THE SCIENCE OF CRYONICS

HOW Cryoprotectants Work

Hidup adalah proses kimia kompleks yang terjadi dalam air. Tanpa air cair, ada kehidupan, atau paling tidak ada proses kehidupan. Krioprotektan adalah bahan kimia yang melindungi makhluk hidup dari yang terluka oleh pembekuan air selama paparan dingin. Bagaimana krioprotektan bekerja adalah misteri bagi kebanyakan orang. Bahkan, bagaimana mereka pekerjaan bahkan menjadi misteri bagi ilmu sampai hanya beberapa dekade lalu. Artikel ini akan menjelaskan secara dasar hal bagaimana krioprotektan melindungi sel-sel dari kerusakan yang disebabkan oleh kristal es, dan beberapa kemajuan yang telah dibuat dalam desain solusi krioprotektan.
Bagaimana Pembekuan melukai Sel Air mengembang ketika membeku, tetapi sebaliknya dengan kepercayaan populer itu bukan perluasan air yang menyebabkan cedera. Ini adalah pemurnian air selama pembekuan yang menyebabkan cedera. Air membeku sebagai zat murni yang mengecualikan segalanya. Proses inilah pengecualian yang menyebabkan cedera. Alih-alih sisa pelarut yang memungkinkan molekul hidup untuk secara bebas campuran di dalamnya, air yang membeku mengumpulkan sendiri menjadi kristal mendorong segala sesuatu yang lain keluar. Ini diilustrasikan dalam Gambar 1. Pembekuan penyebab kerusakan oleh dua berbeda mekanisme. Yang pertama adalah kerusakan mekanis sebagai bentuk sel terdistorsi oleh kristal es. Yang kedua adalah kerusakan yang disebabkan oleh bahan kimia dan efek osmotik terkonsentrasi zat terlarut dalam air beku sisa

antara kristal es. Hal ini disebut "solusi efek "cedera. Bagaimana Melindungi krioprotektan sel Krioprotektan adalah bahan kimia yang larut dalam air dan menurunkan titik leleh air. Untuk aplikasi luar Cryobiology, bahan kimia seperti kadang-kadang disebut "Antibeku." Contoh umum adalah gliserol, etilen glikol, propilen glikol, dan dimetilsulfoksida (DMSO).... Sebuah konsentrasi krioprotektan dari sekitar 5% sampai 15% biasanya semua yang diperlukan untuk memungkinkan kelangsungan hidup sebagian besar dari terisolasi sel setelah pembekuan dan pencairan dari suhu nitrogen cair. Gambar 2 menunjukkan konsep penting dari cryoprotection selama sel beku. Compacts es pertumbuhan sel ke dalam kantong kecil dan lebih kecil dari dicairkan cair karena suhu diturunkan. Itu kehadiran krioprotektan yang membuat lebih besar kantong pada temperatur tertentu dari mereka akan jika krioprotektan tidak hadir. Kantong dicairkan lebih besar untuk mengurangi sel-sel kerusakan dari kedua bentuk cedera pembekuan, mekanis kerusakan dari es dan berlebihan konsentrasi garam. Sifat krioprotektan. Tidak semua bahan kimia yang larut dalam air krioprotektan. Selain menjadi air larut, krioprotektan yang baik adalah efektif menekan titik leleh air, jangan endapan atau bentuk eutectics atau hidrat, dan relatif tidak beracun untuk sel pada konsentrasi tinggi. Semua krioprotektan membentuk hidrogen obligasi dengan air. Sejak penemuan gliserol sebagai krioprotektan pertama lebih dari 50 tahun yang lalu (1), sekitar 100 senyawa telah secara eksplisit diidentifikasi dan dipelajari

sebagai digunakan secara rutin dalam Cryobiology (2).Yang terbaik dan paling umum digunakan krioprotektanadalah kelas krioprotektan disebut krioprotektan penetrasi. tembus krioprotektan adalah molekul kecil yang mudah menembus membran sel. molekul massa krioprotektan adalah penetrasi biasanya kurang dari 100 dalton. dengan memasukkan dan tertinggal di dalam sel, penetrasi krioprotektan mencegah dehidrasi yang berlebihan sel selama proses pembekuan.
Vitrifikasi sebagai Alternatif untuk Pembekuan Jaringan terorganisir lebih rusak oleh pembekuan dari sel terisolasi. Tidak seperti suspensi sel terputus, jaringan tidak memiliki ruang untuk es untuk tumbuh, dan tidak dapat dengan mudah menyita dirinya menjadi kantong dicairkan antara kristal es. Organ sangat rentan terhadap cedera pembekuan. Untuk organ untuk melanjutkan fungsi setelah pembekuan, semua beragam sel jenis organ, dari parenkim sel ke sel-sel pembuluh darah terkecil, harus bertahan hidup dalam jumlah besar. 25% tingkat ketahanan hidup sering terlihat pada pembekuan sel adalah tidak cukup baik. Untuk kriopreservasi organ, pendekatan yang berbeda diperlukan.

Pada tahun 1984 cryobiologist Gregory Fahy diusulkan vitrifikasi sebagai pendekatan untuk kriopreservasi (3). Vitrifikasi, yang berarti "Mengubah ke dalam gelas," sebelumnya dikenal di Cryobiology sebagai sebuah proses yang terjadi ketika air didinginkan terlalu cepat untuk membentuk kristal es. Hal itu juga diyakini proses dengan mana sel-sel selamat di saku dicairkan dari terkonsentrasi krioprotektan antara kristal es pada suhu yang sangat rendah. Fahy diusulkan cara untuk mengubah seluruh volume jaringan atau organ menjadi setara dengan dicairkan kaca saku krioprotektan terkonsentrasi. Untuk mencapai vitrifikasi, diusulkan bahwa jaringan atau organ dimuat dengan begitu banyak krioprotektan sebelum pendinginan yang bisa menghindari pembentukan es selama seluruh pendinginan proses. Jika pendinginan cepat, ini bisa dilakukan dengan konsentrasi sebenarnya kurang krioprotektan dari sel-sel yang terkena selama akhir tahap pembekuan konvensional. Itu Konsep ini diilustrasikan pada Gambar 3. Dengan menghindari distorsi mekanis yang disebabkan oleh es batu dan garam memungkinkan dan molekul lainnyauntuk tetap tak terganggu di lokasi alami mereka, vitrifikasi menghindari kerusakan besarmekanisme pembekuan. Harga yang dibayarkan adalahkerusakan dari toksisitas krioprotektan. krioprotektan Toksisitas Dalam kriopreservasi dengan pembekuan atau vitrifikasi, lebih dari setengah air di dalam sel pada akhirnya digantikan oleh molekul krioprotektan.Cryoprotection dapat dianggap sebagai proses penggantian molekul air denganlain molekul yang tidak dapat membekukan. ketika salah satumempertimbangkan peran penting yang bermain di airmempertahankan bentuk yang tepat dan bentuk proteindan molekul lain dari kehidupan, itu adalah menakjubkan bahwa hal ini dapat selamat.
Toksisitas krioprotektan diberikan di dekat-pembekuan suhu adalah berbeda jenis toksisitas dari toksisitas mengalami oleh makhluk hidup pada suhu hangat. Misalnya, untuk seseorang di bawah kondisi biasa, propilen glikol tidak beracun, sedangkan etilena glikol dimetabolisme menjadi racun. Namun pada konsentrasi tinggi dekat 0 C, etilena glikol kurang beracun ke sel-sel dari

propilen glikol. Aturan biasa tidak berlaku. Baru aturan yang berkaitan dengan bagaimana kehidupan merespon ketika sejumlah besar air yang diganti pada rendah suhu masih harus ditemukan. Mekanisme toksisitas krioprotektan masih kurang dipahami (4,5), tetapi beberapa generalisasi empiris dapat dibuat. Lipofilisitas (afinitas untuk lemak dan minyak) sangat berkorelasi dengan toksisitas. Molekul dengan afinitas untuk lemak dapat melakukan partisi ke dalam membran sel, mendestabilisasi mereka. Ini juga telah baru ini menemukan bahwa hidrogen yang kuat ikatan berkorelasi dengan toksisitas, possibily oleh mengganggu shell hidrasi sekitar makromolekul. Hal ini menyebabkan hasil yang tak terduga bahwa krioprotektan dengan kelompok kutub yang berinteraksi lemah dengan air terbaik untuk vitrifikasi, bahkan jika konsentrasi yang lebih tinggi adalah diperlukan untuk mencapai vitrifikasi (6). para listrik properti dari solusi krioprotektan juga telah berhubungan dengan toksisitas membran (7). Beberapa krioprotektan, seperti gliserol dan mungkin DMSO, juga dikenal memiliki merugikan reaksi dengan biokimia spesifik target. Akhirnya, pengurangan saling toksisitas, terutama seperti yang terlihat dalam DMSO / formamida kombinasi, telah sangat berguna dalam vitrifikasi solusi pembangunan, meskipun mekanisme pengurangan toksisitas masih tidak diketahui (5). Komponen kriopreservasi solusi Lebih dari sekedar krioprotektan harus ditambahkan ke sel dan jaringan untuk melindungi terhadap pembekuan cedera. Sebuah kriopreservasi solusi, yang dapat berupa pembekuan larutan atau vitrifikasi solusi, terdiri dari: pembawa Solusi pembawa solusi terdiri dari solusi bahan yang tidak eksplisit krioprotektan. Peran operator solusinya adalah dengan memberikan dasar dukungan untuk sel pada suhu mendekati titik beku. Ini berisi garam, osmotik agen, pH buffer, dan kadangkadang nutrisi bahan atau apoptosis inhibitor. Bahan biasanya hadir pada konsentrasi isotonik dekat (300 miliosmol) sehingga sel tidak menyusut atau membengkak saat dipegang dalam larutan pembawa. pembawa solusi kadangkadang disebut "dasar perfusi." The solusi pembawa biasanya digunakan dengan M22 krioprotektan solusi disebut LM5. Berbagai konsentrasi krioprotektan mungkin diperlukan pada berbagai tahap krioprotektan pengenalan dan penghapusan, tetapi konsentrasi bahan pembawa solusi selalu tetap konstan. Ini komposisi konstan- persyaratan dapat dianggap sebagai definisi solusi pembawa. Sebagai praktis materi, ini berarti bahwa kriopreservasi solusi harus dilakukan dengan cara lain dari menambahkan krioprotektan ke kurir pra-dibuat solusi karena selain naif akan mencairkan bahan pembawa. menembus krioprotektan Krioprotektan Penetrating kecil mampu melintasi membran sel molekul. Itu peran krioprotektan penetrasi adalah untuk mengurangi pertumbuhan es dan mengurangi dehidrasi sel selama pembekuan. Dalam vitrifikasi, peran krioprotektan penetrasi adalah untuk benar-benar mencegah pembentukan es. Seperti terlihat pada Gambar 4, krioprotektan penetrasi adalah mayoritas bahan solusi vitrifikasi.

Non-penetrasi krioprotektan(bahan opsional) Non-penetrasi krioprotektan adalah molekul besar, biasanya polimer, ditambahkan ke krioprotektan solusi. Mereka menghambat es pertumbuhan dengan mekanisme yang sama dengan penetrasi krioprotektan, tetapi tidak masuk sel. Polietilen glikol (PEG) dan polivinilpirolidon (PVP) adalah contoh. Non-penetrasi krioprotektan biasanya kurang beracun dari krioprotektan penetrasi di konsentrasi yang sama. Mereka mengurangi jumlah krioprotektan penetrasi diperlukan dengan meniru luar sel yang cryoprotective efek protein dalam sel. Itu juga telah baru-baru ini menemukan bahwa menggunakan non-penetrasi krioprotektan untuk meningkatkan yang tonisitas (konsentrasi osmotik aktif) solusi vitrifikasi dapat mencegah jenis cedera disebut cedera mengerikan. Es Blockers (bahan opsional) Blocker es adalah senyawa yang secara langsung memblokir pertumbuhan es dengan mengikat selektif dengan es atau mengikat kontaminan yang memicu pembentukan es (nucleators es). Biasa krioprotektan bertindak dengan berinteraksi dengan air. Blocker Es pujian krioprotektan konvensional dengan berinteraksi

dengan es atau permukaan yang menyerupai es. Blocker es seperti obat dalam jumlah itu hanya kecil diperlukan untuk menemukan dan mengikat target mereka. Molekul rendah berat polivinil alkohol dan poligliserol, yang disebut X-1000 dan Z-1000, dan biologis protein antibeku adalah contoh dari es blocker (8,9). Blocker Es hanya digunakan dalam solusi vitrifikasi, bukan pembekuan solusi (Lihat Gambar 5). Bagaimana krioprotektan yang Digunakan Pembekuan larutan yang mengandung relatif rendah konsentrasi krioprotektan mendekati 10% biasanya ditambahkan dalam satu langkah. Ini menyebabkan respon shrink- membengkak klasik Cryobiology di mana sel pertama menyusut osmosis dalam menanggapi konsentrasi zat terlarut tinggi luar sel, dan kemudian membengkak sebagai krioprotektan menembus masuk ke dalam sel. Dalam beberapa menit, atau puluhan menit untuk potongan jaringan tipis, krioprotektan konsentrasi di dalam dan di luar sel menyetarakan, dan sel kembali ke volume yang didefinisikan oleh yang tonisitas larutan pembawa. Sel-sel atau jaringan sekarang siap untuk pembekuan. Untuk kriopreservasi dengan pembekuan, pendinginan dilakukan perlahanlahan, biasanya kurang dari 1 C per menit. Hal ini memungkinkan waktu untuk air meninggalkan sel sebagai pembekuan berlangsung sehingga krioprotektan yang konsentrasi di dalam sel bersama-sama naik dengan konsentrasi di luar sel. Ini mencegah interior sel dari titik beku. Pembekuan juga dapat kadang-kadang berhasil meskipun konsentrasi
krioprotektan masih rendah jika pembekuan dan pencairan dilakukan sangat cepat sehingga tidak ada cukup waktu untuk es tumbuh di dalam sel. Vitrifikasi solusi yang mengandung krioprotektan konsentrasi dekat atau melebihi 50% tidak dapat ditambahkan dalam satu langkah karena respon menyusut awal osmotik akan terlalu ekstrim. Sebaliknya, bahan untuk akan vitrifikasi adalah berturut-turut terkena beberapa solusi yang mengandung meningkat secara eksponensial konsentrasi krioprotektan, seperti 1/8 x, 1/4 x, 1/2 x, 1 x konsentrasi penuh vitrifikasi solusi, biasanya selama 20 menit setiap langkah. Selain ini dilakukan pada suhu dekat 0 C untuk meminimalkan toksisitas. Itu bahan ini kemudian siap

untuk vitrifikasi. Untuk kriopreservasi oleh vitrifikasi, pendinginan dan rewarming dilakukan secepat mungkin. Tidak seperti suspensi sel atau jaringan kecil potong, organ terlalu besar untuk menyerap krioprotektan dengan hanya berendam di eksternal solusi. Untuk krioprotektan organ kriopreservasi, konsentrasi terus menerus.

Cryprotectants adalah dihapus dengan membalik langkah-langkah yang dijelaskan di atas, kecuali bahwa penghapusan semua solusi kecuali untuk yang terakhir mengandung beberapa ratus milimol dari osmotik penyangga, seperti manitol. Peran penyangga osmotik adalah untuk mengurangi luasnya awal membengkak respon sel sebagai mereka terkena menurun eksternal krioprotektan konsentrasi. Pertimbangan Khusus untuk Organ Waktu yang dibutuhkan untuk memperkenalkan dan menghilangkan krioprotektan dari organ
yang lebih lama dibandingkan sel. Untuk solusi vitrifikasi kali perfusi, jam yang khas. Hal ini karena krioprotektan harus bergerak melalui ruang-ruang kecil antara sel-sel yang melapisi bagian dalam pembuluh darah, endotelium kapiler. Hal ini membuat sel dari endotelium kapiler di antara mereka yang paling rentan terhadap toksisitas krioprotektan karena mereka terkena konsentrasi tertinggi dari krioprotektan untuk waktu yang lama sementara menunggu sel lain dalam organ untuk mengejar ketinggalan. Otak memiliki kesulitan tambahan dalam bahwa ruang antara endotel kapiler sel sangat kecil. Ini adalah apa yang disebut darah otak penghalang, atau BBB. BBB menyebabkan penetrasi krioprotektan meninggalkan darah pembuluh bahkan lebih lambat dari organ lain, dan tidak mengizinkan larut dalam air molekul lebih besar dari 500 dalton untuk meninggalkan sama sekali. Oleh karena itu non-penetrasi krioprotektan tidak melewati sebuah BBB utuh. Namun ini tidak berarti bahwa nonpenetrating agen tidak berpengaruh pada otak jaringan. Gerakan osmotik air di BBB ditentukan oleh seluruh krioprotektan solusi komposisi. Air bergerak untuk menyamakan titik leleh solusi, atau "aktivitas air," di kedua sisi BBB. Ini berarti bahwa setiap bahan yang menurunkan titik leleh solusi krioprotektan juga meningkatkan ketahanan jaringan luar formasi untuk es BBB dengan menggambar keluar air dan meningkatkan konsentrasi zat terlarut secara alami hadir dalam otak. Itu otak adalah organ yang menembus cryprotectants dan dehidrasi tampaknya bertindak bersamaan untuk menyediakan cryoprotection. Enam Generasi Vitrifikasi Solusi Solusi Vitrifikasi telah berkembang sangat sejak usulan awal vitrifikasi yang modern oleh Fahy pada awal tahun 1980. Kemajuan ini dapat dipandang sebagai terjadi dalam enam generasi lompatan (10). Generasi tiga sampai enam adalah dikembangkan di Century Kedokteran ke-21, Inc Generasi 1 : Solusi paling sederhana adalah vitrifikasi krioprotektan tunggal dalam larutan pembawa. Generasi 2 : Ditemukan bahwa total yang lebih tinggi krioprotektan konsentrasi dengan toksisitas yang dapat diterima dapat dicapai dengan menggabungkan

dengan DMSO amida seperti asetamida atau formamida, dan kemudian menambahkan propilen glikol. kombinasi tersebut DMSO, formamida, dan propilena glikol adalah dasar dari VS41A (juga disebut VS55) vitrifikasi solusi, yang paling canggih vitrifikasi solusi dari pertengahan tahun 1990. generasi 3 : Sebuah terobosan terjadi dengan Fahy penemuan yang bahwa toksisitas krioprotektan berkorelasi dengan jumlah molekul air per krioprotektan kutub kelompok di konsentrasi kritis diperlukan untuk vitrifikasi, apa yang disebut qv * (6). Hal ini menyebabkan penggantian propylene glikol di VS41A dengan etilen glikol, menghasilkan larutan vitrifikasi Veg. generasi 4 : Penggunaan polimer dalam larutan vitrifikasi diizinkan lebih lanjut penurunan toksisitas oleh mengurangi konsentrasi krioprotektan penetrasi diperlukan untuk mencapai vitrifikasi. generasi 5 : Penggunaan polimer es memblokir diizinkan lebih jauh penurunan toksisitas oleh mengurangi konsentrasi krioprotektan semua diperlukan untuk mencapai vitrifikasi. VM3 adalah vitrifikasi solusi generasi kelima (6). generasi 6 : Ditemukan bahwa cedera mengerikan, sebuah kurang dipahami dengan kecelakaan yang disebabkan oleh hanya lewat melalui beberapa sub-nol suhu rentang, dapat diatasi dengan meningkatkan tonisitas dari non-penetrasi komponen vitrifikasi solusi (11). M22, krioprotektan yang saat ini digunakan oleh Alcor, adalah generasi keenam solusi. Vitrifikasi sukses kini telah menunjukkan untuk katup jantung (12), pembuluh darah jaringan (13), tulang rawan (14), kornea (15), dan tikus ovarium (16, 17). kemajuan terus untuk ginjal kelinci, dengan pemulihan dari organ menunjukkan setelah pendinginan hingga di bawah - 40 C sementara cryoprotected dengan vitrifikasi sebuah solusi (11), dan satu melaporkan instance dari jangka panjang kelangsungan hidup setelah vitrifikasi (18). Vitrifikasi juga menunjukkan utilitas untuk layak pelestarian irisan jaringan yang beragam, termasuk otak irisan (19), dan pelestarian histologis dari sistem yang lebih besar (20). Masa Depan generasi krioprotektan solusi harus mengatasi banyak masalah yang masih beredar, termasuk molekul mekanisme kegagalan kriopreservasi (21), dan khususnya toksisitas krioprotektan. Krioprotektan toksisitas yang muncul sebagai akhir perbatasan Cryobiology. Masa depan terbesar terobosan dalam Cryobiology dapat berasal dari lebih baik pemahaman dan mitigasi krioprotektan toksisitas.