Tugas Makalah Praktikum Biologi Sel dan Molekuler

Prosedur Praktikum Biologi Sel dan Molekuler untuk Prodi Pendidikan Biologi S2
Oleh:

Weni Astari Widia Ningsih Yovanna M.Daniel

8116174017 8116174018 8116174019 8116173011

Pendidikan Biologi B

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS NEGERI MEDAN 2011

DAFTAR ISI

Daftar isi ...................................................................................................... i Kata Pengantar..ii BAB I Pendahulan ..................................................................................... 1 BAB II Prosedur Praktikum Biologi Sel Dan Molekuler ........................ 2 A. Hubungan Struktur dan Fungsi Sel ................................................. 2 B. Komponen Sel ................................................................................. 3 C. Pengamatan Pembelahan Mitosis.................................................... 4 D. Isolasi DNA Plasmid ....................................................................... 6 E. Retriksi DNA Plasmid .................................................................... 10 F. Elekrtroforesis Gel Agragosa .......................................................... 14 G. Transformasi Sel E.Coli JM 109 ..................................................... 17 BAB III Penutup ......................................................................................... 21 Daftar Pustaka ............................................................................................. 22

ii

KATA PENGANTAR

Syukur Alhamdulillah, penulis sampaikan puji dengan syukur kehadirat Allah SWT. yang telah memberikan Taufik dan hidayah-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas makalah mata kuliah Praktikum Biologi Sel dan Molekuler mengenai Praktikum Biologi Sel dan Molekuler mengenai Prodi Pendidikan Biologi S2. Adapun informasi ilmiah yang mendukung penyusunan makalah ini, dihimpun dari sejumlah referensi meliputi hal-hal yang berkaitan dengan teknologi dalam biologi molekuler dan segala aspek yang berkaitan dengan hal tersebut. Namun penulis pada akhirnya menyadari bahwa tugas akhir ini belum sempurna banyak sekali keterbatasannya, baik terkait dengan studi literatur atau pustaka sebagai pendahuluan, maupun teori dan metodologi yang masih terbatas. Oleh karena itu penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada ibu Dra. Uswatun Hasanah, M.Si selaku dosen pembimbing mata kuliah : Praktikum Biologi Sel dan Molekuler dan teman-teman PPs Pendidikan Biologi Angkatan 2011. Akhirnya, mudah-mudahan amal kebaikan kita semua diterima oleh Allah SWT. Amin.

Penulis

BAB I PENDAHULUAN

Praktikum Biologi Sel dan Molekuler di peroleh Mahasiswa S2 Prodi Pendidikan Biologi pada semester pertama sebagai mata kuliah wajib yang seiring berjalan dengan mata kuliah teori Biologi Sel dan Molekuler. Pada praktikum biologi molekuler ini menggunakan teknik- teknik khusus yang khas pada biologi molekuler, namun kini semakin memadukan teknik- teknik tersebut dengan teknik dan gagasan dari genetika dan biokimia. Tidak terdapat lagi garis tegas yang memisahkan disiplin- disiplin ilmu ini seperti sebelumnya. Secara umum keterkaitan bidang- bidang tersebut dapat digambarkan ssebagai berikut. Biokimia- telaah zat kimia dan proses- proses vital yang berlangsung pada makhluk hidup., Genetika- telaah atas efek perbedaan genetic pada makhluk hidup (misalnya telaah mengenai mutan), dan biologi molekuler itu sendiri telaah dalam skala molekul atas proses replikasi, transkripsi, dan translasi bahan genetik. Semakin banyak bidang biologi laiinnya yang memfokuskan diri pada molekul , baik secara langsung mempelajari interaksi molecular dalam bidang mereka sendiri seperti pada biologi sel dan biologi perkembangan, maupun secara tidak langsung (misalnya dengan menggunakan teknik biologi molekuler untuk menyimpulkan cirri- cirri historis populasi atau spesies) seperti pada genetika populasi dan filogenetika. Adapun materi praktikum Biologi Sel dan Molekuler ini meliputi pengamatan terhadap Hubungan Fungsi dan Struktur Sel, Komponen sel, Pengamatan Pembelahan Mitosis, Isolasi DNA Plasmid, Retriksi DNA Plasmid, Elektroforesis Gel Agragosa, Transformasi Sel E.Coli JM 109.

BAB II PROSEDUR PRAKTIKUM BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER

A. HUBUNGAN STRUKTUR DAN FUNGSI SEL

1. Landasan Teori Semua makhluk terdiri dari sel, sel dikatakan sebagai unit dasar kehidupan. Sel hidup memiliki ciri- ciri seperti makhluk hidup juga dapat tumbuh, reproduksi, metabolism, menghasilkan energi, merespon terhadap lingkungan mereka dan seterusnya. Namun sel pada setiap makhluk hidup tidaklah sama, bahkan mereka sangat berbeda. Sebagai bahan pertimbangan apakah bakteri memiliki kesamaan dengan sel kupu- kupu, sel lumba- lumba dengan sel mawar? dan apa perbedaannya. Sel adalah unit struktural dan fungsional terkecil dari makhluk hidup. Dari kupu-kupu hingga kanguru, dari pohon kelapa hingga cemara semua tersusun atas sel. Makhluk hidup ada yang tersusun dari satu sel saja, disebut organisme uniseluler, dan ada makhluk hidup yang tersusun lebih dari satu sel, disebut organisme multiseluler.Sel meskipun memiliki ukuran sangat kecil, sel tergolong luar biasa. Fungsi dari suatu bagian sel atau jaringan dapat di indikasikan dari struktur sel/ jaringan pada suatu organ tersebut. Masing- masing organ pada tumbuhan mempunyai struktur yag berbeda- beda, hal ini karena fungsi dari masing- masing organ berbeda.

2. Tujuan Mengamati struktur anatomi preparat dari Akar, batang, dan daun Zea mays Menganalisis hubungan struktur dan fungsi sel- sel penyusun jaringan dari Akar, batang, dan daun Zea mays

3. Alat dan Bahan Alat a) Mikroskop b) Silet Bahan a) Akar, batang, dan daun Zea mays

4. Prosedur Kerja 1) Membuat irisan penampang melintang dari semua bahan 2) Mengamati struktur anatomi ketiga preparat : a) Bentuk, susunan, ciri khas dari sel-sel penyusun setiap jaringan pada preparat tersebut (epidermis, parenkim, jaringan pengangkut, jaingan penguat) b) Analisis mengenai struktur dan fungsi sel-sel penyusun jaringan di atas

B. KOMPONEN SEL

1. Landasan Teori Sel merupakan unit dasar umum dari struktur organic. Sel tumbuhan diartikan sebagai suatu kehidupan kecil yang membatasi batas nyata atau dinding sel, didalamnya terjadi reaksi- reaksi kimia yang rumit (Pandey, 1980). Sel bagian hidujuga dikatakan sebagai kesatuan struktur fisiologi yang terkecil dari organism hidup. Pada dasarnya sel tumbuhan terdiri dari protoplas yang dikelilingi dinding sel. Biasanya dinding sel di anggap bagian mati sedangkan protoplas adalah bagian hidup dari sel. Protoplas terdi dari komponen protoplasmic dan non protoplasmic. Komponen protoplasmic ada yang bersifat cair yaitu sitoplasma Sitoplasma metupakan substansi setengah cair lebih pekat (viscous) dari air dan bening (tembus cahaya: transculent), sehingga sukar dilihat oleh mata meskipun telah menggunakan mikroskop. Sitoplasma memenuhi

ruangan sel hidup dan didalamnya terdapat organel- organel serta vakuola. Di dalam vakuola bisa terlarut berbagai zat seperti gula, garam, protein, alkaloid, dan zat pewarna. Bahan- bahan yang terdapat di dalam vakuola digolongkan sebagai bahan- bahan ergastik, yaitu bahan- bahan hasil meabolisme sel (Suryani, 2008).

