Tugas Makalah Praktikum Biologi Sel dan Molekuler

Prosedur Praktikum Biologi Sel dan Molekuler untuk Prodi Pendidikan Biologi S2
Oleh:

Weni Astari Widia Ningsih Yovanna M.Daniel

8116174017 8116174018 8116174019 8116173011

Pendidikan Biologi B

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS NEGERI MEDAN 2011

i

DAFTAR ISI

Daftar isi ...................................................................................................... i Kata Pengantar……………………………………………………………..ii BAB I Pendahulan ..................................................................................... 1 BAB II Prosedur Praktikum Biologi Sel Dan Molekuler ........................ 2 A. Hubungan Struktur dan Fungsi Sel ................................................. 2 B. Komponen Sel ................................................................................. 3 C. Pengamatan Pembelahan Mitosis.................................................... 4 D. Isolasi DNA Plasmid ....................................................................... 6 E. Retriksi DNA Plasmid .................................................................... 10 F. Elekrtroforesis Gel Agragosa .......................................................... 14 G. Transformasi Sel E.Coli JM 109 ..................................................... 17 BAB III Penutup ......................................................................................... 21 Daftar Pustaka ............................................................................................. 22

M. Namun penulis pada akhirnya menyadari bahwa tugas akhir ini belum sempurna banyak sekali keterbatasannya.ii KATA PENGANTAR Syukur Alhamdulillah. dihimpun dari sejumlah referensi meliputi hal-hal yang berkaitan dengan teknologi dalam biologi molekuler dan segala aspek yang berkaitan dengan hal tersebut. Adapun informasi ilmiah yang mendukung penyusunan makalah ini. penulis sampaikan puji dengan syukur kehadirat Allah SWT. Amin. Uswatun Hasanah. yang telah memberikan Taufik dan hidayah-Nya.Si selaku dosen pembimbing mata kuliah : Praktikum Biologi Sel dan Molekuler dan teman-teman PPs Pendidikan Biologi Angkatan 2011. baik terkait dengan studi literatur atau pustaka sebagai pendahuluan. mudah-mudahan amal kebaikan kita semua diterima oleh Allah SWT. Akhirnya. sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas makalah mata kuliah Praktikum Biologi Sel dan Molekuler mengenai “Praktikum Biologi Sel dan Molekuler mengenai Prodi Pendidikan Biologi S2”. maupun teori dan metodologi yang masih terbatas. Oleh karena itu penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada ibu Dra. Penulis .

transkripsi.cirri historis populasi atau spesies) seperti pada genetika populasi dan filogenetika. Biokimia. Isolasi DNA Plasmid. Komponen sel.disiplin ilmu ini seperti sebelumnya. namun kini semakin memadukan teknik. Retriksi DNA Plasmid. . Pengamatan Pembelahan Mitosis.telaah atas efek perbedaan genetic pada makhluk hidup (misalnya telaah mengenai mutan).teknik tersebut dengan teknik dan gagasan dari genetika dan biokimia. Genetika. Tidak terdapat lagi garis tegas yang memisahkan disiplin. Pada praktikum biologi molekuler ini menggunakan teknik. Secara umum keterkaitan bidang. dan biologi molekuler itu sendiri telaah dalam skala molekul atas proses replikasi. Transformasi Sel E.teknik khusus yang khas pada biologi molekuler.Coli JM 109. dan translasi bahan genetik. Elektroforesis Gel Agragosa.bidang tersebut dapat digambarkan ssebagai berikut. maupun secara tidak langsung (misalnya dengan menggunakan teknik biologi molekuler untuk menyimpulkan cirri.. Semakin banyak bidang biologi laiinnya yang memfokuskan diri pada molekul .BAB I PENDAHULUAN Praktikum Biologi Sel dan Molekuler di peroleh Mahasiswa S2 Prodi Pendidikan Biologi pada semester pertama sebagai mata kuliah wajib yang seiring berjalan dengan mata kuliah teori Biologi Sel dan Molekuler.proses vital yang berlangsung pada makhluk hidup.telaah zat kimia dan proses. Adapun materi praktikum Biologi Sel dan Molekuler ini meliputi pengamatan terhadap Hubungan Fungsi dan Struktur Sel. baik secara langsung mempelajari interaksi molecular dalam bidang mereka sendiri seperti pada biologi sel dan biologi perkembangan.

menghasilkan energi. Namun sel pada setiap makhluk hidup tidaklah sama.kupu.lumba dengan sel mawar? dan apa perbedaannya.beda. Masing. dari pohon kelapa hingga cemara semua tersusun atas sel. merespon terhadap lingkungan mereka dan seterusnya. sel lumba.masing organ pada tumbuhan mempunyai struktur yag berbeda. 2. dan daun Zea mays Menganalisis hubungan struktur dan fungsi sel. Sel adalah unit struktural dan fungsional terkecil dari makhluk hidup. disebut organisme multiseluler.sel penyusun jaringan dari Akar. dan ada makhluk hidup yang tersusun lebih dari satu sel.Sel meskipun memiliki ukuran sangat kecil. HUBUNGAN STRUKTUR DAN FUNGSI SEL 1. sel tergolong luar biasa. bahkan mereka sangat berbeda. Fungsi dari suatu bagian sel atau jaringan dapat di indikasikan dari struktur sel/ jaringan pada suatu organ tersebut.BAB II PROSEDUR PRAKTIKUM BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER A. Sebagai bahan pertimbangan apakah bakteri memiliki kesamaan dengan sel kupu. Tujuan Mengamati struktur anatomi preparat dari Akar. batang. metabolism. Landasan Teori Semua makhluk terdiri dari sel. sel dikatakan sebagai unit dasar kehidupan. Dari kupu-kupu hingga kanguru. reproduksi. Makhluk hidup ada yang tersusun dari satu sel saja. hal ini karena fungsi dari masing. Sel hidup memiliki ciri. dan daun Zea mays . batang. disebut organisme uniseluler.masing organ berbeda.ciri seperti makhluk hidup juga dapat tumbuh.

