Tugas Makalah Praktikum Biologi Sel dan Molekuler

Prosedur Praktikum Biologi Sel dan Molekuler untuk Prodi Pendidikan Biologi S2
Oleh:

Weni Astari Widia Ningsih Yovanna M.Daniel

8116174017 8116174018 8116174019 8116173011

Pendidikan Biologi B

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS NEGERI MEDAN 2011

i

DAFTAR ISI

Daftar isi ...................................................................................................... i Kata Pengantar……………………………………………………………..ii BAB I Pendahulan ..................................................................................... 1 BAB II Prosedur Praktikum Biologi Sel Dan Molekuler ........................ 2 A. Hubungan Struktur dan Fungsi Sel ................................................. 2 B. Komponen Sel ................................................................................. 3 C. Pengamatan Pembelahan Mitosis.................................................... 4 D. Isolasi DNA Plasmid ....................................................................... 6 E. Retriksi DNA Plasmid .................................................................... 10 F. Elekrtroforesis Gel Agragosa .......................................................... 14 G. Transformasi Sel E.Coli JM 109 ..................................................... 17 BAB III Penutup ......................................................................................... 21 Daftar Pustaka ............................................................................................. 22

yang telah memberikan Taufik dan hidayah-Nya. Adapun informasi ilmiah yang mendukung penyusunan makalah ini.ii KATA PENGANTAR Syukur Alhamdulillah. Penulis . Namun penulis pada akhirnya menyadari bahwa tugas akhir ini belum sempurna banyak sekali keterbatasannya. mudah-mudahan amal kebaikan kita semua diterima oleh Allah SWT. Uswatun Hasanah. M.Si selaku dosen pembimbing mata kuliah : Praktikum Biologi Sel dan Molekuler dan teman-teman PPs Pendidikan Biologi Angkatan 2011. sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas makalah mata kuliah Praktikum Biologi Sel dan Molekuler mengenai “Praktikum Biologi Sel dan Molekuler mengenai Prodi Pendidikan Biologi S2”. penulis sampaikan puji dengan syukur kehadirat Allah SWT. Amin. Oleh karena itu penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada ibu Dra. dihimpun dari sejumlah referensi meliputi hal-hal yang berkaitan dengan teknologi dalam biologi molekuler dan segala aspek yang berkaitan dengan hal tersebut. baik terkait dengan studi literatur atau pustaka sebagai pendahuluan. Akhirnya. maupun teori dan metodologi yang masih terbatas.

Tidak terdapat lagi garis tegas yang memisahkan disiplin. baik secara langsung mempelajari interaksi molecular dalam bidang mereka sendiri seperti pada biologi sel dan biologi perkembangan. transkripsi. Pada praktikum biologi molekuler ini menggunakan teknik.proses vital yang berlangsung pada makhluk hidup.teknik khusus yang khas pada biologi molekuler..telaah zat kimia dan proses.disiplin ilmu ini seperti sebelumnya. Adapun materi praktikum Biologi Sel dan Molekuler ini meliputi pengamatan terhadap Hubungan Fungsi dan Struktur Sel. Pengamatan Pembelahan Mitosis. Secara umum keterkaitan bidang.telaah atas efek perbedaan genetic pada makhluk hidup (misalnya telaah mengenai mutan). . Isolasi DNA Plasmid. Komponen sel. Genetika. maupun secara tidak langsung (misalnya dengan menggunakan teknik biologi molekuler untuk menyimpulkan cirri.bidang tersebut dapat digambarkan ssebagai berikut. dan translasi bahan genetik.teknik tersebut dengan teknik dan gagasan dari genetika dan biokimia.cirri historis populasi atau spesies) seperti pada genetika populasi dan filogenetika. namun kini semakin memadukan teknik.Coli JM 109. Semakin banyak bidang biologi laiinnya yang memfokuskan diri pada molekul .BAB I PENDAHULUAN Praktikum Biologi Sel dan Molekuler di peroleh Mahasiswa S2 Prodi Pendidikan Biologi pada semester pertama sebagai mata kuliah wajib yang seiring berjalan dengan mata kuliah teori Biologi Sel dan Molekuler. Biokimia. dan biologi molekuler itu sendiri telaah dalam skala molekul atas proses replikasi. Elektroforesis Gel Agragosa. Retriksi DNA Plasmid. Transformasi Sel E.

beda. disebut organisme multiseluler.ciri seperti makhluk hidup juga dapat tumbuh. Dari kupu-kupu hingga kanguru. sel tergolong luar biasa. batang. Sel hidup memiliki ciri. Landasan Teori Semua makhluk terdiri dari sel. Sebagai bahan pertimbangan apakah bakteri memiliki kesamaan dengan sel kupu. metabolism. hal ini karena fungsi dari masing.Sel meskipun memiliki ukuran sangat kecil. Masing. dan daun Zea mays . reproduksi.kupu. sel dikatakan sebagai unit dasar kehidupan. 2. Fungsi dari suatu bagian sel atau jaringan dapat di indikasikan dari struktur sel/ jaringan pada suatu organ tersebut. Namun sel pada setiap makhluk hidup tidaklah sama. dari pohon kelapa hingga cemara semua tersusun atas sel. dan daun Zea mays Menganalisis hubungan struktur dan fungsi sel. Tujuan Mengamati struktur anatomi preparat dari Akar.lumba dengan sel mawar? dan apa perbedaannya. menghasilkan energi.sel penyusun jaringan dari Akar. HUBUNGAN STRUKTUR DAN FUNGSI SEL 1. merespon terhadap lingkungan mereka dan seterusnya. Sel adalah unit struktural dan fungsional terkecil dari makhluk hidup. disebut organisme uniseluler. batang.masing organ berbeda.BAB II PROSEDUR PRAKTIKUM BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER A. Makhluk hidup ada yang tersusun dari satu sel saja. sel lumba. bahkan mereka sangat berbeda. dan ada makhluk hidup yang tersusun lebih dari satu sel.masing organ pada tumbuhan mempunyai struktur yag berbeda.

Protoplas terdi dari komponen protoplasmic dan non protoplasmic. didalamnya terjadi reaksi. Komponen protoplasmic ada yang bersifat cair yaitu sitoplasma Sitoplasma metupakan substansi setengah cair lebih pekat (viscous) dari air dan bening (tembus cahaya: transculent). Alat dan Bahan Alat a) Mikroskop b) Silet Bahan a) Akar. Sel tumbuhan diartikan sebagai suatu kehidupan kecil yang membatasi batas nyata atau dinding sel. Prosedur Kerja 1) Membuat irisan penampang melintang dari semua bahan 2) Mengamati struktur anatomi ketiga preparat : a) Bentuk. ciri khas dari sel-sel penyusun setiap jaringan pada preparat tersebut (epidermis. Sel bagian hidujuga dikatakan sebagai kesatuan struktur fisiologi yang terkecil dari organism hidup.reaksi kimia yang rumit (Pandey. 1980). jaringan pengangkut. Pada dasarnya sel tumbuhan terdiri dari protoplas yang dikelilingi dinding sel. dan daun Zea mays 4. Landasan Teori Sel merupakan unit dasar umum dari struktur organic. sehingga sukar dilihat oleh mata meskipun telah menggunakan mikroskop. KOMPONEN SEL 1. Biasanya dinding sel di anggap bagian mati sedangkan protoplas adalah bagian hidup dari sel. batang.3. jaingan penguat) b) Analisis mengenai struktur dan fungsi sel-sel penyusun jaringan di atas B. parenkim. Sitoplasma memenuhi . susunan.

Landasan Teori Mitosis adalah proses pembelahan sel yang terjadi baik pada sel hewan maupun sel tumbuhan. Prosedur Kerja 1) Buat irisan penampang melintang pada semua bahan 2) Amati beberapa buah sel pada setiap jaringan penyusun organ tumbuhan 3) Amati komponen-komponen sel yang terlihat dengan mikroskop yang ada C. 2008). bila diwarnai dapat diliha beberapa stadium pembelahan mitosis yaitu propase.bahan hasil meabolisme sel (Suryani. Di dalam vakuola bisa terlarut berbagai zat seperti gula. dan telofase. Ujung bagian akar bawah terbagi tiga daerah yaitu: daerah meristem perpanjangan sel dan daerah diferensiasi. Fase. . protein. yaitu bahan. Tujuan Mengamati komponen sel baik komponen yang hidup atau yang tidak hidup dalam sebuah sel 3.bahan ergastik. garam. 2. alkaloid. Alat dan Bahan : Alat a) Mikroskop b) Silet Bahan c) Umbi kentang. Pada akar Allium cepa yaitu pada bagian ujungnya. daun bunga pukul empat 4. Bahan. batang bayam.ruangan sel hidup dan didalamnya terdapat organel.fase pembelahan mitosis dapat dilihat pada daerah meristem ujung akar Allium cepa. PENGAMATAN PEMBELAHAN MITOSIS 1. Pembelahan ini penting untuk pertumbuhan serta menjaga agar jumlah kromososm sel induk sama dengan sel anak (2n-2n). dan zat pewarna.bahan yang terdapat di dalam vakuola digolongkan sebagai bahan. metafase.organel serta vakuola.

tetapi jangan sampai mendidih 4. .fase pembelahan mitosis pada akar Allium cepa. Gelas penutup 4. Asam Klorida (HCl) 3. Jarum preparat 5. Hisaplah kelebihan asetokarmin dengan kertas hisap. Silet Bahan 1.2. Asetokarmin 2. Panaskan preparat tersebu di atas api bunsen atau lampu spiritus sampai menguap. Kertas Hisap 4. Rendam bawang pada air dalam gelas biarkan selama 2-3 hari. Cawan petri 6. 5. Prosedur Kerja 1. Fenil Lakto Fenol 4. Mikroskop 2. 6. Gelas objek 3. Alat dan Bahan Alat 1. 3. Pembakar bunsen / lampu spiritus 8. Gelas piala 500 ml 7. 2. Pindahkan potongan aakar bawang yang sudah dipanaskan ke gelas objek dan beri satu tetes asetokarmin biarkanlah lebih kurang 30 menit. Tujuan Mengetahui kedudukan kromosom pada fase. Tetesi preparat tersebut dengan polienil alkohol (Fenil Lakto Fenol) di sampingnya (jangan kena preparat). Potong akar bawang sepanjang 1 cm kemudian rendam pada asetokarmin dan HCl dengan perbandingan 9 : 1 3. Akar bawang 5.

Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri. khususnya bakteri dan sel eukariotik tingkat rendah misalnya yeast. coli sebagai host. Tutup dengan gelas penutup kemudian di tekan dengan menggunakan pensil sampai preparat pipih (hati.7. Penggunaan plasmid dalam DNA rekombinan dilakukan karena plasmid memiliki tiga region yang berperan penting untuk DNA kloning. D. Landasan Teori Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot. Amati di bawah mikroskop 9. 2. interferon. Tujuan Melihat cara kerja isolasi DNA plasmid 3. Plasmid biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan menggunakan E. ISOLASI DNA PLASMID 1. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin. dan berbagai enzim. marker yang memungkinkan adanya seleksi (biasanya gen resisten antibiotik) dan region yang mampu disisipi oleh fragmen DNA dari luar (Lodish et al. sehingga dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. yaitu : a replication origin. DNA plasmid mengalami duplikasi sebelum pembelahan sel inang. tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Cawan petri .).hati gelas penutup jangan sampai pecah) 8. Bunsen burner 2. Alat dan Bahan Alat 1.

. 3.700 x g selama 5 menit. Freezer 4. Kultur bakteri hasil inkubasi 16 jam sebanyak 3 ml diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5. Ampisilin 2. Es batu 4. Micropipette segala ukuran 9. Medium Luria Bertani (LB) agar dan LB cair. 5. Pelet sel diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dan disentrifugasi dengan kecepatan 5. QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen. E. DNA vektor pUC19 diisolasi menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen. Glove 5. Tip micropipette segala ukuran (Bio=Rad dan Axygen Scientific). 2. Shaker incubator 11. USA). Spidol marker 12. Tube microsentrifuge Bahan 1.700 x g selama 5 menit.Coli JM109 yang mengandung plasmid pUC19 3. Jarum ose 6. 5. USA) 4. Koloni tunggal bakteri JM transforman pUC19 dinokulasikan ke 25 ml medium LB cair dan diinkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (semalam). Erlenmeyer 100 ml 7. Pelet sel bakteri diresuspensi dengan 250 µl Buffer P1 sampai homogen. Prosedur Kerja 1. Refrigerator 10. 4. Microcentrifuges 5415D (Eppendorf) 8. 13.3.

16. QIAprep spin column dicuci dengan 500 μl PB dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit. Suspensi ditambah 250 µl Buffer P2 dan diresuspensi kembali dengan cara dibolak-balik sebanyak 4-6 kali.5 ml yang lain dan ditambah dengan 50 μl buffer EB. 9. Cairan yang melewati QIAprep spin column dibuang. 13. Tahap selanjutnya tabung mikrosentrifuga disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm (17. dan ke dalam QIAprep spin column ditambahkan kembali 750 μl buffer PE. dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi pertama). Cairan yang melewati membran dibuang dan QIAprep spin column dimasukkan kembali ke dalam tabung mikrosentrifuga. dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit. 15. 7. Suspensi yang dihasilkan akan berubah warnanya menjadi biru.5 ml baru dan ditambah dengan 50 μl buffer EB.900 x g) selama 10 menit. . Cairan yang melewati QIAprep spin column kembali dibuang dan disentrifugasi ulang untuk menghilangkan sisa buffer pencuci. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1. 10. 8.900 x g) selama satu menit. 11. 14. Supernatan yang dihasilkan dipindah dengan cara memipet ke dalam collection tube yang dilengkapi dengan QIAprep spin column dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000 rpm (17. Suspensi selanjutnya ditambah 350 µl N3 dan diresuspensi dengan cara yang sama sehingga warna suspensi kembali seperti warna awal. 12. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1. Tabung mikrosentrifuga beserta QIAprep spin column disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi kedua).6.

16 jam 1 Cairan dibuan g Sp dibuan g Sentrifugasi 5. 1' Sentrifugasi 13.000 rpm.Skema kerja Isolasi DNA Plasmid menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen.000 rpm.700xg (5000 rpm). USA) @ 3 ml E. 5' Kolom pindah + 500 µl Buffer PB Sentrifugasi + 50 µl Buffer EB Sentrifugasi 13. 1' Sp dipinda h Sentrifugasi 13. shaker 150 rpm.000 rpm.000 rpm. 1' .000 rpm. 5' Sentrifugasi 13. + 1 ml STE resuspensi 5' Sentrifuga si 5000 rpm.000 rpm. 1' 13. 1' Sp dibuan g Cairan dibuan gg + 250 µl Buffer P1 Resuspensi (vortex. bolak balik + 250 µl Buffer P2 Bolak-balik sebentar Warna mjd BIRU + 350 µl Buffer N3 Bolak-balik sebentar Warna BIRU hilang + 750 µl Buffer PE Sentrifugasi DNA plasmid Cairan dibuan g 13.coli transforman pUC19 25 ml LB Inkubasi 370C.

Sisi pengenalan enzim restriksi tersebut berbeda – beda pada suatu fragmen DNA. Enzim restriksi akan mengenali sisi restriksi suatu fragmen DNA yang biasanya terdiri atas 4 – 8 pasang basa. misalnya BamHI yang diperoleh dari Bacillus amyloliquefaciens memiliki sisi pengenalan yang akan memotong pada basa G nomor 2 dari tepi masing – masing strand (Lodish et al. sensitivitas terhadap metilasi. Landasan Teori Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu organisme dalam jumlah besar.angan basa palindrom.). Enzim restriksi dengan sekuens . AGCT merupakan sisi pengenalan AluI. yaitu : ukuran fragmen. EcoRI dan PstI dapat memotong masing-masing strand DNA. Pemilihan enzim restriksi untuk pemotongan fragmen DNA pada suatu teknologi DNA rekombinan didasarkan pada beberapa hal. Sisi restriksi tersebut biasanya berupa pas. GAATTC merupakan sisi pengenalan EcoRI. RESTRIKSI DNA PLASMID 1. kompatibiliti terhadap kondisi reaksi. Manipulasi pemotongan DNA dilakukan oleh enzim yang disebut endonuklease restriksi. blunt-ended atau sticky-ended fragment. Molekul DNA rekombinan dapat diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang memiliki daerah pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom.E. Enzim restriksi akan memotong fragmen DNA di ujung yang sama pada 2 strand (blunt ended). Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA). Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian dapat berasosiasi dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain yang juga telah dipotong dengan enzim restriksi. namun biasanya enzim restriksi akan memotong pada ujung yang berbeda pada 2 strand sehingga menghasilkan sisi lengket (sticky ended). Beberapa enzim seperti BamHI. Enzim – enzim restriksi yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan berasal dari beberapa bakteri.

Volume akhir untuk komponen reaksi biasanya 10 – 50 µL. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 7. 2007).pengenal lebih pendek akan menghasilkan lebih banyak potongan fragmen DNA. Freezer 2. DNA. Spidol marker 6. Apabila terdapat 2 enzim yang cocok untuk suatu reaksi yang sama maka kedua enzim ini dapat ditambahkan pada reaksi dengan reaksi bufer dan suhu yang sama (Anonim. Korea) . Microsentrifuge 5415D (Eppendorf) 5. Volume di bawah 10 µL tidak dianjurkan karena memiliki kemungkinan yang sangat besar untuk terjadinya kesalahan pipeting. 2007). buffer dan enzim. Komponen reaksi (master mix)restriksi terdiri dari : air. Metilasi biasanya terjadi pada DNA mahluk hidup dan bervariasi polanya sehingga dibutuhkan enzim restriksi yang cocok untuk DNA yang mengalami metilasi dengan pola tertentu. Tujuan Melihat cara kerja pemotongan DNA plasmid 3. Sticky ended biasanya lebih efisien dalam ligasi sedangkan blunt ended biasanya dikenali oleh enzi khusus yang cocok dengan tipe pemotongan blunt ended. Micropipette segala ukuran 4. Glove 3. Tube microsentrifuge 8. Komponen enzim ditambahkan terakhir pada saat pembuatan master mix (Anonim. Alat dan Bahan Alat 1. Pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH. 2.

tabung mikrosentrifuga selanjutnya diinkubasi pada suhu 70 0C selama 10 menit menggunakan Water Bath. 7.Bahan 1. Buffer E 3. ddH2O 5. 4. Vektor pUC19 dipotong dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotongan DNA genom. EcoRI. DNA dan PstI 3. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml. Misalkan reaksi restriksi bekerja secara optimum dengan komposisi Buffer E sebanyak 5 µl.5 µl. Es batu 7. dengan komposisi Buffer E. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml sesuai dengan hasil optimasi reaksi restriksi. dan PstI sebayak 2 µl untuk vinal volume 50 µl. Tabung mikrosentrifuga yang berisi campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu 37 0C selama 4 jam menggunakan pemanas air (Water Bath). BSA 2. 5. 2. Tabung mikrosentrifuga diketuk sebentar untuk memastikan campuran sudah tersuspensi. Optimasi reaksi restriksi sebelumya dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan DNA dapat terpotong sempurna dengan kondisi optimasi tersebut. Restriction enzyme of Hind III. 6. Prosedur Kerja 1. larutan DNA hasil restriksi disimpan di dalam Freezer. DNA pUC19 sebayak 20 µl. BSA sebayak 0. DNA plasmid pUC19 6. BSA. Hal ini dilakukan untuk inaktifasi enzim restriksi. Pst I 4. yaitu enzim PstI. Buffer H 4. Campuran reaksi dihomogenkan sebentar menggunakan mikrosentrifuga selama 1-2 detik. .

suhu 700C dg waterbath. dg Water bath selama 4 jam Simpan di frezer Inaktifasi.Skema Kerja Restriksi DNA plasmid 1 2 3 4 5 6 7 P1 P2 P3 Spin sebentar. 10 menit . 2” Ketuk-ketuk Inkubasi 37 0C.

Makin besar ukuran molekulnya. Tabung mikrosentrifuga 4.F.000 pasang basa (bp). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Sarung tangan 5. Landasan Teori Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20. Gelas Ukur 1000 ml 2. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet. Alat dan Bahan Alat 1. kuantifikasi DNA. Kertas parafilm . Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 6. ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA 1. Tujuan Melihat cara kerja elektroforesis gel agarosa 3. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. 2010). Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Labu Erlenmeyer 50 ml 3. 2. pemisahan dan ekstraksi fragmen DNA (Anonim. makin rendah laju migrasinya. Elektroforesis gel agarosa biasanya digunaka untuk analisis ukuran dan konformasi sampel DNA.

Larutan Etidium Bromid (EtBr) 2. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna. DNA marker. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0.5 M pH 8. 57.25% xylene cyalol. DNA kromosom bakteri. 15% ficoll tipe 4000. dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml) 4. misalnya DNA λ yang dipotong dengan HindIII 6. Buat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245 ml akuades. 3. Siapkan baki gel agarosa. Akuades 5. EDTA 120 mM) 9. Prosedur Kerja 1. misalnya : a. DNA plasmid hasil isolasi (uncut) c.7. Loading dye 6x (0. Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base. Agarosa 3. Kamera digital Bahan 1. 100 ml EDTA 0. 0. Kaca mata UV 11. Seperangkat alat elektroforesis 8.2 g untuk dilarutkan ke dalam bufer TAE 1x hingga volume 20 ml. lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masingmasing ujung baki) 4. 2. Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir menyentuh dasar baki . Sampel DNA. b. DNA plasmid hasil restriksi (cut) 4.25% bromophenol blue. UV transluminator 10.1 g asam asetat glacial.

masukkan 10 µl sampel DNA dan 2 µl loading dye 6x ke dalam sumuran gel agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet. kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel agarosa. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar. 16. aturlah voltase dan waktu running hingga diperoleh angka 70 V dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus. 15. nyalakan sumber arus. 7. 8. elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis. . Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis. lepaskan selotip dari ujung-ujung baki. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan. biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat. 14. 13. 17. 10. masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE). gunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik). jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus. jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60 0C. amati pita-pita DNA yang tervisualisasi. yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. 9. hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran. jika tidak demikian. buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan. 6. 11. siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis. ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya). tambahkan 1 µl etidium bromid (PERINGATAN KERAS!!.5. ambil sisir dengan hati-hati. keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas UV transluminator). nyalakan UV transluminator. 12.

Korea) . Microsentrifuga 5415D (Eppendorf) 6. maka untuk mendapatkan sel transforman cukup mudah yaitu dengan menumbuhkan sel hasil transformasi pada media yang mengandung ampisilin. coli tersebut akan berubah karena mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. Transformasi dilakukan dengan menggunakan sel kompeten. Sel kompeten merupakan sel yang memiliki kemampuan untuk disisipi DNA dari luar. Teknologi ini digunakan dalam usaha memperoleh tanaman yang tahan terhadap infeksi bakteri. E. pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH. Strain E. coli biasanya digunakan sebagai sel kompeten. Sel E. 2. coli disisipi vektor DNA rekombinan yang disisipkan ke dalam plasmid. coli 3. Apabila vektor DNA rekombinan telah terintegrasi dengan sel inang maka sel tersebut dapat dikatakan telah ditransformasi. Tabung mikrosentrifuga 4.coli. Alat dan Bahan Alat 1. coli hasil transforman mengandung plasmid dan salah satu ciri sel yang disisipi plasmid adalah resisten terhadap antibiotik (ampisilin). jamur. Transformasi merupakan hal yang penting karena menghasilkan organisme rekombinan sesuai dengan gen yang disipkan pada vektor. Landasan Teori Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang bakteri misalnya bakteri E. Tujuan Praktikum ini bertujuan untuk melakukan transformasi pada sel E. TRANSFORMASI SEL E. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 5. Setelah diinkubasi.G. termometer 3. sel tersebut akan memperbanyak diri sehingga jumlahnya menjadi banyak. herbisida. shaker-incubator 2. karena fenotip strain E. coli JM109 1.

Ltd. Pindahkan kultur E. 2. . media LB cair 3. 4. coli JM 109 hasil inkubasi semalam ke media LB cair 25 ml dengan cara mengambil 250 μl kultur E. Sebanyak 1. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 μl CaCl2 dingin. media cawan LB ampisilin dan media cawan LB tanpa ampisilin 4. shaker-incubator tipe EFM-60 (Seiwa Rico. batang drugalsky 9.) 12. Erlenmeyer 11.700 x g selama 5 menit. strain E. es batu 4. Bahan 1. 3. kemudian dilakukan inkubasi dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm selama 120 menit (2 jam) pada suhu 37oC.700 x g selama 5 menit. diresuspensi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5. coli JM 109 ke media LB cair.5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5. coli JM 109 ke dalam media LB cair 25 ml. kamera digital. coli JM 109 2. Kultur semalam strain E. coli JM 109 dikultivasi ke media LB cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni strain E. media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG 5. Prosedur Kerja 1. Inkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (semalam). cawan Petri 10. jarum ose 8. atau dengan kata lain perbandingan antara volume media dan volume kultur 10:1.7.

7. 9. dua diantaranya untuk inkubasi 2 jam dan 3 lainnya untuk inkubasi 16 jam. diresuspensi dan diinkubasi dalam es. ke dalam tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 16 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten. sebanyak 50 μl hasil inkubasi pada tabung nomor 2 ditumbuhkan juga pada media LB tanpa ampisilin. 11. salah satunya atau tabung nomor 1 ditambah dengan 10 μl palsmid pUC19 sirkuler. sedangkan tabung nomor 2 tidak ditambah dengan palsmid. Sementara itu. kemudian diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik dengan suhu 42oC dan segera dipindahkan ke dalam es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit. dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37oC dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 1. ditambahkan 10 μl vektor pUC19 sirkuler untuk penentuan efisiensi transformasi (tabung nomor 3). Selain itu. Sebanyak 100 μl hasil inkubasi ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp untuk kedua tabung. 6. 2 μl vektor pUC19 rekombinan (tabung nomor 4) dan tidak ditambahkan apapun (tabung nomor 5). 10. . Tabung mikrosentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah inkubasi 10 menit.5 jam pada suhu 37oC. Inkubasi dilakukan selama 16 jam pada suhu 37oC.5. dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator selama 1. Tabung mikrosentrifuga selanjutnya ditambahkan dengan media LB hingga 1 ml. 12. Kedua tabung diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit. Supernatan dibuang kembali dan ke dalam tabung ditambahkan kembali 200 μl CaCl2 dingin. Dalam perlakuan ini terdapat lima tabung mikrosentrifuga. Ketiga tabung mikrosentrifuga diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit dan diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik pada suhu 42oC dan segera dipindahkan ke es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit.5 jam. 8.

700 x g selama 5 menit. coli dengan pUC19 sirkuler dilakukan penjumlahan koloni untuk diketahui efisiensi transformasinya. 15. 14. Supernatan dibuang hingga tersisa 100 μl. Untuk cawan yang berisi E. Hasil inkubasi tabung nomor 3 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG sebanyak 100 μl. 18. dilanjutkan dengan inkubasi selama 16 jam pada suhu 37oC. 17. Σkoloni = jumlah koloni putih (dalam cfu) [pUC19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng) . Efisiensi transformasi dihitung dengan cara sebagai berikut Dimana. Tabung nomor 4 disentrifugasi dengan kecepatan 5.13. dan kemudian ditumbuhkan dengan cara plating ke media LB/Amp/X-Gal/IPTG. 16. Disiapkan media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG dengan cara menambahkan 50 μl X-Gal dan 100 μl IPTG ke media cawan LB/Amp. Hasil inkubasi pada tabung no.5 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp sebanyak 100 μl dan ke media cawan LB sebanyak 50 μl. lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama lebih kurang 30 menit.

karena alat dan bahan merupakan faktot utama sebagai indikator berhasil atau tidakkah suatu praktikum.BAB III PENUTUP Pada praktikum Biologi Sel dan Molekuler ini. Retriksi DNA Plasmid. diperlukan alat dan bahan yang memadai di laboratorium. Komponen Sel dan Pengamatan Pembelahan Mitosis. Adapun judul praktikum yang dapat dilaksanakan yaitu Hubungan Struktur dan Fungsi Sel.Coli JM 109 tidak dapat dilaksanakan karena kurang terfasilitasi alat dan bahan yang ada dilaboraotium Biologi S1. Elektroforesis Gel Agragosa. Adapun judul pengamatan Isolasi DNA Plasmid. Setelah dilakukan konfirmasi dengan laboran banyak alat dan bahan yang tidak ada di laboratorium biologi S1. . karena jika salah satu alat/ bahan tidak ada maka paraktikum itu akan gagal secara keseluruhan. dan Transformasi Sel E. Hal tersebut menjadi kendala untuk dilaksanakan praktikum tersebut.

2008. Purwokerto: Program Pasca Sarjana Universitas Jenderal . Laporan praktikum Biologi sel dan Molekuler S2 Bologi UNSOED. Medan: FMIPA UNIMED. Praktikum Genetika. Suryani. Medan: FMIPA UNIMED. 2010. 2009. Soedirman . (Bahan Referensi) Tim Biologi UNIMED. Cicik.DAFTAR PUSTAKA Kurniawan. Praktikum Struktur Pertumbuhan II.

4.9   70007   4.3:7.4.8.74803971:0 5503/471    $5/42..2-.8 /03.3.7.8.9/.8 54. 9079039:  5.3 .8..3.  a9/.35.3 ..3   .3 . /-:9:./.3 5./.3./. 70.      a  '4:20 / -.4.4 /03.8 -.3.8 .8..7 :39:907.: /:5 /.3 8.9 /9.7 .9: 70.5.7.9.2.3 54. 0/:.  2.3 70.      .8.8.7   -:1107 /...3 -:39 03/0/  09.880/. 8.9502-:.4 :39: 8:. 907/.::7. 2.703..9..0391. 032 3 /.89072 3432      %::.75.3.9  032 .3.5024943.7455099080.3 .3. /03. 03/0/ -.317.3 -07.707   $0507. 907.203  $9.8 -.30--./ 5..3.3 032 708978 .54943.. /./3.07.    %:-02...0   .50303. 4 #. 3432    425430370.3 203.-.3.355093 4254303032/9.953.8907 2 708978907/7 /.2 .0- 01803 /.303$.3.0-503/0.3 -:39 03/0/-.9 -08.3 032  '4:20 .3 . 40 03 :8:8 .7.907-.2-.3 .3 950 5024943. 202 02:33.8 2.7 :39: 4254303 70.2.3203.92745509-08079. 803.8-:107/.3 0..08.2 209..4 :39:  .38::.5.38.3.74803971:0   !02.82/   .9 950    % 470.38.32.8 /03.//.3907.

. a  5& 80-.8::  80..7 203:3. /.270007  .:: :39: 202. -07::7. 80.2.3!89   #0. /03.9078:85038    %.2 9.25:7.9430320413/ .82/5&   8-.907. .3.2.8 5.9 .9:   #0897.3  /.907.   /09  %.8 708978 80-0:2.25:7./.8 4592.3:39:3.-:3274803971:.8 708978 /5078.3 274803971:./.8 70.32 /03.3425488:1107 $ /.3.  a  $ 80-.5.2..8 708978  8.5.-:3 274803971:.4:20 a    .3.38:/.8:: 80.3 70.8.3//..3:93.2.25:7.85.3 /.8 708978 /5078.   '0947 5& /54943 /03.30342 ..8 708978 -007...3 5024943...3   $   :1107   :1107   //    5.5../3:-.3 !8980-.7.9 90754943 8025:73.2 9.3 43/8 4592.-:3 274803971:.3 /..-:3 274803971:.-:3 274803971:.3502.8 90780-:9 /3:-.. a:39: .8032 708978    . a  /.3. 4592:2 /03.3  2 808:. /09: 80-039.89.  2039203:3.3 .2203:3.7 ...9:032!89    592.3 70.8 90780-:9  #0..3/.8 70.91.7 :39: 202.:.3 -078 .3 8.80.:.8 /42403...89. 80.3 425488 :1107  80-.3 9070- /.3 032 708978 .370. -07::7.4# !89    !7480/:707. /03.7:9.3 80-039.9    9.3.3. /03.8708978/825.

2 $5380-039.907-.8  /.2.8 8:: /.3/ 17007 3.9  2039 ..#089785.91.980.907-.7    09: 09:          $25.$02.82/         9 9 9               3:-.07.

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

.   .  /03.9 /.4:20 2 .3 -:1107%  978 -.3 5488... /03.748./.7:9.39/:2742/ 97    .  2% 5/.3 .7:9.8..38:23./08   2.7:98025:73.8 :3.748./083.235:7.3 -.250 28.:.809..4  1.:9  .   :..9 0 .3. 2..748..3 .3.9: ::3 -./08    :.748. 2    :.3 5....707 28.:.  5.2.22..7-.   :39: /.3 9/.884.7:9. 203.33.8708978 .  . 8.83 2.3.3 -:1107 %  /03.3/.5.2.. .7. 2032-.  0.7.    $.2.80    . 0 ..9   2 .82/.30/.3.83::3-.900974147088   4./.7:9. .  $0507./3 /0   -74245034 -:0  030 ..&'  .7:9.82/.4950 % 2    &'97.3   .5 ::3 -.89.7:9.947  .3 -.748./9.  7424842-.207..3/54943/03.33/   $...3 . :-.9 :.8.    !.9 .257203039:/. 80495 200... 0 .9. .3 80495 /9.3  2 % 0/. 5.748.9.9..:9     !7480/:707.8. 0 ..3 887 00974147088 / 8. ///..748.2-:107%3.907  -  5..

3 90780-:9 9070- /.28:2:7.7.  !078.3 /2.3.89..703.3 .748..12203:3.29.7:9.2 -.809.9. /03.3.390.3 0 /.7:9..9.85.8:/.3 9:...3a4.3.8:.9 8:2:7.7.748.3 0/:.7:8 0 9.8:. 34247 8:2:7.39078.7 8:2-07 . ..91 -07.9.::80..85.8:.3.3 . .280:7:3.25:7../.748.3.0/.3 /. 2030250. -.3-07:-.3 80-039...-0780.3 . /8 /03.7.9/.9 05.9    ..8::.5488-. 203.748.3 070320070 9..9 . /42403././ 0 . -0781..3   :-:3.2-:3 0 :9:- 30.300974147088 .7:9..079. -.-0 /.3 20303./.3.9.2079.7.2%    8. 203.9:7:33.7::3 ::3-.748.7:9.3 -:107 %  5.7:39.32745509   -:.99.3-..3 038 8.250/.7  02:/./03..3 3.207.7./02.3 5. 0 90703/.300974147088   2.8::3.8. 0.5.783403    .3809.7. .3 .7:9./. / /0.3 -.3 :-..12//0.3a 09/:2-742/ !#%#$ :3.3 .5..3 a8.380495/.3 90./3/00/.    2.3 -.7.7    9.2-.3 00974147088 5..3 .9.38....2-887/03.3 0 ..-0 .250  ..3.89.3 .

3 80:-:3 .37:333 /03..3 8:2-07 .3.00.3942-4 .8 &' 97.3 /.947   3.7:8 /./.2030.   3.959.7:8   ..38:2-07.3 /9.2030.9.7.:. -:3 ..3 808:.-8  .3.3  2039 /03. 40 .7..80/.9:7:3333. .7:8   00974147088 .7..3 0 /.3..3 ..3.8  ./50740 . 5..3.72  .3 09.3/.../.3907. 8:2-07.8:2-07.300974147088 .5.79.9:7.947 ./.5.3&'97.3 8:/.3.300974147088   0:.38:23.80-.9.8.49. 59.3 -07039 .38:23.   ' /.38:23.8:..2.8&'97.3 /909. ../.3.9.7:8 .947 09.-.-.3.3942-47:3 5..9.7.9: ..2/..9.

92745509-08079.381472.3 /885.804250903    %::.. .3 8.3 /./-.381472.3 /03.3:39:20./.3 80 3.703.381472.9.3./. .9:23-079::.4 $0 .8.3808:.3 :39: /885  /.3 2./:3.-.3 .3 -07:-.2583  $97.7 80 .7088903907.80 90780-:9 /.39. /97.    ..381472.303 .8  %7.2.3 203. 4 #.3 47./.3 903 97.8 5.9. 203/.3 0 /.3  . 20250740 9.9 /.3 /85.3 80 ..381472.3/ -./.8 /.3.4-.8.  %7.:39: 203/..3 202 02.82/   $090.9.8 207:5.897.::5 2:/.2583  2.5./.2 5.381472.7: .9 950    % 470. .3 /885 5.947   9072420907   %.953.907 .3. ..2 :8.09477042-3.3%047 %7.4 90780-:9 .3907. 40 240:  90780-:9  5.   $0507.25:..381472..3 203:3..38107 240:  0 /.0947  7042-3.303$.74803971:.:2.07 3.3 203:2-:.5..7 .3/:3 .82/.9/.3.. /3:-..203.3 203.4/885. 5503/471    502.3.8 97.3 90.7  .. .8.3.9: ./7803.3/:3 5.9:/03. 8.8.9   8.3   ..:.  .3..3 5.53108-..397. 20/.90728../03.3 .350393 ..2 80 3.80 .3 .3 202507-.3 .380-.8  80 90780-:9 .4    .3 !7.0391.907-.3 03 03 503..703.38207042-3.8 207:5.//.3./.8 /03.3 80 4250903  $0 4250903 207:5.3 90..103495897.39-49 .5.-:3274803971:.0947  %0344 3 /:3.3 /-.907 ..703.4 .  %#$ #$$ .381472.3/.4   . 203..3.3 80 .-.82/ /.85.5..:-. 9073907.:.3..3 8097.3-.7 :.2:7 07-8/.

7:2480   -..4 9/   .320/.947950   $0.3 ..3.35.#.3...3/7:..  ..8   .  ../9..9.4    20/.:-.7   20/....3!097  7032007  8.2583/..2583   20/.07 3...39..3   897.207.

25.

 ..

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

8 75280.20880.7.2 9.  3. .3 8007.2-.9:3.9.:.-:3 274803971:.8  .2 8.9. . 3:-.93020/.9.-:3342479/.8 3:-.30.2. /03.8::4/03.33907/.2    %.  2 8090.8.947 5. .2 08   .92.8   2039  /.2-.9.3 /3:-.2-.:9..83 -078  804250903 8.   /09 /03..8 02-.-:3 /9.35.80-.:39: 3:-./.2..83 2. /.    .2 08 :39: /3:-..5.8.39..8 0.3....3 /03.2    $0-.3 0 /.33. /33  /708:85038 /.3 8:: 4 /.-:3/3:-.3 02-.3 2.2.3.8 /. 80.-:3 274803971:..3/03. ..8 /. /9.9.3:9./9.3..-:3274803971:.:39:3:-.07 3. 2039 02:/.-:334247/9.   2039    %.5.82/5&87:07 80/.8/9:2-:./03.3.83:-.3 20/.2/. /:..82/    0/:..3.2. /53/.  $:5073.2-./.:-.3  5.05.7.3:9/.3 3:-.3 .3 02-.3749..8.2 507.  80.2 .3.3 /-:.3 0 /.3 /-07 0:9 5.39.9 84.

2583 3:-./.8/.:-.20880.2 9.25.3 /03./9. 5. .3:93.-:334247 /.2.3 . /9./3:-.9 84.39/.     . /095.3008:39:/3:-.3 /03.5.3/-070:95.. 80.380.-:334247   09.  9. 80.2.3..8 5.2-.2 .3 3:-.2 8. 2039   %.-:3 34247   .802-.3:9/.7.25..:./. 9:  0 /.3 9.3 01803897.-:3 274803971:.8::4  .3.8::4   $02039.0947 5& 87:07:39: 503039:.  2039/. .8 3:-. 20/.8 0.25 :39: 0/:.2-.5:3 9.381472..-:3 274803971:.07 3.-:3 34247  /9:2-:.83 2.2.8 9.80./../.8::4 /./.947 80.-:3   $0.35..  3.83-078 804250903 /9..2./53/.. 9.09475&7042-3.  .2.80-.8  .-:3 274803971:.3 20/.3 .32.8 /.  2  /.3:9.3 :.2-.38007. 9.8 3:-.3 9:  80-.9.

.5.3.320/... 8.

25.

 ..

3     ... /.2-.203.3 .. ..7.3    !% 0 20/.!%/03.3.

0-:7.8 5..-:334247/9:2-:..5.3 2039   .8::480.89./.3.7.2.93020/.25  . .83:-.3.3/03.: /3:-..

25.

. .

.3.  2039   $:5073.93020/.5.!%80-.2.3 /-:.-:3 34247  /803971:.3 02:/.3/03.    %.3      80.3 0.7.9. 90788.9.3 /9:2-:.3 3..3.05.     /.8 /03.

25.

 ..

8 5.3.!%   .3 /03.. 5.7.8 3:-.3 .-:3 34  /9:2-:./.93 0 20/. 9....

...381472.3.381472.3020/.33:-.3443:39:/09...7.3. /..25.-07:9 2.2.3..1:  5&(4380397.3/03.  Ð443 :2.   1803897.85& /.83./..380-.8/9:3/03.8::4   &39: .2.3 5& 87:07 /..3 -078   .2580-.3 ..:.   /.23          .880.4435:9 /.3 503:2.80-.3.4 /03..:01803897.3:9.

../.3 202. / .9.9:2  .703.703. 8.9: 57...9.8 .9:2 44$0/.3 207:5. 3/.340:073 /507:. 8:. 8.3 ...947 -07.949 :9.3. 80-.57. !&%&!    !..947:2  .9 /...3-.9: . .-47.3 -.2./.: 9/. .3 1.9/.

 ./.3 %7.3!02-0.9.8.3.-47.-47.9:2 .82/  0974147088 0 7.8 .5:3 :/: 503.3 !03.9: :-:3.3.9 /.343172... 90780-:9 203..3 :38 $0  4254303 $0 /.3 57.  /...2.89.3.381472.-47.2.. /.5..080:7:.3-.703.8.39488   /./.5.8  !.3.5..8.5:3 :/: 57. / .9:2 90780-:9  /.9 /. :39: /.39/..3.:../ 03/.3.3 9/..3 -.48./.3.3 .9:29:.9/.7.. :7.82/  #0978  !.80.3   $090.947:2 -44 $  .3 ..8 $0  4    9/.3 84.7.3 /..3 .2..8/03.9 /./. /.3 $97:9:7 /.3 ..49:2 44$     .-.3-.3 9071.9.

8 03/07.3#0107038  %244&   !7.3  .3 57..3 ! &  .3.3  $:7.9:2 $97:9:7 !079:2-:..7. &3..3 40:07 $ 44 &$    !:740794 !747.9:20309.0789.9:2 44 80 /. 0/. $40/72. $.     !7.%#!&$%  :73.3   0/.2 !.3!&    .547.8.3     .