PEMBUATAN PREPARAT DAN PENGECATANNYA

Mikroorganisme yang ada dialam ini mempunyai morfologi, struktur khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jaweta, 1986; Dwidjoseputro, 1994; Assani, 1994). Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Pelczar & Chan, 1986; Volk & Wheeler, 1993; Lim, 1998). Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, subtrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pewarnaan gram pertama kali mulai dikembangkan pada tahun 1884 oleh ahli histologi yaitu Cristian Gram (Cappuccino & Sherman, 1983). Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Garm (Ratna, 1993; Dwidjoseputro, 1994). Tujuan dari percobaan ini adalah dapat melakukan pembuatan preparat dari bahan yang berasal dari penderita baik itu dengan media cair dan media padat.Dapat melakukan pengecatan bakteri khususnya dapat membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Mikroorganisme merupakan populasi makhluk hidup di alam yang jumlahnya sangat besar namun, semua mikroorganisme mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas,

sama halnya dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air. Pengecatan dan pewarnaan merupakan salah satu cara untuk mengamati sel-sel bakteri (Sutedjo, 1991). Bakteri-bakteri dari genus Mycobacterium dan spesies tertentu dari genus Nocardia mengandung sejumlah besar zat lipoidal (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel baktei tersebut tidak terwarnai oleh pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram. Kelompok bakteri tahan asam ini juga dapat hidup sebagai flora normal pada usus ternak unggas, dengan demikian sumber tersebut memudahkan dalam upaya mendapatkan isolat bekteri yang tahan asam (Cappuccino & Sherman, 1983) Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994). Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri (Sutedjo, 1991). Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-,

Kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan untuk keberlangsungan aktivitas sel vegetatif. pengeringan. 1993). Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Sporogenesis dan germinasi tidak dimaksudkan untuk reproduksi tetapi hanya mekanisme yang menjamin ketahanan sel dibawah kondisi lingkungan (Suriawiria. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti: fiksasi. COOHCOO. salah satunya adalah sel vegetatif yang aktif secara metabolik. sehingga selnya akan berwarna. begitu pula dengan bakteri. dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Sebagian besar dari genus anaerobik Clostridium dan Desulfotomaculum dan genus aerobik Bacillus adalah contoh-contoh organisme yang mempunyai kapasitas untuk pertahanan. pembekuan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat . peluntur warna. dan agent kimia lainnya sehingga diperlukan pewarnaan khusus secara mikrobiologi dan ketika kondisi lingkungan kembali normal. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagianbagian inti sel. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air. Sel–sel bakteri mempunyai muatan yang agak negatif bila pH lingkungannya mendekati netral. radiasi. intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo.CH3COO-. Perbedaan muatan inilah yang menyebabkan adanya ikatan atau gabungan antara zat warna dan sel bakteri (Schegel. tipe-tipe sel inaktif secara metabolik disebut spora. 1983) Kondisi yang terus memburuk membuta endospora dibebaskan dari degenerasi sel vegetatif dan menjadi sel independen yang disebut spora yang diakibatkan komposisi lapisan kimia spora bersifat tahan terhadap efek-efek merusak. Muatan negatif dari sel bakteri akan bergabung dengan muatan positif dari ion zat warna misalnya methylen blue. misalnya pemanasan berkelebihan. 1991). substrat. spora bebas kembali untuk aktif secara metabolik dan sel vegetatif berkurang resisten melalui germinasi. sel ini mempunyai kapasitas untuk mengalami sporogenesis dan memberikan reaksi untuk pembentukan struktur intraseluler baru (endospora) yang dilindungi oleh lapisan yang tidak dapat ditembus air (tahan penetrasi) dikenal sebagai jaket spora (spore coats) (Cappuccino & Sherman. 2005) dan sifat-sifat yang khas. biasanya pada saat kurangnya sumber nutrisi karbon.

1994). untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola. Tujuan dari percobaan ini adalah dapat melakukan pembuatan preparat dari bahan yang berasal dari penderita baik itu dengan media cair dan media padat. menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna. Pengecatan dan pewarnaan merupakan salah satu cara untuk mengamati sel-sel bakteri (Sutedjo. 1986. Volk & Wheeler. subtrat. Bakteri-bakteri dari genus Mycobacterium dan spesies tertentu dari genus Nocardia mengandung sejumlah besar zat lipoidal (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum . struktur dan sifat-sifat yang khas. Assani.fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jaweta. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air. Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam. serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Pelczar & Chan. yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. peluntur warna. 1991). Pewarnaan gram pertama kali mulai dikembangkan pada tahun 1884 oleh ahli histologi yaitu Cristian Gram (Cappuccino & Sherman. Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop. sama halnya dengan bakteri. 1994. seperti pewarnaan sederhana atau Garm (Ratna. intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. 1998). 1994). 1993. 1993. Dwidjoseputro. Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa. Mikroorganisme merupakan populasi makhluk hidup di alam yang jumlahnya sangat besar namun. memperjelas ukuran dan bentuk bakteri.Dapat melakukan pengecatan bakteri khususnya dapat membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Lim. Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi. semua mikroorganisme mempunyai morfologi. 1983). 1986. Dwidjoseputro.

dan lain-lain. Sel–sel bakteri mempunyai muatan yang agak negatif bila pH lingkungannya mendekati netral. maka disebut zat warna basa. substrat. Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. dengan demikian sumber tersebut memudahkan dalam upaya mendapatkan isolat bekteri yang tahan asam (Cappuccino & Sherman. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam. 1994). 1983) Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus. substrat.sehingga sel baktei tersebut tidak terwarnai oleh pewarnaan biasa. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri (Sutedjo. maka disebut zat warna asam. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo. safranin. 1990). COOHCOO. 1991). Contoh zat warna basa adalah methylen blue. Muatan negatif dari sel bakteri akan bergabung dengan muatan positif dari ion zat . Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagianbagian inti sel. Jika warna terdapat pada ion negatif. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti: fiksasi. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). netral red. intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. basil. Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-. CH3COO-. dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro. Kelompok bakteri tahan asam ini juga dapat hidup sebagai flora normal pada usus ternak unggas. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte. peluntur warna. 1991). seperti pewarnaan sederhana atau Gram. spirilum. peluntur warna . SO4-. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer.

