P. 1
teknik PCR

teknik PCR

|Views: 611|Likes:
Published by Sri Winarsih

More info:

Published by: Sri Winarsih on Dec 22, 2011
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

06/06/2013

pdf

text

original

T EK N I K

Perbandingan Beberapa Metode Molekuler dalam Uji DNA HPV (Human Papillomavirus)
Sinta Sasika Novel1, Ratu Safitri1, Sri Hartini Harijanto2, Sukma Nuswantara3
1Jurusan

Biologi, FMIPA Universitas Padjadjaran, Jatinangor, 2Rumah Sakit Kanker Dharmais Slipi Jakarta Barat,
3Lembaga

Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bogor

ABSTRAK Uji DNA HPV telah dipakai sebagai uji tambahan paling efektif cara mendeteksi keberadaan HPV sedini mungkin. Uji DNA HPV dapat mengetahui golongan hr-HPV atau lr-HPV dengan menggunakan teknik HC II atau dengan metode PCR, uji DNA HPV juga dapat melihat genotipe HPV dengan metode DNA-HPV Micro Array System, Multiplex HPV Genotyping Kit, dan Linear Array HPV Genotyping Test. Metode PCR dan Elektroforesis PCR (Polymerase Chain Reaction) atau reaksi berantai polimerase adalah suatu metode enzimatis untuk memperbanyak secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu secara invitro[1]. PCR pertama kali dikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1985 seorang peneliti dari CETUS Corporation[2]. PCR dapat melipat memperbanyak molekul DNA dan memisahkan gen-gen; kelebihan metode ini adalah suhu yang dapat tinggi dan rendah dengan cepat selain itu PCR juga bekerja dengan komponen yang jumlahnya sedikit[1]. Pada tahun 1990 Ting dan Manos telah mengembangkan suatu metode deteksi HPV dengan PCR[3]. Metode tersebut dikembangkan dengan mengidentifikasi suatu daerah homologi di dalam genotipe HPV yang kemudian digunakan sebagai dasar untuk mendesain primer untuk amplifikasi[1]. Daerah homologi tersebut panjangnya 20-25 pasangan basa dan diketahui setelah dilakukan perbandingan urutan nukleotida HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV18, dan HPV-33 terutama pada daerah ORF E1 dan L1[1,3] Prinsip kerja PCR dan elektroforesis yaitu (1) isolasi DNA sampel dari bahan klinis atau dari jaringan yang disimpan pada paraffin[4], (2) proses amplifikasi DNA yang telah diisolasi; proses amplifikasi sendiri terbagi tiga tahapan yaitu denaturasi, annealing, dan elongasi. Tahapan denaturasi terjadi pada suhu 970C[1]. Pada proses ini terjadi denaturasi linearisasi DNA[5]. Tahap kedua adalah penempelan primer atau annealing pada DNA target yang akan diperbanyak, membutuhkan suhu sekitar 550C[6]. Tahap ketiga adalah elongasi (polimerisasi) membutuhkan suhu 720C agar siklus polimerisasi lebih optimal[7], (3) hasil amplifikasi dideteksi menggunakan alat elektroforesis pada gel agarosa[1]; teknik elektroforesis adalah teknik yang memisahkan molekul-molekul bentuk, muatan netto, dan berat molekulnya dalam sebuah medan listrik pada medium padat atau semipadat[5,7]. Metode PCR dan elektroforesis hanya digunakan untuk mendeteksi ada atau tidaknya DNA HPV di dalam sel epitel yang dicurigai terinfeksi HPV[6]; sulit untuk menentukan genotipe HPV yang menginfeksi[4]. Proses genotyping dengan metode PCR dan elektroforesis memerlukan waktu yang cukup lama, karena hanya menggunakan satu kontrol positif untuk satu genotipe HPV saja[5,7]; umumnya HPV-16 atau HPV-18 [1]. Pada gambar 2 dapat dilihat nomor 1 sd.11, nomor 1 dan 2 merupakan kontrol negatif dan kontrol positif genotipe HPV-16. Nomor 3-11 adalah sampel-sampel yang positif terinfeksi; ke-9 sampel menunjukkan sinyal yang sama dengan nomor 2, menunjukkan bahwa ke-9 sampel tersebut positif terinfeksi HPV, namun tidak cukup untuk menentukan genotipe HPV dalam setiap sampelnya[4,8].
Gambar 2. Hasil amplifikasi yang dideteksi menggunakan PCR pada pemeriksaan infeksi HPV[2,4]

