Makalah Kultur Jaringan Lengkap

BAB I PENDAHULUAN I.1. Latar Belakang Salah satu dampak dalam peningkatan ekspor komoditi pertanian adalah kebutuhan bibit yang semakin meningkat. Bibit dari suatu varietas unggul yang dihasilkan jumlahnya sangat terbatas, sedangkan bibit tanaman yang dibutuhkan jumlahnya sangat banyak. Penyediaan bibit yang berkualitas baik merupakan salah satu faktor yang menentukan keberhasilan dalam pengembangan pertanian di masa mendatang. Salah satu teknologi harapan yang banyak dibicarakan dan telah terbukti memberikan keberhasilan adalah melalui teknik kultur jaringan. Melalui kultur jaringan tanaman dapat diperbanyak setiap waktu sesuai kebutuhan karena faktor perbanyakannya yang tinggi. Bibit dari varietas unggul yang jumlahnya sangat sedikit dapat segera dikembangkan melalui kultur jaringan. Pada tanaman perbanyakan melalui kultur jaringan, bila berhasil dapat lebih menguntungkan karena sifatnya akan sama dengan induknya (seragam) dan dalam waktu yang singkat bibit dapat diproduksi dalam jumlah banyak dan bebas penyakit. Kultur jaringan adalah metode perbanyakan vegetatif dengan menumbuhkan sel, organ atau bagian tanaman dalam media buatan secara steril dengan lingkungan yang terkendali. Tanaman bisa melakukan kultur jaringan jika memiliki sifat totipotensi, yaitu kemampuan sel untuk beregenerasi menjadi tanaman lengkap kembali. I.2. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini diadakan adalah untuk mengetahui lebih dalam mengenai perkembangbiakan vegetatif melalui kultur jaringan. Termasuk di dalamnya tahapan dan manfaat kultur jaringan itu sendiri. Serta keterkaitan antara teori totipotensi dengan perbanyakan melalui kultur jaringan. I.3. Rumusan Masalah 1. Apa pengertian kultur jaringan? 2. Apa prinsip dasar dalam kultur jaringan? 3. Apa keterkaitan antara teori totipotensi dengan kultur jaringan? 4. Apa saja tipe-tipe kultur jaringan? 5. Apakah kelebihan dan kekurangan dari kultur jaringan? 6. Apa perbedaan perbanyakan alami dengan kultur jaringan? 7. Apa saja peralatan yang dipakai dalam kultur jaringan? 8. Apa saja fasilitas laboratorium kultur jaringan? 9. Apa metode pelaksanaan kultur jaringan? 10. Apa saja tahapan dalam kultur jaringan?

11. Apa saja yang mempengaruhi regenerasi pada kultur jaringan? 12. Apa saja kendala dan masalah yang dapat terjadi dalam kultur jaringan? I.4. Landasan Teori Teori yang melandasi kultur jaringan ini adalah teori totipotensi sel (Schwann dan Schleiden) yang menyatakan bahwa sel memiliki sifat totipotensi, yaitu bahwa setiap sel tanaman yang hidup dilengkapi dengan informasi genetik dan perangkat fisiologis yang lengkap untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman utuh, jika kondisinya sesuai. Teori ini mempercayai bahwa setiap bagian tanaman dapat berkembangbiak karena seluruh bagian tanaman terdiri atas jaringan-jaringan hidup. BAB II PEMBAHASAN II.1. Pengertian Kultur jaringan bila diartikan ke dalam Bahasa Jerman disebut Gewebe Kultur, dalam Bahasa Inggris disebut Tissue Culture, dalam Bahasa Belanda disebut weefsel kweek atau weefsel cultuur. Kultur jaringan atau budidaya in vitro adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, jaringan atauorgan yang serba steril, dalam botolkultur yang sterildan dalam kondisi yang aseptic, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman yang lengkap. Usaha memperoleh suatu individu baru dari satu sel atau jaringan dikenal sebagai kultur sel atau kultur jaringan.. Menurut Suryowinoto (1991), kultur jaringan dalam bahasa asing disebut tissue culture. Kultur adalah budidaya dan jaringan adalah sekelompok sel yang mempunyai bentuk dan fungsi yang sama. Jadi, kultur jaringan berarti membudidayakan suatu jaringan tanaman menjadi tanaman kecil yang memiliki sifat seperti induknya. Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Kultur jaringan termasuk jenis perkembangbiakan vegetatif yang prinsip dasarnya sama dengan menyetek. Bagian tanaman yang akan dikultur (eksplan) dapat diambil dari akar, pucuk, bunga, meristem, serbuk sari. II.2. Prinsip Dasar Kultur Jaringan Menurut Thorpe (1981), ada 3 prinsip utama dalam kultur jaringan:  Isolasi bagian tanaman dari tanaman utuh (organ, akar, daun dll)  Memelihara bagian tanaman tadi dalam lingkungan yang sesuai dan kondisi kultur yang tepat  Pemeliharaan dalam kondisi aseptik

buah muda. Kultur biji (seed culture). Kultur protoplasma. Sel dari suatu organisme multiseluler dimanapun letaknya sebenarnya sama dengan sel zigot karena berasal dari satu sel tersebut (omne cellula ex cellula). Teori ini mempercayai bahwa setiap bagian tanaman dapat berkembangbiak karena seluruh bagian tanaman terdiri atas jaringan-jaringan hidup. Tipe. pucuk aksilar. 3. eksplan yang digunakan adalah sel yang telah dilepas bagian dinding selnya menggunakan bantuan enzim. akar dll. tangkai daun. 2. Protoplas diletakkan pada media padat dibiarkan agar membelah diri dan membentuk dinding selnya kembali. helaian daun.4. digunakan sebagai dasar dalam pelaksanaan kultur jaringan.tipe Kultur Jaringan Tipe-tipe kultur. yakni: 1. merupakan budidaya yang bahan tanamnya menggunakan organ. II. 4.3. yaitu bahwa setiap sel tanaman yang hidup dilengkapi dengan informasi genetik dan perangkat fisiologis yang lengkap untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman utuh. Kultur kalus (callus culture). kultur yang bahan tanamnya menggunakan biji atau seedling. 5. inflorescentia. bunga. Kultur organ (organ culture). bagian tanaman yang ditanam di media tersebut ternyata dapat bertumbuh dan berkembang menjadi individu baru bila kondisinya sesuai. seperti: ujung akar. biasanya eksplan yang digunakan berupa kalus atau jaringan meristem. Seperti teori totipotensi tersebut. Kultur suspensi sel (suspension culture) adalah kultur yang menggunakan media cair dengan pengocokan yang terus menerus menggunakan shaker dan menggunakan sel atau agregat sel sebagai bahan eksplannya. b. Teori Totipotensi Sel Teori sel oleh Schwann dan Schleiden (1898) yang menyatakan bahwa sel memiliki sifat totipotensi. Kultur protoplas biasanya untuk keperluan hibridisasi somatik atau fusi sel soma (fusi 2 protoplas baik intraspesifik maupun interspesifik). . II. buku batang. merupakan kultur yang menggunakan jaringan (sekumpulan sel) biasanya berupa jaringan parenkim sebagai bahan eksplannya. Dalam kultur jaringan bagian tanaman yang terdiri atas sel-sel dan jaringan dibuat sedemikian mungkin untuk ditanam di sebuah media yang steril dan lingkungan yang terkendali. Kaitan Teori Totipotensi dengan Kultur Jaringan Teori totipotensi yang menyatakan bahwa setiap sel tanaman dapat berkembang menjadi individu baru. jika kondisinya sesuai.Teori Dasar Kultur Jaringan: a.

peralatan dan perlengkapan. Membutuhkan modal investasi awal yang tinggi untuk bangunan (laboratorium khusus). Tidak perlu areal pembibitan yang luas. Alat- . yakni: kepalasari/ anther (kultur anther/kultur mikrospora). ovule (kultur ovule). tepungsari/ pollen (kutur pollen). Peralatan Kultur Jaringan Alat-alat yang dipakai dalam penanaman dalam kultur jaringan harus dalam keadaan steril.6. Kultur haploid adalah kultur yang berasal dari bagian reproduktif tanaman. Perbanyakan dalam waktu singkat. II. II. Diperlukan persiapan SDM yang handal untuk mengerjakan perbanyakan kultur jaringan agar dapat memperoleh hasil yg memuaskan.5. Produk kultur jaringan pada akarnya kurang kokoh.6. Tanaman bebas jamur dan bakteri. cara kultur jaringan dinilai mahal dan sulit. Sedangkan kekurangannya:      Bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap hama penyakit dan udara luar.7. Bagi orang tertentu. sehingga dapat dihasilkan tanaman haploid. Kelebihan dan Kekurangan Kultur Jaringan Kelebihan:      Sifat identik dengan induknya. Tidak dipengaruhi oleh musim. Perbedaan Perbanyakan Alami dan Kultur Jaringan Alami Nutrisi diperoleh secara alami dari dalam tanah Tanaman dapat membuat makanannya sendiri (autotrof) Sumber tanaman harus cukup umur Fotosintesis dengan bantuan matahari Ada musim hujan dan kemarau yang tidak terkendali Kultur Jaringan Media terbuat dari nutrisi kimia Tanaman tidak membuat makanannya sendiri Sumber tanaman sedikit Fotosintesis dengan cahaya lampu Tidak dipengaruhi musim II.

Gelas Ukur.8. merupakan bentuk lama dari alat penabur (LAFC).Ruang Tidak Steril Ruang Tamu Dalam laborsatorium kultur jaringan sebaiknya di lengkapi dengan ruang tamu. karena biasanya . Pipet Peralatan kultur jaringan: Laminar Air Flow Cabinet (LAFC). Botol-botol kosong. II. Entkas. Timbangan Analitik. Jarum. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator khusus untuk scapel. merupakan semacam jenis gelas piala yang mutlak dibutuhkan dalam kultur jaringan. Laboratorium kultur jaringan harus dirancang secara khusus. yaitu sebagai berikut: A. alat ini digunakan sebagai tahap perlakuan penanaman. digunakan untuk sterilisasi dissecting kit (skalpel dan pinset) di dalam laminar air flow cabinet atau di dalam enkas pada kita mengerjakan penanaman atau sub-culture. tetapi yang penting adalah timbanagn yaang dapat dipergunakan untuk menimbang sampai satuan yang sangat keil. Pinset. Oleh karena itu untuk bladenya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit. Karena ada bagian-bagian atau ruangan-ruangan yang harus dalam suasana steril atau bebas mikroba. digunakan untuk menakar air suling dan bahan kimia yang akan digunakan. Alat-alat kultur jaringan yang perlu disterilisasi sebelum penanaman adalah. Pinset dan Scalpel. Dengan menggunakan listrik. Gunting. Autoklaf. Ruang-ruang dalam kultur jaringan di kelompokkan menurut macam kegiatan yang ada di dalamnya. jenis alat ini bermacam-macam. maka fungsinya pun sama seperti (LAFC) Shaker (penggojok). yaitu ruang yang selalu harus dalam keadaan steril. alat ini digunakan dalama kultur jaringan tanaman sebagai sarana mmenuangkan air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eeksplan. Penggojok ini dapat digunakan untuk keperluan menumbuhkan kalus pada eksplan anggrek atau untuk membentuk protokormusatau sering disebut plb (protocorm like bodies) dari kalus bermacam jaringan tanaman. merupakan alat penggojok yang putarannya dapat diatur menurut kemauan kita. merupakan alat sterilisasi untuk alat dan medium kultur jarinang tanaman. Alat ini berfungsi sebagai alat untuk menimbang bahan-bahan kimia yang digunakan untuk kultur jaringan. gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan namun pisaunya dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperatur tinggi. Gelas Piala. alat ini berfungsi untuk menggojok dengan pemanas. pinset digunakan untuk memegang atau mengambil irisan eksplan atau untuk menanam eksplan Lampu Spiritus. alat ini letaknya di ruang penabur. Fasilitas Laboratorium Kultur Jaringan Fasilitas laboratorium kultur jaringan di bagi dalam beberapa bagian yang fungsinya satu sama lainnya berbeda-beda dan persyaratannya pun berbeda-beda pula. Petridish. Tabung Reaksi. – Gagang scapel. Erlenmeyer. alat ini berfungsi sebagai kompor disamping sebagai penggojok. Kertas saring. digunakan pada saat mengerjakan isolasi protoplas dan isiolasi khloroplas. Stirer.alat logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf. digunakan untuk menuangkan atau mempersiapkan bahan kimia dan air suling dalam pembuatan medium. Petridish.

Oleh karena itu dalam ruangan kultur jaringan perlu di adakan ruang ganti pakaian. tidak berkeringat dan tidak berdebu Ruang Ganti Pakaian Untuk menghindari timbulnya kontaminasi oleh mikroba. gelas ukur dan alat gelas lainnya perlu disimpan dalam almari tersendiri. Rumah Kaca (Green House) Rumah kaca adalah suatu bangunan yang atap dan sekeliling dinding bagian atasnya terbuat dari kaca.dengan demikian dibutuhkan lat untuk menimbang semua komponen bahan kimia tersebut. Peralatan yang ada antara lain keranjang-keranjang plastik untuk tempat peralatan yang baru dicuci. Oleh sebab itu. Ruang Tidak Mutlak Steril Ruang Planlet Ruangan ini menggunakan alat pendingi (AC). Penyimpanan yang tidak teratur akan mempelambat dalam pekerjaan. Kamar Mandi dan WC Ruang kultur jaringan harus dalam suasana bersih untuk menghindari kontaminasi oleh mikroba. maka para karyawan di dalam laboratorium kultur jaringan perlu memakai pakaian yang bersih. Oleh karena itu.laboratorium kultur jaringan selalu di datangi tamu baik tamu yang ingin melihat sarana dan suasana laboratorium maupun tamu ingin membeli hasil biakan kultur jaringan. Tujuan penyediaan rumah kaca adalah untuk tempat meletakkan pot-pot bibit tanaman. Di dalam ruang staf ini dapat pula di lakasanakan diskusi antar staf pada waktu berkumpul bersama. Alat-alat dari gelas seperti erlenmeyer. Bila pekerja akan memasuki ruangan penabur atau ruang inkubator. Ruang Preparasi Di dalam ruangan ini disediakan peralatan dan tempat untuk mencuci alat-alat laboratorium yang akan digunakan. maka temperatur ruangan dapat mencapai sekitar 25OC sehingga ideal bagi pertumbuhan planlet. Ruang Penimbangan dan Sterilisasi Bermacam-macam media kultur jaringan dijual dalam bentuk kemasan dengan harga yang relatif mahal. tujuannya adalah agar dapat di adakan pembagian kerja sesuai dengan spesialisasinya masing-masing. pembelian media kultur jringan. misalnya dalam mencari salah sau komponen media saja membutuhkan waktu yang lama. dan transaksi-transaksi ataupun perjanjianperjanjian kerja sama tentang penelitian dilaksanakan di dalam ruangan administrasi. Botol-botol yang berisi planlet jumlahnya dapat mencapai ratusan. Ruang Tempat Penyimpanan Bahan Kimia dan Alat-alat dari Gelas Komponen bahan kimia penyusun media kultur jaringan sangat banyak macamna. Misalnya menimbang bahan kimia makro dan mikro. Ruang Staf Laboratorium kultur jaringan membutuhkan staf peneliti dalam jumlah banyak. Ruang Inkubator Eksplan yang sudah ditanam dalam media kultur jringan perlu dipantau pertumbuhannya setiap . penyimpanannya memerlukan pengaturn yang khusus supaya mudah mecarinya. B. staf labolatorium lebih senang meramu sendiri medum tanam yang dibutuhkannya. penjualan bibit-bibit hasil biakan kultur jaringan. dalam arti baru di cuci. Bahan kimia yang mahal harganya seperti hormon tumbuh dan enzim untuk isolasi protoplas harus disimpan dala ruangan yang sejuk. Ruang Administrasi Segala surat-menyurat tentang pembelian alat-alatlboratorium. Oleh karena itu. tubuh dan pakaiannya harus bersih. dalam ruangan ini perlu disediakan rak-rak alumuniaum yang dasrnya berlobang-lobang untuk meletakkan botol-botol tersebut secara teratur dan rapi.

yaitu untuk menabur eksplan. karena tempat area kalus yaitu pada irisan .9 Metode Pelaksanaan Kultur Jaringan Metode Kultur Jaringan: 1. Ruang Shaker dan Enkas. Bila keadaan protocormus sudah keadaan demikian maka sudah siap dipindahkan kedalam media padat untuk di tumbuhkan menjadi planlet. Bila kalus ini cukup umur. C. Sedangkan media yang terlalu lembek akan menyebabkan kegagalan dalam pekerjaan. yaitu menumbuhkan suatu eksplan atau kalus dengan menggunakan media cair (media yang tidak menggunakan zat pemadat atau agar). Metode Padat (Solid Method) Metode pada dilakukan dengan tujuan mendapatkan kalus dan kemudian dengan medium diferensiasi yang berguna untuk menumbuhkan akar dan tunas sehingga kalus dapat tumbuh menjadi planlet. pada saat akan keluar lampu neon di matikan dan setelah keluar menutup daun pintu kembali lampu ultra violet dinyalakan. Ruang inkubator harus memiliki suhu kurang lebih 25OC dan harus dilengkapi dengan lampu-lampu neon. Sebaiknya. yaitu ruang inkubator.hari. kegunaan enkas ini sama dengan Laminar Air Flow Cabinet. Sterilisasi ruangan dilakukan dengan cara menyemprotkan alkohol 96% dengan hand-sprayer. Ruang Mutlak Steril Ruang Penabur Ruang penabur biasanya di buat dengan ukuran yang tidak terlalu besar. agar-agar bubuk. yaitu 2×3 m2. Hasil pertumbuhan kalus ini adalah berupa protokormus atau dalam istilah asing disebut plb (protocorm like bodies). karena eksplan yang ditumbuhkan dalam ruangan inkubasi membutuhkan temperatru dan cahaya yang dapat diatur dan disesuaikan dengan jenis eksplannya. Dengan demikian steril ruangan dapat dijamin. sehingga sterilisasi mudah dilakukan. II. Untuk pemantauan ini perlu ruangan khusus yang keadaannya lebih steril dari ruang planlet. Dilihat dari Macam Media Tanam Teknik kultur jaringan dapat dilaksanakan dengan dua metode yaitu: a. Bentuk protocormus adalah bulat-bulat padat dan berwarna hijau. tujuannya adalah agar pelaksanaan sterilisasi ruangannya tidak membutuhkan waktu yang lama dan tidak mengalami kesulitan. sebab akar sulit untuk menembus ke dalam media. kemudian digojok di atas shaker. Sedangkan sterilisasi lantai dengan menggunakan kain pel yang dibasahi alkohol 96%. Dinding ruang penabur dilengkapi dengan porselin. lampu ultra violet harus dimatkan terlebih dahulu kemudian menyalakan lampu neon biasa dan calon penabur diperbolehkan memasuki ruangan tersebut. Eksplan yang baru ditanam dan diinkubasikan dalam ruang inkubator akan menghasilkan kalus. Bila saat calon penabur akan memasuki ruangan. maka dapat diperlukan suspensi sel. Sterilisasi ini mutlak harus dilakukan menjelang ruang penabur akan digunakan. Enkas juga sering di letakkan dalam satu ruang dengan shaker. Kegagalan dapat berupa tenggelamnya eksplan yang ditanam. Zat pemadat tersebut dapat berupa agar-agar batangan. atau agar-agar kemasan kaleng yang yang memang khusus digunakan untuk media padat untuk kultur jaringan. Media padat adalah media yang mengandung semua komponen kimia yang dibutuhkan oleh tanaman dan kemudian dipadatkan dengan menambahkan zat pemadat. Eksplan yang tenggelam tidak akan dapat tumbuh menjadi kalus. Media yang terlalu padat akan mengakibatkan akar sukar tumbuh.

untuk menumbuhkan planlet dari protokormus stelah dipindahkan dari suspensi sel. Metode padat dapat digunakan untuk metode kloning. Media cair dapat bersifat tenang atau dalam kondisi selalu bergerak. karena untuk menumbuhkan kalus langsung dari ekspaln sangat sulit sehingga keberhasilannya sangat kecil dan hana tanaman-tanaman tertentu yang dapat berhasil. Media cair adalah nutrisi yang dilarutkan di air. eksplan atau kalus yang sudah waktunya untuk dipindahkan ke dalam media tanam yang baru harus segera dilaksanakan. b.10.Tahapan Kultur Jaringan Pelaksanaan teknik ini memerlukan berbagai prasyarat pendukung kehidupan jaringan yang dibiakkan. Media padat pada umumnya berupa padatan gel. Oleh karena itu.(jaringan yang luka) tertutup oleh medium. tergantung kebutuhan. seperti agar. Nutrisi dicampurkan pada agar. 2) Kultur antera 3) Kultur endosperma 4) Kultur suspensi sel 5) Kultur protoplas 6) Kultur embrio 7) Kultur spora 8) Dan lain-lain 3. Media cair juga tidak memerlukan zat pemadat sehingga keadaannya tetap berupa larutan nutrein. II. Pembuatan media cair jauh lebih cepat daripada media padat. Dilihat dari Cara Pemeliharaan Eksplan yang telah ditanam. agar dapat tumbuh menjadi kalus dan kemudian menjadi planlet. maka metode kultur jaringan yang telah dikenal sekarang antara lain adalah: 1) Kultur meristem. Yang paling esensial adalah wadah dan media tumbuh yang steril. tidak boleh sampai terlambat. penggunaan media cair lebih ditekankan untuk suspensi sel. Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh dan mengambil nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan. 2. Media tumbuh menyediakan berbagai bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya. karena setiap tahapan pekerjaan tersebut memerlukan penanganan tersendiri dengan dasar pengetahuan tersendiri. Artinya. yaitu: . Ada dua penggolongan media tumbuh: media padat dan media cair. Pelaksana harus bekerja dengan teliti dan serius. untuk menumbuhkan protoplas stelah diisolasikan. Metode Cair(Liquid Metho) Penggunaan metode cair ini kurang praktis dibandingkan dengan metode padat. karena kita tidak p erlu memanaskannya untuk melarutkan agar-agar. yaitu untuk menumbuhkan plb (prtocorm like bodies). Dari protokormus ini nantinya dapat tumbuh menjadi planlet apabila dipindahkan kedalam media padat yang sesuai. membutuhkan pemeliharaan yang rutin dan tepat. dan untuk menumbuhkan planlet dari prtoplas yang sudah difusikan (digabungkan). Dilihat dari Bahan atau Eksplan yang Dipakai Bila dilihat dari macam bahan yang digunakan. Pemindahan yang terlambat dapat menyebabkan pertumbuahn eksplan atau kalus dapat terhenti atau dapat mengalami brownig atau terkontaminasi oleh jamur atau bakteri. Tahapan tersebut.

