Makalah Kultur Jaringan Lengkap

BAB I PENDAHULUAN I.1. Latar Belakang Salah satu dampak dalam peningkatan ekspor komoditi pertanian adalah kebutuhan bibit yang semakin meningkat. Bibit dari suatu varietas unggul yang dihasilkan jumlahnya sangat terbatas, sedangkan bibit tanaman yang dibutuhkan jumlahnya sangat banyak. Penyediaan bibit yang berkualitas baik merupakan salah satu faktor yang menentukan keberhasilan dalam pengembangan pertanian di masa mendatang. Salah satu teknologi harapan yang banyak dibicarakan dan telah terbukti memberikan keberhasilan adalah melalui teknik kultur jaringan. Melalui kultur jaringan tanaman dapat diperbanyak setiap waktu sesuai kebutuhan karena faktor perbanyakannya yang tinggi. Bibit dari varietas unggul yang jumlahnya sangat sedikit dapat segera dikembangkan melalui kultur jaringan. Pada tanaman perbanyakan melalui kultur jaringan, bila berhasil dapat lebih menguntungkan karena sifatnya akan sama dengan induknya (seragam) dan dalam waktu yang singkat bibit dapat diproduksi dalam jumlah banyak dan bebas penyakit. Kultur jaringan adalah metode perbanyakan vegetatif dengan menumbuhkan sel, organ atau bagian tanaman dalam media buatan secara steril dengan lingkungan yang terkendali. Tanaman bisa melakukan kultur jaringan jika memiliki sifat totipotensi, yaitu kemampuan sel untuk beregenerasi menjadi tanaman lengkap kembali. I.2. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini diadakan adalah untuk mengetahui lebih dalam mengenai perkembangbiakan vegetatif melalui kultur jaringan. Termasuk di dalamnya tahapan dan manfaat kultur jaringan itu sendiri. Serta keterkaitan antara teori totipotensi dengan perbanyakan melalui kultur jaringan. I.3. Rumusan Masalah 1. Apa pengertian kultur jaringan? 2. Apa prinsip dasar dalam kultur jaringan? 3. Apa keterkaitan antara teori totipotensi dengan kultur jaringan? 4. Apa saja tipe-tipe kultur jaringan? 5. Apakah kelebihan dan kekurangan dari kultur jaringan? 6. Apa perbedaan perbanyakan alami dengan kultur jaringan? 7. Apa saja peralatan yang dipakai dalam kultur jaringan? 8. Apa saja fasilitas laboratorium kultur jaringan? 9. Apa metode pelaksanaan kultur jaringan? 10. Apa saja tahapan dalam kultur jaringan?

11. Apa saja yang mempengaruhi regenerasi pada kultur jaringan? 12. Apa saja kendala dan masalah yang dapat terjadi dalam kultur jaringan? I.4. Landasan Teori Teori yang melandasi kultur jaringan ini adalah teori totipotensi sel (Schwann dan Schleiden) yang menyatakan bahwa sel memiliki sifat totipotensi, yaitu bahwa setiap sel tanaman yang hidup dilengkapi dengan informasi genetik dan perangkat fisiologis yang lengkap untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman utuh, jika kondisinya sesuai. Teori ini mempercayai bahwa setiap bagian tanaman dapat berkembangbiak karena seluruh bagian tanaman terdiri atas jaringan-jaringan hidup. BAB II PEMBAHASAN II.1. Pengertian Kultur jaringan bila diartikan ke dalam Bahasa Jerman disebut Gewebe Kultur, dalam Bahasa Inggris disebut Tissue Culture, dalam Bahasa Belanda disebut weefsel kweek atau weefsel cultuur. Kultur jaringan atau budidaya in vitro adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, jaringan atauorgan yang serba steril, dalam botolkultur yang sterildan dalam kondisi yang aseptic, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman yang lengkap. Usaha memperoleh suatu individu baru dari satu sel atau jaringan dikenal sebagai kultur sel atau kultur jaringan.. Menurut Suryowinoto (1991), kultur jaringan dalam bahasa asing disebut tissue culture. Kultur adalah budidaya dan jaringan adalah sekelompok sel yang mempunyai bentuk dan fungsi yang sama. Jadi, kultur jaringan berarti membudidayakan suatu jaringan tanaman menjadi tanaman kecil yang memiliki sifat seperti induknya. Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Kultur jaringan termasuk jenis perkembangbiakan vegetatif yang prinsip dasarnya sama dengan menyetek. Bagian tanaman yang akan dikultur (eksplan) dapat diambil dari akar, pucuk, bunga, meristem, serbuk sari. II.2. Prinsip Dasar Kultur Jaringan Menurut Thorpe (1981), ada 3 prinsip utama dalam kultur jaringan:  Isolasi bagian tanaman dari tanaman utuh (organ, akar, daun dll)  Memelihara bagian tanaman tadi dalam lingkungan yang sesuai dan kondisi kultur yang tepat  Pemeliharaan dalam kondisi aseptik

