ISOLASI & PEMBIAKAN VIRUS

Oleh: Drh Maria Aega Gelolodo

Isolasi virus
Diagnosa klinis pengambilan spesimen

 Material Otopsi Respirasi : Paru-paru & Thrakea Sistem saraf: otak & sum2 tulang belakang Jantung : jantung Pantropik : ginjal, hati & limpa

 Feses : Rectal swab Darah Cairan tubuh: Cerebrospinal, pericard, peritoneum & synovial serta eksudat yang keluar dari mata, hidung maupun mulut (swab) Urine

PEMBIAKAN VIRUS
Virus merupakan mikroorganisme yang bersifat parasit obligat dan hanya bisa hidup pada media yang hidup. Berkaitan dengan sifatnya tersebut, virus hanya dapat dibiakan pada sel hidup. Pemilihan media yang digunakan tergantung dari jenis virusnya dan organ target dari virus tersebut.

Untuk menumbuhkan virus dalam rangka mengisolasi suatu virus dapat dilakukan secara : 1. in ovo yaitu metode menumbuhkan pada media telur berembrio (telur yang sudah dibuahi) 2. in vivo adalah metode menumbuhkan pada hewan percobaan sebagai model 3. in vitro yaitu menumbuhkan virus di dalam gelas- gelas atau tabung menggunakn media biakan jaringan (tissue culture) atau biakan sel (cell culture).

Virus Isolation: Telur Embrio Tunas (TET)

Telur berembrio telah lama dan paling sering digunakan sebagai media isolasi dan propagasi atau pembiakan virus.

 Telur berembrio atau sering disebut dengan telur embrio tertunas (TET) atau telur ayam berembrio (TAB) sangat penting dalam perkembangan virologi karena pada telur tertunas dapat ditemukan bermacam-macam tipe sel yang mampu ditumbuhi/menjadi media tumbuhnya berbagai jenis virus.

Macam-macam sel tersebut adalah : 1. Sel epitel khorion yang berada pada membran khorion 2. Sel epitel alantois yang merupakan sel penyusun pada membran khorioalantaois. 3. Sel epitel amnion yang melapisi ruang amnion 4. sel pada kantong kuning telur ( Yolk sac) dan sel endotel pada pembuluh darah 5. Sel dari embrionya itu sendiri yang umumnya adalah sel fibroblast.

Keberhasilan isolasi dan propagasi virus pada telur dipengaruhi oleh :  Rute inokulasi  Umur embrio pada telur  Temperatur/suhu inkubasi  Lamanya waktu inkubasi setelah inokulasi  Volume dan pengenceran inokulum yang digunakan  Status kekebalan flok dari induk tempat telur berasal

 Dalam membiakan virus menggunakan telur, sebaiknya digunakan telur yang berasal dari breeding flock yang bebas patogen tertentu (SPF/spesific pathogen free). Telur yang digunakan diinkubasikan pada suhu 37o-3 o Celcius dan kelembaban relatif 60-70%.

 Sebelum diinokulasi telur diperiksa dengan teropong (candling), pemeriksaan ini dilakukan untuk mengetahui apakah telur dalam kondisi normal, sesuai dengan umurnya atau ada kelainan. Kelainan yang terjadi misalnya tidak adanya kantung udara, infertile (tidak dibuahi), embrio lemah atau mati. Telur-telur yang tidak normal tidak bisa digunakan.

 Inokulasi virus kedalam telur dapat dilakukan dibeberapa tempat tergantung jenis virusnya, misalnya pada virus yang lebih menyukai sel epitel sebagai tempat berkembang biaknya dapat diinokulasikan pada membran khorioalantois. Rute inokulasi yang dapat dilakukan antara lain adalah kedalam ruang amnion (amnionic cavity), ruang alantois (allantoic cavity), membran khorio alantois, kantong kuning telur (yolk sac), intravena (pembuluh darah ) & kedalam otak embrio.

 Dalam menginokulasi virus ke telur selain rute, umur telur juga harus diperhatikan, sebab pada umur tertentu, pada daerah tertentu kondisinya optimal. Bila akan menginokulasi kedaerah ruang amnion , pembuluh darah (intra vena) dan kantong kuning telur sebaiknya digunakan telur yang berumur 5-7 hari karena pada umur tersebut embrio masih muda dan kecil sehingga kuning telur masih cukup besar ukurannya demikian juga ruang amnionnya.

 Untuk menginokulasi ke daerah ruang alantois dilakukan pada tekur yang berumur 9-12 hari karena pada saat itu luas ruang alantois yang optimal dan bila akan menginokulasi ke membran khorio alantois sebaiknya pada telur yang berumur 12-14 hari sebab pada umur tersebut mambran cukup kuat untuk ditarik dan dibuat kantung udara buatan. contoh pemanfaatan TET misanya untuk memperbanyak virus ND ataupun Pox.

Pembiakan virus pada kultur sel

Virus dapat diperbanyak dengan melakukan kultur sel yaitu menumbuhkan sel yang terinfeksi virus secara invitro. Why do we need Cell culture? Research
Reduce animal use

Commercial or large-scale production

Production of cell material: vaccine, antigen

Jenis sel asal hewan yang sering digunakan pada kultur sel
CELL LINE* 3T3 293 BHK21 MDCK HeLa PtK1 L6 PC12 SP2 COS CHO DT40 (chick) R1 E14.1 H1, H9 S2 BY2 CELL TYPE AND ORIGIN Fibroblast (mouse) Kidney epithelium (human) fibroblast (Syrian hamster) epithelial cell (dog) cancer epithelial cell (human) epithelial cell (rat kangaroo) myoblast (rat) chromaffin cell (rat) (neuroblastoma cell) plasma cell (mouse) kidney (monkey) ovary (chinese hamster) lymphoma cell for efficient targeted recombination embryonic stem cells (mouse) embryonic stem cells (mouse) embryonic stem cells (human) macrophage-like cells (Drosophila) undifferentiated meristematic cells (tobacco)

Pembiakan virus pada kultur sel

Kelebihan : Dapat memproduksi dalam jumlah banyak Semua jenis virus dapat dibiakan pada kultur sel( tergantung jenis selnya) Kekurangannya : Biaya lebih mahal Pengerjaan harus aseptis Perlu peralatan yang lebih kompleks dibanding pembiakan pada telur

Pembiakan virus pada hewan percobaan

Sudah jarang dilakukan terkait dengan kesejahteraan hewan Penelitian sudah demikian maju, sudah banyak jenis kultur sel yang dapat digunakan untuk menumbuhkan virus.

REAKSI VIRUS TERHADAP AGEN FISIK & KIMIA

1. Suhu dan Temperatur Sebagian besar virus sangat labil dan dapat hidup diluar tubuh induk semang. Di dalam laboratorium harus diusahakan agar suspensi virus dan jaringan tubuh yang mengandung virus secepatnya disimpan pada suhu -40C atau akan lebih bagus pada suhu 70C. Beberapa virus ada yang stabil pada temperatur kamar serta dapat hidup dalam waktu yang cukup lama. Misalnya virus Pox.

 Pengawetan virus yang terbaik adalah melalui proses pengeringan dalam keadaan beku, yang disebut dengan freeze drying. Kebanyakan virus dapat disimpan berbulanbulan bahkan bertahun-tahun pada ampul gelas hampa udara dalam nitrogen cair (196C) atau pada suhu -70C sampai -90C (untuk virus beramplop).

 Material penyakit yang mengandung virus harus ditempatkan dalam tabung tertutup kedap udara bila didinginkan dengan CO2 padat (es kering) untuk menghindari perusakan virus oleh gas CO2. Sejumlah virus dapat diinaktifkan oleh proses pembekuan pencairan (feezing-thawing). Sebagian besar virus dapat diinaktifkan pada suhu 56C selama 30 menit atau 100C selama beberapa detik karena terjadi proses denaturasi virus.

2. Perubahan pH Secara umum sebagian besar virus tetap hidup pada pH 5-9 akan tetapi virus akan cepat rusak atau inaktif pada pH yang terlalu asam atau terlalu basa. Asam kuat dan basa kuat menyebabkan denaturasi protein virus, oleh karena itu sangat efektif untuk membasmi virus. Misalnya Natrium hidroksida 2% (caustic soda) digunakan untuk desinfeksi virus Penyakit Mulut dan Kuku (PMK).

3. Radiasi Ultraviolet Sinar matahari langsung mematikan mikroorganisme karena mengandung sinar ultraviolet. Berdasarkan panjang gelombangnya sinar ultraviolet dapat dikelompokkan menjadi: 3150-4000A, 2800-3150A, dan kurang dari 2800A. Sinar ultraviolet yang kurang dari 2800A, mempunyai efek fermisidal (merusak mikroorganisme) dan dapat menyebabkan peradangan kulit (erythema) dan peradangan mata (conjunctivis).

4. Formaldehid Larutan formaldehid, yaitu formalin yang banyak digunakan untuk pembuatan vaksin inaktif. Hanya RNA yang dapat diinaktifkan dengan formalin

5. Pelarut Lemak Virus-virus yang mengandung lemak pada amplopnya dapat diinaktifkan oleh : ether, kloloform, natrium deoksikolat, fosfolifase, dan bahan pelarut lemak lainnya. 6. Deterjen Untuk melarutkan virus beramplop dan sebagai pembersih alat-alat laboratorium. Untuk meningkatkan daya penetrasi deterjen dapat dicampur dengan formalin atau glutaraldehid.

Metode dan bahan kimia yang berbeda digunakan untuk keperluan inaktivasi yaitu: A. Sterilisasi : Tekanan uap,pemanasan kering,oksidasi ethylene,irradiasi sinar g. B. Disinfeksi permukaan : natrium hipoklorin, gluataraldehid, formaldehid,asam pirasetik. C. Disinfeksi kulit : Klorheksidin, ethanol 70%, iodophore D. Produksi vaksin : formaldehid,propiolakton.

CARA MENGAWETKAN VIRUS

1.Temperatur Kebanyakan virus tahan hidup selama beberapa hari dalam temperatur 4 C . keuntungan penyimpanan virus dalam suhu ini ialah dapat menghindari proses pembekuan dan pencairan (freeze thawing) suspensi virus yang dapat merusak partikel virus. Untuk menyimpan virus dalam waktu lama ( berbulan-bulan atau sampai bertahuntahun) digunakan temperatur -70 C (dalam freezer) atau -196 C (dalam tabung berisi nitrogen cair).

2. Bahan Kimia a. Jika virus disimpan pada temperatur -70 C, bahan kimia yang dapat dipakai untuk mengurangi kerusakan virus adalah DMSO dengan konsentrasi 10% b. Bila virus tersebut Cell associated, disamping DMSO 10%, pada media penyimpanan virus ditambahkan pula serum sampai 10% untuk menjaga keutuhan sel. c. Gliserol sebagai alkohol polihidrat dapat menstabilkan dinding sel dan partikel virus. Pada konsentrasi 50% gliserol digunakan untuk mengawetkan virus pox dan sel epitel yang mengandung virus PMK.

3. Proses Kering Beku Cara ini juga disebut liofilisasi dan merupakan yang terbaik dalam mengawetkan virus. Virus yang sudah kering beku dapat disimpan dalam temperatur 4 C selama berbulan-bulan. Metode ini digunakan dalam penyimpanan vaksi aktif.