Tahapan pembuatan media kultur:      Persiapan bahan Formulasi Pengukuran pH (5. 1976). Ini mengusahakan kultur yang aseptik atau aksenik. Cu. Sterilisasi Sterilisasi adalah proses pembebasan dari mikroorganisme. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Mo. Ca. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Zn.5 % dll – direndam dalam bahan sterilant – sterilisasi dalam laminar – tanaman dipro-kondisi c. Co) .8) Pemberian agar-agar dan pemanasan media Penuangan dan penutupan media -> sterilisasi Kandungan nutrisi dalam agar-agar : 1. gula. tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Sterilisasi bahan tanaman Tanaman induk – sterilisasi bahan tanam/eksplan menggunakan detergen. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral. Dalam tahap ini juga diharapkan bahwa eksplan yang dikulturkan akan menginisiasi pertumbuhan baru. 2. b. vitamin. K. Selain itu. Mg) Mikro nutrient (Mn. baik jenisnya maupun jumlahnya. dan lain-lain. menghambat pertumbuhan atau bahkan dapat mematikan jaringan eksplan. alcohol. 1976). Masalah yang sering dihadapi pada kultur tahap ini adalah terjadinya pencokelatan atau penghitaman bagian eksplan (browning). Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoclave. mineral :   Makro nutrient (N. Pembuatan media kultur Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.a.7-5. sedangkan aksenik berarti bebas dari mikroorganisme yang tidak diinginkan. diperlukan juga bahan tambahan seperti agar. kloroks 0. dan hormon. Hal ini disebabkan oleh senyawa fenol yang timbul akibat stress mekanik yang timbul akibat pelukaan pada waktu proses isolasi eksplan dari tanaman induk. P. Inisiasi Kultur Tujuan utama dari propagasi secara in-vitro tahap ini adalah pembuatan kultur dari eksplan yang bebas mikroorganisme serta inisiasi pertumbuhan baru (Wetherell. Senyawa fenol tersebut bersifat toksik. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi. Aseptik berarti bebas dari mikroorganisme.untuk perbanyakan (multiplikasi) pada kultur tahap selanjutnya (Wetherell. Sterilisasi peralatan gelas dan stainless dalam suhu 121o di dalam autoklaf. Tujuan sterilisasi yaitu untuk menciptakan kondisi kultur yang steril. sehingga akan memungkinkan dilakukannya pemilihan bagian tanaman yang tumbuhnya paling kuat. Tahapan Sterilisasi: 1.

5 18. dan varietasnya serta harus sehat dan bebas dari hama dan penyakit. KNO3 1900 3. vitamin (B dan C) 4. Glisin 2 20. Niasin 0.2 11. KH2PO4 170 6. MgSO4+7H20 370 5. FeSO4+7H20 27 7.7H2O 8. Syarat eksplan yang baik:  Berasal dari induk yang sehat dan subur  Berasal dari induk yang diketahui jenisnya  Tempat tumbuh pada lingkungan yang baik  Ukuran tunas optimal sekitar 5 cm tingginya  Tunas langsung diproses sesegera mungkin Tahapan sub kultur:  Induksi tunas Tanaman tersebut harus jelas jenis. MnSO4+4H20 22.6 10.3 8.5 17.1 19. CuSO4+5H20 0.83 12. spesies. CoCl2+6H20 0.025 14. hormon Komposisi media Murashige dan Skoog (MS) Bahan Kimia Konsentrasi Kimia (mg/l) 1. Tiamin-HCL 0. tanaman ditanam pada media tanam di laminar air flow menggunakan alat-alat yang steril. Myoinositol 100 16.25 13. CaCL2+2H20 440 4. Penanaman eksplan Melalui sub kultur atau transfer.025 15. Sukrosa 30000 d. Na2MoO4+2H20 0. NH4NO3 1650 2. Piridoksin-HCL 0.2. karbohidrat (gula) 3. Na 37. protein 5. H3BO3 6. KI 0. ZnSO4.3 9. Tanaman indukan sumber eksplan tersebut harus dikondisikan dan dipersiapkan secara khusus di rumah kaca atau greenhouse agar eksplan yang akan dikulturkan .

Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Tabung yang telah ditanami eksplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar. Proses perakaran pada umumnya berlangsung selama 1 bulan. Ini dilakukan untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Dan pada saat itu planlet sudah mencapai tinggi 20 – 25 cm.  Inkubasi Pada tahap inkubasi. maka di dalam ruangan tersebut dipasang Air Conditioner (AC).sehat dan dapat tumbuh baik serta bebas dari sumber kontaminan pada waktu dikulturkan secara in-vitro.  Multiplikasi tunas Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif. Suhu yang sesuai untuk pertumbuhan kultur adalah antara 24–28oC.11. Setelah itu tanaman perlu ditumbuhkan di nursery sampai mencapai tinggi 50 – 60 cm kemudian dipindahkan ke lapangan II. eksplan ditempatkan di ruang/lingkungan yang terkendali (untuk duji keberhasilannya). Selanjutnya bibit siap ditumbuhkan dalam polibag. Untuk mengkondisikan ruang inkubasi pada suhu yang diinginkan. Pada saat aklimatisasi ini umumnya 2 minggu dengan sungkup dan 4 minggu tanpa sungkup. Untuk pengakaran digunakan media MS + NAA. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri). yaitu dengan memberikan sungkup. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap.  Aklitimasi Aklitimasi merupakan proses adaptasi/pemindahan tanaman dari lingkungan dalam ke lingkungan luar (dari lingkungan yang terkendali ke lingkungan yang tidak terkendali).  Pengakaran Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik.Faktor yang Mempengaruhi Proses Regenerasi .

Bila kita terpaksa harus membeli medium yang sudah jadi (dalam kemasan) jelas akan sangat mahal. pucuk adventif. Benziladenin (BA). Terdapat 13 komposisi media dalam kultur jaringan. sebab medium yang sudah jadi masih harus di impor dari luar negeri. TIBA. Pekerjaan kultur jaringan meliputi: persiapan media. Di samping itu. karena pelaksanaan teknik kultur jaringan tanaman memerlukan keterampilan khusus dan harus dilatar belakangi dengan ilmu pengetahuan dasar tentang fisiologi tumbuhan. anatomi tumbuhan. Paclobutrazol. Biaya untuk mewujudkan perbanyakan tanaman secara in vitro ini juga sangat mahal. kecuali kita meramu medium sendiri. . Pelaksana harus bekerja dengan teliti dan serius.Kendala dan Masalah Melakukan Kultur Jaringan Teknik kultur jaringan sampai saat ini memang belum biasa dilaksanakan oleh para petani.12. Bentuk Regenerasi dalam Kultur In Vitro: pucuk aksilar. letak pada cabang. batang muda. embrio. hipokotil. Apalagi kita harus membeli saran untuk perlakuan isolasi dan fusi protoplas. antara lain: Murashige dan Skoog (MS). dan seks (jantan/betina). dll. pelaksanaan teknik kultur jaringan mutlak memerlukan laboratorium khusus.4-D. namun tetap memerlukan peralatan yang memadai. Media yang sering digunakan secara luas adalah MS. karena setiap tahapan pekerjaan tersebut memerlukan penanganan tersendiri dengan dasar pengetahuan tersendiri. Thidiazuron. 2. Karena semua pekerjaan harus dilaksanakan secara hati-hati dan cermat serta memerlukan kesabaran yang tinggi. dan ukuran wadah kultur. panjang penyinaran. 4. Bagian tanaman yang dapat digunakan sebagi eksplan adalah pucuk muda. pembentukan protocorm like bodies. anther. Faktor eksplan yang penting adalah genotipe/varietas. Media Tumbuh. Napthalene Acetic Acid (NAA). Zeatin. Lingkungan Tumbuh Lingkungan tumbuh yang dapat mempengruhi regenerasi tanaman meliputi temperatur. CPA dan Indole Acetic Acid (IBA). isolasi bahan tanam (eksplan). inokulasi eksplan. II. embrio somatik. kotiledon. aklimatisasi dan usaha pemindahan tanaman hasil kultur jaringan ke lapang. kualitas sinar. dan CCC. Zat Pengatur Tumbuh Tanaman Faktor yang perlu diperhatikan dalam penggunaan ZPT adalah konsentrasi. umur eksplan. walaupun dapat di usahakan secara sederhana (dalam ruang yang terbatas). 5. dan bentuk fisik media. Dengan demikian jelas akan amat sulit untuk diterima oleh kalangan petani biasa. Kemungkinan lain petani akan merasa enggan bekerja secara aseptik. Enzim-enzim yang digunakan dalam kultur jaringan juga masih dibeli dari luar negeri seperti Jepang. biologi. endosperm. Eksplan Merupakan bagian tanaman yang dipergunakan sebagai bahan awal untuk perbanyakan tanaman. Anderson dll. Golongan Gibberelin seperti GA3. urutan penggunaan dan periode masa induksi dalam kultur tertentu. Di dalam media tumbuh mengandung komposisi garam anorganik. zat pengatur tumbuh. intensitas penyinaran. dan PBA. Lepas semua dari kendala-kendala tersebut diatas. 2I-P. sterilisasi eksplan. Golongan zat penghambat tumbuh seperti Ancymidol. Golongan Sitokinin seperti Kinetin. tentu biayanya akan bertambah besar. Knop. kita harus mengakui bahwa teknik kultur jaringan sangat bermanfaat bagi dunia ilmu pengetahuan. ovari muda. baru beberapa kalangan pengusaha swasta saja yang sudah mencoba melaksanakannya.1. terutama untuk pengembangan bioteknologi. Jenis yang sering digunakan adalah golongan Auksin seperti Indole Aceti Acid(IAA). daun muda.. Woody Plant Medium (WPM). kimia dan pertanian. Knudson-C. 3. dll 2.

Lakukan proses penanaman bahan pada keadaan anda nyaman dan cari waktu yang longgar. jamur. Pertrumbuhan batang cenderung ke arah penambahan diameter Tanaman utuhnya menjadi sangat turgescent. . Adapun masalah-masalah yang terjadi dalam kultur jaringan yaitu: 1) Kontaminasi Kontaminasi adalah gangguan yang sangat umum terjadi dalam kegiatan kultur jaringan. Pada daunnya tidak memiliki jaringan pallisade.Masalah-masalah Dalam Kultur Jaringan Dalam kegiatan kultur jaringan. variasi terjadi karena terjadinya sub kultur berulang yang tidak terkontrol Penggunaan teknik yang tidak sesuai. keragaman tersebut dapat dilihat dari jenis kontaminasinya (bakteri. media atau hormon. dan bukan sebagai upaya pemuliaan tanaman maka variasi genetik adalah kendala. Munculnya gangguan ini bila dipahami secara mendasar adalah merupakan sesuatu yang sangat wajar sebagai konsekuensi penggunaan yang diperkaya. Pencoklatan umumnya merupakan suatu tanda-tanda kemunduran fisiologi eksplan dan tidak jarang berakhir pada kematian eksplan. Peristiwa pencoklatan sesunggguhnya merupakan peristiwa alamiah yang biasa yang sering terjadi. Variasi genetik yang paling umum terjadi pada kultur kalus dan kultur -suspensi sel. virus. Tanaman yang dihasikan pendek-pendek atau kerdil.. tidak sedikit masalah-masalah yang muncul sebagai pengganggu dan bahkan menjadi penyebab tidak tercapainya tujuan kegiatan kultur yang dilakukan. 2) Pencoklatan/browning Pencoklatan adalah suatu karakter munculnya warna coklat atau hitam yang sering membuat tidak terjadinya pertumbuhan dan perkembangan eksplan. maupun dari manusianya. dll). Gangguan kultur secara umum dapat muncul dari bahan yang ditanam. dari lingkungan kultur. hal tersebut terjadi karena munculnya sifat instabilitas kromosom mungkin akibat teknis kultur. 4) Variabilitas Genetik Bila kultur jaringan digunakan untuk upaya perbanyakan tanaman yang seragam dalam jumlah yang banyak. 3) Vitrifikasi Vitrifikasi adalah suatu istilah problem pada kultur yang ditandai dengan: Munculnya pertumbuhan dan pertumbuhan yang tidaknormal. Untuk yang tidak dapat diprediksi. Upaya mencegah terjadinya kontaminsi:    Biasakan membersihkan berbagai sarana yang diperlukan dalam kultur jaringan. Fenomena kontaminasi sangat beragam. Permasalahan dalam kultur ada yang dapat diprediksi sebelumnya dan ada pula yang sulit diprediksi kejadiannya. cara mengatasinya tidak dapat secara preventif tetapi diselesaikan setelah kasus itu muncul. Variasi genetik dapat terjadi pada kultur in vitro karena: Laju multiflikasi yang tinggi. Yakinkan bahwa proses sterilisasi media secara baik dan benar.

mata tunas. Faktor eksplan yang perlu . kultur jaringan merupakan suatu tehnik membiakkan sel atau jaringan ke dalam media kultur. tahapan pembentukan kalus harus dilanjutkan dengan mendorong induksi embriosomatik dari sel-sel kalus. fisik. potensi gangguan. Prapelakuan dilakukan umumnya untuk tujuan-tujuan tertentu. membelah. karena dari kondisi medialah suatu sel dapat atau tidak terdorong melakukan proses pembelahan dan pembesaran dirinya. pertumbuahn dan perkembangannya dlama botol saja tetapi juga sangat bisa dipengaruhi oleh persyaratan kegiatan prapelakuan. Pada kasus ini masalah akan muncul bila kegiatan prapelakuaan tidak dilakukan.1. suhu yang terlalu rendah aatau tinggi dapat mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan pada eksplan. 7) Lingkungan Mikro Masalah lingkungan inkubator juga tidak bisa diabaiakan karena ini juga sering menjadi masalah. yaitu sel atau irisan jaringan tanaman yang akan menjadi benih tanaman yang baru nanti setelah di kultur jaringan. namunddemikian solusinya sulit dilakukan mengingat umumnya ruangan inkubator suatu ruangan laboratorium kultur jaringan tidak bisa dibuat variasi antara satu ruangan dengan bagian ruangan yang lainnya. 6) Praperlakuan Masalah pada kegiatan in vitro bukan hanya dari penanaman eksplan saja.Kesimpulan Pada dasarnya. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan mengisolasi bagian tanaman seperti daun. Hambatan berupa bahan kimia penanganannya harus dimulai dari pengenalan senyawa aktif. Karena awal pertumbuhan eksplan akan dimulai dari selsel yang muda yang aktif membelah. secara umum adalah dalam rangka menghilangkan hambatan. Suhu ruangan inkubator sangat menentukan optimasi pertumbuhan eksplan. Media juag dapat menjadi sebab terjadinya stagnasi pertumbuhan. Pada proses klutur jaringan yang bersifa inderict embriogenesis. BAB III PENUTUP III. proses reaksi dan alternatif pengelolaannya.Cara mengatasi masalah variasi genetik tentunya tidak sederhana. Untuk menghindari hal itu dapat dilakukan dengan preventif menghindari bahan tanam yang tidak juvenil atau tidak meristematik. atau dari sel-sel tua yang muda kembali. dari mulai tanam hingga kurun waktu tertentu tidak mati tetapi tidak tumbuh. Sehingga optimasi pertumbuhan tidak bisa diharapkan sama antara kultur yang satu dengan kultur yang lain. sehingga tumbuh. Dalam kultur jaringan digunakan eksplan. serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptic yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril. 5) Pertumbuhan dan Perkembangan Masalah utama berkaitan dengan proses pertumbuhan adalah bila eksplan yang ditanam mengalami stagnasi. Hambatan apat berupa hambatan kemikalis. harus memperhatikan aspek yang dikulturkan. dan menghasilkan tumbuhan baru dengan cepat dan memiliki sifat yang sama dengan induknya. biologis. Kebutuhan antara satu tananaman dengan tanaman yang lain berbeda. Terjadinya embrio somatik dapat secara endogen atau eksogen.

Totipotensi artinya kemampuan setiap sel tumbuhan untuk menjadi individu yang sempurna atau untuk beregenerasi menjadi tanaman lengkap kembali. Teori Totipotensi Sel (Total Genetic Potential). kotiledon. Aklitimasi Peralatan Kultur Jaringan:              Laminar Air Flow Cabinet (LAFC) Entkas Shaker Autoklaf Timbangan Analitik Stirer Erlenmeyer Gelas Ukur Gelas Piala Petridish Pinset dan Scalpel Lampu Spiritus Tabung Reaksi Faktor yang Mempengaruhi Proses Regenerasi 1. hipokotil. Penanaman eksplan e.diperhatikan adalah genotipe/varietas. 2. ovari muda.karena seluruh bagian tanaman terdiri atas jaringan – jaringan hidup. Sterilisasi c. Sel dari suatu organisme multiseluler dimana pun letaknya. Pembuatan media kultur d. batang muda. Inisiasi kultur b. yaitu bahwa setiap sel tanaman yang hidup dilengkapi dengan informasi genetik dan perangkat fisiologis yang lengkap untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman utuh. dan sifat Totipotensi. Teori ini mempercayai bahwa setiap bagian tanaman dapat berkembang biak. letak pada cabang. sehingga tumbuhan yang bersifat Autonom akan dapat mengatur aktvitas yg dilakukannya sendiri. umur eksplan. Tanaman yang dimanfaatkan dalam kultur jaringan harus memiliki sifat Autonom. artinya setiap sel memiliki potensi genetik seperti zigot yaitu mampu memperbanyak diri dan berediferensiasi menjadi tanaman lengkap. Sedangkan Tahap-tahap pada kultur jaringan tanaman yaitu : a. sebenarnya sama dengan sel zigot karena berasal dari satu sel tersebut (Setiap sel berasal dari satu sel). Prinsip dasar Kultur Jaringan yaitu : a. Bagian tanaman yang dapat digunakan sebagai eksplan adalah pucuk muda. daun muda. Inkubasi f. jika kondisinya sesuai. Jadi sifat totipotensi ( total genetic potential) sel. b. dll. dan seks (jantan/betina). Bentuk Regenerasi . endosperm. anther. 1. Autonom artinya dapat mengatur aktivitas hidup sendiri. embrio.

Saya menyarankan kepada pemerintah. Hal ini dikarenakan kurangnya dana dan fasilitas.Saran Pelaksanaan kultur jaringan di Indonesia belum cukup banyak dilakukan. Saya harap saran dipertimbangkan.. Drs. Lingkungan Tumbuh Masalah-masalah yang dapat terjadi dalam kultur jaringan:        Kontaminasi Pencokelatan/browning Vitrifikasi Variabilitas Genetik Masalah dalam pertumbuhan dan perkembangan eksplan Masalah dalam properlakuan Masalah dalam lingkungan mikro III. Surakarta: Aspirasi. Media 4. Juga kepada SMAN 1 Purwakarta. Zat Pengatur Tumbuh Tanaman 5. .A.2. untuk mengagendakan pembuatan laboratorium kultur jaringan di masa yang akan datang supaya para murid dapat dengan mudah mempraktekkan teori yang didapat mengenai kultur jaringan. D. Biologi. 2007. Biologi. Hapsoro. dkk.2. sebaiknya pemerintah ikut memperhatikan masalah mengenai pertanian terutama dalam metode kultur jaringan yang seharusnya dapat menghasilkan keberhasilan yang besar. Eksplan 3. LAMPIRAN Laminar Air Flow Tempat penanaman eksplan dilakukan Autoklaf Tempat pensterilan media kultur Tahap Sterilisasi Tahap induksi tunas Tahap Multiplikasi Tunas Tahap Inkubasi Tunas Eksplan mulai berakar dan siap di aklitimasi DAFTAR PUSTAKA Pratiwi. Jakarta: Erlangga.

sterilisasi dan penyimpanan .com/ Blogspot http://rsf-gudangilmu.: . serta rak atau lemari penyimpanan alat.blogspot. ruang untuk tempat oven pengering. meja kerja yang terbuat dari bahan yang tahan terhadap asam dan basa.Ruang pencucian .Ruang persiapan media.Catatan hasil study tour ke Mekarsari. .html http://hamdan-motor. rak pengering dan mempunyai saluran untuk air demineralisasi atau destilasi.Ruang pengamatan dan koleksi data Diagram laboratorium kultur jaringan dapat dilihat pada gambar B-2. Ruang Pencucian Ruang pencucian harus mempunyai bak cuci.com/2009/11/kultur-jaringan-dan-teori-totipotensi. a.com/2008/07/kultur-jaringan. 26 Oktober 2010 SITUS WEB Google http://www.wordpress.html Wikipedia 1.Ruang kultur atau inkubator yang lingkungannya terkontrol .blogspot.1. Organisasi Dalam Laboratorium Kultur Jaringan Di setiap laboratorium dimana teknik kultur jaringan digunakan harus mempunyai sejumlah fasilitas yang mencakup al.google.com/ Search engine WordPress http://thafransisca.Ruang transfer aseptik . alat/mesin pencuci dan pengering.

jamur.). Ruang Kultur Semua jenis kultur harus disimpan dalam tempat yang terkontrol baik temperatur. dengan menggunakan karbon aktif untuk menghilangkan kontaminan organik dan bebas klorine. oven dan autoclave untuk sterilisasi mdia. distiling unit. dll. gelas kultur dan penutupnya. mikroorganisme (algae. Peralatan lain yang biasanya ada di ruang persiapan dan pembuatan media antara lain alat vaccum. dan bahan organik dan mempunyai konduktivitas elektrik kurang dari 1. klorida. Ruang Persiapan Media Di dalam ruang persiapan media harus tersedia tempat untuk penyimpanan bahan-bahan kimia. Oleh karena itu pemindahan atau transfer biakan dikerjakan dalam ruang transfer steril atau laminar air flow. bunsen.0 µmho/cm. magnesium natrium. peralatan gelas dan peralatan lain. mikrowave. Metode-metode lain yang dapat digunakan untuk mendapatkan air murni type II adalah (1) penyaringan dengan cara absorpsi. Deionisasi menghilangkan dari bahan yang bersifat ionik dan proses destilasi menghilangkan molekul-molekul organik. Meja yang kokoh atau ”bench” untuk penyimpanan ”hot plate magnetic stirrer”.97 – 99. Faktor-faktor lingkungan tersebut akan mempengaruhi proses pertumbuhan dan diferensiasi biakan baik secara langsung maupun tidak . bahan organik dan bahan partikulat. kalsium. d. anion-anion (bikarbonat. HEPA filter harus mempunyai pori sekitar 0. yang menghilangkan sekitar 99% bakteri. bahanbahan kimia yang digunakan harus yang bertaraf analitik dan penimbangannya harus baik dan benar. kompor gas.b. dan peralatan gelas yang diperlukan untuk pembuatan media. c. nitrogen) dan bahan-bahan lain (minyak. mikroorganisme dan pirogen. dalam pembuatan media harus dilakukan tahap demi tahap dan bahanbahan yang digunakan harus di ”checklist”. sirkulasi udara. dan dispenser harus tersedia. Penyaring udara harus mempunyai filter udara dengan efisiensi tinggi atau ”highefficiency particulate air (HEPA filter). dan (3) reverse osmosis. Agar lebih akurat. Didalam pembuatan media kultur. Ruang Transfer Teknik kultur jaringan dapat berlangsung dengan sukses apabila dilakukan dibawah kondisi laboratorium yang sangat bersih. Air ledeng atau sumur tidak digunakan untuk pembuatan media karena mengandung kation-kation (amonium. fosfat.99%. CO2. refrigerator (kulkas) dan freezer untuk penyimpanan larutan stok dan bahan kimia.). Air yang digunakan dalam kultur jaringan harus mempunyai standar type II (minimum) yaitu bebas pirogen. Air yang digunakan dalam pembuatan media harus berkualitas tinggi yang mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi. timbangan. bakteri). Laminar air flow yang digunakan dalam kultur jaringan tanaman adalah tipe horizontal dan dirancang dengan mempunyai ruangan yang bebas dari partikel debu yang halus dan dilengkapi dengan sinar ultra violet (UV) serta unit penyaring udara. (2) penyaringan dengan membran.). flourida. Semua permukaan ruang kerja dalam laminar harus dirancang dan mempunyai konstruksi sedemikian rupa sehingga debu dan mikroorganisme tidak dapat berakumulasi dan permukaan tempat kerja dapat mudah dibersihkan dan diidisinfeksi. kelmbaban maupun kualitas dan lamanya cahaya. pH meter. besi. dll. gambar Metoda yang paling umum untuk pemurnian air standar type II adalah dengan deionosasi yang diikuti dengan satu atau dua destilasi gelas. gas-gas (oksigen. bahan organik dll. gas.3 µm dengan efisiensi kerja berkisar 99. yang menghilangkan bahan-bahan partikulat dan kontaminasi oleh bakteri.

125. Peralatan gelas tesebut harus tahan panas selama proses sterilisasi dengan oven atau autoclave. semua bahan yang ditimbang harus dilakukan dengan hati-hati meskipun untuk pembuatan media dalam skala komersial. Pipet ukur 16. Bahan kimia yang diperlukan untuk pembuatan media (Lampiran) 20. erlenmeyer) atau stainless steel untuk memanaskan dan melarutkan media 3. Suhu ruang kultur untuk pertumbuhan umumnya berkisar antara 15o – 30oC. suspensi sel dan kultur anther adalah yang paling sensitif terhadap kondisi lingkungan. kebersihan dan keamanan saat bekerja dengan teknik kultur jaringan. Gelas ukur gradual 7. cawan petri. Penimbangan Pada saat pembuatan media. 1000 atau 2000 ml) digunakan untuk wadah kultur dan pembuatan media. Prosedur Dasar Laboratorium Umumnya penggunaan operasional di lab perbanyakan tanaman dengan kultur jaringan dapat dipelajari dengan mudah. Peralatan dan Bahan Dasar Dalam Laboratorium Kultur Jaringan Peralatan yang diperlukan dari suatu laboratorium umumnya adalah sbb. Alat diseksi (spatula. Ventilasi udara harus baik dengan kelembaban berkisar 20-98%. Laminar air flow 18. 2. scalpel (pinset). Oven 13. Alat sterilisasi dengan tekanan uap (autoclave) 4.5oC.: 1. botol jam atau bekas selai juga sering digunakan sebagai botol kultur. akan tetapi kisaran suhu yang lebih besar mungkin diperlukan untuk tujuan percobaan. Ruang kultur harus mempunyai pencahayaan hingga 10. Timbangan (analitical dan bench top loading) 6. Tabung gelas.langsung. dengan fluktuasi kurang dari ±0. Mikroskop 15. Dll. Kultur protoplas. gunting) 10. Microwave 14. Shaker 17. Peralatan gelas (gelas ukur. Hal yang paling perlu diperhatikan adalah akurasi. . Peralatan gelas yang digunakan di lab kultur jaringan umumnya terbuat dari Pyrex. Erlenmeyer dari berbagai ukuran (50. 3. 250. Peralatan gelas lain yang biasanya digunakan adalah gelas piala. Refrigerator 11. forcep. Dispenser 9. Distiling unit atau water deionizer 12.000 lux. gelas ukur. pH meter 5. Setiap penggunaan timbangan atau alat-alat lain harus memperhatikan instruksi dari pabrikannya. Hot plate/magnetic stirrer atau kompor 2. pipet dan labu ukur. Botol kultur dengan penutupnya 8. Suhu dan cahaya harus dapat diprogram selama 24 jam. Disinfectant 19. 500.

dikeringkan dalam oven pada suhu 150oC dibungkus dengan aluminium foil. Spora jamur sangat ringan dan ada disekeliling lingkungan. Ruang kultur harus dibersihkan dengan sabun kemudian dilap dengan Na-hypoklorit 2% (merek komersial seperti Sunclin. Membersihkan peralatan gelas Metoda konvensional pencucian peralatan gelas dilakukan dengan merendam gelas dalam larutan asam kromat yang diikuti pembilasan dengan air kran dan air destilasi. Sterilisasi Ruang Kultur dan Transfer Sterilisasi ruang kultur yang paling baik adalah dilakukan dengan penggunaan sinar ultraviolet (UV). stabil. 25. (ii) daerah sekitar penimbangan harus terjaga kebersihannya. Waktu sterilisasi bervariasi tergantung dari ukuran ruang transfer itu sendiri dan harus dilakukan apabila tidak ada kegiatan dalam ruang tersebut. maka akan terjadi kontaminasi.Jenis timbangan yang sering digunakan di lab antara lain top-loading balance dan analytical balance yang memungkinkan akurasi penimbangan hingga skala milligram. penimbangan jangan sampai pernah overload. Ruang kerja dalam laminar flow biasanya sudah dilengkapi dengan lampu UV. Cairan dihisap kedalam pipet dengan menekan tombol bagian atas dan melepaskan cairan dengan menekan tombol bagian bawah. Pencucian yang lebih aman adalah dengan air panas (>70oC) + sabun. Bayclin atau pembersih lantai lain yang . Karena asam kromat dapat menyebabkan korosif. Peralatan gelas yang telah dicuci. sehingga sterilisasinya dilakukan dengan UV dan diikuti dengan membasuh/melap permukaan tempat bekerja dalam laminar dengan alkohol 95% sebelum mulai bekerja. 100 dan 1000 ml banyak digunakan untuk mengukur volume. Penggunaan pipet harus dibantu dengan alat penghisap larutan (pipetor). a. diikuti dengan pembilasan dengan air panas dan air destilasi. (iii) alat penghisap dengan bantuan pompa udara secara elektrik. Ruang transfer dapat juga disterilisasi dengan mencuci/mengepel 1-2 kali setiap bulan dengan bahan anti jamur (fungisida) komersial. (iv) pipet mikro. biasanya untuk pengambilan larutan dengan volume yang sangat kecil (mikro liter). (iv) penimbangan disarankan menggunakan wadah atau alas yang ringan atau kertas daripada menempatkan bahan yang ditimbang secara langsung di atas piring timbangan. Pengukuran larutan dengan menggunakan pipet dan labu ukur hanya akan akurat apabila bagian dasar dari cekungan antara air dan udara berada tepat pada tanda pengukuran. Gelas ukur kapasitas 10. tetapi pengukuran yang lebih akurat diperlukan labu ukur dan pipet. (ii) pipet penghisap yang dioperasikan menggunakan roda kecil pada bagian atas alat penghisap. kemudian disimpan dalam lemari tertutup. Apabila spora jamur kontak dengan media kultur dan kondisinya optimal untuk perkecambahan jamur. permukaannya rata yang bebas getaran dan kebocoran. maka cara ini banyak ditinggalkan kecuali untuk peralatan gelas yang terkontaminasi tinggi. Beberapa persyaratan yang harus diperhatikan agar diperoleh penimbangan yang akurat adalah (i) timbangan harus ditempatkan pada tempat yang keras. Sterilisasi Bagian yang sangat penting dalam teknik in vitro adalah sterilisasi bahan tanaman dan media dan menjaga kondisi aseptik yang telah dicapai. (iii) yang terpenting lagi. Pengukuran cairan/larutan Peralatan gelas yang mempunyai ukuran seperti gelas piala. erlenmeyer dan pipet diperlukan untuk pembuatan media. Radiasi UV sangat berbahaya bagi mata dan kulit. Bakteri dan jamur adalah dua kontaminan yang paling banyak dijumpai dalam kultur. Jangan pernah menggunakan mulut untuk memipet. Jenis-jenis pipetor yang umum digunakan antara lain (i) tipe bola penghisap yang dilengkapi dengan beberapa katup pengontrol.

Sterilisasi Media Ada dua metoda untuk sterilisasi media yang umum digunakan. Filter Millipore yang mempunyai porositas ± 0. Untuk volume larutan per wadah yang sedikit (< 100 ml). pipet. Sterilisasi Bahan Tanaman . peralatan gelas. asam amino. aluminium foil atau plastik. tutup plastik. (iii) kedua larutan yang sudah disterilisasi dengan metoda yang berbeda tersebut digabungkan dalam kondisi aseptik. Teknik ini disebut sterilisasi pembakaran (flame sterilization). b. air. vitamin. ekstrak tanama. dll. pakaian lab. Teknik ini harus dilakukan dengan ekstra hati-hati karena alkohol sangat mudah terbakar. Autoclave adalah metoda sterilisasi dengan menggunakan tekanan uap air. d d. (ii) pada bagian lain dalam kondisi yang steril. aluminium foil. c. Hampir semua mikroba dapat mati bila diautoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 15 psi selama 15-20 menit. tetapi jangan menggunakan kertas karena akan akan terdekomposisi pada suhu 170oC. Tekanan jangan melebhi dari 20 psi karena dapat mengakibatkan dekomposisi karbohidrat dan bahan lain dalam media yang bersifat thermolabile. dan media kultur. Bahan-bahan atau alat yang dapat disterilisasi dengan cara autoclave ini antara lain kapas penutup tabung. hormon dan karbohidrat ada yang bersifat thermolabile yang mungkin akan mengakibatkan dekomposisi bila disterilisasi dengan autoclave. Akan tetapi. Peralatan gelas yang akan menampung media yang disterilisasi dengan filter harus sudah disterilisasi dahulu dengan autoclave. Peralatan yang terbuat dari metal. larutan dari bahan-bahan yang bersifat tidak stabil (heat-labile) harus menggunakan filter. Sterilisasi dengan menggunakan autoclave tidak dsarankan untuk bahan yang erbuat dari metal karena akan menyebabkan karat. kemudian didinginkan sampai suhu 50o-60oC pada kondisi steril (biasanya dalam laminar). Lantai ruangan dan dinding harus dibesihkan seminggu sekali dengan bahan yang sama. Untuk peralatan diseksi yang akan digunakan pada ruang transfer atau laminar. tetapi untuk jumlah yang besar (2-4 liter) selama 30-40 menit. Semua peralatan tersebut harus dibungkus sebelum di oven. Sterilisasi Peralatan Gelas dan Peralatan Lain.2 mikron (µm) merupakan salah satu filter yang banyak digunakan untuk sterilisasi bahan yang bersifat thermolabile.mengandung disinfektan) atau alkohol 95%. larutan yang mengandung komponen besifat thermolabile disterilisasi dengan filter. Media yang sebagian mengandung komponen thermolabile. air destilasi dan campuran yang stabil dapat disterilisasi dalam autoclave dengan menggunakan wadah yang ditutup dengan kapas. saringan dari nylon. gelas. setelah disterilisasi dalam oven harus direndam dahulu dalam alkohol 96% kemudian dibakar di atas lampu bunsen. dapat disterilsasi dengan cara pengeringan dalam oven pada suhu 130o-170oC selama 2-4 jam. Media kultur. waktu yang dibutuhkan adalah 15-20 menit. Beberapa senyawa yang tergolong dalam kelompok protein. sehingga harus disterilisasi dengan filter. Umumnya media diautoclave pada tekanan 15 psi dengan suhu 121oC. dapat dibuat dengan cara: (i) larutan yang mengandung komponen heat-stable disterilisasi dengan autoclave.. yaitu dengan autoclave dan filter membran.

7 ± 0. Organ atau jaringan tanaman harus disterilisasi dengan larutan disinfektan. sehingga waktu perendaman dalam larutan disinfektan merupakan kisaran karena tergantung pada jenis bahan dan tanaman yang akan disterilisasi. pH dapat memengaruhi kelarutan ion-ion di dalam media. Untuk tanaman berkayu. Tidak ada metoda yang baku untuk sterilisasi eksplan. . Menentukan pH larutan pH larutan diukur berdasarkan konsentrasi ion hidrogen dalam larutan. Larutan yang digunakan harus yang aman bagi jaringan/eksplan tetapi bersifat dapat membunuh kontaminan baik bakteri maupun jamur. biasanya sebelum disterilisasi dengan larutan disinfektan harus dibersihkan dahulu dengan sabun dan dibilas dengan air mengalir. pH dari media kultur umumnya diatur 5. umbi dll. kemampuan agar untuk menjadi gel dan selanjutnya mempengaruhi pertumbuhan sel-sel. karena sebagai bahan biologis tidak dapat dilakukan dengan cara pemanasan yang ekstrim. dan setelahnya harus dibilas dengan akuades steril sekurang-kurangnya tiga kali.1 sebelum diautoclave. Umumnya pengukuran pH media menggunakan pH meter. tetapi tidak untuk tanaman jenis herbaceous. 95% kultur akan mengalami kontaminasi apabila eksplan tidak didisinfeksi. Meskipun bermacam tindakan pencegahan sudah dilakukan. Oleh karena itu akurasi pH media menjadi faktor yang penting untk diperhatikan. Semua permukaan eksplan yang disteriliasi harus terendam dalam sterilan. Skala pH mulai dari 0 (sangat asam) hingga 14 (sangat basa) dan skala 7 adalah titik netral.Mendapatkan bahan tanaman yang steril merupakan hal yang sulit.