kultur yang bahan tanamnya menggunakan biji atau seedling. helaian daun. tangkai daun. bagian tanaman yang ditanam di media tersebut ternyata dapat bertumbuh dan berkembang menjadi individu baru bila kondisinya sesuai. pucuk aksilar.tipe Kultur Jaringan Tipe-tipe kultur. merupakan kultur yang menggunakan jaringan (sekumpulan sel) biasanya berupa jaringan parenkim sebagai bahan eksplannya. seperti: ujung akar. b.4. Kultur protoplasma. inflorescentia. jika kondisinya sesuai.3. Dalam kultur jaringan bagian tanaman yang terdiri atas sel-sel dan jaringan dibuat sedemikian mungkin untuk ditanam di sebuah media yang steril dan lingkungan yang terkendali. Tipe. akar dll. . biasanya eksplan yang digunakan berupa kalus atau jaringan meristem. digunakan sebagai dasar dalam pelaksanaan kultur jaringan. Protoplas diletakkan pada media padat dibiarkan agar membelah diri dan membentuk dinding selnya kembali. Kultur kalus (callus culture). 3. yakni: 1. II. 4. eksplan yang digunakan adalah sel yang telah dilepas bagian dinding selnya menggunakan bantuan enzim. 5. merupakan budidaya yang bahan tanamnya menggunakan organ. II. yaitu bahwa setiap sel tanaman yang hidup dilengkapi dengan informasi genetik dan perangkat fisiologis yang lengkap untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman utuh.Teori Dasar Kultur Jaringan: a. Teori ini mempercayai bahwa setiap bagian tanaman dapat berkembangbiak karena seluruh bagian tanaman terdiri atas jaringan-jaringan hidup. Kultur suspensi sel (suspension culture) adalah kultur yang menggunakan media cair dengan pengocokan yang terus menerus menggunakan shaker dan menggunakan sel atau agregat sel sebagai bahan eksplannya. Kultur protoplas biasanya untuk keperluan hibridisasi somatik atau fusi sel soma (fusi 2 protoplas baik intraspesifik maupun interspesifik). 2. bunga. buah muda. buku batang. Kaitan Teori Totipotensi dengan Kultur Jaringan Teori totipotensi yang menyatakan bahwa setiap sel tanaman dapat berkembang menjadi individu baru. Sel dari suatu organisme multiseluler dimanapun letaknya sebenarnya sama dengan sel zigot karena berasal dari satu sel tersebut (omne cellula ex cellula). Teori Totipotensi Sel Teori sel oleh Schwann dan Schleiden (1898) yang menyatakan bahwa sel memiliki sifat totipotensi. Kultur organ (organ culture). Kultur biji (seed culture). Seperti teori totipotensi tersebut.

Perbanyakan dalam waktu singkat. II. tepungsari/ pollen (kutur pollen). Peralatan Kultur Jaringan Alat-alat yang dipakai dalam penanaman dalam kultur jaringan harus dalam keadaan steril. Alat- .7. Tanaman bebas jamur dan bakteri. ovule (kultur ovule). Diperlukan persiapan SDM yang handal untuk mengerjakan perbanyakan kultur jaringan agar dapat memperoleh hasil yg memuaskan. Produk kultur jaringan pada akarnya kurang kokoh. peralatan dan perlengkapan. II. Membutuhkan modal investasi awal yang tinggi untuk bangunan (laboratorium khusus). Bagi orang tertentu. Kelebihan dan Kekurangan Kultur Jaringan Kelebihan:      Sifat identik dengan induknya. Tidak perlu areal pembibitan yang luas. Sedangkan kekurangannya:      Bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap hama penyakit dan udara luar. Perbedaan Perbanyakan Alami dan Kultur Jaringan Alami Nutrisi diperoleh secara alami dari dalam tanah Tanaman dapat membuat makanannya sendiri (autotrof) Sumber tanaman harus cukup umur Fotosintesis dengan bantuan matahari Ada musim hujan dan kemarau yang tidak terkendali Kultur Jaringan Media terbuat dari nutrisi kimia Tanaman tidak membuat makanannya sendiri Sumber tanaman sedikit Fotosintesis dengan cahaya lampu Tidak dipengaruhi musim II. yakni: kepalasari/ anther (kultur anther/kultur mikrospora). sehingga dapat dihasilkan tanaman haploid. cara kultur jaringan dinilai mahal dan sulit.5.6.6. Kultur haploid adalah kultur yang berasal dari bagian reproduktif tanaman. Tidak dipengaruhi oleh musim.

alat ini letaknya di ruang penabur. Karena ada bagian-bagian atau ruangan-ruangan yang harus dalam suasana steril atau bebas mikroba. Autoklaf. Gunting. Alat-alat kultur jaringan yang perlu disterilisasi sebelum penanaman adalah. Jarum. alat ini digunakan sebagai tahap perlakuan penanaman. Pipet Peralatan kultur jaringan: Laminar Air Flow Cabinet (LAFC). merupakan bentuk lama dari alat penabur (LAFC). Oleh karena itu untuk bladenya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit. Kertas saring. maka fungsinya pun sama seperti (LAFC) Shaker (penggojok). yaitu sebagai berikut: A. jenis alat ini bermacam-macam. Botol-botol kosong.alat logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf. Erlenmeyer. Gelas Piala. Stirer. digunakan untuk menuangkan atau mempersiapkan bahan kimia dan air suling dalam pembuatan medium. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator khusus untuk scapel. alat ini digunakan dalama kultur jaringan tanaman sebagai sarana mmenuangkan air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eeksplan. merupakan alat sterilisasi untuk alat dan medium kultur jarinang tanaman. Ruang-ruang dalam kultur jaringan di kelompokkan menurut macam kegiatan yang ada di dalamnya. digunakan untuk sterilisasi dissecting kit (skalpel dan pinset) di dalam laminar air flow cabinet atau di dalam enkas pada kita mengerjakan penanaman atau sub-culture. karena biasanya . alat ini berfungsi untuk menggojok dengan pemanas. Fasilitas Laboratorium Kultur Jaringan Fasilitas laboratorium kultur jaringan di bagi dalam beberapa bagian yang fungsinya satu sama lainnya berbeda-beda dan persyaratannya pun berbeda-beda pula. Penggojok ini dapat digunakan untuk keperluan menumbuhkan kalus pada eksplan anggrek atau untuk membentuk protokormusatau sering disebut plb (protocorm like bodies) dari kalus bermacam jaringan tanaman. merupakan semacam jenis gelas piala yang mutlak dibutuhkan dalam kultur jaringan. gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan namun pisaunya dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperatur tinggi. Petridish. Entkas. Pinset dan Scalpel. alat ini berfungsi sebagai kompor disamping sebagai penggojok. yaitu ruang yang selalu harus dalam keadaan steril.Ruang Tidak Steril Ruang Tamu Dalam laborsatorium kultur jaringan sebaiknya di lengkapi dengan ruang tamu. digunakan pada saat mengerjakan isolasi protoplas dan isiolasi khloroplas. Petridish. Gelas Ukur. digunakan untuk menakar air suling dan bahan kimia yang akan digunakan. Alat ini berfungsi sebagai alat untuk menimbang bahan-bahan kimia yang digunakan untuk kultur jaringan. Tabung Reaksi. Pinset. II. tetapi yang penting adalah timbanagn yaang dapat dipergunakan untuk menimbang sampai satuan yang sangat keil. – Gagang scapel. merupakan alat penggojok yang putarannya dapat diatur menurut kemauan kita. pinset digunakan untuk memegang atau mengambil irisan eksplan atau untuk menanam eksplan Lampu Spiritus. Laboratorium kultur jaringan harus dirancang secara khusus.8. Timbangan Analitik. Dengan menggunakan listrik.