ciri khas dari sel-sel penyusun setiap jaringan pada preparat tersebut (epidermis. batang. Biasanya dinding sel di anggap bagian mati sedangkan protoplas adalah bagian hidup dari sel. Sitoplasma memenuhi . 1980). Pada dasarnya sel tumbuhan terdiri dari protoplas yang dikelilingi dinding sel. Prosedur Kerja 1) Membuat irisan penampang melintang dari semua bahan 2) Mengamati struktur anatomi ketiga preparat : a) Bentuk. parenkim. didalamnya terjadi reaksi. dan daun Zea mays 4. susunan.3.reaksi kimia yang rumit (Pandey. sehingga sukar dilihat oleh mata meskipun telah menggunakan mikroskop. Komponen protoplasmic ada yang bersifat cair yaitu sitoplasma Sitoplasma metupakan substansi setengah cair lebih pekat (viscous) dari air dan bening (tembus cahaya: transculent). Alat dan Bahan Alat a) Mikroskop b) Silet Bahan a) Akar. KOMPONEN SEL 1. Protoplas terdi dari komponen protoplasmic dan non protoplasmic. jaingan penguat) b) Analisis mengenai struktur dan fungsi sel-sel penyusun jaringan di atas B. Sel tumbuhan diartikan sebagai suatu kehidupan kecil yang membatasi batas nyata atau dinding sel. jaringan pengangkut. Sel bagian hidujuga dikatakan sebagai kesatuan struktur fisiologi yang terkecil dari organism hidup. Landasan Teori Sel merupakan unit dasar umum dari struktur organic.

Landasan Teori Mitosis adalah proses pembelahan sel yang terjadi baik pada sel hewan maupun sel tumbuhan. yaitu bahan. daun bunga pukul empat 4. 2. Bahan.bahan hasil meabolisme sel (Suryani. protein. . metafase. Alat dan Bahan : Alat a) Mikroskop b) Silet Bahan c) Umbi kentang. Ujung bagian akar bawah terbagi tiga daerah yaitu: daerah meristem perpanjangan sel dan daerah diferensiasi. batang bayam.organel serta vakuola. Prosedur Kerja 1) Buat irisan penampang melintang pada semua bahan 2) Amati beberapa buah sel pada setiap jaringan penyusun organ tumbuhan 3) Amati komponen-komponen sel yang terlihat dengan mikroskop yang ada C.fase pembelahan mitosis dapat dilihat pada daerah meristem ujung akar Allium cepa. dan telofase. Tujuan Mengamati komponen sel baik komponen yang hidup atau yang tidak hidup dalam sebuah sel 3. bila diwarnai dapat diliha beberapa stadium pembelahan mitosis yaitu propase.bahan yang terdapat di dalam vakuola digolongkan sebagai bahan. Di dalam vakuola bisa terlarut berbagai zat seperti gula.ruangan sel hidup dan didalamnya terdapat organel. alkaloid. Pada akar Allium cepa yaitu pada bagian ujungnya. garam. Pembelahan ini penting untuk pertumbuhan serta menjaga agar jumlah kromososm sel induk sama dengan sel anak (2n-2n). PENGAMATAN PEMBELAHAN MITOSIS 1.bahan ergastik. dan zat pewarna. Fase. 2008).

Rendam bawang pada air dalam gelas biarkan selama 2-3 hari. Silet Bahan 1. Asetokarmin 2. 3. Pembakar bunsen / lampu spiritus 8. Cawan petri 6. Kertas Hisap 4. Mikroskop 2. Jarum preparat 5. Tetesi preparat tersebut dengan polienil alkohol (Fenil Lakto Fenol) di sampingnya (jangan kena preparat). Gelas objek 3. 6. Hisaplah kelebihan asetokarmin dengan kertas hisap. 2. Panaskan preparat tersebu di atas api bunsen atau lampu spiritus sampai menguap. Prosedur Kerja 1. Gelas piala 500 ml 7. . Alat dan Bahan Alat 1. Akar bawang 5. 5. tetapi jangan sampai mendidih 4.fase pembelahan mitosis pada akar Allium cepa. Asam Klorida (HCl) 3. Fenil Lakto Fenol 4.2. Potong akar bawang sepanjang 1 cm kemudian rendam pada asetokarmin dan HCl dengan perbandingan 9 : 1 3. Tujuan Mengetahui kedudukan kromosom pada fase. Gelas penutup 4. Pindahkan potongan aakar bawang yang sudah dipanaskan ke gelas objek dan beri satu tetes asetokarmin biarkanlah lebih kurang 30 menit.

Cawan petri . interferon. Penggunaan plasmid dalam DNA rekombinan dilakukan karena plasmid memiliki tiga region yang berperan penting untuk DNA kloning. sehingga dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Plasmid biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan menggunakan E. Tutup dengan gelas penutup kemudian di tekan dengan menggunakan pensil sampai preparat pipih (hati. dan berbagai enzim. marker yang memungkinkan adanya seleksi (biasanya gen resisten antibiotik) dan region yang mampu disisipi oleh fragmen DNA dari luar (Lodish et al. D. Bunsen burner 2. yaitu : a replication origin. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri. tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. coli sebagai host. Alat dan Bahan Alat 1.). DNA plasmid mengalami duplikasi sebelum pembelahan sel inang. Landasan Teori Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot. Tujuan Melihat cara kerja isolasi DNA plasmid 3. 2. khususnya bakteri dan sel eukariotik tingkat rendah misalnya yeast.7. ISOLASI DNA PLASMID 1. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin.hati gelas penutup jangan sampai pecah) 8. Amati di bawah mikroskop 9.

Pelet sel bakteri diresuspensi dengan 250 µl Buffer P1 sampai homogen. 13. Micropipette segala ukuran 9. Jarum ose 6. Tip micropipette segala ukuran (Bio=Rad dan Axygen Scientific). DNA vektor pUC19 diisolasi menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen. Glove 5. Kultur bakteri hasil inkubasi 16 jam sebanyak 3 ml diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5. E. . Es batu 4. USA) 4. Pelet sel diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dan disentrifugasi dengan kecepatan 5. Microcentrifuges 5415D (Eppendorf) 8. Freezer 4. 2. 5. 5. 4. Ampisilin 2. Koloni tunggal bakteri JM transforman pUC19 dinokulasikan ke 25 ml medium LB cair dan diinkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (semalam). USA). Tube microsentrifuge Bahan 1. Shaker incubator 11. Refrigerator 10. QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen.3. Medium Luria Bertani (LB) agar dan LB cair. Spidol marker 12.700 x g selama 5 menit.700 x g selama 5 menit. Erlenmeyer 100 ml 7. 3.Coli JM109 yang mengandung plasmid pUC19 3. Prosedur Kerja 1.

Suspensi selanjutnya ditambah 350 µl N3 dan diresuspensi dengan cara yang sama sehingga warna suspensi kembali seperti warna awal. Tahap selanjutnya tabung mikrosentrifuga disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm (17. dan ke dalam QIAprep spin column ditambahkan kembali 750 μl buffer PE. .900 x g) selama 10 menit. 7. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1. Suspensi yang dihasilkan akan berubah warnanya menjadi biru.5 ml baru dan ditambah dengan 50 μl buffer EB. 14.900 x g) selama satu menit. 8. Cairan yang melewati QIAprep spin column kembali dibuang dan disentrifugasi ulang untuk menghilangkan sisa buffer pencuci. Suspensi ditambah 250 µl Buffer P2 dan diresuspensi kembali dengan cara dibolak-balik sebanyak 4-6 kali. QIAprep spin column dicuci dengan 500 μl PB dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit. 13.5 ml yang lain dan ditambah dengan 50 μl buffer EB. 12.6. 15. dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1. Cairan yang melewati QIAprep spin column dibuang. Cairan yang melewati membran dibuang dan QIAprep spin column dimasukkan kembali ke dalam tabung mikrosentrifuga. Tabung mikrosentrifuga beserta QIAprep spin column disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi kedua). 9. Supernatan yang dihasilkan dipindah dengan cara memipet ke dalam collection tube yang dilengkapi dengan QIAprep spin column dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000 rpm (17. 16. 11. 10. dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi pertama).

000 rpm. 16 jam 1 Cairan dibuan g Sp dibuan g Sentrifugasi 5. 5' Sentrifugasi 13. 5' Kolom pindah + 500 µl Buffer PB Sentrifugasi + 50 µl Buffer EB Sentrifugasi 13. 1' Sp dipinda h Sentrifugasi 13.000 rpm.000 rpm.000 rpm. 1' .Skema kerja Isolasi DNA Plasmid menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen.000 rpm. 1' 13. 1' Sentrifugasi 13. USA) @ 3 ml E.coli transforman pUC19 25 ml LB Inkubasi 370C. shaker 150 rpm.700xg (5000 rpm).000 rpm. bolak balik + 250 µl Buffer P2 Bolak-balik sebentar Warna mjd BIRU + 350 µl Buffer N3 Bolak-balik sebentar Warna BIRU hilang + 750 µl Buffer PE Sentrifugasi DNA plasmid Cairan dibuan g 13. + 1 ml STE resuspensi 5' Sentrifuga si 5000 rpm. 1' Sp dibuan g Cairan dibuan gg + 250 µl Buffer P1 Resuspensi (vortex.

sensitivitas terhadap metilasi. EcoRI dan PstI dapat memotong masing-masing strand DNA. Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA). Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian dapat berasosiasi dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain yang juga telah dipotong dengan enzim restriksi. Sisi restriksi tersebut biasanya berupa pas. RESTRIKSI DNA PLASMID 1. GAATTC merupakan sisi pengenalan EcoRI. yaitu : ukuran fragmen. Enzim restriksi dengan sekuens . Sisi pengenalan enzim restriksi tersebut berbeda – beda pada suatu fragmen DNA. Molekul DNA rekombinan dapat diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang memiliki daerah pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom. Manipulasi pemotongan DNA dilakukan oleh enzim yang disebut endonuklease restriksi.). Pemilihan enzim restriksi untuk pemotongan fragmen DNA pada suatu teknologi DNA rekombinan didasarkan pada beberapa hal. Enzim – enzim restriksi yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan berasal dari beberapa bakteri. blunt-ended atau sticky-ended fragment. AGCT merupakan sisi pengenalan AluI. namun biasanya enzim restriksi akan memotong pada ujung yang berbeda pada 2 strand sehingga menghasilkan sisi lengket (sticky ended). Enzim restriksi akan memotong fragmen DNA di ujung yang sama pada 2 strand (blunt ended). misalnya BamHI yang diperoleh dari Bacillus amyloliquefaciens memiliki sisi pengenalan yang akan memotong pada basa G nomor 2 dari tepi masing – masing strand (Lodish et al.angan basa palindrom. Enzim restriksi akan mengenali sisi restriksi suatu fragmen DNA yang biasanya terdiri atas 4 – 8 pasang basa. Beberapa enzim seperti BamHI. Landasan Teori Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu organisme dalam jumlah besar. kompatibiliti terhadap kondisi reaksi.E.

Pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH. Volume di bawah 10 µL tidak dianjurkan karena memiliki kemungkinan yang sangat besar untuk terjadinya kesalahan pipeting. Apabila terdapat 2 enzim yang cocok untuk suatu reaksi yang sama maka kedua enzim ini dapat ditambahkan pada reaksi dengan reaksi bufer dan suhu yang sama (Anonim. 2. Korea) . Volume akhir untuk komponen reaksi biasanya 10 – 50 µL.pengenal lebih pendek akan menghasilkan lebih banyak potongan fragmen DNA. Micropipette segala ukuran 4. Microsentrifuge 5415D (Eppendorf) 5. DNA. Glove 3. buffer dan enzim. Komponen enzim ditambahkan terakhir pada saat pembuatan master mix (Anonim. Tujuan Melihat cara kerja pemotongan DNA plasmid 3. 2007). 2007). Sticky ended biasanya lebih efisien dalam ligasi sedangkan blunt ended biasanya dikenali oleh enzi khusus yang cocok dengan tipe pemotongan blunt ended. Alat dan Bahan Alat 1. Freezer 2. Spidol marker 6. Metilasi biasanya terjadi pada DNA mahluk hidup dan bervariasi polanya sehingga dibutuhkan enzim restriksi yang cocok untuk DNA yang mengalami metilasi dengan pola tertentu. Tube microsentrifuge 8. Komponen reaksi (master mix)restriksi terdiri dari : air. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 7.

Es batu 7. 2. larutan DNA hasil restriksi disimpan di dalam Freezer. yaitu enzim PstI.Bahan 1. Buffer H 4. tabung mikrosentrifuga selanjutnya diinkubasi pada suhu 70 0C selama 10 menit menggunakan Water Bath. Tabung mikrosentrifuga yang berisi campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu 37 0C selama 4 jam menggunakan pemanas air (Water Bath). EcoRI. Campuran reaksi dihomogenkan sebentar menggunakan mikrosentrifuga selama 1-2 detik. Optimasi reaksi restriksi sebelumya dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan DNA dapat terpotong sempurna dengan kondisi optimasi tersebut. dan PstI sebayak 2 µl untuk vinal volume 50 µl. Misalkan reaksi restriksi bekerja secara optimum dengan komposisi Buffer E sebanyak 5 µl. BSA 2. BSA. BSA sebayak 0. 7. Vektor pUC19 dipotong dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotongan DNA genom. Tabung mikrosentrifuga diketuk sebentar untuk memastikan campuran sudah tersuspensi. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml. 6. 5. DNA pUC19 sebayak 20 µl. Restriction enzyme of Hind III.5 µl. dengan komposisi Buffer E. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml sesuai dengan hasil optimasi reaksi restriksi. ddH2O 5. Buffer E 3. Prosedur Kerja 1. DNA dan PstI 3. Hal ini dilakukan untuk inaktifasi enzim restriksi. 4. . Pst I 4. DNA plasmid pUC19 6.

10 menit .Skema Kerja Restriksi DNA plasmid 1 2 3 4 5 6 7 P1 P2 P3 Spin sebentar. dg Water bath selama 4 jam Simpan di frezer Inaktifasi. suhu 700C dg waterbath. 2” Ketuk-ketuk Inkubasi 37 0C.

Tujuan Melihat cara kerja elektroforesis gel agarosa 3. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet. makin rendah laju migrasinya. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20. 2. Gelas Ukur 1000 ml 2. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Sarung tangan 5. Kertas parafilm . Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Makin besar ukuran molekulnya. Landasan Teori Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Tabung mikrosentrifuga 4. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Elektroforesis gel agarosa biasanya digunaka untuk analisis ukuran dan konformasi sampel DNA. kuantifikasi DNA.000 pasang basa (bp). ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA 1. 2010). Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. pemisahan dan ekstraksi fragmen DNA (Anonim. Alat dan Bahan Alat 1. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 6. Labu Erlenmeyer 50 ml 3.F.

Kamera digital Bahan 1. 15% ficoll tipe 4000. 57. 3. EDTA 120 mM) 9.2 g untuk dilarutkan ke dalam bufer TAE 1x hingga volume 20 ml. UV transluminator 10.25% bromophenol blue. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna. Akuades 5. Prosedur Kerja 1. Loading dye 6x (0.7. 100 ml EDTA 0. DNA plasmid hasil restriksi (cut) 4. lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masingmasing ujung baki) 4. Agarosa 3.25% xylene cyalol. Seperangkat alat elektroforesis 8. DNA kromosom bakteri. DNA plasmid hasil isolasi (uncut) c. 0. dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml) 4. Kaca mata UV 11.5 M pH 8. b. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0. DNA marker. Siapkan baki gel agarosa. 2. Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir menyentuh dasar baki . misalnya : a. Buat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245 ml akuades. Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base. Larutan Etidium Bromid (EtBr) 2. misalnya DNA λ yang dipotong dengan HindIII 6. Sampel DNA.1 g asam asetat glacial.

aturlah voltase dan waktu running hingga diperoleh angka 70 V dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus. masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE). 11. 15. tambahkan 1 µl etidium bromid (PERINGATAN KERAS!!. lepaskan selotip dari ujung-ujung baki. keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas UV transluminator). 6. 14. 16. 17. amati pita-pita DNA yang tervisualisasi. 12. hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran. nyalakan UV transluminator. ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya).5. jika tidak demikian. jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60 0C. kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel agarosa. buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan. siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis. ambil sisir dengan hati-hati. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan. 7. 8. 13. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar. nyalakan sumber arus. 9. gunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik). 10. jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus. . elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis. biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat. yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. masukkan 10 µl sampel DNA dan 2 µl loading dye 6x ke dalam sumuran gel agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet.

coli tersebut akan berubah karena mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf) 6. herbisida. Transformasi dilakukan dengan menggunakan sel kompeten. 2. coli hasil transforman mengandung plasmid dan salah satu ciri sel yang disisipi plasmid adalah resisten terhadap antibiotik (ampisilin). Sel E. jamur. TRANSFORMASI SEL E. Sel kompeten merupakan sel yang memiliki kemampuan untuk disisipi DNA dari luar. termometer 3. E. Teknologi ini digunakan dalam usaha memperoleh tanaman yang tahan terhadap infeksi bakteri. Apabila vektor DNA rekombinan telah terintegrasi dengan sel inang maka sel tersebut dapat dikatakan telah ditransformasi. Strain E.G. karena fenotip strain E. coli 3. Transformasi merupakan hal yang penting karena menghasilkan organisme rekombinan sesuai dengan gen yang disipkan pada vektor.coli. Setelah diinkubasi. maka untuk mendapatkan sel transforman cukup mudah yaitu dengan menumbuhkan sel hasil transformasi pada media yang mengandung ampisilin. coli JM109 1. coli biasanya digunakan sebagai sel kompeten. Landasan Teori Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang bakteri misalnya bakteri E. Tabung mikrosentrifuga 4. Tujuan Praktikum ini bertujuan untuk melakukan transformasi pada sel E. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 5. shaker-incubator 2. sel tersebut akan memperbanyak diri sehingga jumlahnya menjadi banyak. coli disisipi vektor DNA rekombinan yang disisipkan ke dalam plasmid. pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH. Alat dan Bahan Alat 1. Korea) .

cawan Petri 10. 2. batang drugalsky 9. coli JM 109 hasil inkubasi semalam ke media LB cair 25 ml dengan cara mengambil 250 μl kultur E. media cawan LB ampisilin dan media cawan LB tanpa ampisilin 4. atau dengan kata lain perbandingan antara volume media dan volume kultur 10:1. kamera digital.700 x g selama 5 menit. . jarum ose 8.700 x g selama 5 menit. Inkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (semalam). coli JM 109 dikultivasi ke media LB cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni strain E. 4. Ltd. coli JM 109 2. Erlenmeyer 11. diresuspensi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5. strain E. Pindahkan kultur E. Bahan 1.7. coli JM 109 ke dalam media LB cair 25 ml. kemudian dilakukan inkubasi dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm selama 120 menit (2 jam) pada suhu 37oC. Kultur semalam strain E. media LB cair 3. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 μl CaCl2 dingin. coli JM 109 ke media LB cair. media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG 5. shaker-incubator tipe EFM-60 (Seiwa Rico.5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.) 12. Prosedur Kerja 1. es batu 4. 3. Sebanyak 1.

sebanyak 50 μl hasil inkubasi pada tabung nomor 2 ditumbuhkan juga pada media LB tanpa ampisilin. ke dalam tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 16 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten. Tabung mikrosentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah inkubasi 10 menit. 8.5. dua diantaranya untuk inkubasi 2 jam dan 3 lainnya untuk inkubasi 16 jam. dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37oC dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 1. Ketiga tabung mikrosentrifuga diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit dan diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik pada suhu 42oC dan segera dipindahkan ke es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit. 2 μl vektor pUC19 rekombinan (tabung nomor 4) dan tidak ditambahkan apapun (tabung nomor 5). Supernatan dibuang kembali dan ke dalam tabung ditambahkan kembali 200 μl CaCl2 dingin. Tabung mikrosentrifuga selanjutnya ditambahkan dengan media LB hingga 1 ml. dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator selama 1. 9. ditambahkan 10 μl vektor pUC19 sirkuler untuk penentuan efisiensi transformasi (tabung nomor 3). 11. kemudian diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik dengan suhu 42oC dan segera dipindahkan ke dalam es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit. sedangkan tabung nomor 2 tidak ditambah dengan palsmid.5 jam. Kedua tabung diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit. Dalam perlakuan ini terdapat lima tabung mikrosentrifuga. 12. salah satunya atau tabung nomor 1 ditambah dengan 10 μl palsmid pUC19 sirkuler. Sebanyak 100 μl hasil inkubasi ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp untuk kedua tabung. . 7. 6. 10. Inkubasi dilakukan selama 16 jam pada suhu 37oC. diresuspensi dan diinkubasi dalam es. Selain itu. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten.5 jam pada suhu 37oC. Sementara itu.

16. 15. Disiapkan media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG dengan cara menambahkan 50 μl X-Gal dan 100 μl IPTG ke media cawan LB/Amp. Hasil inkubasi tabung nomor 3 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG sebanyak 100 μl. coli dengan pUC19 sirkuler dilakukan penjumlahan koloni untuk diketahui efisiensi transformasinya. Σkoloni = jumlah koloni putih (dalam cfu) [pUC19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng) . Tabung nomor 4 disentrifugasi dengan kecepatan 5. Hasil inkubasi pada tabung no. Supernatan dibuang hingga tersisa 100 μl.700 x g selama 5 menit. 14. 17. dilanjutkan dengan inkubasi selama 16 jam pada suhu 37oC.13. Efisiensi transformasi dihitung dengan cara sebagai berikut Dimana.5 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp sebanyak 100 μl dan ke media cawan LB sebanyak 50 μl. dan kemudian ditumbuhkan dengan cara plating ke media LB/Amp/X-Gal/IPTG. lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama lebih kurang 30 menit. Untuk cawan yang berisi E. 18.

Coli JM 109 tidak dapat dilaksanakan karena kurang terfasilitasi alat dan bahan yang ada dilaboraotium Biologi S1. Hal tersebut menjadi kendala untuk dilaksanakan praktikum tersebut. karena alat dan bahan merupakan faktot utama sebagai indikator berhasil atau tidakkah suatu praktikum. diperlukan alat dan bahan yang memadai di laboratorium. karena jika salah satu alat/ bahan tidak ada maka paraktikum itu akan gagal secara keseluruhan. Komponen Sel dan Pengamatan Pembelahan Mitosis. Retriksi DNA Plasmid. Setelah dilakukan konfirmasi dengan laboran banyak alat dan bahan yang tidak ada di laboratorium biologi S1. Adapun judul pengamatan Isolasi DNA Plasmid. .BAB III PENUTUP Pada praktikum Biologi Sel dan Molekuler ini. Adapun judul praktikum yang dapat dilaksanakan yaitu Hubungan Struktur dan Fungsi Sel. Elektroforesis Gel Agragosa. dan Transformasi Sel E.

Suryani. (Bahan Referensi) Tim Biologi UNIMED. Cicik. Soedirman . Laporan praktikum Biologi sel dan Molekuler S2 Bologi UNSOED. Medan: FMIPA UNIMED. Praktikum Genetika. Purwokerto: Program Pasca Sarjana Universitas Jenderal . 2008.DAFTAR PUSTAKA Kurniawan. Praktikum Struktur Pertumbuhan II. Medan: FMIPA UNIMED. 2010. 2009.

3.4.3907.82/   .2 .8 -.75.2 209. 70.953.2-. 03/0/ -.9.3 -:39 03/0/  09.3.8 .89072 3432      %::.9 /9.      a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a9/.3./..3 032 708978 .3   .

 80./.38:/.30342 .3 425488 :1107  80-.270007  .5.9:032!89    592.5.. a:39: .80. -07::7. a  /.907. /.2 9.3 274803971:.8:: 80. .-:3 274803971:.89.9430320413/ .3/.2203:3.7. /03.907.2.2 9.25:7.8 70.8 5..8 708978 /5078.7 ..8 708978 80-0:2.3 /.3   $   :1107   :1107   //    5.:.-:3 274803971:....3 -078 .7 203:3.3 .. /03.9    9.3502.25:7.   '0947 5& /54943 /03.2.32 /03.9:   #0897.8 90780-:9 /3:-. 4592:2 /03.8 708978  8.9 90754943 8025:73.3 70.3.3425488:1107 $ /.8 70..  2039203:3.3 80-039.7 :39: 202.3.25:7..3:39:3.. -07::7.3//. /09: 80-039.3:93..3  2 808:.4# !89    !7480/:707.3  /.89.8 /42403.  a  $ 80-.3.   /09  %.-:3274803971:.-:3 274803971:.8032 708978    .3 8.8::  80.8708978/825.8./. a  5& 80-.3 5024943.3 43/8 4592.2.85.370..:.3 70.3 032 708978 ..8 4592.8 90780-:9  #0..-:3 274803971:.82/5&   8-. /03.3 !8980-.91.3 /.3 9070- /.9 . 80.8 708978 -007.8 708978 /5078.3..:: :39: 202./3:-..5.3!89   #0.3.3..4:20 a    .7:9.2.9078:85038    %.

980.2 $5380-039.7    09: 09:          $25.3/ 17007 3.9  2039 .$02.91.07.#089785.907-.8  /.82/         9 9 9               3:-.8 8:: /..2.907-.

88.3 /03.3 .8.9 240: 8:.9 240: /.0/703/.391.   $.9.3 -.:.33..  0974147088 0 .3 ..83.3 90. /03. 0 .3 .303$.3903:39: 2028.3 -07.3   $0507.3:93.9/.  '8:8..:2.3 897.3 / -.3 431472.3 .3 202-.7.9.3%047 0974147088 207:5.3 ::7. /9.9.: 27..: 27.   5.7:97.-:7032007 2   %.9 /5077. /.8.3 -0727.3 /.91803. /:3. .8::7.5.8   5028.3..3 /.3.5.748.5.3 .009741470880.748.3/.//.7.39.203 240:  89.9:8 3.3 30.3 /.8..250   :.3:39: 20.34/0 . . /09.  %#  #$$# $   .3 240:3.. -5  0974147088 0 .8. / /.8.5./.0391.3/3.7.7  2.9780203:::9:-54891 .707  .. /..8.7:9..: ::7.820.9   0.3/..3 -.38.7:39.: 27.3 .-:3274803971:.2-.  07.:.2/ /.9: 17. :39: .33.3897:9:718 240:3..817.7.88 ::7.8.3 0897.2.7 -0-07.250  /03. -.7::7.5..203  /....3 09/:2-742/ .85.883.92745509-08079..  2.409    %::.7.3.8:.7.8&:7 2   .9.2 502-:..748.3 703/.250 -07/.203 17..9.3/.203 3432    40:  -072:. 9070- /..9 /.   .3.8 17. /:3.3 0..953. 7.3..2 20/.12 .3 83. 5.83.309/:2-742/80-0:2/5.3 8..748.7:9. 4 #.07.8.7 :97.9.3 :39: 2028.7.3.:: 0 /.409 8090.    079.3-08.8  80.

