TEKNIK PEWARNAAN BAKTERI I. TUJUAN Mempelajari teknik pewarnaan untuk pewarnaan mikroorganisme. II. PENDAHULUAN A.

Latar Belakang Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Selain itu bakteri yang hidup akan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Sedangkan, untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitianpenelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu, bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan merah sedangkan yang positif berwarna ungu (Levine, 2000). Berdasarkan pewarnaan bakteri tadi yaitu gram positif dan gram negative, kedua kelompok bakteri tersebut memiliki sifat khas yang tersendiri baik dalam hal bentuk, komponen dinding sel, hingga kenampakan dalam suatu pewarnaan. Pemarnaan bakteri sendiri digunakan agar mempermudah dalam mempelajari suatu mikroba. Pewarnaan sendiri ada berbagai macam cara dan berbagai macam tujuan dengan dilakukannya suatu pewarnaan. Pewarnaan yang paling mudah dilakukan adalah pewarnaan gram, dan jika berhasil maka akan terlihat perbedaannya secara nyata. Namun ada beberapa tahapan yang merupakan tahap krusial pewarnaan, jika terjadi suatu kesalahan maka hasilnya sangat fatal. Pada percobaan ini dilakukan agar setiap mahasiswa terampil dalam melakukan pewarnaan pada bakteri, dapat melihat perbedaan hasil secara nyata, serta mampu menganalisis fenomena yang terjadi dari setiap tahapan pewarnaan.

B. Dasar Teori Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode ini, bakteri dikelompokkan menjadi 2, yaitu: Bakteri gram positif dan bakteri gram negative yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada

mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti, Mycoplasma sp. (Sutedjo, 1991). Struktur bakteri terbagi menjadi 2, yaitu: 1. Struktur dasar (dimiliki oleh hamper semua jenis bakteri) Meliputi dinding sel, membrane plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan. 2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu) Meliputi kapsul, flagellum, pilus, fimbria, kromosom, vakuola gas dan endospora (Assani, 1994). Staphylococcus adalah bakteri gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentuk seperti buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada 2 jenis warna staphylococci yaitu: Staphylococus aureus yang berwarna kuning dan Staphylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karakteristik yang dimiliki Staphylococcus aureus diantaranya: hemolytic pada darah agar, catalase-oxidase-positif dan negative, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl pada konsentrasi tinggi hingga 15% dan menghasilkan enzim koagulase. Selain itu, biasanya S. aureus merupakan pathogen seperti bisul, sytesdan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan endocarditis serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepaskan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepaskan superantigens kedalam aliran darah (Cappaccino,1983). Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri pathogen. Akan tetapi pada strain baru dari E. coli merupakan pathogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang menguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah diair, indicator pada level pencemaran air serta mendeteksi pathogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella thypi. Endospore adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi stress karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut dilingkungan sampai kondisi menjadi baik (Gupte, 1990). Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk basil pembagiannya yaitu: basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk bulat), diplococus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur). Khusus pada spiral hanya dibagi 2 yaitu: setengah melengkung dan tidak melengkung (Dwijoseputro,1994). Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negative ditandai dengan pewarnaan ungu,