salah satunya adalah sel vegetatif yang aktif secara metabolik. Sporogenesis dan germinasi tidak dimaksudkan untuk reproduksi tetapi hanya mekanisme yang menjamin ketahanan sel dibawah kondisi lingkungan (Suriawiria. radiasi. spora bebas kembali untuk aktif secara metabolik dan sel vegetatif berkurang resisten melalui germinasi.warna misalnya methylen blue. 1983) Kondisi yang terus memburuk membuta endospora dibebaskan dari degenerasi sel vegetatif dan menjadi sel independen yang disebut spora yang diakibatkan komposisi lapisan kimia spora bersifat tahan terhadap efek-efek merusak. Sebagian besar dari genus anaerobik Clostridium dan Desulfotomaculum dan genus aerobik Bacillus adalah contoh-contoh organisme yang mempunyai kapasitas untuk pertahanan. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). sel ini mempunyai kapasitas untuk mengalami sporogenesis dan memberikan reaksi untuk pembentukan struktur intraseluler baru (endospora) yang dilindungi oleh lapisan yang tidak dapat ditembus air (tahan penetrasi) dikenal sebagai jaket spora (spore coats) (Cappuccino & Sherman. . sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. 2005) Pengecatan Gram Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif. 1993). dan agent kimia lainnya sehingga diperlukan pewarnaan khusus secara mikrobiologi dan ketika kondisi lingkungan kembali normal. biasanya pada saat kurangnya sumber nutrisi karbon. pembekuan. Kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan untuk keberlangsungan aktivitas sel vegetatif. misalnya pemanasan berkelebihan. pengeringan. sehingga selnya akan berwarna. Perbedaan muatan inilah yang menyebabkan adanya ikatan atau gabungan antara zat warna dan sel bakteri (Schegel. tipe-tipe sel inaktif secara metabolik disebut spora.

sedangkan pada bakteri gram negatif tidak. Pada gram negatif lemak terekstraksi dari dinding sel sehingga pori membesar dan kompleks violet kristal-iodin keluar sel. Larutan violet kristal hucker (1 tetes) sebagai cat utama yang akan diikat oleh peptidoglikan bakteri. Namun setelah pencucian dengan etanol warna ungu yang diikat oleh bakteri gram negatif luntur. Sedangkan bakteri gram positif adalah Staphylococci. Ethanol 95% (secukupnya sampai cat utama luntur). Salmonella spp.Sifat Komposisi dinding sel Ketahanan terhadap penisilin Penghambatan warna basa Kebutuhan nutrien Ketahanan terhadap perlakuan fisik Gram positif Kandungan lipid rendah Lebih sensitif Lebih dihambat Kompleks Lebih tahan Gram Negatif Lipid tinggi Lebih tahan Kurang dihambat Relatif sederhana Kurang tahan Genus bakteri yang termasuk gram negatif adalah Enterobactericeae. sedangkan pada gram posotif dinding sel dehidrasi. E. Shigella spp. Bacillus. bakteri gram positif dan negatif samasama berwarna ungu. 2. sebagai bahan peluntur untukk melunturkan cat utama 4. Coli. Enterococci. Saat ditetesi iodin. Safranin (1 tetes) sebagai cat penutup untuk mewarnai kembali sel-sel yang sudah kehilangan warna cat utamanya Pada saat pemberian larutan cat kristal violet. Clostridium. pori berkerut dan permeabilitas rendah sehingga kompleks violet kristal-iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasm sehingga sel tetap biru/ungu. bakteri gram negatif mengikatnya sedangkan gram negatif melewatkannya. pada gram positif terbentuk kompleks iodin kristal violet sehingga sel berwarna biru. demikian juga gram negatif. . Streptococci. Saat penambahan safranin. Reagen-reagen yang digunakan dalam pengecatan gram adalah: 1. Iodin (1 tetes) sebagai mordan untuk mengintensifkan cat utama 3. Yersinia enterolitica.

a. memerlukan cara pembuatan preparat yang berbeda pula. pus (nanah). Berikut cara pembuatan preparat untuk berbagai sumber bahan. urin dan cairan serebrospinal. yang selanjutnya dapat diamati di bawah mikroskop. tentu harus disiapkan bahan (spesimen) yang akan diperiksa. Bahan :  Untuk bahan yang berbeda. yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Oleh karena itu. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Bahan langsung dari penderita . Pemeriksaan ini dapat dilakukan dengan cepat dan biaya murah serta. Dengan metode pengecatan Gram. Pembuatan preparat Alat dan bahan yang diperlukan adalah : Alat :    Ose atau kapas lidi steril Gelas obyek Lampu spiritus Bahan yang akan diperiksa. discharge telinga. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. dalam kasus tertentu. Spesimen yang akan dicat. Persiapan Sebelum dilakukan pengecatan Gram. Bahan yang akan diperiksa. dapat berasal dari : 1) langsung dari penderita dapat berupa sputum (dahak). dapat membantu dokter untuk memulai terapi suatu penyakit tanpa menunggu hasil kultur. bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua.Teknik Pengecatan Gram Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Pengertian preparat adalah sampel spesimen yang diletakkan atau dioleskan pada permukaan gelas obyek (object glass) atau slides. dengan atau tanpa pewarnaan.1. discharge hidung. Metode pengecatan tersebut pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. sebelumnya dibuat sediaan atau preparat (smear) terlebih dulu.

  Cat Gram Cat Gram yang digunakan terdiri dari 4 macam. Letakkan ose pada tempatnya. Komposisi dan fungsi masingmasing cat Gram. a. Selanjutnya dikerjakan sebagaimana membuat preparat dengan bahan berasal dari penderita. teteskan formalin 1 % tunggu selama 5 menit dan keringkan sekali lagi.8 gram Akuades : 80 ml . Bahan dari media pertumbuhan padat Ambil gelas obyek yang bersih dan steril. Setelah kering. campur dengan kaldu tadi sampai homogen kemudian tipiskan. Preparat yang sudah dibuat kemudian dikeringkan dan ditetesi formalin dengan cara seperti pembuatan preparat langsung. C dan D. Dengan ose steril. ambil satu koloni kuman dan ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter 1 – 2 cm. bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus. Setelah betul-betul kering. a. yaitu cat Gram A. jangan diletakkan di sembarang tempat (misal di atas meja) Jangan memegang mata (ujung) ose dengan tangan. Prinsip yang selalu harus diingat dan dipatuhi adalah :   Selalu mensterilkan ose. kemudian endapannya dibuat preparat. Usahakan tidak banyak bicara pada saat kerja. Bahan yang berupa endapan (pellet) hasil sentrifuge tersebut diambil dengan ose steril atau kapas lidi steril kemudian digoreskan pada gelas obyek setipis mungkin. adalah sebagai berikut : Cat Gram A Cat ini terdiri atas : Kristal violet : 2 gram Etil alkohol 95 : 20 ml Ammonium oksalat : 0.3. ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter kira-kira 1-2 cm. pada saat akan dipakai dan setelah dipakai. Panaskan gelas obyek di atas nyala api lampu spiritus sambil diayunkan secukupnya (jarak preparat sampai nyala api kira-kira 20 cm). Masingmasing mempunyai komposisi dan fungsi yang berbeda. B.Bahan disentrifuge terlebih dulu. bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus. Teteskan satu ose kaldu atau NaCl pada gelas obyek tersebut.2. preparat siap dicat. Ambil kuman dari biakan cair (yang sebelumnya telah diaduk secara steril) dengan menggunakan ose steril. sampai preparat tersebut kering. Bahan dari biakan cair Ambil gelas obyek yang bersih dan steril.

Akibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan :  Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu. Cat ini berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya. Cat Gram B merupakan cat Mordan. maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat). karena tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif. Cat Gram B Cat ini terdiri atas : Yodium : 1 gram Kalium Yodida : 2 gram Akuades : 300 ml Cat Gram B berwarna coklat. Ikatan antara cat dengan bakteri dilunturkan oleh alkohol. akan terjadi 2 kemungkinan :  Bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat Gram C Cat ini terdiri atas :   Aseton : 50 ml Etil alkohol 95 % : 50 ml Cat Gram C tidak berwarna. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. semua mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram A.25 gram Etil alkohol 95 % : 10 ml Akuades : 90 ml Cat ini berwarna merah. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. karena tidak tahan terhadap alkohol. . yaitu cat atau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme target. Cat Gram A merupakan cat primer yang akan memberi warna mikroorganisme target.  Bakteri akan tidak berwarna. Akibat pemberian cat Gram B. Bakteri yang bersifat demikian disebut bakteri Gram positif. Akibat pemberian cat Gram D.Cat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal violet). Cat Gram D Cat Gram D terdiri atas :    Safranin : 0. Pada saat diberi cat ini. karena telah jenuh mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu lagi mengikat cat Gram D.

Pori-pori pada dinding sel membesar. Dasar teori cat Gram Berdasarkan sifat terhadap cat Gram. B. Bakteri Gram positif mempunyai susunan dinding yang kompak dengan lapisan peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan. Terdapat dua teori yang dapat menjelaskan dasar perbedaan ini yaitu : Teori Salton Teori ini berdasarkan kadar lipid yang tinggi (20 %) di dalam dinding sel bakteri Gram negatif. Alat dan bahan yang diperlukan adalah : Alat :   Rak pengecatan Kran/sumber air yang mengalir Cat Gram A. dan kompleks kristal yodium tidak dapat keluar. CARA PENGECATAN GRAM Sebelum melakukan pengecatan Gram. sehingga zat warna yang sudah diserap mudah dilepaskan dan bakteri menjadi tidak berwarna. Zat lipid ini akan larut selama pencucian dengan alkohol. Permeabilitas dinding sel lebih besar sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks kristal yodium. Jangan sampai terlalu jauh sehingga menyulitkan dan memakan waktu. Teori permeabilitas dinding sel Teori ini berdasarkan tebal tipisnya lapisan peptidoglikan dalam dinding sel. siapkan alat dan bahan yang diperlukan. hanya 1 – 2 lapisan dan susunan dinding selnya tidak kompak. pori-pori mengecil sehingga kompleks kristal yodium yang berwarna ungu dipertahankan dan bakteri akan tetap berwarna ungu. Bakteri Gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding selnya akibat pencucian dengan alkohol. C dan D Preparat yang telah siap untuk dicat Bahan :   . Protein menjadi keras dan beku. Bakteri Gram negatif akan berwarna merah. Bakteri Gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis. Permeabilitas dinding sel kurang. Pastikan semua alat dan bahan yang diperlukan serta tempat untuk mencuci terletak di tempat yang terjangkau. bakteri dapat dikelompokkan menjadi 2 yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampu mengikat cat Gram D.

Terdapat lebih dari 50 spesies Mycobacterium. maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonore. sehingga tidak mampu mengikat warna kedua. begitu pula dengan bakteri. Bakteri tahan asam adalah bakteri yang pada pengecatan Ziehl-Neelsen (ZN) tetap mengikat warna pertama. Hal ini karena bakteri Gram positif dan negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika. Pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik.Kelebihan dan Kekurangan Pengecatan Gram Kelebihan : 1. Bakteri tersebut ketika diamati dibawah mikroskop tampak berwarna merah dengan warna dasar muda. Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna diagnostik. 2. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Pengecatan Bakteri Tahan Asam Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi. dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. antara lain banyak yang m erupakan saprofit. Misalnya pada pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana) uretral. struktur dan sifat-sifat yang khas. . memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air. Kekurangan : Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari 104 per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal. sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri terhadap antibiotik). Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis. tidak luntur oleh asam dan alkohol. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.

Mycobacterium tuberculosis merupakan bakteri tahan asam. dan kadang-kadang menyebabkan penyakit pada pasien dengan system imun yang normal. Sputum disiapkan (hati-hati. Pewarnaan kuman BTA dapat dilakukan dengan 3 macam pewarnaan yaitu Ziehl-Neelsen. bernyanyi atau bicara. berbentuk batang dan bersifat aerob obligat yang tumbuh lambat dengan waktu generasi 12 jam atau lebih. Bahan-bahan lain. dan usapan tenggorokan. Hasil yang didapat disamakan dengan penilaian IUATLD (International Union Against Tuberculose Lung Diseases) ϖ Pembuatan Sediaan Apus Sputum 1. Partikel mengandung kuman ini (berukuran diameter 1-5 µm) akan terhisap oleh orang sehat dan menimbulkan infeksi di saluran napas. cairan cerebrospinal. 2. Mycobacterium avium-intracellulare (kompleks M. Mycobacterium leprae menyebabkan lepra. misalnya nanah. Air kuras lambung. Air kemih pagi hari. Infeksi kuman ini paling sering disebarkan melalui udara (air borne. pertama kali keluar merupakan urin pancaran tengah. hindari droplet/percikan sputum). Terdapat beberapa macam bahan spesimen dalam pemeriksaan laboratorium tuberkulosis yaitu: • • • Sputum (dahak). harus benar-benar dahak bukan ingus juga bukan ludah. tertawa. adalah patogen ortunistik pada orang-orang dengan fungsi imun yang terganggu lainnya. Umumnya pewarnaan Ziehl-Neelsen dan Tan Thiam Hok yang sering digunakan. Penyebaran melalui udara berupa partikel-partikel percikan dahak yang mengandung kuman berasal dari penderita saat batuk. bersin. diambil sedikit dari bagian yang kental dan berwarna kuning kehijauan (purulen) menggunakan ose. . Sumber penularan adalah penderita TB yang dahaknya mengandung kuman TB hidup (BTA positif). Ose dipanaskan di atas api spirtus sampai merah dan didinginkan. umumnya anak-anak atau penderita yang tidak dapat mengeluarkan dahak. avian) dan mikobakteria apitik lain yang sering menginfeksi pasien AIDS. cairan pleura. Mycobacterium tuberculosis menyebabkan tuberculosis dan merupakan patogen yang berbahaya bagi manusia. droplets infection). Tan Thiam Hok (Kinyoun-Gabbett) dan Auramin–phenol fluorochrome.

Pewarnaan/Pengecetan Ziehl-Neelsen  1. 5. Sediaan yang telah kering dilakukan fiksasi 5 menit.3%. 7. 2. Warna merah dilarutkan pada sediaan sampai bersih dengan 3% alkohol-asam. 4. Pembacaan dan Penilaian Pembacaan 1. 2. 6. Dicari dengan adanya batang panjang atau pendek yang berwarna merah dengan latar belakang berwarna biru. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.3. BTA negatif : apabila dalam 100 LP atau 15 menit pengamatan tidak dijumpai adanya BTA. Sediaan diambil dengan pinset dan difiksasi selama 3-5 menit. Diamati di bawah mikroskop cahaya. Sediaan yang telah kering ditetesi minyak imersi. digenangi dengan carbol fuchsin 0. Ose yang telah digunakan dimasukkan ke dalam alkohol sambil digoyang-goyangkan sampai sisa-sisa sputum bersih. kemudian dibakar. Sediaan yang telah dibuat dikeringkan di udara terbuka sekitar 15-30 detik. Digenangi dengan larutan methylen blue selama 20-30 detik. 6. BTA positif : apabila dalam pengamatan dijumpai adanya BTA. Sambil difiksasi. 4. b. Sputum dioleskan secara merata (seperti obat nyamuk) pada objek glass (dengan ukuran 2x3 cm). Penilaian 1. 8. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. 2. dipanaskan di atas pembakar spirtus sampai menguap tetapi jangan sampai mendidih atau kering selama 5 menit. dilihat dengan mikroskop dengan pembesaran 100 kali. jangan sampai terkena matahari langsung. 3. . 5.

Kuman TBC masuk ke paru-paru melalui pernafasan aerosol (Girsang. tuberculosis. penyebab penyakit tuberculosis dan M.  Positif 1 : Ditemukan 10-90 BTA/100 LP.tuberculosis. dinamakan menurut kedua orang peneliti yang mengembangkannya pada akhir 1800-an. Hal ini mengakibatkan dinding sel tersebut relatif tidak permeable terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel-sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode-metode pewarna biasa. 2002). Bakteri-bakteri dari genus Mycobacterium dan spesies-spesies tertentu dari genus Nocardia mengandung sejumlah besar zat lipoid (berlemak) di dalam dinding-dinding selnya. pertama kali ditemukan oleh Robert Koch tahun 1882. Mycobacterium tuberculosis.BTA posiif apabila dibuat sediaan langsung dan diwarnai dengan Ziehl-Neelsen atau Kinyoun Gabbert maka dapat dilakukan penilaian sebagai berikut : Penilaian menurut IUATLD (International Union Against Tuberculose Lung Diseases)  Negatif : Tidak dijumpai adanya BTA.  Positif 3 : Ditemukan lebih dari 10 BTA / 1 LP.  Positif 2 : Ditemukan 1-10 BTA/1 LP. Menunjang diagnosis penyakit-penyakit tersebut. Kedua genus tersebut mengandung spesies-spesies yang patogenik bagi manusia. Teknik pewarnaan khusus itu disebut juga pewarnaan tahan asam. leprae penyebab penyakit lepra. yaitu pewarna Ziehl-Neelsen. Prosedur ini . Genus Mycobacterium dan mempunyai banyak spesies. Akibat sifat dinding selnya yang demikian itu maka untuk memenuhi tujuan tersebut harus digunakan pewarna khusus (Hadioetomo. Penyakit yang ditularkan oleh basil tersebut dikenal dengan sebutan TBC atau Tb-paru. bakteri penyebabnya harus dapat diisolasi dari spesimen si sakit dan dibuat tampak serta mudah dibedakan dengan bakteri-bakteri yang lain.  Positif : Ditemukan 1-9 BTA/100 LP. Prosedur pewarnaan yang umum digunakan pada masa kini merupakan hasil perbaikan teknik Ehrlich yang asli. 1993). mula-mula dikembangkan oleh Paul Ehrlich pada tahun 1882 ketika meneliti M. termasuk Ordo Actinomycetales Familia Mycobacteriaceae. Bakteri yang paling dikenal diantaranya adalah M.

Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. 1993). Bakteri tahan asam akan mempertahankan warna pertama yang diberikan. Sekali sitoplasma terwarnai. organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah.1% dituang sampai menutupi seluruh permukaan. .4x3 µm. pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Modifikasi teknik ini yang berkembang kemudian. dan biru metilena Loeffler sebagai pewarna tandingan. 1993).3% dituang pada seluruh permukaan sediaan. Mycobacterium tuberculosis memiliki ciri khas yaitu dalam jaringan. kemudian dipanaskan di atas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih atau kering selama 5 menit. pewarna yang mengandung bahan pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Hadioetomo. sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo.menggunakan pewarna utama dengan pemanasan. Setelah itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit. Hasil yang didapat adalah terdapatnya bakteri tahan asam. dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir. basil tuberkel merupakan batang ramping lurus berukuran kira-kira 0. artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). kelebihan larutan dibuang. Pewarnaan Ziehl-Neelsen akan menampakkan bakteri tahan asam yang berwarna merah dengan latar berwarna biru. larutan carbol fuchsin 0. Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel. Kondisi pewarnaan ini. Pewarnaan Ziehl Neelsen menurut Kurniawati 2005. perlakuan panas diganti dengan penggunaan pembasah (suatu deterjen untuk mengurangi tegangan permukaan lemak) untuk menjamin penetrasi. Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkoholaseton yang banyak digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal. Perbenihan buatan. maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat warna tersebut dengan erat. Larutan methylene blue 0.

Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri (Sutedjo. Granula metakhromatik sering ditemukan pada jenis-jenis kuman patogen tertentu dan berbentuk khas untuk kuman tersebut. mikobakteria dapat diperhatikan karena memberi fluoresensi kuning-jingga setelah diwarnai dengan zat warna fluorokrom (misalnya auramin. meskipun dibubuhi iodium. sitoplasma bakteri mungkin mengandung inklusi sel-kepingankepingan kecil material yang tidak menjadi bagian utuh struktur sel. Sekali diwarnai dengan zat warna basa. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna.granula glikogen serta granula lemak.terlihat bentuk kokus dan filamen. rodamin) (Annonimous. 1991). Disamping material nukleus. Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen dipergunakan untuk identifikasi bakteri tahan asam. Pengecatan Granula Kromatik Di dalam sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatikyang terdiri atas volutin. Basil tuberkel yang sebenarnya ditandai oleh sifat tahan asam misalnya 95% etil alkohol yang mengandung 3% asam hidroklorida (asam alkohol) dengan cepat akan menghilangkan warna bakteri kecuali mikobakteria. 2008). warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan alkohol. peluntur warna. intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Dwidjoseputro. granula metakhromatik terletak pada tempat-tempat khas di dalam sel kuman. Mikobakteria tidak dapat diklasifikasikan sebagai Gram positif atau Gram negatif. Di dalam sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatik yang tersebut di dalam sediaan mikroskopik. Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi. 1994). Butiran khusus ini yang . Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Pada spesies kuman tertentu. Sifat tahan asam ini tergantung pada integritas struktur selubung berlilin. Misalnya bila diwarnai sediaan kuman difteri dengan zat warna biru metilen. substrat.granula Babes-Ernst akan berwarna coklat tua. granula tersebut akan berwarna lain dari pada zat warna yang digunakan. Misalnya kuman difteri mempunyai granula metakhromatik karena bila diwarnai dalam sediaan. Dahak atau irisan jaringan.

• Dialiri dengan larutan yodium.granula glikogen serta granula lemak. • Cat dibuang. granula metakhromatik terletak pada tempat-tempat khas di dalam sel kuman. Sedangkan pada badan bakteri warna dari toluidin blue akan larut oleh air dan mengambil warna merah dari safranin. Metode Much Weis (Mycobacterium tuberculose). didiamkan selama 1 menit.granula Babes-Ernst akan berwarna coklat tua.rupanya bertindak sebagai sumber fosfat dan energi disebut butiran metakromat karena akan menyerap warna merah apabila diwarnai dengan biru metilen. granula tersebut akan berwarna lain dari pada zat warna yang digunakan. • Dicuci dengan air mengalir. Pewarnaan Granula dapat dilakukan dengan metode selain Neisser yaitu: 1. isapkan dengan tissue. Metode Albert’s 2. Butiran metakromat disebut juga kolektif volutin. Misalnya bila diwarnai sediaan kuman difteri dengan zat warna biru metilen. didiamkan selama 1menit. Cara Kerja: • Dibuat sediaan kuman dan fiksasi • Diwarnai dengan zat warna toluidin blue. Di dalam sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatik yang tersebut di dalam sediaan mikroskopik. Pewarnaan Granula Pada Bakteri Metode Albert & Christensen Di dalam sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatikyang terdiri atas volutin. keringkan di udara. PROSEDUR KERJA Metode : Albert & Christensen Tujuan : Untuk melihat granula bakteri Prinsip : Pada pengecatan dengan toluidine blue granula bakteri akan berwarna hitam (karena bersifat metakromatik) dan tidak akan larut oleh air sehingga pada pemberian safranin warna granula tetap hitam. • Dicuci dengan air mengalir • Ditambahkan zat warna Safranin. Misalnya kuman difteri mempunyai granula metakhromatik karena bila diwarnai dalam sediaan. Pada spesies kuman tertentu. . Granula metakhromatik sering ditemukan pada jenis-jenis kuman patogen tertentu dan berbentuk khas untuk kuman tersebut.

sitoplasma bakteri mungkin mengandung inklusi sel-kepingankepingan kecil material yang tidak menjadi bagian utuh struktur sel.Disamping material nukleus. didiamkan selama 1menit. • Cat dibuang. Butiran metakromat disebut juga kolektif volutin. Pewarnaan Granula dapat dilakukan dengan metode selain Neisser yaitu : 1. • Dicuci dengan air mengalir. Metode Albert’s 2. • Dicuci dengan air mengalir • Ditambahkan zat warna Safranin. Butiran khusus ini yang rupanya bertindak sebagai sumber fosfat dan energi disebut butiran metakromat karena akan menyerap warna merah apabila diwarnai dengan biru metilen. keringkan di udara. Metode Much Weis (Mycobacterium tuberculose). • Microbiology UJI KATALASE . isapkan dengan tissue. Pengecatan Endospora Related Posts : Food Technology. didiamkan selama 1 menit. Sedangkan pada badan bakteri warna dari toluidin blue akan larut oleh air dan mengambil warna merah dari safranin. PROSEDUR KERJA Metode : Albert & Christensen Tujuan : Untuk melihat granula bakteri Prinsip : Pada pengecatan dengan toluidine blue granula bakteri akan berwarna hitam (karena bersifat metakromatik) dan tidak akan larut oleh air sehingga pada pemberian safranin warna granula tetap hitam. Cara Kerja : • Dibuat sediaan kuman dan fiksasi • Diwarnai dengan zat warna toluidin blue. • Dialiri dengan larutan yodium.

Bakteri pembentuk spora lebih tahan terhadap desinfektan. panas. Endospora bakteri merupakan struktur yang tahan terhadap keadaan lingkungan yang ekstrim misalnya kering. kekeringan. Karena kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya. Clostridium adalah bakteri yang bersifat anaerobic. sinar. pemanasan. Oleh karena itu. tapi umumnya hamper sama. Setelah pewarnaan selanjutnya dengan safranin. Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarna biasa. misalnya malachite green. Struktur endospora mungkin bervariasi untuk setiap jenis spesies. maka endospora berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop. sel vegetatif mudah mengikat warna kembali. Kebanyakan bakteri pembentuk spora tinggal di tanah. Pengecatan Spora Bakteri penghasil spora tahan terhadap pewarnaan.• • • • • Pengecatan Endospora Media Pertumbuhan Mikroorganisme Pengecatan Gram Pengamatan Preparat Basah Factors Influencing The Effectiveness of Antimicrobial Agent (Faktor yang Mempengaruhi Keefektifan Antimikroba) Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri. setelah diwarnai oleh suatu warna. sel vegetatif dapat mengikat warna tetapi dapat luntur setelah dilunturkan karena ikatannya tidak kuat. sehingga harus digunakan pewarna spesifik dan yang biasa digunakan adalah malachite green [1]. Akhirnya warna bakteri spora adalah hijau. Bakteri yang tidak berspora cenderung tidak tahan pengecatan karena hanya memiliki sel vegetatif. Saat diwarnai oleh malachite. . sedangkan Bacillus pada umumnya bersifat aerobic. akan mengikat kuat senyawa pewarna. hasil pewarnaan akhir adalah merah muda dari safranin. namun spora bakteri dapat tersebar di mana saja [3]. Dua jenis bakteri yang dapat membentuk spora misalnya Clostridium dan Bacillus. Untuk pewarnaan selanjutnya. Oleh karena itu. dan kedinginan. dan keadaan asam [3]. cat tersebut (misalnya safranin) sel spora tidak dapat menerimanya karena sudah terikat dengan cat pertama.

memproduksi dinding sel yang sama sekali baru dan berubah bentuk. Selain itu.Metode Klein Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. endospora juga lebih tahan terhadap pewarnaan. sel vegetatif tidak dapat mengikat malachite sehingga saat dilunturkan. hanya memiliki sel vegetatif. proses ini diteliti secara mendalam untuk mempelajari peristiwa apa yang memicu perubahan enzim dan morfologi. warna malachite dapat hilang. Subtilis memiliki endospora. Eschericia coli setelah pengecatan akan berwarna merah muda dari safranin. B. jika selalu diadakan pemindahan piaraan ke medium yang baru. Sekali berhasil diwarnai. Apabila sel vegetatif membentuk endospora. Hal ini berarti B. a. Coli. Endospora dibuat irisan dapat terlihat terdiri atas pembungkus luar. sel ini membuat enzim baru.coli berarti tidak memiliki endospora.Contoh yang paling mudah adalah untuk spesies Bacilllus subtilis dan E. Sporulasi dapat dicegah. Karena E.coli hanya memiliki sel vegetatif. Saat diwarnai denga malachite. karena itu.Pengecatan Spora Bakteri . Kemudian saat diberi safranin. E. atau bahan kimia yang beracun. spora sangat sukar untuk melepaskan zat warna sehingga saat diberi warna dari safranin tetap berwarna hijau karena spora sudah mengikat malachite dan sulit mengikat warna yang diberikan kemudian. Endospora jauh lebih tahan terhadap pengaruh luar yang buruk dari pada bakteri biasa yaitu bakteri dalam bentuk vegetatif. sel vegetatif dapat mengikat warna kembali sehingga warna sel menjadi merah muda. Dengan kata lain sporulasi adalah bentuk sederhana diferensiasi sel. Subtilis akan berwarna hijau setelah pengecatan. Endospora lebih tahan lama meski dalam keadaan linghkungan ekstrim seperti kering. Spora lazim disebut endospora ialah karena spora itu dibentuk di dalam sel. sel vegetatif tidak tahan terhadap pewarnaan. korteks dan inti yang mengandung struktur nukleus. . Segera setelah keadaan luar baik lagi bagi mereka. panas. maka pecahlah bungkus spora dan tumbuhlah bakteri.

PROSEDUR KERJA Metode : Klein Tujuan : Untuk melihat spora bakteri Prinsip : Spora kuman mempunyai dinding yang tebal sehingga diperlukan pemanasan agar pori-pori membesar zat warna fuchsin dapat masuk.subterminal dan terminal. Spora biasanya diwarnai dengan hijau malachit atau carbol fuchsin. . sedangkan pada badan bakteri warna fuchsin dilepaskan dan mengambil warna biru dari methylen blue. Berdasarkan letaknya spora di dalam sel kuman. sehingga menyebabkan pembengkakan sel kuman. lonjong atau silindris. Cara Kerja : • Dibuat suspensi kuman. Ada spora yang garis tengahnya lebih besar dari garis tengah sel kuman. ditambah dengan carbol fuchsin sama banyak.Spora biasanya terlihat sebagai badan-badan refraktil intrasel dalam sediaan suspensi sel yang tidak diwarnai atau sebagai daerah tidak berwarna pada sel yang diwarnai secara biasa. dikenal letak sentral. dengan pencucian pori-pori kembali mengecil menyebabkan zat warna fuchsin tidak dapat dilepas walaupun dilunturkan dengan asam alkohol. • Dipanaskan selama 6 menit pada api kecil atau pada penangas air 80oc selama 10 menit. ini pula yang mencegah hilangnya zat warna spora setelah melalui pencucian dengan alkohol yang cukup lama untuk menghilangkan zat warna sel vegetatif. Dinding spora relatif tidak dapat ditembus. Sel vegetatif akhirnya dapat diberi zat warna kontras. Spora kuman dapat berbentuk bulat. • Dibuat sediaan dan dikeringkan.

Setelah perlakuan malachite green.Keringkan dan tambahkan safranin. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan spora secara umum.Tetesi dengan malachite green 5. • Diperiksa dibawah mikroskop. • Diwarnai dengan methylen blue selama 1 menit kemudian dicuci dan dikeringkan. endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses pemanasan.Siapkan waterbath yang dipanaskan.blogspot. Pengecatan Endospora Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya. diamkan selama 2 menit. Sumber : ripanimusyaffalab. tetapi sekali diwarnai.Biarkan gelas preparat dingin lalu cuci dengan air deionisasi. zat warna tersebut akan sulit hilang. Langkah-langkahnya sebagai berikut. 2. 6.com b. siapkan biakan bakteri dalam kondisi udara yang kering dan dengan pemanasan yang baik. Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora.Gunakan teknik aseptis.pindahkan gelas preparat dari waterbath dan ambil kertas tisu dari preparat. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya [2]. .• Dimasukkan kedalam H2SO4 1% selama 2 detik • Dimasukkan kedalam alkohol sehingga tidak ada lagi warna merah mengalir. 3.Tutup gelas preparat dengan selembar tisu dan letakkan pada rak di atas waterbath. • Sediaan dicuci dengan air.Lakukan pengamatan preparat dengan mikroskop dengan bantuan minyak emersi. 8. 7. 9. Interpretasi hasil : Spora : warna merah dan Badan bakteri : warna biru. 1. biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. 4. 10.Cuci sisa safranin dengan air deionisasi dan keringkan noda.Panaskan gelas preparat selama 5 menit.

• Diperiksa dibawah mikroskop. campurkan dengan tinta cina sampai homogen • Dengan ujung objek glass yang lain. Ukuran kapsul berbedabeda menurut jenis bakterinya dan juga dapat berbeda diantara jalur-jalur yang berlainan dalam satu spesies. Simpai biasanya diperlihatkan dengan cara pewarnaan negatif atau modifikasi dari cara itu. . Interpretasi hasil : Kapsul: transparan dan Badan bakteri : warna merah. perlindungan terhadap fagositosis ( baik dalam tubuh inang maupun dialam bebas ) atau perlindungan terhadap dehidrasi.. tetapi produksinya sangat dipengaruhi oleh komposisi medium tempat ditumbuhkannya sel-sel yang bersangkutan. sehingga pada pemberian cat tinta cina dan calbol fuchsin terlihat bulatan terang atau transparan dengan latar belakang gelap dan badan kuman berwarna merah dari fuchsin. Garam tembaga memberi pula warna pada latar belakang. polimer gula amino (misalnya asam hialuronat pada Staphylococcus piogenik). Salah satu pewarnaan simpai (kapsul) ini ( metode Welch) meliputi pemberian larutan kristal ungu panas disusul kemudian dengan pencucian dengan larutan tembaga sulfat. Tembaga sulfat ini digunakan untuk menghilangkan zat warna berlebihan karena pencucian biasa dengan air akan melarutkan simpai. Bila bahan berlendir tersebut kompak dan tampak sebagai suatu bentuk yang pasti ( bundar/lonjong) maka disebut kapsul. dibiarkan kering dan fiksasi • Ditambahkan carbol fuchsin 1/10 selama 1 menit • Sisa cat dibuang dan dikeringkan. Komposisi kimiawi kapsul ada yang berupa glukosa ( misalnya dektrosa pada leokonostok mesendteroides). Pada beberapa jenis bakteri adanya kapsul sebagai petunjuk virulensi. tetapi bila tidak teratur bentuknya dan menempelnya pada sel kurang erat maka disebut selaput lendir. sehingga sel dan latar belakang akan tampak biru tua dan simpai berwarna biru yang lebih muda. tapi dapat berfungsi sebagai makanan cadangan. Semua kapsul bakteri tampaknya dapat larut dalam air.Pewarnaan Kapsul Beberapa jenis bakteri dan amoeba hijau-biru mengeluarkan bahan-bahan yang amat berlendir dan lengket pada permukaan selnya. melengkungi dinding sel. polipeptida (misalnya polimer asam D-glutamat pada Bacillus antraksis) atau kompleks polisakarida protein ( misalnya B disentri). PROSEDUR KERJA Metode : Burry Gins Tujuan : Untuk melihat kapsul bakteri Prinsip : Kapsul pada kuman tidak dapat mengikat zat warna. Kemampuan menghasilkan kapsul merupakan sifat genetis. Cara Kerja : • Persiapkan 2 objek glass yang bersih dan bebas lemak • Letakkan 1 ose tinta cina pada bagian pinggir objek glass • Diambil 1 ose suspensi bakteri. Kapsul dan lendir tidaklah esensial bagi kehidupan sel. buat hapusan. Komposisi medium juga dapat mempengaruhi ukuran kapsul.

sebagai contoh. berarti juga harus menghadapi stress oksidatif. dan oxidative phosphorylation. Khamir. Aerob fakultatif dapat menggunakan oksigen tetapi dapat juga menghasilkan energi secara anaerobik. Hal ini disebabkan terdapat membran yang harus dilewati oleh transport aktif. Angka ini 19 kali lebih besar daripada yang dihasilkan reaksi anaerobik. Aerob. C6H12O6 + 6 O2 + 38 ADP + 38 fosfat → 6 CO2 + 6 H2O + 38 ATP Energi yang dilepaskan pada reaksi ini sebesar 2880 kJ per mol.Organisme aerobik Organisme aerobik atau aerob adalah organisme yang melakukan metabolisme dengan bantuan oksigen. • • Aerob obligat membutuhkan oksigen untuk melakukan respirasi sel aerobik. Organisme eukariotik (semua kecuali bakteri) hanya memperoleh 36 ATP yang diregenerasi dari ADP dalam proses ini. siklus Krebs. sebagian besar fungi. Organisme aerotoleran dapat hidup walaupun terdapat oksigen di sekitarnya. adalah aerob fakultatif. Persamaan ini merupakan rangkuman dari apa yang sesungguhnya terjadi dalam tiga seri reaksi biokimia: glikolisis. Mikroaerofil adalah organisme yang bisa menggunakan oksigen tetapi dalam konsentrasi yang sangat kecil (mikromolar). Sel-sel pada manusia juga merupakan aerob fakultatif: mereka akan melakukan fermentasi asam laktat jika tidak mendapatkan oksigen. Akan tetapi. dalam proses dikenal sebagai respirasi sel. . walaupun menguntungkan dalam memperoleh energi. Sebagian besar organisme anaerobik adalah bakteri. hal ini tidak dapat berlangsung terusmenerus sehingga manusia termasuk dalam aerob obligat. Hampir semua hewan. tetapi mereka tetap anaerobik karena mereka tidak menggunakan oksigen sebagai terminal electron acceptor (akseptor elektron terminal). Menjadi aerob obligat. dan beberapa bakteri adalah aerob obligat. • • Contoh yang dapat diberikan adalah oksidasi glukosa (monosakarida) dalam respirasi aerobik. yang disimpan dalam regenerasi 38 ATP dari 38 ADP per glukosa. menggunakan oksigen untuk mengoksidasi substrat (sebagai contoh gula dan lemak) untuk memperoleh energi.

Anaerob fakultatif dapat menggunakan oksigen jika tersedia. • • • Anaerob obligat akan mati bila terpapar pada oksigen dengan kadar atmosfer. Mikroaerofil adalah organisme yang dapat menggunakan oksigen. Ini hanya 5% energi per molekul gula daripada yang dapat dihasilkan oleh reaksi aerobik. tetapi hanya pada konsentrasi yang rendah (rentang mikromolar rendah). Jika terdapat oksigen.Contoh dari bakteri aerob obligat adalah: Nocardia (Gram positif). Organisme Anaerobic Organisme anaerobik atau anaerob adalah setiap organisme yang tidak memerlukan oksigen untuk tumbuh. Mycobacterium tuberculosis (Acid Fast). Terdapat beberapa persamaan kimia untuk reaksi fermentasi anaerobik. tanpa oksigen beberapa diantaranya berfermentasi. Organisme anaerobik fermentatif biasanya menggunakan jalur fermentasi asam laktat: C6H12O6 + 2 ADP + 2 fosfat → 2 asam laktat + 2 ATP Energi yang dilepaskan pada persamaan ini sekitar 150 kJ per mol. and Bacillus (Gram positif).Tumbuhan dan jamur (contohnya ragi) . yang disimpan dalam regenerasi dua ATP dari ADP per glukosa. Mikroaerofil melakukan respirasi aerobik. Nanaerob adalah organisme yang tidak dapat tumbuh bila terdapat konsentrasi mikromolar oksigen. Anaerob obligat dapat menggunakan fermentasi atau respirasi anaerobik. anaerob fakultatif menggunakan respirasi aerobik. Pseudomonas aeruginosa (Gram negatif). pertumbuhannya dihambat oleh level oksigen yang normal (sekitar 200 mikromolar). beberapa lagi menggunakan respirasi anaerobik. tetapi dapat tumbuh dan diuntungkan pada konsentrasi nanomolar oksigen. tetapi mereka tetap anaerobik karena mereka tidak menggunakan oksigen sebagai terminal electron acceptor (akseptor elektron terminal). dan beberapa diantaranya dapat juga melakukan respirasi anaerobik. Organisme aerotoleran hanya dapat berfermentasi. Organisme aerotoleran dapat hidup walaupun terdapat oksigen di sekitarnya.

asetogenesis atau metanogenesis. fermentasi asam butirat. fermentasi pelarut. Bakteri anaerobik dan archaea menggunakan jalur ini dan beberapa jalur lainnya dalam melakukan fermentasi seperti: fermentasi asam propionat. fermentasi butanediol.biasanya melakukan fermentasi alkohol (etanol) ketika oksigen terbatas melalui reaksi berikut: C6H12O6 + 2 ADP + 2 fosfat → 2 C2H5OH + 2 CO2 + 2 ATP Energi yang dilepaskan sekitar 180 kJ per mol. .Anaerob obligat akan mati bila terdapat oksigen karena tidak adanya enzim superoksida dismutase dan katalase yang dapat mengubah superoksida berbahaya yang timbul dalam selnya karena adanya oksigen.Beberapa bakteri anaerobik menghasilkan toksin (racun) seperti toksin tetanus atau botulinum yang sangat berbahaya bagi organisme yang lebih besar. yang disimpan dalam regenerasi dua ATP dari ADP per glukosa. fermentasi asam campuran. fermentasi Stickland. termasuk manusia.