748.8.82/.4  1.7:9.3 -.3 887 00974147088 / 8..:.9.7:9.9 ./3 /0   -74245034 -:0  030 ./08   2.748.7-.9   2 .3 -:1107 %  /03. 0 .. .  /03. 5..257203039:/.748.. 80495 200..9 0 .900974147088   4.250 28.9..4:20 2 .5 ::3 -.3 9/.4950 % 2    &'97.3/.. 0 .83 2.&'  .2.3 .7:9.39/:2742/ 97    .748.80    . 2    :.3   .:. ///.3.2. :-...89.3 -:1107%  978 -.7:98025:73..3 80495 /9.884./.:9  .7.3 5488.   :.3 .7.33.707 28.  .:9     !7480/:707...33/   $.    !./. .9: ::3 -. 8.  2% 5/.907  -  5.947  ../08    :.8.2-:107%3.  7424842-.8 :3.  5.   :39: /.. 2.3.22.2. /03.748.3/54943/03.8. . 2032-.3  2 % 0/.82/.748.38:23..   .30/.  0.5./9..9 /..    $.  $0507..9 :.3.207.9.3. 203.3 -.7:9..3 .. 0 .3 5...809...83::3-.8708978 .7:9./083.748.7:9.235:7.

7:9.28:2:7.3 0 ./..::80.3 20303.3.9 .9 05. -.3   :-:3.7.7.  !078.9    . 2030250.2079.3 038 8.3 :-.7:8 0 9.-0 /..7 8:2-07 ./02.300974147088 .85.2-887/03.3a 09/:2-742/ !#%#$ :3.7:39. /03.89.3 3.3 9:.380495/.9.. ..250  ../ 0 .3-07:-.8:.280:7:3.3 /.. 0 90703/.12203:3.25:7.7:9.91 -07..9.748.3 -.2-.8:/..079.3 0/:. / /0. 203.7  02:/.0/.3.748.3 80-039.3 ./3/00/.748. .7:9./..5./03.3a4. /8 /03.5488-.7:9.8::.7::3 ::3-. /42403.7.2 -..3809. 0.3 070320070 9.3 90780-:9 9070- /.3..38..250/.9.3 .3.99..85./.3 . .3 /2.300974147088   2.9 8:2:7.3-./.3 -.3.-0 .39078.8:.9/.7    9.703.8:.    2. -..5. -0781.7.. 34247 8:2:7.3 a8. 203.7.9.3 .12//0.32745509   -:..3 .3.8.2%    8.2-:3 0 :9:- 30.7:9..809.748.7...207.3 .3 5.89.3 .783403    .3 0 /..9:7:33.9.8::3.748.3.3 00974147088 5.390..3 90.-0780...3 -:107 %  5..29.7.

00...3/.38:23..2.3907.7.300974147088 .3 /9. 8:2-07.947 ./..3.8./..3  2039 /03. 40 ..8:. -:3 .38:2-07.8:2-07.8&'97..9:7.300974147088   0:..-8  ..7:8   .8 &' 97.49.3 -07039 .3./...3 /909.959.37:333 /03.2030..9.3&'97.7. .3.3942-4 .2030.9: .80/.7.3.38:23. 5.-.79.9.7:8 /.3 8:/.   ' /.72  .80-.3 .9.9:7:3333.9.3.3 80:-:3 .8  .3 /.3.3 808:.947   3.5..:.7:8   00974147088 . 59..3 0 /. .3942-47:3 5.9.7.7:8 .-./50740 ..2/./.38:23.3.3 8:2-07 .5.   3.947 09.3 09.3.

2583  $97.09477042-3.703.3 90.3. 203..82/   $090.953.381472.3 03 03 503.3./.3808:.3 80 3. /97.74803971:.  %#$ #$$ .:2.3 /-.:39: 203/..3 203:2-:.3 /85.4 .9.897.3 .    .9 950    % 470.7: .3.3 80 4250903  $0 4250903 207:5. 9073907..0947  %0344 3 /:3.2583  2. 203/.3:39:20../.-:3274803971:...8.85. .82/.80 90780-:9 /.7  .3 8097.4   .3 /885.07 3.8  %7./.3 202507-.3 .381472.3. /3:-...3%047 %7..90728..:.3-./..3.381472.2 5.8.39.9: .82/ /.8  80 90780-:9 .::5 2:/.92745509-08079.8.3 !7.3/ -./.3 90.3.7 80 .3 0 /.3 8.4    .3.8.7 :..3  .4-.5.3 203.381472.350393 .9 /.397.3/:3 .3/:3 5. 20250740 9.8 207:5.4/885..804250903    %::.3 /885 5.9   8.3 -07:-./:3./-.3 2.-.9.381472.4 90780-:9 ..0391.7088903907.7 .907 .9:23-079::.:..5.3 :39: /885  /.381472.39-49 .3 5.8 /.3   .-.303$.103495897.303 . 8.3907.8 5.5./7803.5.9.9:/03.80 ./.38107 240:  0 /.2 :8. .380-..9/.2 80 3.3 80 . 40 240:  90780-:9  5. .3 47.  . .3 202 02.38207042-3.3 .3/.53108-.2:7 07-8/.3 80 . .381472.8 97.3..8 207:5.3.3 /.3.703.3 203..3 203:3.   $0507./03..3 903 97.  %7.25:.8 /03.3 . 5503/471    502.. 20/.4 $0 .//.2.203..907-.381472.703.:-..907 . 4 #.0947  7042-3..3 /03.947   9072420907   %.

