LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UJI POTENSI ANTIMIKROBIAL MENGGUNAKAN METODE DILUSI

KELOMPOK C2 I Putu Riska Winatha Fajar Handayani Arum Wahyuningsih Wulan Putri Asih Dita Pertiwi A.D 08613007 09613149 09613152 09613153 09613155

LABORATORIUM FARMAKOLOGI DAN TERAPI JURUSAN FARMASI FAKULTAS MIPA UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA 2011/2012

UJI POTENSI ANTIMIKROBIAL MENGGUNAKAN METODE DILUSI

I.

TUJUAN Mahasiswa dapat menentukan MIC dan MBC suatu antibiotika terhadap bakteri menggunakan teknik dilusi dan mikrodilusi

II.

LATAR BELAKANG Mikroorganisme terdapat di berbagai habitat, seperti dalam tanah, lingkungan akuatik dan atmosfer, selain itu juga terdapat di permukaan tubuh, di dalam sel pencernaan makanan, mulut, hidung dan bagian-

bagian tubuh yang lain. Mikroorganisme dapat hidup jika pada kondisi yang sesuai, yaitu kecukupan mendapat makanan, kelembapan dan suhu. Mikroorganisme tidak dapat dipisahkan dengan lingkungan abiotik dan biotik dari suatu ekosistem karena peranannya sebagai pengurai. Mikrobia dapat menyebabkan banyak bahaya, karena dapat menginfeksi organisme lain mulai dari infeksi ringan sampai kepada kematian. Patogenesis infeksi bakteri meliputi permulaan awal dari proses infeksi hingga mekanisme timbulnya tanda dan gejala penyakit. Ciri- ciri bakteri patogen yaitu kemampuan untuk menularkan, melekat pada sel inang, menginvasi sel inang dan jaringan, mampu untuk meracuni serta mampu untuk menghindari dari sistem kekebalan inang. Beberapa infeksi disebabkan oleh bakteri yang secara umum dianggap patogen tidak menampakkan gejala (asimptomatik). Suatu penyakit terjadi jika bakteri atau reaksi imunologi yang ditimbulkannya menyebabkan suatu bahaya bagi seseorang. Maka untuk menghambat daya infeksi agar tidak berkelanjutan lebih tinggi, bahkan kematian, perlu adanya antibakteri atau antibiotik sebagai obatnya.

III.

DASAR TEORI Antibiotik adalah senyawa kimia khas yang dihasilkan oleh organisme hidup, termasuk turunan senyawa dan struktur analognya yang dibuat secara sintetik, dan dalam kadar rendah mampu menghambat proses penting dan kehidupan satu spesies atau lebih mikroorganisme (Siswandono,2000). Berdasarkan sasaran bakteri, antibiotic dibedakan menjadi : a. Antibiotik spectrum sempit (narrow spectrum) yaitu antibiotic yang hanya ektif terhadap mikroba pathogen terbatas. Contohnya : ampisilin, streptomisin, sefalosporin. b. Antibiotik spectrum luas (broad spectrum) yaitu antibiotic yang efektif terhadap berbagai macam pathogen. Contohnya : eritromisin, gentamisin, isoniazid (Ganiswara, 2005). Mekanisme aksi antibiotic : 1. Menghambat pembentukan dinding sel. Contoh : penisilin, ampisilin, metsilin, sefalosporin. 2. mengganggu pembentukan membrane sel. Contoh : polimiksin B. 3. menghambat sintesis protein. Contoh : streptomisin, gentamisin, kloramfenikol. 4. Menghambat sintesis asam nukleat. Contoh : siproploksazin, nifampin. 5. antagonis metabolit contoh : isoniazid (Jawetz,2001).

Resistensi bakteri adalah suatu sifat tidak terganggunya kehidupan sel bakteri oleh antimikrobia. Secara umum resistensi di bagi dalam 3 kelompok :

A. Resistensi genetic Terjadi mutasi spontan pada gen bakteri sehingga terjadi perubahan pada bakteri yang semula sensitive terhadap suatu antimikrobia

menjadi resisten. Bakteri dapat berubah menjadi resisten akibat memperoleh suatu elemen pembawa factor resisten. Cara transformasi factor resisten bakteri terjadi dengan jalan bekteri menginporlasi factor resisten langsung dari media sekitarnya (lingkungan). B. Resisten non genetic Bakteri dalam keadaan istirahat, biasanya tidak dipengaruhi olah antimikrobia bakteri. Bakteri ini dikenal sebagai persistem. Bila berubah menjadi aktif kembali, bakteri kembali bersifat sensitive terhadap antimikroba semula. C. Resistensi silang Resistensi silang adalah keadaan resisten terhadap antimikroba yang juga memperlihatkan sifat resisten terhadap antimikroba yang lain. Pada resisten silang, sifat resistensi ditentukan oleh suatu lokus genetic. Resistensi silang biasanya terjadi antara antimikrobia dengan struktur yang hamper sama, misalnya antara beberapa derivate tetrasiklin. Mekanisme resisten kuman terhadap antimikroba ada 5 yaitu : 1. Perubahan tempat kerja obat pada mikroba. 2. Mikroba menurunkan permeabilitasnya sehingga obat sulit masuk ke dalam sel. 3. Mikroba membentuk jalan pintas untuk menghindari tahap yang dihambat oleh mikroba. 4. Meninggkatkan produk enzim yang dihambat oleh antimikroba. 5. Inaktivasi oleh mikroba.

Terbentuknya resistensi dapa dikurangi dengan cara: 1. Mencegah pemakaian antibiotic tanpa pembedaan kasus-kasus yang tidak membutuhkan antibiotic. 2. Menghentikan penggunaan antibiotic pada infeksi biasa atau sebagai obat luar. 3. Mengguanakan antibiotic yang tepat dengan dosis agar infeksi cepat sembuh.

4. Menggunakan keefektifannya.

kombinasi

antibiotic

yang

telah

terbukti

5. Mengguanakan antibiotic yang lain bila ada tanda-tanda bahwa suatu organisme akan menjadi resisten terhadap antibiotic yang digunakan semula.

Penyebab mikroorganisme resisten terhadap antibiotic adalah 1. Pemakaian antibiotic yang tidak tepat. 2. Pengobatan yang tidak tuntas antau penghentian antibiotic sebelum bakteri benar-benar mati. 3. Pemakaian dosis obat antibiotic dibawah dosis terapi. 4. Bakteri bersifat resisten karena mutasi.

Penentuan kepekaan bacteria pathogen terhadap antimikrobia dapat dilakukan dengan salah satu dari dua metode pokok yakni dilusi atau difusi. 1. DILUSI PADAT ATAU CAIR Pada prinsipnya antibiotik diencerkan hingga beberapa konsentrasi. Pada delusi cair, masing-masing konsentrasi obat ditambah suspensi kuman dalam media. Sedangkan pada delusi pada tiap konsentrasi obat dicampur dengan media agar, lalu ditambah kuman (Lay, 1994).

2. DIFUSI Media yang dipakai adalah agar Mueller Hilton dan pada difusi ini ada beberapa cara yaitu : a. Cara Kirby Baeur 1. Ambil beberapa koloni kuman dari pertumbuhan yang diinkubasi selama 24 jam pada agar. Suspensikan ke dalam 0,5 ml BHI cair, inkubasi 5-8 jam pada suhu 37C.

2. Suspensi di atas di tambah aquades steril hingga kekeruhan tertentu sesuai dengan standar konsentrasi kuman, 108 CFU/ml. 3. Kapas lidi steril dicelupkan ke dalam suspensi kuman lalu di tekan-tekan pada dinding tabung hingga kapasnya tidak terlalu basah. Kemudian oleskan pada permukaan media agar hingga rata. 4. Letakkan paper disk yang mengandung antibiotik di atasnya. Inkubasi pada 37C selama 19-24 jam (Lay, 1994). b. SUMURAN 1. Pada langkah 1,2,3 sama dengan Kirby Bauer. 2. Pada agar dibuat sumuran dengan garis tengah tertentu dan kedalam sumuran tersebut di tetesi larutan antibiotik yang digunakan. 3. Inkubasi pada 37C selama 18-24 jam (Lay,1994). c. Cara Pour 1. pada langkah 1 dan 2 sama dengan cara Kirby Bauer. 2. dengan menggunakan ose khusus, ambillah satu mata ose dan masukkan dalam 4 ml agar base 1,5 % yang mempunyai temperatur 500 C (diambil dari waterbath). 3. Setelah suspensi kuman tersebut dibuat homogen, tuanglah pada media Mueler Hilton agar. 4. Inkubasi selama 15-20 jam dengan temperatur 37C (Lay, 1994). Bahan kimia yang digunakan dalam pengobatan (kemoterapeutik) menjadi pilihan bila dapat mematikan dan bukan menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Bahan kimia yang mematikan bakteri

disebut

bakterisidal,

sedangkan

bahan

kimia

yang

menghambat

pertumbuhan bakteri disebut bakteriostatik. Bahan antimicrobial dapat bersifat bakteriostatik pada konsentrasi rendah, namun bersifat bakterisidal pada konsentrasi tinggi. Bahan kemoterapeutik yang baik mempunyai daya mematikan mikroorganisme, namun tidak menyebabkan keracunan pada induk semang yang menggunakan bahan tersebut, bahan dengan sifat demikian memiliki toksisitas selektif. Luas wilayah jernih merupakan petunjuk kepekaan

mikroorganisme terhadap antibiotic. Selain itu, luasnya wilayah juga berkaitan dengan kecepatan berdifusi antibiotic dalam medium. Kecepatan berdifusi ini harus diperhitungkan dalam penentuan keampuhan antibiotic. Keampuhan antibiotic dapat ditentukan dengan melihat konsentrasi terendah antibiotic yang masih mampu mematikan atau menghambat pertumbuhan mikroortanisme pathogen. Metode penentuan keampuhan antibiotic ini disebut MIC (Minimun Inhibitory Concentration).

IV.

ALAT DAN BAHAN ALAT Tabung reaksi Gelas beker Gelas ukur Pipet tetes Mikropipet Erlenmeyer Autoclve LAF Bunsen BAHAN Media TSB (Trypticase Soy Broth/nutrien broth) Suspensi bakteri eschericia colli Antibiotik ampisilin

V.

CARA KERJA

A. TeknikDilusiCair

1. HariPertama Siapkan 7 buah tabung reaksi ( 2 tabung untuk kontrol dan 5 tabung untuk perlakuan)

Lakukan pengenceran larutan streptomisin/penisilin dengan menggunakan media TSB/NB sebagai pengencer. Seri pengenceran yang dibuat adalah 400 g/ml, 200 g/ml, 100 g/ml, 50 g/ml, dan 25 g/ml dengan volume akhir tabung adalah 2 ml. Inokulasikan setiap tabung (kecuali kontrol 1) dengan menggunakan 0,1 ml biakan E coli (24 jam, 10 8 CFU/ml). Inkubasi pada suhu 37C selama 24 jam.

2. Harikedua Amati tabung yang menunjukkan pertumbuhan dengan di kocok. apabila tabung keruh (+) berarti menunjukkan pertumbuhan, bila tabung jernih (-) berarti tidak terjadi pertumbuhan.

Laporkan hasilnya dalam bentuk tabel.

Pindahkan satu mata ose biakan dari tabung jernih (-) kedalam media TSB atau media TSA yang baru. Inkubasi pada suhu 37C selama 24 jam.

3. Hari ketiga

Amati tabung yang menunjukkan pertumbuhan dengan di kocok. apabila tabung keruh (+) berarti menunjukkan pertumbuhan, bila tabung jernih (-) berarti tidak terjadi pertumbuhan.

Laporkan hasilnya dalam bentuk tabel.

Tentukan konsentrasi bahan kimia yang bersifat bakteriostatik atau bakterisidal.

VI.

DATA DAN HASIL

Laporan Hasil Percobaan Jenis/jumlah sampel : Bakteri E.coli dan antibiotic amphicilin 1. Foto hasil Percobaan

Gambar. 1 Keterangan Gambar 1 : Tabung A : 400 g/ml Tabung B : 200 g/ml Tabung C : 100 g/ml Tabung D : 50 g/ml Tabung E : 25 g/ml (bening/tidak keruh = tidak terjadi pertumbuhan bakteri )

Gambar. 2 Keterangan : Tabung K (+) = tabung control positive berisi media + bakteri (keruh) Tabung K (-) = Tabung control negative berisi Aquades (bening)

2. Hasil data

Dilusi Cair Kadar sampel 400 g/ml 200 g/ml 100 g/ml 50 g/ml 25 g/ml Hasil (-) (-) (-) (-) (-)

Keterangan : (+) = tumbuh (-) = tidak tumbuh

3. Data ELISA

Tabung Kontrol (+) Kontrol (-) A B C D E

Absorbansi
0.360 0.103 0.105 0.101 0.104 0.094 0.092

4.

Presentase kematian sel bakteri

A.

B.

C.

D.

E.

VII.

PEMBAHASAN Untuk menentukan MIC dan MKC maka dilakukan teknik dilusi. Metode dilusi dibedakan menjadi 2 macam, yakni dilusi cair dan dilusi padat, perbedaanya terletak pada media pertumbuhan yang digunakan. Dilusi cair, menggunakan media tumbuh berupa agar yang cair, sedangkan dilusi padat menggunakan menggunakan media agar padat. Untuk menentukan MIC dan MKC pada bakteri E. Colly ini digunakan teknik dilusi cair. MIC merupakan konsentrasi terendah bahan antimikrobial yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri, untuk MKC merupakan konsentrasi terendah antibiotik yang mematikan bakteri. Bahan

antimikrobial yang bersifat menghambat pertumbuhan bakteri bila digunakan dalam kosentrasi yang kecil, namun apabila konsentrasinya besar dapat untuk membunuh bakteri. Dilusi cair memiliki kelebihan jika dibandingkan dengan teknik delusi. Kelebihan dilusi cair adalah dapat menentukan MIC dan MKC, sedangkan pada teknik difusi hanya dapat diketahui zona hambatnya. Metode dilusi juga memiliki kekurangan yaitu metode ini bersifat subjektif karena parameter yang digunakan adalah kekeruhan. Hari pertama praktikum melakukan inkubasi bakeri E. colly dimana dilakukan pengenceran pada 5 tabung reaksi yang berisi antibiotik ampicilin. Ampicilin merupakan golongan antibiotic Penisilin. Penisilin adalah antibiotika yang termasuk paling banyak dan paling luas dipakai. Golongan penisilin bersifat bakterisid dan bekerja dengan mengganggu sintesis dinding sel. Antibiotika penisilin mempunyai ciri khas secara kimiawi adanya nukleus asam amino-penisilinat, yang terdiri dari cincin tiazolidin dan cincin betalaktam. Spektrum bakteri terutama untuk bakteri Gram positif. Beberapa golongan penisilin ini juga aktif terhadap bakteri Gram negative. Sehingga antibiotic ini aktif dalam menghambat bakteri Eschericia colly. Konsentrasi antibiotik yang digunakan adalah 400g/ml. Dan untuk media agar yang digunakan adalah media TSB. Pengenceran hanya dilakukan dari tabung ketiga yng diambil dari tabung kedua. Untuk tabung

pertama dan kedua diambil langsung dari konsentrasi antibiotik 400g/ml.Pengenceran yang dilakukan adalah 400g/ml, 200g/ml, 100g/ml, 50g/ml, 25g/ml. Dua tabung yang lain digunakan sebagai kontrol, tabung 1 berisi media agar cair dengan aqudes, dan tabung yang lain berisi media cair dengan bakteri. Dan dinnkubasi selama 24 jam, dengan suhu 370c. Suhu 370c adalah menyesuaikan dengan suhu tubuh pada manusia, sedangakan waktu 24 jam dalah waktu maksimum pertumbuhan bakteri. Pada praktikum kali ini setelah dilakukan teknik dilusi pada hari pertama dan tabung berisi biakan berbagai konsentrasi antibiotik di inkubasi selama 24 jam, maka tabung dengan jumlah konsentrasi antibiotik terendah yang jernih menunjukkan MIC (Minimum Inhibitory

Concentration). Dari hasil praktikum didapatkan semua tabung jernih kecuali tabung berisi kontrol positif. Tabung ini berisi media dan sample bakteri, kontrol positif ini untuk melihat apakah bakteri yang digunakan masih bagus, kekeruhan media pada tabung kontrol positif ini menandakan bakteri masih dalam keadaan baik. Semua tabung dari konsentrasi 400, 200, 100, 50, 25 g/ml tidak menunjukkan pertumbuhan bakteri, menurut definisi dari MIC adalah kadar terendah antibiotik yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri, maka kadar hambat minimum adalah 25 g/ml. Kekeruhan menunjukkan bakteri masih dalam keadaan baik. Kekeruhan memiliki standar brown atau Standar Kekeruhan McFarland. Standar McFarland berada dalam bentuk skala yang bernomor dari 1 sampai 10, yang menjelaskan konsentrasi spesifik dari bakteri per mL. Ini didesain untuk digunakan dalam mengestimasi konsentrasi bakteri Gram negatif. Kekeruhan larutan bakteri pada tiap tabung kurang lebih sesuai dengan nomor skala McFarland yaitu kekeruhan bakteri pada konsentrasi

2,1 x 109/mL. jadi penambahan bakteri pada tiap tabung diperlukan standar McFarland agar dihasilkan konsentrasi yang sama sehingga saat diinkubasi dan dibaca hasil presentase kematian bakteri didapatkan hasil yang benar dalam perhitungan presentase kematian bakteri. Selanjutnya media dimikropipet sebanyak 50l dalam lubang mikroplate yang kemudian dianalisis dengan metode ELISA ( Enzym Linked Immun Sorbent Assay). Metode ELISA ini akan membaca absorbansi dengan panjang gelombang 570 nm. Pada praktikum ini hanya bisa diketahui MIC-nya karena untuk menentukan MKC dibutuhkan kultur ulang dengan pembuatan media TSB yang baru dan diambil dari kadar terendah dari MIC. Jadi nilai absorbansi yang dianalisis menggunakan metode ELISA yaitu pembacaan absorbansi dari MBC.

Dari hasil yang diperoleh dapat dihitung prosentasi kematian sel bakteri dengan rumus :

Dengan absorbansi kontrol sama dengan absorbansi pada kontrol positif, dan absorbansi media sama dengan absorbansi kontrol negatif. Pengadaan kontrol negatif yang berisi media + aquades berfungsi untuk mengetahui media yang digunakan masih baik atau tidak, sedangkan kontrol positif yang berisi media dan bakteri berfungsi untuk mengetahui apakah bakteri yang digunakan masih baik atau tidak. Hasil yang didapat kurang signifikan, seharusnya semakin tinggi konsentrasi antibiotik semakin rendah serapan dari hasil ELISA karena semakin sedikit pula bakteri yang masih hidup. Hal ini dapat disebabkan karena kesalahan saat proses dilusi dimana terjadi kesalahan pengenceran pada tabung C sehingga konsentrasi antibiotik pada tabung C,D, dan E tidak lagi diketahui.

Kelebihan dari metode mikrodilusi cair ini adalah dapat memberikan hasil kuantitatif yang menunjukkan jumlah antimikroba yang dibutuhkan untuk mematikan bakteri.

VIII. KESIMPULAN Semakin tinggi konsentrasi antibiotik yang digunakan maka semakin banyak bakteri yang mati. MIC yang didapatkan pada kadar 25 g/ml.

IX. DAFTAR PUSTAKA 1. Jawetz, Melnick, & Adelbergs, 2001, Mikrobiologi Kedokteran, Penerjemah Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran UNAIR, Penerbit Salemba Medika, Jakarta, Hal 223-228, 351-357 2. Mulyaningsih, S, 2004, Mikrobiologi Dasar, FMIPA UII, Yokyakarta 3. Pelczar, Michael J.,& E.C.S. Chan, 1988, Dasar-Dasar Mikrobiologi, edisi 2,Penerbit UI-Press, Jakarta, Hal 515-522 4. Waluyo, Lud, 2005, Mikrobiologi Umum, UMM-Press, Malang