Makalah Mikrobiologi, Kromatografi dan Spektrofotometri

Disususn oleh : Dessy Alfionita XII Kimia Analisis 1 P2

KATA PENGANTAR

Puji Syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa yang telah memberikan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas makalah ini dengan tepat waktu. Makalah ini berisi tentang penjelasan mikrobiologi dan spektrofotometri. Terselesaikannya makalah ini tidak terlepas dari bantuan-bantuan berbagai pihak. Oleh karena itu, dengan rasa hormat dan rendah hati penulis mengucapkan terima kasih kepada Guru-guru produktif Kimia Analisis yang telah memberikan materi-materi tentang Kimia analitik khususnya materi kimia instrumen mikrobiologi dan yang berkaitan dengan tema dari makalah ini dan teman-teman XII KA 1 yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan makalah ini. Penulis berharap makalah ini dapat memberikan manfaat bagi pembaca pada umumnya dan bagi diri kami khususnya. Penulis menyadari bahwa makalah ini masih jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu penulis membutuhkan kritik dan saran yang dapat membangun dari pembaca, agar makalah ini menjadi lebih baik.

Bekasi, Februari 2012

Penulis

Daftar Isi

Cover Kata Pengantar Daftar Isi A. Mirobiologi ................................................................................................................... Pengertian Mikrobiologi ..................................................................................................... UJI MPN (Most Propable Number) .................................................................................... Uji TPC (Total Plate Count) ................................................................................................ Sterilisasi .............................................................................................................................. Bakteri Patogen ................................................................................................................... Potensi Antibiotik ............................................................................................................... Inokulasi ............................................................................................................................... Inkubasi ............................................................................................................................... B. Proses Absorbsi Cahaya pada Spektrofotometri ....................................................... Spektrum UV, VIS, UV-VIS dan IR .................................................................................. Prinsip dan Pengertian Sprektofotometer Serapan Atom ................................................... Sistem Atomisasi Nyala ........................................................................................................ Sistem Atomisasi dengan Elektrothermal (TUNGKU) ....................................................... Bagan Alat AAS .................................................................................................................. Lampu HCL (HOLLOW CHATODE LAMP) .................................................................. C. Kromatografi ............................................................................................................... Kromatografi partisi ............................................................................................................ Kromatografi kertas ............................................................................................................. Kromatografi gas ................................................................................................................. HPLC ..................................................................................................................................

A.

Mikrobiologi

I. Pengertian Mikrobiologi
Mikrobiologi adalah sebuah cabang dari ilmu biologi yang mempelajari mikroorganisme. Objek kajiannya biasanya adalah semua makhluk (hidup) yang perlu dilihat dengan mikroskop, khususnya bakteri, fungi, alga mikroskopik, protozoa, dan Archaea. Virus sering juga dimasukkan walaupun sebenarnya tidak sepenuhnya dapat dianggap sebagai makhluk hidup. Mikrobiologi dimulai sejak ditemukannya mikroskop dan menjadi bidang yang sangat penting dalam biologi setelah Louis Pasteur dapat menjelaskan proses fermentasi anggur (wine) dan membuat serum rabies Perkembangan biologi yang pesat pada abad ke-19 terutama dialami pada bidang ini dan memberikan landasan bagi terbukanya bidang penting lain: biokimia. Penerapan mikrobiologi pada masa kini masuk berbagai bidang dan tidak dapat dipisahkan dari cabang lain karena diperlukan juga dalam bidang farmasi, kedokteran, pertanian, ilmu gizi, teknik kimia, bahkan hingga astrobiologi dan arkeologi. II. UJI MPN (Most Propable Number) Tujuan MPN : Untuk menghitung jumlah bakteri e-coli atau golongan coliform yang terdapat dalam sampel. Dasar Uji MPN : Cara ini khusus dilakukan untuk menghitung bakteri golongan coli atau coliform, adanya tabung durham yang terbalik memudahkan pengamatan gas yang terbentuk. Jika menggunakan tabung kimia yang tertutup, kekeruhan pada media menandakan adanya bakteri, dengan adanya reaksi pada tabung durham atau tabung kimia, maka menandakan adanya bakteri, dan jumlah bakteri coliform dapat dirata-ratakan.

Metode MPN 1. Dengan cara pengenceran a) Uji sangkaan

Cara ini khusus dilakukan untuk menghitung jumlah bakteri golongan coliform. b) Uji penguat Hasil positif dari uji penguat di pindahkan atau dilanjutkan dalam media BGLB (brilliant green lactose bilebroth) tanpa pengenceran. c) Uji pelengkap Untuk menentukan bakteri escherichia coli. 1. Sistem ABCD Cara ini untuk menghitung jumlah bakteri golongan coli (coliform)dalam contoh cairan dengan membiakan bakteri pada media

I. Uji TPC (Total Plate Count)

TPC merupakan salah satu metode yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam bahan pangan. Metode TPC merupakan metode yang paling banyak digunakan dalam analisa, karena koloni dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Untuk menghitung total koloni bakteri dengan metode cawan digunakan Nutrien Agar (NA). Alat yang digunakan untuk metode TPC adalah coloning counter.

II.Sterilisasi
Sterilisasi adalah proses untuk mencuci hamakan bahan atau alat yang akan dipakai untuk menganalisis mikrobiologi. Cara-cara sterilisasi : 1) pemanasan langsung atau dengan nyala api
2) cara kering dengan oven (160o C-180o C)

digunakan untuk mensterilisasi alat alat gelas. Alat alat gelas di bungkus dengan koran dengan di pilin pilin. 3) Sterilisasi cara basah Alat yang digunakan dalam sterilisasi basah adalah autoklaf dengan suhu 121o C 4) Pasteorisasi Untuk mensterilkan bahan makanan dan susu, dengan suhu 60oC-70oC . 5) Dengan bahan kimia atau desinfektan

Sterilisasi menggunakan alkohol 70%, formalin, dsb )

I. Bakteri Patogen
Merupakan kelompok bakteri parasit yang menimbulkan penyakit pada manusia, hewan dan tumbuhan. Bakteri penyebab penyakit pada manusia: No. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Nama bakteri Salmonella typhosa Shigella dysenteriae Vibrio comma Haemophilus influenza Diplococcus pneumoniae Clostridium tetani Neiseria meningitis Neiseria gonorrhoeae Penyakit yang ditimbulkan Tifus Disentri basiler Kolera Influensa Pneumonia (radang paru-paru) Tetanus Meningitis (radang selaput otak) Gonorrhaeae (kencing nanah) Sifilis atau Lues atau raja singa Lepra (kusta) Puru atau patek

Mycobacterium tuberculosis TBC paru-paru

10. Treponema pallidum 11. Mycobacterium leprae 12. Treponema pertenue

II.Potensi Antibiotik
Antibiotika adalah suatu substansi kimia yang dibentuk atau diperoleh dari berbagai spesies mikroorganisme, yang dalam konsentrasi rendah mampu menghambat pertumbuhan mikroorganisme lainnya. Antibiotika tersebar di dalam alam dan memegang peranan penting dalam mengatur populasi mikroba dalam tanah, air, limbah, dan kompos. Antibiotika ini memiliki susunan kimia dan cara kerja yang berbeda-beda sehingga masing-masing antibiotika memiliki kuman standar tertentu. Dari sekian banyak antibiotika yang telah berhasil ditemukan, hanya beberapa saja yang cukup tidak toksik untuk dapat dipakai dalam pengobatan. Antibiotika yang kini banyak dipakai kebanyakan diperoleh dari genus Bacillus, Penicillum, dan Streptomyces. Sifat-sifat antibiotika sebaiknya:

Menghambat atau membunuh patogen tanpa merusak host Bersifat bakterisid Tidak menyebabkan resistensi terhadap kuman Berspektrum luas atau menimbulkan efek samping jika

Tidak bersifat alenergik digunakan dalam waktu lama

Aktif dalam plasma, cairan badan, atau eksudat Larut dalam air serta stabil

Bakterial level di dalam tubuh cepat dicapai dan bertahan untuk waktu lama. Antibiotika mengganggu bagian-bagian yang peka dalam sel, yaitu: Sintesis dinding sel Fungsi membran Sintesis protein Metabolism asam nukleat Metabolism intermedier

Berdasarkan sifat toksisitas selektif, ada antimikroba yang bersifat menghambat pertumbuhan mikroba yang dikenal sebagai aktivitas bakteriostatik dan ada juga yang bersifat membunuh mikroba yang dikenal sebagai aktivitas bakterisid. Dalam percobaan ini antibiotik berupa amoxicilin diuji potensinya apakah memenuhi standar dalam kegunaannya untuk membunuh mikroba. Bila perhitungan potensi antibiotik berada pada kisaran 95% -105% berarti antibiotik amoxicillin yang diujikan dapat menghambat pertumbuhan kuman dengan baik.
I.

Inokulasi
Penanaman bakteri atau biasa disebut juga inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Untuk melakukan penanaman bakteri (inokulasi) terlebih dahulu diusakan agar semua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium agar tetap steril, hal ini agar menghindari terjadinya kontaminasi (Dwijoseputro, 1998). Ada beberapa tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan teknik penanaman bakteri (inokulasi) yaitu : 1. Menyiapkan ruangan Ruang tempat penanaman bakteri harus bersih dan keadannya harus steril agar tidak terjadi kesalahan dalam pengamatan atau percobaaan .dalam labotarium pembuataan serum vaksin dan sebagainya. Inokulasi dapat dilakukan dalam sebuah kotak kaca (encast) udara yang lewat dalam kotak tersebut dilewatkan saringan melalui suatu jalan agar tekena sinar ultraviolet (Pelczar, 1986). 2. Pemindahan dengan dengan pipet Cara ini dilakukan dalam penyelidikan air minum atau pada penyelidikan untuk diambil 1 ml contoh yang akan diencerkan oleh air sebanyak 99 ml murni (Pelczar, 1986).

3. Pemindahan dengan kawat inokulasi Ujung kawat inokulasi sebaliknya dari platina atau nikel .ujungnya boleh lurus juga boleh berupa kolongan yang diametrnya 1-3mm. Dalam melakukuan penanaman bakteri kawat ini terlebih dahulu dipijarkan sedangkan sisanya tungkai cukup dilewatkan nyala api saja setelah dingin kembali kawat itu disentuhkan lagi dalam nyala (Pelczar, 1986). Teknik inokulasi merupakan suatu pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Dengan demikian akan diperoleh biakan mikroorganisme yang dapat digunakan untuk pembelajaran mikrobiologi. Pada praktikum ini akan dilakukan teknik inokulasi biakan mikroorganisme pada medium steril untuk mempelajari mikrobiologi dengan satu kultur murni saja. Identifikasi biakan mikroorganisme seringkali memerlukan pemindahan ke biakan segar tanpa terjadi pencemaran. Pemindahan mikroorganisme ini dilakukan dengan teknik aseptik untuk mempertahankan kemurnian biakan selama pemindahan berulangkali. Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dalam biakan cair atau padat. Kekeruhan dalam kaldu menunjukkan terjadinya pertumbuhan mikroorganisme. Bila mikroorganisme menumpuk pada dasar tabung maka akan membentuk sedimen, sedangkan pada permukaan kaldu pertumbuhannya terlihat sebagai pelikel. Pertumbuhan mikroorganisme dalam kaldu seringkali menggambarkan aktivitas metabolismenya. Mikroba aerob obligat berkembang biak pada lapisan permukaan karena pada bagian ini kandungan oksigen tinggi. Selain dalam media cair, mikroorganisme juga memperlihatkan pertumbuhan dengan ciri tertentu dalam biakan padat seperti agar miring atau lempengan agar. Agar miring lazimnya digunakan untuk menyimpan biakan murni sedangkan agar lempengan lazimnya digunakan untuk memurnikan mikroorganisme.
II.

Inkubasi
merupakan suatu teknik perlakuan bagi mikroorganisme yang telah diinokulasikan pada madia (padat atau cair), kemudian di simpan pada suhu tertentu untuk dapat melihat pertumbuhannya. Bila suhu inkubasi tidak sesuai dengan yang diperlukan, biasanya mikroorganisme tidak dapat tumbuh dengan baik. Media inkubasi digolongkan menjadi 2 jenis :

1. 2. Proses

Pada lemari biasa atau suhu kamar, Pada incubator yang suhunya dapat di tentukan ini bertujuan agar kita dapat melihat pertumbuhan atau

perkembangbiakan pada mikroorganisme.

A. Pengertian Dasar Spektrofotometer Vis, UV, UV-Vis

Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Peralatan yang digunakan dalam spektrofotometri disebut spektrofotometer. Cahaya yang dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan materi dapat berupa atom dan molekul namun yang lebih berperan adalah elektron valensi. Sinar atau cahaya yang berasal dari sumber tertentu disebut juga sebagai radiasi elektromagnetik. Radiasi elektromagnetik yang dijumpai dalam kehidupan sehari-hari adalah cahaya matahari. Dalam interaksi materi dengan cahaya atau radiasi elektromagnetik, radiasi elektromagnetik kemungkinanan dihamburkan, diabsorbsi atau dihamburkan sehingga dikenal adanya spektroskopi hamburan, spektroskopi absorbsi ataupun spektroskopi emisi. Pengertian spektroskopi dan spektrofotometri pada dasarnya sama yaitu di dasarkan pada interaksi antara materi dengan radiasi elektromagnetik. Namun pengertian spektrofotometri lebih spesifik atau pengertiannya lebih sempit karena ditunjukan pada interaksi antara materi dengan cahaya (baik yang dilihat maupun tidak terlihat). Sedangkan pengertian spektroskopi lebih luas misalnya cahaya maupun medan magnet termasuk gelombang elektromagnetik. Radiasi elektromagnetik memiliki sifat ganda yang disebut sebagai sifat dualistik cahaya yaitu: 1) Sebagai gelombang

2) Sebagai partikel-partikel energi yang disebut foton. Karena sifat tersebut maka beberapa parameter perlu diketahui misalnya panjang gelombang, frekuensi dan energi tiap foton. Panjang gelombang (l) didefinisikan sebagai jarak antara dua puncak.

Interaksi antara materi dengan cahaya disini adalah terjadi penyerapan cahaya, baik cahaya Uv, Vis maupun Ir oleh materi sehingga spektrofotometri disebut juga sebagai spektroskopi absorbsi. Dari 4 jenis spektrofotometri ini (UV, Vis, UV-Vis dan Ir) memiliki prinsip kerja yang sama yaitu adanya interaksi antara materi dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu. Perbedaannya terletak pada panjang gelombang yang digunakan. Secara sederhana Instrumen spektrofotometri yang disebut spektrofotometer terdiri dari : sumber cahaya monokromator sel sampel detektor read out (pembaca).

Fungsi masing-masing bagian: 1. Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis dengan berbagai macam rentang panjang gelombang. Untuk sepktrofotometer

UV menggunakan lampu deuterium atau disebut juga heavi hidrogen VIS menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram UV-VIS menggunan photodiode yang telah dilengkapi monokromator. Infra merah, lampu pada panjang gelombang IR.

2. Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya monaokromatis. Jenis monokromator yang saat ini banyak digunakan adalan gratting atau lensa prisma dan filter optik.

Jika digunakan grating maka cahaya akan dirubah menjadi spektrum cahaya. Sedangkan filter optik berupa lensa berwarna sehingga cahaya yang diteruskan sesuai dengan warnya lensa yang dikenai cahaya. Ada banyak lensa warna dalam satu alat yang digunakan sesuai dengan jenis pemeriksaan. Pada gambar di atas disebut sebagai pendispersi atau penyebar cahaya. dengan adanya pendispersi hanya satu jenis cahaya atau cahaya dengan panjang gelombang tunggal yang mengenai sel sampel. Pada gambar di atas hanya cahaya hijau yang melewati pintu keluar. Proses dispersi atau penyebaran cahaya seperti yang tertera pada gambar.

3. Sel sampel berfungsi sebagai tempat meletakan sampel - UV, VIS dan UV-VIS menggunakan kuvet sebagai tempat sampel. Kuvet biasanya terbuat dari kuarsa atau gelas, namun kuvet dari kuarsa yang terbuat dari silika memiliki kualitas yang lebih baik. Hal ini disebabkan yang terbuat dari kaca dan plastik dapat menyerap UV sehingga penggunaannya hanya pada spektrofotometer sinar tampak (VIS). Cuvet biasanya berbentuk persegi panjang dengan lebar 1 cm. - IR, untuk sampel cair dan padat (dalam bentuk pasta) biasanya dioleskan pada dua lempeng natrium klorida. Untuk sampel dalam bentuk larutan dimasukan ke dalam sel natrium klorida. Sel ini akan dipecahkan untuk mengambil kembali larutan yang dianalisis, jika sampel yang dimiliki sangat sedikit dan harganya mahal.

4. Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan mengubahnya menjadi arus listrik. Syarat-syarat sebuah detektor : Kepekaan yang tinggi Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi Respon konstan pada berbagai panjang gelombang. Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi. Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi.

Macam-macam detektor : Detektor foto (Photo detector) Photocell, misalnya CdS. Phototube Hantaran foto Dioda foto Detektor panas

5. Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat listrik yang berasal dari detektor.

I.

Proses Absorbsi Cahaya pada Spektrofotometri

Ketika cahaya dengan panjang berbagai panjang gelombang (cahaya polikromatis) mengenai suatu zat, maka cahaya dengan panjang gelombang tertentu saja yang akan diserap. Di dalam suatu molekul yang memegang peranan penting adalah elektron valensi dari setiap atom yang ada hingga terbentuk suatu materi. Elektron-elektron yang dimiliki oleh suatu molekul dapat berpindah (eksitasi), berputar (rotasi) dan bergetar (vibrasi) jika dikenai suatu energi. Jika zat menyerap cahaya tampak dan UV maka akan terjadi perpindahan elektron dari keadaan dasar menuju ke keadaan tereksitasi. Perpindahan elektron ini disebut transisi elektronik. Apabila cahaya yang diserap adalah cahaya inframerah maka elektron yang ada dalam atom atau elektron ikatan pada suatu molekul dapat hanya akan bergetar (vibrasi). Sedangkan gerakan berputar elektron terjadi pada energi yang lebih rendah lagi misalnya pada gelombang radio. Atas dasar inilah spektrofotometri dirancang untuk mengukur konsentrasi suatu suatu yang ada dalam suatu sampel. Dimana zat yang ada dalam sel sampel disinari dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu. Ketika cahaya mengenai sampel sebagian akan diserap, sebagian akan dihamburkan dan sebagian lagi akan diteruskan. Pada spektrofotometri, cahaya datang atau cahaya masuk atau cahaya yang mengenai permukaan zat dan cahaya setelah melewati zat tidak dapat diukur, yang dapat diukur adalah It/I0 atau I0/It (perbandingan cahaya datang dengan cahaya setelah melewati materi (sampel)). Proses penyerapan cahaya oleh suatu zat dapat digambarkan sebagai berikut:

Gambar Proses penyerapan cahaya oleh zat dalam sel sampel. dari gambar terlihat bahwa zat sebelum melewati sel sampel lebih terang atau lebih banyak di banding cahaya setelah melewati sel sampel

Cahaya yang diserap diukur sebagai absorbansi (A) sedangkan cahaya yang hamburkan diukur sebagai transmitansi (T), dinyatakan dengan hukum lambert-beer atau Hukum Beer, berbunyi:

jumlah radiasi cahaya tampak (ultraviolet, inframerah dan sebagainya) yang diserap atau ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat dan tebal larutan.

Berdasarkan hukum Lambert-Beer, rumus yang digunakan untuk menghitung banyaknya cahaya yang hamburkan:

dan absorbansi dinyatakan dengan rumus:

dimana I0 merupakan intensitas cahaya datang dan It atau I1 adalah intensitas cahaya setelah melewati sampel. Rumus yang diturunkan dari Hukum Beer dapat ditulis sebagai:

A= a . b . c atau A = . b . c

dimana: A = absorbansi b atau terkadang digunakan l = tebal larutan (tebal kuvet diperhitungkan juga umumnya 1 cm) c = konsentrasi larutan yang diukur = tetapan absorptivitas molar (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam molar)

a = tetapan absorptivitas (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam ppm).

Secara eksperimen hukum Lambert-beer akan terpenuhi apabila peralatan yang digunakan memenuhi kriteria-kriteria berikut: 1. 2. 3. Sinar yang masuk atau sinar yang mengenai sel sampel berupa sinar Penyerapan sinar oleh suatu molekul yang ada di dalam larutan tidak Penyerapan terjadi di dalam volume larutan yang luas penampang

dengan dengan panjang gelombang tunggal (monokromatis). dipengaruhi oleh molekul yang lain yang ada bersama dalam satu larutan. (tebal kuvet) yang sama. 4. Penyerapan tidak menghasilkan pemancaran sinar pendafluor. Artinya

larutan yang diukur harus benar-benar jernih agar tidak terjadi hamburan cahaya oleh partikel-partikel koloid atau suspensi yang ada di dalam larutan. 5. Konsentrasi analit rendah. Karena apabila konsentrasi tinggi akan menggangu kelinearan grafik absorbansi versus konsntrasi.

Faktor-faktor

yang

sering

menyebabkan

kesalahan

dalam

menggunakan spektrofotometer dalam mengukur konsentrasi suatu analit: 1. Adanya serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan

blangko, yaitu larutan yang berisi selain komponen yang akan dianalisis termasuk zat pembentuk warna. 2. 3. Serapan oleh kuvet. Kuvet yang ada biasanya dari bahan gelas atau Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi kuarsa, namun kuvet dari kuarsa memiliki kualitas yang lebih baik. sangat rendah atau sangat tinggi, hal ini dapat diatur dengan pengaturan konsentrasi, sesuai dengan kisaran sensitivitas dari alat yang digunakan (melalui pengenceran atau pemekatan).

I.

Spektrum UV, VIS, UV-VIS dan IR

Data-data yang dikeluarkan oleh UV atau VIS dapat berupa absorbansi

atau transmitansi yang langsung dibaca pada spektrofotometer. Namun untuk UV, VIS, UV-VIS dan IR data yang dikeluarkan dapat berupa spektrum jika telah dihubungkan dengan komputer. Spektrum yang dikeluarkan oleh UV, VIS dan UV-VIS berupa pita yang lebar sedangkan pada pita yang dikeluarkan oleh IR berupa garis atau puncak tajam. Pita melebar dari UV-VIS disebabkan karena energi yang dimiliki selain menyebabkan transisi elektronik terjadi pula rotasi dan vibrasi elektron dalam molekul. Sedangkan pada IR hanya terjadi vibrasi elektron maka spektrum yang dihasilkan berupa garis atau puncak tajam. Selain pada IR, spektrum berupa garis dapat terjadi pula pada spektroskopi NMR karena hanya terjadi rotasi elektron.

II.

Prinsip dan Pengertian Sperktofotometer Serapan Atom

Prinsip analisis dengan SSA adalah interaksi antara energi radiasi dengan atom

unsur yang dianalisis. AAS banyak digunakan untuk analisis unsur. Atom suatu unsur akan menyerap energi dan terjadi eksitasi atom ke tingkat energi yang lebih tinggi. Keadaan ini tidak stabil dan akan kembali ke tingkat dasar dengan melepaskan sebagian atau seluruh tenaga eksitasinya dalam bentuk radiasi. Frekuansi radiasi yang dipancarkan karakteristik untuk setiap unsur dan intensitasnya sebanding dengan jumlah atom yang tereksitasi yang kemudian mengalami deeksitasi. Teknik ini dikenal dengan SEA (spektrofotometer emisi atom). Untuk SSA keadaan berlawanan dengan cara emisi yaitu, populasi atom pada tingkat dasar dikenakan seberkas radiasi, maka akan terjadi penyerapan energi radiasi oleh atom-atom yang berada pada tingkat dasar tersebut. Penyerapan ini menyebabkan terjadinya pengurangan intensitas radiasi yang diberikan. Pengurangan intensitasnya sebanding dengan jumlah atom yang berada pada tingkat dasar tersebut.

Larutan sampel diaspirasikan ke suatu nyala dan unsur-unsur di dalam sampel diubah menjadi uap atom sehingga nyala rnengandung atom unsur-unsur yang dianalisis. Beberapa diantara atom akan tereksitasi secara termal oleh ayala, tetapi kebanyakan atom tetap tinggal sebagai atom netral dalam keadaan dasar (ground state). Atom-atom ground state ini kemudian menyerap radiasi yang diberikan oleh sumber radiasi yang terbuat dari unsur-unsur yang bersangkutan. Panjang gelombang yang dihasilkan oleh sumber radiasi adalah sama dengan panjang gelombang yang diabsorpsi oleh atom dalam nyala. Absorpsi ini mengikuti hukum Lambert-Beer. yakni absorbansi berbanding lurus dengan panjang uyala yang dilalui sinar dan konsentrasi uap atom dalam nyala. Kedua variabel ini sulit untuk ditentukan tetapi panjang nyala dapat dibuat konstan sehingga absorbansi hanya berbanding langsung dengan konsentrasi analit dalam larutan sampel. Teknikteknik analisisnya sama seperti pada spektrofotometri UV -Vis yaitu standar tunggal, kurva kalibrasi dan kurva adisi standar.

IV. Sistem Atomisasi Nyala

Setiap alat spektrometri atom akan mencakup dua komponen utama sistem introduksi sampel dan sumber (source) atomisasi. Untuk kebanyakan instrumen sumber atomisasi ini adalah nyala dan sampel di introduksikan dalarn bentuk larutan. Sampel masuk ke nyala dalam bentuk aerosol. Aerosol biasanya dihasilkan oleh Nebulizer (pengabut) yang dihubungkan ke nyala oleh ruang penyemprot (chamber spray). Ada banyak variasi nyala yang telah diapakai bertahun-tahun untuk spektrometri atom. Namun demikian. yang saat ini menonjol dan dipakai secara luas untuk pengukuran analitik adalah udara-asetilen dan nitrous oksida- asetilen. Dengan kedua jenis nyala ini, kondisi analisis yang sesuai untuk kebanyakan ana! it (unsur yang dianalisis) dapat ditentukan dengan menggunakan metode-metode emisi, absorbsi dan juga fluoresensi. 1) Nyala udara-asetilen Biasanya menjadi pilihan untuk analisis menggunakan AAS,. temperarur nyala-nya yang lebih rendah mendorong terbentuknya atom netral dan dengan

nyala yang kaya bahan bakar pembentukan oksida dari banyak unsur dapat diminimalkan. 2) Nitrous oksida-asetilen Dianjurkan dipakai untuk penentuan unsur-unsur yang mudah membentuk oksida dan sulit terurai. Hal ini disebabkan temperatur nyala yang dihasilkan relative tinggi. Unsur-unsur tersebut adalah: Al, B, Mo, Si, So, Ti, V danW. Proses atomisasi adalah proses pengubahan sample dalam bentuk larutan menjadi spesies atom dalam nyala. Proses atomisasi ini akan berpengaruh terhadap hubungan antara konsentrasi atom analit dalam larutan dan sinyal yang diperoleh pada detektor dan dengan demikian sangat berpengaruh terhadap sensitivitas analisis. Langkah-langkah proses atomisasi melibatkan hal-hal kunci sebagaimana diberikan pada Gambar 3. Secara ideal fungsi dari sistem atomisasi (source) adalah : 1) Mengubah sembarang jenis sampel menjadi uap atom fasa-gas dengan sedikit perlakuan atau tanpa perIakuan awal. 2) Me!akukan seperti pada point 1) untuk semua elemen (unsur) dalam sampel pada s sampel. 4) Mendapatkan sinyal analitik sebagai fungsi sederhana dari konsentrasi tiaptiap elemen. yakni agar gangguan(interfererisi) dan penganih matriks (media) sampel menjadi minimal. 6) 7) " 5) Memberikan analisis yang teliti (precise) dan tepat (accurate). Mendapatkan harga beli, perawatan dan pengoperasian yang murah. Memudahkanoperasi. emua level konsentrasi. 3) Agar diperoleh kondisi operasi yang identik untuk setiap elemen dan

V. Sistem Atomisasi dengan Elektrothermal (TUNGKU) Sistem nyala api ini lebih dikenal dengan nama GFAAS. GFAAS dapat mengatasi kelemahan dari sistem nyala seperti, sensitivitas, jumlah sampel dan penyiapan sampel. Ada tiga tahap atomisasi dengan tungku yaitu:

a. b.

Tahap pengeringan atau penguapan larutan

Tahap pengabuan atau penghilangan senyawa-senyawa organik dan Unsur-unsur yang dapat dianalsis dengan menggunakan GFAAS adalah sama

c. Tahap atomisasi dengan unsur-unsur yang dapat dianalisis dengan sistem nyala. Beberapa unsur yang sama sekali tidak dapat dianalisis dengan GFAAS adalah tungsten, Hf, Nd, Ho, La, Lu, Os, Br, Re, Sc, Ta, U, W, Y dan Zr, hal ini disebabkan karena unsur tersebut dapat bereaksi dengan graphit. Petunjuk praktis penggunaan GFAAS: 1. 2. 3. Jangan menggunakan media klorida, lebih baik gunakan nitrat Sulfat dan fosfat bagus untuk pelarut sampel, biasanya setelah sampel Gunakan cara adisi sehingga bila sampel ada interferensi dapat terjadi pada

ditempatkan dalam tungku sampel dan standard. VI. Bagan Alat AAS Karena komponen lain dalam instrumentasi AAS telah disinggung sebelumnya kecuali hollow cathode lamp: HCL (Iampu katoda cekung), maka selanjutnya hanya akan dibahas komponen HCL yang merupakan kunci berkembang pesatnya AAS dan sekaligus penjelasan mengapa metode AAS merupakan metode analsis yang sangat selektif. VII. Lampu HCL (HOLLOW CHATODE LAMP) Lampu ini merupakan sumber radiasi dengan spektra yang tajam dan mengemisikan gelombang monokhromatis. Lampu ini terdiri dari katoda cekung yang silindris yang terbuat dari unsur yang akan ditentukan atau campurannya (alloy) dan anoda yang terbuat dari tungsten. Elektroda-elektroda ini berada dalam tabung gelas dengan jendela quartz karena panjang gelombang emisinya sering berada pada daerah ultraviolet. Tabung gelas tersebut dibuat bertekanan rendah dan diisi dengan gas inert Ar atau Ne. Beda voltase yang cukup tinggi dikenakan pada kedua elektroda tersebut sehingga atom gas pada anoda terionisasi. Ion positif ini dipercepat kearah katoda dan ketika menabrak katoda menyebabkan beberapa logam pada katoda terpental dan berubah menjadi uap, Atom yang teruapkan ini,

karena tabrakan dengan ion gas yang berenergi tinggi, tereksitasi ke tingkat energi elektron yang lebih tinggi; ketika kembali ke keadaan dasar atom-atom tersebut memancarkan sinar dengan yang karakteristik untuk unsur katoda tersebut. Berkas sinar yang diemisikan bergerak melalui nyala dan berkas dengan tertentu yang dipilih dengan monokromator akan diserap oleh uap atom yang ada dalam nyala yang berasal dari sampel. Sinar yang diabsorpsi paling kuat biasanya adalah sinar yang berasal dart transisi elektron ke tingkat eksitasi terendah. Sinar ini disebut garis resonansi. Sumber radiasi lain yang sering digunakan adalah "Electrodless Discharge Lamp ". Lampu ini mempunyai prinsip kerja hampir sama dengan HCL, tetapi mempunyai output radiasi lebih tinggi dan biasanya digunakan untuk analisis unsur-unsur As dan Se, karena lampu HCL untuk unsur-unsur ini mempunyai sinyal yang lemah dan tidak stabil.

Ada tiga teknik yang biasa dipakai dalam analisis secara spektrometri. Ketiga teknik tersebut adalah (1) Metoda Standar Tunggal Metoda sangat praktis karena hanya menggunakan satu larutan standar yang telah diketahui konsentrasinya (Cstd). Selanjutnya absorbsi larutan standar (Asta) dan absorbsi larutan sampel (Asmp) diukur dengan Spektrofotometri. Dengan mengukur Absorbansi larutan sampel dan standar, konsentrasi larutan sampel dapat dihitung. (2) Metode Kurva Kalibrasi Dalam metode ini dibuat suatu seri larutan standar dengan berbagai konsentrasi dan absorbansi dari larutan tersebut diukur dengan AAS. Langkah selanjutnya adalah membuat grafik antara konsentrasi (C) dengan Absorbansi (A) yang akan merupakan garis lurus melewati titik nol dengan slope = .b atau slope = a.b. Konsentrasi larutan sampel dapat dicari setelah absorbansi larutan sampel diukur dan diintrapolasi ke dalam kurva kalibrasi atau dimasukkan ke dalam persamaan garis lurus yang diperoleh dengan menggunakan program regresi linear pada kurva kalibrasi. (3) Metoda Adisi Standar

Metoda ini dipakai secara luas karena mampu meminimalkan kesalahan yang disebabkan oleh perbedaan kondisi lingkungan (matriks) sampel dan standar. Dalam metoda ini dua atau lebih sejumlah volume tertentu dari sampel dipindahkan ke dalam labu takar. Satu larutan diencerkan sampat volume tertentu kemudian diukur absorbansinya tanpa ditambah dengan zat standar, sedangkan larutan yang lain sebelum diukur absorbansinya ditambah terlebih dulu dengan sejumlah tertentu tarutan standar dan diencerkan seperti pada larutan yang pertama.

C. Kromarografi
Di awal abad ke-20, kimiawan Rusia Mikhail Semnovich Tsvet (18721919) menyiapkan kolom yang diisi dengan serbuk kalsium karbonat, dan kedalamnya dituangkan campuran pigmen tanaman yang dilarutkan dalam eter. Secara mengejutkan, pigmen memisahkan dan membentuk lapisan berwarna di sepanjang kolom. Ia menamakan kromatografi pada teknik pemisahan baru ini (1906). Kemudian kimiawan dari Swiss Richard Martin Willsttter (1872-1942) menerapkan teknik ini untuk risetnya yakni khlorofil untuk menunjukkan manfaat teknik ini, dan sejak itu banyak perhatian diberikan pada kromatografi. Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan campuran menjadi

komponennya dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-masing komponen. Alat yang digunakan terdiri atas kolom yang di dalamnya diisikan fasa stasioner (padatan atau cairan). Campuran ditambahkan ke kolom dari ujung satu dan campuran akan bergerak dengan bantuan pengemban yang cocok (fasa mobil). Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom, yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fasa mobil dan fasa diam (stationer). Komponen utama kromatografi adalah fasa stationer dan fasa mobil dan kromatografi dibagi menjadi beberapa jenis bergantung pada jenis fasa mobil dan mekanisme pemisahannya, seperti ditunjukkan di Tabel 12.1

Tabel 12.1 Klasifikasi kromatografi

Kriteria

Nama Kromatografi cair, kromatografi gas Kromatografi adsorpsi, kromatografi partisi Kromatografi pertukaran ion kromatografi gel Kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis, kromatografi kertas

Fasa mobil

Mekanisme

Fasa stationer

Beberapa contoh kromatografi yang sering digunakan di laboratorium diberikan di bawah ini. I. Kromatografi partisi Prinsip kromatografi partisi dapat dijelaskan dengan hukum partisi yang dapat diterapkan pada sistem multikomponen yang dibahas di bagian sebelumnya. Dalam kromatografi partisi, ekstraksi terjadi berulang dalam satu kali proses. Dalam percobaan, zat terlarut didistribusikan antara fasa stationer dan fasa mobil. Fasa stationer dalam banyak kasus pelarut diadsorbsi pada adsorben dan fasa mobil adalah molekul pelarut yang mengisi ruang antar partikel yang ter adsorbsi. Contoh khas kromatografi partisi adalah kromatografi kolom yang digunakan luas karena merupakan sangat efisien untuk pemisahan senyawa organik (Gambar 12.3). Kolomnya (tabung gela) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau pati yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sammpel diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom. Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa mobil) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa stationer). Selama perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut. Akhirnya, zat terlarut akan terpisahkan membentuk beberapa lapisan.

Akhirnya, masing-masing lapisan dielusi dengan pelarut yang cocok untuk memberikan spesimen murninya. Nilai R didefinisikan untuk tiap zat etralrut dengan persamaan berikut. R = (jarak yang ditempuh zat terlarut) / (jarak yang ditempuh pelarut/fasa mobil).

Gambar 12.3 Diagram skematik kromatografi

II. Kromatografi kertas

Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas prinsipnya sama dengan mekanisme pada kromatografi kolom. Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas saring, yakni selulosa. Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian digantung dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan kedalam pelarut yang mengisi dasar wadah. Fasa mobil (pelarut) dapat saja beragam. Air, etanol, asam asetat atau campuran zat-zat ini dapat digunakan. Kromatografi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino dengan sukses besar. Karena asam amino memiliki sifat yang sangat mirip, dan asam-asam amino larut dalam air dan tidak mudah menguap (tidak mungkin didistilasi), pemisahan asam amino adalah masalah paling sukar yang dihadapi kimiawan di akhir abad 19 dan awal abad 20. Jadi penemuan kromatografi kertas merupakan berita sangat baik bagi mereka.

Kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914-1994) adalah orang pertama yang menggunakan metoda analisis asam amino dengan kromatografi kertas. Saat campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung berulang-ulang. Ketiak pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai R, masing-masing asam amino diidentifikasi. Kromatografi kertas dua-dimensi (2D) menggunakan kertas yang luas bukan lembaran kecil, dan sampelnya diproses secara dua dimensi dengan dua pelarut.

Gambar 12.4 Contoh hasil kromatografi kertas pigmen dari www.indigo.com/ science-supplies/filterpaper. html

III. Kromatografi gas

Campuran gas dapat dipisahkan dengan kromatografi gas. Fasa stationer dapat berupa padatan (kromatografi gas-padat) atau cairan (kromatografi gas-cair). Umumnya, untuk kromatografi gas-padat, sejumlah kecil padatan inert misalnya karbon teraktivasi, alumina teraktivasi, silika gel atau saringan molekular diisikan ke dalam tabung logam gulung yang panjang (2-10 m) dan tipis. Fasa mobil adalah gas semacam hidrogen, nitrogen atau argon dan disebut gas pembawa. Pemisahan gas bertitik didih rendah seperti oksigen, karbon monoksida dan karbon dioksida dimungkinkan dengan teknik ini.

Dalam kasus kromatografi gas-cair, ester seperti ftalil dodesilsulfat yang diadsorbsi di permukaan alumina teraktivasi, silika gel atau penyaring molekular, digunakan sebagai fasa diam dan diisikan ke dalam kolom. Campuran senyawa yang mudah menguap dicampur dengan gas pembawa disuntikkan ke dalam kolom, dan setiap senyawa akan dipartisi antara fasa gas (mobil) dan fasa cair (diam) mengikuti hukum partisi. Senyawa yang kurang larut dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu. Metoda ini khususnya sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah menguap seperti hidrokarbon dan ester. Analisis minyak mentah dan minyak atsiri dalam buah telah dengan sukses dilakukan dengan teknik ini. Efisiensi pemisahan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan cairannya. Disarankan untuk mencoba fasa cair standar yang diketahui efektif untuk berbagai senyawa. Berdasarkan hasil ini, cairan yang lebih khusus kemudian dapat dipilih. Metoda deteksinya, akan mempengaruhi kesensitifan teknik ini. Metoda yang dipilih akan bergantung apakah tujuannya analisik atau preparatif.

IV. HPLC
Akhir-akhir ini, untuk pemurnian (misalnya untuk keperluan sintesis) senyawa organik skala besar, HPLC (high precision liquid chromatography atau high performance liquid chromatography) secara ekstensif digunakan. Bi la zat melarut dengan pelarut yang cocok, zat tersebut dapat dianalisis. Ciri teknik ini adalah penggunaan tekanan tinggi untuk mengirim fasa mobil kedalam kolom. Dengan memberikan tekanan tinggi, laju dan efisiensi pemisahan dapat ditingkatkan dengan besar. Silika gel atau oktadesilsilan yang terikat pada silika gel digunakan sebagai fasa stationer. Fasa stationer cair tidak populer. Kolom yang digunakan untuk HPLC lebih pendek daripada kolom yang digunakan untuk kromatografi gas. Sebagian besar kolom lebih pendek dari 1 m. Kromatografi penukar ion menggunakan bahan penukar ion sebagai fasa diam dan telah berhasil digunakan untuk analisis kation, anion dan ion organik.