35.207...4 9/   .2583   20/.  ...3!097  7032007  8..3.3/7:.:-..4    20/..947950   $0..3   897./9.2583/.07 3.320/.9...3 .7   20/.39...3..  ..7:2480   -..#.8   .

25.

. .

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

3/03.3 /-07 0:9 5.9.39.. .82/    0/:.07 3.3 3:-.30.35.92.3  5.2 .2..9:3.2 507. /33  /708:85038 /.82/5&87:07 80/.9 84.83 2.  $:5073.3.3 .83 -078  804250903 8.8/9:2-:.5./9.8 02-...8 3:-. /9.05. 80.:9.9.3 2.:39: 3:-.3 02-.39.2 8.8.8.  2 8090.2/..-:3342479/. .33. /03.3 0 /.2    %.3 /3:-.    ./.3:9/.8::4/03.8  .2.   2039    %.947 5./.8 75280.80-.8 /..3.2-.7.-:334247/9.3 8007.33907/.3 0 /...-:3 274803971:.3.-:3 274803971:.2-.. /. /53/.3 20/..-:3274803971:.20880.. 3:-.83:-.93020/./03. 2039 02:/.2-.8.9.  80.2 08   .8 0. .7.8 /.:.3:9.3 /-:.  3. .   /09 /03.:-.9.3749.5.2-.3 /03.3 8:: 4 /.-:3/3:-.3.3.. /:.2.2    $0-.2 08 :39: /3:-.8   2039  /.2 9..2.9.:39:3:-.3 02-.-:3 /9.3..

 2039   %.     .25.8 /..-:334247 /..-:3 274803971:.2.83 2.380.. 20/. 9.8::4  .38007.35..3 3:-.3 /03.947 80.8 9.25. .32.5.7.8 0.-:3 34247  /9:2-:.3.3 ./9.8 5.0947 5& 87:07:39: 503039:..8::4 /.09475&7042-3.. 9.3 /03.  2  /.802-.3:9.80-.  2039/.-:334247   09.8 3:-./3:-.-:3 34247   .  9./.83-078 804250903 /9./.5:3 9./.07 3.3:93.2.8/.2-.3 9:  80-.  ./53/.  3.3 :.:-.3.2 9.-:3 274803971:...3 .:. /095. 9:  0 /. /9.2.3008:39:/3:-.381472./.2. .39/.8 3:-.9.2 8.8::4   $02039.3:9/.20880.80.25 :39: 0/:.3 9.3 01803897.-:3 274803971:.2-.-:3   $0. 80.2583 3:-.2-.3/-070:95./.2 .8  .9 84. 5.3 20/.2. 80.

.320/.3. 8..5..

25.

 ..

!%/03.3    !% 0 20/.3     . /. .3...203..2-..7.3 .

3 2039   .89.0-:7.8::480.3.: /3:-.-:334247/9:2-:.3.93020/.5.25  .83:-.7...3/03.8 5. ./.2..

25.

. .

5.3.2.     /.3.3/03.7.    %.3 /-:.3      80.9.8 /03.93020/.3 0.  2039   $:5073.05.-:3 34247  /803971:.3 /9:2-:.!%80-.9. 90788.3 3.3 02:/...

25.

. .

3 ..!%   .-:3 34  /9:2-:..3./.3 /03.8 5..8 3:-. 9.93 0 20/.7.. 5.

8/9:3/03.2.381472...3443:39:/09.3:9..  Ð443 :2. /.4435:9 /.23          .8::4   &39: .2.381472.3 5& 87:07 /.3 503:2.-07:9 2.   1803897..85& /.:.   /.3.4 /03..83.3.3.3020/.3 .7.2580-.380-.1:  5&(4380397...3/03..:01803897.3.3 -078   ..33:-.25..880.80-../.

 ...-47. 8.949 :9.703.3 -.. .3 202.9.3 207:5.9:2 44$0/.703. 80-.9/..9 /. 8:./.9.947 -07. / . 8.3 ..57.. 3/.9: 57..3-.340:073 /507:.: 9/.947:2  . !&%&!    !..3.2./.9: .9:2  .3 1..8 .

3 .9 /. :39: /.82/  #0978  !.48..89.3 9/..8..9.3-.3 ..947:2 -44 $  .9 /.8/03.9:2 .9:2 90780-:9  /.5:3 :/: 57.39/.3 %7.9 /.7.5. :7./.8  !./.3 .2./.5:3 :/: 503.3 57.703.9: :-:3..2.381472.3 $97:9:7 /.3 !03..5.343172.8 .:. .9.-47.3./ 03/.3 84.3!02-0. / .2.-.3.3 9071.7.3-.. /.3 :38 $0  4254303 $0 /.3   $090.49:2 44$     .3 /. /./.080:7:.  /.8.9/..3 -.5.8.80.39488   /..-47.3.3.3.3 ..9:29:. 90780-:9 203..8 $0  4    9/...-47..3..3..82/  0974147088 0 7.

 &3.3 57.3 40:07 $ 44 &$    !:740794 !747...7.%#!&$%  :73.8. $40/72.547.3!&    . $.0789.8 03/07.3  $:7.3     . 0/.9:2 44 80 /.3..     !7.9:20309.3   0/.3 ! &  .3  .2 !.9:2 $97:9:7 !079:2-:.3#0107038  %244&   !7.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful