LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UJI POTENSI ANTIMIKROBIAL MENGGUNAKAN METODE DILUSI

KELOMPOK C2 I Putu Riska Winatha Fajar Handayani Arum Wahyuningsih Wulan Putri Asih Dita Pertiwi A.D 08613007 09613149 09613152 09613153 09613155

LABORATORIUM FARMAKOLOGI DAN TERAPI JURUSAN FARMASI – FAKULTAS MIPA UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA 2011/2012

mampu untuk meracuni serta mampu untuk menghindari dari sistem kekebalan inang. di dalam sel pencernaan makanan. Mikroorganisme dapat hidup jika pada kondisi yang sesuai. LATAR BELAKANG Mikroorganisme terdapat di berbagai habitat. Mikrobia dapat menyebabkan banyak bahaya. . seperti dalam tanah.ciri bakteri patogen yaitu kemampuan untuk menularkan. yaitu kecukupan mendapat makanan. Mikroorganisme tidak dapat dipisahkan dengan lingkungan abiotik dan biotik dari suatu ekosistem karena peranannya sebagai pengurai. hidung dan bagian- bagian tubuh yang lain. melekat pada sel inang. lingkungan akuatik dan atmosfer. bahkan kematian. Beberapa infeksi disebabkan oleh bakteri yang secara umum dianggap patogen tidak menampakkan gejala (asimptomatik).UJI POTENSI ANTIMIKROBIAL MENGGUNAKAN METODE DILUSI I. Suatu penyakit terjadi jika bakteri atau reaksi imunologi yang ditimbulkannya menyebabkan suatu bahaya bagi seseorang. perlu adanya antibakteri atau antibiotik sebagai obatnya. Patogenesis infeksi bakteri meliputi permulaan awal dari proses infeksi hingga mekanisme timbulnya tanda dan gejala penyakit. menginvasi sel inang dan jaringan. kelembapan dan suhu. Maka untuk menghambat daya infeksi agar tidak berkelanjutan lebih tinggi. selain itu juga terdapat di permukaan tubuh. TUJUAN Mahasiswa dapat menentukan MIC dan MBC suatu antibiotika terhadap bakteri menggunakan teknik dilusi dan mikrodilusi II. Ciri. mulut. karena dapat menginfeksi organisme lain mulai dari infeksi ringan sampai kepada kematian.

Contoh : siproploksazin. streptomisin. ampisilin. Menghambat sintesis asam nukleat. gentamisin. gentamisin. Contoh : penisilin. menghambat sintesis protein. Contoh : polimiksin B.2001). antagonis metabolit contoh : isoniazid (Jawetz. nifampin. Secara umum resistensi di bagi dalam 3 kelompok : A. Contohnya : ampisilin. Antibiotik spectrum luas (broad spectrum) yaitu antibiotic yang efektif terhadap berbagai macam pathogen.2000). b. Mekanisme aksi antibiotic : 1. metsilin. Contohnya : eritromisin. Menghambat pembentukan dinding sel. Resistensi genetic Terjadi mutasi spontan pada gen bakteri sehingga terjadi perubahan pada bakteri yang semula sensitive terhadap suatu antimikrobia . Contoh : streptomisin. Berdasarkan sasaran bakteri. dan dalam kadar rendah mampu menghambat proses penting dan kehidupan satu spesies atau lebih mikroorganisme (Siswandono. 2005). sefalosporin. isoniazid (Ganiswara. 3. mengganggu pembentukan membrane sel.III. sefalosporin. Resistensi bakteri adalah suatu sifat tidak terganggunya kehidupan sel bakteri oleh antimikrobia. 5. antibiotic dibedakan menjadi : a. 2. kloramfenikol. DASAR TEORI Antibiotik adalah senyawa kimia khas yang dihasilkan oleh organisme hidup. termasuk turunan senyawa dan struktur analognya yang dibuat secara sintetik. 4. Antibiotik spectrum sempit (narrow spectrum) yaitu antibiotic yang hanya ektif terhadap mikroba pathogen terbatas.

Inaktivasi oleh mikroba. Perubahan tempat kerja obat pada mikroba.menjadi resisten. Menghentikan penggunaan antibiotic pada infeksi biasa atau sebagai obat luar. Terbentuknya resistensi dapa dikurangi dengan cara: 1. Mikroba menurunkan permeabilitasnya sehingga obat sulit masuk ke dalam sel. Pada resisten silang. Meninggkatkan produk enzim yang dihambat oleh antimikroba. Bila berubah menjadi aktif kembali. Mengguanakan antibiotic yang tepat dengan dosis agar infeksi cepat sembuh. . 3. 2. Bakteri ini dikenal sebagai “persistem”. 2. B. Resistensi silang Resistensi silang adalah keadaan resisten terhadap antimikroba yang juga memperlihatkan sifat resisten terhadap antimikroba yang lain. sifat resistensi ditentukan oleh suatu lokus genetic. Bakteri dapat berubah menjadi resisten akibat memperoleh suatu elemen pembawa factor resisten. misalnya antara beberapa derivate tetrasiklin. 4. 3. Mencegah pemakaian antibiotic tanpa pembedaan kasus-kasus yang tidak membutuhkan antibiotic. Mekanisme resisten kuman terhadap antimikroba ada 5 yaitu : 1. 5. Resistensi silang biasanya terjadi antara antimikrobia dengan struktur yang hamper sama. Cara transformasi factor resisten bakteri terjadi dengan jalan bekteri menginporlasi factor resisten langsung dari media sekitarnya (lingkungan). Mikroba membentuk jalan pintas untuk menghindari tahap yang dihambat oleh mikroba. biasanya tidak dipengaruhi olah antimikrobia bakteri. Resisten non genetic Bakteri dalam keadaan istirahat. bakteri kembali bersifat sensitive terhadap antimikroba semula. C.

Bakteri bersifat resisten karena mutasi. inkubasi 5-8 jam pada suhu 37ºC. Suspensikan ke dalam 0. Pemakaian dosis obat antibiotic dibawah dosis terapi. lalu ditambah kuman (Lay. 2. Menggunakan keefektifannya. 1. 2. Mengguanakan antibiotic yang lain bila ada tanda-tanda bahwa suatu organisme akan menjadi resisten terhadap antibiotic yang digunakan semula. 1994). Penyebab mikroorganisme resisten terhadap antibiotic adalah 1. 4. kombinasi antibiotic yang telah terbukti 5. Pemakaian antibiotic yang tidak tepat. 3. Ambil beberapa koloni kuman dari pertumbuhan yang diinkubasi selama 24 jam pada agar. Penentuan kepekaan bacteria pathogen terhadap antimikrobia dapat dilakukan dengan salah satu dari dua metode pokok yakni dilusi atau difusi. Pengobatan yang tidak tuntas antau penghentian antibiotic sebelum bakteri benar-benar mati. Cara Kirby Baeur 1. DILUSI PADAT ATAU CAIR Pada prinsipnya antibiotik diencerkan hingga beberapa konsentrasi. masing-masing konsentrasi obat ditambah suspensi kuman dalam media.4. DIFUSI Media yang dipakai adalah agar Mueller Hilton dan pada difusi ini ada beberapa cara yaitu : a. . Sedangkan pada delusi pada tiap konsentrasi obat dicampur dengan media agar. Pada delusi cair.5 ml BHI cair.

5 % yang mempunyai temperatur 500 C (diambil dari waterbath).2. Inkubasi pada 37ºC selama 18-24 jam (Lay. b. ambillah satu mata ose dan masukkan dalam 4 ml agar base 1. Kemudian oleskan pada permukaan media agar hingga rata.1994). Inkubasi pada 37ºC selama 19-24 jam (Lay. 4. Pada agar dibuat sumuran dengan garis tengah tertentu dan kedalam sumuran tersebut di tetesi larutan antibiotik yang digunakan. c. Bahan kimia yang digunakan dalam pengobatan (kemoterapeutik) menjadi pilihan bila dapat mematikan dan bukan menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Kapas lidi steril dicelupkan ke dalam suspensi kuman lalu di tekan-tekan pada dinding tabung hingga kapasnya tidak terlalu basah. pada langkah 1 dan 2 sama dengan cara Kirby Bauer. Letakkan paper disk yang mengandung antibiotik di atasnya. 1994). Cara Pour 1. 3. Bahan kimia yang mematikan bakteri .2. 3. dengan menggunakan ose khusus. 1994).3 sama dengan Kirby Bauer. 2. Suspensi di atas di tambah aquades steril hingga kekeruhan tertentu sesuai dengan standar konsentrasi kuman. tuanglah pada media Mueler Hilton agar. 4. 108 CFU/ml. Setelah suspensi kuman tersebut dibuat homogen. Pada langkah 1. 2. 3. SUMURAN 1. Inkubasi selama 15-20 jam dengan temperatur 37ºC (Lay.

disebut bakterisidal. namun tidak menyebabkan keracunan pada induk semang yang menggunakan bahan tersebut. luasnya wilayah juga berkaitan dengan kecepatan berdifusi antibiotic dalam medium. bahan dengan sifat demikian memiliki toksisitas selektif. Metode penentuan keampuhan antibiotic ini disebut MIC (Minimun Inhibitory Concentration). Selain itu. sedangkan bahan kimia yang menghambat pertumbuhan bakteri disebut bakteriostatik. Kecepatan berdifusi ini harus diperhitungkan dalam penentuan keampuhan antibiotic. Luas wilayah jernih merupakan petunjuk kepekaan mikroorganisme terhadap antibiotic. Bahan antimicrobial dapat bersifat bakteriostatik pada konsentrasi rendah. Keampuhan antibiotic dapat ditentukan dengan melihat konsentrasi terendah antibiotic yang masih mampu mematikan atau menghambat pertumbuhan mikroortanisme pathogen. Bahan kemoterapeutik yang baik mempunyai daya mematikan mikroorganisme. . namun bersifat bakterisidal pada konsentrasi tinggi.

IV. ALAT DAN BAHAN  ALAT Tabung reaksi Gelas beker Gelas ukur Pipet tetes Mikropipet Erlenmeyer Autoclve LAF Bunsen  BAHAN Media TSB (Trypticase Soy Broth/nutrien broth) Suspensi bakteri eschericia colli Antibiotik ampisilin .

Seri pengenceran yang dibuat adalah 400 μg/ml. Inokulasikan setiap tabung (kecuali kontrol 1) dengan menggunakan 0. apabila tabung keruh (+) berarti menunjukkan pertumbuhan.1 ml biakan E coli (24 jam. 2. bila tabung jernih (-) berarti tidak terjadi pertumbuhan. TeknikDilusiCair 1. 10 8 CFU/ml). CARA KERJA A. Laporkan hasilnya dalam bentuk tabel. 50 μg/ml. dan 25 μg/ml dengan volume akhir tabung adalah 2 ml. Pindahkan satu mata ose biakan dari tabung jernih (-) kedalam media TSB atau media TSA yang baru. Inkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. HariPertama Siapkan 7 buah tabung reaksi ( 2 tabung untuk kontrol dan 5 tabung untuk perlakuan) Lakukan pengenceran larutan streptomisin/penisilin dengan menggunakan media TSB/NB sebagai pengencer. Harikedua Amati tabung yang menunjukkan pertumbuhan dengan di kocok.V. 100 μg/ml. 200 μg/ml. . Inkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam.

bila tabung jernih (-) berarti tidak terjadi pertumbuhan. Laporkan hasilnya dalam bentuk tabel. Hari ketiga Amati tabung yang menunjukkan pertumbuhan dengan di kocok. Tentukan konsentrasi bahan kimia yang bersifat bakteriostatik atau bakterisidal.3. apabila tabung keruh (+) berarti menunjukkan pertumbuhan. .

VI. 1 Keterangan Gambar 1 : Tabung A : 400 µg/ml Tabung B : 200 µg/ml Tabung C : 100 µg/ml Tabung D : 50 µg/ml Tabung E : 25 µg/ml (bening/tidak keruh = tidak terjadi pertumbuhan bakteri ) Gambar. 2 Keterangan : Tabung K (+) = tabung control positive berisi media + bakteri (keruh) Tabung K (-) = Tabung control negative berisi Aquades (bening) .coli dan antibiotic amphicilin 1. DATA DAN HASIL Laporan Hasil Percobaan Jenis/jumlah sampel : Bakteri E. Foto hasil Percobaan Gambar.

360 0.2.101 0. Data ELISA Tabung Kontrol (+) Kontrol (-) A B C D E Absorbansi 0. Hasil data Dilusi Cair Kadar sampel 400 µg/ml 200 µg/ml 100 µg/ml 50 µg/ml 25 µg/ml Hasil (-) (-) (-) (-) (-) Keterangan : (+) = tumbuh (-) = tidak tumbuh 3.092 .104 0.094 0.105 0.103 0.

Presentase kematian sel bakteri A. B. C. D.4. . E.

perbedaanya terletak pada media pertumbuhan yang digunakan. Antibiotika penisilin mempunyai ciri khas secara kimiawi adanya nukleus asam amino-penisilinat. Spektrum bakteri terutama untuk bakteri Gram positif. colly dimana dilakukan pengenceran pada 5 tabung reaksi yang berisi antibiotik ampicilin. Konsentrasi antibiotik yang digunakan adalah 400µg/ml. sedangkan pada teknik difusi hanya dapat diketahui zona hambatnya. Kelebihan dilusi cair adalah dapat menentukan MIC dan MKC. Metode dilusi dibedakan menjadi 2 macam. Sehingga antibiotic ini aktif dalam menghambat bakteri Eschericia colly. yakni dilusi cair dan dilusi padat. Metode dilusi juga memiliki kekurangan yaitu metode ini bersifat subjektif karena parameter yang digunakan adalah kekeruhan. Dan untuk media agar yang digunakan adalah media TSB. Dilusi cair memiliki kelebihan jika dibandingkan dengan teknik delusi. Untuk menentukan MIC dan MKC pada bakteri E. Bahan antimikrobial yang bersifat menghambat pertumbuhan bakteri bila digunakan dalam kosentrasi yang kecil. Ampicilin merupakan golongan antibiotic Penisilin. Colly ini digunakan teknik dilusi cair. Hari pertama praktikum melakukan inkubasi bakeri E. MIC merupakan konsentrasi terendah bahan antimikrobial yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Beberapa golongan penisilin ini juga aktif terhadap bakteri Gram negative. yang terdiri dari cincin tiazolidin dan cincin betalaktam.VII. Pengenceran hanya dilakukan dari tabung ketiga yng diambil dari tabung kedua. sedangkan dilusi padat menggunakan menggunakan media agar padat. Dilusi cair. Untuk tabung . menggunakan media tumbuh berupa agar yang cair. PEMBAHASAN Untuk menentukan MIC dan MKC maka dilakukan teknik dilusi. untuk MKC merupakan konsentrasi terendah antibiotik yang mematikan bakteri. Penisilin adalah antibiotika yang termasuk paling banyak dan paling luas dipakai. namun apabila konsentrasinya besar dapat untuk membunuh bakteri. Golongan penisilin bersifat bakterisid dan bekerja dengan mengganggu sintesis dinding sel.

sedangakan waktu 24 jam dalah waktu maksimum pertumbuhan bakteri. 25 µg/ml tidak menunjukkan pertumbuhan bakteri. Ini didesain untuk digunakan dalam mengestimasi konsentrasi bakteri Gram negatif.pertama dan kedua diambil langsung dari konsentrasi antibiotik 400µg/ml. dengan suhu 370c. Dari hasil praktikum didapatkan semua tabung jernih kecuali tabung berisi kontrol positif. Suhu 370c adalah menyesuaikan dengan suhu tubuh pada manusia. maka kadar hambat minimum adalah 25 µg/ml. kekeruhan media pada tabung kontrol positif ini menandakan bakteri masih dalam keadaan baik. maka tabung dengan jumlah konsentrasi antibiotik terendah yang jernih menunjukkan MIC (Minimum Inhibitory Concentration). Semua tabung dari konsentrasi 400. 200µg/ml. tabung 1 berisi media agar cair dengan aqudes. Tabung ini berisi media dan sample bakteri. yang menjelaskan konsentrasi spesifik dari bakteri per mL. 100µg/ml. Kekeruhan menunjukkan bakteri masih dalam keadaan baik. kontrol positif ini untuk melihat apakah bakteri yang digunakan masih bagus. Kekeruhan larutan bakteri pada tiap tabung kurang lebih sesuai dengan nomor skala McFarland yaitu kekeruhan bakteri pada konsentrasi . Kekeruhan memiliki standar brown atau Standar Kekeruhan McFarland. menurut definisi dari MIC adalah kadar terendah antibiotik yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. 100. 25µg/ml. 200.Pengenceran yang dilakukan adalah 400µg/ml. Pada praktikum kali ini setelah dilakukan teknik dilusi pada hari pertama dan tabung berisi biakan berbagai konsentrasi antibiotik di inkubasi selama 24 jam. 50µg/ml. Dua tabung yang lain digunakan sebagai kontrol. 50. dan tabung yang lain berisi media cair dengan bakteri. Standar McFarland berada dalam bentuk skala yang bernomor dari 1 sampai 10. Dan dinnkubasi selama 24 jam.

Metode ELISA ini akan membaca absorbansi dengan panjang gelombang 570 nm. jadi penambahan bakteri pada tiap tabung diperlukan standar McFarland agar dihasilkan konsentrasi yang sama sehingga saat diinkubasi dan dibaca hasil presentase kematian bakteri didapatkan hasil yang benar dalam perhitungan presentase kematian bakteri.D. Hal ini dapat disebabkan karena kesalahan saat proses dilusi dimana terjadi kesalahan pengenceran pada tabung C sehingga konsentrasi antibiotik pada tabung C. Hasil yang didapat kurang signifikan. Dari hasil yang diperoleh dapat dihitung prosentasi kematian sel bakteri dengan rumus : Dengan absorbansi kontrol sama dengan absorbansi pada kontrol positif. sedangkan kontrol positif yang berisi media dan bakteri berfungsi untuk mengetahui apakah bakteri yang digunakan masih baik atau tidak. Selanjutnya media dimikropipet sebanyak 50µl dalam lubang mikroplate yang kemudian dianalisis dengan metode ELISA ( Enzym Linked Immun Sorbent Assay). seharusnya semakin tinggi konsentrasi antibiotik semakin rendah serapan dari hasil ELISA karena semakin sedikit pula bakteri yang masih hidup.2.1 x 109/mL. Jadi nilai absorbansi yang dianalisis menggunakan metode ELISA yaitu pembacaan absorbansi dari MBC. Pada praktikum ini hanya bisa diketahui MIC-nya karena untuk menentukan MKC dibutuhkan kultur ulang dengan pembuatan media TSB yang baru dan diambil dari kadar terendah dari MIC. dan absorbansi media sama dengan absorbansi kontrol negatif. Pengadaan kontrol negatif yang berisi media + aquades berfungsi untuk mengetahui media yang digunakan masih baik atau tidak. dan E tidak lagi diketahui. .

.Kelebihan dari metode mikrodilusi cair ini adalah dapat memberikan hasil kuantitatif yang menunjukkan jumlah antimikroba yang dibutuhkan untuk mematikan bakteri. MIC yang didapatkan pada kadar 25 µg/ml. KESIMPULAN Semakin tinggi konsentrasi antibiotik yang digunakan maka semakin banyak bakteri yang mati. VIII.

& E. Penerjemah Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran UNAIR. Jakarta. Mikrobiologi Dasar. 1988. Hal 515-522 4. Lud. Mulyaningsih. Hal 223-228. Jakarta.C. 2004. 2005. S. Malang . & Adelberg’s. Pelczar. DAFTAR PUSTAKA 1. 351-357 2. Dasar-Dasar Mikrobiologi. edisi 2. FMIPA UII.. Mikrobiologi Umum.Penerbit UI-Press. Jawetz. Chan. Penerbit Salemba Medika. 2001.IX.S. Waluyo. UMM-Press. Michael J. Yokyakarta 3. Melnick. Mikrobiologi Kedokteran.