CARA KERJA WESTERN BLOT ANALYSIS 1.

Menyiapkan sampel yang akan diteliti, apakah itu limfosit T, fibroblas atau sel darah tepi. Sampel harus dijaga tetap dingin. 2. Menyiapkan buffer supaya pH dapat berada pada jangkauan yang stabil 3. Menyiapkan antibodi yang akan digunakan sebagai pelacak Monoklonal antibodi maupun poliklonal antibodi dapat digunakan a. Antibodi monoklonal adalah yang lebih baik digunakan, karena : Sinyal yang lebih baik Spesifisitas yang lebih tinggi Hasil yang lebih jernih pada proses pembuatan film western blot

b. Antibodi Poliklonal Mengenali lebih banyak epitop

4. Melakukan Lisis pada Sel Kita perlu melisis sel untuk mengeluarkan protein yang diinginkan dari sel. Untuk melisis sel dapat digunakan detergen SDS dan RIPA. Bila yang diinginkan adalah sebuah protein yang terfosforilasi, maka perlu

ditambahkan inhibitor fosfatase agar gugus fosfat pada protein tersebut tidak dibuang. Cara melisis : sentrifuge dan ambil pellet yang terbentuk. Jaga agar tetap dingin dengan menggunakan kotak es. Tambahkan buffer lisis, lalu kumpulkan dalam tabung eppendorf, jaga agar tetap dingin. 5. Gel Elektroforesis Gel yang biasa dipakai misalnya SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis) untuk memisahkan protein berdasarkan ukurannya dengan adanya arus listrik. Akrilamid 10% juga ditambahkan. Kerja SDS-PAGE ini adalah dengan mendenaturasi polipeptida setelah terlebih dahulu polipeptida tersebut dibuang struktur sekunder dan tersiernya. Sampel terlebih dahulu dimasukkan ke dalam sumur gel. Satu jalur biasanya untuk satumarker. Protein sampel akan memiliki muatan yang sama dengan SDS yang negatif sehingga bergerak menuju elektroda positif melalui jaring-

jaring akrilamid. Protein yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat melewati jaring-jaring akrilamid. Perbedaan kecepatan pergerakan ini akan terlihat pada pita-pita yang tergambar pada tiap jalur. 6. Transfer Gel Agar protein tersebut dapat diakses oleh antibodi, maka protein tersebut harus dipindahkan dari gel ke sebuah kertas membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF. Membran ini diletakkan di atas gel, dan tumpukan kertas penyerap diletakkan di atasnya. Larutan buffer kemudian akan merambat ke atas melalui reaksi kapiler dengan membawa protein-proteinnya.

Cara lain untuk mentransfer protein adalah dengan menggunakan teknik elektroblotting. Teknik ini menggunakan arus listrik untuk menarik protein dari gel ke membran. Selain itu, diperlukan pula sebuah prosedur untuk mencegah terjadinya interaksi antara molekul-molekul yang tidak diinginkan agar hasil yang diperlukan lebih jernih (to reduce noise). Caranya adalah dengan menempatkan membran pada BSA (Bovine serum albumin) atau non-fat dry milk dengan sedikit detergen tween 20 sehingga serum tersebut akan menempel pada pada daerah yang tidak ditempeli protein sampel. Hal ini bertujuan untuk membuat antibodi hanya akan dapat menempel pada binding site protein target. Setelah itu, barulah membran dengan protein sampel tersebut diinkubasi dengan antibodi. 7. Deteksi Deteksi dilakukan dengan antibodi yang telah dimodifikasi bersama dengan sebuah enzim yang disebut reporter enzyme. Proses deteksi biasanya berlangsung dalam dua tahap, yaitu : a. Antibodi Primer Antibodi yang digunakan di sini adalah antibodi yang pertama kali dihasilkan sistem imun ketika terpajang protein target. Antibodi terlarut kemudian diinkubasi bersama kertas membran paling sedikit selama 30 menit.

b. Antibodi Sekunder Setelah diinkubasi bersama antibodi primer, kertas mebran dibilas terlebih dahulu barulah diinkubasi dengan antibodi sekunder. Antibodi sekunder adalah antibodi yang spesifik untuk suatu spesies pada antibodi primer. Misalnya, anti-tikus hanya akan berikatan pada antibodi primer yang berasal dari tikus. Antibodi sekunder biasanya berikatan dengan enzim reporter seperti alkaline fosfatase atau horseradish peroxidase. Antibodi sekunder ini kemudian akan menguatkan sinyal yang dihasilkan oleh antibodi primer. Sekarang, proses deteksi dapat dilakukan dengan satu langkah saja, yaitu dengan menggunakan antibodi yang dapat mengenali protein yang diinginkan sekaligus memiliki label yang mudah dideteksi 8. Analisis a. Colorimetric detection Metode ini digunakan bila substrat dapat bereaksi dengan reporter enzyme sehingga dapat mewarnai membran nitorselulosa b. Chemiluminescent Metode ini digunakan bila substrat merupakan molekul yang bila bereaksi dengan antibodi sekunder atu dengan reporter enzyme akan teriluminasi. Hasilnya kemudian diukur dengan densitometri untuk mengetahui jumlah protein yang terwarnai. Teknik terbarunya yang paking canggih disebut Enhanced Cheiluminescent (ECL). Teknik inilah yang paling banyak digunakan sekarang. c. Radioactive detection Metode ini menggunakan X-ray yang bila mengenai label akan menciptakan region gelap. Namun metode ini sangat maha dan beresiko tinggi terhadap kesehatan. d. Fluorescent detection Pelacak yang mmepunyai label yang dapat mengalami fluorosensi lalu kemudian dideteksi oleh fotosensor seperti kamera CCD yang menangkap

image digital dari western blot. Hasil kemudian dapat dianalisi secara kuantitaif maupun kualitatif Metode ini juga merupakan salah satu metode yang paling sering digunakan karena sangat sensitif.

PRINSIP KERJA WESTERN BLOT ANALYSIS Prinsip kerja Western Blot yaitu pertama kali dilakukan analisis dengan SDS-PAGE karena protein mempunyai berat molekul yang beragam, sehingga setelah dilakukan SDSPAGE, protein dengan berat molekul yang berbeda akan terpisah pada area gel. Kemudian dilanjutkan dengan mentransfer protein tersebut dari Polyacrilamide Gel ke membrane nitroselulose dan selanjutnya dilabel dengan antibodi. Hasil ikatan antara protein antigen dan antibodi tersebut kemudian diwarnai dengan menggunakan pewarnaan yang diinginkan, seperti pewarnaan dengan commasie blue (Rantam, 2003).

Gambar 1. Rincian langkah-langkah yang terlibat dalam memperoleh protein untuk western blot.

Gambar 2. Gambar merinci langkah-langkah dalam melakukan western blot

See Diagram 1 below. First things first. Obtain a protein sample you want to analyze, such as cell samples. Lyse the cells to release protein contents. Run these on a gel which separates proteins on the basis of size. Then transfer these

gel proteins onto a membrane using electricity. This membrane can then be used to probe for proteins of interest using a primary antibody. What You Need to Western Blot: A Protein Sample A Good Antibody to Detect your Protein of Interest Western blot relies on the primary antibody to detect this protein from the thousands of proteins on your membrane and previously on your gel! (a cell can contain 30,000 different proteins - and these same proteins can even be altered giving you over 300,000 different proteins!). Using an antibody recognizes your primary antibody (a secondary antibody) you build up a protein-antibodyantibody sandwich! The secondary antibody has a horse radish peroxidase enzyme which converts a luminol substrate to a light releasing substance! This light is detected as a spot on film. From this spot you can determine how much protein is there relative to other spots, or the size of the protein relative to a size marker that is run also on the gel.

Diagram 2 shows a western blot example gel. Lane 1 is a protein size marker ladder which shows different known sizes of proteins, this can be purchased commercially and the sizes of all the spots are given in a pamphlet. Lane 3 is a cancer sample and lane 5 is a normal sample. As you can see the protein in lane 3 has a higher expression than the cancer sample in lane 5, which is interesting. Also, the protein spots in lanes 3 and 5 are the same size as the 2nd spot in the size ladder from lane 1. We can then look at the known protein size from our brochure which we received with the ladder. We then determine that the size of the protein is 80 kDa. Our protein of interest is also 80 kDa. So we know that the western blot worked and that the protein is highly expressed in a cancer sample! To Detect your Protein: Buy an Antibody Against Your Primary Antibody Source Use an ECL - Chemiluminescence Kit and Film to Get the Results

DAFTAR PUSTAKA: http://id.shvoong.com/medicine-and-health/medicine-history/2111504western-blot/#ixzz1fNk5xeOf http://www.molecularstation.com/protein/western-blot/#top