Tugas Pengantar Bioteknologi Aplikasi Bioteknologi Modern Nama : Desi Puspitasari Evi Kurnia Sari (1507100007) (1507100039

)

Cloning and over-expression of Penicillin G acylase in Escherichia coli BL21 Mengkloning dan Over-Ekspresi Asilase Penisilin G dalam Escherichia coli BL21 Penisilin G asilase (PGA) adalah salah satu enzim yang paling penting dalam industri farmasi.Ini digunakan dalam proses produksi penisilin semi-sintetik. Beberapa acylases penisilin yang berbeda dengan berbagai karakteristik telah diisolasi dari bakteri yang berbeda dan identifikasi isolat bakteri PGA industri dengan kompatibilitas yang lebih tinggi. Secara tradisional, penisilin semi-sintetik dihasilkan oleh sintesis kimia yang memerlukan serangkaian reaksi kimia yang kompleks pada temperatur rendah, menggunakan senyawa beracun. . Pelarut ini tidak diinginkan dan harus dihapus ada kebutuhan untuk quality control yang ketat dari sintesis kimia sebagian besar telah digantikan oleh kurang polusi metode biologi dengan menggunakan enzim yang diisolasi dari mikroorganisme yang berbeda (Shewale et al, 1990; Demain, 2000.). Penisilin G asilase (PGA) adalah tipe II penisilin asilase yang menghidrolisis penisilin G menjadi asam 6-aminopenisilanat (6 - APA) dan asam fenil asetat (PAA) (Ohashi et al, 1989; Zietkiewicz et al, 1994 ..). 6-APA merupakan bahan dasar untuk produksi penisilin semi-sintetik (Kumar et al, 2007; Ochman et al, 1988..).

termasuk budaya pada biru eosin-metilen (EMB) agar. Voges-Proskauer (VP). ekspresi PGA pada E. media. coli asli di bawah kendali sirkus kompleks (Wang et al. toleransi suhu. masing-masing. merah metil (MR) dan uji Sitrat (IMViC) (Forbes et al. E. indole. dan plasmid Strain E. Sedangkan pada E. dll Oleh karena itu. Dalam beberapa tahun terakhir.Karakteristik PGA yang diisolasi dari sumber hayati dan lingkungan yang berbeda ditemukan bervariasi dalam banyak aspek termasuk spesifisitas substrat. coli ekspresi rekombinan dapat berada di bawah kontrol yang ketat. coli Isolasi dari sampel Dalam penelitian ini. coli strain terisolasi dari air. coli. 2006). Sampel dibawa ke laboratorium dan kemudian uji mikrobiologis standar. Organisme yang dipelihara pada nutrien agar (Difco) miring pada 4 ° C sampai mereka digunakan. dilakukan untuk mengidentifikasi isolat. strain rekombinan bisa mengekspresikan tingkat yang lebih tinggi protein rekombinan dibandingkan dengan jenis asli. 2004. tanah dan spesimen klinis disaring untuk PGA. mikroorganisme telah disaring untuk isolasi dari novel penisilin acylases dengan kompatibilitas yang lebih tinggi dengan industri deacylation persyaratan. dan bakteri yang dilapisi dengan sentrifugasi pada 9000 rpm. Gram staining dan biokimia tes seperti oksidase. CA) dan BL21 (DE3) (Novagen. Hanya 1 isolat yang dipilih dari masing-masing sampel. Pertama. teknologi DNA rekombinan telah muncul sebagai teknologi yang potensial untuk produksi tingkat tinggi protein berguna. Dalam metode ini. Ampisilin digunakan pada konsentrasi 100 GML-1 untuk memilih bakteri berubah. pH 8. pelet bakteri resuspended dalam buffer TE (10 mM Tris. pH optimum. pGEM-T Easy plasmid vektor (Promega) digunakan untuk kloning gen diamplifikasi Penisilin G asilase (PGA) dan PET 22 b plasmid digunakan untuk ekspresi protein.). yang diinginkan dan meningkatkan hasil yang dicapai oleh vektor yang sesuai dan seleksi sel inang. USA) digunakan untuk ekspresi kloning dan protein.) 2009 dengan sedikit modifikasi. Adapun beberapa langkah untuk membuat penisilin : Bakteri strain. 1 mM EDTA) SDS . Ekstraksi DNA dan PCR Penyaringan isolat ditanam dalam kaldu LB bermalam di 37 ° C dengan kuat gemetar. Isolasi DNA dilakukan pada dasarnya seperti yang dijelaskan (Montazami et al. Kedua. Sebanyak 280 spesimen yang dikumpulkan dari air. produksi PGA oleh teknologi rekombinan bisa memiliki beberapa keunggulan. tanah dan spesimen klinis. Strain dikultur pada 37 ° C dalam Luria-Bertani (LB) kaldu. E. Secara singkat. Carlsbad. DH5 (Invitrogen.

Produk PCR dimurnikan dengan kit pemurnian PCR (Qiagen) sesuai dengan instruksi manufaktur dan digunakan untuk kloning TA menggunakan pGEM-T kloning kit mudah (Promega) yang dihasilkan klon plasmid pGEMPGA. 5'TGTCGCGATGA TATTTGTG-3 'dan PGA R1. pelet itu kemudian dicuci dengan etanol 70% dan dilarutkan dalam air suling setelah pengeringan. coli mengalami amplifikasi PCR dengan pasangan primer PGA F1. Nukleotida dan urutan asam amino prediksi dibandingkan dengan data yang tersedia dengan metode pencarian BLAST. 5'-ACGTGCAACACTTC GCTCGAGTCTCTGA-3'. dCTP. amplifikasi PCR dilakukan pada strain positif menggunakan primer F2.000 rpm. Ekspresi gen rekombinan pada E.mengandung (1%) dan proteinase K (10 mg / ml) dan diinkubasi pada 55 ° C selama 2 h. Setelah itu. volume sama fenol-kloroform (1: 1) ditambahkan. DNA diekstrak dari isolat E. thermocycler kondisi untuk PCR adalah salah satu siklus 94 ° C selama 4 menit.4 M konsentrasi primer setiap maju dan mundur dan 1 U Taq DNA polimerase (Fermentas. 50 ° C selama 30 detik dan 72 ° C selama 60 detik dan salah satu siklus 72 ° C selama 5 menit diikuti dengan suspensi pada 10 ° C. 0. Hasil PCR dinilai dengan elektroforesis pada gel agarose 1% dan divisualisasikan dengan pewarnaan dengan bromida (EtBr). 50 mM KCl. melengkapi 5 'dan 3' akhir gen fulllength PGA. Fase air dipindahkan ke tabung baru. masing-masing. yang menghasilkan pET22b subclone plasmid-PGA. 2 mM MgCl2. diinkubasi dengan RNase (10 mg / ml) selama 20 menit pada 37 ° C dan DNA diendapkan dengan penambahan 2. 32 siklus 94 ° C selama 45 s. 5'-GCGGGATTT AGCGTAAGC-3'.2 mM konsentrasi masing-masing trifosfat 2deoxynucleoside (2-dNTP) (dATP . Litani). diinkubasi pada suhu kamar selama 5 menit dan disentrifugasi selama 5 menit pada 10. Kloning dan sekuensing gen full-length PGA PGA Setelah identifikasi menghasilkan strain. bangunan itu berubah . coli kompeten DH5a sel dan klon positif diajukan untuk sequencing dengan maju M13 dan primer reverse. Primer dipilih berdasarkan gen yang berkelanjutan PGA lokal yang telah dilaporkan. 18 mM NaCl. Reaksi ditransformasikan ke dalam E.3). amplifikasi PCR dilakukan dalam 25 volume l akhir mengandung 20 mM Tris-HCl (pH 8. dTTP dan dGTP).5 volume etanol dingin 100% . Sequencing dengan primer berbasis vektor menunjukkan bahwa fusi-Nya-tag itu dalam bingkai. sebuah 0. 5'-TGGCCATGA AAAATAGAAATCGTATGATC-3 'dan R2. coli PGA Lokal coding untuk panjang penuh dari PGA diisolasi oleh pencernaan klon pGEM-PGA dengan Msc I-Xho enzim restriksi dan subcloned ke Msc I-Xho tempat 22b vektor ekspresi PET ( Novagen) dalam bingkai dengan tag dari enam terminal histidin karboksi-.

coli Yang mengandung insert panjang penuh PGA subcloned ke PET 22 b ekspresi vektor (Novagen) dalam bingkai dengan terminal-C-tag-Nya fusi untuk pemurnian afinitas (Gambar 3). Kloning urutan gen mengungkapkan bahwa gen terdiri dari 2538 bp pengkodean protein dari 846 asam amino. coli BL21 berubah dengan kaset ekspresi untuk menghasilkan ekspresi yang tinggi protein rekombinan seperti ditunjukkan dalam analisis SDSPAGE dari lisat disebabkan bakteri. Amplifikasi. Hal ini menunjukkan bahwa urutan PGA adalah kekal antara strain E. PGA amplifikasi PCR panjang hasil penuh dari sekitar 2500 bp (Gambar 1). coli BL21 berisi PET 22b-PGA membangun kultur dalam media I (1% Tripton.D-thiogalactopyranoside (IPTG) ke konsentrasi akhir 0. penapisan 280 spesimen (spesimen lingkungan dan klinis) untuk menghasilkan isolasi bakteri E.15% asam fenil asetat) ke absorbansi 0.menjadi E. sel-sel dikumpulkan dengan sentrifugasi dan produksi PGA diperkirakan oleh aminobenzaldehyde-dimetil-metode p (PDAB) (et al Shewale. sel-sel Hasil PCR untuk menghasilkan PGA isolat E. Gambar 4 menunjukkan SDS-PAGE gel Commassie biru-bernoda . Singkatnya. coli 180.).7 unit. Sapi ekstrak 0. Setelah dua jam. Produk PCR diligasikan ke kloning pGEMTeasy vektor dan diverifikasi oleh PCR dan pencernaan pembatasan (Gambar 2). coli Dalam penelitian ini. Induksi dengan IPTG E. coli BL 21strain. berbudaya pada 37 ° C dalam medium LB yang mengandung ampisilin 100 ml-1 mg untuk penyerapan dari 600 nm (A600) sebesar 0. coli E. Ekspresi protein diinduksi dengan menambahkan isopropil .3% dan 0.8 dan diinduksi dengan menambahkan IPTG ( 1 mM). Urutan Nukleotida diendapkan di NCBI Gene Bank dengan nomor aksesi HM011571. Biologis assay untuk produksi PGA oleh bakteri rekombinan E. coli untuk produksi PGA menghasilkan identifikasi positif dari lima strain. coli DNA genom dengan primer di bidang desain yang berkelanjutan gen PGA menghasilkan band PCR 815 bp.5 mM dan dianalisis dengan SDS-PAGE. Urutan produk PCR menegaskan identitas mereka sebagai bagian dari gen PGA. skrining PCR isolat E. Multiple alignment prediksi urutan asam amino dengan urutan PGA dalam data base mengungkapkan homologi antara 90-94%. kloning dan sekuensing amplifikasi PCR PGA E. PGA ekspresi rekombinan di E. 1987. coli.

1985. 2005). Hasil penelitian menunjukkan bahwa induksi dengan 1 mM IPTG mengakibatkan tingginya tingkat aktivitas PGA oleh E. Hasil ini konsisten dengan laporan sebelumnya menunjukkan manfaat teknologi DNA rekombinan untuk produksi PGA (Olsson et al. Hasil ini konsisten dengan laporan sebelumnya pada penerapan teknik PCR untuk identifikasi strain bakteri 7ACA positif (Luo et al. produsen PGA yang 5 e. coli. Analisis menunjukkan urutan gen terdiri dari 2538 nukleotida 846 pengkodean asam amino. 1986. coli. coli isolat. diinkubasi dengan penisilin G dan diuji untuk 6APA produksi. 1996). Konservasi tinggi PGA gen pada E. coli BL21 yang setara dengan 150 unit per gram (berat basah) bakteri rekombinan. dipanen. Assay untuk produksi asilase penisilin G oleh E. coli BL21 membawa gen untuk PGA pada vektor ekspresi pET 22 b dengan liar E. 2002. bakteri dikultur dalam media I dan diinduksi dengan penambahan berbagai konsentrasi IPTG. Garcia et al. coli. coli strain antara 280 proyek.. 2004. Gen dari satu isolat positif diklon dalam vektor pGEM-Teasy dan digunakan untuk sekuensing DNA.) Dan homologi 81% untuk Kluyvera citrophila (et al Guisán. coli BL21 mengekspresikan PGA rekombinan menunjukkan tingginya tingkat aktivitas enzim 3 kali lebih besar dari kegiatan PGA strain liar-jenis E. PGA homologi dengan gen lain yang dilaporkan adalah 96% untuk xylosoxidans Achromobacter (Cai et al.). Hasil penelitian peneliti menunjukkan bahwa gen PGA adalah abadi antara strain E. 1993.. cepat dan efisien strain bakteri yang diproduksi PGA. peneliti menggunakan PCR untuk mengidentifikasi strain e. Metode telah digunakan untuk deteksi biologis diskusi untuk isolasi dan identifikasi bakteri menghasilkan PGA. coli penisilin G produksi asilase sampel klinis dan lingkungan. Analisis BLAST menunjukkan bahwa urutan gen homologi berisi 98% untuk gen PGA sebelumnya dilaporkan dari strain E. tetapi metode ini adalah tenaga kerja dan memakan waktu. coli tipe liar. Budaya dilanjutkan untuk kepadatan tinggi (Lee.dari budaya E. coli sebelum dan sesudah induksi bersama-sama dengan bakteri tanpa ekspresi membangun. Hasil penelitian peneliti menunjukkan bahwa prosedur ini adalah identifikasi sederhana. coli isolat untuk menunjukkan manfaat enzim ini penting untuk kelangsungan hidup bakteri ini dalam kondisi lingkungan yang berbeda.). Polderman-Tijmes et al. Dalam proyek ini. . Bioassay ekspresi rekombinan PGA untuk membandingkan kegiatan PGA rekombinan e. Kegiatan ini adalah sekitar 300% lebih dari yang dipamerkan oleh E.

coli liar isolat dari asal yang berbeda.Kesimpulan dari penelitian ini menunjukkan kesesuaian dan manfaat dari teknik PCR untuk deteksi cepat asilase Penisilin G dalam E. Hasil peneliti bisa memperluas aplikasi PCR sebagai metode murah dan cepat untuk screening isolat dengan karakteristik farmasi dan biologis penting. Hasil dari proyek ini juga menunjukkan bahwa teknologi rekombinan dapat digunakan untuk produksi tingkat tinggi PGA. .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful