ISOLASI & PEMBIAKAN VIRUS

Oleh: Drh Maria Aega Gelolodo

Isolasi virus
‡ Diagnosa klinis pengambilan spesimen 

Material Otopsi Respirasi : Paru-paru & Thrakea Sistem saraf: otak & sum2 tulang belakang Jantung : jantung Pantropik : ginjal, hati & limpa

‡ Feses : Rectal swab ‡ Darah ‡ Cairan tubuh: Cerebrospinal. peritoneum & synovial serta eksudat yang keluar dari mata. hidung maupun mulut (swab) ‡ Urine . pericard.

‡ Pemilihan media yang digunakan tergantung dari jenis virusnya dan organ target dari virus tersebut. virus hanya dapat dibiakan pada sel hidup.PEMBIAKAN VIRUS ‡ Virus merupakan mikroorganisme yang bersifat parasit obligat dan hanya bisa hidup pada media yang hidup. ‡ Berkaitan dengan sifatnya tersebut. .

gelas atau tabung menggunakn media biakan jaringan (tissue culture) atau biakan sel (cell culture). . in vitro yaitu menumbuhkan virus di dalam gelas.Untuk menumbuhkan virus dalam rangka mengisolasi suatu virus dapat dilakukan secara : 1. in vivo adalah metode menumbuhkan pada hewan percobaan sebagai model 3. in ovo yaitu metode menumbuhkan pada media telur berembrio (telur yang sudah dibuahi) 2.

Virus Isolation: Telur Embrio Tunas (TET) ‡ Telur berembrio telah lama dan paling sering digunakan sebagai media isolasi dan propagasi atau pembiakan virus. .

.‡ Telur berembrio atau sering disebut dengan telur embrio tertunas (TET) atau telur ayam berembrio (TAB) sangat penting dalam perkembangan virologi karena pada telur tertunas dapat ditemukan bermacam-macam tipe sel yang mampu ditumbuhi/menjadi media tumbuhnya berbagai jenis virus.

sel pada kantong kuning telur ( Yolk sac) dan sel endotel pada pembuluh darah 5. Sel epitel amnion yang melapisi ruang amnion 4.Macam-macam sel tersebut adalah : 1. Sel epitel alantois yang merupakan sel penyusun pada membran khorioalantaois. 3. . Sel dari embrionya itu sendiri yang umumnya adalah sel fibroblast. Sel epitel khorion yang berada pada membran khorion 2.

Keberhasilan isolasi dan propagasi virus pada telur dipengaruhi oleh :  Rute inokulasi  Umur embrio pada telur  Temperatur/suhu inkubasi  Lamanya waktu inkubasi setelah inokulasi  Volume dan pengenceran inokulum yang digunakan  Status kekebalan flok dari induk tempat telur berasal .

. sebaiknya digunakan telur yang berasal dari breeding flock yang bebas patogen tertentu (SPF/spesific pathogen free). ‡ Telur yang digunakan diinkubasikan pada suhu 37o-3 o Celcius dan kelembaban relatif 60-70%.‡ Dalam membiakan virus menggunakan telur.

Telur-telur yang tidak normal tidak bisa digunakan. sesuai dengan umurnya atau ada kelainan. pemeriksaan ini dilakukan untuk mengetahui apakah telur dalam kondisi normal. .‡ Sebelum diinokulasi telur diperiksa dengan teropong (candling). Kelainan yang terjadi misalnya tidak adanya kantung udara. infertile (tidak dibuahi). embrio lemah atau mati.

misalnya pada virus yang lebih menyukai sel epitel sebagai tempat berkembang biaknya dapat diinokulasikan pada membran khorioalantois. kantong kuning telur (yolk sac). ruang alantois (allantoic cavity).‡ Inokulasi virus kedalam telur dapat dilakukan dibeberapa tempat tergantung jenis virusnya. ‡ Rute inokulasi yang dapat dilakukan antara lain adalah kedalam ruang amnion (amnionic cavity). membran khorio alantois. intravena (pembuluh darah ) & kedalam otak embrio. .

‡ Dalam menginokulasi virus ke telur selain rute. pada daerah tertentu kondisinya optimal. ‡ Bila akan menginokulasi kedaerah ruang amnion . . umur telur juga harus diperhatikan. pembuluh darah (intra vena) dan kantong kuning telur sebaiknya digunakan telur yang berumur 5-7 hari karena pada umur tersebut embrio masih muda dan kecil sehingga kuning telur masih cukup besar ukurannya demikian juga ruang amnionnya. sebab pada umur tertentu.

.‡ Untuk menginokulasi ke daerah ruang alantois dilakukan pada tekur yang berumur 9-12 hari karena pada saat itu luas ruang alantois yang optimal dan bila akan menginokulasi ke membran khorio alantois sebaiknya pada telur yang berumur 12-14 hari sebab pada umur tersebut mambran cukup kuat untuk ditarik dan dibuat kantung udara buatan. ‡ contoh pemanfaatan TET misanya untuk memperbanyak virus ND ataupun Pox.

Why do we need Cell culture? ‡ Research ± Reduce animal use ‡ Commercial or large-scale production ± Production of cell material: vaccine. antigen .Pembiakan virus pada kultur sel Virus dapat diperbanyak dengan melakukan kultur sel yaitu menumbuhkan sel yang terinfeksi virus secara invitro.

1 H1.Jenis sel asal hewan yang sering digunakan pada kultur sel CELL LINE* 3T3 293 BHK21 MDCK HeLa PtK1 L6 PC12 SP2 COS CHO DT40 (chick) R1 E14. H9 S2 BY2 CELL TYPE AND ORIGIN Fibroblast (mouse) Kidney epithelium (human) fibroblast (Syrian hamster) epithelial cell (dog) cancer epithelial cell (human) epithelial cell (rat kangaroo) myoblast (rat) chromaffin cell (rat) (neuroblastoma cell) plasma cell (mouse) kidney (monkey) ovary (chinese hamster) lymphoma cell for efficient targeted recombination embryonic stem cells (mouse) embryonic stem cells (mouse) embryonic stem cells (human) macrophage-like cells (Drosophila) undifferentiated meristematic cells (tobacco) .

Pembiakan virus pada kultur sel Kelebihan : ‡ Dapat memproduksi dalam jumlah banyak ‡ Semua jenis virus dapat dibiakan pada kultur sel( tergantung jenis selnya) Kekurangannya : ‡ Biaya lebih mahal ‡ Pengerjaan harus aseptis ‡ Perlu peralatan yang lebih kompleks dibanding pembiakan pada telur .

Pembiakan virus pada hewan percobaan ‡ Sudah jarang dilakukan terkait dengan kesejahteraan hewan ‡ Penelitian sudah demikian maju. sudah banyak jenis kultur sel yang dapat digunakan untuk menumbuhkan virus. .

REAKSI VIRUS TERHADAP AGEN FISIK & KIMIA 1. ‡ Di dalam laboratorium harus diusahakan agar suspensi virus dan jaringan tubuh yang mengandung virus secepatnya disimpan pada suhu -40°C atau akan lebih bagus pada suhu 70°C. Misalnya virus Pox. Suhu dan Temperatur ‡ Sebagian besar virus sangat labil dan dapat hidup diluar tubuh induk semang. . Beberapa virus ada yang stabil pada temperatur kamar serta dapat hidup dalam waktu yang cukup lama.

. yang disebut dengan freeze drying. Kebanyakan virus dapat disimpan berbulanbulan bahkan bertahun-tahun pada ampul gelas hampa udara dalam nitrogen cair (196°C) atau pada suhu -70°C sampai -90°C (untuk virus beramplop).‡ Pengawetan virus yang terbaik adalah melalui proses pengeringan dalam keadaan beku.

‡ Material penyakit yang mengandung virus harus ditempatkan dalam tabung tertutup kedap udara bila didinginkan dengan CO2 padat (es kering) untuk menghindari perusakan virus oleh gas CO2. Sejumlah virus dapat diinaktifkan oleh proses pembekuan pencairan (feezing-thawing). . ‡ Sebagian besar virus dapat diinaktifkan pada suhu 56°C selama 30 menit atau 100°C selama beberapa detik karena terjadi proses denaturasi virus.

Misalnya Natrium hidroksida 2% (caustic soda) digunakan untuk desinfeksi virus Penyakit Mulut dan Kuku (PMK). oleh karena itu sangat efektif untuk membasmi virus. . ‡ Asam kuat dan basa kuat menyebabkan denaturasi protein virus. Perubahan pH ‡ Secara umum sebagian besar virus tetap hidup pada pH 5-9 akan tetapi virus akan cepat rusak atau inaktif pada pH yang terlalu asam atau terlalu basa.2.

. Berdasarkan panjang gelombangnya sinar ultraviolet dapat dikelompokkan menjadi: 3150-4000A. ‡ Sinar ultraviolet yang kurang dari 2800A. dan kurang dari 2800A. Radiasi Ultraviolet ‡ Sinar matahari langsung mematikan mikroorganisme karena mengandung sinar ultraviolet. 2800-3150A. mempunyai efek fermisidal (merusak mikroorganisme) dan dapat menyebabkan peradangan kulit (erythema) dan peradangan mata (conjunctivis).3.

yaitu formalin yang banyak digunakan untuk pembuatan vaksin inaktif. ‡ Hanya RNA yang dapat diinaktifkan dengan formalin . Formaldehid ‡ Larutan formaldehid.4.

Untuk meningkatkan daya penetrasi deterjen dapat dicampur dengan formalin atau glutaraldehid. kloloform. fosfolifase. dan bahan pelarut lemak lainnya. natrium deoksikolat. . 6. Deterjen Untuk melarutkan virus beramplop dan sebagai pembersih alat-alat laboratorium.5. Pelarut Lemak Virus-virus yang mengandung lemak pada amplopnya dapat diinaktifkan oleh : ether.

gluataraldehid.propiolakton. Disinfeksi permukaan : natrium hipoklorin.asam pirasetik.Metode dan bahan kimia yang berbeda digunakan untuk keperluan inaktivasi yaitu: A. B. C. Sterilisasi : Tekanan uap. . formaldehid. ethanol 70%.pemanasan kering. iodophore D. Produksi vaksin : formaldehid.oksidasi ethylene.irradiasi sinar g. Disinfeksi kulit : Klorheksidin.

Untuk menyimpan virus dalam waktu lama ( berbulan-bulan atau sampai bertahuntahun) digunakan temperatur -70 C (dalam freezer) atau -196 C (dalam tabung berisi nitrogen cair).CARA MENGAWETKAN VIRUS 1. keuntungan penyimpanan virus dalam suhu ini ialah dapat menghindari proses pembekuan dan pencairan (freeze thawing) suspensi virus yang dapat merusak partikel virus.Temperatur Kebanyakan virus tahan hidup selama beberapa hari dalam temperatur 4 C . .

2. c. bahan kimia yang dapat dipakai untuk mengurangi kerusakan virus adalah DMSO dengan konsentrasi 10% b. Pada konsentrasi 50% gliserol digunakan untuk mengawetkan virus pox dan sel epitel yang mengandung virus PMK. Jika virus disimpan pada temperatur -70 C. pada media penyimpanan virus ditambahkan pula serum sampai 10% untuk menjaga keutuhan sel. Bila virus tersebut Cell associated. disamping DMSO 10%. . Bahan Kimia a. Gliserol sebagai alkohol polihidrat dapat menstabilkan dinding sel dan partikel virus.

.3. Virus yang sudah kering beku dapat disimpan dalam temperatur 4 C selama berbulan-bulan. Metode ini digunakan dalam penyimpanan vaksi aktif. Proses Kering Beku Cara ini juga disebut liofilisasi dan merupakan yang terbaik dalam mengawetkan virus.