sedangkan yang positif berwarna merah. Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. selain itu, ada endospora yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi stress karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut dilingkungan sampai kondisi menjadi baik (Jaweta, 1986). Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negatif sehingga diperlukan adanya pratikum ini dilakukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaan gram. Pewarnaan gram menghasilkan 2 kelompok besar bakteri, yaitu: gram positif berwarna ungu dan gram negative berwarna merah. Adanya gram positif dan gram negative disebabkan oleh perbedaan bandingan dinding sel bakteri. Kandungan senyawa peptidoglikan pada dinding sel gram positif lebih tebal dibandingkan pada dinding gram negatif. Beberapa cara pengecatan, yaitu: Pengecatan negative Pengecatan sederhana Pengecatan gram Pengecatan ziehl Nielsen Pengecatan kapsul Pengecatan spora Pengecatan flagella (Ratna,1995). Sebelum melakukan pewarnaan, perlu dilakukan fiksasi mikroorganisme dan penyiapan olesan. Fiksasi yang dilakukan pada medium padat berbeda denga fiksasi pada medium cair. Cara fiksasi medium cair yaitu meletakkan suspensi mikroorganisme pada kaca objek yang telah dilingkari, lalu menyebarkan hingga rata, membiarkan olesan kering lalu diletakkan di atas api bunsen. Untuk medium padat, sebelum diberi suspensi diberi air steril dulu, lalu kelanjutannya sama dengan fiksasi pada medium cair. Fiksasi panas dilakukan saat olesan sudah benar-benar kering, apabila belum kering sel-sel organisme akan bersangkutan seperti direbus. (Hadioetomo, 1993). Teknik pewarnaan ada bermacam-macam cara, tetapi pada praktikum kali ini hanya dilakukan pewarnaan gram dan pewarnaan spora. Adapun beberapa teknik pewarnaan antara lain: 1. Pewarnaan Sederhana Menggunakan satu jenis zat warna, kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan sederhana, sitoplasma bersifat basofil, zat warna bersifat alkali (komponen kromatoforiknya positif). 2. Pewarnaan Tahan Asam Mengunakan pewarnaan karbolfuksin dengan pemanasan, pewarna tandingan metilene blue Loffler. 3. Pewarnaan Spora Dengan metode Dorner, digunakan nigrosin dan menghasilkan spora berwarna merah dan sporangium tak berwarna.

4.

Pewarnaan Kapsula Pewarnaan tidak bisa dilakukan dengan prosedur biasa karena kapsula bersifat ionic. 5. Pewarnaan Negatif Pewarnaan ini tidak mengalami pemanasan atau perlakuan keras, menggunakan nigrosin. (Team Mikrobiologi, 2001). 6. Pewarnaan Gram Merupakan pewarnaan diferensial; pewarnaan yang menampilkan perbedaan antar sel-sel mikroba dan bagian-bagiannya. Digunakan lebih dari satu pewarna. Pewarnaan gram termasuk dalam differensial, karena mampu membedakan dua jenis bakteri besar, yaitu gram positif dan gram negatif. Gram positif adalah organisme yang dapat menahan kompleks pewarna primer ungu kristal iodium sampai akhir prosedur, sehingga berwarna ungu. Hal ini dikarenakan dinding sel gram positif lebih tebal, menyusut oleh perlakuan alkohol karena dehidrasi sehingga dinding sel menutup sedag gram negatif mengandung lemak tinggi yang dapat larut dalam aseton atau alkohol. Gram negatif adalah organisme yang kehilangan kompleks pewarna ungu kristal iodium pada waktu pembilasan dengan alcohol dan terwarnai pewarna tandingan safranin, berwarna merah muda. Pewarnaan ini paling banyak digunakan utuk mencirikan bakteri. Faktor yang menimbulkan keragaman dalam reaksi gram antara lain: a. Pelaksanaan fiksasi b. Kerapatan sel c. Konsentrasi dan umur reagen d. Sejarah biakan e. Sifat, konsentrasi, jumlah pemucat (Pelczar, 1993). Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan pewarnaan sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zatzat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin, Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel bakteri (Hadioetomo,1994). Pewarnaan basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah methylene blue,kristal violet dan arbon fuehsin. Bakteri gram positif antraks batang ungu) pada contoh cairan serebrospina. Jika ada, bakteri spesies gran negative akan berwarna merah muda. sel-sel lain adalah sel darah putih (Suriawiria, 2005). III. METODE A. Alat dan Bahan

1. Alat a. Mikroskop b. Bunsen 2. a. b. c. d. e. f. g. Bahan Bakteri sampel A Bakteri sampel B Kristal violet Iodin Alkohol 96% Safranin Aquades

1 tetes 1 tetes 1 tetes 1 tetes 1 tetes 1 tetes secukupnya

B. Cara Kerja 1. Gelas benda diambil, kemudian dilewatkan pada api Bunsen 2. Yogurt diambil dengan memakai pipet tetes, sebanyak 1 tetes 3. Diletakkan pada gelas benda, kemudian difiksasi, yakni di lewatka pada nyala api, hingga tetesan yogurt menjadi kering 4. Gelas benda tersebut kemudian ditetesi dengan kristal violet, 1 tetes. Didiamkan selama 60 detik, kemudian dibilas dengan menggunakan penyemprot yang berisi aquadest 5. Selanjutnya ditetesi dengan 1 tetes iodine menggunakan pipet tetes. Didiamkan 60 detik, kemudian dibilas dengan menggunakan penyemprot yang berisi aquadest 6. Ditetesi dengan alkohol 96% sebanyak 1 tetes menggunakan pipet tetes. Didiamkan 45 detik, kemudian dibilas dengan menggunakan penyemprot yang berisi aquadest 7. Terakhir ditetesi dengan safranin 1 tetes menggunakan pipet tetes. Didiamkan 45 detik, kemudian dibilas dengan menggunakan penyemprot yang berisi aquadest 8. Sampel dipanaskan di atas bunsen atau dihisap kelebihan cairan menggunakan tissu 9. Diamati dibawah mikroskop 10. Langkah tersebut juga diulangi pada sample suspensi X III. HASIL DAN PEMBAHASAN Tabel hasil percobaan No. 1. 2. Sampel A B Warna akhir Merah muda Ungu muda Jenis bakteri Gram negative Gram positif Nama bakteri Escherichia coli Bacillus cereus

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal

identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel. Langkah-langkah utama dalam teknik pewarnaan antara lain: a. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis. b. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun, formalin, fenol. c. Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna. Pewarnaan gram pada praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu: a. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu. b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ. c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam. d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin. Penetesan masing-masing larutan pewarnaan gram (kristal violet, iodin, alkohol 95%, dan safranin) tersebut memiliki fungsi diantaranya penetesan kristal violet berfungsi sebagai cat utama yang akan diikat oleh peptidoglikan bakteri dan dilakukan selama 30 detik supaya cat dapat melekat sempurna pada dinding bakteri. Iodin sebagai cat mordan untuk mengintensifkan cat utama dan dilakukan selama 30 detik agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih kuat. Alkohol 96% untuk melunturkan cat utama, dilakukan selama 30 detik supaya cat dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa. Larutan terakhir yaitu safranin yang berwarna merah sebagai cat penutup untuk mewarnai kembali sel-sel yang sudah kehilangan warna utamanya dan dilakukan selama 45 detik agar bakteri yang telah luntur dapat terwarnai (Hadioetomo, 1993). Prosedur pewarnaan gram awalnya adalah tahap pemberian sample kemudian setelah sample diteteskan difiksasi. Namun, tidak terkena api hanya dilewatkan saja hingga kering. Tahapan kedua yakni sudah masuk tahap awal pewarnaan, yaitu penetesan kristal violet pada sampel, dimana pembarian kristal violet ini bertujuan sebagai cat utama yang nantinya akan diikat oleh peptidoglikan bakteri dan pada saat penetesan ini tidak langsung dibilas dengan aquades setelah penetesan. Namun, didiamkan 1 menit dahulu agar cat terikat kuat, setelah itu baru kemudian di bilas dengan aquades, agar tidak terjadi penumpukan. Kemudian ditetesi dengan memakai Iodin yang mana pemberian iodine ini bertujuan untuk mengintensikan cat utama atau mempertegas dan dalam proses ini di tunggu 1 menit sebelum dibilas, tidak boleh terlalu lama atau terlalu sebentar. Karena jika terlalu lama bakteri akan cenderung menjadi gram positif, walaupun sebenarnya yang diwarnai adalah bakteri gram negative. Setelah proses tersebut gelas benda

dibersihkan dengan aquades. Tahap pewarnaan berikutnya adalah penetesan dengan memakai alcohol 95% dimana fungsinya adalah untuk melunturkan cat utama. Pada tahap ini dilakukan selama 1 menit, dan tidak boleh terlalu lama atau terlalu sebentar. Karena jika terlalu lama akan cenderung menjadi gram negative, meskipun yang diuji gram positif. Tahap terakhir adalah pewarnaan dengan safranin yakni untuk mewarnai kembali sel-sel yang sudah kehiklangan cat warna utama. Kemudian didiamkan 45 detik agar cat meresap. Setelah itu, dibilas memakai aquades dan kemudian dikeringkan. Hasil pawarnaan dapat diamati langsung dibawah mikroskop.

Dari hasil percobaan diketahui bahwa koloni bakteri A merupakan bakteri Escherichia Coli dengan hasil percobaan menunjukan warna merah muda yang menandakan bahwa bakteri merupakan gram negatif. Sedangkan koloni bakteri B merupakan bakteri Bacillus cereus dengan hasil percobaan menunjukan warna ungu muda yang menandakan bahwa bakteri merupakan gram positif. Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi

peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatife. Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu: Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana. Tidak resisten terhadap gangguan fisik. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat Peka terhadap streptomisin Toksin yang dibentuk Endotoksin Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu : Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. Lebih resisten terhadap gangguan fisik. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut Tidak peka terhadap streptomisin Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin Klasifikasi Ilmiah Kingdom : Bacteria Filum : Firmicutes Kelas : Bacili Ordo : Bacillales Famili : Bacillaceae Genus : Bacillus Spesies : Bacillus cereus Bacillus cereus

Hasil pengamatan mikroskop Bacillus cereus adalah, endemik tanah-tinggal, Gram-positif, berbentuk batang, bakteri hemolitik beta. Beberapa strain yang berbahaya bagi manusia dan menyebabkan penyakit bawaan makanan, sedangkan jenis lain dapat bermanfaat sebagai probiotik untuk hewan. Ini adalah penyebab dari "Sindrom Nasi Goreng," karena bakteri adalah klasik dikontrak dari piring nasi goreng yang telah duduk pada suhu kamar selama berjam-jam (seperti pada prasmanan). B. cereus bakteri aerob, dan seperti anggota lain dari genus Bacillus dapat menghasilkan endospora pelindung. Faktor virulensi meliputi cereolysin dan fosfolipase C. Klasifikasi Ilmiah Kingdom : Bacteria Filum : Proteobacteria Kelas : Gammaproteobacteria Ordo : Enterobacteriales Famili : Enterobacteriaceae Genus : Escherichia Spesies : Escehricia coli Eschericia coli

Hasil pengamatan mikroskop E. coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk bakteri gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E. coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare, sindrom diare lanjutan, muntaber, hemolitik uremic (hus), infeksi usus, infeksi saluran urin, dan neonatal meningitis. Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia

yang disebabkan oleh Salmonella typhi. Disamping itu, E. coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika dan biasa digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan karena bakteri ini memiliki pertumbuhan yang sangat cepat dan mudah dalam penanganannya. IV. KESIMPULAN 1. Teknik pembuatan sediaan apusan (preparat) dapat dilakukan dengan mensuspensikan biakan bakteri denagn aquades, kemudian difiksasi 2. Pewarnaan struktur sel bakteri dilakukan dengan menggunakan larutan kristal violet, iodine, alcohol 96%, dan safranin 3. Bakteri yang termasuk gram positif adalah Lactobacillus casei dan bakteri gram negative adalah Escherichia coli 4. Bakteri di klasifikasi atas dua golongan, yakni bakteri grampositif dan bakteri gram-negatif. Terbagi atas: a. Bakteri berbentuk kokus (bulat) b. Bakteri berbentuk batang c. Bakteri berbentuk lengkung d. Bakteri yang termasuk kelompok khusus 5. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. 6. Langkah-langkah urutan pewarnaan harus diperhatikan. Fungsi pewarnaan larutan yaitu: a. Pewarna dasar (kristal violet) b. Larutan pengikat warna dasar (larutan iodin) c. Larutan pencuci warna dasar (alkohol 96%) d. Sebagai penutup warna utama (safranin)

DAFTAR PUSTAKA Assani, S. 1994. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta: Fakultas Kedokteran UI Cappucino, J. G. & Natalie. S. 1983.Microbiology a Laboratory manual. New York: Addison-Wesley Publishing company Dwijoseputro, D. 1994. Dasar-dasar mikrobiologi. Jakarta: PT. Jambatan Gupta, S. 1990.Mikrobiologi dasar.Jakarta: Bina Rupa Aksara Hadioetomo, Ratna Sri. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Yogyakarta: UGM Press Jaweta, E.1986.Mikrobiologi untuk Profesi Kesehatan. Jakarta: EGC Pelczar, Michael. 1993. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press

Surakarta, 19 Oktober 2011 Mengetahui Asisten Pembimbing Praktikan

Zulfiyah

Santosa Pradana Putra S.N.

LAMPIRAN