THE SCIENCE OF CRYONICS

HOW Cryoprotectants Work
Hidup adalah proses kimia kompleks yang terjadi dalam air. Tanpa air cair, ada kehidupan, atau paling tidak ada proses kehidupan. Krioprotektan adalah bahan kimia yang melindungi makhluk hidup dari yang terluka oleh pembekuan air selama paparan dingin. Bagaimana krioprotektan bekerja adalah misteri bagi kebanyakan orang. Bahkan, bagaimana mereka pekerjaan bahkan menjadi misteri bagi ilmu sampai hanya beberapa dekade lalu. Artikel ini akan menjelaskan secara dasar hal bagaimana krioprotektan melindungi sel-sel dari kerusakan yang disebabkan oleh kristal es, dan beberapa kemajuan yang telah dibuat dalam desain solusi krioprotektan.
Bagaimana Pembekuan melukai Sel Air mengembang ketika membeku, tetapi sebaliknya dengan kepercayaan populer itu bukan perluasan air yang menyebabkan cedera. Ini adalah pemurnian air selama pembekuan yang menyebabkan cedera. Air membeku sebagai zat murni yang mengecualikan segalanya. Proses inilah pengecualian yang menyebabkan cedera. Alih-alih sisa pelarut yang memungkinkan molekul hidup untuk secara bebas campuran di dalamnya, air yang membeku mengumpulkan sendiri menjadi kristal mendorong segala sesuatu yang lain keluar. Ini diilustrasikan dalam Gambar 1. Pembekuan penyebab kerusakan oleh dua berbeda mekanisme. Yang pertama adalah kerusakan mekanis sebagai bentuk sel terdistorsi oleh kristal es. Yang kedua adalah kerusakan yang disebabkan oleh bahan kimia dan efek osmotik terkonsentrasi zat terlarut dalam air beku sisa

antara kristal es. Hal ini disebut "solusi efek "cedera. Bagaimana Melindungi krioprotektan sel Krioprotektan adalah bahan kimia yang larut dalam air dan menurunkan titik leleh air. Untuk aplikasi luar Cryobiology, bahan kimia seperti kadang-kadang disebut "Antibeku." Contoh umum adalah gliserol, etilen glikol, propilen glikol, dan dimetilsulfoksida (DMSO).... Sebuah konsentrasi krioprotektan dari sekitar 5% sampai 15% biasanya semua yang diperlukan untuk memungkinkan kelangsungan hidup sebagian besar dari terisolasi sel setelah pembekuan dan pencairan dari suhu nitrogen cair. Gambar 2 menunjukkan konsep penting dari cryoprotection selama sel beku. Compacts es pertumbuhan sel ke dalam kantong kecil dan lebih kecil dari dicairkan cair karena suhu diturunkan. Itu kehadiran krioprotektan yang membuat lebih besar kantong pada temperatur tertentu dari mereka akan jika krioprotektan tidak hadir. Kantong dicairkan lebih besar untuk mengurangi sel-sel kerusakan dari kedua bentuk cedera pembekuan, mekanis kerusakan dari es dan berlebihan konsentrasi garam. Sifat krioprotektan. Tidak semua bahan kimia yang larut dalam air krioprotektan. Selain menjadi air larut, krioprotektan yang baik adalah efektif menekan titik leleh air, jangan endapan atau bentuk eutectics atau hidrat, dan relatif tidak beracun untuk sel pada konsentrasi tinggi. Semua krioprotektan membentuk hidrogen obligasi dengan air. Sejak penemuan gliserol sebagai krioprotektan pertama lebih dari 50 tahun yang lalu (1), sekitar 100 senyawa telah secara eksplisit diidentifikasi dan dipelajari

Yang terbaik dan paling umum digunakan krioprotektanadalah kelas krioprotektan disebut krioprotektan penetrasi. ketika salah satumempertimbangkan peran penting yang bermain di airmempertahankan bentuk yang tepat dan bentuk proteindan molekul lain dari kehidupan. molekul massa krioprotektan adalah penetrasi biasanya kurang dari 100 dalton. semua beragam sel jenis organ. Tidak seperti suspensi sel terputus. Untuk kriopreservasi organ. Fahy diusulkan cara untuk mengubah seluruh volume jaringan atau organ menjadi setara dengan dicairkan kaca saku krioprotektan terkonsentrasi." sebelumnya dikenal di Cryobiology sebagai sebuah proses yang terjadi ketika air didinginkan terlalu cepat untuk membentuk kristal es. diusulkan bahwa jaringan atau organ dimuat dengan begitu banyak krioprotektan sebelum pendinginan yang bisa menghindari pembentukan es selama seluruh pendinginan proses. etilena glikol kurang beracun ke sel-sel dari .Cryoprotection dapat dianggap sebagai proses penggantian molekul air denganlain molekul yang tidak dapat membekukan. propilen glikol tidak beracun. lebih dari setengah air di dalam sel pada akhirnya digantikan oleh molekul krioprotektan. Vitrifikasi. Dengan menghindari distorsi mekanis yang disebabkan oleh es batu dan garam memungkinkan dan molekul lainnyauntuk tetap tak terganggu di lokasi alami mereka. sedangkan etilena glikol dimetabolisme menjadi racun. Namun pada konsentrasi tinggi dekat 0 º C. jaringan tidak memiliki ruang untuk es untuk tumbuh. dengan memasukkan dan tertinggal di dalam sel. Harga yang dibayarkan adalahkerusakan dari toksisitas krioprotektan. Toksisitas krioprotektan diberikan di dekat-pembekuan suhu adalah berbeda jenis toksisitas dari toksisitas mengalami oleh makhluk hidup pada suhu hangat. ini bisa dilakukan dengan konsentrasi sebenarnya kurang krioprotektan dari sel-sel yang terkena selama akhir tahap pembekuan konvensional. Jika pendinginan cepat. Hal itu juga diyakini proses dengan mana sel-sel selamat di saku dicairkan dari terkonsentrasi krioprotektan antara kristal es pada suhu yang sangat rendah. pendekatan yang berbeda diperlukan. dan tidak dapat dengan mudah menyita dirinya menjadi kantong dicairkan antara kristal es. Untuk organ untuk melanjutkan fungsi setelah pembekuan. Misalnya.sebagai digunakan secara rutin dalam Cryobiology (2). tembus krioprotektan adalah molekul kecil yang mudah menembus membran sel. vitrifikasi menghindari kerusakan besarmekanisme pembekuan. Itu Konsep ini diilustrasikan pada Gambar 3. Untuk mencapai vitrifikasi. harus bertahan hidup dalam jumlah besar. penetrasi krioprotektan mencegah dehidrasi yang berlebihan sel selama proses pembekuan. krioprotektan Toksisitas Dalam kriopreservasi dengan pembekuan atau vitrifikasi. yang berarti "Mengubah ke dalam gelas. dari parenkim sel ke sel-sel pembuluh darah terkecil. Organ sangat rentan terhadap cedera pembekuan. untuk seseorang di bawah kondisi biasa. Vitrifikasi sebagai Alternatif untuk Pembekuan Jaringan terorganisir lebih rusak oleh pembekuan dari sel terisolasi. Pada tahun 1984 cryobiologist Gregory Fahy diusulkan vitrifikasi sebagai pendekatan untuk kriopreservasi (3). itu adalah menakjubkan bahwa hal ini dapat selamat. 25% tingkat ketahanan hidup sering terlihat pada pembekuan sel adalah tidak cukup baik.

Berbagai konsentrasi krioprotektan mungkin diperlukan pada berbagai tahap krioprotektan pengenalan dan penghapusan. Sebagai praktis materi." The solusi pembawa biasanya digunakan dengan M22 krioprotektan solusi disebut LM5. tetapi beberapa generalisasi empiris dapat dibuat. Ini juga telah baru ini menemukan bahwa hidrogen yang kuat ikatan berkorelasi dengan toksisitas. pH buffer. Dalam vitrifikasi. para listrik properti dari solusi krioprotektan juga telah berhubungan dengan toksisitas membran (7). yang dapat berupa pembekuan larutan atau vitrifikasi solusi. Aturan biasa tidak berlaku. . telah sangat berguna dalam vitrifikasi solusi pembangunan. Ini komposisi konstan. meskipun mekanisme pengurangan toksisitas masih tidak diketahui (5). dan kadangkadang nutrisi bahan atau apoptosis inhibitor. ini berarti bahwa kriopreservasi solusi harus dilakukan dengan cara lain dari menambahkan krioprotektan ke kurir pra-dibuat solusi karena selain naif akan mencairkan bahan pembawa. bahkan jika konsentrasi yang lebih tinggi adalah diperlukan untuk mencapai vitrifikasi (6).persyaratan dapat dianggap sebagai definisi solusi pembawa. terdiri dari: pembawa Solusi pembawa solusi terdiri dari solusi bahan yang tidak eksplisit krioprotektan. tetapi konsentrasi bahan pembawa solusi selalu tetap konstan. Peran operator solusinya adalah dengan memberikan dasar dukungan untuk sel pada suhu mendekati titik beku. Beberapa krioprotektan. seperti gliserol dan mungkin DMSO. juga dikenal memiliki merugikan reaksi dengan biokimia spesifik target. krioprotektan penetrasi adalah mayoritas bahan solusi vitrifikasi. Komponen kriopreservasi solusi Lebih dari sekedar krioprotektan harus ditambahkan ke sel dan jaringan untuk melindungi terhadap pembekuan cedera. terutama seperti yang terlihat dalam DMSO / formamida kombinasi. pengurangan saling toksisitas. Ini berisi garam. peran krioprotektan penetrasi adalah untuk benar-benar mencegah pembentukan es. pembawa solusi kadangkadang disebut "dasar perfusi. osmotik agen. Itu peran krioprotektan penetrasi adalah untuk mengurangi pertumbuhan es dan mengurangi dehidrasi sel selama pembekuan.propilen glikol. Sebuah kriopreservasi solusi. menembus krioprotektan Krioprotektan Penetrating kecil mampu melintasi membran sel molekul. Lipofilisitas (afinitas untuk lemak dan minyak) sangat berkorelasi dengan toksisitas. Baru aturan yang berkaitan dengan bagaimana kehidupan merespon ketika sejumlah besar air yang diganti pada rendah suhu masih harus ditemukan. Akhirnya.5). Mekanisme toksisitas krioprotektan masih kurang dipahami (4. Seperti terlihat pada Gambar 4. mendestabilisasi mereka. possibily oleh mengganggu shell hidrasi sekitar makromolekul. Hal ini menyebabkan hasil yang tak terduga bahwa krioprotektan dengan kelompok kutub yang berinteraksi lemah dengan air terbaik untuk vitrifikasi. Bahan biasanya hadir pada konsentrasi isotonik dekat (300 miliosmol) sehingga sel tidak menyusut atau membengkak saat dipegang dalam larutan pembawa. Molekul dengan afinitas untuk lemak dapat melakukan partisi ke dalam membran sel.

Mereka mengurangi jumlah krioprotektan penetrasi diperlukan dengan meniru luar sel yang cryoprotective efek protein dalam sel. yang disebut X-1000 dan Z-1000. Ini mencegah interior sel dari titik beku. Non-penetrasi krioprotektan biasanya kurang beracun dari krioprotektan penetrasi di konsentrasi yang sama. biasanya selama 20 menit setiap langkah. dan kemudian membengkak sebagai krioprotektan menembus masuk ke dalam sel. Sel-sel atau jaringan sekarang siap untuk pembekuan. bahan untuk akan vitrifikasi adalah berturut-turut terkena beberapa solusi yang mengandung meningkat secara eksponensial konsentrasi krioprotektan. seperti 1/8 x. Hal ini memungkinkan waktu untuk air meninggalkan sel sebagai pembekuan berlangsung sehingga krioprotektan yang konsentrasi di dalam sel bersama-sama naik dengan konsentrasi di luar sel. Sebaliknya. tetapi tidak masuk sel. biasanya kurang dari 1 º C per menit. Ini menyebabkan respon shrink. Itu juga telah baru-baru ini menemukan bahwa menggunakan non-penetrasi krioprotektan untuk meningkatkan yang tonisitas (konsentrasi osmotik aktif) solusi vitrifikasi dapat mencegah jenis cedera disebut cedera mengerikan. dan biologis protein antibeku adalah contoh dari es blocker (8. Untuk kriopreservasi dengan pembekuan. Es Blockers (bahan opsional) Blocker es adalah senyawa yang secara langsung memblokir pertumbuhan es dengan mengikat selektif dengan es atau mengikat kontaminan yang memicu pembentukan es (nucleators es). Pembekuan juga dapat kadang-kadang berhasil meskipun konsentrasi krioprotektan masih rendah jika pembekuan dan pencairan dilakukan sangat cepat sehingga tidak ada cukup waktu untuk es tumbuh di dalam sel. Itu bahan ini kemudian siap . Dalam beberapa menit. Mereka menghambat es pertumbuhan dengan mekanisme yang sama dengan penetrasi krioprotektan. Vitrifikasi solusi yang mengandung krioprotektan konsentrasi dekat atau melebihi 50% tidak dapat ditambahkan dalam satu langkah karena respon menyusut awal osmotik akan terlalu ekstrim. Selain ini dilakukan pada suhu dekat 0 º C untuk meminimalkan toksisitas.9). 1/2 x. Blocker es seperti obat dalam jumlah itu hanya kecil diperlukan untuk menemukan dan mengikat target mereka. Bagaimana krioprotektan yang Digunakan Pembekuan larutan yang mengandung relatif rendah konsentrasi krioprotektan mendekati 10% biasanya ditambahkan dalam satu langkah. 1 x konsentrasi penuh vitrifikasi solusi. atau puluhan menit untuk potongan jaringan tipis. Blocker Es pujian krioprotektan konvensional dengan berinteraksi dengan es atau permukaan yang menyerupai es. Molekul rendah berat polivinil alkohol dan poligliserol. dan sel kembali ke volume yang didefinisikan oleh yang tonisitas larutan pembawa. bukan pembekuan solusi (Lihat Gambar 5). Polietilen glikol (PEG) dan polivinilpirolidon (PVP) adalah contoh. pendinginan dilakukan perlahanlahan. biasanya polimer. ditambahkan ke krioprotektan solusi. 1/4 x. Biasa krioprotektan bertindak dengan berinteraksi dengan air. Blocker Es hanya digunakan dalam solusi vitrifikasi.membengkak klasik Cryobiology di mana sel pertama menyusut osmosis dalam menanggapi konsentrasi zat terlarut tinggi luar sel. krioprotektan konsentrasi di dalam dan di luar sel menyetarakan.Non-penetrasi krioprotektan(bahan opsional) Non-penetrasi krioprotektan adalah molekul besar.

" di kedua sisi BBB. Hal ini karena krioprotektan harus bergerak melalui ruang-ruang kecil antara sel-sel yang melapisi bagian dalam pembuluh darah. Peran penyangga osmotik adalah untuk mengurangi luasnya awal membengkak respon sel sebagai mereka terkena menurun eksternal krioprotektan konsentrasi. Pertimbangan Khusus untuk Organ Waktu yang dibutuhkan untuk memperkenalkan dan menghilangkan krioprotektan dari organ yang lebih lama dibandingkan sel. Enam Generasi Vitrifikasi Solusi Solusi Vitrifikasi telah berkembang sangat sejak usulan awal vitrifikasi yang modern oleh Fahy pada awal tahun 1980. Cryprotectants adalah dihapus dengan membalik langkah-langkah yang dijelaskan di atas.untuk vitrifikasi. Untuk solusi vitrifikasi kali perfusi. atau "aktivitas air. endotelium kapiler. Namun ini tidak berarti bahwa nonpenetrating agen tidak berpengaruh pada otak jaringan. Generasi 2 : Ditemukan bahwa total yang lebih tinggi krioprotektan konsentrasi dengan toksisitas yang dapat diterima dapat dicapai dengan menggabungkan . dan tidak mengizinkan larut dalam air molekul lebih besar dari 500 dalton untuk meninggalkan sama sekali. pendinginan dan rewarming dilakukan secepat mungkin. BBB menyebabkan penetrasi krioprotektan meninggalkan darah pembuluh bahkan lebih lambat dari organ lain. Itu otak adalah organ yang menembus cryprotectants dan dehidrasi tampaknya bertindak bersamaan untuk menyediakan cryoprotection. atau BBB. Otak memiliki kesulitan tambahan dalam bahwa ruang antara endotel kapiler sel sangat kecil. Kemajuan ini dapat dipandang sebagai terjadi dalam enam generasi lompatan (10). Ini berarti bahwa setiap bahan yang menurunkan titik leleh solusi krioprotektan juga meningkatkan ketahanan jaringan luar formasi untuk es BBB dengan menggambar keluar air dan meningkatkan konsentrasi zat terlarut secara alami hadir dalam otak. Hal ini membuat sel dari endotelium kapiler di antara mereka yang paling rentan terhadap toksisitas krioprotektan karena mereka terkena konsentrasi tertinggi dari krioprotektan untuk waktu yang lama sementara menunggu sel lain dalam organ untuk mengejar ketinggalan. Ini adalah apa yang disebut darah otak penghalang. konsentrasi terus menerus. Oleh karena itu non-penetrasi krioprotektan tidak melewati sebuah BBB utuh. Tidak seperti suspensi sel atau jaringan kecil potong. kecuali bahwa penghapusan semua solusi kecuali untuk yang terakhir mengandung beberapa ratus milimol dari osmotik penyangga. seperti manitol. Untuk kriopreservasi oleh vitrifikasi. Untuk krioprotektan organ kriopreservasi. Gerakan osmotik air di BBB ditentukan oleh seluruh krioprotektan solusi komposisi. organ terlalu besar untuk menyerap krioprotektan dengan hanya berendam di eksternal solusi. Air bergerak untuk menyamakan titik leleh solusi. jam yang khas. Generasi tiga sampai enam adalah dikembangkan di Century Kedokteran ke-21. Inc Generasi 1 : Solusi paling sederhana adalah vitrifikasi krioprotektan tunggal dalam larutan pembawa.

tulang rawan (14). apa yang disebut qv * (6). VM3 adalah vitrifikasi solusi generasi kelima (6). adalah generasi keenam solusi. 17). generasi 6 : Ditemukan bahwa cedera mengerikan. termasuk otak irisan (19). termasuk molekul mekanisme kegagalan kriopreservasi (21). dan tikus ovarium (16. Vitrifikasi juga menunjukkan utilitas untuk layak pelestarian irisan jaringan yang beragam. Krioprotektan toksisitas yang muncul sebagai akhir perbatasan Cryobiology. dan satu melaporkan instance dari jangka panjang kelangsungan hidup setelah vitrifikasi (18). Hal ini menyebabkan penggantian propylene glikol di VS41A dengan etilen glikol. dan propilena glikol adalah dasar dari VS41A (juga disebut VS55) vitrifikasi solusi.40 º C sementara cryoprotected dengan vitrifikasi sebuah solusi (11). generasi 3 : Sebuah terobosan terjadi dengan Fahy penemuan yang bahwa toksisitas krioprotektan berkorelasi dengan jumlah molekul air per krioprotektan kutub kelompok di konsentrasi kritis diperlukan untuk vitrifikasi. Masa depan terbesar terobosan dalam Cryobiology dapat berasal dari lebih baik pemahaman dan mitigasi krioprotektan toksisitas. formamida. generasi 4 : Penggunaan polimer dalam larutan vitrifikasi diizinkan lebih lanjut penurunan toksisitas oleh mengurangi konsentrasi krioprotektan penetrasi diperlukan untuk mencapai vitrifikasi. dan khususnya toksisitas krioprotektan. Masa Depan generasi krioprotektan solusi harus mengatasi banyak masalah yang masih beredar. dan pelestarian histologis dari sistem yang lebih besar (20). menghasilkan larutan vitrifikasi Veg. dan kemudian menambahkan propilen glikol. dapat diatasi dengan meningkatkan tonisitas dari non-penetrasi komponen vitrifikasi solusi (11). yang paling canggih vitrifikasi solusi dari pertengahan tahun 1990. krioprotektan yang saat ini digunakan oleh Alcor. Vitrifikasi sukses kini telah menunjukkan untuk katup jantung (12). . M22. sebuah kurang dipahami dengan kecelakaan yang disebabkan oleh hanya lewat melalui beberapa sub-nol suhu rentang. pembuluh darah jaringan (13). kemajuan terus untuk ginjal kelinci. kombinasi tersebut DMSO.dengan DMSO amida seperti asetamida atau formamida. dengan pemulihan dari organ menunjukkan setelah pendinginan hingga di bawah . kornea (15). generasi 5 : Penggunaan polimer es memblokir diizinkan lebih jauh penurunan toksisitas oleh mengurangi konsentrasi krioprotektan semua diperlukan untuk mencapai vitrifikasi.