PEMBUATAN PREPARAT DAN PENGECATANNYA

Mikroorganisme yang ada dialam ini mempunyai morfologi, struktur khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jaweta, 1986; Dwidjoseputro, 1994; Assani, 1994). Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Pelczar & Chan, 1986; Volk & Wheeler, 1993; Lim, 1998). Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, subtrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pewarnaan gram pertama kali mulai dikembangkan pada tahun 1884 oleh ahli histologi yaitu Cristian Gram (Cappuccino & Sherman, 1983). Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Garm (Ratna, 1993; Dwidjoseputro, 1994). Tujuan dari percobaan ini adalah dapat melakukan pembuatan preparat dari bahan yang berasal dari penderita baik itu dengan media cair dan media padat.Dapat melakukan pengecatan bakteri khususnya dapat membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Mikroorganisme merupakan populasi makhluk hidup di alam yang jumlahnya sangat besar namun, semua mikroorganisme mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas,

sama halnya dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air. Pengecatan dan pewarnaan merupakan salah satu cara untuk mengamati sel-sel bakteri (Sutedjo, 1991). Bakteri-bakteri dari genus Mycobacterium dan spesies tertentu dari genus Nocardia mengandung sejumlah besar zat lipoidal (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel baktei tersebut tidak terwarnai oleh pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram. Kelompok bakteri tahan asam ini juga dapat hidup sebagai flora normal pada usus ternak unggas, dengan demikian sumber tersebut memudahkan dalam upaya mendapatkan isolat bekteri yang tahan asam (Cappuccino & Sherman, 1983) Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994). Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri (Sutedjo, 1991). Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-,

Sel–sel bakteri mempunyai muatan yang agak negatif bila pH lingkungannya mendekati netral. intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat . Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagianbagian inti sel. 1993). peluntur warna. 1983) Kondisi yang terus memburuk membuta endospora dibebaskan dari degenerasi sel vegetatif dan menjadi sel independen yang disebut spora yang diakibatkan komposisi lapisan kimia spora bersifat tahan terhadap efek-efek merusak. spora bebas kembali untuk aktif secara metabolik dan sel vegetatif berkurang resisten melalui germinasi. dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Perbedaan muatan inilah yang menyebabkan adanya ikatan atau gabungan antara zat warna dan sel bakteri (Schegel. pengeringan. 2005) dan sifat-sifat yang khas. Sporogenesis dan germinasi tidak dimaksudkan untuk reproduksi tetapi hanya mekanisme yang menjamin ketahanan sel dibawah kondisi lingkungan (Suriawiria. Sebagian besar dari genus anaerobik Clostridium dan Desulfotomaculum dan genus aerobik Bacillus adalah contoh-contoh organisme yang mempunyai kapasitas untuk pertahanan. substrat. Kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan untuk keberlangsungan aktivitas sel vegetatif. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti: fiksasi. pembekuan. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air. dan agent kimia lainnya sehingga diperlukan pewarnaan khusus secara mikrobiologi dan ketika kondisi lingkungan kembali normal. tipe-tipe sel inaktif secara metabolik disebut spora. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. salah satunya adalah sel vegetatif yang aktif secara metabolik. 1991). sehingga selnya akan berwarna. begitu pula dengan bakteri. radiasi. sel ini mempunyai kapasitas untuk mengalami sporogenesis dan memberikan reaksi untuk pembentukan struktur intraseluler baru (endospora) yang dilindungi oleh lapisan yang tidak dapat ditembus air (tahan penetrasi) dikenal sebagai jaket spora (spore coats) (Cappuccino & Sherman.CH3COO-. misalnya pemanasan berkelebihan. COOHCOO. biasanya pada saat kurangnya sumber nutrisi karbon. Muatan negatif dari sel bakteri akan bergabung dengan muatan positif dari ion zat warna misalnya methylen blue.

Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam. yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Pengecatan dan pewarnaan merupakan salah satu cara untuk mengamati sel-sel bakteri (Sutedjo. untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola. semua mikroorganisme mempunyai morfologi. Tujuan dari percobaan ini adalah dapat melakukan pembuatan preparat dari bahan yang berasal dari penderita baik itu dengan media cair dan media padat. sama halnya dengan bakteri. peluntur warna. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air. 1994). Pewarnaan gram pertama kali mulai dikembangkan pada tahun 1884 oleh ahli histologi yaitu Cristian Gram (Cappuccino & Sherman. Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi. Assani. 1983). memperjelas ukuran dan bentuk bakteri. 1991). Bakteri-bakteri dari genus Mycobacterium dan spesies tertentu dari genus Nocardia mengandung sejumlah besar zat lipoidal (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum .Dapat melakukan pengecatan bakteri khususnya dapat membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop. seperti pewarnaan sederhana atau Garm (Ratna. 1993. 1993. 1994. Dwidjoseputro. 1998). menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna. intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Lim.fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jaweta. 1986. serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Pelczar & Chan. Dwidjoseputro. subtrat. struktur dan sifat-sifat yang khas. Mikroorganisme merupakan populasi makhluk hidup di alam yang jumlahnya sangat besar namun. 1994). Volk & Wheeler. Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa. 1986.

peluntur warna . intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. 1990). 1983) Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus. 1991). sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Jika warna terdapat pada ion negatif. dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagianbagian inti sel. Contoh zat warna basa adalah methylen blue. safranin. maka disebut zat warna basa. dan lain-lain. seperti pewarnaan sederhana atau Gram. intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna. dengan demikian sumber tersebut memudahkan dalam upaya mendapatkan isolat bekteri yang tahan asam (Cappuccino & Sherman. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri (Sutedjo. peluntur warna. Kelompok bakteri tahan asam ini juga dapat hidup sebagai flora normal pada usus ternak unggas. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). netral red. Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti: fiksasi. 1994). maka disebut zat warna asam. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam. basil. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. 1991). dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. substrat.sehingga sel baktei tersebut tidak terwarnai oleh pewarnaan biasa. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna. Sel–sel bakteri mempunyai muatan yang agak negatif bila pH lingkungannya mendekati netral. COOHCOO. kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-. CH3COO-. spirilum. substrat. Muatan negatif dari sel bakteri akan bergabung dengan muatan positif dari ion zat . SO4-. Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi.

salah satunya adalah sel vegetatif yang aktif secara metabolik. sehingga selnya akan berwarna. dan agent kimia lainnya sehingga diperlukan pewarnaan khusus secara mikrobiologi dan ketika kondisi lingkungan kembali normal. pembekuan. spora bebas kembali untuk aktif secara metabolik dan sel vegetatif berkurang resisten melalui germinasi. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif. 1983) Kondisi yang terus memburuk membuta endospora dibebaskan dari degenerasi sel vegetatif dan menjadi sel independen yang disebut spora yang diakibatkan komposisi lapisan kimia spora bersifat tahan terhadap efek-efek merusak.warna misalnya methylen blue. pengeringan. tipe-tipe sel inaktif secara metabolik disebut spora. 1993). misalnya pemanasan berkelebihan. . Kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan untuk keberlangsungan aktivitas sel vegetatif. Sporogenesis dan germinasi tidak dimaksudkan untuk reproduksi tetapi hanya mekanisme yang menjamin ketahanan sel dibawah kondisi lingkungan (Suriawiria. sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. 2005) Pengecatan Gram Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Sebagian besar dari genus anaerobik Clostridium dan Desulfotomaculum dan genus aerobik Bacillus adalah contoh-contoh organisme yang mempunyai kapasitas untuk pertahanan. radiasi. sel ini mempunyai kapasitas untuk mengalami sporogenesis dan memberikan reaksi untuk pembentukan struktur intraseluler baru (endospora) yang dilindungi oleh lapisan yang tidak dapat ditembus air (tahan penetrasi) dikenal sebagai jaket spora (spore coats) (Cappuccino & Sherman. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). Perbedaan muatan inilah yang menyebabkan adanya ikatan atau gabungan antara zat warna dan sel bakteri (Schegel. biasanya pada saat kurangnya sumber nutrisi karbon.

Coli. Safranin (1 tetes) sebagai cat penutup untuk mewarnai kembali sel-sel yang sudah kehilangan warna cat utamanya Pada saat pemberian larutan cat kristal violet. Salmonella spp. Shigella spp. Streptococci. bakteri gram positif dan negatif samasama berwarna ungu. pada gram positif terbentuk kompleks iodin kristal violet sehingga sel berwarna biru. Saat penambahan safranin. Ethanol 95% (secukupnya sampai cat utama luntur). Saat ditetesi iodin. Enterococci. Clostridium. pori berkerut dan permeabilitas rendah sehingga kompleks violet kristal-iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasm sehingga sel tetap biru/ungu. E. Bacillus. sebagai bahan peluntur untukk melunturkan cat utama 4. Sedangkan bakteri gram positif adalah Staphylococci. Larutan violet kristal hucker (1 tetes) sebagai cat utama yang akan diikat oleh peptidoglikan bakteri.Sifat Komposisi dinding sel Ketahanan terhadap penisilin Penghambatan warna basa Kebutuhan nutrien Ketahanan terhadap perlakuan fisik Gram positif Kandungan lipid rendah Lebih sensitif Lebih dihambat Kompleks Lebih tahan Gram Negatif Lipid tinggi Lebih tahan Kurang dihambat Relatif sederhana Kurang tahan Genus bakteri yang termasuk gram negatif adalah Enterobactericeae. sedangkan pada gram posotif dinding sel dehidrasi. Reagen-reagen yang digunakan dalam pengecatan gram adalah: 1. sedangkan pada bakteri gram negatif tidak. Yersinia enterolitica. Iodin (1 tetes) sebagai mordan untuk mengintensifkan cat utama 3. bakteri gram negatif mengikatnya sedangkan gram negatif melewatkannya. 2. . Namun setelah pencucian dengan etanol warna ungu yang diikat oleh bakteri gram negatif luntur. Pada gram negatif lemak terekstraksi dari dinding sel sehingga pori membesar dan kompleks violet kristal-iodin keluar sel. demikian juga gram negatif.

yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut.Teknik Pengecatan Gram Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. dapat membantu dokter untuk memulai terapi suatu penyakit tanpa menunggu hasil kultur. pus (nanah). dapat berasal dari : 1) langsung dari penderita dapat berupa sputum (dahak). urin dan cairan serebrospinal. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. discharge hidung. Bahan :  Untuk bahan yang berbeda. Dengan metode pengecatan Gram. memerlukan cara pembuatan preparat yang berbeda pula. Persiapan Sebelum dilakukan pengecatan Gram. bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua. tentu harus disiapkan bahan (spesimen) yang akan diperiksa. Spesimen yang akan dicat. Bahan yang akan diperiksa. dalam kasus tertentu. dengan atau tanpa pewarnaan.1. Pemeriksaan ini dapat dilakukan dengan cepat dan biaya murah serta. Metode pengecatan tersebut pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Berikut cara pembuatan preparat untuk berbagai sumber bahan. a. Bahan langsung dari penderita . Pengertian preparat adalah sampel spesimen yang diletakkan atau dioleskan pada permukaan gelas obyek (object glass) atau slides. sebelumnya dibuat sediaan atau preparat (smear) terlebih dulu. Pembuatan preparat Alat dan bahan yang diperlukan adalah : Alat :    Ose atau kapas lidi steril Gelas obyek Lampu spiritus Bahan yang akan diperiksa. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. yang selanjutnya dapat diamati di bawah mikroskop. Oleh karena itu. discharge telinga.

Bahan dari biakan cair Ambil gelas obyek yang bersih dan steril. Bahan dari media pertumbuhan padat Ambil gelas obyek yang bersih dan steril. Teteskan satu ose kaldu atau NaCl pada gelas obyek tersebut. Selanjutnya dikerjakan sebagaimana membuat preparat dengan bahan berasal dari penderita. a. Masingmasing mempunyai komposisi dan fungsi yang berbeda. a. Ambil kuman dari biakan cair (yang sebelumnya telah diaduk secara steril) dengan menggunakan ose steril. Setelah kering. campur dengan kaldu tadi sampai homogen kemudian tipiskan. teteskan formalin 1 % tunggu selama 5 menit dan keringkan sekali lagi. C dan D.Bahan disentrifuge terlebih dulu. adalah sebagai berikut : Cat Gram A Cat ini terdiri atas : Kristal violet : 2 gram Etil alkohol 95 : 20 ml Ammonium oksalat : 0. Dengan ose steril. kemudian endapannya dibuat preparat.   Cat Gram Cat Gram yang digunakan terdiri dari 4 macam. B. Komposisi dan fungsi masingmasing cat Gram. Panaskan gelas obyek di atas nyala api lampu spiritus sambil diayunkan secukupnya (jarak preparat sampai nyala api kira-kira 20 cm). preparat siap dicat. ambil satu koloni kuman dan ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter 1 – 2 cm. Preparat yang sudah dibuat kemudian dikeringkan dan ditetesi formalin dengan cara seperti pembuatan preparat langsung. Setelah betul-betul kering. yaitu cat Gram A. pada saat akan dipakai dan setelah dipakai. Usahakan tidak banyak bicara pada saat kerja. bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus.8 gram Akuades : 80 ml .3. sampai preparat tersebut kering. bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus. ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter kira-kira 1-2 cm.2. Bahan yang berupa endapan (pellet) hasil sentrifuge tersebut diambil dengan ose steril atau kapas lidi steril kemudian digoreskan pada gelas obyek setipis mungkin. Letakkan ose pada tempatnya. Prinsip yang selalu harus diingat dan dipatuhi adalah :   Selalu mensterilkan ose. jangan diletakkan di sembarang tempat (misal di atas meja) Jangan memegang mata (ujung) ose dengan tangan.

Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Akibat pemberian cat Gram D. maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat). yaitu cat atau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme target. Cat Gram A merupakan cat primer yang akan memberi warna mikroorganisme target. Cat Gram C Cat ini terdiri atas :   Aseton : 50 ml Etil alkohol 95 % : 50 ml Cat Gram C tidak berwarna. Cat Gram B merupakan cat Mordan. Ikatan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol.  Bakteri akan tidak berwarna. Bakteri yang bersifat demikian dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif.Cat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal violet). karena tahan terhadap alkohol. Pada saat diberi cat ini. Bakteri yang bersifat demikian disebut bakteri Gram positif. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Akibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan :  Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu. Ikatan antara cat dengan bakteri dilunturkan oleh alkohol. Cat ini berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat Gram D Cat Gram D terdiri atas :    Safranin : 0. Cat Gram B Cat ini terdiri atas : Yodium : 1 gram Kalium Yodida : 2 gram Akuades : 300 ml Cat Gram B berwarna coklat. . semua mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram A. karena telah jenuh mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu lagi mengikat cat Gram D. akan terjadi 2 kemungkinan :  Bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu.25 gram Etil alkohol 95 % : 10 ml Akuades : 90 ml Cat ini berwarna merah. Akibat pemberian cat Gram B. karena tidak tahan terhadap alkohol.

dan kompleks kristal yodium tidak dapat keluar. Zat lipid ini akan larut selama pencucian dengan alkohol. hanya 1 – 2 lapisan dan susunan dinding selnya tidak kompak. Teori permeabilitas dinding sel Teori ini berdasarkan tebal tipisnya lapisan peptidoglikan dalam dinding sel. CARA PENGECATAN GRAM Sebelum melakukan pengecatan Gram. karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampu mengikat cat Gram D. C dan D Preparat yang telah siap untuk dicat Bahan :   . Permeabilitas dinding sel kurang. Bakteri Gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding selnya akibat pencucian dengan alkohol. Bakteri Gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis. pori-pori mengecil sehingga kompleks kristal yodium yang berwarna ungu dipertahankan dan bakteri akan tetap berwarna ungu. Pastikan semua alat dan bahan yang diperlukan serta tempat untuk mencuci terletak di tempat yang terjangkau. Dasar teori cat Gram Berdasarkan sifat terhadap cat Gram. sehingga zat warna yang sudah diserap mudah dilepaskan dan bakteri menjadi tidak berwarna. Bakteri Gram positif mempunyai susunan dinding yang kompak dengan lapisan peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan. Pori-pori pada dinding sel membesar. Alat dan bahan yang diperlukan adalah : Alat :   Rak pengecatan Kran/sumber air yang mengalir Cat Gram A. Protein menjadi keras dan beku. bakteri dapat dikelompokkan menjadi 2 yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Terdapat dua teori yang dapat menjelaskan dasar perbedaan ini yaitu : Teori Salton Teori ini berdasarkan kadar lipid yang tinggi (20 %) di dalam dinding sel bakteri Gram negatif. siapkan alat dan bahan yang diperlukan. Permeabilitas dinding sel lebih besar sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks kristal yodium. Bakteri Gram negatif akan berwarna merah. Jangan sampai terlalu jauh sehingga menyulitkan dan memakan waktu. B.

Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. antara lain banyak yang m erupakan saprofit. begitu pula dengan bakteri. Bakteri tersebut ketika diamati dibawah mikroskop tampak berwarna merah dengan warna dasar muda. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air. Kekurangan : Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari 104 per ml. Bakteri tahan asam adalah bakteri yang pada pengecatan Ziehl-Neelsen (ZN) tetap mengikat warna pertama. sehingga tidak mampu mengikat warna kedua. Misalnya pada pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana) uretral. Hal ini karena bakteri Gram positif dan negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika. Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna diagnostik. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonore. struktur dan sifat-sifat yang khas. Terdapat lebih dari 50 spesies Mycobacterium. 2. . Pengecatan Bakteri Tahan Asam Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi. sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri terhadap antibiotik).Kelebihan dan Kekurangan Pengecatan Gram Kelebihan : 1. Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis. tidak luntur oleh asam dan alkohol. Pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal. memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan.

Sumber penularan adalah penderita TB yang dahaknya mengandung kuman TB hidup (BTA positif). Penyebaran melalui udara berupa partikel-partikel percikan dahak yang mengandung kuman berasal dari penderita saat batuk. Sputum disiapkan (hati-hati. Umumnya pewarnaan Ziehl-Neelsen dan Tan Thiam Hok yang sering digunakan. diambil sedikit dari bagian yang kental dan berwarna kuning kehijauan (purulen) menggunakan ose. Mycobacterium leprae menyebabkan lepra. misalnya nanah. Air kuras lambung. cairan pleura. Hasil yang didapat disamakan dengan penilaian IUATLD (International Union Against Tuberculose Lung Diseases) ϖ Pembuatan Sediaan Apus Sputum 1. Ose dipanaskan di atas api spirtus sampai merah dan didinginkan. Bahan-bahan lain. Mycobacterium tuberculosis menyebabkan tuberculosis dan merupakan patogen yang berbahaya bagi manusia. dan usapan tenggorokan. cairan cerebrospinal. berbentuk batang dan bersifat aerob obligat yang tumbuh lambat dengan waktu generasi 12 jam atau lebih. bernyanyi atau bicara. Infeksi kuman ini paling sering disebarkan melalui udara (air borne. hindari droplet/percikan sputum).Mycobacterium tuberculosis merupakan bakteri tahan asam. pertama kali keluar merupakan urin pancaran tengah. umumnya anak-anak atau penderita yang tidak dapat mengeluarkan dahak. tertawa. bersin. droplets infection). Tan Thiam Hok (Kinyoun-Gabbett) dan Auramin–phenol fluorochrome. 2. dan kadang-kadang menyebabkan penyakit pada pasien dengan system imun yang normal. Partikel mengandung kuman ini (berukuran diameter 1-5 µm) akan terhisap oleh orang sehat dan menimbulkan infeksi di saluran napas. harus benar-benar dahak bukan ingus juga bukan ludah. Terdapat beberapa macam bahan spesimen dalam pemeriksaan laboratorium tuberkulosis yaitu: • • • Sputum (dahak). Mycobacterium avium-intracellulare (kompleks M. Pewarnaan kuman BTA dapat dilakukan dengan 3 macam pewarnaan yaitu Ziehl-Neelsen. adalah patogen ortunistik pada orang-orang dengan fungsi imun yang terganggu lainnya. . Air kemih pagi hari. avian) dan mikobakteria apitik lain yang sering menginfeksi pasien AIDS.

Warna merah dilarutkan pada sediaan sampai bersih dengan 3% alkohol-asam. Sediaan yang telah dibuat dikeringkan di udara terbuka sekitar 15-30 detik. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Sediaan yang telah kering ditetesi minyak imersi. Penilaian 1. Dicari dengan adanya batang panjang atau pendek yang berwarna merah dengan latar belakang berwarna biru. . kemudian dibakar. 4. BTA positif : apabila dalam pengamatan dijumpai adanya BTA. Pewarnaan/Pengecetan Ziehl-Neelsen  1. Sambil difiksasi. Ose yang telah digunakan dimasukkan ke dalam alkohol sambil digoyang-goyangkan sampai sisa-sisa sputum bersih. 5. 2. BTA negatif : apabila dalam 100 LP atau 15 menit pengamatan tidak dijumpai adanya BTA. Diamati di bawah mikroskop cahaya. jangan sampai terkena matahari langsung. 8. dilihat dengan mikroskop dengan pembesaran 100 kali. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. 2. b. 2. digenangi dengan carbol fuchsin 0. 3. 7. 6. dipanaskan di atas pembakar spirtus sampai menguap tetapi jangan sampai mendidih atau kering selama 5 menit. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.3.3%. 5. 6. Sediaan yang telah kering dilakukan fiksasi 5 menit. Digenangi dengan larutan methylen blue selama 20-30 detik. Sputum dioleskan secara merata (seperti obat nyamuk) pada objek glass (dengan ukuran 2x3 cm). Pembacaan dan Penilaian Pembacaan 1. 4. Sediaan diambil dengan pinset dan difiksasi selama 3-5 menit.

 Positif 2 : Ditemukan 1-10 BTA/1 LP. Mycobacterium tuberculosis. dinamakan menurut kedua orang peneliti yang mengembangkannya pada akhir 1800-an.BTA posiif apabila dibuat sediaan langsung dan diwarnai dengan Ziehl-Neelsen atau Kinyoun Gabbert maka dapat dilakukan penilaian sebagai berikut : Penilaian menurut IUATLD (International Union Against Tuberculose Lung Diseases)  Negatif : Tidak dijumpai adanya BTA.  Positif : Ditemukan 1-9 BTA/100 LP. leprae penyebab penyakit lepra. Genus Mycobacterium dan mempunyai banyak spesies. tuberculosis. Akibat sifat dinding selnya yang demikian itu maka untuk memenuhi tujuan tersebut harus digunakan pewarna khusus (Hadioetomo. Teknik pewarnaan khusus itu disebut juga pewarnaan tahan asam. Prosedur ini .  Positif 3 : Ditemukan lebih dari 10 BTA / 1 LP. Hal ini mengakibatkan dinding sel tersebut relatif tidak permeable terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel-sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode-metode pewarna biasa. Bakteri-bakteri dari genus Mycobacterium dan spesies-spesies tertentu dari genus Nocardia mengandung sejumlah besar zat lipoid (berlemak) di dalam dinding-dinding selnya. Bakteri yang paling dikenal diantaranya adalah M. termasuk Ordo Actinomycetales Familia Mycobacteriaceae. yaitu pewarna Ziehl-Neelsen.  Positif 1 : Ditemukan 10-90 BTA/100 LP. bakteri penyebabnya harus dapat diisolasi dari spesimen si sakit dan dibuat tampak serta mudah dibedakan dengan bakteri-bakteri yang lain. 2002). Menunjang diagnosis penyakit-penyakit tersebut.tuberculosis. Kuman TBC masuk ke paru-paru melalui pernafasan aerosol (Girsang. Kedua genus tersebut mengandung spesies-spesies yang patogenik bagi manusia. Prosedur pewarnaan yang umum digunakan pada masa kini merupakan hasil perbaikan teknik Ehrlich yang asli. 1993). penyebab penyakit tuberculosis dan M. Penyakit yang ditularkan oleh basil tersebut dikenal dengan sebutan TBC atau Tb-paru. mula-mula dikembangkan oleh Paul Ehrlich pada tahun 1882 ketika meneliti M. pertama kali ditemukan oleh Robert Koch tahun 1882.

4x3 µm. maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat warna tersebut dengan erat. Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkoholaseton yang banyak digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram. perlakuan panas diganti dengan penggunaan pembasah (suatu deterjen untuk mengurangi tegangan permukaan lemak) untuk menjamin penetrasi. Mycobacterium tuberculosis memiliki ciri khas yaitu dalam jaringan.1% dituang sampai menutupi seluruh permukaan. pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. 1993). 1993). basil tuberkel merupakan batang ramping lurus berukuran kira-kira 0. Setelah itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit. larutan carbol fuchsin 0. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Pewarnaan Ziehl-Neelsen akan menampakkan bakteri tahan asam yang berwarna merah dengan latar berwarna biru. Perbenihan buatan. Hasil yang didapat adalah terdapatnya bakteri tahan asam. Sekali sitoplasma terwarnai.3% dituang pada seluruh permukaan sediaan. Bakteri tahan asam akan mempertahankan warna pertama yang diberikan. pewarna yang mengandung bahan pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Hadioetomo.menggunakan pewarna utama dengan pemanasan. kelebihan larutan dibuang. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal. artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Kondisi pewarnaan ini. dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir. . sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo. Pewarnaan Ziehl Neelsen menurut Kurniawati 2005. organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Modifikasi teknik ini yang berkembang kemudian. Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel. kemudian dipanaskan di atas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih atau kering selama 5 menit. dan biru metilena Loeffler sebagai pewarna tandingan. Larutan methylene blue 0.

Basil tuberkel yang sebenarnya ditandai oleh sifat tahan asam misalnya 95% etil alkohol yang mengandung 3% asam hidroklorida (asam alkohol) dengan cepat akan menghilangkan warna bakteri kecuali mikobakteria. substrat. Di dalam sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatik yang tersebut di dalam sediaan mikroskopik. Sekali diwarnai dengan zat warna basa.terlihat bentuk kokus dan filamen. Misalnya kuman difteri mempunyai granula metakhromatik karena bila diwarnai dalam sediaan. granula tersebut akan berwarna lain dari pada zat warna yang digunakan. 1991). 2008). meskipun dibubuhi iodium. Pengecatan Granula Kromatik Di dalam sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatikyang terdiri atas volutin. warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan alkohol. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Mikobakteria tidak dapat diklasifikasikan sebagai Gram positif atau Gram negatif. sitoplasma bakteri mungkin mengandung inklusi sel-kepingankepingan kecil material yang tidak menjadi bagian utuh struktur sel. Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Disamping material nukleus. Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen dipergunakan untuk identifikasi bakteri tahan asam. Dahak atau irisan jaringan. Pada spesies kuman tertentu. Misalnya bila diwarnai sediaan kuman difteri dengan zat warna biru metilen. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri (Sutedjo. Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi. mikobakteria dapat diperhatikan karena memberi fluoresensi kuning-jingga setelah diwarnai dengan zat warna fluorokrom (misalnya auramin. Sifat tahan asam ini tergantung pada integritas struktur selubung berlilin. peluntur warna.granula glikogen serta granula lemak. Granula metakhromatik sering ditemukan pada jenis-jenis kuman patogen tertentu dan berbentuk khas untuk kuman tersebut. intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Dwidjoseputro.granula Babes-Ernst akan berwarna coklat tua. Butiran khusus ini yang . granula metakhromatik terletak pada tempat-tempat khas di dalam sel kuman. rodamin) (Annonimous. 1994).

keringkan di udara. Sedangkan pada badan bakteri warna dari toluidin blue akan larut oleh air dan mengambil warna merah dari safranin. • Dialiri dengan larutan yodium. Metode Albert’s 2. isapkan dengan tissue. Granula metakhromatik sering ditemukan pada jenis-jenis kuman patogen tertentu dan berbentuk khas untuk kuman tersebut. didiamkan selama 1 menit. • Dicuci dengan air mengalir • Ditambahkan zat warna Safranin. granula metakhromatik terletak pada tempat-tempat khas di dalam sel kuman.granula glikogen serta granula lemak. Di dalam sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatik yang tersebut di dalam sediaan mikroskopik. • Cat dibuang. didiamkan selama 1menit. Butiran metakromat disebut juga kolektif volutin.granula Babes-Ernst akan berwarna coklat tua. • Dicuci dengan air mengalir. Cara Kerja: • Dibuat sediaan kuman dan fiksasi • Diwarnai dengan zat warna toluidin blue. Misalnya bila diwarnai sediaan kuman difteri dengan zat warna biru metilen. Pada spesies kuman tertentu. granula tersebut akan berwarna lain dari pada zat warna yang digunakan. Metode Much Weis (Mycobacterium tuberculose). Pewarnaan Granula dapat dilakukan dengan metode selain Neisser yaitu: 1.rupanya bertindak sebagai sumber fosfat dan energi disebut butiran metakromat karena akan menyerap warna merah apabila diwarnai dengan biru metilen. PROSEDUR KERJA Metode : Albert & Christensen Tujuan : Untuk melihat granula bakteri Prinsip : Pada pengecatan dengan toluidine blue granula bakteri akan berwarna hitam (karena bersifat metakromatik) dan tidak akan larut oleh air sehingga pada pemberian safranin warna granula tetap hitam. . Pewarnaan Granula Pada Bakteri Metode Albert & Christensen Di dalam sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatikyang terdiri atas volutin. Misalnya kuman difteri mempunyai granula metakhromatik karena bila diwarnai dalam sediaan.

Butiran metakromat disebut juga kolektif volutin.Disamping material nukleus. Sedangkan pada badan bakteri warna dari toluidin blue akan larut oleh air dan mengambil warna merah dari safranin. • Dialiri dengan larutan yodium. • Dicuci dengan air mengalir • Ditambahkan zat warna Safranin. Cara Kerja : • Dibuat sediaan kuman dan fiksasi • Diwarnai dengan zat warna toluidin blue. Metode Much Weis (Mycobacterium tuberculose). keringkan di udara. isapkan dengan tissue. Butiran khusus ini yang rupanya bertindak sebagai sumber fosfat dan energi disebut butiran metakromat karena akan menyerap warna merah apabila diwarnai dengan biru metilen. • Microbiology UJI KATALASE . • Cat dibuang. didiamkan selama 1 menit. Metode Albert’s 2. sitoplasma bakteri mungkin mengandung inklusi sel-kepingankepingan kecil material yang tidak menjadi bagian utuh struktur sel. PROSEDUR KERJA Metode : Albert & Christensen Tujuan : Untuk melihat granula bakteri Prinsip : Pada pengecatan dengan toluidine blue granula bakteri akan berwarna hitam (karena bersifat metakromatik) dan tidak akan larut oleh air sehingga pada pemberian safranin warna granula tetap hitam. • Dicuci dengan air mengalir. Pewarnaan Granula dapat dilakukan dengan metode selain Neisser yaitu : 1. Pengecatan Endospora Related Posts : Food Technology. didiamkan selama 1menit.

dan kedinginan. cat tersebut (misalnya safranin) sel spora tidak dapat menerimanya karena sudah terikat dengan cat pertama. maka endospora berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop. Saat diwarnai oleh malachite. misalnya malachite green. tapi umumnya hamper sama. kekeringan. Oleh karena itu. panas. Dua jenis bakteri yang dapat membentuk spora misalnya Clostridium dan Bacillus. sehingga harus digunakan pewarna spesifik dan yang biasa digunakan adalah malachite green [1]. dan keadaan asam [3]. Setelah pewarnaan selanjutnya dengan safranin.• • • • • Pengecatan Endospora Media Pertumbuhan Mikroorganisme Pengecatan Gram Pengamatan Preparat Basah Factors Influencing The Effectiveness of Antimicrobial Agent (Faktor yang Mempengaruhi Keefektifan Antimikroba) Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri. sel vegetatif dapat mengikat warna tetapi dapat luntur setelah dilunturkan karena ikatannya tidak kuat. Pengecatan Spora Bakteri penghasil spora tahan terhadap pewarnaan. setelah diwarnai oleh suatu warna. Untuk pewarnaan selanjutnya. Karena kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya. hasil pewarnaan akhir adalah merah muda dari safranin. sinar. Kebanyakan bakteri pembentuk spora tinggal di tanah. sedangkan Bacillus pada umumnya bersifat aerobic. akan mengikat kuat senyawa pewarna. Bakteri yang tidak berspora cenderung tidak tahan pengecatan karena hanya memiliki sel vegetatif. Clostridium adalah bakteri yang bersifat anaerobic. pemanasan. . namun spora bakteri dapat tersebar di mana saja [3]. Struktur endospora mungkin bervariasi untuk setiap jenis spesies. Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarna biasa. sel vegetatif mudah mengikat warna kembali. Akhirnya warna bakteri spora adalah hijau. Bakteri pembentuk spora lebih tahan terhadap desinfektan. Endospora bakteri merupakan struktur yang tahan terhadap keadaan lingkungan yang ekstrim misalnya kering. Oleh karena itu.

sel vegetatif dapat mengikat warna kembali sehingga warna sel menjadi merah muda. sel vegetatif tidak tahan terhadap pewarnaan.Contoh yang paling mudah adalah untuk spesies Bacilllus subtilis dan E. Endospora jauh lebih tahan terhadap pengaruh luar yang buruk dari pada bakteri biasa yaitu bakteri dalam bentuk vegetatif. memproduksi dinding sel yang sama sekali baru dan berubah bentuk. Selain itu. korteks dan inti yang mengandung struktur nukleus. karena itu. Spora lazim disebut endospora ialah karena spora itu dibentuk di dalam sel. Subtilis akan berwarna hijau setelah pengecatan. Eschericia coli setelah pengecatan akan berwarna merah muda dari safranin. sel ini membuat enzim baru. Endospora dibuat irisan dapat terlihat terdiri atas pembungkus luar.Metode Klein Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar.Pengecatan Spora Bakteri . a. . Subtilis memiliki endospora. Coli. Saat diwarnai denga malachite. sel vegetatif tidak dapat mengikat malachite sehingga saat dilunturkan. B. Dengan kata lain sporulasi adalah bentuk sederhana diferensiasi sel. panas.coli hanya memiliki sel vegetatif. Kemudian saat diberi safranin. Sekali berhasil diwarnai. atau bahan kimia yang beracun. endospora juga lebih tahan terhadap pewarnaan. spora sangat sukar untuk melepaskan zat warna sehingga saat diberi warna dari safranin tetap berwarna hijau karena spora sudah mengikat malachite dan sulit mengikat warna yang diberikan kemudian. warna malachite dapat hilang. Hal ini berarti B. Segera setelah keadaan luar baik lagi bagi mereka. proses ini diteliti secara mendalam untuk mempelajari peristiwa apa yang memicu perubahan enzim dan morfologi. maka pecahlah bungkus spora dan tumbuhlah bakteri. E. Sporulasi dapat dicegah. jika selalu diadakan pemindahan piaraan ke medium yang baru.coli berarti tidak memiliki endospora. hanya memiliki sel vegetatif. Karena E. Endospora lebih tahan lama meski dalam keadaan linghkungan ekstrim seperti kering. Apabila sel vegetatif membentuk endospora.

• Dipanaskan selama 6 menit pada api kecil atau pada penangas air 80oc selama 10 menit. Berdasarkan letaknya spora di dalam sel kuman. dengan pencucian pori-pori kembali mengecil menyebabkan zat warna fuchsin tidak dapat dilepas walaupun dilunturkan dengan asam alkohol. dikenal letak sentral. Ada spora yang garis tengahnya lebih besar dari garis tengah sel kuman. lonjong atau silindris. sedangkan pada badan bakteri warna fuchsin dilepaskan dan mengambil warna biru dari methylen blue.Spora biasanya terlihat sebagai badan-badan refraktil intrasel dalam sediaan suspensi sel yang tidak diwarnai atau sebagai daerah tidak berwarna pada sel yang diwarnai secara biasa. sehingga menyebabkan pembengkakan sel kuman. Sel vegetatif akhirnya dapat diberi zat warna kontras. Spora kuman dapat berbentuk bulat. Cara Kerja : • Dibuat suspensi kuman. Dinding spora relatif tidak dapat ditembus. Spora biasanya diwarnai dengan hijau malachit atau carbol fuchsin. PROSEDUR KERJA Metode : Klein Tujuan : Untuk melihat spora bakteri Prinsip : Spora kuman mempunyai dinding yang tebal sehingga diperlukan pemanasan agar pori-pori membesar zat warna fuchsin dapat masuk.subterminal dan terminal. . • Dibuat sediaan dan dikeringkan. ini pula yang mencegah hilangnya zat warna spora setelah melalui pencucian dengan alkohol yang cukup lama untuk menghilangkan zat warna sel vegetatif. ditambah dengan carbol fuchsin sama banyak.

Gunakan teknik aseptis. • Diwarnai dengan methylen blue selama 1 menit kemudian dicuci dan dikeringkan.Tetesi dengan malachite green 5. Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora.blogspot. endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses pemanasan. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora.com b. 3. . Interpretasi hasil : Spora : warna merah dan Badan bakteri : warna biru. 1. Pengecatan Endospora Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya. 7.Cuci sisa safranin dengan air deionisasi dan keringkan noda.Biarkan gelas preparat dingin lalu cuci dengan air deionisasi.Lakukan pengamatan preparat dengan mikroskop dengan bantuan minyak emersi.Panaskan gelas preparat selama 5 menit. 2. • Sediaan dicuci dengan air. Langkah-langkahnya sebagai berikut. diamkan selama 2 menit. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan spora secara umum. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya [2].Keringkan dan tambahkan safranin. 9.• Dimasukkan kedalam H2SO4 1% selama 2 detik • Dimasukkan kedalam alkohol sehingga tidak ada lagi warna merah mengalir. 6. Setelah perlakuan malachite green. 10. 4. zat warna tersebut akan sulit hilang. Sumber : ripanimusyaffalab.Tutup gelas preparat dengan selembar tisu dan letakkan pada rak di atas waterbath. biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. 8. • Diperiksa dibawah mikroskop.Siapkan waterbath yang dipanaskan. tetapi sekali diwarnai. siapkan biakan bakteri dalam kondisi udara yang kering dan dengan pemanasan yang baik.pindahkan gelas preparat dari waterbath dan ambil kertas tisu dari preparat.

Komposisi medium juga dapat mempengaruhi ukuran kapsul. Kapsul dan lendir tidaklah esensial bagi kehidupan sel.. Komposisi kimiawi kapsul ada yang berupa glukosa ( misalnya dektrosa pada leokonostok mesendteroides). sehingga sel dan latar belakang akan tampak biru tua dan simpai berwarna biru yang lebih muda. Bila bahan berlendir tersebut kompak dan tampak sebagai suatu bentuk yang pasti ( bundar/lonjong) maka disebut kapsul. melengkungi dinding sel. buat hapusan. polipeptida (misalnya polimer asam D-glutamat pada Bacillus antraksis) atau kompleks polisakarida protein ( misalnya B disentri). tetapi produksinya sangat dipengaruhi oleh komposisi medium tempat ditumbuhkannya sel-sel yang bersangkutan. . Garam tembaga memberi pula warna pada latar belakang. Salah satu pewarnaan simpai (kapsul) ini ( metode Welch) meliputi pemberian larutan kristal ungu panas disusul kemudian dengan pencucian dengan larutan tembaga sulfat. • Diperiksa dibawah mikroskop. tetapi bila tidak teratur bentuknya dan menempelnya pada sel kurang erat maka disebut selaput lendir.Pewarnaan Kapsul Beberapa jenis bakteri dan amoeba hijau-biru mengeluarkan bahan-bahan yang amat berlendir dan lengket pada permukaan selnya. Tembaga sulfat ini digunakan untuk menghilangkan zat warna berlebihan karena pencucian biasa dengan air akan melarutkan simpai. campurkan dengan tinta cina sampai homogen • Dengan ujung objek glass yang lain. tapi dapat berfungsi sebagai makanan cadangan. Pada beberapa jenis bakteri adanya kapsul sebagai petunjuk virulensi. Semua kapsul bakteri tampaknya dapat larut dalam air. Simpai biasanya diperlihatkan dengan cara pewarnaan negatif atau modifikasi dari cara itu. Interpretasi hasil : Kapsul: transparan dan Badan bakteri : warna merah. Kemampuan menghasilkan kapsul merupakan sifat genetis. sehingga pada pemberian cat tinta cina dan calbol fuchsin terlihat bulatan terang atau transparan dengan latar belakang gelap dan badan kuman berwarna merah dari fuchsin. PROSEDUR KERJA Metode : Burry Gins Tujuan : Untuk melihat kapsul bakteri Prinsip : Kapsul pada kuman tidak dapat mengikat zat warna. perlindungan terhadap fagositosis ( baik dalam tubuh inang maupun dialam bebas ) atau perlindungan terhadap dehidrasi. dibiarkan kering dan fiksasi • Ditambahkan carbol fuchsin 1/10 selama 1 menit • Sisa cat dibuang dan dikeringkan. Cara Kerja : • Persiapkan 2 objek glass yang bersih dan bebas lemak • Letakkan 1 ose tinta cina pada bagian pinggir objek glass • Diambil 1 ose suspensi bakteri. polimer gula amino (misalnya asam hialuronat pada Staphylococcus piogenik). Ukuran kapsul berbedabeda menurut jenis bakterinya dan juga dapat berbeda diantara jalur-jalur yang berlainan dalam satu spesies.

sebagai contoh. Organisme aerotoleran dapat hidup walaupun terdapat oksigen di sekitarnya.Organisme aerobik Organisme aerobik atau aerob adalah organisme yang melakukan metabolisme dengan bantuan oksigen. sebagian besar fungi. Sebagian besar organisme anaerobik adalah bakteri. tetapi mereka tetap anaerobik karena mereka tidak menggunakan oksigen sebagai terminal electron acceptor (akseptor elektron terminal). Sel-sel pada manusia juga merupakan aerob fakultatif: mereka akan melakukan fermentasi asam laktat jika tidak mendapatkan oksigen. . dan oxidative phosphorylation. Akan tetapi. • • Contoh yang dapat diberikan adalah oksidasi glukosa (monosakarida) dalam respirasi aerobik. Hal ini disebabkan terdapat membran yang harus dilewati oleh transport aktif. Hampir semua hewan. menggunakan oksigen untuk mengoksidasi substrat (sebagai contoh gula dan lemak) untuk memperoleh energi. • • Aerob obligat membutuhkan oksigen untuk melakukan respirasi sel aerobik. Menjadi aerob obligat. Organisme eukariotik (semua kecuali bakteri) hanya memperoleh 36 ATP yang diregenerasi dari ADP dalam proses ini. adalah aerob fakultatif. C6H12O6 + 6 O2 + 38 ADP + 38 fosfat → 6 CO2 + 6 H2O + 38 ATP Energi yang dilepaskan pada reaksi ini sebesar 2880 kJ per mol. Mikroaerofil adalah organisme yang bisa menggunakan oksigen tetapi dalam konsentrasi yang sangat kecil (mikromolar). Angka ini 19 kali lebih besar daripada yang dihasilkan reaksi anaerobik. Khamir. dan beberapa bakteri adalah aerob obligat. Persamaan ini merupakan rangkuman dari apa yang sesungguhnya terjadi dalam tiga seri reaksi biokimia: glikolisis. dalam proses dikenal sebagai respirasi sel. Aerob fakultatif dapat menggunakan oksigen tetapi dapat juga menghasilkan energi secara anaerobik. walaupun menguntungkan dalam memperoleh energi. hal ini tidak dapat berlangsung terusmenerus sehingga manusia termasuk dalam aerob obligat. yang disimpan dalam regenerasi 38 ATP dari 38 ADP per glukosa. berarti juga harus menghadapi stress oksidatif. Aerob. siklus Krebs.

Nanaerob adalah organisme yang tidak dapat tumbuh bila terdapat konsentrasi mikromolar oksigen. Mikroaerofil melakukan respirasi aerobik. Anaerob obligat dapat menggunakan fermentasi atau respirasi anaerobik. Organisme anaerobik fermentatif biasanya menggunakan jalur fermentasi asam laktat: C6H12O6 + 2 ADP + 2 fosfat → 2 asam laktat + 2 ATP Energi yang dilepaskan pada persamaan ini sekitar 150 kJ per mol. Organisme aerotoleran hanya dapat berfermentasi. and Bacillus (Gram positif). tetapi mereka tetap anaerobik karena mereka tidak menggunakan oksigen sebagai terminal electron acceptor (akseptor elektron terminal). beberapa lagi menggunakan respirasi anaerobik.Contoh dari bakteri aerob obligat adalah: Nocardia (Gram positif). Ini hanya 5% energi per molekul gula daripada yang dapat dihasilkan oleh reaksi aerobik. Mikroaerofil adalah organisme yang dapat menggunakan oksigen. yang disimpan dalam regenerasi dua ATP dari ADP per glukosa.Tumbuhan dan jamur (contohnya ragi) . Mycobacterium tuberculosis (Acid Fast). Anaerob fakultatif dapat menggunakan oksigen jika tersedia. tanpa oksigen beberapa diantaranya berfermentasi. Terdapat beberapa persamaan kimia untuk reaksi fermentasi anaerobik. Jika terdapat oksigen. anaerob fakultatif menggunakan respirasi aerobik. pertumbuhannya dihambat oleh level oksigen yang normal (sekitar 200 mikromolar). Organisme Anaerobic Organisme anaerobik atau anaerob adalah setiap organisme yang tidak memerlukan oksigen untuk tumbuh. • • • Anaerob obligat akan mati bila terpapar pada oksigen dengan kadar atmosfer. Organisme aerotoleran dapat hidup walaupun terdapat oksigen di sekitarnya. Pseudomonas aeruginosa (Gram negatif). dan beberapa diantaranya dapat juga melakukan respirasi anaerobik. tetapi dapat tumbuh dan diuntungkan pada konsentrasi nanomolar oksigen. tetapi hanya pada konsentrasi yang rendah (rentang mikromolar rendah).

biasanya melakukan fermentasi alkohol (etanol) ketika oksigen terbatas melalui reaksi berikut: C6H12O6 + 2 ADP + 2 fosfat → 2 C2H5OH + 2 CO2 + 2 ATP Energi yang dilepaskan sekitar 180 kJ per mol. fermentasi Stickland. termasuk manusia. asetogenesis atau metanogenesis. fermentasi asam campuran. fermentasi asam butirat. fermentasi pelarut. yang disimpan dalam regenerasi dua ATP dari ADP per glukosa.Anaerob obligat akan mati bila terdapat oksigen karena tidak adanya enzim superoksida dismutase dan katalase yang dapat mengubah superoksida berbahaya yang timbul dalam selnya karena adanya oksigen. . Bakteri anaerobik dan archaea menggunakan jalur ini dan beberapa jalur lainnya dalam melakukan fermentasi seperti: fermentasi asam propionat.Beberapa bakteri anaerobik menghasilkan toksin (racun) seperti toksin tetanus atau botulinum yang sangat berbahaya bagi organisme yang lebih besar. fermentasi butanediol.