Makalah Pengantar Ensimologi

Purifikasi dan Strategi Enzim

Disusun oleh: Ari Wardani Ahsanatun Syahidawati (10/300464/PN/12043) (09/288778/PN/11863)

FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS GADJAH MADA 2012

BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Enzim merupakan salah satu bagian yang penting dalam kehidupan manusia. Perannya begitu penting dan tidak bisa diabaikan. Hal ini mengingat enzim sebagai katalisator mampu untuk mempercepat reaksi. Aktivitas enzim sangat tergantung pada kemurniannya. Kemurnian enzim ynag tinggi akan membuat aktiviatas enzim semakin tinggi. Oleh karena itu perlu dilakukan pemurnian enzim. Pemurnian enzim adalah suatu kegiatan memisahkan enzim yang diinginkan dari senyawa lain yang tidak dikehendaki. Pemurnian enzim dilakukan dengan strategi khusus yang terdiri terdiri dari beberapa tahap yaitu ekstraksi, pemekatan dan fraksinasi.Tahap-tahap pemurnian bergantung pada tujuan akhir pemurnian. Tujuan pemurnian ada 2 yaitu tujuan komersial dan tujuan penelitian penelitian. B. Tujuan Tujuan penulisan makalah ini adalah untuk mengetahui pemurnian enzim dan strategi pemurniannya. C. Manfaat Penulisan makalah ini diharapkan dapat memeberikan manfaat berupa: a. Mengetahui cara-cara yang efektif untuk memurnikan enzim b. Mengembangkan penelitian enzim yang bermanfaat untuk semua ranah kehidupan.

BAB II PEMBAHASAN A. Pengertian Pemurnian Suatu enzim tidak bisa dapat ditemukan langsung berbentuk enzim murni. Mengingat enzim itu berada dalam tubuh makhluk hidup seperti di dalam sel tumbuhan, hewan, dan manusia. Pada mulanya jika ingin mendapatkan suatu enzim untuk keperluan tertentu, maka perlu mengambil suatu sel dari bagian makhluk hidup. Namun akhirnya cara tersebut dipandang tidak efektif sehingga dicari berbagai cara untuk mendapatkan enzim murni. Menurut Channel (1998) pemurnian berarti membebaskan suatu bahan dari bahan-bahan lain yang tidak diinginkan atau sering disebut pengotor. Dijelaskan bahwa tingkat kemurnian suatu produk enzim berbeda-beda tergantung pada metode yang digunakan. Dengan mengetahui enzim yang didapatkan adalah enzim murni, maka diharapkan dapat diperoleh data yang valid dalam penggunaannya. Harris (1989) menyebutkan, minimal ada tiga strategi dalam pemurnian enzim yang harus diperhatikan yaitu: 1. Kualitas Perlu tindakan untuk mempertahankan aktivitas protein dengan cara mengurangi proteolisis dan denaturasi. 2. Kuantitas Pemakaian akhir dari protein murni akan menentukan kuantitas enzim yang diperlukan 3. Ekonomis Merupakan hal penting bila akandigunakan di industry atau dalam skala laboratorium. Secara umum permunian enzim bisa dibagi menjadi tiga bagian yaitu ekstraksi, pemekatan, dan fraksinasi. Selain itu perlu diperhatikan pula sumber dari enzim, metode homogenasi yang digunakan dan metode pemisahannya.
B. Ekstraksi Enzim

Enzim dapat didapatkan secara murni melalui ekstraksi. Bebrapa hal yang perlu diperhatikan diantaranya mendeterminasikan enzim yang tidak diketahui dalam bahan.

Jika seorang akan mengekstraksi suatu enzim ada dua hal yang mesti dipertanyakan karena menyangkut tentang pengaturan eksraksi. Yaitu:
1. Apa yang harus diisolasi? 2. Mengapa harus mencoba mengisolasi?

Minimal dengan dua pertanyaan ini, seseorang bisa merancang desain ekstraksinya. Menyangkut pertanyaan pertama, berikut ini beberapa jawaban yang relevan antara lain beberapa enzim yang tidak diketahui sangat penting dalam aktivitas metabolisme, enzim tertentu hanya diproduksi secara spesifik oleh sel tubuh tertentu, dan semua kejadian kimiawi dalam tubuh organism memiliki karakter tersendiri. Alasan- alasan yang bisa menjawab diantaranya untuk memurnikan sejumlah enzim bisa dilakukan sebagian atau keseluruhan, lebih khusus lagi untuk menyediakan bahan yang cukup diizinkan untuk melakukan pengecekan struktur enzim, produkzi dengan jumlah enzim yang maksimal dapat digunakan untuk kepentingan yang akan datang dan tes biologi yang lebih ekstensif. C. Pemekatan Enzim Pemekatan enzim dilakukan untuk memisahkan konsentrat protein dari komponen biomolekul lainnya diantaranya karbohidrat, lemak dan asam nukleat. Ada dua metode pemekatan enzim yaitu analitik dan preparatif (penyiapan). Metode analitik menggunakan pengendapan asam (misalnya asam trikloroasetat),pengendapan organik (misalnya aseton atau etanol), dan imunopresipitasi yang dapat menyebabkan denaturasi protein. Metode preparatif bertujuan untuk tetap mempertahankan aktifitas enzim, misalnya menggunakan garam, pelarut organik,polimer organik, ultrafiltrasi dan liofilisasi (Bollag dan Edelstein, 1991). D. Fraksinasi Enzim Fraksinasi merupakan tahap akhir dalam pemurnian enzim, yang bertujuan untuk memisahkan enzim dari protein non enzim lainnya. Metode fraksinasi umum untuk pemurnian enzim, meliputi kromatografi kolom dan elektroforesis. Elektroforesis adalah suatu teknik untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatan dan berat molekul. Elektroforesis gel poliakrilamid (PAGE = Poly Acrylamide Gel Electrophoresis) merupakan metode yang sering digunakan dalam analisis sampelbiologis karena kemampuannya dalam memisahkan campuran protein yangkompleks dengan baik dan resolusi yang tinggi (Bollag dan Edelstein, 1991). Elektroforesis pada gel poliakrilamida adalah metode yang paling sering digunakan untuk karakterisasi protein dan campuran protein, karena prosedur inirelatif

cepat dan sensitif. Elektroforesis didefnisikan sebagai perpindahan partikel-partikel bermuatan karena pengaruh muatan medan listrik. Mekanisme pada elektroforesis gel poliakrilamida sodium dodesil sulfat (SDS-PAGE) adalah protein akan bereaksi dengan SDS yang merupakan deterjen anionik membentuk kompleks berikatan dengan SDS. matriks gel. Kompleks protein yang bermuatan negatif ini kemudian akan muatan dan ukurannya secara elektroforesis di dalam dengan cara membandingkan nilai Berat molekul protein dapat diukur menggunakan protein standar terpisahkan berdasarkan

yang telah diketahui berat molekulnya

mobilitas relatifnya (Rf) (Bollag dan Edelstein 1991). Zimografi adalah teknik elektroforesis untuk menetapkan aktifitas enzim secara in situ. Berbeda dengan SDS-PAGE, gel pemisah zimografi mengandung substrat enzim yang akan dihidrolisis oleh enzim selama masa inkubasi. Enzim dipisahkan dalam gel denaturasi (SDS), namun dalam kondisi tidak tereduksi. Penambahan deterjen Triton X-100 akan melepaskan SDS sehingga protein kembali melipat (renaturasi). Gel selanjutnya diwarnai sehingga molekul protein yang memiliki aktifitas tampak sebagai pita bening. Metode zimografi bersifat mudah, sensitif dan kualitatif dalam menganalisis aktifitas enzim. Adapun substrat yang bisa digunakan untuk zimogram diantaranya kasein, gelatin dan lain-lain (Leber dan Balkwill 1997). Jenis- jenis fraksinasi enzim bergantung pada individual sampel dan tujuan dari pemisahan. Biasanya sebuah kolom dijalankan eluate dibagi menjadi beberapa bagian mengikuti kandungan senyawa. Misalkan eluate dari kolom silica memiliki volume 10 ml diharapkan bisa dibagi menjadi 20 x 5 ml fraksinasi. Semakin kecil jumlah yang difraksinasi diharapkan memiliki kandungan enzim yang lebih murni. Hal ini juga mencegah terjadinya penghamburan target enzim. Sebagai alternative digunakan berbagai metode untuk pemisahan meliputi HPLC ( high performance liquid chromatography), dan dimonitori oleh sinar ultraviolet. E. Strategi Purifikasi Enzim Secara ringkas enzim memiliki startegi untuk pemurniannya. Di bawah ini merupakan skema untuk memurnikan enzim:

a. Sumber Sumber untuk medapatkan suatu enzim begitu melimpah di muka bumi ini. Misalkan kelenjar laktasi mamalia merupakan sumber yang bagus untuk asetil KoA karboksilase dan ginjal adalah sumber terbaik untuk mendapatkan enzim hidrolase semacam alkalin fosfat. Selain itu pada E. Coli dapat digunakan untuk mensintesis beta galaktosidase. Memang tidak semua bahan itu bisa disediakan dengan mudah mengingat kondisi gegografi dan ekonomi suatu tempat. Namun hal ini bisa disiasati dengan mengeksplorasi dari hewan-hewan laut khususnya untuk medapatkan jumlah yang besar. Sumber yang sudah ditentukan lalu dilakukan homogenisasi sebagian atau pemecahan subseluler (organel sel). Hal ini akan mendapatkan purifikasi organel. Jika sumber bahan dilakukan homogenisasi total maka akan langsung mendapatkan ekstrak. Setelah mendapatkan ekstrak suatu bahan maka langkah selanjutnya ialah untuk mendapatkan hasil akhir berupa enzim murni. Hal ini bisa dilakukan melalui dua cara tergantung tujuannya yaitu skala komersial atau skala penelitian. Skala komersial biasanya menggunakan metode separasi atau pemisahan. Hasilnya akan mendapatkan enzim kasar. Enzim kasar atau yang dimurnikan sebagian masih dapat digunakan untuk komersial. Metode ini dipilih mengingat biaya yang dikeluarkan sangat besar padahal dalam skala komersial hal yang harus diingat adalah minimalisasi biaya. Namun jika diinginkan enzim murni dalam skala kecil perlu dilakukan perlakuan metode separasi yang kedua untuk mendapatkan jumlah yang lebih murni. Jika tujuannya skala penelitian maka menggunakan dengan metode afinitas separasi. Metode ini akan menghasilkan enzim murni. Enzim murni atau hampir murni dikehendaki

dalam penelitian atau dipakai dalam produk analitik. Kemurnian ini sangat oenting karena akan berpengaruh pada validitas data yang diperoleh. b. Homogenisasi Homogenisasi bertujuan untuk memecah sel dan mengekstrak isi yang dikandungnya. Pilihan metode bergantung pada jenis jaringan atau organism yang digunakan sebagai sumber enzim. Sebagai contoh jaringan mamalia pada kenyataannya lebih mudah untuk dihomogenisasi daripada organisme lain. Jaringan diambil sebagian kecil lalu dihomogenisasi dengan memutar pestle Teflon pada gelas mortar atau dengan blender berkecepatan tinggi. Bagian sel yang penting untuk diambil berupa lisosom. Organel ini mengandung sejumlah enzim hidrolase seperti protease. Adapun tekanan yang digunakan sebagai teknik homogenisasi bergantung pada besar kesilnya sampel yang digunakan. Selama homogenisasi bisa menghilangkan vakuola yang dapat menyebabkan kerusakan pada enzim. Sehingga perlu ditambahkan buffer yang dapat mencegah kerusakan. Pada sumber enzim dari tumbuhan mengandung sejumlah senyawa fenol yang memiliki pigment gelap. Hal ini dapat menganggu sehingga pigmen dapat dihilangkan dengan diadsorpsi pada polimer polivinilpirolidon. c. Metode Separasi Kesuksesan dari pemisahan enzim dapat ditentukan melalui ukuran, jumlah, kelarutan, dan posisi bagian ikatan enzim. Berikut ini beberapa contoh metode yang digunakan: jika mengacu pada ukuran atau massa maka yang digunakan ialah metode centrifugasi, gel filtrasi, dan dialysis atau ultrafiltration dengan skala pada umumnya kecil. Selanjutnya jika yang menjadi acuan kepolarannya maka dapat digunakan metode ion-exchange chromatography, chromatofocusing, ekeltroforesis, isoelektric focusing, dan hydrophobic chromatography dengan skala yang ditargetkan biasanya skala kecil. Lalu jika yang menjadi pokok adalah kelarutannya maka metode yang dilakukan change in pH, change in ionic strength, dan penurunan dielektrik konstan dengan skalanya biasanya besar. Terakhir jika yang menjadi acuan adalah struktur enzimnya maka metode yang digunakan berupa afnitas kromatografi, afnitas elution, dye-ligand chromatography, immunoadsorption, dan covalent chromatography dengan target skala biasanya kecil.

BAB III PENUTUP A. Kesimpulan 1. Pemurnian enzim beertujuan untuk mendapatkan enzim murni dari bahan-bahan yang tersedia dalam jaringan makhluk hidup (hewan, tumbuhan, manusia). 2. Sumber-sumber enzim di muka bumi melimpah, namun pemurnian bergantung pada tujuan penggunaan enzim dan cara untuk memurnikan. 3. Pemurnian enzim dilakukan melalui tahap ekstraksi, pemekatan, dan fraksinasi. Sedangkan starteginya dari sumber bahan enzim dihomogenisasi untuk mendapatkan ekstrak lalu dilakukan meode afnitas untuk mendapatkan enzim murni. Atau jika ingin mendapatkan jumlah besar (skala industry) dari sumber bahan enzim dilakukan pemecahan subseluler sehingga didapatkan organel murni lalu diekstrak dan dipreparasi ganda sehingga didapatkan enzim murni. B. Saran Agar lebih baik maka berikut ini beberapa saran yang perlu diperhatika untuk menghasilkan karya sejenis yang lebih baik di masa yang akan datang: a. Perlu pengujian di laboratorium untuk membuktikan teori yang ada. b. Perlu perluasan berbagai teori yang ada sehingga bisa saling melengkapi informasi yang diperlukan. c. Enzim yang akan dipurifikasi perlu dibuat semacam tabel, sehingga memudahkan peta konsep pemurnian enzim.

DAFTAR PUSTAKA Channel, Richard. JP. 1998. Natural Product Isolation. Humana press, New Jersey. Harris. 1989. Bollag, D. M. and S. J. Edelstein (1991). Protein Methods. New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore, Wiley-Liss. (Leber dan Balkwill 1997).