Isolasi dan Visualisasi DNA Genomik Bakteri Eschericia coli

Laporan Genetika Molekuler

Kelompok 4 :

Metta Padmalia Jily Gavrila Sompie

412008002 412008018

Program Studi Biologi Fakultas Biologi Universitas Kristen Satya Wacana Salatiga 2011

Pembuangan remukan sel dilakukan dengan cara sentrifugasi. atau sama sekali belum dipotong. sedangkan 1 . Bila terpotongnya DNA bukan karena reaksi enzimatik. Konstruksi pustaka genom dan pengklonan DNA membutuhkan DNA yang utuh agar fragmen DNA betul-betul berasal dari proses pemotongan enzimatik yang sangat spesifik. Pada kelompok prokaryot. 2008). (2003). 2010). isolasi DNA genom yang utuh sangat diperlukan bila DNA tersebut akan diproses untuk pengklonan (Suharsono dan Widyastuti. Pendahuluan A. Isolasi DNA kromosm bakteri secara garis besar meliputi tahap-tahap (1) pemanenan sel. Materi-materi genetik menyandi berbagai informasi untuk sintesis protein pada organisme. elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA yang sudah dipotong sebelumnya. (4) pembuangan remukan sel. bahan genetik utama terdiri atas beberapa unit independen yang terpisah. Perusakan dinding sel antara lain dapat dilakukan dengan pemberian lisozim. Latar Belakang Menurut Micklos et al. pada kelompok eukaryot.I. umumnya hanya ada satu unit bahan genetik utama yang membawa semua informasi genetik yang diperlukan untuk kelangsungan pertumbuhan jasad tersebut. Oleh sebab itu. DNA merupakan materi genetik dalam organisme. 2006 dalam Anam. sedangkan untuk lisis sel biasanya digunakan sodium dodesil sulfat (SDS). Isolasi DNA genom sangat penting dalam rangka pengklonan DNA atau gen sasaran. (3) lisis sel. serta (5) pemisahan DNA dari protein dan RNA. tetapi semua unit bahan genetik merupakan satu kesatuan genom yang menentukan kelangsungan hidup suatu spesies eukaryot (Yuwono. Sebaliknya. (2) perusakan dan pembuangan dinding sel. Selain DNA. Salah satu perbedaan fundamental antara jasad prokaryot dan eukaryot adalah pada organisasi bahan genetiknya (Yuwono. terdapat pula RNA sebagai materi genetik. Pemanenan sel dilakukan dari biakan yang telah diinkubasi sebelumnya. 2008). maka fragmen DNA tersebut sulit disambungkan dengan DNA dari vektor pengklonan.

Kecepatan gerak molekul pada elektroforesis bergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya dan pada bentuk molekulnya. Hal tersebut menyebabkan praktikum isolasi dan visualisasi DNA hewan merupakan hal yang sangat penting untuk dipahami dan dipelajari. Selain itu. Fragmen molekul DNA dapat ditentukan ukurannya melalui medium gel agarosa. misalnya dengan penambahan amonium asetat dan alkohol. Elektroforesis dilakukan berdasarkan ukuran makromolekul. 2003). 2 . Tujuan Praktikum Untuk mengisolasi DNA genomik bakteri Eschericia coli secara bertahap dan mengamati hasil running dari DNA bakteri pada medium gel agarosa pada visualisasi menggunakan UV. Hasil tersebut merupakan pengetahuan awal untuk proses analisa dan riset di bidang biologi molekuler. kebutuhan masyarakat akan informasi genetik dan teknologi pun dewasa ini kian berkembang. dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. suatu bahan semi-padat berupa polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut (Yatim. sedangkan fragmen yang berukuran lebih besar akan berjalan lebih lambat (Yuwono. Elektroforesis merupakan teknik biologi sel untuk analisis DNA. Fragmen yang kecil akan berjalan cepat. 2008). 2008). misalnya dampak obat dan antibiotik. Visualisasi terhadap hasil elektroforesis DNA yang telah diisolasi tersebut penting untuk dipelajari. DNA hasil isolasi dikatakan baik apabila mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi dan tidak mengalami fragmentasi (Anonim. Molekul DNA yang telah diisolosi tersebut kemudian dimurnikan. Pengetahuan awal yang didapatkan akan mendasari penelitian-penelitian selanjutnya yang lebih mendalam. untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA.protein dan RNA masing-masing dihilangkan menggunakan kloroform dan RNAse. B. Fragmen-fragmen DNA yang telah diisolasi kemudian dielektroforesis.

20 mM EDTA pH. tip. H2O steril. buffer I (10 mM glukosa. buffer TAE.II. buffer TE. Salatiga. ethidium bromida. buffer II (0. beaker glass 100 ml. coli) dikultivasi ke media cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni bakteri ke media LB (Luria Bertani). Ke dalam microtube berisi pellet kembali dituangkan 1. ethanol absolut. stirrer. mortar. centrifuge. vortex. kalium asetat 5M. C. Beberapa bahan yang digunakan adalah agarosa. ethanol 70 %. bibiter es dan selotip. Prosedur Kerja 1. Bahan dan Metode A.000 rpm selama 5 menit. Alat dan Bahan Beberapa alat yang digunakan adalah hot plate.50 mm Tris pH 8. 0. cetakan gel agarosa.5 ml kultur hasil inkubasi sebelumnya dan kembali diulang 3 . sehingga dalam microtube hanya terdapat pellet. 1% SDS). Universitas Kristen Satya Wacana. Waktu dan Tempat Praktikum Praktikum dilaksanakan pada bulan November – Desember 2011. sisir sumuran. seperangkat alat elektroforesis. Bahan uji yang digunakan adalah sampel DNA Bakteri E. coli. pestel. di Laboratorium Biokimia dan Biologi Molekuler. microtube (ependorf). Inkubasi dilakukan di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (overnight). Fakultas Biologi. wadah es. selotipe bening. Supernatan yang dihasilkan dibuang. UV. dan buffer pewarna. B. waterbath. Pemanenan Sel dari Kultur Bakteri Kultur overnight (semalam) bakteri (E.0).2 M NaOH. Sebanyak 1. Bahan analisis yang digunakan fenol:klorofom (50v:50v).5 ml kultur hasil inkubasi 16 jam tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam microtubekemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5. sarung tangan dan mikropipet.

diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kecepatan tinggi 13. 2. Pellet diresuspensi dengan 1 ml larutan STE (Bufer Sodium Tris-EDTA) dengan cara vortex dan disentrifugasi dengan kecepatan 5. lisis sel dan pembuangan remukannya Supernatan yang dihasilkan dibuang dan diperoleh pellet sel bakteri. Supernatan dibuang kembali dan pellet diresuspensi dengan 200 µl lisozim dengan cara vortex dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam (dalam prakteknya tahap ini dilewati karena tidak terdapatnya lisozim pada laboratorium). Supernatan dibuang kembali. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 µl etanol 70%. Perusakan dinding sel. ditambah 50 µl TE dan 4 . 100 µl fenol dingin. diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kecepatan tinggi 13.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. Ke dalam tabung ditambah 100 µl CI (kloroform Isoamil alkoholdan). Lapisan paling atas dari supernatan dipindahkan kembali ke tabung sentrifuge yang baru dan diperkirakan besar volumenya.000 rpm.000 rpm selama 5 menit. diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13. diresuspensi dengan cara digojog (± 1 menit). tabung dikeringkan. Campuran larutan tersebut diresuspensi dan dilakukan inkubasi pada suhu 20oC selama 2 jam.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit.memasukkan kultur inkubasi ke dalam tabung microtube sebanyak 1. Lapisan paling atas dari supernatan dipindahkan ke tabung sentrifuge dan diperkirakan besar volumenya. Pemisahan DNA dari protein dan RNA Supernatan tersebut ditambah Na asetat 3 M pH 5.1 volume supernatan dan etanol absolut sebanyak 2x volume supernatan.5 ml dan disentrifugasi selama 5. Proses selanjutnya ke dalam tabung ditambah CI sebanyak 1x volume supernatan. 3.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit.Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam disentrifugasi kecepatan tinggi 13.2 sebanyak 0. Tabung sentrifuge hasil inkubasi satu jam ditambah 200 µl buffer lisis ditambah bibiter (fresh).

diresuspensi dengan cara dibolak-balik. Agarosa ditambahkan pada pelarut buffer TAE. Langkah terakhir. kemudian dituangkan ke dalam cetakan gel yang sudah diatur posisinya bersama sisir sumurannya. sementara dipersiapkan gel agarosa. Arus listrik 80 V dialirkan selama 2 jam. hasil elektroforesis DNA divisualisasikan dengan radiasi UV transilluminator. Elektroforesis dan visualisasinya Untuk melakukan eletroforesis terhadap sampel. Gel agarosa diambil. Pada DNA yang telah diisolasi ditambahkan buffer pewarna sebanyak 4 L dan H2O steril 6 L.8% (Lampiran). Campuran DNA E.Gel agarosa yang telah mengeras dikeluarkan dari cetakannya dengan hati-hati. Setelah dicampurkan. Suspensi yang diperoleh adalah suspensi DNA kromosom bakteri. mula-mula gel agarosa dibuat dengan konsentrasi 0. Gel agarosa tersebut dimasukkan ke dalam chamber elektroforesis dengan hatihati pula. microtube ditutup kembali dan disimpan di dekat es batu. Selanjutnya. Campuran dididihkan dalam hot plate dan stirrer. 4. 5 . direndam dengan buffer TAE secukupnya. dan didinginkan hingga mengeras pada suhu ruang. kemudian arus listrik dimatikan. dicat dengan EtBr yang telah disiapkan selama 8 menit dalam ruang UV. coliyang telah diisolasi dimasukkan pada sumur gel agarosa dengan mikropipet P20. Chamber elektroforesis ditutup dan disambungkan dengan kabel penghubung arus listriknya.

2011). Hasil isolasi DNA kemudian dielektroforesis dan divisualisasi untuk dianalisis DNA genomikyang terdapat pada E. pribadi. tipis) h : DNA bakteri (smear) Gambar 1. Hasil dan Pembahasan A. 6 .III. coli diisolasi dengan menambahkan beberapa larutan/ senyawa tertentu dengan fungsi spesifik. coli tersebut (Gambar 1). Hasil Sampel DNA bakteri E. b c d e f a h g Keterangan : a b c d : sumuran : sampel DNA hewan : sampel DNA tumbuhan : sampel DNA jamur e f g : sampel DNA bakteri : DNA hewan (smear) : DNA jamur (smear. Hasil visualisasi dari elektroforesis beberapa sampel DNApada gel agarosa setelah diberi penyinaran UV (Dok.

Sedangkan dari sampel tumbuhan. harus sampai larut supaya enzim bekerja merata dan efektif. Hal yang harus diperhatikan dalam tahap tersebut adalah sebagai berikut. dilakukan pelepasan DNA dari sel. DNA masih belum tampak. SDS dapat melarutkan protein membran dan enzim. berbeda pada jamur yang walaupun tampak tetapi sangat tipis. smear tampak jelas. Penggunaan pelarut organik akan menggumpalkan DNA dapat dilihat pada gambar berikut. jamur. tampak adanya DNA hewan. Selain itu. Setelah sel dipanen. Pengaruh pemberian C-I untuk mempresipitasi DNA. Pembahasan Tahap pertama yang dilakukan dalam isolasi DNA bakteri adalah pemanenan seluntuk mendapatkan pellet sel yang terpisah dari media pertumbuhannya.Pemberian bibiter bertujuan untuk mencerna dinding sel. setelah diberi fenol dan dibolak-balik seharusnya terdapat lendir jika tutup tube dibuka. untuk menjaga suhu supaya dingin. dan bakteri yang tervisualisasi. 7 . 2010). Dalam penghomogenan. Pada sampel bakteri dan hewan. B. Gambar 2.Pada hasil foto dari visualisasi elektroforesis. Lebih baik semua tahap dilakukan di atas es yang telah diserut.EDTA mengikat ion Mg2+ sehingga mendestabilisasi membran (karena ion Mg ada pada protein membran hilang) dan menghambat DNAse (Muttaqin.

Etanol dapat mempresipitasi DNA karena penambahan garam berfungsi sebagai penetralcharge pada gula fosfat DNA. Atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi.Fungsi penembahan pelarut organik seperti etanol adalah menurunkan konstanta dielektrik tersebut. Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. Penambahan C-I dilakukan dua kali karena protein mungkin masih tersisa pada tube dari pembersihan dengan C-I pertama. 2010). Tahap selanjutnya adalah pemisahan dan pemekatan DNA. Ilustrasinya sebagai berikut (Gambar 4).Prinsip pemekatan DNA kromosom hampir sama dengan pemekatan plasmid. 8 .Selanjutnya.Jika di dalam air. gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan  (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air (air memiliki 2 muatan (+) pada H dan  pada O). Etamol absolut dingin bertujuan mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas dan mencuci plasmid(Muttaqin. 2010).Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. Pengaruh pemberian SDS dan EDTA terhadap dinding sel. Atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi. ditambahkan etanol 70% yang berguna untuk membersihkan lagi dan lebih memekatkan DNA(Muttaqin.Gambar 3. Ion-ion seperti kation (Na+.

Setelah dilakukan tahap isolasi DNA bakteri E. maka apabila elektroforesis dilakukan hanya satu jam atau kurang. tidak tampak hasil visualisasi. Sayangnya masih belum digunakannya marker/ penanda sehingga ukuran DNA yang tervisualisasi tidak dapat diketahui. ada tiga kemungkinan penyebab visualisasi yang kurang memuaskan. pada sampel DNA tumbuhan.. maka voltage dapat diperkecil dan gel agarosa diencerkan. dinding sel tumbuhan masih belum lisis karena tidak digunakannya nitrogen cair. 9 . Agar DNA yang terlalu besar dapat tervisualisasi dengan baik. electrophoresis migration rate yang dialami terlalu singkat. masih tidak tampak running jelas dari sampel hasil isolasi. sehingga tidak maksimal saat dielektroforesis. Diduga. sehingga saat diamati di bawah UV. Dan yang kedua. Ilustrasi pengaruh penambahan etanol dibandingkan dengan air pada rantai DNA. hanya sekitar satu jam. Mengingat ukuran DNA yang terlalu besar. Pertama. demikian pula pada hewan dan jamur. Elektroforesis ternyata telah dapat memberikan hasil visualisasi yang cukup baik pada sampel bakteri. DNA berukuran terlalu besar. berikutnya dilakukan elektroforesis terhadap sampel tersebut. 2009). yaitu running yang sedikit sekali terjadi karena waktu yang diberikan untuk elektroforesis cukup singkat. Ketiga. Sedangkan dugaan kedua. electrophoresis migration rate yang terjadi pada gel agarosa belum dapat menunjukkan keberadaan DNA yang berukuran besar tersebut (Becker et al.Gambar 4. Namun. coli.

6. Pengaruh temperatur Mobilitas DNA stabil pada temperatur 4-30C dan elektroforesis gel agarosa dilakukan pada suhu kamar. 5. 4. kemampuan paling rendah.Menurut Becker (2009). umum dipakai untuk preparatif. untuk DNA  2 kb pada gel agarosa bergerak  5 v/cm. dan linier (III). Konsentrasi gel agarosa Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan bergerak sesuai dengan konsentrasi dari gel agarosa yang digunakan. Keberadaan pewarna DNA Intercalating agent ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresence untuk deteksi asam nukleat. Penggunaan voltage (tegangan listrik) dan arah dari bidang elektris Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional. yaitu super-helix circular (I). 7. Untuk masing-masing ukuran DNA yang bergerak ideal pada tegangan tertentu. Konformasi DNA Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/ konformasi DNA. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single stranded atau double stranded asam nukleat (DNA atau RNA). menghasilkan laju migrasi yang berbeda. yaitu sebagai berikut. circular-opened (II). electrophoresis migration rate (migrasi rata-rata eletroforesis) selama DNA bergerak menembus gel agarosa dipengaruhi oleh beberapa faktor utama. 3. 10 . Komposisi buffer elektroforesis Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang digunakan untuk pembuatan gel agarosa. Misalnya. tetapi efektif untuk isolasi DNA dari gel agarosa. 1. Ada tiga macam bentuk DNA. 2. Ukuran molekul DNA Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat. EtBr akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. Misalnya tris-acetate.

Kemungkinan hal itu disebabkan adanya protein lain atau ada bagian-bagian sel yang terikut (debris sel) pada saat isolasi DNA. Dengan elektroforesis memberikan hasil memuaskan pada visualisasi DNA E. Dari hasil elektroforesis menunjukkan pita DNA bakteri tampak jelas (berarti jumlah DNA yang terdeteksi banyak). Kesimpulan Dari hasil yang didapatkan. Jadi pada isolasi DNA Bakteri ini kita mendapatkan DNA yang belum benarbenar murni. coli dari hasil visualisasi dengan menggunakan sinar ultra violet (UV). 11 .IV. sedangkan bagian bawah gel agarose masih terdapat berkas. dapat dilihat adanya DNA E. Sayangnya masih belum digunakannya marker / penanda sehingga ukuran DNA yang tervisualisasi tidak dapat diketahui. coli.

2003. Pasande. 2008..A.com/praktikum/petunjuk-praktikum/i-isolasidna-kromosom-bakteri/). (http://www. (http://23bios1unsoed. W. T. 12 . Kamus Biologi.M.Daftar Pustaka Anam K. New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2003. Kleinsmith. Cold Spring Harbor. Bertoni. Jakarta : Yayasan Obor Indonesia. The World of the Cell. Institut Pertanian Bogor. dan G. G. 2010. 2008. 2009. J. Crotty.wordpress.A. L. Isolasi DNA Genom dan Polymerase Chain Reaction (PCR) Gen Penyandi 16s rRNA. Micklos. Jakarta : Erlangga. W. dan D.com/2011/03/17/isolasi-dnagenom-2/).P. 2006. DNA Science – A First Course.J.rcaprpb.A. Anonim. Biologi Molekuler.wordpress. 2010. Diakses tanggal 19 Oktober 2011. Peningkatan Kemurnian Genom DNA Rumput Laut Melalui Penambahan Kalium Asetat dalam Metode Ekstraksi DNA.com/UserFiles/File/BTLA%20vol%205%20no%202%202006/DNA%20rum put%20laut. Freyer. Yuwono. Isolasi DNA Kromosom Bakteri. D. Diakses tanggal 27 Oktober 2009. Laporan II – Isolasi DNA Genom. Becker. Diakses tanggal 20 Oktober 2011. (http://biofin. San Fransisco : Pearson Education. Inc. Hardin. Yatim. R.pdf). Muttaqin M.

28 ml = 0.8% pada cetakan Ukur volume cetakan untuk membuat gel agarosa  Cetakan diberi selotip bening pada samping-sampingnya  Akuades dituangkan ke dalam cetakan yang sampingnya telah rapat oleh selotip  Diukur banyaknya akuades yang dituangkan dalam cetakan hingga cetakan tersebut penuh  Diketahui bahwa volume akuades untuk memenuhi cetakan adalah 35 ml  Gel agarosa yang hendak dibuat adalah 0. sehingga agarosa yang dipakai dapat dihitung sebagai berikut.28 g 13 .Lampiran Pembuatan gel agarosa 0. = 0. untuk memenuhi cetakan gel agarosa. 0.28 g gel agarosa dilarutkan dengan pelarut buffer TAE hingga volume 35 ml.8% x volume cetakan =  Jadi.8%. sebanyak 0.

Komposisi masing-masing larutan yang ditambahkan untuk isolasi DNA bakteri 14 .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful