PEMBUATAN PREPARAT DAN PENGECATANNYA

Mikroorganisme yang ada dialam ini mempunyai morfologi, struktur khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jaweta, 1986; Dwidjoseputro, 1994; Assani, 1994). Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Pelczar & Chan, 1986; Volk & Wheeler, 1993; Lim, 1998). Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, subtrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pewarnaan gram pertama kali mulai dikembangkan pada tahun 1884 oleh ahli histologi yaitu Cristian Gram (Cappuccino & Sherman, 1983). Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Garm (Ratna, 1993; Dwidjoseputro, 1994). Tujuan dari percobaan ini adalah dapat melakukan pembuatan preparat dari bahan yang berasal dari penderita baik itu dengan media cair dan media padat.Dapat melakukan pengecatan bakteri khususnya dapat membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Mikroorganisme merupakan populasi makhluk hidup di alam yang jumlahnya sangat besar namun, semua mikroorganisme mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas,

sama halnya dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air. Pengecatan dan pewarnaan merupakan salah satu cara untuk mengamati sel-sel bakteri (Sutedjo, 1991). Bakteri-bakteri dari genus Mycobacterium dan spesies tertentu dari genus Nocardia mengandung sejumlah besar zat lipoidal (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel baktei tersebut tidak terwarnai oleh pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram. Kelompok bakteri tahan asam ini juga dapat hidup sebagai flora normal pada usus ternak unggas, dengan demikian sumber tersebut memudahkan dalam upaya mendapatkan isolat bekteri yang tahan asam (Cappuccino & Sherman, 1983) Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah pewarna sederhana dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994). Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri (Sutedjo, 1991). Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-,

CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagianbagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti: fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo, 1991). Selsel bakteri mempunyai muatan yang agak negatif bila pH lingkungannya mendekati netral. Muatan negatif dari sel bakteri akan bergabung dengan muatan positif dari ion zat warna misalnya methylen blue, sehingga selnya akan berwarna. Perbedaan muatan inilah yang menyebabkan adanya ikatan atau gabungan antara zat warna dan sel bakteri (Schegel, 1993). Sebagian besar dari genus anaerobik Clostridium dan Desulfotomaculum dan genus aerobik Bacillus adalah contoh-contoh organisme yang mempunyai kapasitas untuk pertahanan, salah satunya adalah sel vegetatif yang aktif secara metabolik, tipe-tipe sel inaktif secara metabolik disebut spora. Kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan untuk keberlangsungan aktivitas sel vegetatif, biasanya pada saat kurangnya sumber nutrisi karbon, sel ini mempunyai kapasitas untuk mengalami sporogenesis dan memberikan reaksi untuk pembentukan struktur intraseluler baru (endospora) yang dilindungi oleh lapisan yang tidak dapat ditembus air (tahan penetrasi) dikenal sebagai jaket spora (spore coats) (Cappuccino & Sherman, 1983) Kondisi yang terus memburuk membuta endospora dibebaskan dari degenerasi sel vegetatif dan menjadi sel independen yang disebut spora yang diakibatkan komposisi lapisan kimia spora bersifat tahan terhadap efek-efek merusak, misalnya pemanasan berkelebihan, pembekuan, radiasi, pengeringan, dan agent kimia lainnya sehingga diperlukan pewarnaan khusus secara mikrobiologi dan ketika kondisi lingkungan kembali normal, spora bebas kembali untuk aktif secara metabolik dan sel vegetatif berkurang resisten melalui germinasi. Sporogenesis dan germinasi tidak dimaksudkan untuk reproduksi tetapi hanya mekanisme yang menjamin ketahanan sel dibawah kondisi lingkungan (Suriawiria, 2005) dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat

fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jaweta, 1986; Dwidjoseputro, 1994; Assani, 1994). Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Pelczar & Chan, 1986; Volk & Wheeler, 1993; Lim, 1998). Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, subtrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pewarnaan gram pertama kali mulai dikembangkan pada tahun 1884 oleh ahli histologi yaitu Cristian Gram (Cappuccino & Sherman, 1983). Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Garm (Ratna, 1993; Dwidjoseputro, 1994). Tujuan dari percobaan ini adalah dapat melakukan pembuatan preparat dari bahan yang berasal dari penderita baik itu dengan media cair dan media padat.Dapat melakukan pengecatan bakteri khususnya dapat membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Mikroorganisme merupakan populasi makhluk hidup di alam yang jumlahnya sangat besar namun, semua mikroorganisme mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, sama halnya dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air. Pengecatan dan pewarnaan merupakan salah satu cara untuk mengamati sel-sel bakteri (Sutedjo, 1991). Bakteri-bakteri dari genus Mycobacterium dan spesies tertentu dari genus Nocardia mengandung sejumlah besar zat lipoidal (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum

sehingga sel baktei tersebut tidak terwarnai oleh pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram. Kelompok bakteri tahan asam ini juga dapat hidup sebagai flora normal pada usus ternak unggas, dengan demikian sumber tersebut memudahkan dalam upaya mendapatkan isolat bekteri yang tahan asam (Cappuccino & Sherman, 1983) Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah pewarna sederhana dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994). Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri (Sutedjo, 1991). Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagianbagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti: fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo, 1991). Selsel bakteri mempunyai muatan yang agak negatif bila pH lingkungannya mendekati netral. Muatan negatif dari sel bakteri akan bergabung dengan muatan positif dari ion zat

