Isolasi dan Visualisasi DNA Genomik Bakteri Eschericia coli

Laporan Genetika Molekuler

Kelompok 4 :

Metta Padmalia Jily Gavrila Sompie

412008002 412008018

Program Studi Biologi Fakultas Biologi Universitas Kristen Satya Wacana Salatiga 2011

Salah satu perbedaan fundamental antara jasad prokaryot dan eukaryot adalah pada organisasi bahan genetiknya (Yuwono. Oleh sebab itu. Konstruksi pustaka genom dan pengklonan DNA membutuhkan DNA yang utuh agar fragmen DNA betul-betul berasal dari proses pemotongan enzimatik yang sangat spesifik. isolasi DNA genom yang utuh sangat diperlukan bila DNA tersebut akan diproses untuk pengklonan (Suharsono dan Widyastuti. Bila terpotongnya DNA bukan karena reaksi enzimatik. elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA yang sudah dipotong sebelumnya.I. Materi-materi genetik menyandi berbagai informasi untuk sintesis protein pada organisme. Pembuangan remukan sel dilakukan dengan cara sentrifugasi. (2) perusakan dan pembuangan dinding sel. DNA merupakan materi genetik dalam organisme. Isolasi DNA kromosm bakteri secara garis besar meliputi tahap-tahap (1) pemanenan sel. Isolasi DNA genom sangat penting dalam rangka pengklonan DNA atau gen sasaran. 2010). (2003). pada kelompok eukaryot. Pada kelompok prokaryot. Perusakan dinding sel antara lain dapat dilakukan dengan pemberian lisozim. umumnya hanya ada satu unit bahan genetik utama yang membawa semua informasi genetik yang diperlukan untuk kelangsungan pertumbuhan jasad tersebut. serta (5) pemisahan DNA dari protein dan RNA. (3) lisis sel. 2006 dalam Anam. atau sama sekali belum dipotong. tetapi semua unit bahan genetik merupakan satu kesatuan genom yang menentukan kelangsungan hidup suatu spesies eukaryot (Yuwono. bahan genetik utama terdiri atas beberapa unit independen yang terpisah. Selain DNA. Sebaliknya. Pemanenan sel dilakukan dari biakan yang telah diinkubasi sebelumnya. 2008). sedangkan untuk lisis sel biasanya digunakan sodium dodesil sulfat (SDS). sedangkan 1 . Pendahuluan A. terdapat pula RNA sebagai materi genetik. maka fragmen DNA tersebut sulit disambungkan dengan DNA dari vektor pengklonan. 2008). Latar Belakang Menurut Micklos et al. (4) pembuangan remukan sel.

untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA. Hasil tersebut merupakan pengetahuan awal untuk proses analisa dan riset di bidang biologi molekuler. misalnya dampak obat dan antibiotik. Selain itu. 2 . Fragmen molekul DNA dapat ditentukan ukurannya melalui medium gel agarosa. Molekul DNA yang telah diisolosi tersebut kemudian dimurnikan. sedangkan fragmen yang berukuran lebih besar akan berjalan lebih lambat (Yuwono. 2008). DNA hasil isolasi dikatakan baik apabila mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi dan tidak mengalami fragmentasi (Anonim. Pengetahuan awal yang didapatkan akan mendasari penelitian-penelitian selanjutnya yang lebih mendalam. Hal tersebut menyebabkan praktikum isolasi dan visualisasi DNA hewan merupakan hal yang sangat penting untuk dipahami dan dipelajari. kebutuhan masyarakat akan informasi genetik dan teknologi pun dewasa ini kian berkembang. dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Tujuan Praktikum Untuk mengisolasi DNA genomik bakteri Eschericia coli secara bertahap dan mengamati hasil running dari DNA bakteri pada medium gel agarosa pada visualisasi menggunakan UV. misalnya dengan penambahan amonium asetat dan alkohol. Visualisasi terhadap hasil elektroforesis DNA yang telah diisolasi tersebut penting untuk dipelajari. Fragmen-fragmen DNA yang telah diisolasi kemudian dielektroforesis. B. 2008). Fragmen yang kecil akan berjalan cepat. Kecepatan gerak molekul pada elektroforesis bergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya dan pada bentuk molekulnya.protein dan RNA masing-masing dihilangkan menggunakan kloroform dan RNAse. 2003). Elektroforesis merupakan teknik biologi sel untuk analisis DNA. Elektroforesis dilakukan berdasarkan ukuran makromolekul. suatu bahan semi-padat berupa polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut (Yatim.

coli) dikultivasi ke media cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni bakteri ke media LB (Luria Bertani). Universitas Kristen Satya Wacana. waterbath. Ke dalam microtube berisi pellet kembali dituangkan 1. Alat dan Bahan Beberapa alat yang digunakan adalah hot plate.5 ml kultur hasil inkubasi 16 jam tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam microtubekemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5. coli. 1% SDS). stirrer. seperangkat alat elektroforesis. buffer TE. di Laboratorium Biokimia dan Biologi Molekuler. Salatiga. buffer TAE. Beberapa bahan yang digunakan adalah agarosa. Bahan analisis yang digunakan fenol:klorofom (50v:50v).2 M NaOH.II. Waktu dan Tempat Praktikum Praktikum dilaksanakan pada bulan November – Desember 2011. kalium asetat 5M. cetakan gel agarosa.50 mm Tris pH 8. sehingga dalam microtube hanya terdapat pellet.0). ethidium bromida. Inkubasi dilakukan di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (overnight). beaker glass 100 ml. pestel. sisir sumuran. buffer I (10 mM glukosa. C. dan buffer pewarna. H2O steril. Bahan uji yang digunakan adalah sampel DNA Bakteri E. ethanol 70 %. B. Sebanyak 1. Prosedur Kerja 1. selotipe bening. centrifuge. UV. tip. wadah es. Fakultas Biologi. Bahan dan Metode A.5 ml kultur hasil inkubasi sebelumnya dan kembali diulang 3 . 0. 20 mM EDTA pH. mortar. sarung tangan dan mikropipet.000 rpm selama 5 menit. bibiter es dan selotip. ethanol absolut. vortex. Supernatan yang dihasilkan dibuang. Pemanenan Sel dari Kultur Bakteri Kultur overnight (semalam) bakteri (E. buffer II (0. microtube (ependorf).

lisis sel dan pembuangan remukannya Supernatan yang dihasilkan dibuang dan diperoleh pellet sel bakteri.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. Campuran larutan tersebut diresuspensi dan dilakukan inkubasi pada suhu 20oC selama 2 jam. diresuspensi dengan cara digojog (± 1 menit). Proses selanjutnya ke dalam tabung ditambah CI sebanyak 1x volume supernatan. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 µl etanol 70%. Lapisan paling atas dari supernatan dipindahkan ke tabung sentrifuge dan diperkirakan besar volumenya.Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam disentrifugasi kecepatan tinggi 13.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. Perusakan dinding sel.memasukkan kultur inkubasi ke dalam tabung microtube sebanyak 1.000 rpm selama 5 menit.1 volume supernatan dan etanol absolut sebanyak 2x volume supernatan. ditambah 50 µl TE dan 4 . Pemisahan DNA dari protein dan RNA Supernatan tersebut ditambah Na asetat 3 M pH 5. diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kecepatan tinggi 13. 100 µl fenol dingin. diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13. diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kecepatan tinggi 13.2 sebanyak 0.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit.5 ml dan disentrifugasi selama 5. Pellet diresuspensi dengan 1 ml larutan STE (Bufer Sodium Tris-EDTA) dengan cara vortex dan disentrifugasi dengan kecepatan 5. Supernatan dibuang kembali. 3. Tabung sentrifuge hasil inkubasi satu jam ditambah 200 µl buffer lisis ditambah bibiter (fresh). 2. Lapisan paling atas dari supernatan dipindahkan kembali ke tabung sentrifuge yang baru dan diperkirakan besar volumenya. tabung dikeringkan. Supernatan dibuang kembali dan pellet diresuspensi dengan 200 µl lisozim dengan cara vortex dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam (dalam prakteknya tahap ini dilewati karena tidak terdapatnya lisozim pada laboratorium). Ke dalam tabung ditambah 100 µl CI (kloroform Isoamil alkoholdan).000 rpm.

kemudian dituangkan ke dalam cetakan gel yang sudah diatur posisinya bersama sisir sumurannya. Pada DNA yang telah diisolasi ditambahkan buffer pewarna sebanyak 4 L dan H2O steril 6 L. microtube ditutup kembali dan disimpan di dekat es batu. Suspensi yang diperoleh adalah suspensi DNA kromosom bakteri. Agarosa ditambahkan pada pelarut buffer TAE. Selanjutnya. Campuran dididihkan dalam hot plate dan stirrer. dicat dengan EtBr yang telah disiapkan selama 8 menit dalam ruang UV. 4.diresuspensi dengan cara dibolak-balik. Gel agarosa tersebut dimasukkan ke dalam chamber elektroforesis dengan hatihati pula.8% (Lampiran). Langkah terakhir. Elektroforesis dan visualisasinya Untuk melakukan eletroforesis terhadap sampel. 5 . hasil elektroforesis DNA divisualisasikan dengan radiasi UV transilluminator. dan didinginkan hingga mengeras pada suhu ruang. mula-mula gel agarosa dibuat dengan konsentrasi 0.Gel agarosa yang telah mengeras dikeluarkan dari cetakannya dengan hati-hati. direndam dengan buffer TAE secukupnya. Arus listrik 80 V dialirkan selama 2 jam. kemudian arus listrik dimatikan. Setelah dicampurkan. sementara dipersiapkan gel agarosa. Chamber elektroforesis ditutup dan disambungkan dengan kabel penghubung arus listriknya. Campuran DNA E. Gel agarosa diambil. coliyang telah diisolasi dimasukkan pada sumur gel agarosa dengan mikropipet P20.

Hasil dan Pembahasan A. 6 . 2011). coli diisolasi dengan menambahkan beberapa larutan/ senyawa tertentu dengan fungsi spesifik. b c d e f a h g Keterangan : a b c d : sumuran : sampel DNA hewan : sampel DNA tumbuhan : sampel DNA jamur e f g : sampel DNA bakteri : DNA hewan (smear) : DNA jamur (smear. Hasil visualisasi dari elektroforesis beberapa sampel DNApada gel agarosa setelah diberi penyinaran UV (Dok. Hasil Sampel DNA bakteri E. coli tersebut (Gambar 1). Hasil isolasi DNA kemudian dielektroforesis dan divisualisasi untuk dianalisis DNA genomikyang terdapat pada E.III. tipis) h : DNA bakteri (smear) Gambar 1. pribadi.

Dalam penghomogenan. B. Pada sampel bakteri dan hewan. DNA masih belum tampak. Lebih baik semua tahap dilakukan di atas es yang telah diserut. setelah diberi fenol dan dibolak-balik seharusnya terdapat lendir jika tutup tube dibuka.Pada hasil foto dari visualisasi elektroforesis. dan bakteri yang tervisualisasi. Selain itu. dilakukan pelepasan DNA dari sel. smear tampak jelas. jamur.EDTA mengikat ion Mg2+ sehingga mendestabilisasi membran (karena ion Mg ada pada protein membran hilang) dan menghambat DNAse (Muttaqin. 2010). Gambar 2. untuk menjaga suhu supaya dingin. 7 . Pembahasan Tahap pertama yang dilakukan dalam isolasi DNA bakteri adalah pemanenan seluntuk mendapatkan pellet sel yang terpisah dari media pertumbuhannya.Sedangkan dari sampel tumbuhan. Pengaruh pemberian C-I untuk mempresipitasi DNA. harus sampai larut supaya enzim bekerja merata dan efektif. Hal yang harus diperhatikan dalam tahap tersebut adalah sebagai berikut. Setelah sel dipanen.Pemberian bibiter bertujuan untuk mencerna dinding sel. SDS dapat melarutkan protein membran dan enzim. Penggunaan pelarut organik akan menggumpalkan DNA dapat dilihat pada gambar berikut. berbeda pada jamur yang walaupun tampak tetapi sangat tipis. tampak adanya DNA hewan.

ditambahkan etanol 70% yang berguna untuk membersihkan lagi dan lebih memekatkan DNA(Muttaqin.Prinsip pemekatan DNA kromosom hampir sama dengan pemekatan plasmid. Etamol absolut dingin bertujuan mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas dan mencuci plasmid(Muttaqin. 2010). Penambahan C-I dilakukan dua kali karena protein mungkin masih tersisa pada tube dari pembersihan dengan C-I pertama. Tahap selanjutnya adalah pemisahan dan pemekatan DNA. Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan  (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air (air memiliki 2 muatan (+) pada H dan  pada O).Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. Pengaruh pemberian SDS dan EDTA terhadap dinding sel. 8 . Atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi. Atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi.Fungsi penembahan pelarut organik seperti etanol adalah menurunkan konstanta dielektrik tersebut.Selanjutnya. Etanol dapat mempresipitasi DNA karena penambahan garam berfungsi sebagai penetralcharge pada gula fosfat DNA.Jika di dalam air.Gambar 3. Ion-ion seperti kation (Na+. Ilustrasinya sebagai berikut (Gambar 4). 2010).

Gambar 4. Ketiga. Ilustrasi pengaruh penambahan etanol dibandingkan dengan air pada rantai DNA. Sedangkan dugaan kedua. Mengingat ukuran DNA yang terlalu besar. DNA berukuran terlalu besar. sehingga saat diamati di bawah UV. dinding sel tumbuhan masih belum lisis karena tidak digunakannya nitrogen cair. maka voltage dapat diperkecil dan gel agarosa diencerkan. Elektroforesis ternyata telah dapat memberikan hasil visualisasi yang cukup baik pada sampel bakteri. Dan yang kedua. maka apabila elektroforesis dilakukan hanya satu jam atau kurang. pada sampel DNA tumbuhan. demikian pula pada hewan dan jamur. electrophoresis migration rate yang dialami terlalu singkat. Pertama. masih tidak tampak running jelas dari sampel hasil isolasi. yaitu running yang sedikit sekali terjadi karena waktu yang diberikan untuk elektroforesis cukup singkat. Sayangnya masih belum digunakannya marker/ penanda sehingga ukuran DNA yang tervisualisasi tidak dapat diketahui. 9 . Agar DNA yang terlalu besar dapat tervisualisasi dengan baik. 2009). Namun. berikutnya dilakukan elektroforesis terhadap sampel tersebut. coli. Setelah dilakukan tahap isolasi DNA bakteri E. Diduga. hanya sekitar satu jam. sehingga tidak maksimal saat dielektroforesis. electrophoresis migration rate yang terjadi pada gel agarosa belum dapat menunjukkan keberadaan DNA yang berukuran besar tersebut (Becker et al.. ada tiga kemungkinan penyebab visualisasi yang kurang memuaskan. tidak tampak hasil visualisasi.

yaitu sebagai berikut. 2.Menurut Becker (2009). Komposisi buffer elektroforesis Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang digunakan untuk pembuatan gel agarosa. yaitu super-helix circular (I). Pengaruh temperatur Mobilitas DNA stabil pada temperatur 4-30C dan elektroforesis gel agarosa dilakukan pada suhu kamar. kemampuan paling rendah. menghasilkan laju migrasi yang berbeda. Misalnya. 10 . Ukuran molekul DNA Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat. Konsentrasi gel agarosa Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan bergerak sesuai dengan konsentrasi dari gel agarosa yang digunakan. electrophoresis migration rate (migrasi rata-rata eletroforesis) selama DNA bergerak menembus gel agarosa dipengaruhi oleh beberapa faktor utama. Penggunaan voltage (tegangan listrik) dan arah dari bidang elektris Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional. Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. Konformasi DNA Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/ konformasi DNA. 4. circular-opened (II). EtBr akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. 7. Misalnya tris-acetate. 1. 6. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single stranded atau double stranded asam nukleat (DNA atau RNA). dan linier (III). Ada tiga macam bentuk DNA. 5. umum dipakai untuk preparatif. tetapi efektif untuk isolasi DNA dari gel agarosa. Untuk masing-masing ukuran DNA yang bergerak ideal pada tegangan tertentu. 3. Keberadaan pewarna DNA Intercalating agent ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresence untuk deteksi asam nukleat. untuk DNA  2 kb pada gel agarosa bergerak  5 v/cm.

Dengan elektroforesis memberikan hasil memuaskan pada visualisasi DNA E. Sayangnya masih belum digunakannya marker / penanda sehingga ukuran DNA yang tervisualisasi tidak dapat diketahui. coli dari hasil visualisasi dengan menggunakan sinar ultra violet (UV). dapat dilihat adanya DNA E. sedangkan bagian bawah gel agarose masih terdapat berkas. 11 . coli. Jadi pada isolasi DNA Bakteri ini kita mendapatkan DNA yang belum benarbenar murni. Kesimpulan Dari hasil yang didapatkan.IV. Dari hasil elektroforesis menunjukkan pita DNA bakteri tampak jelas (berarti jumlah DNA yang terdeteksi banyak). Kemungkinan hal itu disebabkan adanya protein lain atau ada bagian-bagian sel yang terikut (debris sel) pada saat isolasi DNA.

2008. Peningkatan Kemurnian Genom DNA Rumput Laut Melalui Penambahan Kalium Asetat dalam Metode Ekstraksi DNA. 2003. 2008. Inc.pdf). dan G. Anonim.A.wordpress. Jakarta : Erlangga.rcaprpb. 2010. Jakarta : Yayasan Obor Indonesia. T. Institut Pertanian Bogor. 2010. Pasande. Diakses tanggal 20 Oktober 2011. D. Isolasi DNA Genom dan Polymerase Chain Reaction (PCR) Gen Penyandi 16s rRNA. Bertoni.. 12 . Micklos. Crotty. Kamus Biologi. Biologi Molekuler. Cold Spring Harbor. Laporan II – Isolasi DNA Genom.wordpress. 2009. DNA Science – A First Course. W. Freyer. W. 2006. Muttaqin M. G. R.J. The World of the Cell. 2003.com/praktikum/petunjuk-praktikum/i-isolasidna-kromosom-bakteri/).A. Diakses tanggal 27 Oktober 2009. Kleinsmith. New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press. Isolasi DNA Kromosom Bakteri.Daftar Pustaka Anam K. San Fransisco : Pearson Education. J. dan D. Diakses tanggal 19 Oktober 2011. (http://23bios1unsoed.P.com/UserFiles/File/BTLA%20vol%205%20no%202%202006/DNA%20rum put%20laut. Yatim.M. Becker.com/2011/03/17/isolasi-dnagenom-2/).A. (http://www. (http://biofin. Yuwono. Hardin. L.

8% pada cetakan Ukur volume cetakan untuk membuat gel agarosa  Cetakan diberi selotip bening pada samping-sampingnya  Akuades dituangkan ke dalam cetakan yang sampingnya telah rapat oleh selotip  Diukur banyaknya akuades yang dituangkan dalam cetakan hingga cetakan tersebut penuh  Diketahui bahwa volume akuades untuk memenuhi cetakan adalah 35 ml  Gel agarosa yang hendak dibuat adalah 0.8% x volume cetakan =  Jadi. sehingga agarosa yang dipakai dapat dihitung sebagai berikut.28 g gel agarosa dilarutkan dengan pelarut buffer TAE hingga volume 35 ml. untuk memenuhi cetakan gel agarosa.8%.28 ml = 0. sebanyak 0.Lampiran Pembuatan gel agarosa 0. 0. = 0.28 g 13 .

Komposisi masing-masing larutan yang ditambahkan untuk isolasi DNA bakteri 14 .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful