Makalah Pengantar Ensimologi

Purifikasi dan Strategi Enzim

Disusun oleh: Ari Wardani Ahsanatun Syahidawati (10/300464/PN/12043) (09/288778/PN/11863)

FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS GADJAH MADA 2012

Perannya begitu penting dan tidak bisa diabaikan. Mengembangkan penelitian enzim yang bermanfaat untuk semua ranah kehidupan. pemekatan dan fraksinasi.BAB I PENDAHULUAN A. . C. Tujuan Tujuan penulisan makalah ini adalah untuk mengetahui pemurnian enzim dan strategi pemurniannya. Mengetahui cara-cara yang efektif untuk memurnikan enzim b. Manfaat Penulisan makalah ini diharapkan dapat memeberikan manfaat berupa: a. Oleh karena itu perlu dilakukan pemurnian enzim. Latar Belakang Enzim merupakan salah satu bagian yang penting dalam kehidupan manusia. B. Tujuan pemurnian ada 2 yaitu tujuan komersial dan tujuan penelitian penelitian. Pemurnian enzim adalah suatu kegiatan memisahkan enzim yang diinginkan dari senyawa lain yang tidak dikehendaki. Kemurnian enzim ynag tinggi akan membuat aktiviatas enzim semakin tinggi.Tahap-tahap pemurnian bergantung pada tujuan akhir pemurnian. Hal ini mengingat enzim sebagai katalisator mampu untuk mempercepat reaksi. Pemurnian enzim dilakukan dengan strategi khusus yang terdiri terdiri dari beberapa tahap yaitu ekstraksi. Aktivitas enzim sangat tergantung pada kemurniannya.

dan manusia. Pengertian Pemurnian Suatu enzim tidak bisa dapat ditemukan langsung berbentuk enzim murni. Pada mulanya jika ingin mendapatkan suatu enzim untuk keperluan tertentu. pemekatan. Ekstraksi Enzim Enzim dapat didapatkan secara murni melalui ekstraksi. maka perlu mengambil suatu sel dari bagian makhluk hidup. 2. Bebrapa hal yang perlu diperhatikan diantaranya mendeterminasikan enzim yang tidak diketahui dalam bahan. Selain itu perlu diperhatikan pula sumber dari enzim. Namun akhirnya cara tersebut dipandang tidak efektif sehingga dicari berbagai cara untuk mendapatkan enzim murni. metode homogenasi yang digunakan dan metode pemisahannya. Kuantitas Pemakaian akhir dari protein murni akan menentukan kuantitas enzim yang diperlukan 3. Dengan mengetahui enzim yang didapatkan adalah enzim murni. hewan. Mengingat enzim itu berada dalam tubuh makhluk hidup seperti di dalam sel tumbuhan. minimal ada tiga strategi dalam pemurnian enzim yang harus diperhatikan yaitu: 1. Ekonomis Merupakan hal penting bila akandigunakan di industry atau dalam skala laboratorium. maka diharapkan dapat diperoleh data yang valid dalam penggunaannya. Harris (1989) menyebutkan. . Kualitas Perlu tindakan untuk mempertahankan aktivitas protein dengan cara mengurangi proteolisis dan denaturasi.BAB II PEMBAHASAN A. Dijelaskan bahwa tingkat kemurnian suatu produk enzim berbeda-beda tergantung pada metode yang digunakan. Secara umum permunian enzim bisa dibagi menjadi tiga bagian yaitu ekstraksi. dan fraksinasi. Menurut Channel (1998) pemurnian berarti membebaskan suatu bahan dari bahan-bahan lain yang tidak diinginkan atau sering disebut pengotor. B.

Mengapa harus mencoba mengisolasi? Minimal dengan dua pertanyaan ini. Yaitu: 1. Alasan. Metode preparatif bertujuan untuk tetap mempertahankan aktifitas enzim. 1991). enzim tertentu hanya diproduksi secara spesifik oleh sel tubuh tertentu. pelarut organik. produkzi dengan jumlah enzim yang maksimal dapat digunakan untuk kepentingan yang akan datang dan tes biologi yang lebih ekstensif. ultrafiltrasi dan liofilisasi (Bollag dan Edelstein. Menyangkut pertanyaan pertama. lemak dan asam nukleat. Elektroforesis gel poliakrilamid (PAGE = Poly Acrylamide Gel Electrophoresis) merupakan metode yang sering digunakan dalam analisis sampelbiologis karena kemampuannya dalam memisahkan campuran protein yangkompleks dengan baik dan resolusi yang tinggi (Bollag dan Edelstein. Apa yang harus diisolasi? 2. Elektroforesis adalah suatu teknik untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatan dan berat molekul. lebih khusus lagi untuk menyediakan bahan yang cukup diizinkan untuk melakukan pengecekan struktur enzim. D. misalnya menggunakan garam. dan imunopresipitasi yang dapat menyebabkan denaturasi protein. Ada dua metode pemekatan enzim yaitu analitik dan preparatif (penyiapan). seseorang bisa merancang desain ekstraksinya. berikut ini beberapa jawaban yang relevan antara lain beberapa enzim yang tidak diketahui sangat penting dalam aktivitas metabolisme. Metode fraksinasi umum untuk pemurnian enzim.polimer organik. Metode analitik menggunakan pengendapan asam (misalnya asam trikloroasetat). yang bertujuan untuk memisahkan enzim dari protein non enzim lainnya.Jika seorang akan mengekstraksi suatu enzim ada dua hal yang mesti dipertanyakan karena menyangkut tentang pengaturan eksraksi. C. Pemekatan Enzim Pemekatan enzim dilakukan untuk memisahkan konsentrat protein dari komponen biomolekul lainnya diantaranya karbohidrat. meliputi kromatografi kolom dan elektroforesis. Elektroforesis pada gel poliakrilamida adalah metode yang paling sering digunakan untuk karakterisasi protein dan campuran protein. 1991). dan semua kejadian kimiawi dalam tubuh organism memiliki karakter tersendiri.alasan yang bisa menjawab diantaranya untuk memurnikan sejumlah enzim bisa dilakukan sebagian atau keseluruhan. karena prosedur inirelatif .pengendapan organik (misalnya aseton atau etanol). Fraksinasi Enzim Fraksinasi merupakan tahap akhir dalam pemurnian enzim.

Berbeda dengan SDS-PAGE. Enzim dipisahkan dalam gel denaturasi (SDS). gel pemisah zimografi mengandung substrat enzim yang akan dihidrolisis oleh enzim selama masa inkubasi. Zimografi adalah teknik elektroforesis untuk menetapkan aktifitas enzim secara in situ. namun dalam kondisi tidak tereduksi. Biasanya sebuah kolom dijalankan eluate dibagi menjadi beberapa bagian mengikuti kandungan senyawa.cepat dan sensitif. matriks gel. Penambahan deterjen Triton X-100 akan melepaskan SDS sehingga protein kembali melipat (renaturasi). Semakin kecil jumlah yang difraksinasi diharapkan memiliki kandungan enzim yang lebih murni. Adapun substrat yang bisa digunakan untuk zimogram diantaranya kasein. sensitif dan kualitatif dalam menganalisis aktifitas enzim. Sebagai alternative digunakan berbagai metode untuk pemisahan meliputi HPLC ( high performance liquid chromatography). Mekanisme pada elektroforesis gel poliakrilamida sodium dodesil sulfat (SDS-PAGE) adalah protein akan bereaksi dengan SDS yang merupakan deterjen anionik membentuk kompleks berikatan dengan SDS.jenis fraksinasi enzim bergantung pada individual sampel dan tujuan dari pemisahan. gelatin dan lain-lain (Leber dan Balkwill 1997). Strategi Purifikasi Enzim Secara ringkas enzim memiliki startegi untuk pemurniannya. Misalkan eluate dari kolom silica memiliki volume 10 ml diharapkan bisa dibagi menjadi 20 x 5 ml fraksinasi. Gel selanjutnya diwarnai sehingga molekul protein yang memiliki aktifitas tampak sebagai pita bening. E. Di bawah ini merupakan skema untuk memurnikan enzim: . Hal ini juga mencegah terjadinya penghamburan target enzim. Kompleks protein yang bermuatan negatif ini kemudian akan muatan dan ukurannya secara elektroforesis di dalam dengan cara membandingkan nilai Berat molekul protein dapat diukur menggunakan protein standar terpisahkan berdasarkan yang telah diketahui berat molekulnya mobilitas relatifnya (Rf) (Bollag dan Edelstein 1991). Elektroforesis didefnisikan sebagai perpindahan partikel-partikel bermuatan karena pengaruh muatan medan listrik. Metode zimografi bersifat mudah. Jenis. dan dimonitori oleh sinar ultraviolet.

Setelah mendapatkan ekstrak suatu bahan maka langkah selanjutnya ialah untuk mendapatkan hasil akhir berupa enzim murni. Selain itu pada E. Enzim murni atau hampir murni dikehendaki . Hal ini bisa dilakukan melalui dua cara tergantung tujuannya yaitu skala komersial atau skala penelitian. Hasilnya akan mendapatkan enzim kasar. Namun hal ini bisa disiasati dengan mengeksplorasi dari hewan-hewan laut khususnya untuk medapatkan jumlah yang besar. Namun jika diinginkan enzim murni dalam skala kecil perlu dilakukan perlakuan metode separasi yang kedua untuk mendapatkan jumlah yang lebih murni.a. Sumber Sumber untuk medapatkan suatu enzim begitu melimpah di muka bumi ini. Memang tidak semua bahan itu bisa disediakan dengan mudah mengingat kondisi gegografi dan ekonomi suatu tempat. Misalkan kelenjar laktasi mamalia merupakan sumber yang bagus untuk asetil KoA karboksilase dan ginjal adalah sumber terbaik untuk mendapatkan enzim hidrolase semacam alkalin fosfat. Jika tujuannya skala penelitian maka menggunakan dengan metode afinitas separasi. Skala komersial biasanya menggunakan metode separasi atau pemisahan. Metode ini dipilih mengingat biaya yang dikeluarkan sangat besar padahal dalam skala komersial hal yang harus diingat adalah minimalisasi biaya. Sumber yang sudah ditentukan lalu dilakukan homogenisasi sebagian atau pemecahan subseluler (organel sel). Enzim kasar atau yang dimurnikan sebagian masih dapat digunakan untuk komersial. Jika sumber bahan dilakukan homogenisasi total maka akan langsung mendapatkan ekstrak. Hal ini akan mendapatkan purifikasi organel. Coli dapat digunakan untuk mensintesis beta galaktosidase. Metode ini akan menghasilkan enzim murni.

dan penurunan dielektrik konstan dengan skalanya biasanya besar. Pilihan metode bergantung pada jenis jaringan atau organism yang digunakan sebagai sumber enzim. b. Selama homogenisasi bisa menghilangkan vakuola yang dapat menyebabkan kerusakan pada enzim. Selanjutnya jika yang menjadi acuan kepolarannya maka dapat digunakan metode ion-exchange chromatography. immunoadsorption. jumlah.dalam penelitian atau dipakai dalam produk analitik. Organel ini mengandung sejumlah enzim hidrolase seperti protease. Sehingga perlu ditambahkan buffer yang dapat mencegah kerusakan. Terakhir jika yang menjadi acuan adalah struktur enzimnya maka metode yang digunakan berupa afnitas kromatografi. . dan dialysis atau ultrafiltration dengan skala pada umumnya kecil. kelarutan. Sebagai contoh jaringan mamalia pada kenyataannya lebih mudah untuk dihomogenisasi daripada organisme lain. chromatofocusing. change in ionic strength. dan posisi bagian ikatan enzim. isoelektric focusing. dye-ligand chromatography. Metode Separasi Kesuksesan dari pemisahan enzim dapat ditentukan melalui ukuran. Jaringan diambil sebagian kecil lalu dihomogenisasi dengan memutar pestle Teflon pada gelas mortar atau dengan blender berkecepatan tinggi. afnitas elution. Adapun tekanan yang digunakan sebagai teknik homogenisasi bergantung pada besar kesilnya sampel yang digunakan. ekeltroforesis. dan hydrophobic chromatography dengan skala yang ditargetkan biasanya skala kecil. Homogenisasi Homogenisasi bertujuan untuk memecah sel dan mengekstrak isi yang dikandungnya. Bagian sel yang penting untuk diambil berupa lisosom. Hal ini dapat menganggu sehingga pigmen dapat dihilangkan dengan diadsorpsi pada polimer polivinilpirolidon. Pada sumber enzim dari tumbuhan mengandung sejumlah senyawa fenol yang memiliki pigment gelap. Kemurnian ini sangat oenting karena akan berpengaruh pada validitas data yang diperoleh. dan covalent chromatography dengan target skala biasanya kecil. Lalu jika yang menjadi pokok adalah kelarutannya maka metode yang dilakukan change in pH. gel filtrasi. c. Berikut ini beberapa contoh metode yang digunakan: jika mengacu pada ukuran atau massa maka yang digunakan ialah metode centrifugasi.

DAFTAR PUSTAKA Channel. Pemurnian enzim dilakukan melalui tahap ekstraksi. Perlu perluasan berbagai teori yang ada sehingga bisa saling melengkapi informasi yang diperlukan. Atau jika ingin mendapatkan jumlah besar (skala industry) dari sumber bahan enzim dilakukan pemecahan subseluler sehingga didapatkan organel murni lalu diekstrak dan dipreparasi ganda sehingga didapatkan enzim murni. pemekatan. (Leber dan Balkwill 1997). M. Singapore. Brisbane. . sehingga memudahkan peta konsep pemurnian enzim. Natural Product Isolation. Toronto. 1998. c. B. Chichester. Humana press. Sedangkan starteginya dari sumber bahan enzim dihomogenisasi untuk mendapatkan ekstrak lalu dilakukan meode afnitas untuk mendapatkan enzim murni. D. tumbuhan. namun pemurnian bergantung pada tujuan penggunaan enzim dan cara untuk memurnikan. and S. Saran Agar lebih baik maka berikut ini beberapa saran yang perlu diperhatika untuk menghasilkan karya sejenis yang lebih baik di masa yang akan datang: a. b. Sumber-sumber enzim di muka bumi melimpah. 2. Bollag. J. New York. Pemurnian enzim beertujuan untuk mendapatkan enzim murni dari bahan-bahan yang tersedia dalam jaringan makhluk hidup (hewan. Wiley-Liss. dan fraksinasi. manusia). 1989. Kesimpulan 1. Perlu pengujian di laboratorium untuk membuktikan teori yang ada. 3. JP. Richard. Edelstein (1991). Protein Methods. New Jersey. Harris. Enzim yang akan dipurifikasi perlu dibuat semacam tabel.BAB III PENUTUP A.