5 E. HASIL PENGAMATAN 1.

Isolasi DNA tomat Setelah diberi ethanol absolut dingin, larutan pada tabung reaksi terlihat membentuk tiga lapisan yang dapat dilihat pada gambar berikut :

Massa DNA buah Ethanol Sari buah

Hasil positif terlihat adanya 3 lapisan, yaitu lapisan pertama di dasar tabung reaksi berisi sari buah, lapisan tengah berisi etahanol dan lapisan ketiga berisi massa putih DNA buah. 2. Perbedaan hasil isolasi DNA dari bermacam-macam buah

(dari kiri ke kanan) belimbing, jambu biji, pisang, tomat, strawberry, dan jeruk

F. PEMBAHASAN Pada praktikum kali ini, praktikan mempelajari cara yang tepat untuk melihat DNA suatu organisme dengan mengisolasinya dari lokasi awalnya, yaitu di dalam nukleus. Dalam proses isolasi DNA, umumnya terdapat tiga tahapan yang harus dilakukan, yaitu : 1. Melisiskan/menghancurkan sel dengan cara mekanik maupun kimiawi, karena untuk mengekstraksi DNA, dinding sel(jika ada), membran sel, dan membran nukleus(pada eukariot) harus dihancurkan terlebih dahulu sehingga DNA dapat keluar dan terlihat massanya.

6 2. Purifikasi(pemurnian larutan). Ketika sel telah lisis, seluruh komponen sel akan bercampur satu sama lain. Sebagian besar proses manipulasi DNA mengharuskan agar DNA terpisah dan bebas dari protein dan RNA. Untuk proses ini, kemungkinan digunakan enzim pencerna protein, pemanasan, penambahan bahan kimia tertentu atau larutan organik seperti fenol untuk menonaktifkan enzim dan menghilangkan protein dari nukleus. 3. Presipitasi, yaitu pemisahan DNA dari larutan, dengan cara mencampurkannya dengan suatu bahan yang tidak dapat melarutkannya DNA, dalam hal ini alkohol dingin, sehingga DNA dapat memisah/terpresipitasi.

Berdasarkan teori pelaksanaan isolasi DNA tersebut, praktikan melakukan langkah-langkah sebagai berikut dalam praktikum ini: 1. Pemilihan bahan. Bahan yang digunakan dalam praktikum ini ialah irisan daging buah yang lunak seperti tomat (Lycopersicum esculentum), pemilihan buah dengan daging buah yang lunak tak lain ialah untuk mempermudah proses pelumatan, karena dalam praktikum ini kita tidak menggunakan blender sebagai alat untuk menghaluskan bahan dan hanya menggerusnya dengan bantuan mortal dan alu saja. 2. Penghalusan/pelumatan buah. Sel tumbuhan memiliki sistem proteksi berupa

dinding sel dan membran sel. Dinding sel tersusun dari polisakarida. Untuk mengisolasi DNA, maka hal pertama yang dilakukan adalah mendegradasi dinding sel yang merupakan struktur paling luar dari sel tumbuhan dengan cara menggerus bagian buah yang dijadikan sampel hingga lumat dan sehalus mungkin. Selain itu, penggerusan juga bertujuan untuk memisahkan sel yang satu dengan lainnya sehingga memberikan hasil yang lebih baik pada proses ekstraksi selanjutnya. 3. Penambahan garam.. Untuk mengekstraksi DNA, maka DNA yang terdapat di dalam nukleus perlu diuraikan dari protein-protein lain yang mengikatnya. Penambahan garam, khususnya dengan konsentrasi tinggi (> 1 M) dapat memisahkan nuclear protein (khususnya protein histon sehingga gulungan DNA dapat terurai dan terlihat sebagai gumpalan benang putih di permukaan larutan) dan juga memisahkan karbohidrat(polisakarida) yang terkandung dalam esktrak. Penambahan garam juga dapat membantu proses presipitasi DNA. Ion Na+ dari NaCl akan memasuki membran sel secara difusi dan memasuki nukleus melalui pori-pori nukleus. Ion Na+ pada garam dapat mengikat ion fosfat- pada DNA, sehingga molekul-molekul yang memiliki muatan yang sama(negatif) dan bersifat polar kini tidak lagi saling tolak menolak karena tidak lagi bermuatan (netral) atau nonpolar. Proses tersebut mempermudah

7 pemekatan dan pengumpulan massa DNA pada proses presipitasi DNA.(Weising et al., 2005: 90) 4. Penambahan larutan detergen. Kini DNA di dalam nukleus menjadi terurai. Namun, untuk dapat keluar dari sel, membran sel harus didegradasi terlebih dahulu. Membran sel tersusun atas fosfolipid, protein, glikogen, dan kolesterol. Komponen-komponen membran sel tersebut ada yang bersifat hidrofilik (glikoprotein, protein ekstrinsik, kepala fosfolipid) dan hidrofobik (kolesterol, sebagian protein intrinsik, ekor fosfolipid) (Kimball, 1983: 89). Oleh karena itulah diperlukan deterjen yang dapat mendegradasi membran sel melalui mekanisme khusus. Sisi hidrofilik pada deterjen akan mengikat sisi protein yang bersifat hidrofilik dan sisi hidrofobik detergen akan mengikat lipid dan sisi hidrofobik protein sehingga membentuk senyawa lipid proteindeterjen kompleks. Peristiwa inilah menyebabkan interaksi polar yang menyatukan membran sel, sehingga membran sel pun terdegradasi/lisis. 5. Penambahan aquades dan pengadukan. Untuk mempercepat proses penghancuran membran sel, maka setelah detergen dituang, perlu dilakukan homogenisasi antara gerusan buah dan larutan detergen. Oleh karena itu, campuran keduanya lalu ditambahkan aquades dan diaduk perlahan. Warna larutan pun berubah, yang tadinya orange kemerahan khas warna tomat menjadi hijau, tanda bahwa larutan telah homogen. 6. Penyaringan larutan. Setelah dihomogenkan, maka larutan harus disaring dengan mengunakan kertas saring. Fungsi proses filtrasi ini ialah untuk mengumpulkan larutan yang kaya akan DNA dan untuk memisahkannya dari sisa-sisa sel dan jaringan lainnya pada buah yang kemudian akan dibuang. Untuk mempermudah proses penyaringan, maka larutan terlebih dahulu didiamkan selama 12 menit agar molekul dengan massa terbesar dapat mengendap di dasar. 7. Penambahan ethanol absolute dingin. Setelah disaring, larutan tersebut dituang ke dalam tabung reaksi hingga tinggi tabung. Ethanol absolute dingin sejumlah 5 mL dituangkan secara perlahan melewati dinding tabung agar larutan yang berbagai komponennya mulai terpisah tidak menyatu kembali. Setelah beberapa saat, maka akan terlihat bahwa ethanol berada di atas lapisan atas, sementara filtrat berada di dasar, hal ini terjadi karena ethanol memiliki densitas(kerapatan) yang lebih kecil dibandingkan air. Kemudian, setelah diamati selama 15-30 menit, terlihat adanya kumpulan massa putih yang terletak di permukaan tabung reaksi. Kumpulan massa putih tersebut ialah DNA yang terpresipitasi dari filtrat. DNA dapat memisah dari larutan campuran (ethanol+filtrat) karena DNA tidak larut dalam ethanol.

8 DNA bersifat polar, karena adanya muatan negatif dari gugus rangka fosfatnya. Sifat polar ini, berdasarkan prinsip like dissolve like (sejenis terlarut dalam sejenis), membuat DNA larut dalam air yang juga memiliki sifat polar yang tinggi. Sifat polar air dibuktikan dengan tingginya nilai konstanta dielektriknya, yaitu 80,1(pada suhu 20C), yang berarti bahwa kekuatan listrik antara dua muatan dalam larutan yang mengandung air jauh berkurang jika dibandingkan dengan kekuatan yang terjadi di ruang hampa atau di udara. Daya listrik pada ikatan ion pada Kristal NaCl akan melemah saat terlarut dalam air, sehingga membiarkan ion Na+ yang dilindungi oleh pelindung hidrasi (hydration

shell)tersebar dalam air. Mekanisme yang sama terjadi antara muatan negatif fosfat DNA. Walaupun ion positif juga ada dalam larutan, kekuatan listrik yang relatif lemah mencegahnya untuk membentuk ikatan ion yang stabil dengan fosfat pada DNA dan memisahkannya dari larutan. Ethanol memiliki tingkat polar yang lebih rendah daripada air, konstanta dielektriknya adalah 24.3(pada suhu 25C). Artinya, penambahan ethanol pada larutan akan mengacaukan penyaringan muatan oleh air. Jika ethanol dalam jumlah memadai ditambahkan , maka daya tarik antara fosfat dan beberapa ion positif yang terlarut (contohnya ion Na+ dari NaCl yang telah ditambahkan sebelumnya) menjadi cukup kuat untuk membentuk ikatan ion yang stabil dan mempresipitasikan/ memisahkan DNA. Hal ini umumnya terjadi jika jumlah ethanol telah mencapai 64% dari volume larutan, dan mekanisme tersebut mengharuskan adanya ion positif yang terlarut. Biasanya Na +, NH4+, atau Li+ memegang peranan ini, namun karena sebelumnya praktikan telah menambahkan NaCl pada ekstrak buah, maka kemungkinan Na+ lah yang memegang peranan terbesar dalam proses ini. Suhu ethanol yang dingin berperan dalam mempermudah proses pemekatan DNA, semakin dingin suhu ethanol, maka DNA yang mengumpul dan terpresipitasi akan semakin banyak. Walau DNA yang terkumpul sangat banyak, kita tidak akan dapat melihat DNA dalam susunan double helix, walaupun dengan mikroskop elektronik sekalipun, karena susunan double helix DNA hanyalah gambaran mikrograf saja. Pada praktikum kali ini, tidak didapatkan DNA berupa benang-benang putih, melainkan hanya terlihat seperti massa putih yang terletak di permukaan tabung reaksi. Hal ini disebabkan karena tingkat kematangan buah tomat yang kurang dan kadar air buah tomat relatif yang tinggi. Kadar air dalam buah mempengaruhi waktu yang digunakan dalam presipitasi DNA. Semakin tinggi kadar air dalam buah, semakin lama pula waktu yang diperlukan dalam mempresipitasi DNA. Ini disebabkan karena buah yang memiliki kadar air yang banyak, memiliki sel-sel yang lebih sedikit dibanding dengan kadar air yang

9 dikandungnya. Buah yang memiliki kandungan air yang lebih sedikit memiliki jumlah sel yang lebih banyak sehingga DNA yang dihasilkan lebih banyak dan lebih cepat terlihat massanya di permukaan tabung. Selain itu, terjadi pula kesulitan melihat massa putih pada tabung reaksi, hal ini disebabkan penggunaan deterjen, dalam hal ini sunlight cair berwarna hijau, yang terlalu kental sehingga warna hijau menjadi sangat mendominansi. Dari perbedaan hasil isolasi DNA yang didapat pada buah-buahan yang berbeda, dapat diketahui bahwa perbedaan kelunakan, tingkat kemasakan, dan kadar air pada buah akan membuat hasil isolasi yang berbeda. Terdapat enam macam buah yang diisolasi DNAnya, antara lain belimbing, jambu biji, pisang, tomat, strawberry, dan jeruk. Buah belimbing paling sulit di ekstrak karena teksturnya yang kurang lunak dan juga belimbing memiliki kadar air yag relatif tinggi, sehingga sulit mendapatkan massa putih (DNA) pada praktikum ini. Sebaliknya pada buah pisang, teksturnya yang lunak memudahkan proses ekstraksi dan pisang memiliki kadar air yang relatif rendah, sehingga memudahkan proses isolasi DNA ini.

G. KESIMPULAN 1. Untuk mengisolasi DNA pada buah, diperlukan langkah-langkah sistematis, yaitu menghancurkan dinding sel dengan penggerusan bahan, melisiskan membran sel dan membran nukleus dengan pencampuran detergen, serta presipitasi DNA dengan penambahan ethanol absolut dingin dan bantuan ion Na+ dari NaCl (Kristal garam). 2. DNA akan terlihat sebagai massa (benang-benang) putih yang perlahan naik ke permukaan tabung. 3. Kelunakan daging buah, tingkat kemasakan, dan kadar air pada buah akan mempengaruhi hasil isolasi. Semakin keras, kurang masak, dan banyak kadar air maka semakin lama waktu yang dibutuhkan, dan jumlah DNA yang terpresipitasi semakin sedikit. 4. Kesulitan melihat massa putih pada tabung reaksi, disebabkan penggunaan deterjen, dalam hal ini sunlight cair berwarna hijau, yang terlalu kental sehingga warna hijau menjadi sangat mendominansi.

10 DAFTAR PUSTAKA

Campbell, et al.1999. Biologi. Jakarta : Penerbit Erlangga Frired, George. 2007. Schaums: Biologi. Jakarta : Penerbit Erlangga Kimball, John. 1983. Biologi. Jakarta: Penerbit Erlangga Queen-Baker, Jennie. 2004. Meischers Discovery A DNA Extraction Laboratory. USA: University of Maryland Biotechnology Institute. Weising, et al.2005. DNA fingerprinting in plants: principles, methods and applications. 2nd ed. Taylor and Francis Group Frey, Petra M. 2004. Easy isolation/extraction protocol for isolating tomato DNA. (Diperoleh dari http://ucbiotech.org/edu/edu_aids/TomatoDNA.html, Minggu, 18 Desember 2011; 20.00 WIB).