Tugas Pengantar Bioteknologi Aplikasi Bioteknologi Modern Nama : Desi Puspitasari Evi Kurnia Sari (1507100007) (1507100039)

Cloning and over-expression of Penicillin G acylase in Escherichia coli BL21 Mengkloning dan Over-Ekspresi Asilase Penisilin G dalam Escherichia coli BL21 Penisilin G asilase (PGA) adalah salah satu enzim yang paling penting dalam industri farmasi.Ini digunakan dalam proses produksi penisilin semi-sintetik. Beberapa acylases penisilin yang berbeda dengan berbagai karakteristik telah diisolasi dari bakteri yang berbeda dan identifikasi isolat bakteri PGA industri dengan kompatibilitas yang lebih tinggi. Secara tradisional, penisilin semi-sintetik dihasilkan oleh sintesis kimia yang memerlukan serangkaian reaksi kimia yang kompleks pada temperatur rendah, menggunakan senyawa beracun. . Pelarut ini tidak diinginkan dan harus dihapus ada kebutuhan untuk quality control yang ketat dari sintesis kimia sebagian besar telah digantikan oleh kurang polusi metode biologi dengan menggunakan enzim yang diisolasi dari mikroorganisme yang berbeda (Shewale et al, 1990; Demain, 2000.). Penisilin G asilase (PGA) adalah tipe II penisilin asilase yang menghidrolisis penisilin G menjadi asam 6-aminopenisilanat (6 - APA) dan asam fenil asetat (PAA) (Ohashi et al, 1989; Zietkiewicz et al, 1994 ..). 6-APA merupakan bahan dasar untuk produksi penisilin semi-sintetik (Kumar et al, 2007; Ochman et al, 1988..).

Karakteristik PGA yang diisolasi dari sumber hayati dan lingkungan yang berbeda ditemukan bervariasi dalam banyak aspek termasuk spesifisitas substrat, pH optimum, toleransi suhu, dll Oleh karena itu, mikroorganisme telah disaring untuk isolasi dari novel penisilin acylases dengan kompatibilitas yang lebih tinggi dengan industri deacylation persyaratan. Dalam beberapa tahun terakhir, teknologi DNA rekombinan telah muncul sebagai teknologi yang potensial untuk produksi tingkat tinggi protein berguna. Dalam metode ini, yang diinginkan dan meningkatkan hasil yang dicapai oleh vektor yang sesuai dan seleksi sel inang. produksi PGA oleh teknologi rekombinan bisa memiliki beberapa keunggulan. Pertama, strain rekombinan bisa mengekspresikan tingkat yang lebih tinggi protein rekombinan dibandingkan dengan jenis asli. Kedua, ekspresi PGA pada E. coli asli di bawah kendali sirkus kompleks (Wang et al, 2004.), Sedangkan pada E. coli ekspresi rekombinan dapat berada di bawah kontrol yang ketat. Adapun beberapa langkah untuk membuat penisilin : Bakteri strain, media, dan plasmid Strain E. coli, DH5 (Invitrogen, Carlsbad, CA) dan BL21 (DE3) (Novagen, USA) digunakan untuk ekspresi kloning dan protein, masing-masing. Strain dikultur pada 37 C dalam Luria-Bertani (LB) kaldu. Ampisilin digunakan pada konsentrasi 100 GML-1 untuk memilih bakteri berubah. pGEM-T Easy plasmid vektor (Promega) digunakan untuk kloning gen diamplifikasi Penisilin G asilase (PGA) dan PET 22 b plasmid digunakan untuk ekspresi protein. E. coli Isolasi dari sampel Dalam penelitian ini, E. coli strain terisolasi dari air, tanah dan spesimen klinis disaring untuk PGA. Sebanyak 280 spesimen yang dikumpulkan dari air, tanah dan spesimen klinis. Sampel dibawa ke laboratorium dan kemudian uji mikrobiologis standar, termasuk budaya pada biru eosin-metilen (EMB) agar, Gram staining dan biokimia tes seperti oksidase, indole, Voges-Proskauer (VP), merah metil (MR) dan uji Sitrat (IMViC) (Forbes et al, 2006). dilakukan untuk mengidentifikasi isolat. Hanya 1 isolat yang dipilih dari masing-masing sampel. Organisme yang dipelihara pada nutrien agar (Difco) miring pada 4 C sampai mereka digunakan. Ekstraksi DNA dan PCR Penyaringan isolat ditanam dalam kaldu LB bermalam di 37 C dengan kuat gemetar, dan bakteri yang dilapisi dengan sentrifugasi pada 9000 rpm. Isolasi DNA dilakukan pada dasarnya seperti yang dijelaskan (Montazami et al.) 2009 dengan sedikit modifikasi. Secara singkat, pelet bakteri resuspended dalam buffer TE (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA) SDS

mengandung (1%) dan proteinase K (10 mg / ml) dan diinkubasi pada 55 C selama 2 h. Setelah itu, volume sama fenol-kloroform (1: 1) ditambahkan, diinkubasi pada suhu kamar selama 5 menit dan disentrifugasi selama 5 menit pada 10.000 rpm. Fase air dipindahkan ke tabung baru, diinkubasi dengan RNase (10 mg / ml) selama 20 menit pada 37 C dan DNA diendapkan dengan penambahan 2,5 volume etanol dingin 100% . pelet itu kemudian dicuci dengan etanol 70% dan dilarutkan dalam air suling setelah pengeringan. DNA diekstrak dari isolat E. coli mengalami amplifikasi PCR dengan pasangan primer PGA F1, 5'TGTCGCGATGA TATTTGTG-3 'dan PGA R1, 5'-GCGGGATTT AGCGTAAGC-3'. Primer dipilih berdasarkan gen yang berkelanjutan PGA lokal yang telah dilaporkan. amplifikasi PCR dilakukan dalam 25 volume l akhir mengandung 20 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 18 mM NaCl, 0.2 mM konsentrasi masing-masing trifosfat 2deoxynucleoside (2-dNTP) (dATP , dCTP, dTTP dan dGTP), sebuah 0,4 M konsentrasi primer setiap maju dan mundur dan 1 U Taq DNA polimerase (Fermentas, Litani). thermocycler kondisi untuk PCR adalah salah satu siklus 94 C selama 4 menit, 32 siklus 94 C selama 45 s, 50 C selama 30 detik dan 72 C selama 60 detik dan salah satu siklus 72 C selama 5 menit diikuti dengan suspensi pada 10 C. Hasil PCR dinilai dengan elektroforesis pada gel agarose 1% dan divisualisasikan dengan pewarnaan dengan bromida (EtBr). Kloning dan sekuensing gen full-length PGA PGA Setelah identifikasi menghasilkan strain, amplifikasi PCR dilakukan pada strain positif menggunakan primer F2, 5'-TGGCCATGA AAAATAGAAATCGTATGATC-3 'dan R2, 5'-ACGTGCAACACTTC GCTCGAGTCTCTGA-3', melengkapi 5 'dan 3' akhir gen fulllength PGA, masing-masing. Produk PCR dimurnikan dengan kit pemurnian PCR (Qiagen) sesuai dengan instruksi manufaktur dan digunakan untuk kloning TA menggunakan pGEM-T kloning kit mudah (Promega) yang dihasilkan klon plasmid pGEMPGA. Reaksi ditransformasikan ke dalam E. coli kompeten DH5a sel dan klon positif diajukan untuk sequencing dengan maju M13 dan primer reverse. Nukleotida dan urutan asam amino prediksi dibandingkan dengan data yang tersedia dengan metode pencarian BLAST. Ekspresi gen rekombinan pada E. coli PGA Lokal coding untuk panjang penuh dari PGA diisolasi oleh pencernaan klon pGEM-PGA dengan Msc I-Xho enzim restriksi dan subcloned ke Msc I-Xho tempat 22b vektor ekspresi PET ( Novagen) dalam bingkai dengan tag dari enam terminal histidin karboksi-, yang menghasilkan pET22b subclone plasmid-PGA. Sequencing dengan primer berbasis vektor menunjukkan bahwa fusi-Nya-tag itu dalam bingkai. bangunan itu berubah

menjadi E. coli BL 21strain, berbudaya pada 37 C dalam medium LB yang mengandung ampisilin 100 ml-1 mg untuk penyerapan dari 600 nm (A600) sebesar 0,7 unit. Ekspresi protein diinduksi dengan menambahkan isopropil - D-thiogalactopyranoside (IPTG) ke konsentrasi akhir 0,5 mM dan dianalisis dengan SDS-PAGE. Biologis assay untuk produksi PGA oleh bakteri rekombinan E. coli BL21 berisi PET 22b-PGA membangun kultur dalam media I (1% Tripton, Sapi ekstrak 0,3% dan 0,15% asam fenil asetat) ke absorbansi 0,8 dan diinduksi dengan menambahkan IPTG ( 1 mM). Setelah dua jam, sel-sel dikumpulkan dengan sentrifugasi dan produksi PGA diperkirakan oleh aminobenzaldehyde-dimetil-metode p (PDAB) (et al Shewale, 1987.). Singkatnya, sel-sel Hasil PCR untuk menghasilkan PGA isolat E. coli Dalam penelitian ini, penapisan 280 spesimen (spesimen lingkungan dan klinis) untuk menghasilkan isolasi bakteri E. coli E. coli 180. skrining PCR isolat E. coli untuk produksi PGA menghasilkan identifikasi positif dari lima strain. Amplifikasi, kloning dan sekuensing amplifikasi PCR PGA E. coli DNA genom dengan primer di bidang desain yang berkelanjutan gen PGA menghasilkan band PCR 815 bp. Urutan produk PCR menegaskan identitas mereka sebagai bagian dari gen PGA. Urutan Nukleotida diendapkan di NCBI Gene Bank dengan nomor aksesi HM011571. PGA amplifikasi PCR panjang hasil penuh dari sekitar 2500 bp (Gambar 1). Produk PCR diligasikan ke kloning pGEMTeasy vektor dan diverifikasi oleh PCR dan pencernaan pembatasan (Gambar 2). Kloning urutan gen mengungkapkan bahwa gen terdiri dari 2538 bp pengkodean protein dari 846 asam amino. Multiple alignment prediksi urutan asam amino dengan urutan PGA dalam data base mengungkapkan homologi antara 90-94%. Hal ini menunjukkan bahwa urutan PGA adalah kekal antara strain E. coli. PGA ekspresi rekombinan di E. coli Yang mengandung insert panjang penuh PGA subcloned ke PET 22 b ekspresi vektor (Novagen) dalam bingkai dengan terminal-C-tag-Nya fusi untuk pemurnian afinitas (Gambar 3). Induksi dengan IPTG E. coli BL21 berubah dengan kaset ekspresi untuk menghasilkan ekspresi yang tinggi protein rekombinan seperti ditunjukkan dalam analisis SDSPAGE dari lisat disebabkan bakteri. Gambar 4 menunjukkan SDS-PAGE gel Commassie biru-bernoda

dari budaya E. coli sebelum dan sesudah induksi bersama-sama dengan bakteri tanpa ekspresi membangun. Bioassay ekspresi rekombinan PGA untuk membandingkan kegiatan PGA rekombinan e. coli BL21 membawa gen untuk PGA pada vektor ekspresi pET 22 b dengan liar E. coli isolat, bakteri dikultur dalam media I dan diinduksi dengan penambahan berbagai konsentrasi IPTG. Budaya dilanjutkan untuk kepadatan tinggi (Lee, 1996), dipanen, diinkubasi dengan penisilin G dan diuji untuk 6APA produksi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa induksi dengan 1 mM IPTG mengakibatkan tingginya tingkat aktivitas PGA oleh E. coli BL21 yang setara dengan 150 unit per gram (berat basah) bakteri rekombinan. Kegiatan ini adalah sekitar 300% lebih dari yang dipamerkan oleh E. coli tipe liar. Metode telah digunakan untuk deteksi biologis diskusi untuk isolasi dan identifikasi bakteri menghasilkan PGA, tetapi metode ini adalah tenaga kerja dan memakan waktu. Dalam proyek ini, peneliti menggunakan PCR untuk mengidentifikasi strain e. coli penisilin G produksi asilase sampel klinis dan lingkungan. produsen PGA yang 5 e. coli strain antara 280 proyek. Hasil penelitian peneliti menunjukkan bahwa prosedur ini adalah identifikasi sederhana, cepat dan efisien strain bakteri yang diproduksi PGA. Hasil ini konsisten dengan laporan sebelumnya pada penerapan teknik PCR untuk identifikasi strain bakteri 7ACA positif (Luo et al, 2005). Gen dari satu isolat positif diklon dalam vektor pGEM-Teasy dan digunakan untuk sekuensing DNA. Analisis menunjukkan urutan gen terdiri dari 2538 nukleotida 846 pengkodean asam amino. Analisis BLAST menunjukkan bahwa urutan gen homologi berisi 98% untuk gen PGA sebelumnya dilaporkan dari strain E. coli. PGA homologi dengan gen lain yang dilaporkan adalah 96% untuk xylosoxidans Achromobacter (Cai et al, 2004.) Dan homologi 81% untuk Kluyvera citrophila (et al Guisn, 1993.). Hasil penelitian peneliti menunjukkan bahwa gen PGA adalah abadi antara strain E. coli. Konservasi tinggi PGA gen pada E. coli isolat untuk menunjukkan manfaat enzim ini penting untuk kelangsungan hidup bakteri ini dalam kondisi lingkungan yang berbeda. Assay untuk produksi asilase penisilin G oleh E. coli BL21 mengekspresikan PGA rekombinan menunjukkan tingginya tingkat aktivitas enzim 3 kali lebih besar dari kegiatan PGA strain liar-jenis E. coli. Hasil ini konsisten dengan laporan sebelumnya menunjukkan manfaat teknologi DNA rekombinan untuk produksi PGA (Olsson et al, 1985; Garcia et al, 1986;. Polderman-Tijmes et al, 2002..).

Kesimpulan dari penelitian ini menunjukkan kesesuaian dan manfaat dari teknik PCR untuk deteksi cepat asilase Penisilin G dalam E. coli liar isolat dari asal yang berbeda. Hasil peneliti bisa memperluas aplikasi PCR sebagai metode murah dan cepat untuk screening isolat dengan karakteristik farmasi dan biologis penting. Hasil dari proyek ini juga menunjukkan bahwa teknologi rekombinan dapat digunakan untuk produksi tingkat tinggi PGA.