Laporan Genmol_isolasi DNA Bakteri

Isolasi dan Visualisasi DNA Genomik Bakteri Eschericia coli

Laporan Genetika Molekuler

Kelompok 4 :

Metta Padmalia Jily Gavrila Sompie

412008002 412008018

Program Studi Biologi Fakultas Biologi Universitas Kristen Satya Wacana Salatiga 2011

Pada kelompok prokaryot. (2003). tetapi semua unit bahan genetik merupakan satu kesatuan genom yang menentukan kelangsungan hidup suatu spesies eukaryot (Yuwono. Salah satu perbedaan fundamental antara jasad prokaryot dan eukaryot adalah pada organisasi bahan genetiknya (Yuwono. Pemanenan sel dilakukan dari biakan yang telah diinkubasi sebelumnya. Oleh sebab itu. elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA yang sudah dipotong sebelumnya. terdapat pula RNA sebagai materi genetik. Bila terpotongnya DNA bukan karena reaksi enzimatik. 2006 dalam Anam. maka fragmen DNA tersebut sulit disambungkan dengan DNA dari vektor pengklonan. Konstruksi pustaka genom dan pengklonan DNA membutuhkan DNA yang utuh agar fragmen DNA betul-betul berasal dari proses pemotongan enzimatik yang sangat spesifik. 2008).I. Pembuangan remukan sel dilakukan dengan cara sentrifugasi. Isolasi DNA kromosm bakteri secara garis besar meliputi tahap-tahap (1) pemanenan sel. bahan genetik utama terdiri atas beberapa unit independen yang terpisah. DNA merupakan materi genetik dalam organisme. isolasi DNA genom yang utuh sangat diperlukan bila DNA tersebut akan diproses untuk pengklonan (Suharsono dan Widyastuti. umumnya hanya ada satu unit bahan genetik utama yang membawa semua informasi genetik yang diperlukan untuk kelangsungan pertumbuhan jasad tersebut. (3) lisis sel. serta (5) pemisahan DNA dari protein dan RNA. 2010). Pendahuluan A. Perusakan dinding sel antara lain dapat dilakukan dengan pemberian lisozim. sedangkan untuk lisis sel biasanya digunakan sodium dodesil sulfat (SDS). Selain DNA. Latar Belakang Menurut Micklos et al. atau sama sekali belum dipotong. 2008). sedangkan 1 . (2) perusakan dan pembuangan dinding sel. Isolasi DNA genom sangat penting dalam rangka pengklonan DNA atau gen sasaran. Materi-materi genetik menyandi berbagai informasi untuk sintesis protein pada organisme. pada kelompok eukaryot. Sebaliknya. (4) pembuangan remukan sel.

Selain itu. Hal tersebut menyebabkan praktikum isolasi dan visualisasi DNA hewan merupakan hal yang sangat penting untuk dipahami dan dipelajari. Fragmen yang kecil akan berjalan cepat. Fragmen-fragmen DNA yang telah diisolasi kemudian dielektroforesis. Fragmen molekul DNA dapat ditentukan ukurannya melalui medium gel agarosa. Molekul DNA yang telah diisolosi tersebut kemudian dimurnikan. Visualisasi terhadap hasil elektroforesis DNA yang telah diisolasi tersebut penting untuk dipelajari.protein dan RNA masing-masing dihilangkan menggunakan kloroform dan RNAse. misalnya dampak obat dan antibiotik. 2008). Elektroforesis merupakan teknik biologi sel untuk analisis DNA. Hasil tersebut merupakan pengetahuan awal untuk proses analisa dan riset di bidang biologi molekuler. 2003). Elektroforesis dilakukan berdasarkan ukuran makromolekul. suatu bahan semi-padat berupa polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut (Yatim. sedangkan fragmen yang berukuran lebih besar akan berjalan lebih lambat (Yuwono. kebutuhan masyarakat akan informasi genetik dan teknologi pun dewasa ini kian berkembang. Tujuan Praktikum Untuk mengisolasi DNA genomik bakteri Eschericia coli secara bertahap dan mengamati hasil running dari DNA bakteri pada medium gel agarosa pada visualisasi menggunakan UV. Kecepatan gerak molekul pada elektroforesis bergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya dan pada bentuk molekulnya. misalnya dengan penambahan amonium asetat dan alkohol. DNA hasil isolasi dikatakan baik apabila mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi dan tidak mengalami fragmentasi (Anonim. B. 2 . Pengetahuan awal yang didapatkan akan mendasari penelitian-penelitian selanjutnya yang lebih mendalam. 2008). dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA.

vortex. mortar. selotipe bening. coli) dikultivasi ke media cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni bakteri ke media LB (Luria Bertani). coli. Bahan uji yang digunakan adalah sampel DNA Bakteri E. buffer II (0. Beberapa bahan yang digunakan adalah agarosa. Bahan dan Metode A. Alat dan Bahan Beberapa alat yang digunakan adalah hot plate. beaker glass 100 ml. Prosedur Kerja 1. Pemanenan Sel dari Kultur Bakteri Kultur overnight (semalam) bakteri (E. B. Waktu dan Tempat Praktikum Praktikum dilaksanakan pada bulan November – Desember 2011. 1% SDS). buffer TAE. Ke dalam microtube berisi pellet kembali dituangkan 1. sisir sumuran. Salatiga.50 mm Tris pH 8. Inkubasi dilakukan di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (overnight).5 ml kultur hasil inkubasi sebelumnya dan kembali diulang 3 . bibiter es dan selotip. ethidium bromida.2 M NaOH.000 rpm selama 5 menit. centrifuge. 0. di Laboratorium Biokimia dan Biologi Molekuler. sehingga dalam microtube hanya terdapat pellet.II. pestel. H2O steril.0). ethanol absolut.5 ml kultur hasil inkubasi 16 jam tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam microtubekemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5. tip. buffer I (10 mM glukosa. 20 mM EDTA pH. dan buffer pewarna. UV. Universitas Kristen Satya Wacana. microtube (ependorf). ethanol 70 %. stirrer. seperangkat alat elektroforesis. sarung tangan dan mikropipet. Supernatan yang dihasilkan dibuang. Sebanyak 1. buffer TE. waterbath. C. Fakultas Biologi. wadah es. kalium asetat 5M. cetakan gel agarosa. Bahan analisis yang digunakan fenol:klorofom (50v:50v).

000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang kembali. ditambah 50 µl TE dan 4 . Tabung sentrifuge hasil inkubasi satu jam ditambah 200 µl buffer lisis ditambah bibiter (fresh). 100 µl fenol dingin.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 µl etanol 70%. Lapisan paling atas dari supernatan dipindahkan ke tabung sentrifuge dan diperkirakan besar volumenya. Ke dalam tabung ditambah 100 µl CI (kloroform Isoamil alkoholdan). diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kecepatan tinggi 13. Supernatan dibuang kembali dan pellet diresuspensi dengan 200 µl lisozim dengan cara vortex dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam (dalam prakteknya tahap ini dilewati karena tidak terdapatnya lisozim pada laboratorium). diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kecepatan tinggi 13.1 volume supernatan dan etanol absolut sebanyak 2x volume supernatan. 3.000 rpm.Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam disentrifugasi kecepatan tinggi 13. Pemisahan DNA dari protein dan RNA Supernatan tersebut ditambah Na asetat 3 M pH 5.5 ml dan disentrifugasi selama 5. diresuspensi dengan cara digojog (± 1 menit). Campuran larutan tersebut diresuspensi dan dilakukan inkubasi pada suhu 20oC selama 2 jam. Proses selanjutnya ke dalam tabung ditambah CI sebanyak 1x volume supernatan.2 sebanyak 0. Lapisan paling atas dari supernatan dipindahkan kembali ke tabung sentrifuge yang baru dan diperkirakan besar volumenya. lisis sel dan pembuangan remukannya Supernatan yang dihasilkan dibuang dan diperoleh pellet sel bakteri.memasukkan kultur inkubasi ke dalam tabung microtube sebanyak 1. diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13. 2. tabung dikeringkan.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. Pellet diresuspensi dengan 1 ml larutan STE (Bufer Sodium Tris-EDTA) dengan cara vortex dan disentrifugasi dengan kecepatan 5. Perusakan dinding sel.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit.

Gel agarosa yang telah mengeras dikeluarkan dari cetakannya dengan hati-hati. 4. Gel agarosa tersebut dimasukkan ke dalam chamber elektroforesis dengan hatihati pula. kemudian arus listrik dimatikan. Campuran dididihkan dalam hot plate dan stirrer. kemudian dituangkan ke dalam cetakan gel yang sudah diatur posisinya bersama sisir sumurannya. sementara dipersiapkan gel agarosa. microtube ditutup kembali dan disimpan di dekat es batu. Chamber elektroforesis ditutup dan disambungkan dengan kabel penghubung arus listriknya.diresuspensi dengan cara dibolak-balik. hasil elektroforesis DNA divisualisasikan dengan radiasi UV transilluminator. dicat dengan EtBr yang telah disiapkan selama 8 menit dalam ruang UV. Elektroforesis dan visualisasinya Untuk melakukan eletroforesis terhadap sampel. mula-mula gel agarosa dibuat dengan konsentrasi 0. Selanjutnya. coliyang telah diisolasi dimasukkan pada sumur gel agarosa dengan mikropipet P20. Arus listrik 80 V dialirkan selama 2 jam. Setelah dicampurkan.8% (Lampiran). Langkah terakhir. dan didinginkan hingga mengeras pada suhu ruang. 5 . direndam dengan buffer TAE secukupnya. Campuran DNA E. Pada DNA yang telah diisolasi ditambahkan buffer pewarna sebanyak 4 L dan H2O steril 6 L. Agarosa ditambahkan pada pelarut buffer TAE. Gel agarosa diambil. Suspensi yang diperoleh adalah suspensi DNA kromosom bakteri.

Hasil visualisasi dari elektroforesis beberapa sampel DNApada gel agarosa setelah diberi penyinaran UV (Dok.III. coli diisolasi dengan menambahkan beberapa larutan/ senyawa tertentu dengan fungsi spesifik. Hasil dan Pembahasan A. 2011). pribadi. coli tersebut (Gambar 1). Hasil Sampel DNA bakteri E. tipis) h : DNA bakteri (smear) Gambar 1. b c d e f a h g Keterangan : a b c d : sumuran : sampel DNA hewan : sampel DNA tumbuhan : sampel DNA jamur e f g : sampel DNA bakteri : DNA hewan (smear) : DNA jamur (smear. 6 . Hasil isolasi DNA kemudian dielektroforesis dan divisualisasi untuk dianalisis DNA genomikyang terdapat pada E.

Pembahasan Tahap pertama yang dilakukan dalam isolasi DNA bakteri adalah pemanenan seluntuk mendapatkan pellet sel yang terpisah dari media pertumbuhannya. tampak adanya DNA hewan.Pada hasil foto dari visualisasi elektroforesis. Pengaruh pemberian C-I untuk mempresipitasi DNA. Gambar 2. berbeda pada jamur yang walaupun tampak tetapi sangat tipis.EDTA mengikat ion Mg2+ sehingga mendestabilisasi membran (karena ion Mg ada pada protein membran hilang) dan menghambat DNAse (Muttaqin. Penggunaan pelarut organik akan menggumpalkan DNA dapat dilihat pada gambar berikut. SDS dapat melarutkan protein membran dan enzim.Pemberian bibiter bertujuan untuk mencerna dinding sel. Hal yang harus diperhatikan dalam tahap tersebut adalah sebagai berikut. Pada sampel bakteri dan hewan. dilakukan pelepasan DNA dari sel.Sedangkan dari sampel tumbuhan. Setelah sel dipanen. Lebih baik semua tahap dilakukan di atas es yang telah diserut. B. untuk menjaga suhu supaya dingin. harus sampai larut supaya enzim bekerja merata dan efektif. Selain itu. smear tampak jelas. dan bakteri yang tervisualisasi. 2010). DNA masih belum tampak. setelah diberi fenol dan dibolak-balik seharusnya terdapat lendir jika tutup tube dibuka. jamur. 7 . Dalam penghomogenan.

2010). Pengaruh pemberian SDS dan EDTA terhadap dinding sel. Etanol dapat mempresipitasi DNA karena penambahan garam berfungsi sebagai penetralcharge pada gula fosfat DNA. Tahap selanjutnya adalah pemisahan dan pemekatan DNA.Selanjutnya. ditambahkan etanol 70% yang berguna untuk membersihkan lagi dan lebih memekatkan DNA(Muttaqin.Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. Atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi.Prinsip pemekatan DNA kromosom hampir sama dengan pemekatan plasmid. 2010).Gambar 3. Etamol absolut dingin bertujuan mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas dan mencuci plasmid(Muttaqin. gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan  (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air (air memiliki 2 muatan (+) pada H dan  pada O). Ion-ion seperti kation (Na+. Ilustrasinya sebagai berikut (Gambar 4).Fungsi penembahan pelarut organik seperti etanol adalah menurunkan konstanta dielektrik tersebut. 8 . Atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi.Jika di dalam air. Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. Penambahan C-I dilakukan dua kali karena protein mungkin masih tersisa pada tube dari pembersihan dengan C-I pertama.

maka apabila elektroforesis dilakukan hanya satu jam atau kurang. Diduga. Dan yang kedua.. yaitu running yang sedikit sekali terjadi karena waktu yang diberikan untuk elektroforesis cukup singkat. sehingga saat diamati di bawah UV. maka voltage dapat diperkecil dan gel agarosa diencerkan. 9 . Ketiga. coli. tidak tampak hasil visualisasi. Pertama. Elektroforesis ternyata telah dapat memberikan hasil visualisasi yang cukup baik pada sampel bakteri. hanya sekitar satu jam.Gambar 4. sehingga tidak maksimal saat dielektroforesis. pada sampel DNA tumbuhan. Agar DNA yang terlalu besar dapat tervisualisasi dengan baik. DNA berukuran terlalu besar. Ilustrasi pengaruh penambahan etanol dibandingkan dengan air pada rantai DNA. Setelah dilakukan tahap isolasi DNA bakteri E. electrophoresis migration rate yang dialami terlalu singkat. berikutnya dilakukan elektroforesis terhadap sampel tersebut. Sayangnya masih belum digunakannya marker/ penanda sehingga ukuran DNA yang tervisualisasi tidak dapat diketahui. electrophoresis migration rate yang terjadi pada gel agarosa belum dapat menunjukkan keberadaan DNA yang berukuran besar tersebut (Becker et al. Namun. ada tiga kemungkinan penyebab visualisasi yang kurang memuaskan. 2009). masih tidak tampak running jelas dari sampel hasil isolasi. Mengingat ukuran DNA yang terlalu besar. dinding sel tumbuhan masih belum lisis karena tidak digunakannya nitrogen cair. demikian pula pada hewan dan jamur. Sedangkan dugaan kedua.

Menurut Becker (2009). Keberadaan pewarna DNA Intercalating agent ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresence untuk deteksi asam nukleat. Misalnya tris-acetate. Konformasi DNA Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/ konformasi DNA. 4. Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. 6. 3. 2. EtBr akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. Untuk masing-masing ukuran DNA yang bergerak ideal pada tegangan tertentu. Penggunaan voltage (tegangan listrik) dan arah dari bidang elektris Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional. dan linier (III). kemampuan paling rendah. umum dipakai untuk preparatif. yaitu super-helix circular (I). Komposisi buffer elektroforesis Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang digunakan untuk pembuatan gel agarosa. yaitu sebagai berikut. Ukuran molekul DNA Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat. Pengaruh temperatur Mobilitas DNA stabil pada temperatur 4-30C dan elektroforesis gel agarosa dilakukan pada suhu kamar. electrophoresis migration rate (migrasi rata-rata eletroforesis) selama DNA bergerak menembus gel agarosa dipengaruhi oleh beberapa faktor utama. menghasilkan laju migrasi yang berbeda. Misalnya. 7. circular-opened (II). 1. tetapi efektif untuk isolasi DNA dari gel agarosa. 5. untuk DNA  2 kb pada gel agarosa bergerak  5 v/cm. Ada tiga macam bentuk DNA. Konsentrasi gel agarosa Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan bergerak sesuai dengan konsentrasi dari gel agarosa yang digunakan. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single stranded atau double stranded asam nukleat (DNA atau RNA). 10 .

Dari hasil elektroforesis menunjukkan pita DNA bakteri tampak jelas (berarti jumlah DNA yang terdeteksi banyak). Dengan elektroforesis memberikan hasil memuaskan pada visualisasi DNA E. Jadi pada isolasi DNA Bakteri ini kita mendapatkan DNA yang belum benarbenar murni. dapat dilihat adanya DNA E. sedangkan bagian bawah gel agarose masih terdapat berkas. coli dari hasil visualisasi dengan menggunakan sinar ultra violet (UV). 11 . coli. Sayangnya masih belum digunakannya marker / penanda sehingga ukuran DNA yang tervisualisasi tidak dapat diketahui. Kemungkinan hal itu disebabkan adanya protein lain atau ada bagian-bagian sel yang terikut (debris sel) pada saat isolasi DNA.IV. Kesimpulan Dari hasil yang didapatkan.

Inc. Peningkatan Kemurnian Genom DNA Rumput Laut Melalui Penambahan Kalium Asetat dalam Metode Ekstraksi DNA.rcaprpb. Yuwono. The World of the Cell. Kleinsmith. Becker. 2010. San Fransisco : Pearson Education. Hardin.wordpress. 2010.com/2011/03/17/isolasi-dnagenom-2/). Biologi Molekuler. (http://biofin. D.pdf). 2003. Muttaqin M. Jakarta : Erlangga. Diakses tanggal 20 Oktober 2011. G. Yatim. Laporan II – Isolasi DNA Genom. J.com/praktikum/petunjuk-praktikum/i-isolasidna-kromosom-bakteri/).A. Bertoni. New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press. Isolasi DNA Genom dan Polymerase Chain Reaction (PCR) Gen Penyandi 16s rRNA. Kamus Biologi. Cold Spring Harbor. 2008. Diakses tanggal 27 Oktober 2009.Daftar Pustaka Anam K. (http://23bios1unsoed. dan D. dan G. 2008.J. 2009.A. W. Pasande. 12 . Jakarta : Yayasan Obor Indonesia.wordpress. 2003. Diakses tanggal 19 Oktober 2011.. T. Micklos.P. 2006. Anonim. (http://www.M. Crotty. R. Freyer.A. Institut Pertanian Bogor. L. Isolasi DNA Kromosom Bakteri. W.com/UserFiles/File/BTLA%20vol%205%20no%202%202006/DNA%20rum put%20laut. DNA Science – A First Course.

28 ml = 0. = 0. sehingga agarosa yang dipakai dapat dihitung sebagai berikut.28 g 13 .8% x volume cetakan =  Jadi.8% pada cetakan Ukur volume cetakan untuk membuat gel agarosa  Cetakan diberi selotip bening pada samping-sampingnya  Akuades dituangkan ke dalam cetakan yang sampingnya telah rapat oleh selotip  Diukur banyaknya akuades yang dituangkan dalam cetakan hingga cetakan tersebut penuh  Diketahui bahwa volume akuades untuk memenuhi cetakan adalah 35 ml  Gel agarosa yang hendak dibuat adalah 0. untuk memenuhi cetakan gel agarosa.8%.Lampiran Pembuatan gel agarosa 0. sebanyak 0. 0.28 g gel agarosa dilarutkan dengan pelarut buffer TAE hingga volume 35 ml.

Komposisi masing-masing larutan yang ditambahkan untuk isolasi DNA bakteri 14 .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful