Isolasi dan Visualisasi DNA Genomik Bakteri Eschericia coli

Laporan Genetika Molekuler

Kelompok 4 :

Metta Padmalia Jily Gavrila Sompie

412008002 412008018

Program Studi Biologi Fakultas Biologi Universitas Kristen Satya Wacana Salatiga 2011

DNA merupakan materi genetik dalam organisme. pada kelompok eukaryot. atau sama sekali belum dipotong. sedangkan untuk lisis sel biasanya digunakan sodium dodesil sulfat (SDS). Isolasi DNA genom sangat penting dalam rangka pengklonan DNA atau gen sasaran. sedangkan 1 .I. Salah satu perbedaan fundamental antara jasad prokaryot dan eukaryot adalah pada organisasi bahan genetiknya (Yuwono. (4) pembuangan remukan sel. Bila terpotongnya DNA bukan karena reaksi enzimatik. Selain DNA. terdapat pula RNA sebagai materi genetik. serta (5) pemisahan DNA dari protein dan RNA. 2010). (2) perusakan dan pembuangan dinding sel. Pemanenan sel dilakukan dari biakan yang telah diinkubasi sebelumnya. Perusakan dinding sel antara lain dapat dilakukan dengan pemberian lisozim. 2006 dalam Anam. elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA yang sudah dipotong sebelumnya. Pada kelompok prokaryot. Isolasi DNA kromosm bakteri secara garis besar meliputi tahap-tahap (1) pemanenan sel. 2008). Oleh sebab itu. (3) lisis sel. Materi-materi genetik menyandi berbagai informasi untuk sintesis protein pada organisme. Pendahuluan A. tetapi semua unit bahan genetik merupakan satu kesatuan genom yang menentukan kelangsungan hidup suatu spesies eukaryot (Yuwono. Pembuangan remukan sel dilakukan dengan cara sentrifugasi. umumnya hanya ada satu unit bahan genetik utama yang membawa semua informasi genetik yang diperlukan untuk kelangsungan pertumbuhan jasad tersebut. bahan genetik utama terdiri atas beberapa unit independen yang terpisah. 2008). Latar Belakang Menurut Micklos et al. (2003). maka fragmen DNA tersebut sulit disambungkan dengan DNA dari vektor pengklonan. Sebaliknya. isolasi DNA genom yang utuh sangat diperlukan bila DNA tersebut akan diproses untuk pengklonan (Suharsono dan Widyastuti. Konstruksi pustaka genom dan pengklonan DNA membutuhkan DNA yang utuh agar fragmen DNA betul-betul berasal dari proses pemotongan enzimatik yang sangat spesifik.

Pengetahuan awal yang didapatkan akan mendasari penelitian-penelitian selanjutnya yang lebih mendalam. Elektroforesis dilakukan berdasarkan ukuran makromolekul. Elektroforesis merupakan teknik biologi sel untuk analisis DNA. Fragmen molekul DNA dapat ditentukan ukurannya melalui medium gel agarosa. misalnya dampak obat dan antibiotik. Tujuan Praktikum Untuk mengisolasi DNA genomik bakteri Eschericia coli secara bertahap dan mengamati hasil running dari DNA bakteri pada medium gel agarosa pada visualisasi menggunakan UV. misalnya dengan penambahan amonium asetat dan alkohol.protein dan RNA masing-masing dihilangkan menggunakan kloroform dan RNAse. sedangkan fragmen yang berukuran lebih besar akan berjalan lebih lambat (Yuwono. 2008). Fragmen yang kecil akan berjalan cepat. Hasil tersebut merupakan pengetahuan awal untuk proses analisa dan riset di bidang biologi molekuler. Fragmen-fragmen DNA yang telah diisolasi kemudian dielektroforesis. Molekul DNA yang telah diisolosi tersebut kemudian dimurnikan. Hal tersebut menyebabkan praktikum isolasi dan visualisasi DNA hewan merupakan hal yang sangat penting untuk dipahami dan dipelajari. 2 . Visualisasi terhadap hasil elektroforesis DNA yang telah diisolasi tersebut penting untuk dipelajari. 2008). Kecepatan gerak molekul pada elektroforesis bergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya dan pada bentuk molekulnya. DNA hasil isolasi dikatakan baik apabila mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi dan tidak mengalami fragmentasi (Anonim. 2003). kebutuhan masyarakat akan informasi genetik dan teknologi pun dewasa ini kian berkembang. Selain itu. untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA. suatu bahan semi-padat berupa polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut (Yatim. dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. B.

Alat dan Bahan Beberapa alat yang digunakan adalah hot plate. buffer TAE. stirrer. tip. beaker glass 100 ml. vortex. Universitas Kristen Satya Wacana.000 rpm selama 5 menit. buffer TE. Inkubasi dilakukan di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (overnight).5 ml kultur hasil inkubasi 16 jam tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam microtubekemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5. UV. di Laboratorium Biokimia dan Biologi Molekuler. microtube (ependorf). ethanol absolut.2 M NaOH. sehingga dalam microtube hanya terdapat pellet. Supernatan yang dihasilkan dibuang. coli.5 ml kultur hasil inkubasi sebelumnya dan kembali diulang 3 . bibiter es dan selotip. Bahan analisis yang digunakan fenol:klorofom (50v:50v). selotipe bening. 0. Pemanenan Sel dari Kultur Bakteri Kultur overnight (semalam) bakteri (E. 1% SDS). Ke dalam microtube berisi pellet kembali dituangkan 1. Fakultas Biologi. pestel.0). waterbath. Beberapa bahan yang digunakan adalah agarosa. centrifuge. buffer II (0. H2O steril. Waktu dan Tempat Praktikum Praktikum dilaksanakan pada bulan November – Desember 2011.II. wadah es. sarung tangan dan mikropipet. Sebanyak 1. mortar.50 mm Tris pH 8. Salatiga. B. kalium asetat 5M. Bahan dan Metode A. dan buffer pewarna. seperangkat alat elektroforesis. Prosedur Kerja 1. sisir sumuran. buffer I (10 mM glukosa. 20 mM EDTA pH. coli) dikultivasi ke media cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni bakteri ke media LB (Luria Bertani). cetakan gel agarosa. Bahan uji yang digunakan adalah sampel DNA Bakteri E. ethanol 70 %. ethidium bromida. C.

2 sebanyak 0. Campuran larutan tersebut diresuspensi dan dilakukan inkubasi pada suhu 20oC selama 2 jam. Ke dalam tabung ditambah 100 µl CI (kloroform Isoamil alkoholdan). Supernatan dibuang kembali dan pellet diresuspensi dengan 200 µl lisozim dengan cara vortex dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam (dalam prakteknya tahap ini dilewati karena tidak terdapatnya lisozim pada laboratorium). 100 µl fenol dingin. diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kecepatan tinggi 13. Lapisan paling atas dari supernatan dipindahkan kembali ke tabung sentrifuge yang baru dan diperkirakan besar volumenya. Pemisahan DNA dari protein dan RNA Supernatan tersebut ditambah Na asetat 3 M pH 5. Tabung sentrifuge hasil inkubasi satu jam ditambah 200 µl buffer lisis ditambah bibiter (fresh). Lapisan paling atas dari supernatan dipindahkan ke tabung sentrifuge dan diperkirakan besar volumenya.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. 3. Proses selanjutnya ke dalam tabung ditambah CI sebanyak 1x volume supernatan. 2. ditambah 50 µl TE dan 4 .000 rpm selama 5 menit.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. Pellet diresuspensi dengan 1 ml larutan STE (Bufer Sodium Tris-EDTA) dengan cara vortex dan disentrifugasi dengan kecepatan 5.Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam disentrifugasi kecepatan tinggi 13.5 ml dan disentrifugasi selama 5. lisis sel dan pembuangan remukannya Supernatan yang dihasilkan dibuang dan diperoleh pellet sel bakteri. diresuspensi dengan cara digojog (± 1 menit). Supernatan dibuang kembali. tabung dikeringkan.000 rpm.memasukkan kultur inkubasi ke dalam tabung microtube sebanyak 1. diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kecepatan tinggi 13.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 µl etanol 70%. Perusakan dinding sel.1 volume supernatan dan etanol absolut sebanyak 2x volume supernatan. diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit.

5 . kemudian arus listrik dimatikan.Gel agarosa yang telah mengeras dikeluarkan dari cetakannya dengan hati-hati. Gel agarosa diambil.diresuspensi dengan cara dibolak-balik. Elektroforesis dan visualisasinya Untuk melakukan eletroforesis terhadap sampel. 4. hasil elektroforesis DNA divisualisasikan dengan radiasi UV transilluminator. Selanjutnya. sementara dipersiapkan gel agarosa. direndam dengan buffer TAE secukupnya. dan didinginkan hingga mengeras pada suhu ruang. coliyang telah diisolasi dimasukkan pada sumur gel agarosa dengan mikropipet P20. Chamber elektroforesis ditutup dan disambungkan dengan kabel penghubung arus listriknya. Suspensi yang diperoleh adalah suspensi DNA kromosom bakteri. Agarosa ditambahkan pada pelarut buffer TAE. Gel agarosa tersebut dimasukkan ke dalam chamber elektroforesis dengan hatihati pula. Campuran DNA E. dicat dengan EtBr yang telah disiapkan selama 8 menit dalam ruang UV.8% (Lampiran). Pada DNA yang telah diisolasi ditambahkan buffer pewarna sebanyak 4 L dan H2O steril 6 L. Langkah terakhir. kemudian dituangkan ke dalam cetakan gel yang sudah diatur posisinya bersama sisir sumurannya. mula-mula gel agarosa dibuat dengan konsentrasi 0. Setelah dicampurkan. microtube ditutup kembali dan disimpan di dekat es batu. Arus listrik 80 V dialirkan selama 2 jam. Campuran dididihkan dalam hot plate dan stirrer.

Hasil Sampel DNA bakteri E. coli diisolasi dengan menambahkan beberapa larutan/ senyawa tertentu dengan fungsi spesifik. tipis) h : DNA bakteri (smear) Gambar 1.III. Hasil isolasi DNA kemudian dielektroforesis dan divisualisasi untuk dianalisis DNA genomikyang terdapat pada E. b c d e f a h g Keterangan : a b c d : sumuran : sampel DNA hewan : sampel DNA tumbuhan : sampel DNA jamur e f g : sampel DNA bakteri : DNA hewan (smear) : DNA jamur (smear. coli tersebut (Gambar 1). 6 . 2011). pribadi. Hasil visualisasi dari elektroforesis beberapa sampel DNApada gel agarosa setelah diberi penyinaran UV (Dok. Hasil dan Pembahasan A.

dilakukan pelepasan DNA dari sel.EDTA mengikat ion Mg2+ sehingga mendestabilisasi membran (karena ion Mg ada pada protein membran hilang) dan menghambat DNAse (Muttaqin. 7 . Selain itu. Pada sampel bakteri dan hewan. untuk menjaga suhu supaya dingin. smear tampak jelas. Penggunaan pelarut organik akan menggumpalkan DNA dapat dilihat pada gambar berikut. SDS dapat melarutkan protein membran dan enzim. B. Pembahasan Tahap pertama yang dilakukan dalam isolasi DNA bakteri adalah pemanenan seluntuk mendapatkan pellet sel yang terpisah dari media pertumbuhannya. Setelah sel dipanen. Lebih baik semua tahap dilakukan di atas es yang telah diserut. Pengaruh pemberian C-I untuk mempresipitasi DNA. Gambar 2. dan bakteri yang tervisualisasi. Dalam penghomogenan.Sedangkan dari sampel tumbuhan. 2010). berbeda pada jamur yang walaupun tampak tetapi sangat tipis.Pada hasil foto dari visualisasi elektroforesis. jamur. DNA masih belum tampak.Pemberian bibiter bertujuan untuk mencerna dinding sel. Hal yang harus diperhatikan dalam tahap tersebut adalah sebagai berikut. tampak adanya DNA hewan. harus sampai larut supaya enzim bekerja merata dan efektif. setelah diberi fenol dan dibolak-balik seharusnya terdapat lendir jika tutup tube dibuka.

Ilustrasinya sebagai berikut (Gambar 4). Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. Etamol absolut dingin bertujuan mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas dan mencuci plasmid(Muttaqin.Jika di dalam air.Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. ditambahkan etanol 70% yang berguna untuk membersihkan lagi dan lebih memekatkan DNA(Muttaqin. 2010).Selanjutnya. Tahap selanjutnya adalah pemisahan dan pemekatan DNA. Ion-ion seperti kation (Na+. 2010). Pengaruh pemberian SDS dan EDTA terhadap dinding sel.Fungsi penembahan pelarut organik seperti etanol adalah menurunkan konstanta dielektrik tersebut.Gambar 3. Etanol dapat mempresipitasi DNA karena penambahan garam berfungsi sebagai penetralcharge pada gula fosfat DNA.Prinsip pemekatan DNA kromosom hampir sama dengan pemekatan plasmid. Atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi. 8 . gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan  (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air (air memiliki 2 muatan (+) pada H dan  pada O). Atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi. Penambahan C-I dilakukan dua kali karena protein mungkin masih tersisa pada tube dari pembersihan dengan C-I pertama.

Sedangkan dugaan kedua. 9 . Mengingat ukuran DNA yang terlalu besar. berikutnya dilakukan elektroforesis terhadap sampel tersebut. electrophoresis migration rate yang terjadi pada gel agarosa belum dapat menunjukkan keberadaan DNA yang berukuran besar tersebut (Becker et al. demikian pula pada hewan dan jamur. Diduga. Agar DNA yang terlalu besar dapat tervisualisasi dengan baik. Pertama. dinding sel tumbuhan masih belum lisis karena tidak digunakannya nitrogen cair. Ilustrasi pengaruh penambahan etanol dibandingkan dengan air pada rantai DNA. pada sampel DNA tumbuhan. sehingga tidak maksimal saat dielektroforesis. masih tidak tampak running jelas dari sampel hasil isolasi. maka apabila elektroforesis dilakukan hanya satu jam atau kurang. electrophoresis migration rate yang dialami terlalu singkat. maka voltage dapat diperkecil dan gel agarosa diencerkan. 2009). Sayangnya masih belum digunakannya marker/ penanda sehingga ukuran DNA yang tervisualisasi tidak dapat diketahui. coli. Namun. DNA berukuran terlalu besar.Gambar 4. ada tiga kemungkinan penyebab visualisasi yang kurang memuaskan. Elektroforesis ternyata telah dapat memberikan hasil visualisasi yang cukup baik pada sampel bakteri. Setelah dilakukan tahap isolasi DNA bakteri E.. Dan yang kedua. yaitu running yang sedikit sekali terjadi karena waktu yang diberikan untuk elektroforesis cukup singkat. hanya sekitar satu jam. tidak tampak hasil visualisasi. sehingga saat diamati di bawah UV. Ketiga.

umum dipakai untuk preparatif. electrophoresis migration rate (migrasi rata-rata eletroforesis) selama DNA bergerak menembus gel agarosa dipengaruhi oleh beberapa faktor utama. menghasilkan laju migrasi yang berbeda. yaitu sebagai berikut. Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. untuk DNA  2 kb pada gel agarosa bergerak  5 v/cm. Ada tiga macam bentuk DNA. circular-opened (II). 7. dan linier (III). EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single stranded atau double stranded asam nukleat (DNA atau RNA). Misalnya tris-acetate. 5. Ukuran molekul DNA Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat.Menurut Becker (2009). 6. kemampuan paling rendah. 3. Konformasi DNA Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/ konformasi DNA. tetapi efektif untuk isolasi DNA dari gel agarosa. yaitu super-helix circular (I). Keberadaan pewarna DNA Intercalating agent ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresence untuk deteksi asam nukleat. Komposisi buffer elektroforesis Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang digunakan untuk pembuatan gel agarosa. Pengaruh temperatur Mobilitas DNA stabil pada temperatur 4-30C dan elektroforesis gel agarosa dilakukan pada suhu kamar. 2. 4. Konsentrasi gel agarosa Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan bergerak sesuai dengan konsentrasi dari gel agarosa yang digunakan. Penggunaan voltage (tegangan listrik) dan arah dari bidang elektris Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional. 1. EtBr akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. Untuk masing-masing ukuran DNA yang bergerak ideal pada tegangan tertentu. Misalnya. 10 .

IV. Sayangnya masih belum digunakannya marker / penanda sehingga ukuran DNA yang tervisualisasi tidak dapat diketahui. 11 . Dari hasil elektroforesis menunjukkan pita DNA bakteri tampak jelas (berarti jumlah DNA yang terdeteksi banyak). dapat dilihat adanya DNA E. Kemungkinan hal itu disebabkan adanya protein lain atau ada bagian-bagian sel yang terikut (debris sel) pada saat isolasi DNA. Dengan elektroforesis memberikan hasil memuaskan pada visualisasi DNA E. Jadi pada isolasi DNA Bakteri ini kita mendapatkan DNA yang belum benarbenar murni. coli. sedangkan bagian bawah gel agarose masih terdapat berkas. coli dari hasil visualisasi dengan menggunakan sinar ultra violet (UV). Kesimpulan Dari hasil yang didapatkan.

Diakses tanggal 19 Oktober 2011. Crotty. Isolasi DNA Kromosom Bakteri.A. Diakses tanggal 20 Oktober 2011. 2010. R. Cold Spring Harbor.Daftar Pustaka Anam K.A. New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press. (http://www. The World of the Cell. Hardin. Kleinsmith. San Fransisco : Pearson Education.P. Yuwono. Becker.wordpress. Kamus Biologi. Freyer. Jakarta : Yayasan Obor Indonesia.M. (http://biofin. Yatim.A. Muttaqin M. 2003. 2008.com/2011/03/17/isolasi-dnagenom-2/). 2010. 12 . W. D.com/UserFiles/File/BTLA%20vol%205%20no%202%202006/DNA%20rum put%20laut. dan D. T. Inc. Peningkatan Kemurnian Genom DNA Rumput Laut Melalui Penambahan Kalium Asetat dalam Metode Ekstraksi DNA.pdf). Isolasi DNA Genom dan Polymerase Chain Reaction (PCR) Gen Penyandi 16s rRNA. L. Diakses tanggal 27 Oktober 2009. Laporan II – Isolasi DNA Genom.com/praktikum/petunjuk-praktikum/i-isolasidna-kromosom-bakteri/). G.wordpress. 2006. 2003. Bertoni.rcaprpb. Biologi Molekuler. 2008. dan G. Micklos.. Jakarta : Erlangga. 2009. Institut Pertanian Bogor. Pasande. DNA Science – A First Course. Anonim.J. (http://23bios1unsoed. J. W.

untuk memenuhi cetakan gel agarosa.8% x volume cetakan =  Jadi.28 g gel agarosa dilarutkan dengan pelarut buffer TAE hingga volume 35 ml.8% pada cetakan Ukur volume cetakan untuk membuat gel agarosa  Cetakan diberi selotip bening pada samping-sampingnya  Akuades dituangkan ke dalam cetakan yang sampingnya telah rapat oleh selotip  Diukur banyaknya akuades yang dituangkan dalam cetakan hingga cetakan tersebut penuh  Diketahui bahwa volume akuades untuk memenuhi cetakan adalah 35 ml  Gel agarosa yang hendak dibuat adalah 0. sehingga agarosa yang dipakai dapat dihitung sebagai berikut.28 g 13 .8%. 0.28 ml = 0. sebanyak 0. = 0.Lampiran Pembuatan gel agarosa 0.

Komposisi masing-masing larutan yang ditambahkan untuk isolasi DNA bakteri 14 .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful