Kolom Dalam kromatografi lapis tipis, fase diam adalah lapisan tipis jel silika atau alumina pada

sebuah lempengan gelas, logam atau plastik. Kolom kromatografi berkerja berdasarkan skala yang lebih besar menggunakan material terpadatkan pada sebuah kolom gelas vertikal. Berbagai ukuran kolom kromatografi digunakan dan jika anda membuka link pada halaman Kimia Organik dari situs Universitas Colorado, anda akan menemukan foto dari bermacam-macam kolom. Dalam laboratorium sekolah, seringkali dengan mudah digunakan buret biasa sebagai kromatografi kolom.

Penggunaan kolom Anggaplah anda akan memisahkan campuran dari dua senyawa yang berwarna, yaitu kuning dan biru. Warna campuran yang tampak adalah hijau. Anda akan membuat larutan jenuh dari campuran dengan menggunakan pelarut yang lebih disukai dalam kolom. Pertama anda membuka kran penutup untuk membiarkan pelarut yang sudah berada dalam kolom mengering sehingga material terpadatkan rata pada bagian atas, dan kemudian tambahkan larutan secara hati-hati dari bagian atas kolom. Lalu buka kran kembali sehingga campuran berwarna akan diserap pada bagian atas material terpadatkan, sehingga akan tampak seperti gambar dibawah ini:

Selanjutnya tambahkan pelarut baru melalui bagian atas kolom, cegah sedapat mungkin jangan sampai merusak material terpadatkan dalam kolom. Lalu buka kran, supaya pelarut dapat mengalir melalui kolom, kumpulkan dalam satu gelas kimia atau labu dibawah kolom. Karena pelarut mengalir kontinyu, anda tetap tambahkan pelarut baru dari bagian atas kolom sehingga kolom tidak pernah kering.

Gambar berikut menunjukkan perubahan yang mungkin terjadi sejalan dengan perubahan waktu.

Penjelasan tentang apa yang terjadi

Ini mengasumsikan bahwa anda telah membaca penjelasan tentang apa yang terjadi pada kromatografi lapis tipis. Jika belum, ikuti link awal pada bagian atas halaman dan kembali pada bagian ini dan selanjutnya.

Senyawa biru lebih polar daripada senyawa kuning dan memungkinkan mempunyai kemampuan berikatan dengan hidrogen. Anda dapat mengatakan ini karena senyawa biru tidak bergerak secara sangat cepat melalui kolom. Itu berarti bahwa senyawa biru harus dijerap secara kuat pada jel silika atau alumina dibanding dengan senyawa kuning. Karena kurang polar, senyawa kuning menghabiskan waktu dalam pelarut, sehingga keluar dari kolom lebih cepat.

Proses pencucian senyawa melalui kolom menggunakan pelarut dikenal sebagai elusi. Pelarut disebut sebagai eluen.

Apakah anda hanya ingin mengumpulkan senyawa biru saja? Sudah waktunya untuk mencuci senyawa biru melalui kecepatan bergeraknya pada waktunya! Namun, tidak ada alasan mengapa anda tidak dapat mengganti pelarut selama elusi. Anggaplah anda menggantikan pelarut yang anda telah digunakan selama ini dengan pelarut yang lebih polar, setelah seluruh senyawa kuning selesai terkumpulkan. Ini akan mempunyai dua pengaruh, keduanya akan mempercepat senyawa biru melalui kolom.

Pelarut polar akan bersaing untuk mendapatkan ruang pada jel silika atau alumina dengan senyawa biru. Beberapa ruang untuk sementara dipergunakan oleh molekul-molekul pelarut pada permukaan fase diam, tidak menyediakan molekul-molekul biru untuk melekat dan ini akan cenderung menjaga pergerakannya dalam pelarut.

Akan ada atraksi yang lebih besar antara molekul-molekul pelarut polar dan molekul biru yang polar. Kecenderungan ini akan menarik molekul-molekul biru menempel pada fase diam kembali pada larutan.

Pengaruh total yaitu dengan bertambahnya kepolaran pelarut, senyawa biru akan menghabiskan waktu dalam larutan dan karenanya akan bergerak lebih cepat. Lalu mengapa tidak menggunakan alternatif ini dalam tempat pertama? Jawabannya adalah jika senyawa-senyawa dalam campuran bergerak secara sangat cepat melalui kolom dari awal, anda mungkin tidak akan mendapatkan pemisahan yang baik

Bagaimana jika campuran yang anda miliki tidak berwarna?

Jika anda akan menggunakan kromatografi kolom untuk memurnikan produk organik, mungkin produk yang anda harapkan akan menjadi produk yang tidak berwarna, meskipun satu atau lebih dari pengotor berwarna. Mari kita berasumsi kasus terburuk yaitu segala sesuatunya tidak berwarna. Bagaimana anda bisa mengetahui bahwa substansi yang anda diinginkan telah mencapai bagian bawah kolom? Ini bukan merupakan pekerjaan yang cepat dan mudah! Apa yang akan anda kumpulkan dan apa yang keluar dari bawah kolom dalam seluruh rangkaian pipa yang berlabel. Bagaimana besar setiap sampel akan jelas tergantung pada bagaimana besar kolom yaitu-anda mungkin mengumpulkan 1 cm3 atau 5 cm3 sampel atau apapun itu besarnya yang sesuai. Anda kemudian akan mengambil setetes dari setiap larutan dan membuatnya ke dalam kromatografi lapis tipis. Anda menempatkan tetesan pada garis dasar bersama dengan setetes senyawa murni dari senyawa yang sementara anda buat. Dengan mengulangi pekerjaan ini, anda dapat mengidentifikasi sampel yang mana yang dikumpulkan pada bawah kolom yang mengandung produk yang diinginkan dan hanya dibutuhkan. Sekali anda mengetahui prosedur ini, anda dapat menggabungkan seluruh sampel yang yang mengandung produk senyawa murni dan menghilangkan pelarutnya. (Bagaimana anda memisahkan pelarut dari produk, tidak langsung relevan dengan topik ini dan akan bervariasi dan tergantung pada sifat dasar senyawanya. Saya tidak akan menyamaratakannya.)
http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromatografi1/kromatografi_kolom/

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat.

Kromatrografi kolom menunjukkan adanya prinsip yang sama yang digunakan dalam kromatografi lapis tipis yang dapat diterapakan pada skala besar untuk pemisahan campuran. Kromatografi kolom seringkali digunakan untuk pemurnian seyawa di laboratorium. Berbagai ukuran kolom dapat digunakan, dimana hal utama yang dipertimbangkan adalah kapasitas yang memadai untuk menerima sampel sampel tanpa melalui fasa diamnya. Merupakan aturan praktis yang umum bahwa panjang kolom harus sekurang kurangnya 10 kali ukuran diameternya. Jika kita mempunyai kolom dengan panjang 20 cm, dan diameternya 1 atau 2 cm. Bahan pengemasnya suatu adsorben seperti alumina atau resin penukar ion, dimasukkan dalam bentuk suspensi kedalam porsi fasa bergerak dan dibiarkan diam didalam hamparan basah dengan sedikit cairan. Kolom untuk analisis farmasi umumnya digunakan kolom isi dan sebaiknya hanya isi kolom yang mempengaruhi gerak relative zat terlarut melalui system. Kolom terbuat dari kaca, kecuali jika dinyatakan lain. Kolom dengan beragam ukuran dapat digunakan, tetapi umumnya antara 0,6 m hingga 1,8 m serta diameter dalam 2 mm hingga 4 mm. sebagai fase cair dapat digunakan beraneka ragam senyawa kimia, seperti poly etilen glikol, ester dan amida berbobot molekul tinggi, hidro karbon, gom, dan cairan silicon. Kolom harus dikondisikan dengan jalan mengoperasikan sampai keadaan stabil pada suhu yang lebih tinggi dari suhu yang digunakan seperti yang tertera pada masing masing monografi. Suatu uji yang sesuai terhadap sifat inert penyangga, yang perlu untuk fase cair dengan polaritas yang rendah, ada kalanya suatu kolom dapat dikondisikan dengan menyuntikkan ulang senyawa yang dikromatografi. MANFAAT KROMATOGRAFI KOLOM DALAM DUNIA KEFARMASIAN Dalam bidang bioteknologi, kromatografi mempunyai peranan yang sangat besar. Misalnya dalam penentuan, baik kualitatif maupun kuantitatif, senyawa dalam protein. Protein sering dipilih karena ia sering menjadi obyek molekul yang harus di-purified (dimurnikan) terutama untuk keperluan dalam bio-farmasi. Kromatografi juga bisa diaplikasikan dalam pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan molekul penting lainnya. Dengan data-data yang didapatkan dengan menggunakan kromatografi ini, selanjutnya sebuah produk obat-obatan dapat ditingkatkan mutunya, dapat dipakai sebagai data awal untuk menghasilkan jenis obat baru, atau dapat pula dipakai untuk mengontrol kondisi obat tersebut sehingga bisa bertahan lama.

Dalam bidang clinical (klinik), teknik ini sangat bermanfaat terutama dalam menginvestigasi fluida badan seperti air liur. Dari air liur seorang pasien, dokter dapat mengetahui jenis penyakit yang sedang diderita pasien tersebut. Seorang perokok dapat diketahui apakah dia termasuk perokok berat atau ringan hanya dengan mengetahui konsentrasi CN- (sianida) dari sampel air liurnya. Demikian halnya air kencing, darah dan fluida badan lainnya bisa memberikan data yang akurat dan cepat sehingga keberadaan suatu penyakit dalam tubuh manusia dapat dideteksi secara dini dan cepat. Sekarang ini, deteksi senyawa oksalat dalam air kencing menjadi sangat penting terutama bagi pasien kidney stones (batu ginjal). Banyak metode analisis seperti spektrofotometri, manganometri, atau lainnya, akan tetapi semuanya membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang cukup lama untuk mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan teknik kromatografi. Dengan alasan-alasan inilah, kromatografi kemudian menjadi pilihan utama dalam membantu mengatasi permasalahan dalam dunia bioteknologi, farmasi, klinik dan kehidupan manusia secara umum. http://wiro-pharmacy.blogspot.com/2009/10/kuliah-kromatografi-kolom-bagian-1.html
Walaupun agak tidak terlalu jelas, kontribusi kromatografi pada perkembangan kimia modern tidak dapat dipandang rendah. Tanpa teknik kromatografi, sintesis senyawa murni (atau hampir murni) akan sangat sukar , dan dalam banyak kasus, hampir tidak mungkin. Di awal abad ke-20, kimiawan Rusia Mikhail Semnovich Tsvet (1872-1919) menyiapkan kolom yang diisi dengan serbuk kalsium karbonat, dan kedalamnya dituangkan campuran pigmen tanaman yang dilarutkan dalam eter. Secara mengejutkan, pigmen memisahkan dan membentuk lapisan berwarna di sepanjang kolom. Ia menamakan kromatografi pada teknik pemisahan baru ini (1906). Kemudian kimiawan dari Swiss Richard Martin Willsttter (1872-1942) menerapkan teknik ini untuk risetnya yakni khlorofil untuk menunjukkan manfaat teknik ini, dan sejak itu banyak perhatian diberikan pada kromatografi. Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan campuran menjadi komponennya dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-masing komponen. Alat yang digunakan terdiri atas kolom yang di dalamnya diisikan fasa stasioner (padatan atau cairan). Campuran ditambahkan ke kolom dari ujung satu dan campuran akan bergerak dengan bantuan pengemban yang cocok (fasa mobil). Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom, yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fasa mobil dan fasa diam (stationer).

Komponen utama kromatografi adalah fasa stationer dan fasa mobil dan kromatografi dibagi menjadi beberapa jenis bergantung pada jenis fasa mobil dan mekanisme pemisahannya, seperti ditunjukkan di Tabel 12.1 Tabel 12.1 Klasifikasi kromatografi

Kriteria

Nama
Kromatografi cair, kromatografi gas

Fasa mobil Mekanisme

Kromatografi adsorpsi, kromatografi partisi

Kromatografi pertukaran ion kromatografi gel

Kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis, Fasa stationer kromatografi kertas

Beberapa contoh kromatografi yang sering digunakan di laboratorium diberikan di bawah ini.

a. Kromatografi partisi
Prinsip kromatografi partisi dapat dijelaskan dengan hukum partisi yang dapat diterapkan pada sistem multikomponen yang dibahas di bagian sebelumnya. Dalam kromatografi partisi, ekstraksi terjadi berulang dalam satu kali proses. Dalam percobaan, zat terlarut didistribusikan antara fasa stationer dan fasa mobil. Fasa stationer dalam banyak kasus pelarut diadsorbsi pada adsorben dan fasa mobil adalah molekul pelarut yang mengisi ruang antar partikel yang ter adsorbsi. Contoh khas kromatografi partisi adalah kromatografi kolom yang digunakan luas karena merupakan sangat efisien untuk pemisahan senyawa organik (Gambar 12.3). Kolomnya (tabung gela) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau pati yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sammpel diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom. Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa mobil) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa stationer). Selama perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut. Akhirnya, zat terlarut akan terpisahkan membentuk beberapa lapisan. Akhirnya, masing-masing lapisan dielusi dengan pelarut yang cocok untuk memberikan spesimen murninya. Nilai R didefinisikan untuk tiap zat etralrut dengan persamaan berikut.

R = (jarak yang ditempuh zat terlarut) / (jarak yang ditempuh pelarut/fasa mobil).

Kromatografi pertamakali dikenalkan oleh Michael Tswest yaitu seorang botani dari Rusia. Dia berhasil mencoba memisahkan klorofil dan pigmen pigmen lain dalam ekstrak tumbuhan dengan menggunakan serbuk kalsium karbonat yang diisikan ke dalam kolom kaca dan petroleum eter sebagai pelarut. Proses pemisahan itu diawali dengan menempatkan larutan cuplikan pada permukaan atas kalsium karbonat, kemudian dialirkan pelarut petroleum eter. Hasilnya berupa pita pita berwarna yang terlihat sepanjang kolom sebagai hasil pemisahan komponen komponen dalam ekstrak tumbuhan. Dari pita pita berwarna tersebut muncul istilah kromatografi, dari kata choram dan graphein. Menurut bahasa yunani kedua kata itu berarti warna dan menulis. Pengertian kromatografi adalah metode pemisahan yang didasarkan atas distribusi diferensial komponen sampel diantara dua fasa. Menurut pengertian ini kromatigrafi selalu melibatkan dua fasa yaitu fasa diam (stationary phase) dan fasa gerak (mobile phase). Fasa diam dapat berupa padatan atau cairan yang terikat pada permukaan padatan (kertas atau suatu adsorben). Sedangkan fasa gerak dapat berupa cairan yang disebut eluen atau pelarut atau gas pembawa yang inert. Gerakan fasa gerak ini mengakibatkan terjadinya migras diferensial komponen komponen dalam sampel. Kecendrungan dalam proses kromatografi yaitu.

Kecendrungan molekul molekul komponen untuk melarut dalam cairan.

Kecendrungan molekul molekul komponen untuk melekat pada permukaan padatan halus (adsobsi = penyerapan) Kecendrungan molekul molekul komponen untuk bereaksi secara kimia ( penukaran Ion)

Komponen yang dipisahkan harus larut dalam fasa gerak dan harus mempunyai kemampuan untuk berinteraksi dengan fasa diam dengan cara melarut di dalamnya, teradsobsi atau bereaksi secara kimia (penukar ion). Pemisahan terjadi berdasarkan perbedaan migrasi zat zat yang menyusun sampel. Hasil pemisahan ini dapat digunakan untuk keperluan identifikasi (analisis kuantitatif), penetapan kadar (analisis kuantitatif) serta pemurniaan suatu senyawa (preparatif). PRAKTIKUM ANALISIS KROMATOGRAFI KOLOM

Judul : Analisis yang telah dilakukan adalah analisis kromatografi kolom yaitu memisahkan klorofil yang ada dalam daun suji. Tujuan : Analisis ini dilakukan dengan tujuan memisahkan suatu komponen yang terdapat dalam daun suji yaitu klorofil. Prinsip Percobaan : Analisis kromatografi kolom dilakukan untuk pemisahan, pemurnian komponen dalam suatu campuran . Dalam analisis kromatografi kolom ini menggunakan metode basah yaitu dengan cara adsorben yang digunakan terlebih dahulu di buat bubur kolom. Teori Dasar : Kromatografi kolom umumnya digunakan sebagi teknik pemurnian untuk mengisolasi komponen yang diinginkan dai sutu campuran. Dalam kromatografi kolom, fase diam (adsorben padat) ditempatkan secara vertikal dalam kolom gelas dan fase gerak 9cairan) ditempatkan pada bagian atas kolom dan begerak ke bawah melewati kolom (karena gravitasi atau tekanan eksternal). Sampel yang akan dianalisis dimsukkan ke bagian atas kolom. Eluen ditambahkan ke dalam kolom dan bergerak ke bawah melewtikolom. Keseimbangan terjadi antara komponen yang teradsopsi pda adorben dengan pelarut yang terelusi mengalir melewati kolom. Klasifikasi Kromatografi Kolom 1. Berdasarkan interaksi komponen dengan adsorben

a.

Kromatografi adsorbsi

Dalam kromatografi adsorbsi, komponen yang dipisahkan secara selektif teradsorbsi pada permukaan adsorben yang dipakai untuk bahan isian kolom. b. Kromatografi partisi

Dalm kromtografi partisi, komponen yang dipisahkan secara selektif mengalami partisi antara lapisan cairan tipis pada penyangga padat yang bertindak sebagai fase diam dn eluen yang bertindak sebagai fase gerak. c. Komatografi petukaran ion

Kromatografi petukran ion memishkan komponen yang berbentuk ion. Komponen-komponen tersebut yang terikat pda penukar ion sebagai fase diam secara selektif akan terlepas/terelusi oleh fase gerak. d. Komatogrfi filtrasi gel

Dalam kromatografi filtrasi gel, kolom diisi dengan gel yang permeabel sebagai fase diam. Pemisahan berlangsung seperti proses pengayakan yang didasarkan atas ukuran molekul dari komponen yang dipisahkan. 2. Berdasarkan gatya yang bekerja pada kolom

Kromatografi kolom kategori ini tergantung pada bagaimana eluen bergerak melewati kolom, terdiri dari kromatografi kolom gravitasi dan kromatografi kolom tekanan. a. Kromatografi kolom gravitasi

Dalm komatografi kolom gravitasi, eluen bergerak berdasarkan gaya gravitasi atau perkolasi. b. Adsorben Dalam kromatografi kolom tekanan, eluen bergerak karena adanya pemberian tekanan pada kolom. Tekanan yang diberikan tidak terlalu rendah dan tidak terlalu tinggi. Silika gel (SiO2) dan alumina (Al2O3) adalah 2 adsorben yang paling umum disunakan untuk kromatografi kolom. Jika ukuran mesh lebih besar, maka ukuran silika tersebut lebih kecil. Ukuran partikel dari adsorben sngat berpengaruh pada bagaiman eluen bergerak melewati kolom. Partikel yang lebih kecil (mesh lebih besar) digunakan untuk kromatografi kolom tekanan sedangkan adsorben dengan ukuran partikel yang lebih besar digunakan untuk komatografi kolom gravitasi. Kromatografi kolom tekanan

Alumina lebih sering digunakan dalam komtografin kolom dibanding kromtografi lapis tipis. Daya adsorbsi alumina dapat diatur dengan mengatur jumlah air yang dikandung. CAranya ialah dengan mengeringkan alumina pada suhu 360OC selma 5 jam, kemudian membiarkan alumina kering tersebut menyerap air sampai jumlah tertentu. Aktivitasnya tergantung dri kadar irnya dan dinyatakan dalam skala Brockman. Pelarut Pelarut mempunyai peranan yang penting dalam mengelusi sampel yang dapat menentukan keberhasilan pemisahan secaa kromatografi kolom. Pelarut yang mampu menjalankan elusi terlalu cepat tidak akan mampu mengadakan pemisahan yang sempurna. Sebaliknya elusi yang terlalu lambat akan menyebabkan waktu retensi yang terlalu lama. Sistem pelarut dengan kepolaran yang bertingkat sering juga digunakan adalah pelarut mengelusi kolom. Dalm hal ini pelarut yang pertama kali digunakan adalah pelarut non polar untuk mengelusi komponen yang kurang polar. Pelarut yang lebih polah ditambahkan untuk mengelusi komponen yang lebih polar juga. Teknik Pengoperasian dalam Kromatografi Kolom Peralatan a. Wadah eluen (fase gerak). Untuk peralatan komersil dilengkapi dengan pengatur tekanan. b. Kolom Biasanya terbuat dari gelas yang berfungsi sebagai penunjang fase diam. Pada bagian dasar dari kolom mempuny bentuk sedemikian rupa agar fase diam dapat tetap dalam keadaan statis. Terdapat glass woll atau kapas, atau bahan dari pasir kuarsa yang dikemas dengan kolom. c. Wadah penampung Eluat dari kolom ditampung dalam bentuk fraksi-fraksi. Pada dasarnya penampung dapat dilakukan secara manual, namun jik total volume dari eluat besar dengan setiap fraksi yang diinginkan dalam volume kecil, maka diperlukan suatu alat penampung tertentu. Untuk hal ini biasanya digunakan suatu alat penampun otomatis yng dikenal sebagai kolektor. Prosedur Untuk Kromatografi Kolom Gravitasi a. Pengemasan Kolom Pemngemasan kolom adalah salah satu faktor penting untuk untuk mempeoleh hasil pemisahan yang baik. Ada 2 cra pengemasan kolom (packing0 dalm komtografi kolom gravitasi yaitu :

1. Metode basah Adsorben dicampur dengan pelarut, kemudian campuran dimasukkan ke dalam kolom. Keuntungan dari metode ini adalah gelembung udara dapat dihilangkan dari kolom. Contoh pengerjaan : kolom diisi dengan pelarut non polar seperti hekasana kira-kira setengah dai tinggi kolom gels. Ditimbang sebnyak 8 gram alumina dalam gelas piala sementara erlenmeyer 125 diisi 15 ml heksana. Dengan perlahan serbuk alumina ditambahkan sedikit demi sedikit sambil diaduk. Gunakan pipet pasteu untuk membut bubur, kemudian dengan cepat bubur tersebut dipipet dan dimasukkan ke dalm kolom. Tempatkan erlenmeyer di bawh kolom kemudian buka screw clamp dan biarkan pelarut mengalir. Teruskan penambahan bubur alumina sampai habis, jangan lupa penambahan pelarut heksana terus dilakukan dan pelarut heksan yang keluar dapat ditampung dan digunakan kembali untuk packing/menambah lagi alumina ke dalam kolom. Jika packing sudah selesai, screw clamp ditutup, tinggi cairan minimal sma dengan tinggi alumina. Kadang-kadang pasir juga ditmbahkan pda puncak kolom untuk mencegah dari gangguan saat pelaut baru ditambahkan. 2. Metode kering Metode ini lebih mudah tapi dapat menimbulkan adanya gelembung udara dalam kolom. Gelembung udara ini harus dihindari, karena akan mengurangi resolusi dari pemisahan. Contoh pengerjaan : Bagian dasar dari kolom diisi dengan glass woll secukupnya. Pinch clamp ditutup dan kolom diisi dengan pelrut. Masukkan 8 gram alumina ke dalam kolom gelas yang berisi pelarut dan biarkan pelarut mengalir. Pinch clamp ditutup jika packing sudah selesai dan tinggi pelarut minimal sama dengn tinggi alumina. Demikian juga hindai agar kolom tidak kering. Pebandingan antara volume total kolom (cair+padat) dengan diameter kolom yang optimal agar dipeoleh pemisahan yang baik, sulit dinyatakan secara tepat dan ini dilakukan secara coba-coba secara sistematis. Secara umum, hanya dapat dinyatakan bahwa kemasan kolom yang panjang akan memberikan tingkat pemishan yang tinggi dan kolom yang lebar adalah baik untuk memisahkan komponen-komponen dalam jumlah besar. Jenis fase diam yang digunakan adalah silika gel dan alumina. b. Aplikasi sampel dan Proses Elusi Sebelum sampel dimasukkan ke dalam kolom, pelarut dikeluarkan sedemikian rupa hingga cairan di atas fase diam hmpir kering. Smpel dimasukkan pada bagian atas dari fase diam dengan bantuan pipet tetes. Sejumlah kecil pengelusi (fase gerak) digunakan untuk mencuci sissa sampel dalam wdah sampel dan selnjutnya dimsukkan ke dalam kolom.

Setelah sampel dimasukkan, biasanya ditambah lagi eluen sedemikian rupa hingga ketinggian fase gerak di atas fase diam 5-10 cm. Selanjutnya, hubungkan dengan wadah fase gerak (proses elusi dilakukan) dan alirkan pengelusi sedemikin rupa sehingg ketinggian cairan di atas fse diam dipertahankan. Proses elusi dilakukan sampai komponen yang diinginkan keluar dari kolom. c. Pengumpulan Fraksi Pengumpulan fraksi dapat dilakukan secara manual dengan menggunakan tabung reaksi yang sebekumnya diberi tanda sesuai dengan volume yang diinginkan atau pada waktu tertentu yang ditetapkan sebelumnya. Pengumpulan ini dapat juga dilakukan secara otomatis dengan bantuan kolektor fraksi. Jika tidak ada prosedur tentang jumlah tiap fraksi yang harus dikumpulakn maka biasanya diambil pendekatan yakni 2-5% dari volume total (cair+padat). d. Deteksi Komponen Deteksi komponen dapat dilakukan dengan teknik analisis seperti cara-cara spektoskopi, KLT, dsb. Prosedur Untuk Kromatografi Kolom Tekanan Skala Mikro Kromatografi kolom tekanan skala mikro meupakan metode yang paling seing digunakan dalam laboratorium kimia organik karena mudah dilakukan dn ramah lingkungan. Pemisahan terbaik jika jumlah sampel berkisar 25 mg. a. Pengemasan kolom Kolom dikemas dengan metode kering. Bagian bawah pipet pasteur disumbat dengan kapas secukupnya. Tambahkan silika gel kering 230-400 mesh. b. Pra elusi kolom Untuk digunakan pelarut non polar sepeti hekasana. Heksana ditambahkan pada bagian atas kolom (silika gel). Pelarut akan bergerak dengan perlahan, proses pra elusi dpat dipercepat dengan bantuan bulb pipet untuk mendorong pelarut melewati silika gel. Ketika batas pelarut sudh mencapai batas bawh dari kolom, proses elusi selesai dan kolom siap digunakan. c. Aplikasi sampel

1. Metode basah Sampel dilarutkan dalam sejumlah kecil pelarut sepeti heksana, aseton dan sebagainya. Larutan ini kemudioan dimasukkan ke dalam kolom. 2. Metode kering Sampel dilarutkan salam sejumlah kecil pelaut dan tambahkan 100 mg silika gel. Tunggu sampai pelarut menguap sehingga yang tertinggal hanya serbuk kering. Masukkan sampel ke dalam kolom

dengan bantuan kertas. Tambahkan pelarut segar ke dalam kolom dan proses elusi pun siap dimulai. d. Elusi kolom Proses elusi untuk kromatografi kolom tekanan berskala mikro dilakukan dengan cara menekan bulb yang ada di ujung pipet pasteur sehingga pelarut akan bergerak melewati kolom. Jangan biarkan fase diam sampai mengering. Jika kita ingin memisahkan campuran yang mengandung lebih dari satu komponen maka kita harus mengubah kepolaran dari sistem pelarut yang digunakan sebelumnya. e. Analisis fraksi Jika fraksi yang diperoleh berwarna, kita dapat menggabungkan fraksi berdasarkan kesaman warna tapi jika fraksinya tidak berwarna, penggabunagn fraksi dapat dilakukan bedasrkan hasil KLT. Alat yang digunakan : 1. Wadah Kolom 2. Glass woll 3. Gelas Ukur 10 ml 4. Corong Bahan/Pereaksi : a. N-Heksan

b. Aseton c. Sample Klorofil Cara Kerja : 1. Pelarutan klorofil Sample klorofil Sample klorofil dilarutkan dalam 2 ml n-heksan dan 1 ml aseton. 2. Pembuatan bubur kolom Silika gel dimasukan ke dalam beaker glass, kemudian ditambahkan 7:3 N-Heksan dan aseton sampai basah. 3. Memasukan bubur kolom ke dalam pipet Setelah dibuat bubur kolom, maka pipet diisi dengan glass woll, kemudian dimasukan n-heksan dan aseton, kemudian bubur yang telah basah, dimasukan ke dalam wadah kolom, sampai wadah kolom tersebut padat oleh kolom, setelah padat, maka atasnya diberi glass woll kembali, cerat dibuka sampai silika gell semua basah.

4. Memasukan sample ke dalam kolom kromatografi Sample yang telah dilarutkan, kemudian dimasukkan ke dalam kromatografi kolom. Amatilah sampai terbentuknya cincin. Data Pengamatan : Tidak ada cincin yang terbentuk. Pembahasan : Setelah dilakukan praktikum analisis kromatografi dengan cara basah ini, setelah diamati hasil yang didapatkan tidak terbentuk cincin, hal ini dapat dipengaruhi karena bubur kolom yang masukan ke dalam kolom, tidak padat, sehingga dapat menambah rongga udara dalam kolom tersebut, maka cincin tidak akan terbentuk karena terhalang oleh uadara yang ada dalam kolom. Kesimpulan : Jadi setelah melakukan praktikum analisis kromatografi kolom dengan metode basah, hasil yang didapatkan tidak terbentuk cincin pada kolom kromatografi.