ISOLASI DAN IDENTIFIKASI Bacillus sp.

Oleh : Nama NIM Kelompok Rombongan Asisten : Dewi Apriyani : B1J009021 :2 :I : Rosi Istiqomah

LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI

KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2011

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Menurut Soetarto (2008), Bakteri merupakan mikroba uniseluler yang termasuk dalam kelas Shizomycetes. Pada umumnya bakteri tersebar luas di alam. Ada yang hidup bebas, besifat saprofitik, parasit, atau patogen pada manusia, binatang atau tumbuhan.ada beberapa jenis bakteri bersifat fotosinteteik. Ada tiga bentuk dasar bakteri, yaitu bentuk bulat (coccus), batang (bacillus), dan melilit (spiral) (Irianto, 2007). Identifikasi dan determinasi suatu biakan murni bakteri yang diperoleh dari hasil isolasi dapat dilakukan dengan cara pengamatan sifat morfologi koloni, morfologi sel bakteri, pengujian sifat-sifat fisiologi dan biokimianya. Selain itu, identifikasi juga dapat dilakukan dengan pengujian sifat patogenitas dan serologinya. Pertumbuhan bakteri di alam dipengaruhi oleh berapa faktor luar seperti substrat pertumbuhan, pH, temperatur, dan bahan kimia. Bakteri yang nampak, dapat memiliki morfologi yang sama, namun keperluan nutrisi dan persyaratan ekologinya berbeda (Soetarto, 2008). Untuk pengamatan morfologi bakteri dengan jelas, tubuhnya perlu diisi dengan cat warna, pewarnaan ini disebut pengecatan bakteri ( Irianto, 2007). Menurut Pelczar (1958), bentuk morfologi pertumbuhan koloni bakteri pada streak agar ada beberapa macam yaitu filiform, villous, echinulate, bead, rhizoid, effuse, dan arborescent. Bentuk pertumbuhan koloni pada nutrient cair yaitu pellicle, membranous, flocculent dan ring. Bacillus Megaterium merupakan bakteri gram positif yang sering ditemukan di tanah dan termasuk dalam genus Bacillus. Bakteri ini juga memiliki kemampuan untuk membentuk endospora yang melindunginya dari perubahan lingkungan dengan kondisi yang ekstrim. Bacillus Megaterium diklasifikasikan sebagai organisme obligate aerob, yang berarti membutuhkan oksigen untuk hidup. Bakteri ini sangat memerlukan kontak dengan udara langsung supaya dapat mereduksi unsur-unsur dan oksigen. Semua genus Bacillus bersifat obligat aerob. Secara teori, dalam medium cair bakteri akan bersifat aerob dan memiliki bentuk koloni yang mengumpul di permukaan medium. Hasil pengamatan menunjukkan suatu perbedaan bahwa koloni bakteri Bacillus Megaterium dalam medium cair tersebar merata di seluruh bagian, dan bagian yang menumpuk terdapat

di bagian bawah medium. Hanya bakteri yang bersifat fakultatif anaerob yang memiliki bentuk koloni seperti ini. Bentuk koloni Bacillus Megaterium dapat menjadi tersebar dalam medium disebabkan terjadinya penggojogan medium ketika melakukan pengamatan. Bentuk pertumbuhan koloni bakteri Bacillus Megaterium dalam medium padat tegak adalah bead, Artinya koloni yang tumbuh pada garis inokulasi terpisahkan. Sedangkan bentuk pertumbuhan koloninya pada medium padat miring yaitu tipe echinulate, artinya batas pertumbuhan koloni bakteri mempunyai bentuk yang menyerupaigigi atau titik-titik batas.

B. Tujuan Tujuan dari praktikum ini adalah mengisolasi bakteri Bacillus sp. dan mengidentifikasi bakteri Bacillus sp. Hasil isolasi dengan pendekatan mikrobiologis.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi Alat yang digunakan adalah jarum ose, object glass, mikroskop, mikrometer, kertas merang, tabung reaksi, pipet tetes, beaker glass, cawan petri, oven, pembakar spirtus, inkubator, wrapper. Bahan yang digunakan dalam praktkum ini adalah akuades, alkohol 70%, Alumunium foil, medium Nutrient Agar (NA), Nitrat Broth (NB), Malachite Green, Sterch Agar (SA), SIMA semisolid, Skim Milk Agar (SMA), Simon Citrat, MR-VP Broth, KOH-alfanaftol, reagen A dan B, NB 0%, NB +Nacl (6,5%, dan 10 %), Kristal Violet, lugols iodine, safranin, etanol 96%, reagen H2O2, media rafinosa, laktosa, reagen oksidase.

B. Metode a. Pengambilan Sampel 1. Tanah diambil secara aseptis 2. Alumunium foil disiapkan yang sebelumnya disterilkan terlebih dahulu dengan alkohol 70% 3. Sampel diambil dengan cepat dan dengan hati-hati dimasukkan ke dalam alumunium foil steril kemudian ditutup rapat. b. Tahap Isolasi Bacillus 1. Preparasi suspensi dilakukan 2. Sampel tanah dimasukkan ke dalam tabung pengenceran pertama 3. Sampel tanah direbus pada suhu 80oC selama 10 menit c. Tahap Pemurnian Dengan Metode Streak Kuadran 1. Dipilih satu koloni yang nampak terdiri dari satu tipe sel 2. Jarum ose dibakar, setelah dingin disentuhkan ke permukaan koloni bakteri yang akan disteak pada plating NA 3. Streak ini dianggap sebagai sterak primer pada permukaan NA 4. Jarum ose dibakar, diangkat lalu didinginkan dan disteakan melewati streak primer kesatu atau kedua dan kemudian dilanjutkan kestreak sekunder tanpa kembali kestreak primer

5. Jarum ose dibakar, diangkat lalu didinginkan melewati streak sekunder dan kemudian dilanjutkan kestreak tersier tanpa kembali kestreak primer dan sekunder diinkubasi pada suhu 30oC selama 2 x 24 jam d. Pengamatan Morfologi Koloni 1. Dibuat biakan pada media Nutrient Agar (NA) cawan 2. Diinkubasi 2 x 24 jam pada suhu 30oC 3. Diamati perbedaan bentuk koloni, ukuran, margin, elevasi, dan permukaan. e. Pengukuran Panjang Dan Lebar Sel 1. Disiapkan mikroskop yang telah dipasang mikrometer okuler yang sudah terkalibrasi 2. Dibuat preparat ulas bakteri uji dengan metode pewarnaan sederhana mengggunakan pewarna Methylen Blue 3. Diukur panjang dan lebar sel, kemudian dihitung panjang dan lebar sel sebenarnya f. Uji Pewarnaan Gram 1. Dibuat ulasan bakteri pada object glass, kemudian difiksasi 2. Ditetesi dengan gram A (Kristal violet), dibiarkan selama 60 detik 3. Dicuci dengan air mengalir, lalu dikeringanginkan 4. Ditetesi dengan gram B (lugols iodine), dibiarkan selama 60 detik 5. Dicuci dengan air mengalir, lalu dikeringanginkan 6. Dicuci dengan gram C(ethanol 96%) setetes demi settee sampai etanol yang jatuh berwarna bening 7. Ditetesi dengan gram D (safranin), dibiarkan selama 45 detik, dicuci dan dikeringanginkan 8. Diamati dibawah mikroskop g. Uji Pewarnaan Endospora 1. Dibuat ulasan bakteri pada object glass lalu ditutupi dengan kertas merang 2. Ditetesi dengan Malachite Green diatas kertas merang dan diletakkan di atas air mendidih 3. Dibiarkan selama lim menit, jika pinggir mulai mongering, ditambahkan lagi Malachite Green

h. Uji Motilitas 1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium SIMA semisolid sebanyak 1 ose 2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC 3. Dilihat pertumbuhan koloni bakterinya yang ada pada amedium SIMA semisolid i. Uji Hidrolisis Starch 1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium padat Starch Agar sebanyak 1 ose. 2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperature 30oC 3. Permukaan media ditetesi dengan larutan Lugols Iodine. 4. Diamati perubahan yang terjadi, jika terbentuk zona jernih di sekitar koloni menandakan hasil uji positif, dan jika tidak terbentuk zona jernih (warna biru reagen) menandakan hasil uji negatif j. Uji Hidolisis kasein 1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium padat SMA sebanyak 1 ose. 2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC 3. Diamati perubahan yang terjadi, jika terbentuk zona jernih di sekitar koloni menandakan hasil uji positif, dan jika warna media tetap menandakan hasil uji negatif k. Uji VP (Voges Proskauer) 1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium cair MR-VP sebanyak 1 ose 2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC 3. Bakteri ditetesi dengan alfanaftol 3 tetes dan KOH 40 % 2 tetes 4. Diamati perubahan yang terjadi, jika media berubah menjadi merah muda s.d merah setelah penambahan alfanaftol dan KOH 40% menandakan hasil uji positif, dan jika tidak terbentuk warna tersebut maka menandakan hasil uji negatif l. Uji Katalase 1. Dibuat preparat ulas bakteri pada objek glass 2. Ditetesi dengan larutan H2O2 3. Diamati perubahan yang terjadi 4. Jika terbentuk gelembung gas menunjukka bahwa hasil uji positif dan sebaliknya

m. Uji Oksidase 1. Dibuat preparat ulas bakteri pada objek glass, tutup dengan potongan tissue 2. Ditetesi dengan reagen oksidase 3. Diamati perubahan yang terjadi 4. Hasil positif jika berwarna biru marun, hasil uji negatif yaitu tidak terbentuk warna biru marun n. Uji Penggunaan Sitrat 1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium agar miring Simons Citrate sebanyak 1 ose 2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC 3. Diamati perubhan yang tejadi, jika hasil positif media berwarna biru sedangkan hasil negatif tetap berwarna hijau. o. Uji Gula 1. Bakteri uji ditumbuhkan pada medium Rafinosa dan Laktosa 2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC 3. Diamati perubahannya, hasil positif jika media berubah warna dari ungu menjadi kuning dan hasil negatif jika media tetap berwarna ungu. p. Uji Reduksi Nitrat 1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium cair Nitrate Broth sebanyak 1 ose 2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC 3. Diteteskan 1 ml nitrat reagen A dan dilanjutkan dengan nitrate reagen B 4. Hasil positif jika terbentuk warna merah tua/ merah gelap, jika belum terbentuk warna merah, ditambahkan bubuk seng (sampai dengan 5 mg/ml media) dan diamati jika terbentuk warna merah maka hasi pengujian positif q. Uji Toleransi NaCl 1. Dibuat tiga buah tabung Nutrient Broth yang mengandung Nacl 0%, 6,5 %, dan 10 % 2. Isolat diinokulasikan dengan streak kontinyu 3. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC 4. Diamati hasilnya dengan melihat tingkat kekeruhan pada media

R. Penentuan Spesies Melalui Pendekatan Homologi 1. Data-data yang diperoleh dibandingkan dengan data karakter bakteri dari sumber 2. Ditentukan persen homologinya dengan rumus % Homologi = Jumlah karakter yang sama x 100% Jumlah karakter yang diujikan

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Pemurnian

Pemurnian

Stok

Uji Gula

Pewarnaan Gram

Pewarnaan Endospora

Uji Hidrolisis Casein

Uji Oksidase

MR VP negatif

Toleransi NaCl 0%, 6,5%, 1%

MR VP (sebelum perlakuan) dan Nitrat Broth

Uji Hidrolisis Starch

Uji Katalase

Uji Motilitas

Uji Penggunaan Sitrat

Tabel 1. Hasil Uji Terhadap Bakteri Dari Tanah TPA

Uji Pewarnaan Gram Pewarnaan Endospora Uji Motilitas Uji Hidrolisis Starch Uji Hidrolisis Kasein Uji VP Uji Katalase Uji Oksidase Uji Penggunan Sitrat Uji Gula (Rafinosa & Laktosa) Uji Toleransi NaCl

Hasil Gram Positif + berwarna biru + + + + + -

Hasil Persen Homologi Uji Hasil B. subtilis 1. Pewarnaan Gram 2. Pewarnaan Endospora 3. Uji Motilitas + + 4. Uji Hidrolisis Starch 5. Uji Hidrolisis Kasein 6. Uji VP 7. Uji Katalase 8. Uji Oksidase 9. Uji Penggunaan Sitrat 10. Uji Gula 11. Uji Toleransi Nacl Jumlah Karakter yang sama % Homologi = Jumlah karakter yang sama x 100% Jumlah karakter yang diujikan =9 11 = 81,82% 8 5 7 8 9 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + B. polymyxa + B. cereus + B. antrachis + B. megaterium +

B. Pembahasan Berdasarkan kunci identifikasi, hasil uji terhadap bakteri yang diisolasi dari tanah TPA, didapatkan hasil identifikasinya yaitu Bacillus megaterium. Cirinya yaitu bakteri gram positif, menghasilkan endospora pada lingkungan yang bersuhu tinggi, motil, mampu menghidrolisis starch dan casein, uji VP negative, uji katalase dan oksidase positif, mampu menggunakan sitrat, uji gula (rafinosa dan laktosa) negatif, dan tidak toleran terhadap konsentrasi NaCl tinggi (Cowan, 1974). Dengan diketahuinya genus dari masing-masing bakteri maka identifikasi dapat dilanjutkan hingga ke tahap penentuan spesies. Dilakukan kembali serangkaian uji biokimia yang sesuai untuk penentuan spesies pada Genus Bacillus. Teori dari identifikasi bakteri dengan teknik konvensional adalah membandingkan bakteri yang sedang diidentifikasi dengan bakteri yang telah teridentifikasi sebelumnya. Bila tidak terdapat bakteri yang ciri-cirinya 100% serupa, maka dilakukan pendekatan terhadap bakteri yang memiliki ciri-ciri yang paling menyerupai (Dwipayana, 2008). Cara untuk mendapatkan biakan murni disebut isolasi. Isolasi merupakan salah satu tahapan yang sangat penting dalam Industri. Isolat yang diperoleh dan bersifat unggul akan digunakan untuk memproduksi senyawa yang bernilai ekonmis. Mikroba dapat diisolasi dari alam: sayur, buah-buahan (segar atau busuk) tanaman, hewan tanah, lumpur danau atau sungai, limbah dan sebagainya. Namun untuk mendapatkan isolat yang lebih spesifik, isolasi dilakukan dari lingkungan khusus atau kondisi lingkungan yang ekstrim, seperti mikroba temofilik dapat diisolasi dari lingkungan air panas. Karakterisasi atau penentuan sifat fisiologis mikroba, merupakan dasar dalam identifikasi mikroba secara sistematik. Selain itu pengetahuan tentang sifat fisologis isolat juga diperlukan dalam kemudahan proses pemeliharaan dan optimisasi proses fermentasi. Beberapa karakter yang perlu diketahui dari isolat, antara lain adalah; a. Morfologi dan struktur sel (spora,flagel) b. Sifat Gram c. Morfologi koloni pada media padat d. Sifat petumbuhan pada medium cair e. Kebutuhan oksigen f. Kebutuhan energi dan nutrien

g. Suhu dan pH optimal untuk pertumbuhan h. Kurva pertumbuhan Selanjutnya identifikasi isolat dapat dilakukan dengan berbagai cara, antara lain berdasarkan: a. Reaksi enzimatik/tes biokimia: fermentasi gula, TSIA, Indol, Metil red, Vouges Pros kauer, Citrat, Urease, katalase, oksidase dan sebagainya b. Tes serologi: yakni reaksi antigen dengan antibodi c. Sifat genetik: yakni dengan menentukan komposisi basa, urutan basa nukleotida dan hibridisasi DNA d. Urutan asam amino: urusan asam amino yang menyusun protein adalah spesifik, karena merupakan merupakan refleksi dari urutan basa DNA, dan lain-lain (Yulneriwarni, 2008). Mikroba tanah merupakan berbagai jenis mikroorganisme yang hidup di tanah. Jumlah dan jenis mikroorganisme yang hidup ditanah tergantung dari ciri- ciri lingkungan tanah dan unsur unsur yang terkandung di dalam tanah tersebut. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dalam setiap hektar tanah terdapat 2.200 kilogram jamur, 1.100 kilogram bakteri, 220 kilogram protozoa, 125 kilogram algae, dan 125 kilogram ragi (Dinata, 2002). Salah satu mikroorganisme yang hidup dalam tanah adalah bakteri. Bakteri tersebut berperan penting dalam proses

penguraian unsur dan senyawa-senyawa yang terkandung dalam tanah menjadi senyawa atau unsur yang bermanfaat bagi jasad hidup lainnya. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, bakteri yang biasa terdapat dalam tanah adalah Arthrobacter (5- 60% ) , Bacillus (7- 67%), Pseudomonas (3- 15%), flavobacterium (2- 10%), dan Alkaligenes (2- 12%). Sedangkan untuk

Corynebacterium, Xanthomonas, Sarcina, Mycobacterium dan Staphylococcus kurang dari 5% ( Suwandi., 1993). Berdasarkan data tersebut, dapt diketahui bahwa Bacillus merupakan genus yang paling banyak terdapat di dalam tanah. Genus Bacillus ini pun dilaporkan merupakan salah satu bakteri proteolitik. Identifikasi dan determinasi suatu biakan murni bakteri yang diperoleh dari hasil isolasi dapat dilakukan dengan cara pengamatan sifat morfologi koloni, morfologi sel bakteri, pengujian sifa-sifat fisiologi dan biokimianya. Selain itu, identifikasi juga dapat dilakukan dengan pengujian sifat patogenitas dan serologinya.

Pertumbuhan bakteri di alam dipengaruhi oleh berapa faktor luar seperti substrat pertumbuhan, pH, temperatur, dan bahan kimia. Bakteri yang nampak dapat memiliki morfologi yang sama, namun keperluan nutrisi dan persyaratan ekologinya berbeda (Soetarto, 2008). Untuk pengamatan morfologi bakteri dengan jelas, tubuhnya perlu diisi dengan cat warna, pewarnaan ini disebut pengecatan bakteri (Irianto, 2007). Bacillus Megaterium merupakan bakteri gram positif yang sering ditemukan di tanah. Bakteri ini juga memiliki kemampuan untuk membentuk endospora yang melindunginya dari perubahan lingkungan dengan kondisi yang ekstrim. Bacillus Megaterium diklasifikasikan sebagai organisme aerob obligat, yang berarti membutuhkan oksigen untuk hidupnya. Bakteri ini sangat memerlukan kontak dengan udara langsung supaya dapat mereduksi unsur-unsur dan oksigen. Semua genus Bacillus bersifat obligat aerob. Secara teori, dalam medium cair bakteri ini akan bersifat aerob dan memiliki bentuk koloni yang mengumpul di permukaan medium. Hasil pengamatan menunjukkan suatu perbedaan bahwa koloni bakteri Bacillus Megaterium dalam medium cair tersebar merata di seluruh bagian, dan bagian yang menumpuk terdapat di bagian bawah medium. Hanya bakteri yang bersifat fakultatif anaerob yang memiliki bentuk koloni seperti ini. Bentuk koloni Bacillus Megaterium dapat menjadi tersebar dalam medium disebabkan terjadinya penggojogan medium ketika melakukan pengamatan (Aksoy, 2002). Bentuk pertumbuhan koloni bakteri Bacillus Megaterium dalam medium padat tegak adalah bead, Artinya koloni yang tumbuh pada garis inokulasi terpisahkan. Sedangkan bentuk pertumbuhan koloninya pada medium padat miring yaitu tipe echinulate, artinya batas pertumbuhan koloni bakteri mempunyai bentuk yang menyerupai gigi atau titik-titik batas. Macam uji biokimiawi pada Bacillus sp. Antara lain sebagai berikut : 1. Pewarnaan Sederhana Pada pewarnaan sederhana bakteri Bacillus Megaterium zat pewarna yang digunakan adalah kristal violet. Biakan murni diambil dari tabung reaksi secara aseptik dan diletakkan langsung pada objek glass kemudian difiksasi agar protein bakteri terkoagulasi serta dapat menempel pada objek glass dan tidak ikut tercuci sewaktu dibilas dengan akuades. Hal yang dilakukan

selanjutnya adalah mengamati dalam mikroskop. Sel bakteri berukuran sangat kecil dan tebal lapisan air tipis diantara cover glass dan objek glass masih bisa menampung beberapa bakteri bacillus yang ditumpuk vertikal, artinya tebal tersebut masih bisa digunakan sel untuk berenang ke atas dan ke bawah. Jangan menganggap gambar yang terlihat pada mikroskop adalah gambar datar. Kontrol sangatlah penting, meskipun kita sulit untuk mendapatkannya. Akan tetapi lebih baik jika bakteri yang dilihat dapat dibandingkan dengan bakteri lain yang telah diketahui bentuknya dengan pasti. Dari pengamatan mikroskopis diperoleh bentuk morfologi dari bakteri Bacillus Megaterium yaitu strukutr morfologinya berbentuk batang (bacil), dan susunan bakterinya adalah berantai. 2. Pewarnaan Gram Pewarnaan gram pada Bacillus Megaterium digunakan empat pewarna, yaitu Kristal violet sebagai pewarna utama, iodine sebagai pengikat warna utama (mordant), alkohol sebagai dekolorisasi, dan safranin sebagai pewarna tandingan. Pada pengamatan dengan menggunakan mikroskop nampak Bacillus Megaterium berbentuk basil (batang) dan merupakan bakteri gram positif. Ini bisa diketahui saat tahap dekolorisasi. Pada tahap tersebut warna yang dihasilkan sama dengan warna utama, yaitu warna ungu. Ini menunjukkan bahwa pada Bacillus Megaterium memiliki dinding yang tebal sehinnga saat bakteri mengalami dehidrasi, pori-porinya menciut yang akhirnya menyebabkan warna utama tidak bisa keluar. Pada Bacillus Megaterium, koloninya bergerombol sedikit terpisah-pisah bahkan

membentuk rantai panjang. Bacillus Megaterium merupakan bakteri grampositif yang berbentuk batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus Megaterium juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol. 3. Pewarnaan Spora Pewarnaan Spora pada Bacillus Megaterium tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, akan tetapi apabila sekali diwarnai, zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode

pengecatan spora secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora, endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya. Bacillus Megaterium memiliki endospora, endospora lebih tahan lama meski dalam keadaan lingkungan ekstrim seperti kering, panas, atau bahan kimia yang beracun. Selain itu, endospora juga lebih tahan terhadap pewarnaan. Sekali berhasil diwarnai, spora sangat sukar untuk melepaskan zat warna sehingga saat diberi warna dari saftranin tetap berwarna hijau karena spora sudah mengkiat malachit green dan sulit mengikat warna yang diberikan kemudian. Karakterisasi dan klasifikasi sebagian besar mikroba seperti bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe media, memproduksi tipe metabolit tertentu yang dideteksi dengan interaksi mikrobia dengan reagen test yang menghasilkan warna reagen. Reaksireaksi dalam sel akan teridentifikasi dengan melakukan pengujian-pengujian tertentu. Sel akan memberikan respon sesuai dengan kemampuan yang dimilikinya, misalnya menghasilkan enzim katalase, enzim gelatinase atau kemampuan untuk

menghidrolisis lemak (Pelczar dan Chan, 1986). Secara morfologis, biakan maupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa. Karena itu ciri fisiologis atau biokimiawi merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi spesimen yang tidak dikenal. Tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organisme yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidaklah mungkin dilakukan. Oleh karena itu percobaan ini penting dilakukan, karena dengan melakukan uji biokimia kita dapat mengidentifikasi organisme tak dikenal (Hadieotomo, 1993). Uji fisiologi biasanya identik dengan uji biokimia. Uji-uji biokimia yang biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri atau mikroorganisme yang antara lain uji katalase, koagulase, uji nitrit, hidrolisis gelatin, uji hidrolisis kanji, uji hidrogen sulfit dan lain-lain. Pengujian biokimia

merupakan salah satu hal yang sangat penting dalam dunia mikrobiologi (Lim, 1998). Uji-uji biokimia yang biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri atau mikroorganisme yaitu antara lain adalah uji koagulase, uji katalase, uji MRVP, uji nitrit, hidrolisis gelatin, uji H2S dan lain-lain. Salah satu uji yaitu adalah uji hidrolisis urea. Uji ini sangat penting dalam identifikasi bakteri-bakteri patogen penghuni usus, begitu pula uji yang lain sebenarnya digunakan untuk

mengidentifikasi bakteri dengan karakter tertentu, yang mana dengan karakter tersebut ia dapat dibedakan dengan jelas dari bakteri-bakteri yang lain yang hidup disekitarnya (Dwidjoseputro, 1994). Kebanyakan bakteri aerobik dan anaerobik fakultatif akan memproduksi hidrogen peroksida yang bersifat toksik terhadap bakteri yang masih hidup. Untuk menjaga kelangsungan hidupnya, sejumlah bakteri mampu menghasilkan enzim katalase yang memecah H2O2 menjadi air dan oksigen sehingga sifat toksiknya hilang (Pelczar dan Chan, 1986). Matinya bakteri-bakteri anaerobik obligat bila ada oksigen disebabkan karena tidak adanya pembentukan enzim katalase sehingga H2O2 meracuni bakteri itu sendiri. Ada tidaknya pembentukan enzim katalase dapat membantu pembedaan kelompok-kelompok bakteri tertentu. Pada uji katalase, kebanyakan bakteri aerob dan anaerob menggunakan oksigen H2O2 yang sesungguhnya bersifat racun bagi sistem-sistem enzim sendiri. Namun, mereka tetap dapat hidup dengan adanya racun tersebut karena akan meghasilkan enzim katalase (Hadieotomo, 1993). Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu untuk mengetahui apakah bakteri tersebut merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau anaerob obligat. Bakteri yang memerlukan oksigen manghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) yang sebenarnya beracun bagi bakteri sendiri. Namun mereka dapat tetap hidup dengan adanya antimetabolit tersebut karena mereka menghasilkan enzim katalase yang dapat mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen. Letak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi. Tipe utama diantara terminal, subterminal dan sentral. Tipe sentral atau tengah merupakan lokasi dari sel vegetatif yang letaknya tepat di tengah. Tipe terminal memiliki pengertian letak el vegetatif diantara ujung dan pinggir dari sel vegetatif. Tipe subterminal berarti lokasi endosporanya diantara tengah dan pinggir dari sel

vegetatif. Endospora dapat berukuran lebih besar ataupun kecil dari sel vegetatif yang terdiri dari lapisan protein yang terbuat dari keratin. Spora ini memiliki resistensi yang tinggi terhadap pewarnaan, prosedur pewarnaan dengan malachite green adalah dengan pemanasan. Endospora merupakan metode pertahanan hidup yang bukan bertujuan untuk reproduksi. Contohnya Bacillus Megaterium memiliki endospora yang terletak di sentral (Ncbi, 2008). Motilitas dapat diamati dengan baik pada biakan yang masih baru. Pada biakan yang sudah lama, bakteri sudah mati, sehingga sangat sukar untuk mendapatkan sel yang motil, selain itu produksi asam dan produk yang bersifat racun dapat menyebabkan hilangnya motalitas sel bakteri pada biakan (Volk, 1988). Menurut Taringan (1988) beberapa bakteri dapat melakukan gerakan meluncur yang sangat mulus yang hanya terjadi kalau persentuhan dengan benda padat. Kebanyakan bakteri yang motil dapat mendekati atau menjauhi berbagai senyawa kimia yang disebut kemotaksis. Menurut Volk (1988) kemampuan suatu organisme untuk bergerak sendiri disebut motilitas. Hampir semua sel bakteri spiral dan sebagian dari sel bakteri basil bersifat motil, sedangkan bakteri yang berbentuk kokus bersifat immotil. Uji fermentasi karbohidrat bertujuan untuk mengetahui kemampuan isolat bakteri dalam menghidrolisis karbohidrat dengan menggunakan tiga jenis gula, yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa. (Lay, 1994). Uji hidrolisis pati untuk melihat kemampuan bakteri dalam menghidrolisis pati dengan cara menghasilkan enzim amilase. Pati merupakan polisakarida yang memiliki berat molekul yang tinggi, karena ukurannya yang besar, polisakarida tidak mampu diserap oleh membran sel. Uji hidrolisis karbohidrat dengan medium Mannosa, Raffinosa, dan Laktosa yaitu untuk mengetahui bakteri mampu menggunakan substrat berupa oligosakarida dan monosakarida pada medium untuk dipecah menjadi asam-asam anorganik yang lebih sederhana. Bakteri uji ditumbuhkan pada medium Mannosa, Rafinosa, dan Laktosa diberi BCP (Brom Cresol Purple) sebagai indikator. Bakteri uji kemudian diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu 370C. Uji positif jika mampu tumbuh pada medium berubah menjadi warna kuning dan terbentuk gas pada tabung durham

(Tortora et al.,1998). Hasil praktikum bakteri uji gula menunjukkan hasil negatif karena media tidak berubah warna. Menurut Irianto (2007), pengujian Voges-Proskauer bertujuan untuk mengetahui apakah dalam proses pertumbuhan organisme terbentuk asetil-metil karbitol sebagai produk-antara (intermediate product) dari proses metabolisme karbohidrat. Bakteri yang diuji ditumbuhkan pada medium cair MR-VP, diinkubasi pada suhu 370C selama 2x24 jam. Pengamatan dilakukan setelah penambahan KOH sebanyak 3 tetes dan alfanaftol sebanyak 2 tetes. Setelah penambahan KOH sebanyak 3 tetes akan terbentuk Asetoin (Asetil, metal karbinol) + KOH + CH3 . Alfanaftol digunakan untuk memulai proses oksidasi yang kemudian tabung reaksi dibuka dan dimiringkan untuk memperluas permukaan saat proses oksidasi. Media VP mengandung 2,3 butanadiol yang apabila ditambahkan alfanaftol dan KOH akan menghasilkan warna pink yang mengandung asetil metil karbinol. Hasil uji positif apabila pada media tersebut terbentuk warna pink (Helmich et al., 2001). Berdasarkan hasil praktikum, isolat bakteri yang diuji menunjukkan hasil negatif karena warnanya tetap. Katalase merupakan enzim yang mengandung besi yang dapat menguraikan hidrogen peroksida (H202) menjadi air dan oksigen. Hidrogen peroksida dibentuk bakteri aerobik selama metabolisme aerobik. Uji katalase bertujuan untuk mengetahui perbedaan kuantitas oksigen yang dilepaskan, diduga berkaitan dengan tebal tipisnya selaput lendir yang menyelimuti permukaan sel. Tebal tipisnya selaput lendir akan mempengaruhi penetrasi H202 ke dalam sel. Isolat yang diperoleh berdasarkan praktikum menunjukkan sifat katalase positif yaitu ditandai dengan terbentuknya gelembung gas. Uji positif ditandai dengan terbentuknya gelembung oksigen di sekitar koloni bakteri, yang menunjukkan bakteri mampu menghasilkan enzim katalase yang dapat mengkatalisis reaksi penguraian H2O2 menjadi H2O dan O2. Sedangkan uji negatif memberikan hasil uji yang sebaliknya yakni tidak terbentuk gelembung gas di sekitar koloni bakteri. H2O2 H2O + O2 (g)

Dalam Uji penggunaan Sitrat, Uji positif ditandai dengan perubahan warna indikator BTB (Bromthymol blue) dalam media biakan dari hijau menjadi biru, yang menunjukkan terbentuknya senyawa yang bersifat basa yaitu amonium (NH4+)
O H 2C HO C H 2C ONa O ONa O ONa CH 2 sitrat sintase HO C CH 2
sitrat

O OO OO Oion natrium

3 Na

trinatrium sitrat

NH 4H2PO 4
amonium dihidrogen fosfat

NH 4

H2PO 4dihidrogen posfat

amonium

Uji negatif ditandai dengan warna indikator dalam medium biakan yang tetap berwarna hijau yang menunjukkan tidak terbentuknya senyawa yang bersifat basa dan masih terdapat senyawa yang bersifat asam dalam media biakan yaitu sitrat. Pada uji oksidase Uji positif ditandai dengan terbentuknya warna hitam pada koloni bakteri setelah penambahan reagen uji oksidase. Hal ini menunjukkan bakteri memiliki enzim sitokrom oksidase yang dapat mengoksidasi reagen uji. Sedangkan uji negatif memberikan hasil uji yang sebaliknya yakni tidak terbentuk warna hitam pada koloni bakteri. Anggota dari genus Bacillus umumnya ditemukan di

tanah dan sebagian besar dari bakteri ini memiliki kemampuan untuk menghidrolisis protein, atau proteolitik. Enzim protease mikroorganisme ini memiliki peran penting dalam siklus nitrogen, yang memberikan kontribusi untuk kesuburan tanah (Aslim, 2002).

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan Berdasarkan percobaan yang dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa bakteri yang diisolasi dari tanah tempat pembuangan akhir (TPA) adalah Bacillus megaterium.

B. Saran Saran untuk praktikum selanjutnya adalah agar praktikan diberitahu langkah awal dari isolasi, dari pengambilan sampel. Pembuatan media uji, dsb.

DAFTAR PUSTAKA

Aksoy, H.M. 2002. Isolation Of Bacillus megaterium From Aphis pomi (Homoptera: Aphidididae) And Assesment Of Its Pathogenity. Ondokuz Mayis University. Turkey. Aslim, Belma, Necdet Salam, Yavuz Beyatli. 2002. Determination Of Some Properties Of Bacillus Isolated From Soil. Gazi University, Faculty Of Arts And Science, Department Of Biology, Ankara - Turkey Cowan, S.T. 1974. Manual for the Identification of Medical Bacteria. Great Britain : Cambridge University Press. Dinata, Madigan, M.T.,Martinko,J.M.,Parker, P. 2003. Biology of Microorganism. 10th Edition. Prentice Hall.USA.Dwidjoseputro, D., 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan. Dwidjoseputro, 1994. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: PT. Gramedia Jakarta. Dwipayana, 2008. Identifikasi Keberagaman Bakteri Pada Lumpur Hasil Penggolongan Limbah Cat Dengan Teknik Konvensional. ITB, Bandung. Hadioetomo, R.S., 1993, Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi,Gramedia, Helmich, 2001. Hvitved-Jacobsen.,2002. Sewer processes, CRC Press, USA. Irianto, K. 2007.Mikrobiologi. Yrama Widya, BandungPelczar. M.J., and Reid.R.D.,1958.Microbiology. Mc-Graw Hill-book Company,Japan. Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada. Jakarta: 168 hlm. Lim, D., 1998, Microbiology, WCB.Mc graw Hill, New York. Pelczar, M.J. Dan Chan, E.C.S., 1986, Dasar-Dasar Mikrobiologi, UI Press, Jakarta. Soetarto, E.S., Suharni. T.T, Nastiti. S.Y dan Sembiring, L. 2008. Petunjuk PraktikumMikrobiologi Untuk Mahasiswa Fakultas Biologi. Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta

Taringan, Madigan, M.T.,Martinko,J.M.,Parker, P. 2003. Biology of Microorganism. 10th Edition. Prentice Hall.USA.Fessenden, R. J. dan Fessenden, J. S., 1998, Kimia Organik Jilid 2 , Erlangga, Jakarta. Tortora, 1998. A review on the progresses of controlling stored product insects with Bacillus thuringiensis. Chinese Journal of Biological Control 11: 178182. Volk dan Wheeler. 1998. Mikrobiologi Dasar, Jilid 1, Edisi kelima. Erlangga. Jakarta. Yulneriwarni. 2008. Mikroba, Dari Habitat Ke Industri. Fakultas Biologi Universitas Nasional. VIS VITALIS, Vol. 01 No. 2