Isolasi dan Visualisasi DNA Genomik Bakteri Eschericia coli

Laporan Genetika Molekuler

Kelompok 4 :

Metta Padmalia Jily Gavrila Sompie

412008002 412008018

Program Studi Biologi Fakultas Biologi Universitas Kristen Satya Wacana Salatiga 2011

atau sama sekali belum dipotong. Materi-materi genetik menyandi berbagai informasi untuk sintesis protein pada organisme. serta (5) pemisahan DNA dari protein dan RNA. Salah satu perbedaan fundamental antara jasad prokaryot dan eukaryot adalah pada organisasi bahan genetiknya (Yuwono. Isolasi DNA genom sangat penting dalam rangka pengklonan DNA atau gen sasaran. DNA merupakan materi genetik dalam organisme. Pemanenan sel dilakukan dari biakan yang telah diinkubasi sebelumnya. Latar Belakang Menurut Micklos et al. Pada kelompok prokaryot. (4) pembuangan remukan sel. (2) perusakan dan pembuangan dinding sel. (2003). Pembuangan remukan sel dilakukan dengan cara sentrifugasi. maka fragmen DNA tersebut sulit disambungkan dengan DNA dari vektor pengklonan. 2008). 2008). Bila terpotongnya DNA bukan karena reaksi enzimatik. Isolasi DNA kromosm bakteri secara garis besar meliputi tahap-tahap (1) pemanenan sel. 2010). Pendahuluan A. sedangkan untuk lisis sel biasanya digunakan sodium dodesil sulfat (SDS). elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA yang sudah dipotong sebelumnya. Oleh sebab itu. isolasi DNA genom yang utuh sangat diperlukan bila DNA tersebut akan diproses untuk pengklonan (Suharsono dan Widyastuti. Sebaliknya. pada kelompok eukaryot. Konstruksi pustaka genom dan pengklonan DNA membutuhkan DNA yang utuh agar fragmen DNA betul-betul berasal dari proses pemotongan enzimatik yang sangat spesifik. 2006 dalam Anam. (3) lisis sel. tetapi semua unit bahan genetik merupakan satu kesatuan genom yang menentukan kelangsungan hidup suatu spesies eukaryot (Yuwono. umumnya hanya ada satu unit bahan genetik utama yang membawa semua informasi genetik yang diperlukan untuk kelangsungan pertumbuhan jasad tersebut. Perusakan dinding sel antara lain dapat dilakukan dengan pemberian lisozim. bahan genetik utama terdiri atas beberapa unit independen yang terpisah.I. Selain DNA. sedangkan 1 . terdapat pula RNA sebagai materi genetik.

Visualisasi terhadap hasil elektroforesis DNA yang telah diisolasi tersebut penting untuk dipelajari. kebutuhan masyarakat akan informasi genetik dan teknologi pun dewasa ini kian berkembang. 2008). Elektroforesis merupakan teknik biologi sel untuk analisis DNA. Tujuan Praktikum Untuk mengisolasi DNA genomik bakteri Eschericia coli secara bertahap dan mengamati hasil running dari DNA bakteri pada medium gel agarosa pada visualisasi menggunakan UV. 2 . Kecepatan gerak molekul pada elektroforesis bergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya dan pada bentuk molekulnya. misalnya dampak obat dan antibiotik. sedangkan fragmen yang berukuran lebih besar akan berjalan lebih lambat (Yuwono. DNA hasil isolasi dikatakan baik apabila mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi dan tidak mengalami fragmentasi (Anonim. Selain itu. suatu bahan semi-padat berupa polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut (Yatim. 2008). Molekul DNA yang telah diisolosi tersebut kemudian dimurnikan. untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA. Fragmen molekul DNA dapat ditentukan ukurannya melalui medium gel agarosa. Hasil tersebut merupakan pengetahuan awal untuk proses analisa dan riset di bidang biologi molekuler. Elektroforesis dilakukan berdasarkan ukuran makromolekul. B. Fragmen yang kecil akan berjalan cepat. Pengetahuan awal yang didapatkan akan mendasari penelitian-penelitian selanjutnya yang lebih mendalam. 2003). misalnya dengan penambahan amonium asetat dan alkohol. dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Fragmen-fragmen DNA yang telah diisolasi kemudian dielektroforesis.protein dan RNA masing-masing dihilangkan menggunakan kloroform dan RNAse. Hal tersebut menyebabkan praktikum isolasi dan visualisasi DNA hewan merupakan hal yang sangat penting untuk dipahami dan dipelajari.

di Laboratorium Biokimia dan Biologi Molekuler. 1% SDS). kalium asetat 5M. vortex. sisir sumuran. stirrer. cetakan gel agarosa. coli) dikultivasi ke media cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni bakteri ke media LB (Luria Bertani). bibiter es dan selotip. Beberapa bahan yang digunakan adalah agarosa. sehingga dalam microtube hanya terdapat pellet. centrifuge. UV. ethidium bromida.2 M NaOH. waterbath. ethanol 70 %. Salatiga.II. Bahan dan Metode A. tip. Waktu dan Tempat Praktikum Praktikum dilaksanakan pada bulan November – Desember 2011. beaker glass 100 ml. Ke dalam microtube berisi pellet kembali dituangkan 1. buffer I (10 mM glukosa. wadah es. Inkubasi dilakukan di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (overnight).5 ml kultur hasil inkubasi sebelumnya dan kembali diulang 3 . 0. Pemanenan Sel dari Kultur Bakteri Kultur overnight (semalam) bakteri (E. Fakultas Biologi. coli. C. buffer TE. H2O steril. buffer TAE.000 rpm selama 5 menit. Bahan uji yang digunakan adalah sampel DNA Bakteri E. dan buffer pewarna. mortar. ethanol absolut. Bahan analisis yang digunakan fenol:klorofom (50v:50v).5 ml kultur hasil inkubasi 16 jam tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam microtubekemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.0). Prosedur Kerja 1. B. buffer II (0. Alat dan Bahan Beberapa alat yang digunakan adalah hot plate. 20 mM EDTA pH. seperangkat alat elektroforesis. sarung tangan dan mikropipet. selotipe bening. microtube (ependorf). Sebanyak 1. Universitas Kristen Satya Wacana. pestel.50 mm Tris pH 8. Supernatan yang dihasilkan dibuang.

000 rpm selama 5 menit.000 rpm. diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kecepatan tinggi 13. Proses selanjutnya ke dalam tabung ditambah CI sebanyak 1x volume supernatan.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. Lapisan paling atas dari supernatan dipindahkan kembali ke tabung sentrifuge yang baru dan diperkirakan besar volumenya.5 ml dan disentrifugasi selama 5. diresuspensi dengan cara digojog (± 1 menit). Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 µl etanol 70%.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit.memasukkan kultur inkubasi ke dalam tabung microtube sebanyak 1. Campuran larutan tersebut diresuspensi dan dilakukan inkubasi pada suhu 20oC selama 2 jam. Ke dalam tabung ditambah 100 µl CI (kloroform Isoamil alkoholdan). Supernatan dibuang kembali dan pellet diresuspensi dengan 200 µl lisozim dengan cara vortex dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam (dalam prakteknya tahap ini dilewati karena tidak terdapatnya lisozim pada laboratorium).1 volume supernatan dan etanol absolut sebanyak 2x volume supernatan.2 sebanyak 0.Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam disentrifugasi kecepatan tinggi 13. ditambah 50 µl TE dan 4 . 2. tabung dikeringkan. Supernatan dibuang kembali.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. Pemisahan DNA dari protein dan RNA Supernatan tersebut ditambah Na asetat 3 M pH 5.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13. lisis sel dan pembuangan remukannya Supernatan yang dihasilkan dibuang dan diperoleh pellet sel bakteri. 100 µl fenol dingin. Lapisan paling atas dari supernatan dipindahkan ke tabung sentrifuge dan diperkirakan besar volumenya. Perusakan dinding sel. Tabung sentrifuge hasil inkubasi satu jam ditambah 200 µl buffer lisis ditambah bibiter (fresh). 3. Pellet diresuspensi dengan 1 ml larutan STE (Bufer Sodium Tris-EDTA) dengan cara vortex dan disentrifugasi dengan kecepatan 5. diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kecepatan tinggi 13.

coliyang telah diisolasi dimasukkan pada sumur gel agarosa dengan mikropipet P20. sementara dipersiapkan gel agarosa. kemudian dituangkan ke dalam cetakan gel yang sudah diatur posisinya bersama sisir sumurannya. microtube ditutup kembali dan disimpan di dekat es batu. 4.8% (Lampiran). hasil elektroforesis DNA divisualisasikan dengan radiasi UV transilluminator. Campuran dididihkan dalam hot plate dan stirrer. kemudian arus listrik dimatikan. dan didinginkan hingga mengeras pada suhu ruang. 5 . Gel agarosa diambil. Pada DNA yang telah diisolasi ditambahkan buffer pewarna sebanyak 4 L dan H2O steril 6 L. Elektroforesis dan visualisasinya Untuk melakukan eletroforesis terhadap sampel. direndam dengan buffer TAE secukupnya.Gel agarosa yang telah mengeras dikeluarkan dari cetakannya dengan hati-hati. mula-mula gel agarosa dibuat dengan konsentrasi 0. Setelah dicampurkan. Suspensi yang diperoleh adalah suspensi DNA kromosom bakteri. Selanjutnya. dicat dengan EtBr yang telah disiapkan selama 8 menit dalam ruang UV. Gel agarosa tersebut dimasukkan ke dalam chamber elektroforesis dengan hatihati pula. Agarosa ditambahkan pada pelarut buffer TAE.diresuspensi dengan cara dibolak-balik. Arus listrik 80 V dialirkan selama 2 jam. Langkah terakhir. Chamber elektroforesis ditutup dan disambungkan dengan kabel penghubung arus listriknya. Campuran DNA E.

2011). coli diisolasi dengan menambahkan beberapa larutan/ senyawa tertentu dengan fungsi spesifik. Hasil isolasi DNA kemudian dielektroforesis dan divisualisasi untuk dianalisis DNA genomikyang terdapat pada E. coli tersebut (Gambar 1). tipis) h : DNA bakteri (smear) Gambar 1. pribadi. 6 . b c d e f a h g Keterangan : a b c d : sumuran : sampel DNA hewan : sampel DNA tumbuhan : sampel DNA jamur e f g : sampel DNA bakteri : DNA hewan (smear) : DNA jamur (smear. Hasil visualisasi dari elektroforesis beberapa sampel DNApada gel agarosa setelah diberi penyinaran UV (Dok.III. Hasil Sampel DNA bakteri E. Hasil dan Pembahasan A.

Gambar 2. Pengaruh pemberian C-I untuk mempresipitasi DNA. smear tampak jelas.Sedangkan dari sampel tumbuhan. 7 . berbeda pada jamur yang walaupun tampak tetapi sangat tipis. Selain itu. Dalam penghomogenan. setelah diberi fenol dan dibolak-balik seharusnya terdapat lendir jika tutup tube dibuka. Pada sampel bakteri dan hewan. 2010). SDS dapat melarutkan protein membran dan enzim. dan bakteri yang tervisualisasi. harus sampai larut supaya enzim bekerja merata dan efektif. untuk menjaga suhu supaya dingin. Hal yang harus diperhatikan dalam tahap tersebut adalah sebagai berikut. Lebih baik semua tahap dilakukan di atas es yang telah diserut.Pada hasil foto dari visualisasi elektroforesis. DNA masih belum tampak. Setelah sel dipanen. jamur.Pemberian bibiter bertujuan untuk mencerna dinding sel. Penggunaan pelarut organik akan menggumpalkan DNA dapat dilihat pada gambar berikut. tampak adanya DNA hewan. Pembahasan Tahap pertama yang dilakukan dalam isolasi DNA bakteri adalah pemanenan seluntuk mendapatkan pellet sel yang terpisah dari media pertumbuhannya. B.EDTA mengikat ion Mg2+ sehingga mendestabilisasi membran (karena ion Mg ada pada protein membran hilang) dan menghambat DNAse (Muttaqin. dilakukan pelepasan DNA dari sel.

Selanjutnya. Atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi.Prinsip pemekatan DNA kromosom hampir sama dengan pemekatan plasmid. gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan  (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air (air memiliki 2 muatan (+) pada H dan  pada O). 2010). Pengaruh pemberian SDS dan EDTA terhadap dinding sel. 8 . Penambahan C-I dilakukan dua kali karena protein mungkin masih tersisa pada tube dari pembersihan dengan C-I pertama. Etamol absolut dingin bertujuan mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas dan mencuci plasmid(Muttaqin. 2010). ditambahkan etanol 70% yang berguna untuk membersihkan lagi dan lebih memekatkan DNA(Muttaqin. Etanol dapat mempresipitasi DNA karena penambahan garam berfungsi sebagai penetralcharge pada gula fosfat DNA. Ion-ion seperti kation (Na+.Jika di dalam air. Atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi. Ilustrasinya sebagai berikut (Gambar 4).Gambar 3.Fungsi penembahan pelarut organik seperti etanol adalah menurunkan konstanta dielektrik tersebut. Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif.Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. Tahap selanjutnya adalah pemisahan dan pemekatan DNA.

. sehingga saat diamati di bawah UV. maka apabila elektroforesis dilakukan hanya satu jam atau kurang. electrophoresis migration rate yang dialami terlalu singkat. masih tidak tampak running jelas dari sampel hasil isolasi. Elektroforesis ternyata telah dapat memberikan hasil visualisasi yang cukup baik pada sampel bakteri. Sedangkan dugaan kedua. sehingga tidak maksimal saat dielektroforesis. yaitu running yang sedikit sekali terjadi karena waktu yang diberikan untuk elektroforesis cukup singkat. demikian pula pada hewan dan jamur. Pertama. ada tiga kemungkinan penyebab visualisasi yang kurang memuaskan. maka voltage dapat diperkecil dan gel agarosa diencerkan. 2009). dinding sel tumbuhan masih belum lisis karena tidak digunakannya nitrogen cair. Namun.Gambar 4. Ilustrasi pengaruh penambahan etanol dibandingkan dengan air pada rantai DNA. pada sampel DNA tumbuhan. electrophoresis migration rate yang terjadi pada gel agarosa belum dapat menunjukkan keberadaan DNA yang berukuran besar tersebut (Becker et al. Dan yang kedua. berikutnya dilakukan elektroforesis terhadap sampel tersebut. Setelah dilakukan tahap isolasi DNA bakteri E. DNA berukuran terlalu besar. Diduga. 9 . Ketiga. Mengingat ukuran DNA yang terlalu besar. Agar DNA yang terlalu besar dapat tervisualisasi dengan baik. hanya sekitar satu jam. coli. tidak tampak hasil visualisasi. Sayangnya masih belum digunakannya marker/ penanda sehingga ukuran DNA yang tervisualisasi tidak dapat diketahui.

menghasilkan laju migrasi yang berbeda. Konformasi DNA Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/ konformasi DNA. umum dipakai untuk preparatif. 6. Penggunaan voltage (tegangan listrik) dan arah dari bidang elektris Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional. electrophoresis migration rate (migrasi rata-rata eletroforesis) selama DNA bergerak menembus gel agarosa dipengaruhi oleh beberapa faktor utama. Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. 1. 3. Ada tiga macam bentuk DNA. Untuk masing-masing ukuran DNA yang bergerak ideal pada tegangan tertentu. 4. 5. Ukuran molekul DNA Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat. 10 . Misalnya tris-acetate. Konsentrasi gel agarosa Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan bergerak sesuai dengan konsentrasi dari gel agarosa yang digunakan. tetapi efektif untuk isolasi DNA dari gel agarosa. yaitu sebagai berikut. Keberadaan pewarna DNA Intercalating agent ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresence untuk deteksi asam nukleat. dan linier (III). circular-opened (II). yaitu super-helix circular (I). kemampuan paling rendah. Misalnya. 2. untuk DNA  2 kb pada gel agarosa bergerak  5 v/cm. Komposisi buffer elektroforesis Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang digunakan untuk pembuatan gel agarosa. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single stranded atau double stranded asam nukleat (DNA atau RNA).Menurut Becker (2009). 7. EtBr akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. Pengaruh temperatur Mobilitas DNA stabil pada temperatur 4-30C dan elektroforesis gel agarosa dilakukan pada suhu kamar.

Dari hasil elektroforesis menunjukkan pita DNA bakteri tampak jelas (berarti jumlah DNA yang terdeteksi banyak). 11 . Sayangnya masih belum digunakannya marker / penanda sehingga ukuran DNA yang tervisualisasi tidak dapat diketahui. Kemungkinan hal itu disebabkan adanya protein lain atau ada bagian-bagian sel yang terikut (debris sel) pada saat isolasi DNA. Dengan elektroforesis memberikan hasil memuaskan pada visualisasi DNA E. coli. Jadi pada isolasi DNA Bakteri ini kita mendapatkan DNA yang belum benarbenar murni.IV. dapat dilihat adanya DNA E. coli dari hasil visualisasi dengan menggunakan sinar ultra violet (UV). sedangkan bagian bawah gel agarose masih terdapat berkas. Kesimpulan Dari hasil yang didapatkan.

R. 2009. Peningkatan Kemurnian Genom DNA Rumput Laut Melalui Penambahan Kalium Asetat dalam Metode Ekstraksi DNA. (http://23bios1unsoed. J.Daftar Pustaka Anam K.P. Jakarta : Erlangga. T. Biologi Molekuler.A.M.pdf). 2003. (http://www. D.com/2011/03/17/isolasi-dnagenom-2/). W. L. Jakarta : Yayasan Obor Indonesia. 2006. 2010. 2010. Pasande.A. Yatim. 2008. Diakses tanggal 20 Oktober 2011.J. dan D.com/praktikum/petunjuk-praktikum/i-isolasidna-kromosom-bakteri/). Laporan II – Isolasi DNA Genom.wordpress. dan G.com/UserFiles/File/BTLA%20vol%205%20no%202%202006/DNA%20rum put%20laut. Yuwono. DNA Science – A First Course.A. 2003..wordpress. Muttaqin M. (http://biofin. Isolasi DNA Genom dan Polymerase Chain Reaction (PCR) Gen Penyandi 16s rRNA. Anonim. San Fransisco : Pearson Education. Hardin. G. Isolasi DNA Kromosom Bakteri. Freyer. Institut Pertanian Bogor. W. Diakses tanggal 27 Oktober 2009. Kamus Biologi. Crotty. Kleinsmith. 12 . 2008. Bertoni. Cold Spring Harbor. The World of the Cell. Diakses tanggal 19 Oktober 2011. Micklos. Inc.rcaprpb. New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press. Becker.

8% x volume cetakan =  Jadi. 0.28 ml = 0. sehingga agarosa yang dipakai dapat dihitung sebagai berikut. sebanyak 0.8% pada cetakan Ukur volume cetakan untuk membuat gel agarosa  Cetakan diberi selotip bening pada samping-sampingnya  Akuades dituangkan ke dalam cetakan yang sampingnya telah rapat oleh selotip  Diukur banyaknya akuades yang dituangkan dalam cetakan hingga cetakan tersebut penuh  Diketahui bahwa volume akuades untuk memenuhi cetakan adalah 35 ml  Gel agarosa yang hendak dibuat adalah 0.Lampiran Pembuatan gel agarosa 0.8%. = 0.28 g gel agarosa dilarutkan dengan pelarut buffer TAE hingga volume 35 ml.28 g 13 . untuk memenuhi cetakan gel agarosa.

Komposisi masing-masing larutan yang ditambahkan untuk isolasi DNA bakteri 14 .