Gambar 1. Alat PCR (Polymerase Chain Reaction)[2]

Metode Hybrid Capture System (HC-II) Hybrid Capture System (HC-II) adalah metode pemeriksaan hibridisasi dengan teknologi terbaru di bidang biologi molekuler[2]. Teknik HC-II memeriksa pada kondisi lebih awal yaitu kemungkinan seseorang terinfeksi HPV sebelum virus tersebut membuat perubahan pada serviks yang akhirnya dapat mengakibatkan terjadinya kanker serviks[9]. HC-II telah diakui dunia serta disahkan oleh FDA (Food and Drug Administration) Amerika Serikat[10]. HC-II memiliki keakuratan yang tinggi dalam mendeteksi infeksi HPV karena mampu mendeteksi keberadaan DNA HPV dalam jumlah yang sangat kecil[9].
C DK 186/V o l .38 no .5/Ju l i- Agu s tu s 2011

356

HPV-18.12]. Denaturasi merupakan langkah awal prosedur untuk mengeluarkan DNA (release DNA) target dari sel[2]. (3) hasil amplifikasi dihibridisasi menggunakan probe spesifik dari ke-24 genotipe HPV. HPV-31. Gambar 4. HPV-18. HPV-35. Metode Multiplex HPV Genotyping Kit Metode Multiplex HPV Genotyping Kit adalah metode yang digunakan untuk mengetahui genotipe HPV[4]. Biotin penting dalam proses deteksi hasil hibridisasi. HPV-26. (4) ikatan antibodi dengan hibrid DNA-RNA akan bereaksi dengan alkaline phosphatase. makin banyak hibrid DNA-RNA yang tertangkap pada dinding capture plate maka makin banyak pula antibodi kedua yang dapat mengenali hibrid DNA-RNA[9]. Teknik ini adalah salah satu teknik terbaru di dunia molekuler untuk mendeteksi HPV[13]. HPV-54.0 RLU/PC[2. HPV-51. HPV-73. HPV-83. Kelebihan teknik ini adalah dapat diketahuinya tipe HPV yang menginfeksi.9. (4) kemudian proses deteksi menggunakan Luminex analyzer : produk PCR akan terdeteminasi oleh Phycoerythrin fluorescens[4. Metode DNA-HPV Micro Array Metode DNA-HPV Micro Array adalah metode yang digunakan untuk mengetahui genotipe HPV[4].TEKNIK Teknik HC-II adalah antibody capture/solution hybridization/signal amplication assay[9. HPV-59. HPV-67. secara umum HC-II ialah teknik berbasis DNA-RNA yang dapat mendeteksi secara akurat dan cepat dengan sensitivitas 98% dan spesifisitas HC-II 98%[10] Prinsip kerja HC-II yaitu (1) menghancurkan protein kapsid virus HPV dalam sampel yang telah dimasukkan ke dalam botol sampel yang telah disediakan[4]. HPV-44. HPV-59. 3 8 no. 357 . HPV-33. HPV-70. Namun HC-II tidak dapat digunakan untuk menentukan genotipe HPV karena tes ini hanya memperkirakan kuantitatif jumlah virus tanpa mengetahui genotipe HPV-nya[4. (3) hibrid DNA-RNA berikatan antibodi spesifik. HPV-16. Penentuan konsentrasi ambang DNA HPV yang akan berpeluang terbentuknya kanker leher rahim adalah sangat penting. HPV-39. tidak terdapat atau hanya sedikit kontaminasi. HPV-82. HPV-51. HPV-11. Probe A untuk melacak DNA lr-HPV seperti HPV-6. (7) pengukuran tersebut tersambung dengan perangkat komputer menghasilkan nilai RLU (Relative Light Unit)[2] Penentuan nilai positif uji DNA HPV didasarkan pada perbandingan sampel dengan ratarata RLU/PV. HPV-33. HPV-53. jika perbandingan RLU/PC (relative light unit/posirif kontrol) melebihi nilai ambang C DK 1 8 6 / Vo l. HPV-18. HPV-11. HPV-34. HPV-35. HPV-58. di RS Kanker Dharmais digunakan untuk diagnosis infeksi HPV penyebab kanker serviks dan kutil[4]. Gambar 3 menunjukkan visualisasi prinsip kerja HC-II[10]. (5) reaksi ini menghasilkan sinyal chemiluminescent. Prinsip kerja HC-II (1) DNA yang sudah terdenaturasi. 5/Jul i -A g us tus 2011 Linear Array HPV Genotyping Test Metode ini sudah digunakan pada banyak penelitian mengenai HPV[13]. HPV-51. HPV-33. untuk mendenaturasi DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal pada metode ini menggunakan suhu tinggi sehingga DNA akan terdenaturasi. waktu yang lebih singkat. HPV-40. HPV-52. sedangkan probe B untuk melacak 13 tipe DNA hr-HPV yaitu HPV-16. Bila dibandingkan dengan PCR. HPV-54. (6) sinyal amplifikasi dalam bentuk emisi cahaya. Primer akan mengamplifikasi DNA β-globin manusia dan DNA ke-24 HPV. apakah tipe lr-HPV atau hr-HPV yang dapat menyebabkan kaker serviks. HPV-66. Multiplex HPV Genotyping Kit dapat medeteksi 24 genotipe HPV : HPV-6. HPV-16. Prinsip kerja Multiplex HPV Genotyping Kit : (1) ekstraksi sel untuk mengisolasi DNA. (2) Setelah kapsid dirusak. dan HPV-70[12]. tahap berikutnya adalah mendenaturasi DNA untai ganda menjadi untai tunggal dengan menambahkan larutan denaturasi[2].14]. HPV-26. HPV-42. HPV-53. HPV-39. (4) Kuantitas antibodi yang terikat pada hibrid DNA-RNA diukur dengan menambahkan zat chemiluminescent sehingga menghasilkan sinyal chemiluminescent. proses hibridisasi ini memerlukan sejumlah DNA untai tunggal. (5) sinyal ini akan ditangkap oleh alat luminometer yang dihubungkan dengan komputer. HPV-68. Hasil deteksi genotipe HPV[12] Gambar 3. HPV-59. DNA-HPV Micro Array dapat mendeteksi 24 genotipe HPV : HPV-6. HPV-45. diukur Luminometer. HPV-IS39. HPV-69. (3) hibridisasi antara DNA virus dengan probe RNA menghasilkan DNA-RNA hybrid yang ditangkap oleh antibodi yang kemudian akan bereaksi dengan antibodi kedua[4]. Prinsip kerja DNA-HPV Micro Array : (1) ekstraksi sel untuk mengisolasi DNA.10] yang memakai deteksi kualitatif chemiluminescence terhadap DNA HPV. HPV-42. HPV-43. HPV-35. HPV-56. dan HPV-44. HPV-56. HPV-35. HPV-58. HPV-84. HPV-45. HPV-18. HPV-39. HPV-11. Ke-37 genotipe HPV yaitu HPV-6. HPV-56. Digene menetapkan nilai ambang positif sebesar 1. dan HPV-68[10]. (gambar 4). HPV-62. HPV-16. HC-II memiliki ketepatan 92-94% terhadap teknik pemeriksaan sitologi/histologi. HPV-58. pada proses hibridisasi ini diperlukan sejumlah DNA untai tunggal. HPV-45. HPV-52. HPV-64. HPV-81. HPV-61. HPV-71. HPV-53. HPV-70. HPV-31. HPV-42. HPV-31. HPV-72. HPV-66.11]. HPV-56. (2) DNA yang telah diisolasi kemudian di amplifikasi menggunakan PCR yang telah diberi label biotin pada primer sehingga DNA yang diperbanyakpun akan terlabel biotin. HPV-45. dan HPV-82[4. HPV-44. HPV-42. HPV-31. HPV-68.4. Antibodi kedua ini bertindak sebagai sinyal amplifikasi.11]. HPV-39. HPV-58. (3) hasil amplifikasi dihibridisasi menggunakan probe spesifik dari ke-24 genotipe HPV. (2) hibridisasi DNA Virus dengan probe RNA. positif maka spesimen dinyatakan positif terhadap tes DNA HPV[9]. HPV-73. HPV-55. HPV-66. (2) DNA yang telah diisolasi kemudian diamplifikasi menggunakan PCR. HPV-43. dan HPV-CP6108[13]. HPV-43. HPV-40. HPV-52. HPV-52. HPV-59. HPV-33.9]. Linear Array HPV Genotyping Test mampu mendeteksi 37 genotipe HPV baik hr-HPV maupun lr-HPV secara bersamaan[13.10]. HPV-11. dan disertai dengan probe[2]. (4) kemudian proses deteksi sehingga akan terlihat genotipe-genotipe HPV pada sampel yang diperiksa[4. HPV-51. HPV-68.

Genotyping of Human Papillomavirus in Liquid Cytology Cervical Specimens by the PGMY Line Blot Assay and the SPF10 Line Probe Assay. Quint W. An Introduction to Cell and Molecular Biology. 4. 17. 13. Belmont: Wadsworth Publ. Gambar 7. 1995. Essential Molecular Biology. Human Papillomavirus Infection of The Cervix: Relative Risk Associations of 15 Common Anogenital Types. 2008.5/Ju l i. Aplikasi Hybrid Capture II System dalam Deteksi Dini Kanker Serviks. Dasar-dasar Molekuler. 12. 55(10): 721-8. Salah satu perlakuan untuk memecah ikatan hidrogen antar basa nitrogen adalah dengan penambahan senyawa alkali seperti NaOH yang terdapat pada larutan pendenaturasi[18]. 2007. Bandung: Laboratorium Bioteknologi Sandia Biotech Diagnostic Centre. Lohnas IM. 44(9): 3122-9. HPV-61. dan (4) Linear Array HPV Genotyping Strip[4]. Gynecol. Hasil deteksi akan terlihat berwarna biru di atas Linear Array HPV Genotyping Strip yang akan menunjukkan genotipe HPV sampel[4]. Co. 40(3): 979-83. Castle PE.38 no . Lancaster W. Greenburg MD. HPV-68[4] 358 C DK 186/V o l . 1998. 2009. 2. 2008. Distribution of HPV Genotypes in Uterine Cervical Lesions in Yanbian. Ikatan ini akan menghasilkan warna biru pada membran nilon yang menunjukkan genotipe HPV[17]. Verteramo R. Zhao Y. DNA target yaitu DNA yang telah terdenaturasi. 2006. van Doorn LJ. 2002. CDK 2009. Metode Multiplex HPV Genotyping Kit digunakan untuk mendeteksi 24 genotipe HPV. Safitri R. Syrjanen KJ. Brown TA. Nuswantara S. 5. Internat. Jakarta: Erlangga. β-globin low. Microbiol. Santosa Bandung International Hospital. Wolfe SL. 18. Lorincz AT. Proses pra-denaturasi dan denaturasi DNA membutuhkan suhu 950C. (1) (2) SIMPULAN 1. Olivera HS. Biologi Molekuler. Tahap ke tiga yaitu hibridisasi DNA. Yuwono T. ekstraksi dimulai dengan melisis jaringan menggunakan buffer ATL. β-globin low. Tahap pertama ekstrasi DNA dari sampel menggunakan Amplilute Liquid Media Extration Kit. Teori dan Aplikasi PCR. Dis. Microbiol. Lörincz AT. 107: 6-13. hal tersebut sesuai dengan teori bahwa untai DNA tunggal yang disintesis oleh Taq polimerase membutuhkan suhu 720C[5.. Yogyakarta: Penerbit Andi. Xuan Y. 1999. Bandung: Biologi FMIPA-UNPAD. Sinyal tersebut akan ditangkap oleh streptavidin-horseradish peroxidase menandakan bahwa ikatan pelacak dan DNA berhasil[4]. 9. 36(1): 24-6. 3. Pelacak yang digunakan memiliki urutan spesifik untuk 37 genotipe HPV[4]. Stirling J. Northern China. BMC Infect. HPV-16. Microbiol. Human Papillomaviruses and Genital Co-infections in Gynaecological Outpatients. HPV-11. van Ham MAPC. 2005. The Spectrum and Clinical Sequelae of Human Papillomavirus Infection. (3) typing tray. Pathol. Jenson AB. 4. Mancini E. Proses elongasi membutuhkan waktu 1 menit dan suhu 720 C. Kurman RJ. penempelan atau annealing membutuhkan suhu 550C. Seminar Deteksi Dini dan Penanganan Terkini Kanker Leher Rahim: Deteksi Human Papilloma Virus Dalam Pencegahan Dini Kanker Leher Rahim. merusak RNA dengan RNase sehingga akan diperoleh DNA yang diinginkan[4. 15. Inggris: Oxford Univ Press. Metode DNA-HPV Micro Array digunakan untuk mendeteksi 24 genotipe HPV. 2009. Shen D. 2002.T EK N I K Hibridisasi asam nukleat mempunyai dua unsur utama yaitu DNA target dan pelacak.Ag u s tu s 2011 . 14. 1995. Clin. Tewari KS. Pierangeli A. 40: 1088-90. Result of Human Papillomavirus DNA Testing with the Hybrid Capture II Assay are Reproducible. Metode PCR dan elektroforesis dapat mengetahui keberadaan HPV tanpa mengetahui genotipe secara spesifik. Suhu 550C adalah suhu hasil optimasi agar primer tidak salah menempel (mispriming)[1]. 2002.7]. Pathol. Massuger LFAG. Gynecol. Analisis Distribusi G e n o tipe HPV Dengan Metode Linear Array HPV Genotyping Test. Clin. Bakkers JMJ. Yogyakarta: Kanisius. Prinsip kerja Linear Array HPV Genotyping Test terbagi menjadi empat tahapan[14]. (2) reagen. Nuswantara S. Novel SS. 3. Bandung: Santosa Bandung International Hospital. HPV Infections and Oesophageal Cancer. Mekanisme hibridisasi dan deteksi pada metode LA HPV GT (a) membran nilon pada strip (b) pelacak yang berada di atas membrane (c) DNA hasil amplifikasi (d) larutan hibridisasi (e) DNA yang sudah terlabel biotin (f) biotin label non radioaktif (g) streptavidan yang berikatan dengan biotin dan horseradish -peroxidase (h) H2O2 dan TMB[4] Pada tahap ke empat. DNA sudah diberi label biotin sehingga ikatan antara pelacak dan DNA akan terdeteksi dan menghasilkan sinyal[5]. Melchers WJG.13]. Oncol. Bioteknologi Kesehatan. Obstetr. PCR Protocols. Nuswantara S. pada proses ini diperlukan sejumlah DNA untai tunggal sehingga DNA hasil amplifikasi harus didenaturasi menjadi DNA untai tunggal[13.14]. Perangkat diagnostik Linear Array HPV Genotyping Test (1) PCR N9700. Totowa: Human Press. Safitri R. 10. HPV-42 (2) β-globin high. 58: 643-7. 11. Prinsip dasar PCR pada metode Linear Array HPV Genotyping Test adalah enzim AmpliTaq Glod DNA polymerase memperbanyak sekuen spesifik yang dimulai dengan pelekatan primer dan menyatukan dNTP-dNTP yang berlangsung dalam reaksi termal[13. Novel SS. Hasil deteksi LA HPV Genotyping Test (1) β-globin high. Clin. Metode Hybrid Capture II System digunakan untuk mengetahui keberadaan HPV dengan memperkirakan kuantitas/jumlah virus tanpa mengetahui genotipe HPV-nya. Monk BJ. Lin Z. 79: 328-37. Evaluation of The SPF10-INNO LiPA Human Papillomavirus (HPV) Genotyping Test an the Roche Linear Array HPV Genotyping Test.. Lin H. Sudjadi. Yuwono T.17]. 8.2008. 2008. Gambar 6. 9(16): 1-7 16. Bartlett JMS. DAFTAR PUSTAKA 1. Metode Linear Array HPV Genotyping Test digunakan untuk mendeteksi 37 genotipe HPV. 7. 6. Kleter B. J. Tahap kedua yaitu amplifikasi DNA menggunakan PCR TC9700[4]. (3) (4) Gambar 5. prinsipnya DNA akan berikatan dengan pelacak yang menempel pada membran nilon bermuatan[17]. 2006. 2. 5. Streptavidin-horseradish peroxidase akan berikatan dengan H2O2 dan TMB (Tetramethylbenzine)[13]. Clin. Reid R. merusak protein dengan Proteinase K. Nuswantara S. van Hamont D.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->