P. 1
Bioteknologi Modern

Bioteknologi Modern

|Views: 217|Likes:
Published by Galih Widianto

More info:

Published by: Galih Widianto on Jan 10, 2012
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOC, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

03/19/2015

pdf

text

original

Tugas Pengantar Bioteknologi Aplikasi Bioteknologi Modern Nama : Desi Puspitasari Evi Kurnia Sari (1507100007) (1507100039

)

Cloning and over-expression of Penicillin G acylase in Escherichia coli BL21 Mengkloning dan Over-Ekspresi Asilase Penisilin G dalam Escherichia coli BL21 Penisilin G asilase (PGA) adalah salah satu enzim yang paling penting dalam industri farmasi.Ini digunakan dalam proses produksi penisilin semi-sintetik. Beberapa acylases penisilin yang berbeda dengan berbagai karakteristik telah diisolasi dari bakteri yang berbeda dan identifikasi isolat bakteri PGA industri dengan kompatibilitas yang lebih tinggi. Secara tradisional, penisilin semi-sintetik dihasilkan oleh sintesis kimia yang memerlukan serangkaian reaksi kimia yang kompleks pada temperatur rendah, menggunakan senyawa beracun. . Pelarut ini tidak diinginkan dan harus dihapus ada kebutuhan untuk quality control yang ketat dari sintesis kimia sebagian besar telah digantikan oleh kurang polusi metode biologi dengan menggunakan enzim yang diisolasi dari mikroorganisme yang berbeda (Shewale et al, 1990; Demain, 2000.). Penisilin G asilase (PGA) adalah tipe II penisilin asilase yang menghidrolisis penisilin G menjadi asam 6-aminopenisilanat (6 - APA) dan asam fenil asetat (PAA) (Ohashi et al, 1989; Zietkiewicz et al, 1994 ..). 6-APA merupakan bahan dasar untuk produksi penisilin semi-sintetik (Kumar et al, 2007; Ochman et al, 1988..).

coli strain terisolasi dari air. teknologi DNA rekombinan telah muncul sebagai teknologi yang potensial untuk produksi tingkat tinggi protein berguna. pH optimum. E. yang diinginkan dan meningkatkan hasil yang dicapai oleh vektor yang sesuai dan seleksi sel inang. tanah dan spesimen klinis. ekspresi PGA pada E. Sedangkan pada E. indole. pelet bakteri resuspended dalam buffer TE (10 mM Tris. pH 8. toleransi suhu. CA) dan BL21 (DE3) (Novagen. E. Strain dikultur pada 37 ° C dalam Luria-Bertani (LB) kaldu. Adapun beberapa langkah untuk membuat penisilin : Bakteri strain. merah metil (MR) dan uji Sitrat (IMViC) (Forbes et al. Voges-Proskauer (VP). Ampisilin digunakan pada konsentrasi 100 GML-1 untuk memilih bakteri berubah. Sampel dibawa ke laboratorium dan kemudian uji mikrobiologis standar. pGEM-T Easy plasmid vektor (Promega) digunakan untuk kloning gen diamplifikasi Penisilin G asilase (PGA) dan PET 22 b plasmid digunakan untuk ekspresi protein. media. coli asli di bawah kendali sirkus kompleks (Wang et al. strain rekombinan bisa mengekspresikan tingkat yang lebih tinggi protein rekombinan dibandingkan dengan jenis asli. Sebanyak 280 spesimen yang dikumpulkan dari air. dll Oleh karena itu. dan bakteri yang dilapisi dengan sentrifugasi pada 9000 rpm. 2004. Organisme yang dipelihara pada nutrien agar (Difco) miring pada 4 ° C sampai mereka digunakan. coli. masing-masing. USA) digunakan untuk ekspresi kloning dan protein. 2006). produksi PGA oleh teknologi rekombinan bisa memiliki beberapa keunggulan. Carlsbad. Pertama.Karakteristik PGA yang diisolasi dari sumber hayati dan lingkungan yang berbeda ditemukan bervariasi dalam banyak aspek termasuk spesifisitas substrat. coli Isolasi dari sampel Dalam penelitian ini. termasuk budaya pada biru eosin-metilen (EMB) agar. tanah dan spesimen klinis disaring untuk PGA. Secara singkat. Dalam beberapa tahun terakhir. Kedua. dilakukan untuk mengidentifikasi isolat. Gram staining dan biokimia tes seperti oksidase. 1 mM EDTA) SDS . dan plasmid Strain E. Isolasi DNA dilakukan pada dasarnya seperti yang dijelaskan (Montazami et al. Ekstraksi DNA dan PCR Penyaringan isolat ditanam dalam kaldu LB bermalam di 37 ° C dengan kuat gemetar. Hanya 1 isolat yang dipilih dari masing-masing sampel. coli ekspresi rekombinan dapat berada di bawah kontrol yang ketat. Dalam metode ini. DH5 (Invitrogen.).) 2009 dengan sedikit modifikasi. mikroorganisme telah disaring untuk isolasi dari novel penisilin acylases dengan kompatibilitas yang lebih tinggi dengan industri deacylation persyaratan.

2 mM MgCl2. masing-masing. DNA diekstrak dari isolat E. dCTP. Kloning dan sekuensing gen full-length PGA PGA Setelah identifikasi menghasilkan strain. pelet itu kemudian dicuci dengan etanol 70% dan dilarutkan dalam air suling setelah pengeringan.000 rpm. Litani). volume sama fenol-kloroform (1: 1) ditambahkan. Nukleotida dan urutan asam amino prediksi dibandingkan dengan data yang tersedia dengan metode pencarian BLAST. 5'-GCGGGATTT AGCGTAAGC-3'. 50 mM KCl. sebuah 0.mengandung (1%) dan proteinase K (10 mg / ml) dan diinkubasi pada 55 ° C selama 2 h. 18 mM NaCl. 5'TGTCGCGATGA TATTTGTG-3 'dan PGA R1. Primer dipilih berdasarkan gen yang berkelanjutan PGA lokal yang telah dilaporkan. melengkapi 5 'dan 3' akhir gen fulllength PGA. Fase air dipindahkan ke tabung baru. diinkubasi pada suhu kamar selama 5 menit dan disentrifugasi selama 5 menit pada 10.5 volume etanol dingin 100% .2 mM konsentrasi masing-masing trifosfat 2deoxynucleoside (2-dNTP) (dATP . 5'-ACGTGCAACACTTC GCTCGAGTCTCTGA-3'. Produk PCR dimurnikan dengan kit pemurnian PCR (Qiagen) sesuai dengan instruksi manufaktur dan digunakan untuk kloning TA menggunakan pGEM-T kloning kit mudah (Promega) yang dihasilkan klon plasmid pGEMPGA. diinkubasi dengan RNase (10 mg / ml) selama 20 menit pada 37 ° C dan DNA diendapkan dengan penambahan 2. dTTP dan dGTP).3). Ekspresi gen rekombinan pada E. coli kompeten DH5a sel dan klon positif diajukan untuk sequencing dengan maju M13 dan primer reverse. Setelah itu. 50 ° C selama 30 detik dan 72 ° C selama 60 detik dan salah satu siklus 72 ° C selama 5 menit diikuti dengan suspensi pada 10 ° C.4 M konsentrasi primer setiap maju dan mundur dan 1 U Taq DNA polimerase (Fermentas. bangunan itu berubah . Reaksi ditransformasikan ke dalam E. amplifikasi PCR dilakukan dalam 25 volume l akhir mengandung 20 mM Tris-HCl (pH 8. 32 siklus 94 ° C selama 45 s. 0. coli mengalami amplifikasi PCR dengan pasangan primer PGA F1. thermocycler kondisi untuk PCR adalah salah satu siklus 94 ° C selama 4 menit. amplifikasi PCR dilakukan pada strain positif menggunakan primer F2. Hasil PCR dinilai dengan elektroforesis pada gel agarose 1% dan divisualisasikan dengan pewarnaan dengan bromida (EtBr). Sequencing dengan primer berbasis vektor menunjukkan bahwa fusi-Nya-tag itu dalam bingkai. 5'-TGGCCATGA AAAATAGAAATCGTATGATC-3 'dan R2. coli PGA Lokal coding untuk panjang penuh dari PGA diisolasi oleh pencernaan klon pGEM-PGA dengan Msc I-Xho enzim restriksi dan subcloned ke Msc I-Xho tempat 22b vektor ekspresi PET ( Novagen) dalam bingkai dengan tag dari enam terminal histidin karboksi-. yang menghasilkan pET22b subclone plasmid-PGA.

Amplifikasi. coli BL 21strain. Hal ini menunjukkan bahwa urutan PGA adalah kekal antara strain E.15% asam fenil asetat) ke absorbansi 0. coli BL21 berisi PET 22b-PGA membangun kultur dalam media I (1% Tripton.3% dan 0. kloning dan sekuensing amplifikasi PCR PGA E. Biologis assay untuk produksi PGA oleh bakteri rekombinan E.). penapisan 280 spesimen (spesimen lingkungan dan klinis) untuk menghasilkan isolasi bakteri E. Produk PCR diligasikan ke kloning pGEMTeasy vektor dan diverifikasi oleh PCR dan pencernaan pembatasan (Gambar 2). berbudaya pada 37 ° C dalam medium LB yang mengandung ampisilin 100 ml-1 mg untuk penyerapan dari 600 nm (A600) sebesar 0. sel-sel dikumpulkan dengan sentrifugasi dan produksi PGA diperkirakan oleh aminobenzaldehyde-dimetil-metode p (PDAB) (et al Shewale.menjadi E. coli untuk produksi PGA menghasilkan identifikasi positif dari lima strain. coli Yang mengandung insert panjang penuh PGA subcloned ke PET 22 b ekspresi vektor (Novagen) dalam bingkai dengan terminal-C-tag-Nya fusi untuk pemurnian afinitas (Gambar 3). Urutan produk PCR menegaskan identitas mereka sebagai bagian dari gen PGA. coli 180. PGA ekspresi rekombinan di E. skrining PCR isolat E. coli. sel-sel Hasil PCR untuk menghasilkan PGA isolat E. Multiple alignment prediksi urutan asam amino dengan urutan PGA dalam data base mengungkapkan homologi antara 90-94%. coli BL21 berubah dengan kaset ekspresi untuk menghasilkan ekspresi yang tinggi protein rekombinan seperti ditunjukkan dalam analisis SDSPAGE dari lisat disebabkan bakteri. Sapi ekstrak 0.5 mM dan dianalisis dengan SDS-PAGE. Singkatnya. PGA amplifikasi PCR panjang hasil penuh dari sekitar 2500 bp (Gambar 1). coli Dalam penelitian ini.7 unit.D-thiogalactopyranoside (IPTG) ke konsentrasi akhir 0. Induksi dengan IPTG E. 1987. Urutan Nukleotida diendapkan di NCBI Gene Bank dengan nomor aksesi HM011571. Kloning urutan gen mengungkapkan bahwa gen terdiri dari 2538 bp pengkodean protein dari 846 asam amino. Ekspresi protein diinduksi dengan menambahkan isopropil . coli E. Gambar 4 menunjukkan SDS-PAGE gel Commassie biru-bernoda . Setelah dua jam.8 dan diinduksi dengan menambahkan IPTG ( 1 mM). coli DNA genom dengan primer di bidang desain yang berkelanjutan gen PGA menghasilkan band PCR 815 bp.

coli.). Bioassay ekspresi rekombinan PGA untuk membandingkan kegiatan PGA rekombinan e. Konservasi tinggi PGA gen pada E. Dalam proyek ini. coli BL21 yang setara dengan 150 unit per gram (berat basah) bakteri rekombinan. coli penisilin G produksi asilase sampel klinis dan lingkungan. Hasil penelitian peneliti menunjukkan bahwa gen PGA adalah abadi antara strain E. Polderman-Tijmes et al. 1996).) Dan homologi 81% untuk Kluyvera citrophila (et al Guisán. coli tipe liar.dari budaya E. 1986.. Hasil penelitian peneliti menunjukkan bahwa prosedur ini adalah identifikasi sederhana. produsen PGA yang 5 e. Hasil ini konsisten dengan laporan sebelumnya menunjukkan manfaat teknologi DNA rekombinan untuk produksi PGA (Olsson et al. Garcia et al. tetapi metode ini adalah tenaga kerja dan memakan waktu. Analisis menunjukkan urutan gen terdiri dari 2538 nukleotida 846 pengkodean asam amino. Budaya dilanjutkan untuk kepadatan tinggi (Lee. coli BL21 membawa gen untuk PGA pada vektor ekspresi pET 22 b dengan liar E.). coli sebelum dan sesudah induksi bersama-sama dengan bakteri tanpa ekspresi membangun. coli. . 1985. coli isolat untuk menunjukkan manfaat enzim ini penting untuk kelangsungan hidup bakteri ini dalam kondisi lingkungan yang berbeda. diinkubasi dengan penisilin G dan diuji untuk 6APA produksi. Hasil ini konsisten dengan laporan sebelumnya pada penerapan teknik PCR untuk identifikasi strain bakteri 7ACA positif (Luo et al. PGA homologi dengan gen lain yang dilaporkan adalah 96% untuk xylosoxidans Achromobacter (Cai et al. Analisis BLAST menunjukkan bahwa urutan gen homologi berisi 98% untuk gen PGA sebelumnya dilaporkan dari strain E. Kegiatan ini adalah sekitar 300% lebih dari yang dipamerkan oleh E.. coli. Assay untuk produksi asilase penisilin G oleh E. 2005). bakteri dikultur dalam media I dan diinduksi dengan penambahan berbagai konsentrasi IPTG. coli isolat. 1993. Hasil penelitian menunjukkan bahwa induksi dengan 1 mM IPTG mengakibatkan tingginya tingkat aktivitas PGA oleh E. Gen dari satu isolat positif diklon dalam vektor pGEM-Teasy dan digunakan untuk sekuensing DNA. coli strain antara 280 proyek. 2004. coli BL21 mengekspresikan PGA rekombinan menunjukkan tingginya tingkat aktivitas enzim 3 kali lebih besar dari kegiatan PGA strain liar-jenis E. cepat dan efisien strain bakteri yang diproduksi PGA. Metode telah digunakan untuk deteksi biologis diskusi untuk isolasi dan identifikasi bakteri menghasilkan PGA. peneliti menggunakan PCR untuk mengidentifikasi strain e. 2002. dipanen.

Hasil peneliti bisa memperluas aplikasi PCR sebagai metode murah dan cepat untuk screening isolat dengan karakteristik farmasi dan biologis penting.Kesimpulan dari penelitian ini menunjukkan kesesuaian dan manfaat dari teknik PCR untuk deteksi cepat asilase Penisilin G dalam E. Hasil dari proyek ini juga menunjukkan bahwa teknologi rekombinan dapat digunakan untuk produksi tingkat tinggi PGA. coli liar isolat dari asal yang berbeda. .

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->