LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UMUM PEWARNAAN SEL (BAKTERI DAN JAMUR) DAN PEWARNAAN ENDOSPORA

KELOMPOK I Ahmad Soni 0810910002

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2010

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Selain itu bakteri yang hidup akan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Sedangkan, untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitianpenelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu, bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan merah sedangkan yang positif berwarna ungu (Levine, 2000). Praktikum persiapan pembuatan apusan dan teknik pewarnaan gram sangat penting dilakukan karena untuk pengamatan biakan dari koloni mikroba dan biakan jamur dapat dilakukan dengan mudah dan baik. Pewarnaan ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospora yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Pelczar dan Chan, 2007).

.1.2 Tujuan Tujuan dilakukannya praktikum mengenai pewarnaan sel (bakteri dan jamur) dan pewarnaan endospora ini antara lain : 1) Mempelajari teknik pembuatan sediaan apusan (preparat) 2) Mempelajari proses pewarnaan struktur sel bakteri 3) Mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri 4) Memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaan dan memahami reaksi kimiawi di dalam prosedur tersebut 5) Mempelajari proses pewarnaan struktur sel jamur (kapang) 6) Mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel jamur (kapang) 7) Memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaan dan memahami reaksi kimiawi di dalam prosedur tersebut 1.3 Manfaat Manfaat yang diperoleh setelah mengikuti praktikum mengenai pewarnaan sel bakteri dan pewarnaan endospora ini adalah praktikan akan mempunyai keterampilan dan keahlian dalam hal pewarnaan sel bakteri dan pewarnaan endospora yang banyak dilakukan dalam laboratorium-laboratorium mikrobiologi dengan metode yang disesuaikan dengan alat dan biaya yang ada.

Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. yang sudah difiksasi. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana. batang (silindris). bulat. 2007).1 sampai 0. 2004). Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1. Umumnya ukuran bakteri sangat kecil. dinamakan pewarnaan sederhana. serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna. Pemberian warna pada bakteri atau jasad. batang dan spiral. Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. . Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran. untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola. Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna.BAB II TINJAUAN PUSTAKA Bakteri merupakan organisme prokariot. Sel sel individu bakteri dapat berbentuk seperti bola/elips. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0. Sel bakteri memiliki panjang yang beragam. sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain.jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis.000 X atau lebih (Waluyo. memperjelas ukuran dan bentuk bakteri. atau olesan. susunan dan keadaan struktur internal dan butiran.3 µm. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan. bentuk. Bentuk bakteri bermacam – macam yaitu elips. 2007). atau spiral (heliks) (Pelczar & Chan.

2008). Kristal violet. 1991). . salah satu di antaranya berwarna. Pada zat warna yang bersifat basa. Contoh zat warna basa adalah methylen blue. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna. Pewarnaan gram merupakan metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Umsl. netral red. safranin. COOHCOO?. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. pewarnaan diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo. pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram. jika bakteri itu diwarnai. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi. maka disebut zat warna asam. Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Karena sel bakteri tak berwarna di atas latar belakang yang berwarna (Volk & Wheeler. safranin dan metilin blue adalah beberapa zat pewarna basa yang biasa digunakan. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-.Na+). SO4-. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal. Jadi. Jadi. mewarnai bakteri dengan zat pewarna asam akan menghasilkan hanya pewarnaan pada daerah latar belakang saja. peluntur warna. substrat. warna akan terdapat pada ion negatif (zat pewarna. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. 1993). Sebaliknya zat pewarna asam ditolak oleh muatan negatif bakteri menyeluruh.Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Hubungan antara bakteri dengan zat pewarna basa yang menonjol disebabkan terutama oleh adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. dan lainlain. Jika warna terdapat pada ion negatif. maka disebut zat warna basa. muatan negatif dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa. CH3COO-. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana. warna terdapat pada ion positif (zat pewarna+ Cl-) dan pada pewarna asam.

Pewarnaan gram ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang dokter kebangsaan Denmark Christian Gram (membuat zat pewarna khusus) pewarna tersebut merupakan pewarna differensial karena dapat membagi bakteri menjadi dua kelompok fisiologi. setelah satu menit dibilas dan kemudian akan diberi laputan alkohol 95% selama 30 detik. yaitu bakteri gram positif . Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini. yang akan memudahkan untuk identifikasi. setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan berwarna biru. kemudian dibilas dan diberi pewarna safranin atau bismarck (untuk buta warna merah) selama 1 menit. Salmonella. Prosedur pertama dari pewarnaan gram ini adalah memberi pewarna kristal violet. Bakteri Gram positif membentuk kompleks Kristal iodine yang berwarna biru. Contoh bakteri Gram negative adalah Neisseria. bakteri Gram positif akan berwarna ungu. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal violet. struktur. Bakteri gram positif akan terwarna ungu (kristal violet) dan bakteri gram negatif akan terwarna merah (safranin) (Umsl. Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan Gram dan Ziehl‐Nelsen. dll. Clostridia. Klebesiella. dll (Cappuccino & Sherman. Zat pewarna kristal violet dan yodium akan membentuk senyawa yang kompleks. Setelah itu ditambah alkohol. setelah 1 menit dibilas dan kemudian akan diberikan pewarna yodium. Vellonella. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi. Corynebacterium Sedangkan dhypteriae. negatif akan Peptostreptococcus. Beberapa bakteri akan melepaskan zat pewarna dengan mudah apabila dicuci dan beberapa bakteri yang lain zat pewarna akan bertahan walaupun dicuci dengan alkohol 95%. Hemophillus. Gram Peptococcus. 1983). Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit infeksi. dan karakteristik bakteri. Setelah di tambahkan safranin. Proses pewarnaan gram ini memerlukan 4 jenis reagen. Bacillus. Stapilococcus. 2008). Contoh bakteri Gram positif adalah Streptococcus. Shigella. bakteri terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian safranin akan memberikan warna merah pada bakteri Gram negatif.

Larutan yang biasa dipakai adalah ungu kristal. bila komponen dinding sel kuat mengikat warna. maka pori‐pori akan membesar dan tidak mengikat pewarna. Gram B (cokelat) (Iodium. Sedangkan bakteri Gram negatif hanya memiliki 1‐2 lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas dinding sel yang lebih besar. yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. Micobacterium leprae. conttohnya adalah Micobacteriom tuberculosis. maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar. Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel. berupa pewarna basa. Rhodococcus. Gram C (Aseton. Aquades). Hal ini menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna. Hal ini akan mengecilkan pori‐pori sehingga menghasilkan kompleks kristal iodium. Alcohol. jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. lartan iodium. Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada dinding sel bakteri Gram negatif. Aquades). Nocardia. alkohol dan safranin (Tracy. maka warna akan tercuci. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian alcohol. Reagen pertama disebut warna dasar. Ammonium oksalat. Aquades). Gram D (merah) (Safranin. Pewarnaan Gram terdiri atas Gram A (violet) (Kristal violet. bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat. Kalium iodide. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan sebanyak 30 lapisan sehingga permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang. Pewarnaan ZN digunakan untuk mengidentifikasi infeksi yang disebabkan oleh bakteri tahan asam. Sedangkan bakteri Gram positif akan mengalami denaturasi selama pemberian alcohol. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Legionella mycdatci. Mycobacterium marinum dan Mycobacterium ulcerans yang tumbuh pada 31C dan menginfeksi kulit. Aalkohol. Alcohol). Reagen terakhir adalah warna pembanding. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Mycobacterium atypical seperti Mycobacterium avium intraseluler / Mycobacterium avium complex yang tumbuh pada 41C yang menyerang sistem imun. Gordonia / . 2005).dan bakteri gram negatif. Tsukamurella.

dan ZN‐C (biru) (Methylen blue. Cryptosporidium. Sarcocytis. pewarnaan kapsul. Hasilnya berwarna merah. Aquades). Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut: pewarnaan sederhana. pewarnaan differensial (pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam).1 Pewarnaan Sederhana (Gozali. Asam mikolat merupakan asam lemak ranai panjang yang terdiri atas 34‐90 karbon. Fenol. ZN‐B (tidak berwarna) (HCl. Pewarnaan ZN terdiri dari ZN‐ A (merah) (Basic fusion. dan Gordonia. 2009) . Alcohol. Sifat tahan asam pada bakteri tahan asam disebabkan karena dinding selnya terdiri atas peptidoglikan.Gordona. dan lipid (50%‐ nya tersusun atas asam mikolat). Tsukamurella. Aquades) (Madigan. pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel. Isospora. pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri (pewarnaan Neisser (granula volutin). Cyclospora. arabinogalaktan. 2. Rhodococcus. Etil alcohol). pewarnaan yodium (granula glikogen) dan pewarnaan negatif (Gozali. jadi perlu diberi pewarnaan kedua berupa counter stain. pewarnaan spora. Contoh bakteri than asam yang tidak cocok pada pewarnaan ZN tetapi cocok pada Kinyoun adalah Nycordia. 2003). 2009) Gambar 2. Hasil pewarnaan ZN akan mengidentifikasikan : 1. dll. Bakteri tahan asam Bakteri tahan asam baru akan terkarakterisasi setelah pewarnaan setelah pemberian asam‐ alkohol. Bakteri tidak tahan asam Hasilnya adalah berwarna biru karena dekolorisasi pada pewarnaan pertama oleh asam‐alkohol.

Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Hadiotomo. 1990) . maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia. 1990) Gambar 2.2 Pewarnaan Negatif (Hadiotomo. metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap.Pewarnaan negatif.

Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. 2009). Bakteri yang menghasilkan spora pada umumnya tahan terhadap pewarnaan. 2008). Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan spora secara umum. Setelah perlakuan malachite green. Endospora merupakan struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri. sedangkan bakteri yang tidak memiliki spora dan hanya memiliki sel vegetatif tidak tahan terhadap pewarnaan (Partic. Karena kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora.Gambar 2.3 Pewarnaan Gram (Jason. Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya. endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses pemanasan. pemanasan dan keadaan asam. biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan . sehingga harus menggunakan pewarnaan spesifik. maka endospra berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop. tetapi sekali diwarnai. Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarnaan biasa. Endospora merupakan struktur yang tahan terhadap keadaan lingkungan yang ekstrim misalnya kering. Struktur endospora sangat bervariasi pada setiap spesies. zat warna tersebut akan sulit hilang.

Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri. akan mengikat kuat senyawa pewarna. pengeringan. Bakteri penghasil spora tahan terhadap pewarnaan. cat tersebut (misalnya safranin) sel spora tidak dapat menerimanya karena sudah terikat dengan cat pertama. 1992). Akhirnya warna bakteri spora adalah hijau. sehingga harus digunakan pewarna spesifik dan yang biasa digunakan adalah malachite green. 2005). Disebut demikian karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme. dsb) dari bahan-bahan lainnya yang ada pasa olesan yang diwarnai (Hadiotomo. 1990). setelah diwarnai oleh suatu warna. vibrio. radiasi. Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat positif). pembekuan. Karena kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya. Oleh karena itu. Kondisi yang terus memburuk membuat endospora dibebaskan dari degenerasi sel vegetatif dan menjadi sel independen yang disebut spora yang diakibatkan komposisi lapisan kimia spora bersifat tahan terhadap efek-efek merusak. merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarnapewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofil (suka akan basa). Untuk pewarnaan selanjutnya. spora bebas kembali untuk aktif secara metabolik dan sel vegetatif berkurang resisten melalui germinasi. Sporogenesis dan germinasi tidak dimaksudkan untuk reproduksi tetapi hanya mekanisme yang menjamin ketahanan sel dibawah kondisi lingkungan (Suriawiria. misalnya malachite green. Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacammacam tipe morfologi (coccus.menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya (Fardiaz. Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarna biasa. maka endospora berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop. Bakteri . misalnya pemanasan berkelebihan. basillus. Pewarnaan sederhana. dan agent kimia lainnya sehingga diperlukan pewarnaan khusus secara mikrobiologi dan ketika kondisi lingkungan kembali normal.

.yang tidak berspora cenderung tidak tahan pengecatan karena hanya memiliki sel vegetatif. 1994). Oleh karena itu. Saat diwarnai oleh malachite. hasil pewarnaan akhir adalah merah muda dari safranin (Assani. sel vegetatif dapat mengikat warna tetapi dapat luntur setelah dilunturkan karena ikatannya tidak kuat. sel vegetatif mudah mengikat warna kembali. Setelah pewarnaan selanjutnya dengan safranin.

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan.1 Waktu dan Tempat Praktikum mengenai “Pewarnaan Sel (Bakteri dan Jamur) dan Pewarnaan Endospora” dilaksanakan pada hari Kamis 15 April 2010 pada pukul 13. Setelah kering. kemudian bakteri hasil isolasi diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu kali pengambilan yang telah di tehnik aseptis dan diletakkan di atas kaca obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu kali yang pengambilannya dengan jarum ose. Preparat apusan siap diwarnai dan diamati. apusan digenangi dengan cat gram D selama 1 menit. Jurusan Biologi.1 Pembuatan Apusan Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70%. Setelah kering.2. apusan digenangi dengan cat gram B selama 1 menit.2 Teknik Pewarnaan Gram Apusan dicat dan digenangi dengan cat gram A selama 1 menit. Setelah kering. sisa cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan.BAB III METODE PRAKTIKUM 3.35 WIB. Malang. 3. cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. 3. Universitas Brawijaya. apusan ditetesi dengan cat gram C selama 30 detik. cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. bertempat di Laboratorium Mikrobiologi.00 – 16. Kemudian di fiksasi secukupnya hingga kering.2 Cara Kerja 3.2. Kemudian preparat siap diamati dibawah mikroskop .

Preparat ditiriskan dengan kertas saring dan diamati di bawah mikroskop.2. kemudian jarum ose diangkat beberapa sentimeter untuk mengetahui apakah cairan berlendir atau tidak.3.3 Konfirmasi Hasil Cat Gram Dengan KOH Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70%.2. Kemudian genangi preparat dengan pewarna safranin selama 1 menit. subtilis diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu kali pengambilan yang telah di tehnik aseptis dan diletakkan di atas kaca obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu kali pengambilan dengan jarum ose. 3.4 Pewarnaan Endospora Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70%. . endospora akan tampak berwarna hijau dan sel vegetatif akan tampak berwarna merah. Kemudian campurkan dengan mengaduknya. kemudian bakteri yang akan dikonfirmasi diambil sebanyak satu ose dan diletakkan pada gelas obyek yang telah terdapat larutan KOH sebanyak satu jarum ose. di cuci dengan air mengalir. kemudian B. selanjutnya preparat di cuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Kemudian di fiksasi secukupnya hingga kering. Setelah itu dinginkan preparat sebentar. Selanjutnya gelas obyek dipanaskan di atas air mendidih dengan menutup preparat dengan kertas saring dan ditetesi dengan malakit hijau selama 10 menit.

cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Cat gram C akan melarutkan warna sebelumnya.1. 2003). cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. apusan digenangi dengan cat gram B selama 1 menit. maka preparat akan berwarna bening.BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Pembuatan Apusan Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70% agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat pembuatatn apusan. sedangkan bakteri gram positif akan berwarna ungu. sisa cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Bakteri gram negative akan berwarna kemerahan. agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat pembuatatn apusan dan diletakkan di atas kaca obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu kali pengambilan dengan jarum ose.1. . 4. Setelah kering. cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan.2 Teknik Pewarnaan Gram Apusan dicat dan digenangi dengan cat gram A selama 1 menit. kemudian bakteri hasil isolasi diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu kali pengambilan yang telah di tehnik aseptis. Cat gram B akan menguatkan ikatan antara pewarna dengan dinding sel bakteri. agar pewarna sebelumnya tidak bercampur dengan pewarna yang lain yang akan digunakan (Umsl. Setelah kering.1 Analisa Prosedur 4. Kemudian di fiksasi secukupnya hingga kering. apusan digenangi dengan cat gram D selama 1 menit. Kemudian preparat siap diamati dibawah mikroskop. agar bakteri yang akan digunakan mati namun organ dan struktur tidak rusak (Madigan. Setelah kering. apabila preparat bakteri merupakan gram negative. 2008). apusan ditetesi dengan cat gram C selama 30 detik.

subtilis diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu kali pengambilan yang telah di teknik aseptis dan diletakkan di atas kaca obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu kali pengambilan dengan jarum ose.1. Kemudian campurkan dengan mengaduknya. Jika cairan tersebut berlendir maka bakteri tersebut merupakan bakteri gram negatif dan jika cairan tersebut tidak berlendir maka bakteri tersebut bakteri gram positif (Umsl. Kemudian genangi preparat dengan pewarna safranin selama 1 menit. .4. kemudian jarum ose diangkat beberapa sentimeter untuk mengetahui apakah cairan berlendir atau tidak. 2008). agar endospora dapat berkembang (memudahkan pengamatan). gelas obyek dipanaskan dengan diletakkan pada ram kawat di atas air mendidih hingga timbul uap air dengan menutup preparat dengan kertas saring dan ditetesi dengan malakit hijau agar endospora yang berkembang dapat terwarna hijau dan agar endospora tidak mati (menjaga agar tetap lembab (tidak kekeringan)) selama 10 menit. 4.3 Konfirmasi Hasil Cat Gram Dengan KOH 3% Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70% agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat perlakuan. masuknya pewarna dalam endospora di bantu dengan. kemudian bakteri yang akan dikonfirmasi diambil sebanyak satu ose dan diletakkan pada gelas obyek yang telah terdapat larutan KOH sebanyak satu jarum ose.1. selanjutnya preparat di cuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. kemudian B. konfirmasi dilakukan untuk memastikan bakteri tersebut gram negatif atau positif. Setelah itu dinginkan preparat sebentar. agar bakteri yang akan digunakan mati namun organ dan struktur tidak rusak. di cuci dengan air mengalir agar endospora dapat terwarna dengan baik.4 Pewarnaan Endospora Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70% agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat perlakuan. Kemudian di fiksasi secukupnya hingga kering. Selanjutnya apusan bakteri dengan pewarna malakit hijau.

Data hasil pewarnaan bakteri dan endospora No Isolat kel Bentuk Gram Perbesaran Uji KOH 3% Endospora B.3 Data Hasil Pengamatan Tabel 1. 4. 5 6 4 BP 8.subtilis 1 BP 1. Data hasil pewarnaan kapang No Isolat Kelompok Spora Sporan gium 1 KNP 6. cabang.1 3 4 3 BNP 3.1 1 Bentuk : Bulat Ada Tidak bersekat.2. tidak rapat Ujung : Tumpul Jenis : Satu 2 Bentuk : Bulat Ada Tidak bersekat.Preparat ditiriskan dengan kertas saring dan diamati di bawah mikroskop. cabang. 2008). tidak rapat Ujung : Tumpul Ada Hifa Sporan giofor Ada .3 1 2 2 BNP 1.1 7 8 Basil Basil Basil Basil Basil Basil Basil Basil + + 1000x 1000x 1000x 1000x 1000x 1000x 1000x 1000x Ada Ada Tidak ada Tidak ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Tabel 2. endospora akan tampak berwarna hijau dan sel vegetatif akan tampak berwarna merah (Scienceprofonline.

1 5 Bentuk : Lonjong Tidak ada Ujung : Lancip Jenis : Dua : Besar dan Kecil 6 Bentuk : Lonjong Tidak ada Ujung : Lancip Jenis : Dua : Besar dan Kecil 4 KP 5. rapat Tidak ada Bersekat. cabang. tidak rapat Ujung : Tumpul Jenis : Satu 8 Bentuk : Bulat Ada Tidak bersekat.3 3 Bentuk : Bulat Tidak ada Tidak bersekat. cabang. tidak rapat Ada Ada Bersekat.Jenis : Satu 2 KP 5. rapat Tidak ada Tidak ada Tidak ada . cabang. cabang. cabang. 7 Bentuk : Bulat Ada Tidak bersekat. tidak rapat Ujung : Tumpul Jenis : Satu 3 KP 4. tidak rapat Ujung : Tumpul Jenis : Satu 4 Bentuk : Bulat Tidak ada Tidak bersekat. cabang.1.

Ada yang memiliki sporangiofor dan ada pula yang tidak memiliki sporangiofor. kalium yodida 2 gram. aquades 80ml. 2007). Hal ini menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan morfologi yang berarti antara bakteri dan kapang yang tercemar maupun yang tidak tercemar. Gram A merupakan cat yang terdiri dari campuran kristal violet 2 gram. etil alkohol 95% 20 ml. dan gram D.1 merupakan bakteri gram negatif dan berbentuk basil jika diamati pada mikroskop dengan perbesaran 1000x. baik yang tercemar maupun yang tidak tercemar pestisida akan mempunyai karakteristik yang sama berdasarkan hasil pewarnaan yang telah dilakukan. dan biasa digunakan dalam teknik pewarnaan microscopy Certistain (Merck. Bakteri dan kapang. Preparat BNP 1. Pada pewarnaan Gram yang dilakukan digunakan gram A.1 merupakan bakteri gram positif. dimana bakteri ini mempunyai endospora yang ditandai dengan warna hijau. Kristal violet merupakan bahan kimia dengan rumus kimia C18H15N3O3. ada pula hifa yang bersekat dengan cabang rapat. akuades 300ml. namun terdapat bentuk yang berbeda yang dikarenakan kurang telitinya praktikan dalam mengamati bentuk bakteri. bukan merupakan bahan kimia berbahaya. gram B. ujung tumpul dan lancip.2 dan BP 8. Gram B merupakan larutan mordan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh .3 Analisa Hasil Data hasil pengamatan menunjukkan bahwa isolate BP 1.Ujung : Tumpul Jenis : Satu 4. Hifa ada yang bersekat dengan cabang yang tidak rapat. Gram B merupakan merupakan cat yang terdiri dari campuran yodium 1 gram. Data hasil pengamatan pada pewarnaan kapang menunjukkan bahwa terdapat variasi bentuk pada kapang tersebut antara lain bentuk spora yang bulat dan lonjong. Ada yang memiliki sporangium dan ada pula yang tidak mempunyai sporangium. ammonium oksalat 0. gram C. Pewarnaan endospora menggunakan bakteri Bacillus subtilis.8 gram. terdiri atas satu macam atau dua macam spora.3. BNP 3.

penambahan larutan mordan menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks kristal violet-yodium. Oleh sebab itu. 2008) No. Pada pewarnaan gram . Safranin pada gram D tidak akan menyebabkan perubahan warna pada bakteri positif karena persenyawaan kompleks kristal violet-yodium tetap terikat pada dinding sel. Pada bakteri gram negatif penambahan safranin akan menyebabkan warna bakteri berubah menjadi merah karena warna ungu yang dihasilkan oleh kristal violet-yodium telah luntur dengan lisisnya membran sel sehingga safranin dapat terikat. dan akuades 90ml. Tabel 3. Tanpa penambahan larutan mordan. zat warna kristal violet akan larut saat penambahan larutan pemucat. Perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif (Filzahazny.bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat. etil alkohol 95% 10ml. gram D atau zat pewarna kedua berfungsi sebagai pembeda terhadap zat warna kristal violet (Lay. mempersulit pelarutan zat warna. Gram C merupakan larutan pemucat . memperjelas warna dari zat warna tersebut. larutan pemucat berfungsi untuk melarutkan lipida pada membrane bakteri gram negative yang akan menyebabkan pori-pori sel membesar sehingga meningkatkan daya larut persenyawaan kristal violet-yodium. 1994). 1 2 3 Perbedaan Dinding sel Kadar lipid Resistensi terhadap alkali (1% KOH) 4 Kepekaan terhadap Yodium Toksin yang dibentuk 5 Lebih peka Eksotoksin Kurang peka Endotoksin Bakteri Gram Positif (+) Lapian peptidoglikan tebal 1-4% (Lebih rendah) Lebih pekat Bakteri Gram Negarif (-) Lapian peptidoglikan lebih tipis 11-22% (Lebih tinggi) Larut . Gram D merupakan cat yang terdiri dari campuran safranin 0. 25 gram . Gram C merupakan cat yang terdiri dari campuran aseton 50ml dan etil alkohol 95%50ml.

dan ukuran endospora. yang terdiri dari cross-linked keratin. yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik. Tipe subterminal berarti lokasi endosporanya diantara tengah dan pinggir dari sel vegetatif. Contohnya Bacillus subtilis memiliki endospora yang terletak di subterminal (Scienceprofonline. 2008). Spora ini memiliki resistensi yang tinggi terhadap pewarnaan. . Endospora merupakan metode pertahanan hidup yang bukan bertujuan untuk reproduksi. Endospora dapat berukuran lebih besar ataupunkecil dari sel vegetatif yang terdiri dari lapisan protein yang terbuat dari keratin. subterminal dan sentral. Letak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi. Tipe sentral atau tengah merupakan lokasi dari sel vegetatif yang letaknya tepat di tengah. lokasi. Komponen endospora mempunyai resistan terhadap agen kimia yang kuat pada spore coat.6 Resistensi terhadap tellurit Lebih tahan Lebih peka 7 Sifat tahan asam Ada yang tahan asam Tidak ada yang tahan asam 8 Kepekaan terhadap penisilin Lebih peka Kurang peka 9 10 11 12 Kepekaan terhadap streptomisin Penghambatan warna Ketahanan terhadap fisik Kebutuhan nutrien Tidak peka Lebih dihambat Lebih tahan Kompleks Peka Kurang dihambat Kurang tahan Relatif Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi. Tipe utama diantara terminal. prosedur pewarnaan dengan malakit hijau adalah dengan pemanasan. Beberapa endospora mempunyai diameter lebih besar daripada sel. dimana sel tersebut akan nampak menggembang pada letak endosporanya. Identifikasi dapat dilakukan dengan melihat morfologi. Tipe terminal memiliki pengertian letak sel vegetatif diantara ujung dan pinggir dari sel vegetatif.

Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis. Kelebihan dan kekurangan pengecatan gram (Nirwati. memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat gram mempunyai makna dignostik. uretral. dan air suling 40 ml (Waluyo. 2007). . asam laktat 20 ml yang berfungsi untuk menjernihkan latar belakang dan mempertajam struktur kapang. kristal fenol + air panas 70oC untuk membunuh jamur. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal.075 g berfungsi untuk memberi warna pada sel kapang. Hal ini dikarenakan bakteri gram positif dan negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika. 2001): Kelebihannya adalah: pengecatan gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik. gliserol 40 ml berfungsi menjaga fisiologi sel dan menjaga sel terhadap kekeringan.Komposisi dari Lactophenol Cotton Blue yaitu kristal. maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonoro. Kekurangannya adalah pengecatan gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari 104 ml per ml. cotton blue 0. Misalnya pada pemeriksaan gram ditemukan gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana). sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan kepekaan bakteri terhadap antibiotik).

dan karakteristik bakteri. 5. Setelah itu ditambah alkohol. tipe utama diantaranya ialah terminal. Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit infeksi. kemudian difiksasi. Bakteri Gram positif membentuk kompleks Kristal iodine yang berwarna biru.2 Saran Diharapkan praktikan teliti dan hati-hati dalam pemurnian sebab dikhawatirkan dapat terjadi kontaminasi. bakteri Gram positif akan berwarna ungu. Letak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi. struktur. setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan berwarna biru. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi. Setelah di tambahkan safranin. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi. Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan Gram dan Ziehl‐Nelsen. subterminal dan sentral.1 Kesimpulan Teknik pembuatan sediaan apusan (preparat) dapat dilakukan dengan mensuspesikan biakan bakteri dengan aquades. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal violet. . yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik.BAB V PENUTUP 5.

Pearson Education. Mikrobiologi Pangan I. Cresyl Violet Acetate. United State of America.s1LZb0AAAEWZuEfVhTl. Yogyakarta. 2007. B. & Natalie. 2003. Universitas Gadjah Mada press. diakses . Amir.T.html .DAFTAR PUSTAKA Assani. M.temple. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Diakses pada tanggal 26 April 2010 Lay. inc.co. M. Jakarta. New York. Pewarnaan gram. Cappuccino. Merck .merckchemicals. 1983. S.htm. S. 2009. 2009. Jason.id/cresyl-violetacetate/MDA_CHEM105235/p_zyOb. pada tanggal 26 April 2010 Nirwati.. Analisis Mikroba di Laboratorium.com/Penganta-tentang-bakteri. http:/wordpress. 1992. Fardiaz.edu/~jasoncg/ID/ microreporting. Addison-Wesley Publishing Company. Gramedia. http://astro. 1990. Diakses pada tanggal 26 April 2010 Gozali.W. New York. 2008. Jakarta : Pt Gramedia.com/gram/pewarnaan-gram-prinsip.blogspot. Ratna Siri. Levine. 1994. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. An Introduction to Laboratory Technique in Bacteriology. Jakarta. S. . Hera. http://www. Pembuatan preparat dan pengecatan dalam petunjuk praktikum mikrobiologi Fakultas kedokteran Universitas Gadjah Mada. 2001. Mikrobiologi Kedokteran.si d=2XfBHZapUlXHHd9B9vTSj5pCnREAl69HlgSHhO2CnREAkWqXGgJCVGG. PT Raja Grafindo Persada. G. Madigan. McMillan Company. Diakses pada tanggal 26 April 2010 Hadiotomo. The Gram Stainning. Microbiology A Laboratory Manual. J.htm.gozali. Jakarta Filzahazny. http://www.. 1994. 2000. Brock Biology of Microorganism.

Mc Graw Hill Book Company. Papas Sinar Sinanti. www. Pewarnaan endospora. Diakses pada tanggal 26 April 2010 Umsl. Jakarta Waluyo.pdf. 2005. 1993. Chan. Mikrobiologi Dasar. Jakarta. Malang. U.k12. Universitas Muhammadiyah Malang Press. Sutedjo.S. E. Jakarta.umsl. New York. 2008. Rineka Cipta. 2007.C. Diakses www.blogspot.edu/~microbes/pdf/stainingbacteria. M. . Gram Staining.Partic. Penerbit Erlangga. Suriawiria. Elements of Microbiology. J. Mikrobiologi Tanah. Tracy. pada tanggal 26 April 2010 Volk & Wheeler.tracy. 1991. 2008. 2007 .us/thsadvbio/pdfs/gram %20stain.pdf.com/2008/08/pewarnaan endospora. Diakses pada tanggal 26 April 2010 Pelczar..ca.dunia- mikro. L . M. Mikrobiologi Dasar. Mikrobiologi Umum . Li. http://www. Staining Bacteria. 2005.