.3  2039 /03.7. 40 . 8:2-07.3942-47:3 5.3.3&'97. 59..38:23./.2/..9:7.947 .3 /909..3 80:-:3 .38:23.2030.   3. .9.3 .5..8:.3 808:.38:23.:.300974147088   0:.8 &' 97.3942-4 .300974147088 .9: .49.37:333 /03.9.7:8   00974147088 ./50740 .-.3 /.72  .3.2030.3 0 /.3.3 -07039 ..   ' /.3.-8  .8  .2.9./. 5.7.7:8 /.80/..3./..7.947 09. -:3 ./..947   3.-...3907.3.3.9.9:7:3333.7:8 .3 8:2-07 ...7:8   .8&'97.79.3 8:/.3 /9.

303$.3 80 ./.09477042-3.381472.3 !7.3.203..4    ./.3/ -.8. 4 #..3 8097.3 202507-. 5503/471    502.8.350393 .53108-.3 /03.3 203.85../. 20/.:-.3/.3 90.381472.3 202 02.3 80 4250903  $0 4250903 207:5..703.:2.:..4/885.3 .9   8. /3:-..    ..3 :39: /885  /. . 203.2583  2.-.4   . .4 .3.303 ..5.//.381472.9/..3 /885.3/:3 5.3 /85.3 /-.3/:3 .. 20250740 9. /97.9.2 :8.3 -07:-.3   .0391.3 203..3 .9 /..3 80 .9: .9:23-079::.07 3.3-.4 90780-:9 .947   9072420907   %. .:.380-.7 80 .3. ./:3.2 5.74803971:.3:39:20.381472.381472.7088903907.2../03.82/.3 /885 5.8 207:5.9. 8. 9073907.8 97..8  %7.7: .907 .::5 2:/.3 80 3.3 .8 5.703. 40 240:  90780-:9  5.3.8.3 03 03 503.0947  7042-3..804250903    %::.2583  $97. 203/.38107 240:  0 /./-.:39: 203/./.3 8.2 80 3.703.  %#$ #$$ .3 .4-.4 $0 .381472.3 0 /.397.82/ /.381472.3 2.80 90780-:9 /.38207042-3.7 :.3.5..8 /03..39-49 .2:7 07-8/..80 .  %7.5..   $0507../.8  80 90780-:9 .3907.3.907 .3 203:2-:.7 ..3.7  .8.25:.3.90728.3%047 %7..5.  .8 207:5.-:3274803971:.82/   $090.9:/03.3 47.103495897.3 90.3 203:3.381472.0947  %0344 3 /:3.-.3808:.907-.39./7803.92745509-08079.9 950    % 470.3..3  .3 5. .3 /./.953.9.8 /.3 903 97.897.3.

  .3 ..8   .3.7   20/..947950   $0.:-.7:2480   -.4    20/.4 9/   .3..3!097  7032007  8....35..2583/.2583   20/...3   897..207..9.#..07 3./9.3/7:...  ..320/.39.

25.

 ..

.3    .2023/.3:9:7 ..2 20/.8 /03.2.7 2 /03./.07 3.8  752 80.3 0 /.3 /803971:.947 /03.3  80.2020/.   :9:7802.7.. /33  /708:85038 02:/.9.38.7 3:-.3 . .3.8802.!%   08-.. 203.4 .:.7  2 /03....80 20/.2-    :9:7   .05.4:20 20/..8::4    $0-.3 3:-.30.2.3 /-:. /.3  80.3 /2.2-./.:-.2039    $:5073.8:. .2 5.8//..3 .9:443897..05.2039  .3 0 /.3 0.07 3.947/03.3 /.28.3 .3 0.2 /.8752 5...3/3.  .7  2  .39.2 8.4 /:9..-:3 274803971:...3 /.: /03.3 803971:.2    !3/.3 . .2.2897.05.8  ..3 .05.3 /.7.3.2 9.   2039  .3749.2.3 749..9.9:    !7480/:707.4 020/.3 .8 3:-.3 .4:20 :9:7    02:/. /..7..3 /.8.:-.9.:.9.-:3 /9.3 507-.9.9..8 /03.3 0.8::480.   2 :9:7 .2 9.2 802.2- /.8 /.83:-.4    0 /.9..

7.:.8   2039  /.8 /.-:3 274803971:./.2 08   .3.3 /-07 0:9 5.3749.    .3 0 /.2..8.-:334247/9.8.  80..-:3/3:-.3 8007.-:3 274803971:.8/9:2-:..20880. /33  /708:85038 /.2/.5..3 /3:-.9:3..3. /:. 2039 02:/.   /09 /03.2 9.3 2.3 0 /.-:3342479/.33907/.83 -078  804250903 8. /. /03.8  .2-.2 .3:9.2./9.92.2    $0-. 3:-.2 08 :39: /3:-.8 75280.:39:3:-..:-.3 .-:3274803971:.3.8 3:-.9.39.947 5.:39: 3:-.3/03. .  3. .9.2.82/5&87:07 80/../.80-.39.3 /-:.2.  $:5073.2 8. .3:9/./03.   2039    %.8::4/03.3.3.82/    0/:.93020/.3.05.35.33..3 8:: 4 /.07 3.9..83 2.9.5. 80.-:3 /9.9 84.  2 8090.30.8 0.2-.9..2-..8 02-.3 02-..3 02-.2    %.3 20/.8..8 /.3  5.3 3:-.3 /03.83:-.2-. .:9.2 507.7.. /9. /53/.

:-./. 2039   %..3:9/.83 2..3 :.381472.2-.2 8.-:3 34247   .2-.3.9./.3 3:-.80.:.3 20/.  9.3 01803897..38007.09475&7042-3.32././.83-078 804250903 /9./3:-.3. .8 9.2-.25.3/-070:95.-:334247   09.-:3 274803971:.25. 9:  0 /. 9.-:3 274803971:.5.3008:39:/3:-.8 /.  3.3 9:  80-.2.0947 5& 87:07:39: 503039:..  2039/.8/.8::4  ..2./..9 84. .39/.3:93.2.80-..  2  /.2.3 .8::4 /.8 3:-.35.07 3.2583 3:-. /095.8 5.8 3:-.8 0.8  .-:3   $0. 80.. 80.3 9.     . /9.5:3 9./53/.-:334247 /.20880.802-.3 /03.2 9.947 80.380.2.7.2 . 9.8::4   $02039. 5.  .3 /03.-:3 274803971:. 20/.-:3 34247  /9:2-:.25 :39: 0/:.3:9.3 ./9.

 8.3.5...320/..

25.

. .

3.3    !% 0 20/..!%/03. /..3 .3     .2-.203.7... .

89..8 5..0-:7.7.93020/./. .: /3:-.5.2.-:334247/9:2-:.3.3 2039   ..8::480.25  .3/03.83:-.3.

25.

 ..

7.     /.3.!%80-..3 0.3 /-:..3      80.3 02:/.2.3.8 /03.9.3 3.3 /9:2-:. 90788.  2039   $:5073.9.    %.5.93020/.3/03.05.-:3 34247  /803971:.

25.

 ..

93 0 20/.3 /03./.!%   .8 3:-..3 .8 5.-:3 34  /9:2-:. 5.7.3.. 9...

380-./.25.85& /.3.3 -078   .7..   1803897.2580-.3.2...3.83..:01803897.1:  5&(4380397.-07:9 2.4 /03.3/03.3020/..:.  Ð443 :2.3.3 503:2.381472. /.3443:39:/09.   /.3 5& 87:07 /.....381472..8::4   &39: .80-.8/9:3/03.33:-.3:9..3 .4435:9 /.23          .880.2.

3 202.3 -.9.. 8. !&%&!    !./.-47.3 .703.9/. 8:. 8.8 ./.9: 57.9:2  ...3-..57.. / .: 9/.947 -07. ..9. .3 1.947:2  .3.9:2 44$0/.9 /.2.3 207:5. 80-..9: .. 3/.340:073 /507:.949 :9.703..

 /..8.3 $97:9:7 /.5..80.3..703.3.7.343172.89.3   $090.3 .9.82/  0974147088 0 7.3 %7.9 /./ 03/...9:29:.2.39/.3 . .3 84.8 $0  4    9/.080:7:./.3.39488   /.8 .8  !. / .3 /.3 9071.8.3.3 .3 -..3-. :39: /..5.9/.2.-47..9:2 ..9 /.7.381472.3-.3.9:2 90780-:9  /.3 9/..  /./.2.3 :38 $0  4254303 $0 /.5:3 :/: 503..3.3!02-0...:.5.. :7.49:2 44$     .9.8/03.8.48.3 57..3.9: :-:3.5:3 :/: 57.3 ..82/  #0978  !. 90780-:9 203./.947:2 -44 $  ./. /.-47.3 !03.-47.9 /.-.

3  .     !7.3#0107038  %244&   !7.3 57.8 03/07. $..7.%#!&$%  :73.0789.3     . $40/72.3  $:7.3.9:2 $97:9:7 !079:2-:..3   0/. &3..9:20309.8.3!&    .3 40:07 $ 44 &$    !:740794 !747. 0/.9:2 44 80 /.547.3 ! &  .2 !.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful