P. 1
Laporan Genmol_isolasi DNA Bakteri

Laporan Genmol_isolasi DNA Bakteri

|Views: 829|Likes:
Published by Jill Gavril

More info:

Published by: Jill Gavril on Dec 19, 2011
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOCX, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

06/04/2013

pdf

text

original

Isolasi dan Visualisasi DNA Genomik Bakteri Eschericia coli

Laporan Genetika Molekuler

Kelompok 4 :

Metta Padmalia Jily Gavrila Sompie

412008002 412008018

Program Studi Biologi Fakultas Biologi Universitas Kristen Satya Wacana Salatiga 2011

serta (5) pemisahan DNA dari protein dan RNA. 2006 dalam Anam. tetapi semua unit bahan genetik merupakan satu kesatuan genom yang menentukan kelangsungan hidup suatu spesies eukaryot (Yuwono. Materi-materi genetik menyandi berbagai informasi untuk sintesis protein pada organisme. Isolasi DNA genom sangat penting dalam rangka pengklonan DNA atau gen sasaran. 2010). Pada kelompok prokaryot. Latar Belakang Menurut Micklos et al. atau sama sekali belum dipotong. Isolasi DNA kromosm bakteri secara garis besar meliputi tahap-tahap (1) pemanenan sel. Bila terpotongnya DNA bukan karena reaksi enzimatik. sedangkan 1 . elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA yang sudah dipotong sebelumnya. 2008).I. Pembuangan remukan sel dilakukan dengan cara sentrifugasi. (2) perusakan dan pembuangan dinding sel. DNA merupakan materi genetik dalam organisme. umumnya hanya ada satu unit bahan genetik utama yang membawa semua informasi genetik yang diperlukan untuk kelangsungan pertumbuhan jasad tersebut. Salah satu perbedaan fundamental antara jasad prokaryot dan eukaryot adalah pada organisasi bahan genetiknya (Yuwono. (2003). sedangkan untuk lisis sel biasanya digunakan sodium dodesil sulfat (SDS). pada kelompok eukaryot. (4) pembuangan remukan sel. maka fragmen DNA tersebut sulit disambungkan dengan DNA dari vektor pengklonan. 2008). Konstruksi pustaka genom dan pengklonan DNA membutuhkan DNA yang utuh agar fragmen DNA betul-betul berasal dari proses pemotongan enzimatik yang sangat spesifik. isolasi DNA genom yang utuh sangat diperlukan bila DNA tersebut akan diproses untuk pengklonan (Suharsono dan Widyastuti. bahan genetik utama terdiri atas beberapa unit independen yang terpisah. (3) lisis sel. Perusakan dinding sel antara lain dapat dilakukan dengan pemberian lisozim. Selain DNA. Oleh sebab itu. Pendahuluan A. Sebaliknya. terdapat pula RNA sebagai materi genetik. Pemanenan sel dilakukan dari biakan yang telah diinkubasi sebelumnya.

2003). misalnya dengan penambahan amonium asetat dan alkohol. Fragmen yang kecil akan berjalan cepat. sedangkan fragmen yang berukuran lebih besar akan berjalan lebih lambat (Yuwono. DNA hasil isolasi dikatakan baik apabila mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi dan tidak mengalami fragmentasi (Anonim. Selain itu. dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA. Hal tersebut menyebabkan praktikum isolasi dan visualisasi DNA hewan merupakan hal yang sangat penting untuk dipahami dan dipelajari. suatu bahan semi-padat berupa polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut (Yatim. Molekul DNA yang telah diisolosi tersebut kemudian dimurnikan. Visualisasi terhadap hasil elektroforesis DNA yang telah diisolasi tersebut penting untuk dipelajari. 2008). Fragmen molekul DNA dapat ditentukan ukurannya melalui medium gel agarosa. Elektroforesis dilakukan berdasarkan ukuran makromolekul. B.protein dan RNA masing-masing dihilangkan menggunakan kloroform dan RNAse. Tujuan Praktikum Untuk mengisolasi DNA genomik bakteri Eschericia coli secara bertahap dan mengamati hasil running dari DNA bakteri pada medium gel agarosa pada visualisasi menggunakan UV. Kecepatan gerak molekul pada elektroforesis bergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya dan pada bentuk molekulnya. Elektroforesis merupakan teknik biologi sel untuk analisis DNA. 2 . Pengetahuan awal yang didapatkan akan mendasari penelitian-penelitian selanjutnya yang lebih mendalam. kebutuhan masyarakat akan informasi genetik dan teknologi pun dewasa ini kian berkembang. Hasil tersebut merupakan pengetahuan awal untuk proses analisa dan riset di bidang biologi molekuler. misalnya dampak obat dan antibiotik. Fragmen-fragmen DNA yang telah diisolasi kemudian dielektroforesis. 2008).

cetakan gel agarosa.50 mm Tris pH 8. selotipe bening. microtube (ependorf). B. Bahan analisis yang digunakan fenol:klorofom (50v:50v). tip. dan buffer pewarna. seperangkat alat elektroforesis. buffer I (10 mM glukosa. beaker glass 100 ml.5 ml kultur hasil inkubasi 16 jam tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam microtubekemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.0). stirrer. Universitas Kristen Satya Wacana. centrifuge. coli. Pemanenan Sel dari Kultur Bakteri Kultur overnight (semalam) bakteri (E. Alat dan Bahan Beberapa alat yang digunakan adalah hot plate. Beberapa bahan yang digunakan adalah agarosa.000 rpm selama 5 menit. UV. buffer TE. Waktu dan Tempat Praktikum Praktikum dilaksanakan pada bulan November – Desember 2011. sarung tangan dan mikropipet. kalium asetat 5M. buffer II (0. 20 mM EDTA pH. Inkubasi dilakukan di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (overnight). Bahan dan Metode A. sisir sumuran. Salatiga. 1% SDS). ethanol absolut. Sebanyak 1. C. pestel.II. bibiter es dan selotip. buffer TAE. mortar. Bahan uji yang digunakan adalah sampel DNA Bakteri E.5 ml kultur hasil inkubasi sebelumnya dan kembali diulang 3 . vortex. Supernatan yang dihasilkan dibuang. 0. Ke dalam microtube berisi pellet kembali dituangkan 1. Fakultas Biologi. di Laboratorium Biokimia dan Biologi Molekuler.2 M NaOH. coli) dikultivasi ke media cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni bakteri ke media LB (Luria Bertani). ethanol 70 %. Prosedur Kerja 1. ethidium bromida. waterbath. H2O steril. sehingga dalam microtube hanya terdapat pellet. wadah es.

lisis sel dan pembuangan remukannya Supernatan yang dihasilkan dibuang dan diperoleh pellet sel bakteri. diresuspensi dengan cara digojog (± 1 menit).000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. Proses selanjutnya ke dalam tabung ditambah CI sebanyak 1x volume supernatan. ditambah 50 µl TE dan 4 . Pemisahan DNA dari protein dan RNA Supernatan tersebut ditambah Na asetat 3 M pH 5. 3.000 rpm selama 5 menit.000 rpm. diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kecepatan tinggi 13.Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam disentrifugasi kecepatan tinggi 13. 100 µl fenol dingin. Lapisan paling atas dari supernatan dipindahkan kembali ke tabung sentrifuge yang baru dan diperkirakan besar volumenya. Tabung sentrifuge hasil inkubasi satu jam ditambah 200 µl buffer lisis ditambah bibiter (fresh). 2.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit.1 volume supernatan dan etanol absolut sebanyak 2x volume supernatan. Supernatan dibuang kembali dan pellet diresuspensi dengan 200 µl lisozim dengan cara vortex dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam (dalam prakteknya tahap ini dilewati karena tidak terdapatnya lisozim pada laboratorium). Lapisan paling atas dari supernatan dipindahkan ke tabung sentrifuge dan diperkirakan besar volumenya. Pellet diresuspensi dengan 1 ml larutan STE (Bufer Sodium Tris-EDTA) dengan cara vortex dan disentrifugasi dengan kecepatan 5. Campuran larutan tersebut diresuspensi dan dilakukan inkubasi pada suhu 20oC selama 2 jam. Perusakan dinding sel.memasukkan kultur inkubasi ke dalam tabung microtube sebanyak 1.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kecepatan tinggi 13. tabung dikeringkan.5 ml dan disentrifugasi selama 5. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 µl etanol 70%. Ke dalam tabung ditambah 100 µl CI (kloroform Isoamil alkoholdan). Supernatan dibuang kembali.2 sebanyak 0. diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13.

mula-mula gel agarosa dibuat dengan konsentrasi 0. Selanjutnya. 5 . kemudian arus listrik dimatikan. Gel agarosa diambil. Suspensi yang diperoleh adalah suspensi DNA kromosom bakteri. Pada DNA yang telah diisolasi ditambahkan buffer pewarna sebanyak 4 L dan H2O steril 6 L. Gel agarosa tersebut dimasukkan ke dalam chamber elektroforesis dengan hatihati pula. dicat dengan EtBr yang telah disiapkan selama 8 menit dalam ruang UV. coliyang telah diisolasi dimasukkan pada sumur gel agarosa dengan mikropipet P20. Setelah dicampurkan. Elektroforesis dan visualisasinya Untuk melakukan eletroforesis terhadap sampel. dan didinginkan hingga mengeras pada suhu ruang. Campuran DNA E. sementara dipersiapkan gel agarosa. microtube ditutup kembali dan disimpan di dekat es batu. Langkah terakhir. Agarosa ditambahkan pada pelarut buffer TAE. Chamber elektroforesis ditutup dan disambungkan dengan kabel penghubung arus listriknya.8% (Lampiran). 4.Gel agarosa yang telah mengeras dikeluarkan dari cetakannya dengan hati-hati. Campuran dididihkan dalam hot plate dan stirrer. Arus listrik 80 V dialirkan selama 2 jam. hasil elektroforesis DNA divisualisasikan dengan radiasi UV transilluminator. direndam dengan buffer TAE secukupnya. kemudian dituangkan ke dalam cetakan gel yang sudah diatur posisinya bersama sisir sumurannya.diresuspensi dengan cara dibolak-balik.

6 . pribadi.III. Hasil dan Pembahasan A. Hasil Sampel DNA bakteri E. coli tersebut (Gambar 1). tipis) h : DNA bakteri (smear) Gambar 1. b c d e f a h g Keterangan : a b c d : sumuran : sampel DNA hewan : sampel DNA tumbuhan : sampel DNA jamur e f g : sampel DNA bakteri : DNA hewan (smear) : DNA jamur (smear. Hasil isolasi DNA kemudian dielektroforesis dan divisualisasi untuk dianalisis DNA genomikyang terdapat pada E. Hasil visualisasi dari elektroforesis beberapa sampel DNApada gel agarosa setelah diberi penyinaran UV (Dok. coli diisolasi dengan menambahkan beberapa larutan/ senyawa tertentu dengan fungsi spesifik. 2011).

tampak adanya DNA hewan. setelah diberi fenol dan dibolak-balik seharusnya terdapat lendir jika tutup tube dibuka. harus sampai larut supaya enzim bekerja merata dan efektif. dan bakteri yang tervisualisasi.Pada hasil foto dari visualisasi elektroforesis. Lebih baik semua tahap dilakukan di atas es yang telah diserut. dilakukan pelepasan DNA dari sel. untuk menjaga suhu supaya dingin. DNA masih belum tampak. Dalam penghomogenan.EDTA mengikat ion Mg2+ sehingga mendestabilisasi membran (karena ion Mg ada pada protein membran hilang) dan menghambat DNAse (Muttaqin. jamur.Sedangkan dari sampel tumbuhan. Setelah sel dipanen. Hal yang harus diperhatikan dalam tahap tersebut adalah sebagai berikut. Penggunaan pelarut organik akan menggumpalkan DNA dapat dilihat pada gambar berikut.Pemberian bibiter bertujuan untuk mencerna dinding sel. berbeda pada jamur yang walaupun tampak tetapi sangat tipis. 2010). SDS dapat melarutkan protein membran dan enzim. B. Gambar 2. Pengaruh pemberian C-I untuk mempresipitasi DNA. smear tampak jelas. Pada sampel bakteri dan hewan. Selain itu. Pembahasan Tahap pertama yang dilakukan dalam isolasi DNA bakteri adalah pemanenan seluntuk mendapatkan pellet sel yang terpisah dari media pertumbuhannya. 7 .

Selanjutnya.Prinsip pemekatan DNA kromosom hampir sama dengan pemekatan plasmid. Atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi. 2010). Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. 2010). Ion-ion seperti kation (Na+. 8 . Ilustrasinya sebagai berikut (Gambar 4). Etanol dapat mempresipitasi DNA karena penambahan garam berfungsi sebagai penetralcharge pada gula fosfat DNA.Fungsi penembahan pelarut organik seperti etanol adalah menurunkan konstanta dielektrik tersebut. Tahap selanjutnya adalah pemisahan dan pemekatan DNA.Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. ditambahkan etanol 70% yang berguna untuk membersihkan lagi dan lebih memekatkan DNA(Muttaqin. Pengaruh pemberian SDS dan EDTA terhadap dinding sel.Gambar 3. gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan  (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air (air memiliki 2 muatan (+) pada H dan  pada O). Etamol absolut dingin bertujuan mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas dan mencuci plasmid(Muttaqin.Jika di dalam air. Penambahan C-I dilakukan dua kali karena protein mungkin masih tersisa pada tube dari pembersihan dengan C-I pertama. Atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi.

hanya sekitar satu jam. pada sampel DNA tumbuhan. maka voltage dapat diperkecil dan gel agarosa diencerkan. Diduga. dinding sel tumbuhan masih belum lisis karena tidak digunakannya nitrogen cair. Sedangkan dugaan kedua. Namun.Gambar 4. masih tidak tampak running jelas dari sampel hasil isolasi. Sayangnya masih belum digunakannya marker/ penanda sehingga ukuran DNA yang tervisualisasi tidak dapat diketahui. DNA berukuran terlalu besar. maka apabila elektroforesis dilakukan hanya satu jam atau kurang. 9 .. coli. electrophoresis migration rate yang dialami terlalu singkat. tidak tampak hasil visualisasi. berikutnya dilakukan elektroforesis terhadap sampel tersebut. Dan yang kedua. Agar DNA yang terlalu besar dapat tervisualisasi dengan baik. demikian pula pada hewan dan jamur. sehingga tidak maksimal saat dielektroforesis. electrophoresis migration rate yang terjadi pada gel agarosa belum dapat menunjukkan keberadaan DNA yang berukuran besar tersebut (Becker et al. ada tiga kemungkinan penyebab visualisasi yang kurang memuaskan. Mengingat ukuran DNA yang terlalu besar. 2009). Pertama. Ketiga. Ilustrasi pengaruh penambahan etanol dibandingkan dengan air pada rantai DNA. Elektroforesis ternyata telah dapat memberikan hasil visualisasi yang cukup baik pada sampel bakteri. sehingga saat diamati di bawah UV. Setelah dilakukan tahap isolasi DNA bakteri E. yaitu running yang sedikit sekali terjadi karena waktu yang diberikan untuk elektroforesis cukup singkat.

Pengaruh temperatur Mobilitas DNA stabil pada temperatur 4-30C dan elektroforesis gel agarosa dilakukan pada suhu kamar. 10 . Penggunaan voltage (tegangan listrik) dan arah dari bidang elektris Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional. 6. umum dipakai untuk preparatif. 2. Konsentrasi gel agarosa Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan bergerak sesuai dengan konsentrasi dari gel agarosa yang digunakan. electrophoresis migration rate (migrasi rata-rata eletroforesis) selama DNA bergerak menembus gel agarosa dipengaruhi oleh beberapa faktor utama. 5. yaitu sebagai berikut. circular-opened (II). Ada tiga macam bentuk DNA. 7. Konformasi DNA Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/ konformasi DNA. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single stranded atau double stranded asam nukleat (DNA atau RNA). Komposisi buffer elektroforesis Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang digunakan untuk pembuatan gel agarosa. Misalnya. Keberadaan pewarna DNA Intercalating agent ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresence untuk deteksi asam nukleat. 4. 1.Menurut Becker (2009). Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. tetapi efektif untuk isolasi DNA dari gel agarosa. untuk DNA  2 kb pada gel agarosa bergerak  5 v/cm. EtBr akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. kemampuan paling rendah. Ukuran molekul DNA Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat. Misalnya tris-acetate. 3. menghasilkan laju migrasi yang berbeda. dan linier (III). yaitu super-helix circular (I). Untuk masing-masing ukuran DNA yang bergerak ideal pada tegangan tertentu.

Kesimpulan Dari hasil yang didapatkan. dapat dilihat adanya DNA E. Jadi pada isolasi DNA Bakteri ini kita mendapatkan DNA yang belum benarbenar murni. coli dari hasil visualisasi dengan menggunakan sinar ultra violet (UV). Sayangnya masih belum digunakannya marker / penanda sehingga ukuran DNA yang tervisualisasi tidak dapat diketahui. Kemungkinan hal itu disebabkan adanya protein lain atau ada bagian-bagian sel yang terikut (debris sel) pada saat isolasi DNA.IV. 11 . sedangkan bagian bawah gel agarose masih terdapat berkas. Dengan elektroforesis memberikan hasil memuaskan pada visualisasi DNA E. coli. Dari hasil elektroforesis menunjukkan pita DNA bakteri tampak jelas (berarti jumlah DNA yang terdeteksi banyak).

DNA Science – A First Course. 2008.rcaprpb.J.A.. 2003. R. J.wordpress. W. Institut Pertanian Bogor.com/UserFiles/File/BTLA%20vol%205%20no%202%202006/DNA%20rum put%20laut. Jakarta : Erlangga. G.wordpress. Anonim. L.com/praktikum/petunjuk-praktikum/i-isolasidna-kromosom-bakteri/). Laporan II – Isolasi DNA Genom. The World of the Cell. 2003. 2009. Diakses tanggal 20 Oktober 2011. Biologi Molekuler. Yatim. D.pdf). Bertoni. New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press. Yuwono.A. T. Jakarta : Yayasan Obor Indonesia.com/2011/03/17/isolasi-dnagenom-2/). dan G. (http://23bios1unsoed. (http://biofin. W.Daftar Pustaka Anam K. Isolasi DNA Genom dan Polymerase Chain Reaction (PCR) Gen Penyandi 16s rRNA. dan D.P. 2010. Kleinsmith. Pasande. Isolasi DNA Kromosom Bakteri. 2010. Freyer. Peningkatan Kemurnian Genom DNA Rumput Laut Melalui Penambahan Kalium Asetat dalam Metode Ekstraksi DNA. Becker. Kamus Biologi. 12 . Hardin. Micklos. Diakses tanggal 27 Oktober 2009. Crotty.M. Cold Spring Harbor. (http://www. 2006. Muttaqin M. 2008. Inc.A. San Fransisco : Pearson Education. Diakses tanggal 19 Oktober 2011.

sebanyak 0.28 ml = 0. untuk memenuhi cetakan gel agarosa. sehingga agarosa yang dipakai dapat dihitung sebagai berikut.28 g 13 .28 g gel agarosa dilarutkan dengan pelarut buffer TAE hingga volume 35 ml.Lampiran Pembuatan gel agarosa 0.8% pada cetakan Ukur volume cetakan untuk membuat gel agarosa  Cetakan diberi selotip bening pada samping-sampingnya  Akuades dituangkan ke dalam cetakan yang sampingnya telah rapat oleh selotip  Diukur banyaknya akuades yang dituangkan dalam cetakan hingga cetakan tersebut penuh  Diketahui bahwa volume akuades untuk memenuhi cetakan adalah 35 ml  Gel agarosa yang hendak dibuat adalah 0.8% x volume cetakan =  Jadi. 0.8%. = 0.

Komposisi masing-masing larutan yang ditambahkan untuk isolasi DNA bakteri 14 .

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->