2. Tujuan Mengamati komponen sel baik komponen yang hidup atau yang tidak hidup dalam sebuah sel

3. Alat dan Bahan : Alat a) Mikroskop b) Silet Bahan c) Umbi kentang, batang bayam, daun bunga pukul empat

4. Prosedur Kerja 1) Buat irisan penampang melintang pada semua bahan 2) Amati beberapa buah sel pada setiap jaringan penyusun organ tumbuhan 3) Amati komponen-komponen sel yang terlihat dengan mikroskop yang ada

C. PENGAMATAN PEMBELAHAN MITOSIS 1. Landasan Teori Mitosis adalah proses pembelahan sel yang terjadi baik pada sel hewan maupun sel tumbuhan. Pembelahan ini penting untuk pertumbuhan serta menjaga agar jumlah kromososm sel induk sama dengan sel anak (2n-2n). Pada akar Allium cepa yaitu pada bagian ujungnya, bila diwarnai dapat diliha beberapa stadium pembelahan mitosis yaitu propase, metafase, dan telofase. Ujung bagian akar bawah terbagi tiga daerah yaitu: daerah meristem perpanjangan sel dan daerah diferensiasi. Fase- fase pembelahan mitosis dapat dilihat pada daerah meristem ujung akar Allium cepa.

2. Tujuan Mengetahui kedudukan kromosom pada fase- fase pembelahan mitosis pada akar Allium cepa. 3. Alat dan Bahan Alat 1. Mikroskop 2. Gelas objek 3. Gelas penutup 4. Jarum preparat 5. Cawan petri 6. Gelas piala 500 ml 7. Pembakar bunsen / lampu spiritus 8. Silet Bahan 1. Asetokarmin 2. Asam Klorida (HCl) 3. Fenil Lakto Fenol 4. Akar bawang 5. Kertas Hisap

4. Prosedur Kerja 1. Rendam bawang pada air dalam gelas biarkan selama 2-3 hari. 2. Potong akar bawang sepanjang 1 cm kemudian rendam pada asetokarmin dan HCl dengan perbandingan 9 : 1 3. Panaskan preparat tersebu di atas api bunsen atau lampu spiritus sampai menguap, tetapi jangan sampai mendidih 4. Pindahkan potongan aakar bawang yang sudah dipanaskan ke gelas objek dan beri satu tetes asetokarmin biarkanlah lebih kurang 30 menit. 5. Hisaplah kelebihan asetokarmin dengan kertas hisap. 6. Tetesi preparat tersebut dengan polienil alkohol (Fenil Lakto Fenol) di sampingnya (jangan kena preparat).

7. Tutup dengan gelas penutup kemudian di tekan dengan menggunakan pensil sampai preparat pipih (hati- hati gelas penutup jangan sampai pecah) 8. Amati di bawah mikroskop 9. D. ISOLASI DNA PLASMID 1. Landasan Teori Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri dan sel eukariotik tingkat rendah misalnya yeast. DNA plasmid mengalami duplikasi sebelum pembelahan sel inang. Plasmid biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan menggunakan E. coli sebagai host, sehingga dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim. Penggunaan plasmid dalam DNA rekombinan dilakukan karena plasmid memiliki tiga region yang berperan penting untuk DNA kloning, yaitu : a replication origin, marker yang memungkinkan adanya seleksi (biasanya gen resisten antibiotik) dan region yang mampu disisipi oleh fragmen DNA dari luar (Lodish et al.). Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik.

2. Tujuan Melihat cara kerja isolasi DNA plasmid

3. Alat dan Bahan Alat 1. Bunsen burner 2. Cawan petri

3. Freezer 4. Glove 5. Jarum ose 6. Erlenmeyer 100 ml 7. Microcentrifuges 5415D (Eppendorf) 8. Micropipette segala ukuran 9. Refrigerator 10. Shaker incubator 11. Spidol marker 12. Tip micropipette segala ukuran (Bio=Rad dan Axygen Scientific). 13. Tube microsentrifuge Bahan 1. Ampisilin 2. E.Coli JM109 yang mengandung plasmid pUC19 3. Es batu 4. Medium Luria Bertani (LB) agar dan LB cair. 5. QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA)

4. Prosedur Kerja 1. DNA vektor pUC19 diisolasi menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA). 2. Koloni tunggal bakteri JM transforman pUC19 dinokulasikan ke 25 ml medium LB cair dan diinkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (semalam). 3. Kultur bakteri hasil inkubasi 16 jam sebanyak 3 ml diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit. 4. Pelet sel diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dan disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit. 5. Pelet sel bakteri diresuspensi dengan 250 l Buffer P1 sampai homogen.

6. Suspensi ditambah 250 l Buffer P2 dan diresuspensi kembali dengan cara dibolak-balik sebanyak 4-6 kali. 7. Suspensi yang dihasilkan akan berubah warnanya menjadi biru. 8. Suspensi selanjutnya ditambah 350 l N3 dan diresuspensi dengan cara yang sama sehingga warna suspensi kembali seperti warna awal. 9. Tahap selanjutnya tabung mikrosentrifuga disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm (17,900 x g) selama 10 menit. 10. Supernatan yang dihasilkan dipindah dengan cara memipet ke dalam collection tube yang dilengkapi dengan QIAprep spin column dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000 rpm (17,900 x g) selama satu menit. 11. Cairan yang melewati membran dibuang dan QIAprep spin column dimasukkan kembali ke dalam tabung mikrosentrifuga. 12. QIAprep spin column dicuci dengan 500 l PB dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit. 13. Cairan yang melewati QIAprep spin column dibuang, dan ke dalam QIAprep spin column ditambahkan kembali 750 l buffer PE, dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit. 14. Cairan yang melewati QIAprep spin column kembali dibuang dan disentrifugasi ulang untuk menghilangkan sisa buffer pencuci. 15. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml baru dan ditambah dengan 50 l buffer EB, dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi pertama). 16. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml yang lain dan ditambah dengan 50 l buffer EB. Tabung mikrosentrifuga beserta QIAprep spin column disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi kedua).

Skema kerja Isolasi DNA Plasmid menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA)

@ 3 ml

E.coli transforman pUC19

25 ml LB

Inkubasi 370C, shaker 150 rpm, 16 jam 1 Cairan dibuan g Sp dibuan g Sentrifugasi 5.700xg (5000 rpm), + 1 ml STE resuspensi 5' Sentrifuga si 5000 rpm, 5'

Kolom pindah

+ 500 l Buffer PB Sentrifugasi + 50 l Buffer EB Sentrifugasi 13.000 rpm, 1' 13.000 rpm, 1'

Sp dibuan g

Cairan dibuan gg

+ 250 l Buffer P1 Resuspensi (vortex, bolak balik + 250 l Buffer P2 Bolak-balik sebentar Warna mjd BIRU + 350 l Buffer N3 Bolak-balik sebentar Warna BIRU hilang

+ 750 l Buffer PE Sentrifugasi DNA plasmid Cairan dibuan g 13.000 rpm, 5'

Sentrifugasi 13.000 rpm, 1'

Sentrifugasi 13.000 rpm, 1' Sp dipinda h Sentrifugasi 13.000 rpm, 1'

E. RESTRIKSI DNA PLASMID

1. Landasan Teori Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu organisme dalam jumlah besar. Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA). Molekul DNA rekombinan dapat diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang memiliki daerah pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom. Manipulasi pemotongan DNA dilakukan oleh enzim yang disebut endonuklease restriksi. Enzim enzim restriksi yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan berasal dari beberapa bakteri. Beberapa enzim seperti BamHI, EcoRI dan PstI dapat memotong masing-masing strand DNA. Enzim restriksi akan mengenali sisi restriksi suatu fragmen DNA yang biasanya terdiri atas 4 8 pasang basa. Sisi restriksi tersebut biasanya berupa pas- angan basa palindrom. Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian dapat berasosiasi dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain yang juga telah dipotong dengan enzim restriksi. Sisi pengenalan enzim restriksi tersebut berbeda beda pada suatu fragmen DNA, misalnya BamHI yang diperoleh dari Bacillus amyloliquefaciens memiliki sisi pengenalan

yang akan memotong pada basa G nomor 2 dari tepi masing masing strand (Lodish et al.), AGCT merupakan sisi pengenalan AluI, GAATTC merupakan sisi pengenalan EcoRI. Enzim restriksi akan memotong fragmen DNA di ujung yang sama pada 2 strand (blunt ended), namun biasanya enzim restriksi akan memotong pada ujung yang berbeda pada 2 strand sehingga menghasilkan sisi lengket (sticky ended). Pemilihan enzim restriksi untuk pemotongan fragmen DNA pada suatu teknologi DNA rekombinan didasarkan pada beberapa hal, yaitu : ukuran fragmen, blunt-ended atau sticky-ended fragment, sensitivitas terhadap metilasi, kompatibiliti terhadap kondisi reaksi. Enzim restriksi dengan sekuens

pengenal lebih pendek akan menghasilkan lebih banyak potongan fragmen DNA. Sticky ended biasanya lebih efisien dalam ligasi sedangkan blunt ended biasanya dikenali oleh enzi khusus yang cocok dengan tipe pemotongan blunt ended. Metilasi biasanya terjadi pada DNA mahluk hidup dan bervariasi polanya sehingga dibutuhkan enzim restriksi yang cocok untuk DNA yang mengalami metilasi dengan pola tertentu. Apabila terdapat 2 enzim yang cocok untuk suatu reaksi yang sama maka kedua enzim ini dapat ditambahkan pada reaksi dengan reaksi bufer dan suhu yang sama (Anonim, 2007). Komponen reaksi (master mix)restriksi terdiri dari : air, DNA, buffer dan enzim. Volume akhir untuk komponen reaksi biasanya 10 50 L. Volume di bawah 10 L tidak dianjurkan karena memiliki kemungkinan yang sangat besar untuk terjadinya kesalahan pipeting. Komponen enzim ditambahkan terakhir pada saat pembuatan master mix (Anonim, 2007). 2. Tujuan Melihat cara kerja pemotongan DNA plasmid 3. Alat dan Bahan Alat 1. Freezer 2. Glove 3. Micropipette segala ukuran 4. Microsentrifuge 5415D (Eppendorf) 5. Spidol marker 6. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 7. Tube microsentrifuge 8. Pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea)

Bahan 1. BSA 2. Buffer E 3. Buffer H 4. ddH2O 5. DNA plasmid pUC19 6. Es batu 7. Restriction enzyme of Hind III, EcoRI, Pst I

4. Prosedur Kerja 1. Vektor pUC19 dipotong dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotongan DNA genom, yaitu enzim PstI. 2. Optimasi reaksi restriksi sebelumya dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan DNA dapat terpotong sempurna dengan kondisi optimasi tersebut. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml, dengan komposisi Buffer E, BSA, DNA dan PstI 3. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml sesuai dengan hasil optimasi reaksi restriksi. Misalkan reaksi restriksi bekerja secara optimum dengan komposisi Buffer E sebanyak 5 l, BSA sebayak 0,5 l, DNA pUC19 sebayak 20 l, dan PstI sebayak 2 l untuk vinal volume 50 l. 4. Campuran reaksi dihomogenkan sebentar menggunakan mikrosentrifuga selama 1-2 detik. Tabung mikrosentrifuga diketuk sebentar untuk memastikan campuran sudah tersuspensi. 5. Tabung mikrosentrifuga yang berisi campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu 37 0C selama 4 jam menggunakan pemanas air (Water Bath). 6. tabung mikrosentrifuga selanjutnya diinkubasi pada suhu 70 0C selama 10 menit menggunakan Water Bath. Hal ini dilakukan untuk inaktifasi enzim restriksi. 7. larutan DNA hasil restriksi disimpan di dalam Freezer.

Skema Kerja Restriksi DNA plasmid

1 2

4 5 6 7

P1

P2

P3

Spin sebentar, 2 Ketuk-ketuk

Inkubasi 37 0C, dg Water bath selama 4 jam

Simpan di frezer

Inaktifasi, suhu 700C dg waterbath, 10 menit

F. ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

1. Landasan Teori Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp). Elektroforesis gel agarosa biasanya digunaka untuk analisis ukuran dan konformasi sampel DNA, kuantifikasi DNA, pemisahan dan ekstraksi fragmen DNA (Anonim, 2010). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet. 2. Tujuan Melihat cara kerja elektroforesis gel agarosa 3. Alat dan Bahan Alat 1. Gelas Ukur 1000 ml 2. Labu Erlenmeyer 50 ml 3. Tabung mikrosentrifuga 4. Sarung tangan 5. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 6. Kertas parafilm

7. Seperangkat alat elektroforesis 8. Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000; EDTA 120 mM) 9. UV transluminator 10. Kaca mata UV 11. Kamera digital

Bahan 1. Larutan Etidium Bromid (EtBr) 2. Agarosa 3. Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml) 4. Akuades 5. DNA marker, misalnya DNA yang dipotong dengan HindIII 6. Sampel DNA, misalnya : a. DNA kromosom bakteri, b. DNA plasmid hasil isolasi (uncut) c. DNA plasmid hasil restriksi (cut)

4. Prosedur Kerja 1. Buat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245 ml akuades. 2. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0,2 g untuk dilarutkan ke dalam bufer TAE 1x hingga volume 20 ml. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna. 3. Siapkan baki gel agarosa, lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masingmasing ujung baki) 4. Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir menyentuh dasar baki

5. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan, jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60 0C, tambahkan 1 l etidium bromid (PERINGATAN KERAS!!, gunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik). 6. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar, kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel agarosa, biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat. 7. ambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki. 8. masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE). 9. siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis. 10. masukkan 10 l sampel DNA dan 2 l loading dye 6x ke dalam sumuran gel agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet. 11. buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan. 12. hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran; jika tidak demikian, ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya). 13. nyalakan sumber arus, aturlah voltase dan waktu running hingga diperoleh angka 70 V dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus. 14. jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus. 15. elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis. 16. keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas UV transluminator). 17. nyalakan UV transluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi.

G. TRANSFORMASI SEL E. coli JM109 1. Landasan Teori Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang bakteri misalnya bakteri E.coli. Sel E. coli disisipi vektor DNA rekombinan yang disisipkan ke dalam plasmid. Setelah diinkubasi, sel tersebut akan

memperbanyak diri sehingga jumlahnya menjadi banyak, karena fenotip strain E. coli hasil transforman mengandung plasmid dan salah satu ciri sel yang disisipi plasmid adalah resisten terhadap antibiotik (ampisilin), maka untuk mendapatkan sel transforman cukup mudah yaitu dengan menumbuhkan sel hasil transformasi pada media yang mengandung ampisilin. Strain E. coli tersebut akan berubah karena mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. Apabila vektor DNA rekombinan telah terintegrasi dengan sel inang maka sel tersebut dapat dikatakan telah ditransformasi. Transformasi merupakan hal yang penting karena menghasilkan organisme rekombinan sesuai dengan gen yang disipkan pada vektor. Teknologi ini digunakan dalam usaha memperoleh tanaman yang tahan terhadap infeksi bakteri, jamur, herbisida. Transformasi dilakukan dengan menggunakan sel kompeten. Sel kompeten merupakan sel yang memiliki kemampuan untuk disisipi DNA dari luar. E. coli biasanya digunakan sebagai sel kompeten. 2. Tujuan Praktikum ini bertujuan untuk melakukan transformasi pada sel E. coli 3. Alat dan Bahan Alat 1. shaker-incubator 2. termometer 3. Tabung mikrosentrifuga 4. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 5. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf) 6. pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea)

7. jarum ose 8. batang drugalsky 9. cawan Petri 10. Erlenmeyer 11. shaker-incubator tipe EFM-60 (Seiwa Rico, Ltd.) 12. kamera digital. Bahan 1. strain E. coli JM 109 2. media LB cair 3. media cawan LB ampisilin dan media cawan LB tanpa ampisilin 4. media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG 5. es batu

4. Prosedur Kerja 1. Kultur semalam strain E. coli JM 109 dikultivasi ke media LB cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni strain E. coli JM 109 ke media LB cair. Inkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (semalam). 2. Pindahkan kultur E. coli JM 109 hasil inkubasi semalam ke media LB cair 25 ml dengan cara mengambil 250 l kultur E. coli JM 109 ke dalam media LB cair 25 ml, atau dengan kata lain perbandingan antara volume media dan volume kultur 10:1, kemudian dilakukan inkubasi dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm selama 120 menit (2 jam) pada suhu 37oC. 3. Sebanyak 1,5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit. 4. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 l CaCl2 dingin, diresuspensi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.

5. Supernatan dibuang kembali dan ke dalam tabung ditambahkan kembali 200 l CaCl2 dingin, diresuspensi dan diinkubasi dalam es. Dalam

perlakuan ini terdapat lima tabung mikrosentrifuga, dua diantaranya untuk inkubasi 2 jam dan 3 lainnya untuk inkubasi 16 jam. 6. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam yang masing-masing berisi 200 l sel kompeten, salah satunya atau tabung nomor 1 ditambah dengan 10 l palsmid pUC19 sirkuler, sedangkan tabung nomor 2 tidak ditambah dengan palsmid. 7. Kedua tabung diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit, kemudian diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik dengan suhu 42oC dan segera dipindahkan ke dalam es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit. 8. Tabung mikrosentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah inkubasi 10 menit, dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37oC dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 1,5 jam. 9. Sebanyak 100 l hasil inkubasi ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp untuk kedua tabung. Selain itu, sebanyak 50 l hasil inkubasi pada tabung nomor 2 ditumbuhkan juga pada media LB tanpa ampisilin. Inkubasi dilakukan selama 16 jam pada suhu 37oC. 10. Sementara itu, ke dalam tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 16 jam yang masing-masing berisi 200 l sel kompeten, ditambahkan 10 l vektor pUC19 sirkuler untuk penentuan efisiensi transformasi (tabung nomor 3), 2 l vektor pUC19 rekombinan (tabung nomor 4) dan tidak ditambahkan apapun (tabung nomor 5). 11. Ketiga tabung mikrosentrifuga diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit dan diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik pada suhu 42oC dan segera dipindahkan ke es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit. 12. Tabung mikrosentrifuga selanjutnya ditambahkan dengan media LB hingga 1 ml, dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator selama 1,5 jam pada suhu 37oC.

13. Disiapkan media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG dengan cara menambahkan 50 l X-Gal dan 100 l IPTG ke media cawan LB/Amp, lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama lebih kurang 30 menit. 14. Hasil inkubasi tabung nomor 3 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG sebanyak 100 l. 15. Tabung nomor 4 disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit. Supernatan dibuang hingga tersisa 100 l, dan kemudian

ditumbuhkan dengan cara plating ke media LB/Amp/X-Gal/IPTG. 16. Hasil inkubasi pada tabung no.5 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp sebanyak 100 l dan ke media cawan LB sebanyak 50 l, dilanjutkan dengan inkubasi selama 16 jam pada suhu 37oC. 17. Untuk cawan yang berisi E. coli dengan pUC19 sirkuler dilakukan penjumlahan koloni untuk diketahui efisiensi transformasinya. 18. Efisiensi transformasi dihitung dengan cara sebagai berikut Dimana, koloni = jumlah koloni putih (dalam cfu) [pUC19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng)

BAB III PENUTUP

Pada praktikum Biologi Sel dan Molekuler ini, diperlukan alat dan bahan yang memadai di laboratorium, karena alat dan bahan merupakan faktot utama sebagai indikator berhasil atau tidakkah suatu praktikum, karena jika salah satu alat/ bahan tidak ada maka paraktikum itu akan gagal secara keseluruhan. Setelah dilakukan konfirmasi dengan laboran banyak alat dan bahan yang tidak ada di laboratorium biologi S1. Hal tersebut menjadi kendala untuk dilaksanakan praktikum tersebut. Adapun judul praktikum yang dapat

dilaksanakan yaitu Hubungan Struktur dan Fungsi Sel, Komponen Sel dan Pengamatan Pembelahan Mitosis. Adapun judul pengamatan Isolasi DNA Plasmid, Retriksi DNA Plasmid, Elektroforesis Gel Agragosa, dan Transformasi Sel E.Coli JM 109 tidak dapat dilaksanakan karena kurang terfasilitasi alat dan bahan yang ada dilaboraotium Biologi S1.

DAFTAR PUSTAKA
Kurniawan. 2010. Laporan praktikum Biologi sel dan Molekuler S2 Bologi UNSOED. Soedirman . Suryani, Cicik. 2008. Praktikum Struktur Pertumbuhan II. Medan: FMIPA UNIMED. (Bahan Referensi) Tim Biologi UNIMED. 2009. Praktikum Genetika. Medan: FMIPA UNIMED. Purwokerto: Program Pasca Sarjana Universitas Jenderal