warna misalnya methylen blue, sehingga selnya akan berwarna. Perbedaan muatan inilah yang menyebabkan adanya ikatan atau gabungan antara zat warna dan sel bakteri (Schegel, 1993). Sebagian besar dari genus anaerobik Clostridium dan Desulfotomaculum dan genus aerobik Bacillus adalah contoh-contoh organisme yang mempunyai kapasitas untuk pertahanan, salah satunya adalah sel vegetatif yang aktif secara metabolik, tipe-tipe sel inaktif secara metabolik disebut spora. Kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan untuk keberlangsungan aktivitas sel vegetatif, biasanya pada saat kurangnya sumber nutrisi karbon, sel ini mempunyai kapasitas untuk mengalami sporogenesis dan memberikan reaksi untuk pembentukan struktur intraseluler baru (endospora) yang dilindungi oleh lapisan yang tidak dapat ditembus air (tahan penetrasi) dikenal sebagai jaket spora (spore coats) (Cappuccino & Sherman, 1983) Kondisi yang terus memburuk membuta endospora dibebaskan dari degenerasi sel vegetatif dan menjadi sel independen yang disebut spora yang diakibatkan komposisi lapisan kimia spora bersifat tahan terhadap efek-efek merusak, misalnya pemanasan berkelebihan, pembekuan, radiasi, pengeringan, dan agent kimia lainnya sehingga diperlukan pewarnaan khusus secara mikrobiologi dan ketika kondisi lingkungan kembali normal, spora bebas kembali untuk aktif secara metabolik dan sel vegetatif berkurang resisten melalui germinasi. Sporogenesis dan germinasi tidak dimaksudkan untuk reproduksi tetapi hanya mekanisme yang menjamin ketahanan sel dibawah kondisi lingkungan (Suriawiria, 2005)

Pengecatan Gram
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Sifat Komposisi dinding sel Ketahanan terhadap penisilin Penghambatan warna basa Kebutuhan nutrien Ketahanan terhadap perlakuan fisik

Gram positif Kandungan lipid rendah Lebih sensitif Lebih dihambat Kompleks Lebih tahan

Gram Negatif Lipid tinggi Lebih tahan Kurang dihambat Relatif sederhana Kurang tahan

Genus bakteri yang termasuk gram negatif adalah Enterobactericeae, Salmonella spp, Shigella spp, E. Coli, Yersinia enterolitica. Sedangkan bakteri gram positif adalah Staphylococci, Streptococci, Enterococci, Clostridium, Bacillus. Reagen-reagen yang digunakan dalam pengecatan gram adalah: 1. Larutan violet kristal hucker (1 tetes) sebagai cat utama yang akan diikat oleh peptidoglikan bakteri. 2. Iodin (1 tetes) sebagai mordan untuk mengintensifkan cat utama 3. Ethanol 95% (secukupnya sampai cat utama luntur), sebagai bahan peluntur untukk melunturkan cat utama 4. Safranin (1 tetes) sebagai cat penutup untuk mewarnai kembali sel-sel yang sudah kehilangan warna cat utamanya Pada saat pemberian larutan cat kristal violet, bakteri gram positif dan negatif samasama berwarna ungu. Saat ditetesi iodin, pada gram positif terbentuk kompleks iodin kristal violet sehingga sel berwarna biru, demikian juga gram negatif. Namun setelah pencucian dengan etanol warna ungu yang diikat oleh bakteri gram negatif luntur, sedangkan pada bakteri gram negatif tidak. Pada gram negatif lemak terekstraksi dari dinding sel sehingga pori membesar dan kompleks violet kristal-iodin keluar sel, sedangkan pada gram posotif dinding sel dehidrasi, pori berkerut dan permeabilitas rendah sehingga kompleks violet kristal-iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasm sehingga sel tetap biru/ungu. Saat penambahan safranin, bakteri gram negatif mengikatnya sedangkan gram negatif melewatkannya.

Teknik Pengecatan Gram

Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Pemeriksaan ini dapat dilakukan dengan cepat dan biaya murah serta, dalam kasus tertentu, dapat membantu dokter untuk memulai terapi suatu penyakit tanpa menunggu hasil kultur. Metode pengecatan tersebut pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode pengecatan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. Persiapan Sebelum dilakukan pengecatan Gram, tentu harus disiapkan bahan (spesimen) yang akan diperiksa. Bahan yang akan diperiksa, dapat berasal dari : 1) langsung dari penderita dapat berupa sputum (dahak), pus (nanah), discharge telinga, discharge hidung, urin dan cairan serebrospinal. Spesimen yang akan dicat, sebelumnya dibuat sediaan atau preparat (smear) terlebih dulu. Pengertian preparat adalah sampel spesimen yang diletakkan atau dioleskan pada permukaan gelas obyek (object glass) atau slides, dengan atau tanpa pewarnaan, yang selanjutnya dapat diamati di bawah mikroskop. Pembuatan preparat Alat dan bahan yang diperlukan adalah : Alat :

Ose atau kapas lidi steril Gelas obyek Lampu spiritus Bahan yang akan diperiksa.

Bahan :

Untuk bahan yang berbeda, memerlukan cara pembuatan preparat yang berbeda pula. Berikut cara pembuatan preparat untuk berbagai sumber bahan. a.1. Bahan langsung dari penderita

Bahan disentrifuge terlebih dulu, kemudian endapannya dibuat preparat. Bahan yang berupa endapan (pellet) hasil sentrifuge tersebut diambil dengan ose steril atau kapas lidi steril kemudian digoreskan pada gelas obyek setipis mungkin. Panaskan gelas obyek di atas nyala api lampu spiritus sambil diayunkan secukupnya (jarak preparat sampai nyala api kira-kira 20 cm), sampai preparat tersebut kering. Setelah kering, teteskan formalin 1 % tunggu selama 5 menit dan keringkan sekali lagi. Setelah betul-betul kering, preparat siap dicat. a.2. Bahan dari biakan cair Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus. Ambil kuman dari biakan cair (yang sebelumnya telah diaduk secara steril) dengan menggunakan ose steril, ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter kira-kira 1-2 cm. Preparat yang sudah dibuat kemudian dikeringkan dan ditetesi formalin dengan cara seperti pembuatan preparat langsung. a.3. Bahan dari media pertumbuhan padat Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus. Teteskan satu ose kaldu atau NaCl pada gelas obyek tersebut. Dengan ose steril, ambil satu koloni kuman dan ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter 1 2 cm, campur dengan kaldu tadi sampai homogen kemudian tipiskan. Selanjutnya dikerjakan sebagaimana membuat preparat dengan bahan berasal dari penderita. Prinsip yang selalu harus diingat dan dipatuhi adalah :

Selalu mensterilkan ose, pada saat akan dipakai dan setelah dipakai. Letakkan ose pada tempatnya, jangan diletakkan di sembarang tempat (misal di atas meja) Jangan memegang mata (ujung) ose dengan tangan. Usahakan tidak banyak bicara pada saat kerja.

Cat Gram Cat Gram yang digunakan terdiri dari 4 macam, yaitu cat Gram A, B, C dan D. Masingmasing mempunyai komposisi dan fungsi yang berbeda. Komposisi dan fungsi masingmasing cat Gram, adalah sebagai berikut : Cat Gram A Cat ini terdiri atas : Kristal violet : 2 gram Etil alkohol 95 : 20 ml Ammonium oksalat : 0,8 gram Akuades : 80 ml

Cat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal violet). Cat Gram A merupakan cat primer yang akan memberi warna mikroorganisme target. Pada saat diberi cat ini, semua mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram A. Cat Gram B Cat ini terdiri atas : Yodium : 1 gram Kalium Yodida : 2 gram Akuades : 300 ml Cat Gram B berwarna coklat. Cat Gram B merupakan cat Mordan, yaitu cat atau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme target. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat). Cat Gram C Cat ini terdiri atas : Aseton : 50 ml Etil alkohol 95 % : 50 ml

Cat Gram C tidak berwarna. Cat ini berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya. Akibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan : Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian disebut bakteri Gram positif. Bakteri akan tidak berwarna, karena tidak tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif. Cat Gram D Cat Gram D terdiri atas : Safranin : 0,25 gram Etil alkohol 95 % : 10 ml Akuades : 90 ml

Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Akibat pemberian cat Gram D, akan terjadi 2 kemungkinan :

Bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu, karena telah jenuh mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu lagi mengikat cat Gram D.

Bakteri Gram negatif akan berwarna merah, karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampu mengikat cat Gram D.

Dasar teori cat Gram Berdasarkan sifat terhadap cat Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi 2 yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Terdapat dua teori yang dapat menjelaskan dasar perbedaan ini yaitu : Teori Salton Teori ini berdasarkan kadar lipid yang tinggi (20 %) di dalam dinding sel bakteri Gram negatif. Zat lipid ini akan larut selama pencucian dengan alkohol. Pori-pori pada dinding sel membesar, sehingga zat warna yang sudah diserap mudah dilepaskan dan bakteri menjadi tidak berwarna. Bakteri Gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding selnya akibat pencucian dengan alkohol. Protein menjadi keras dan beku, pori-pori mengecil sehingga kompleks kristal yodium yang berwarna ungu dipertahankan dan bakteri akan tetap berwarna ungu. Teori permeabilitas dinding sel Teori ini berdasarkan tebal tipisnya lapisan peptidoglikan dalam dinding sel. Bakteri Gram positif mempunyai susunan dinding yang kompak dengan lapisan peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan. Permeabilitas dinding sel kurang, dan kompleks kristal yodium tidak dapat keluar. Bakteri Gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis, hanya 1 2 lapisan dan susunan dinding selnya tidak kompak. Permeabilitas dinding sel lebih besar sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks kristal yodium. CARA PENGECATAN GRAM Sebelum melakukan pengecatan Gram, siapkan alat dan bahan yang diperlukan. Pastikan semua alat dan bahan yang diperlukan serta tempat untuk mencuci terletak di tempat yang terjangkau. Jangan sampai terlalu jauh sehingga menyulitkan dan memakan waktu. Alat dan bahan yang diperlukan adalah : Alat :

Rak pengecatan Kran/sumber air yang mengalir Cat Gram A, B, C dan D Preparat yang telah siap untuk dicat

Bahan :

Kelebihan dan Kekurangan Pengecatan Gram

Kelebihan : 1. Pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri terhadap antibiotik). Hal ini karena bakteri Gram positif dan negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika. 2. Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna diagnostik. Misalnya pada pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana) uretral, maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonore. Kekurangan : Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari 104 per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis.

Pengecatan Bakteri Tahan Asam

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Bakteri tahan asam adalah bakteri yang pada pengecatan Ziehl-Neelsen (ZN) tetap mengikat warna pertama, tidak luntur oleh asam dan alkohol, sehingga tidak mampu mengikat warna kedua. Bakteri tersebut ketika diamati dibawah mikroskop tampak berwarna merah dengan warna dasar muda. Terdapat lebih dari 50 spesies Mycobacterium, antara lain banyak yang m erupakan saprofit.

Mycobacterium tuberculosis merupakan bakteri tahan asam, berbentuk batang dan bersifat aerob obligat yang tumbuh lambat dengan waktu generasi 12 jam atau lebih. Mycobacterium tuberculosis menyebabkan tuberculosis dan merupakan patogen yang berbahaya bagi manusia. Mycobacterium leprae menyebabkan lepra. Mycobacterium avium-intracellulare (kompleks M. avian) dan mikobakteria apitik lain yang sering menginfeksi pasien AIDS, adalah patogen ortunistik pada orang-orang dengan fungsi imun yang terganggu lainnya, dan kadang-kadang menyebabkan penyakit pada pasien dengan system imun yang normal. Sumber penularan adalah penderita TB yang dahaknya mengandung kuman TB hidup (BTA positif). Infeksi kuman ini paling sering disebarkan melalui udara (air borne, droplets infection). Penyebaran melalui udara berupa partikel-partikel percikan dahak yang mengandung kuman berasal dari penderita saat batuk, bersin, tertawa, bernyanyi atau bicara. Partikel mengandung kuman ini (berukuran diameter 1-5 m) akan terhisap oleh orang sehat dan menimbulkan infeksi di saluran napas. Terdapat beberapa macam bahan spesimen dalam pemeriksaan laboratorium tuberkulosis yaitu: Sputum (dahak), harus benar-benar dahak bukan ingus juga bukan ludah. Air kemih pagi hari, pertama kali keluar merupakan urin pancaran tengah. Air kuras lambung, umumnya anak-anak atau penderita yang tidak dapat mengeluarkan dahak. Bahan-bahan lain, misalnya nanah, cairan cerebrospinal, cairan pleura, dan usapan tenggorokan. Pewarnaan kuman BTA dapat dilakukan dengan 3 macam pewarnaan yaitu Ziehl-Neelsen, Tan Thiam Hok (Kinyoun-Gabbett) dan Auraminphenol fluorochrome. Umumnya pewarnaan Ziehl-Neelsen dan Tan Thiam Hok yang sering digunakan. Hasil yang didapat disamakan dengan penilaian IUATLD (International Union Against Tuberculose Lung Diseases) Pembuatan Sediaan Apus Sputum 1. Ose dipanaskan di atas api spirtus sampai merah dan didinginkan. 2. Sputum disiapkan (hati-hati, hindari droplet/percikan sputum), diambil sedikit dari bagian yang kental dan berwarna kuning kehijauan (purulen) menggunakan ose.

3. Sputum dioleskan secara merata (seperti obat nyamuk) pada objek glass (dengan ukuran 2x3 cm). 4. Ose yang telah digunakan dimasukkan ke dalam alkohol sambil digoyang-goyangkan sampai sisa-sisa sputum bersih, kemudian dibakar. 5. Sediaan yang telah dibuat dikeringkan di udara terbuka sekitar 15-30 detik, jangan sampai terkena matahari langsung. 6. Sediaan diambil dengan pinset dan difiksasi selama 3-5 menit.

Pewarnaan/Pengecetan Ziehl-Neelsen
1. Sediaan yang telah kering dilakukan fiksasi 5 menit. 2. Sambil difiksasi, digenangi dengan carbol fuchsin 0,3%, dipanaskan di atas pembakar spirtus sampai menguap tetapi jangan sampai mendidih atau kering selama 5 menit. 3. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. 4. Warna merah dilarutkan pada sediaan sampai bersih dengan 3% alkohol-asam. 5. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. 6. Digenangi dengan larutan methylen blue selama 20-30 detik. 7. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. 8. Diamati di bawah mikroskop cahaya. b. Pembacaan dan Penilaian Pembacaan 1. Sediaan yang telah kering ditetesi minyak imersi, dilihat dengan mikroskop dengan pembesaran 100 kali. 2. Dicari dengan adanya batang panjang atau pendek yang berwarna merah dengan latar belakang berwarna biru.

Penilaian 1. BTA negatif : apabila dalam 100 LP atau 15 menit pengamatan tidak dijumpai adanya BTA. 2. BTA positif : apabila dalam pengamatan dijumpai adanya BTA.

BTA posiif apabila dibuat sediaan langsung dan diwarnai dengan Ziehl-Neelsen atau Kinyoun Gabbert maka dapat dilakukan penilaian sebagai berikut : Penilaian menurut IUATLD (International Union Against Tuberculose Lung Diseases) Negatif : Tidak dijumpai adanya BTA. Positif : Ditemukan 1-9 BTA/100 LP. Positif 1 : Ditemukan 10-90 BTA/100 LP. Positif 2 : Ditemukan 1-10 BTA/1 LP. Positif 3 : Ditemukan lebih dari 10 BTA / 1 LP. Mycobacterium tuberculosis, pertama kali ditemukan oleh Robert Koch tahun 1882, termasuk Ordo Actinomycetales Familia Mycobacteriaceae, Genus Mycobacterium dan mempunyai banyak spesies. Penyakit yang ditularkan oleh basil tersebut dikenal dengan sebutan TBC atau Tb-paru. Kuman TBC masuk ke paru-paru melalui pernafasan aerosol (Girsang, 2002). Bakteri-bakteri dari genus Mycobacterium dan spesies-spesies tertentu dari genus Nocardia mengandung sejumlah besar zat lipoid (berlemak) di dalam dinding-dinding selnya. Hal ini mengakibatkan dinding sel tersebut relatif tidak permeable terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel-sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode-metode pewarna biasa. Kedua genus tersebut mengandung spesies-spesies yang patogenik bagi manusia. Bakteri yang paling dikenal diantaranya adalah M. tuberculosis, penyebab penyakit tuberculosis dan M. leprae penyebab penyakit lepra. Menunjang diagnosis penyakit-penyakit tersebut, bakteri penyebabnya harus dapat diisolasi dari spesimen si sakit dan dibuat tampak serta mudah dibedakan dengan bakteri-bakteri yang lain. Akibat sifat dinding selnya yang demikian itu maka untuk memenuhi tujuan tersebut harus digunakan pewarna khusus (Hadioetomo, 1993). Teknik pewarnaan khusus itu disebut juga pewarnaan tahan asam, mula-mula dikembangkan oleh Paul Ehrlich pada tahun 1882 ketika meneliti M.tuberculosis. Prosedur pewarnaan yang umum digunakan pada masa kini merupakan hasil perbaikan teknik Ehrlich yang asli, yaitu pewarna Ziehl-Neelsen, dinamakan menurut kedua orang peneliti yang mengembangkannya pada akhir 1800-an. Prosedur ini

menggunakan pewarna utama dengan pemanasan, dan biru metilena Loeffler sebagai pewarna tandingan. Modifikasi teknik ini yang berkembang kemudian, perlakuan panas diganti dengan penggunaan pembasah (suatu deterjen untuk mengurangi tegangan permukaan lemak) untuk menjamin penetrasi, pewarna yang mengandung bahan pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Hadioetomo, 1993). Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkoholaseton yang banyak digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993). Pewarnaan Ziehl Neelsen menurut Kurniawati 2005, larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan sediaan, kemudian dipanaskan di atas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutupi seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir. Pewarnaan Ziehl-Neelsen akan menampakkan bakteri tahan asam yang berwarna merah dengan latar berwarna biru. Bakteri tahan asam akan mempertahankan warna pertama yang diberikan. Hasil yang didapat adalah terdapatnya bakteri tahan asam. Mycobacterium tuberculosis memiliki ciri khas yaitu dalam jaringan, basil tuberkel merupakan batang ramping lurus berukuran kira-kira 0,4x3 m. Perbenihan buatan,

terlihat bentuk kokus dan filamen. Mikobakteria tidak dapat diklasifikasikan sebagai Gram positif atau Gram negatif. Sekali diwarnai dengan zat warna basa, warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan alkohol, meskipun dibubuhi iodium. Basil tuberkel yang sebenarnya ditandai oleh sifat tahan asam misalnya 95% etil alkohol yang mengandung 3% asam hidroklorida (asam alkohol) dengan cepat akan menghilangkan warna bakteri kecuali mikobakteria. Sifat tahan asam ini tergantung pada integritas struktur selubung berlilin. Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen dipergunakan untuk identifikasi bakteri tahan asam. Dahak atau irisan jaringan, mikobakteria dapat diperhatikan karena memberi fluoresensi kuning-jingga setelah diwarnai dengan zat warna fluorokrom (misalnya auramin, rodamin) (Annonimous, 2008). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Dwidjoseputro, 1994). Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri (Sutedjo, 1991).

Pengecatan Granula Kromatik

Di dalam sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatikyang terdiri atas volutin,granula glikogen serta granula lemak. Granula metakhromatik sering ditemukan pada jenis-jenis kuman patogen tertentu dan berbentuk khas untuk kuman tersebut. Di dalam sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatik yang tersebut di dalam sediaan mikroskopik. Misalnya kuman difteri mempunyai granula metakhromatik karena bila diwarnai dalam sediaan, granula tersebut akan berwarna lain dari pada zat warna yang digunakan. Misalnya bila diwarnai sediaan kuman difteri dengan zat warna biru metilen,granula Babes-Ernst akan berwarna coklat tua. Pada spesies kuman tertentu, granula metakhromatik terletak pada tempat-tempat khas di dalam sel kuman. Disamping material nukleus, sitoplasma bakteri mungkin mengandung inklusi sel-kepingankepingan kecil material yang tidak menjadi bagian utuh struktur sel. Butiran khusus ini yang

rupanya bertindak sebagai sumber fosfat dan energi disebut butiran metakromat karena akan menyerap warna merah apabila diwarnai dengan biru metilen. Butiran metakromat disebut juga kolektif volutin. Pewarnaan Granula dapat dilakukan dengan metode selain Neisser yaitu: 1. Metode Alberts 2. Metode Much Weis (Mycobacterium tuberculose). PROSEDUR KERJA Metode : Albert & Christensen Tujuan : Untuk melihat granula bakteri Prinsip : Pada pengecatan dengan toluidine blue granula bakteri akan berwarna hitam (karena bersifat metakromatik) dan tidak akan larut oleh air sehingga pada pemberian safranin warna granula tetap hitam. Sedangkan pada badan bakteri warna dari toluidin blue akan larut oleh air dan mengambil warna merah dari safranin. Cara Kerja: Dibuat sediaan kuman dan fiksasi Diwarnai dengan zat warna toluidin blue, didiamkan selama 1menit. Dicuci dengan air mengalir. Dialiri dengan larutan yodium. Dicuci dengan air mengalir Ditambahkan zat warna Safranin, didiamkan selama 1 menit. Cat dibuang, isapkan dengan tissue, keringkan di udara. Pewarnaan Granula Pada Bakteri Metode Albert & Christensen Di dalam sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatikyang terdiri atas volutin,granula glikogen serta granula lemak. Granula metakhromatik sering ditemukan pada jenis-jenis kuman patogen tertentu dan berbentuk khas untuk kuman tersebut. Di dalam sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatik yang tersebut di dalam sediaan mikroskopik. Misalnya kuman difteri mempunyai granula metakhromatik karena bila diwarnai dalam sediaan, granula tersebut akan berwarna lain dari pada zat warna yang digunakan. Misalnya bila diwarnai sediaan kuman difteri dengan zat warna biru metilen,granula Babes-Ernst akan berwarna coklat tua. Pada spesies kuman tertentu, granula metakhromatik terletak pada tempat-tempat khas di dalam sel kuman.

Disamping material nukleus, sitoplasma bakteri mungkin mengandung inklusi sel-kepingankepingan kecil material yang tidak menjadi bagian utuh struktur sel. Butiran khusus ini yang rupanya bertindak sebagai sumber fosfat dan energi disebut butiran metakromat karena akan menyerap warna merah apabila diwarnai dengan biru metilen. Butiran metakromat disebut juga kolektif volutin. Pewarnaan Granula dapat dilakukan dengan metode selain Neisser yaitu : 1. Metode Alberts 2. Metode Much Weis (Mycobacterium tuberculose). PROSEDUR KERJA Metode : Albert & Christensen Tujuan : Untuk melihat granula bakteri Prinsip : Pada pengecatan dengan toluidine blue granula bakteri akan berwarna hitam (karena bersifat metakromatik) dan tidak akan larut oleh air sehingga pada pemberian safranin warna granula tetap hitam. Sedangkan pada badan bakteri warna dari toluidin blue akan larut oleh air dan mengambil warna merah dari safranin. Cara Kerja : Dibuat sediaan kuman dan fiksasi Diwarnai dengan zat warna toluidin blue, didiamkan selama 1menit. Dicuci dengan air mengalir. Dialiri dengan larutan yodium. Dicuci dengan air mengalir Ditambahkan zat warna Safranin, didiamkan selama 1 menit. Cat dibuang, isapkan dengan tissue, keringkan di udara. Pengecatan Endospora Related Posts : Food Technology,

Microbiology

UJI KATALASE

Pengecatan Endospora Media Pertumbuhan Mikroorganisme Pengecatan Gram Pengamatan Preparat Basah Factors Influencing The Effectiveness of Antimicrobial Agent (Faktor yang Mempengaruhi Keefektifan Antimikroba)

Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri. Karena kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya, maka endospora berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop. Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarna biasa, sehingga harus digunakan pewarna spesifik dan yang biasa digunakan adalah malachite green [1]. Dua jenis bakteri yang dapat membentuk spora misalnya Clostridium dan Bacillus. Clostridium adalah bakteri yang bersifat anaerobic, sedangkan Bacillus pada umumnya bersifat aerobic. Struktur endospora mungkin bervariasi untuk setiap jenis spesies, tapi umumnya hamper sama. Endospora bakteri merupakan struktur yang tahan terhadap keadaan lingkungan yang ekstrim misalnya kering, pemanasan, dan keadaan asam [3]. Bakteri pembentuk spora lebih tahan terhadap desinfektan, sinar, kekeringan, panas, dan kedinginan. Kebanyakan bakteri pembentuk spora tinggal di tanah, namun spora bakteri dapat tersebar di mana saja [3].

Pengecatan Spora
Bakteri penghasil spora tahan terhadap pewarnaan. Oleh karena itu, setelah diwarnai oleh suatu warna, misalnya malachite green, akan mengikat kuat senyawa pewarna. Untuk pewarnaan selanjutnya, cat tersebut (misalnya safranin) sel spora tidak dapat menerimanya karena sudah terikat dengan cat pertama. Akhirnya warna bakteri spora adalah hijau. Bakteri yang tidak berspora cenderung tidak tahan pengecatan karena hanya memiliki sel vegetatif. Saat diwarnai oleh malachite, sel vegetatif dapat mengikat warna tetapi dapat luntur setelah dilunturkan karena ikatannya tidak kuat. Setelah pewarnaan selanjutnya dengan safranin, sel vegetatif mudah mengikat warna kembali. Oleh karena itu, hasil pewarnaan akhir adalah merah muda dari safranin.

Contoh yang paling mudah adalah untuk spesies Bacilllus subtilis dan E. Coli. B. Subtilis akan berwarna hijau setelah pengecatan. Hal ini berarti B. Subtilis memiliki endospora. Endospora lebih tahan lama meski dalam keadaan linghkungan ekstrim seperti kering, panas, atau bahan kimia yang beracun. Selain itu, endospora juga lebih tahan terhadap pewarnaan. Sekali berhasil diwarnai, spora sangat sukar untuk melepaskan zat warna sehingga saat diberi warna dari safranin tetap berwarna hijau karena spora sudah mengikat malachite dan sulit mengikat warna yang diberikan kemudian. Eschericia coli setelah pengecatan akan berwarna merah muda dari safranin. E.coli berarti tidak memiliki endospora, hanya memiliki sel vegetatif. Karena E.coli hanya memiliki sel vegetatif, sel vegetatif tidak tahan terhadap pewarnaan. Saat diwarnai denga malachite, sel vegetatif tidak dapat mengikat malachite sehingga saat dilunturkan, warna malachite dapat hilang. Kemudian saat diberi safranin, sel vegetatif dapat mengikat warna kembali sehingga warna sel menjadi merah muda.

a.Pengecatan Spora Bakteri - Metode Klein

Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Segera setelah keadaan luar baik lagi bagi mereka, maka pecahlah bungkus spora dan tumbuhlah bakteri. Spora lazim disebut endospora ialah karena spora itu dibentuk di dalam sel. Endospora jauh lebih tahan terhadap pengaruh luar yang buruk dari pada bakteri biasa yaitu bakteri dalam bentuk vegetatif. Sporulasi dapat dicegah, jika selalu diadakan pemindahan piaraan ke medium yang baru. Endospora dibuat irisan dapat terlihat terdiri atas pembungkus luar, korteks dan inti yang mengandung struktur nukleus. Apabila sel vegetatif membentuk endospora, sel ini membuat enzim baru, memproduksi dinding sel yang sama sekali baru dan berubah bentuk. Dengan kata lain sporulasi adalah bentuk sederhana diferensiasi sel, karena itu, proses ini diteliti secara mendalam untuk mempelajari peristiwa apa yang memicu perubahan enzim dan morfologi.

Spora biasanya terlihat sebagai badan-badan refraktil intrasel dalam sediaan suspensi sel yang tidak diwarnai atau sebagai daerah tidak berwarna pada sel yang diwarnai secara biasa. Dinding spora relatif tidak dapat ditembus, ini pula yang mencegah hilangnya zat warna spora setelah melalui pencucian dengan alkohol yang cukup lama untuk menghilangkan zat warna sel vegetatif. Sel vegetatif akhirnya dapat diberi zat warna kontras. Spora biasanya diwarnai dengan hijau malachit atau carbol fuchsin. Spora kuman dapat berbentuk bulat, lonjong atau silindris. Berdasarkan letaknya spora di dalam sel kuman, dikenal letak sentral,subterminal dan terminal. Ada spora yang garis tengahnya lebih besar dari garis tengah sel kuman, sehingga menyebabkan pembengkakan sel kuman. PROSEDUR KERJA Metode : Klein Tujuan : Untuk melihat spora bakteri Prinsip : Spora kuman mempunyai dinding yang tebal sehingga diperlukan pemanasan agar pori-pori membesar zat warna fuchsin dapat masuk, dengan pencucian pori-pori kembali mengecil menyebabkan zat warna fuchsin tidak dapat dilepas walaupun dilunturkan dengan asam alkohol, sedangkan pada badan bakteri warna fuchsin dilepaskan dan mengambil warna biru dari methylen blue. Cara Kerja : Dibuat suspensi kuman, ditambah dengan carbol fuchsin sama banyak. Dipanaskan selama 6 menit pada api kecil atau pada penangas air 80oc selama 10 menit. Dibuat sediaan dan dikeringkan.

 Dimasukkan kedalam H2SO4 1% selama 2 detik Dimasukkan kedalam alkohol sehingga tidak ada lagi warna merah mengalir. Sediaan dicuci dengan air. Diwarnai dengan methylen blue selama 1 menit kemudian dicuci dan dikeringkan. Diperiksa dibawah mikroskop. Interpretasi hasil : Spora : warna merah dan Badan bakteri : warna biru. Sumber : ripanimusyaffalab.blogspot.com

b. Pengecatan Endospora
Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, tetapi sekali diwarnai, zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan spora secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora, endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya [2]. Langkah-langkahnya sebagai berikut. 1.Gunakan teknik aseptis, siapkan biakan bakteri dalam kondisi udara yang kering dan dengan pemanasan yang baik. 2.Siapkan waterbath yang dipanaskan. 3.Tutup gelas preparat dengan selembar tisu dan letakkan pada rak di atas waterbath. 4.Tetesi dengan malachite green 5.Panaskan gelas preparat selama 5 menit. 6.pindahkan gelas preparat dari waterbath dan ambil kertas tisu dari preparat. 7.Biarkan gelas preparat dingin lalu cuci dengan air deionisasi. 8.Keringkan dan tambahkan safranin, diamkan selama 2 menit. 9.Cuci sisa safranin dengan air deionisasi dan keringkan noda. 10.Lakukan pengamatan preparat dengan mikroskop dengan bantuan minyak emersi.

Pewarnaan Kapsul Beberapa jenis bakteri dan amoeba hijau-biru mengeluarkan bahan-bahan yang amat berlendir dan lengket pada permukaan selnya, melengkungi dinding sel. Bila bahan berlendir tersebut kompak dan tampak sebagai suatu bentuk yang pasti ( bundar/lonjong) maka disebut kapsul, tetapi bila tidak teratur bentuknya dan menempelnya pada sel kurang erat maka disebut selaput lendir. Kapsul dan lendir tidaklah esensial bagi kehidupan sel, tapi dapat berfungsi sebagai makanan cadangan, perlindungan terhadap fagositosis ( baik dalam tubuh inang maupun dialam bebas ) atau perlindungan terhadap dehidrasi. Kemampuan menghasilkan kapsul merupakan sifat genetis, tetapi produksinya sangat dipengaruhi oleh komposisi medium tempat ditumbuhkannya sel-sel yang bersangkutan. Komposisi medium juga dapat mempengaruhi ukuran kapsul. Ukuran kapsul berbedabeda menurut jenis bakterinya dan juga dapat berbeda diantara jalur-jalur yang berlainan dalam satu spesies. Pada beberapa jenis bakteri adanya kapsul sebagai petunjuk virulensi. Semua kapsul bakteri tampaknya dapat larut dalam air. Komposisi kimiawi kapsul ada yang berupa glukosa ( misalnya dektrosa pada leokonostok mesendteroides), polimer gula amino (misalnya asam hialuronat pada Staphylococcus piogenik), polipeptida (misalnya polimer asam D-glutamat pada Bacillus antraksis) atau kompleks polisakarida protein ( misalnya B disentri). Simpai biasanya diperlihatkan dengan cara pewarnaan negatif atau modifikasi dari cara itu. Salah satu pewarnaan simpai (kapsul) ini ( metode Welch) meliputi pemberian larutan kristal ungu panas disusul kemudian dengan pencucian dengan larutan tembaga sulfat. Tembaga sulfat ini digunakan untuk menghilangkan zat warna berlebihan karena pencucian biasa dengan air akan melarutkan simpai. Garam tembaga memberi pula warna pada latar belakang, sehingga sel dan latar belakang akan tampak biru tua dan simpai berwarna biru yang lebih muda. PROSEDUR KERJA Metode : Burry Gins Tujuan : Untuk melihat kapsul bakteri Prinsip : Kapsul pada kuman tidak dapat mengikat zat warna, sehingga pada pemberian cat tinta cina dan calbol fuchsin terlihat bulatan terang atau transparan dengan latar belakang gelap dan badan kuman berwarna merah dari fuchsin. Cara Kerja : Persiapkan 2 objek glass yang bersih dan bebas lemak Letakkan 1 ose tinta cina pada bagian pinggir objek glass Diambil 1 ose suspensi bakteri, campurkan dengan tinta cina sampai homogen Dengan ujung objek glass yang lain, buat hapusan, dibiarkan kering dan fiksasi Ditambahkan carbol fuchsin 1/10 selama 1 menit Sisa cat dibuang dan dikeringkan.. Diperiksa dibawah mikroskop. Interpretasi hasil : Kapsul: transparan dan Badan bakteri : warna merah.

Organisme aerobik
Organisme aerobik atau aerob adalah organisme yang melakukan metabolisme dengan bantuan oksigen. Aerob, dalam proses dikenal sebagai respirasi sel, menggunakan oksigen untuk mengoksidasi substrat (sebagai contoh gula dan lemak) untuk memperoleh energi.

Aerob obligat membutuhkan oksigen untuk melakukan respirasi sel aerobik. Aerob fakultatif dapat menggunakan oksigen tetapi dapat juga menghasilkan energi secara anaerobik. Mikroaerofil adalah organisme yang bisa menggunakan oksigen tetapi dalam konsentrasi yang sangat kecil (mikromolar). Organisme aerotoleran dapat hidup walaupun terdapat oksigen di sekitarnya, tetapi mereka tetap anaerobik karena mereka tidak menggunakan oksigen sebagai terminal electron acceptor (akseptor elektron terminal).

Contoh yang dapat diberikan adalah oksidasi glukosa (monosakarida) dalam respirasi aerobik. C6H12O6 + 6 O2 + 38 ADP + 38 fosfat 6 CO2 + 6 H2O + 38 ATP Energi yang dilepaskan pada reaksi ini sebesar 2880 kJ per mol, yang disimpan dalam regenerasi 38 ATP dari 38 ADP per glukosa. Angka ini 19 kali lebih besar daripada yang dihasilkan reaksi anaerobik. Organisme eukariotik (semua kecuali bakteri) hanya memperoleh 36 ATP yang diregenerasi dari ADP dalam proses ini. Hal ini disebabkan terdapat membran yang harus dilewati oleh transport aktif. Persamaan ini merupakan rangkuman dari apa yang sesungguhnya terjadi dalam tiga seri reaksi biokimia: glikolisis, siklus Krebs, dan oxidative phosphorylation. Hampir semua hewan, sebagian besar fungi, dan beberapa bakteri adalah aerob obligat. Sebagian besar organisme anaerobik adalah bakteri. Menjadi aerob obligat, walaupun menguntungkan dalam memperoleh energi, berarti juga harus menghadapi stress oksidatif. Khamir, sebagai contoh, adalah aerob fakultatif. Sel-sel pada manusia juga merupakan aerob fakultatif: mereka akan melakukan fermentasi asam laktat jika tidak mendapatkan oksigen. Akan tetapi, hal ini tidak dapat berlangsung terusmenerus sehingga manusia termasuk dalam aerob obligat.

Contoh dari bakteri aerob obligat adalah: Nocardia (Gram positif), Pseudomonas aeruginosa (Gram negatif), Mycobacterium tuberculosis (Acid Fast), and Bacillus (Gram positif).

Organisme Anaerobic
Organisme anaerobik atau anaerob adalah setiap organisme yang tidak memerlukan oksigen untuk tumbuh.

Anaerob obligat akan mati bila terpapar pada oksigen dengan kadar atmosfer. Anaerob fakultatif dapat menggunakan oksigen jika tersedia. Organisme aerotoleran dapat hidup walaupun terdapat oksigen di sekitarnya, tetapi mereka tetap anaerobik karena mereka tidak menggunakan oksigen sebagai terminal electron acceptor (akseptor elektron terminal).

Mikroaerofil adalah organisme yang dapat menggunakan oksigen, tetapi hanya pada konsentrasi yang rendah (rentang mikromolar rendah); pertumbuhannya dihambat oleh level oksigen yang normal (sekitar 200 mikromolar). Nanaerob adalah organisme yang tidak dapat tumbuh bila terdapat konsentrasi mikromolar oksigen, tetapi dapat tumbuh dan diuntungkan pada konsentrasi nanomolar oksigen. Anaerob obligat dapat menggunakan fermentasi atau respirasi anaerobik. Jika terdapat oksigen, anaerob fakultatif menggunakan respirasi aerobik; tanpa oksigen beberapa diantaranya berfermentasi, beberapa lagi menggunakan respirasi anaerobik. Organisme aerotoleran hanya dapat berfermentasi. Mikroaerofil melakukan respirasi aerobik, dan beberapa diantaranya dapat juga melakukan respirasi anaerobik. Terdapat beberapa persamaan kimia untuk reaksi fermentasi anaerobik. Organisme anaerobik fermentatif biasanya menggunakan jalur fermentasi asam laktat: C6H12O6 + 2 ADP + 2 fosfat 2 asam laktat + 2 ATP Energi yang dilepaskan pada persamaan ini sekitar 150 kJ per mol, yang disimpan dalam regenerasi dua ATP dari ADP per glukosa. Ini hanya 5% energi per molekul gula daripada yang dapat dihasilkan oleh reaksi aerobik.Tumbuhan dan jamur (contohnya ragi)

biasanya melakukan fermentasi alkohol (etanol) ketika oksigen terbatas melalui reaksi berikut: C6H12O6 + 2 ADP + 2 fosfat 2 C2H5OH + 2 CO2 + 2 ATP Energi yang dilepaskan sekitar 180 kJ per mol, yang disimpan dalam regenerasi dua ATP dari ADP per glukosa. Bakteri anaerobik dan archaea menggunakan jalur ini dan beberapa jalur lainnya dalam melakukan fermentasi seperti: fermentasi asam propionat, fermentasi asam butirat, fermentasi pelarut, fermentasi asam campuran, fermentasi butanediol, fermentasi Stickland, asetogenesis atau metanogenesis.Beberapa bakteri anaerobik menghasilkan toksin (racun) seperti toksin tetanus atau botulinum yang sangat berbahaya bagi organisme yang lebih besar, termasuk manusia.Anaerob obligat akan mati bila terdapat oksigen karena tidak adanya enzim superoksida dismutase dan katalase yang dapat mengubah superoksida berbahaya yang timbul dalam selnya karena adanya oksigen.