dalam ruangan ini perlu disediakan rak-rak alumuniaum yang dasrnya berlobang-lobang untuk meletakkan botol-botol tersebut secara teratur dan rapi. Kamar Mandi dan WC Ruang kultur jaringan harus dalam suasana bersih untuk menghindari kontaminasi oleh mikroba. Ruang Administrasi Segala surat-menyurat tentang pembelian alat-alatlboratorium.dengan demikian dibutuhkan lat untuk menimbang semua komponen bahan kimia tersebut. misalnya dalam mencari salah sau komponen media saja membutuhkan waktu yang lama. Ruang Staf Laboratorium kultur jaringan membutuhkan staf peneliti dalam jumlah banyak. Ruang Tidak Mutlak Steril Ruang Planlet Ruangan ini menggunakan alat pendingi (AC). tujuannya adalah agar dapat di adakan pembagian kerja sesuai dengan spesialisasinya masing-masing. maka temperatur ruangan dapat mencapai sekitar 25OC sehingga ideal bagi pertumbuhan planlet. penjualan bibit-bibit hasil biakan kultur jaringan. tubuh dan pakaiannya harus bersih. penyimpanannya memerlukan pengaturn yang khusus supaya mudah mecarinya. tidak berkeringat dan tidak berdebu Ruang Ganti Pakaian Untuk menghindari timbulnya kontaminasi oleh mikroba. Oleh karena itu dalam ruangan kultur jaringan perlu di adakan ruang ganti pakaian. dan transaksi-transaksi ataupun perjanjianperjanjian kerja sama tentang penelitian dilaksanakan di dalam ruangan administrasi. Ruang Inkubator Eksplan yang sudah ditanam dalam media kultur jringan perlu dipantau pertumbuhannya setiap . Ruang Penimbangan dan Sterilisasi Bermacam-macam media kultur jaringan dijual dalam bentuk kemasan dengan harga yang relatif mahal. staf labolatorium lebih senang meramu sendiri medum tanam yang dibutuhkannya. Tujuan penyediaan rumah kaca adalah untuk tempat meletakkan pot-pot bibit tanaman. dalam arti baru di cuci. Oleh karena itu. Penyimpanan yang tidak teratur akan mempelambat dalam pekerjaan. Alat-alat dari gelas seperti erlenmeyer.laboratorium kultur jaringan selalu di datangi tamu baik tamu yang ingin melihat sarana dan suasana laboratorium maupun tamu ingin membeli hasil biakan kultur jaringan. Bahan kimia yang mahal harganya seperti hormon tumbuh dan enzim untuk isolasi protoplas harus disimpan dala ruangan yang sejuk. Oleh sebab itu. Di dalam ruang staf ini dapat pula di lakasanakan diskusi antar staf pada waktu berkumpul bersama. Misalnya menimbang bahan kimia makro dan mikro. Botol-botol yang berisi planlet jumlahnya dapat mencapai ratusan. pembelian media kultur jringan. Ruang Tempat Penyimpanan Bahan Kimia dan Alat-alat dari Gelas Komponen bahan kimia penyusun media kultur jaringan sangat banyak macamna. Oleh karena itu. gelas ukur dan alat gelas lainnya perlu disimpan dalam almari tersendiri. Peralatan yang ada antara lain keranjang-keranjang plastik untuk tempat peralatan yang baru dicuci. maka para karyawan di dalam laboratorium kultur jaringan perlu memakai pakaian yang bersih. B. Bila pekerja akan memasuki ruangan penabur atau ruang inkubator. Rumah Kaca (Green House) Rumah kaca adalah suatu bangunan yang atap dan sekeliling dinding bagian atasnya terbuat dari kaca. Ruang Preparasi Di dalam ruangan ini disediakan peralatan dan tempat untuk mencuci alat-alat laboratorium yang akan digunakan.

Kegagalan dapat berupa tenggelamnya eksplan yang ditanam. Sterilisasi ini mutlak harus dilakukan menjelang ruang penabur akan digunakan. yaitu ruang inkubator. Hasil pertumbuhan kalus ini adalah berupa protokormus atau dalam istilah asing disebut plb (protocorm like bodies).9 Metode Pelaksanaan Kultur Jaringan Metode Kultur Jaringan: 1. Bila kalus ini cukup umur. Bentuk protocormus adalah bulat-bulat padat dan berwarna hijau.hari. Sedangkan sterilisasi lantai dengan menggunakan kain pel yang dibasahi alkohol 96%. Dinding ruang penabur dilengkapi dengan porselin. Ruang Shaker dan Enkas. yaitu 2×3 m2. C. Sedangkan media yang terlalu lembek akan menyebabkan kegagalan dalam pekerjaan. kegunaan enkas ini sama dengan Laminar Air Flow Cabinet. kemudian digojok di atas shaker. yaitu untuk menabur eksplan. lampu ultra violet harus dimatkan terlebih dahulu kemudian menyalakan lampu neon biasa dan calon penabur diperbolehkan memasuki ruangan tersebut. agar-agar bubuk. sehingga sterilisasi mudah dilakukan. yaitu menumbuhkan suatu eksplan atau kalus dengan menggunakan media cair (media yang tidak menggunakan zat pemadat atau agar). karena tempat area kalus yaitu pada irisan . karena eksplan yang ditumbuhkan dalam ruangan inkubasi membutuhkan temperatru dan cahaya yang dapat diatur dan disesuaikan dengan jenis eksplannya. Enkas juga sering di letakkan dalam satu ruang dengan shaker. Untuk pemantauan ini perlu ruangan khusus yang keadaannya lebih steril dari ruang planlet. Dilihat dari Macam Media Tanam Teknik kultur jaringan dapat dilaksanakan dengan dua metode yaitu: a. Media yang terlalu padat akan mengakibatkan akar sukar tumbuh. maka dapat diperlukan suspensi sel. tujuannya adalah agar pelaksanaan sterilisasi ruangannya tidak membutuhkan waktu yang lama dan tidak mengalami kesulitan. Metode Padat (Solid Method) Metode pada dilakukan dengan tujuan mendapatkan kalus dan kemudian dengan medium diferensiasi yang berguna untuk menumbuhkan akar dan tunas sehingga kalus dapat tumbuh menjadi planlet. Ruang Mutlak Steril Ruang Penabur Ruang penabur biasanya di buat dengan ukuran yang tidak terlalu besar. Eksplan yang tenggelam tidak akan dapat tumbuh menjadi kalus. Ruang inkubator harus memiliki suhu kurang lebih 25OC dan harus dilengkapi dengan lampu-lampu neon. Dengan demikian steril ruangan dapat dijamin. pada saat akan keluar lampu neon di matikan dan setelah keluar menutup daun pintu kembali lampu ultra violet dinyalakan. sebab akar sulit untuk menembus ke dalam media. Bila saat calon penabur akan memasuki ruangan. II. Sebaiknya. Sterilisasi ruangan dilakukan dengan cara menyemprotkan alkohol 96% dengan hand-sprayer. atau agar-agar kemasan kaleng yang yang memang khusus digunakan untuk media padat untuk kultur jaringan. Zat pemadat tersebut dapat berupa agar-agar batangan. Bila keadaan protocormus sudah keadaan demikian maka sudah siap dipindahkan kedalam media padat untuk di tumbuhkan menjadi planlet. Media padat adalah media yang mengandung semua komponen kimia yang dibutuhkan oleh tanaman dan kemudian dipadatkan dengan menambahkan zat pemadat. Eksplan yang baru ditanam dan diinkubasikan dalam ruang inkubator akan menghasilkan kalus.

tergantung kebutuhan. seperti agar. Media cair adalah nutrisi yang dilarutkan di air. Oleh karena itu. Metode padat dapat digunakan untuk metode kloning. Media padat pada umumnya berupa padatan gel. agar dapat tumbuh menjadi kalus dan kemudian menjadi planlet. Ada dua penggolongan media tumbuh: media padat dan media cair. Media cair juga tidak memerlukan zat pemadat sehingga keadaannya tetap berupa larutan nutrein. Metode Cair(Liquid Metho) Penggunaan metode cair ini kurang praktis dibandingkan dengan metode padat. Tahapan tersebut. dan untuk menumbuhkan planlet dari prtoplas yang sudah difusikan (digabungkan). Artinya. Dilihat dari Cara Pemeliharaan Eksplan yang telah ditanam.10. eksplan atau kalus yang sudah waktunya untuk dipindahkan ke dalam media tanam yang baru harus segera dilaksanakan. penggunaan media cair lebih ditekankan untuk suspensi sel. II. 2) Kultur antera 3) Kultur endosperma 4) Kultur suspensi sel 5) Kultur protoplas 6) Kultur embrio 7) Kultur spora 8) Dan lain-lain 3. Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh dan mengambil nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan. maka metode kultur jaringan yang telah dikenal sekarang antara lain adalah: 1) Kultur meristem. untuk menumbuhkan planlet dari protokormus stelah dipindahkan dari suspensi sel. Pembuatan media cair jauh lebih cepat daripada media padat. yaitu: . tidak boleh sampai terlambat. yaitu untuk menumbuhkan plb (prtocorm like bodies). Dari protokormus ini nantinya dapat tumbuh menjadi planlet apabila dipindahkan kedalam media padat yang sesuai. Nutrisi dicampurkan pada agar.Tahapan Kultur Jaringan Pelaksanaan teknik ini memerlukan berbagai prasyarat pendukung kehidupan jaringan yang dibiakkan. karena untuk menumbuhkan kalus langsung dari ekspaln sangat sulit sehingga keberhasilannya sangat kecil dan hana tanaman-tanaman tertentu yang dapat berhasil. karena kita tidak p erlu memanaskannya untuk melarutkan agar-agar. b. Yang paling esensial adalah wadah dan media tumbuh yang steril. Pelaksana harus bekerja dengan teliti dan serius. karena setiap tahapan pekerjaan tersebut memerlukan penanganan tersendiri dengan dasar pengetahuan tersendiri. Media cair dapat bersifat tenang atau dalam kondisi selalu bergerak. 2. Dilihat dari Bahan atau Eksplan yang Dipakai Bila dilihat dari macam bahan yang digunakan. untuk menumbuhkan protoplas stelah diisolasikan. Media tumbuh menyediakan berbagai bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya. Pemindahan yang terlambat dapat menyebabkan pertumbuahn eksplan atau kalus dapat terhenti atau dapat mengalami brownig atau terkontaminasi oleh jamur atau bakteri.(jaringan yang luka) tertutup oleh medium. membutuhkan pemeliharaan yang rutin dan tepat.

kloroks 0. Masalah yang sering dihadapi pada kultur tahap ini adalah terjadinya pencokelatan atau penghitaman bagian eksplan (browning). tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Mg) Mikro nutrient (Mn. Tahapan Sterilisasi: 1. 1976).5 % dll – direndam dalam bahan sterilant – sterilisasi dalam laminar – tanaman dipro-kondisi c. P. b. dan hormon. menghambat pertumbuhan atau bahkan dapat mematikan jaringan eksplan.a. Pembuatan media kultur Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. baik jenisnya maupun jumlahnya. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoclave. Mo. Senyawa fenol tersebut bersifat toksik.7-5. diperlukan juga bahan tambahan seperti agar. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral. Sterilisasi bahan tanaman Tanaman induk – sterilisasi bahan tanam/eksplan menggunakan detergen. 1976). sehingga akan memungkinkan dilakukannya pemilihan bagian tanaman yang tumbuhnya paling kuat. Tujuan sterilisasi yaitu untuk menciptakan kondisi kultur yang steril.8) Pemberian agar-agar dan pemanasan media Penuangan dan penutupan media -> sterilisasi Kandungan nutrisi dalam agar-agar : 1. Dalam tahap ini juga diharapkan bahwa eksplan yang dikulturkan akan menginisiasi pertumbuhan baru.untuk perbanyakan (multiplikasi) pada kultur tahap selanjutnya (Wetherell. K. Inisiasi Kultur Tujuan utama dari propagasi secara in-vitro tahap ini adalah pembuatan kultur dari eksplan yang bebas mikroorganisme serta inisiasi pertumbuhan baru (Wetherell. Sterilisasi Sterilisasi adalah proses pembebasan dari mikroorganisme. Aseptik berarti bebas dari mikroorganisme. dan lain-lain. Zn. Selain itu. vitamin. gula. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi. Hal ini disebabkan oleh senyawa fenol yang timbul akibat stress mekanik yang timbul akibat pelukaan pada waktu proses isolasi eksplan dari tanaman induk. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. sedangkan aksenik berarti bebas dari mikroorganisme yang tidak diinginkan. Tahapan pembuatan media kultur:      Persiapan bahan Formulasi Pengukuran pH (5. Sterilisasi peralatan gelas dan stainless dalam suhu 121o di dalam autoklaf. Ini mengusahakan kultur yang aseptik atau aksenik. Co) . 2. alcohol. Cu. mineral :   Makro nutrient (N. Ca. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak.

karbohidrat (gula) 3. protein 5.7H2O 8. CoCl2+6H20 0. KI 0. NH4NO3 1650 2.025 14.025 15. MnSO4+4H20 22. KH2PO4 170 6.3 9. H3BO3 6.2 11. Penanaman eksplan Melalui sub kultur atau transfer. hormon Komposisi media Murashige dan Skoog (MS) Bahan Kimia Konsentrasi Kimia (mg/l) 1. Piridoksin-HCL 0.3 8. spesies.5 17. Glisin 2 20.5 18. Tiamin-HCL 0. Na2MoO4+2H20 0. Sukrosa 30000 d. tanaman ditanam pada media tanam di laminar air flow menggunakan alat-alat yang steril. FeSO4+7H20 27 7. Na 37. Syarat eksplan yang baik:  Berasal dari induk yang sehat dan subur  Berasal dari induk yang diketahui jenisnya  Tempat tumbuh pada lingkungan yang baik  Ukuran tunas optimal sekitar 5 cm tingginya  Tunas langsung diproses sesegera mungkin Tahapan sub kultur:  Induksi tunas Tanaman tersebut harus jelas jenis. KNO3 1900 3. MgSO4+7H20 370 5.6 10.2. Niasin 0. vitamin (B dan C) 4.83 12. Tanaman indukan sumber eksplan tersebut harus dikondisikan dan dipersiapkan secara khusus di rumah kaca atau greenhouse agar eksplan yang akan dikulturkan . Myoinositol 100 16. CaCL2+2H20 440 4. ZnSO4.25 13. CuSO4+5H20 0. dan varietasnya serta harus sehat dan bebas dari hama dan penyakit.1 19.

Selanjutnya bibit siap ditumbuhkan dalam polibag. Suhu yang sesuai untuk pertumbuhan kultur adalah antara 24–28oC. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Untuk mengkondisikan ruang inkubasi pada suhu yang diinginkan. Ini dilakukan untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. eksplan ditempatkan di ruang/lingkungan yang terkendali (untuk duji keberhasilannya). Setelah itu tanaman perlu ditumbuhkan di nursery sampai mencapai tinggi 50 – 60 cm kemudian dipindahkan ke lapangan II. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif. Untuk pengakaran digunakan media MS + NAA.  Inkubasi Pada tahap inkubasi. Tabung yang telah ditanami eksplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar.11.  Aklitimasi Aklitimasi merupakan proses adaptasi/pemindahan tanaman dari lingkungan dalam ke lingkungan luar (dari lingkungan yang terkendali ke lingkungan yang tidak terkendali). Pada saat aklimatisasi ini umumnya 2 minggu dengan sungkup dan 4 minggu tanpa sungkup. Proses perakaran pada umumnya berlangsung selama 1 bulan. yaitu dengan memberikan sungkup.Faktor yang Mempengaruhi Proses Regenerasi . Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri).sehat dan dapat tumbuh baik serta bebas dari sumber kontaminan pada waktu dikulturkan secara in-vitro.  Multiplikasi tunas Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media.  Pengakaran Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap. maka di dalam ruangan tersebut dipasang Air Conditioner (AC). Dan pada saat itu planlet sudah mencapai tinggi 20 – 25 cm.

CPA dan Indole Acetic Acid (IBA). Benziladenin (BA). . 3. Apalagi kita harus membeli saran untuk perlakuan isolasi dan fusi protoplas. anatomi tumbuhan. karena pelaksanaan teknik kultur jaringan tanaman memerlukan keterampilan khusus dan harus dilatar belakangi dengan ilmu pengetahuan dasar tentang fisiologi tumbuhan. Terdapat 13 komposisi media dalam kultur jaringan. dan seks (jantan/betina). anther. dll 2. pucuk adventif. hipokotil. kita harus mengakui bahwa teknik kultur jaringan sangat bermanfaat bagi dunia ilmu pengetahuan. Pekerjaan kultur jaringan meliputi: persiapan media. Di dalam media tumbuh mengandung komposisi garam anorganik. 2. kimia dan pertanian. 2I-P. Bila kita terpaksa harus membeli medium yang sudah jadi (dalam kemasan) jelas akan sangat mahal.12. karena setiap tahapan pekerjaan tersebut memerlukan penanganan tersendiri dengan dasar pengetahuan tersendiri. Biaya untuk mewujudkan perbanyakan tanaman secara in vitro ini juga sangat mahal. Eksplan Merupakan bagian tanaman yang dipergunakan sebagai bahan awal untuk perbanyakan tanaman. Enzim-enzim yang digunakan dalam kultur jaringan juga masih dibeli dari luar negeri seperti Jepang. dan bentuk fisik media. intensitas penyinaran. urutan penggunaan dan periode masa induksi dalam kultur tertentu. Thidiazuron. kotiledon. Media yang sering digunakan secara luas adalah MS. Knudson-C. Karena semua pekerjaan harus dilaksanakan secara hati-hati dan cermat serta memerlukan kesabaran yang tinggi. Golongan Sitokinin seperti Kinetin. II. Lingkungan Tumbuh Lingkungan tumbuh yang dapat mempengruhi regenerasi tanaman meliputi temperatur. daun muda. Faktor eksplan yang penting adalah genotipe/varietas. Jenis yang sering digunakan adalah golongan Auksin seperti Indole Aceti Acid(IAA). Paclobutrazol. Napthalene Acetic Acid (NAA). umur eksplan.4-D. sebab medium yang sudah jadi masih harus di impor dari luar negeri. Bentuk Regenerasi dalam Kultur In Vitro: pucuk aksilar. kualitas sinar. Bagian tanaman yang dapat digunakan sebagi eksplan adalah pucuk muda. inokulasi eksplan. Lepas semua dari kendala-kendala tersebut diatas. walaupun dapat di usahakan secara sederhana (dalam ruang yang terbatas).1.Kendala dan Masalah Melakukan Kultur Jaringan Teknik kultur jaringan sampai saat ini memang belum biasa dilaksanakan oleh para petani. Zeatin. dll. Zat Pengatur Tumbuh Tanaman Faktor yang perlu diperhatikan dalam penggunaan ZPT adalah konsentrasi. Dengan demikian jelas akan amat sulit untuk diterima oleh kalangan petani biasa. Anderson dll. kecuali kita meramu medium sendiri. endosperm. panjang penyinaran. embrio somatik. ovari muda. Pelaksana harus bekerja dengan teliti dan serius. Media Tumbuh. tentu biayanya akan bertambah besar. isolasi bahan tanam (eksplan). 4. TIBA. baru beberapa kalangan pengusaha swasta saja yang sudah mencoba melaksanakannya. sterilisasi eksplan. zat pengatur tumbuh. Golongan Gibberelin seperti GA3. Knop. embrio. aklimatisasi dan usaha pemindahan tanaman hasil kultur jaringan ke lapang. biologi. dan PBA. pelaksanaan teknik kultur jaringan mutlak memerlukan laboratorium khusus. Di samping itu. Kemungkinan lain petani akan merasa enggan bekerja secara aseptik. dan ukuran wadah kultur. letak pada cabang. pembentukan protocorm like bodies. batang muda. antara lain: Murashige dan Skoog (MS). dan CCC. terutama untuk pengembangan bioteknologi.. 5. namun tetap memerlukan peralatan yang memadai. Woody Plant Medium (WPM). Golongan zat penghambat tumbuh seperti Ancymidol.

Adapun masalah-masalah yang terjadi dalam kultur jaringan yaitu: 1) Kontaminasi Kontaminasi adalah gangguan yang sangat umum terjadi dalam kegiatan kultur jaringan.Masalah-masalah Dalam Kultur Jaringan Dalam kegiatan kultur jaringan. Pertrumbuhan batang cenderung ke arah penambahan diameter Tanaman utuhnya menjadi sangat turgescent. Munculnya gangguan ini bila dipahami secara mendasar adalah merupakan sesuatu yang sangat wajar sebagai konsekuensi penggunaan yang diperkaya. cara mengatasinya tidak dapat secara preventif tetapi diselesaikan setelah kasus itu muncul. dll). Permasalahan dalam kultur ada yang dapat diprediksi sebelumnya dan ada pula yang sulit diprediksi kejadiannya. keragaman tersebut dapat dilihat dari jenis kontaminasinya (bakteri. Pencoklatan umumnya merupakan suatu tanda-tanda kemunduran fisiologi eksplan dan tidak jarang berakhir pada kematian eksplan. Fenomena kontaminasi sangat beragam. Tanaman yang dihasikan pendek-pendek atau kerdil. 4) Variabilitas Genetik Bila kultur jaringan digunakan untuk upaya perbanyakan tanaman yang seragam dalam jumlah yang banyak. Peristiwa pencoklatan sesunggguhnya merupakan peristiwa alamiah yang biasa yang sering terjadi. 2) Pencoklatan/browning Pencoklatan adalah suatu karakter munculnya warna coklat atau hitam yang sering membuat tidak terjadinya pertumbuhan dan perkembangan eksplan. media atau hormon. Gangguan kultur secara umum dapat muncul dari bahan yang ditanam. Pada daunnya tidak memiliki jaringan pallisade. jamur. Yakinkan bahwa proses sterilisasi media secara baik dan benar. maupun dari manusianya. Untuk yang tidak dapat diprediksi. Lakukan proses penanaman bahan pada keadaan anda nyaman dan cari waktu yang longgar. dari lingkungan kultur. 3) Vitrifikasi Vitrifikasi adalah suatu istilah problem pada kultur yang ditandai dengan: Munculnya pertumbuhan dan pertumbuhan yang tidaknormal. tidak sedikit masalah-masalah yang muncul sebagai pengganggu dan bahkan menjadi penyebab tidak tercapainya tujuan kegiatan kultur yang dilakukan. . Variasi genetik dapat terjadi pada kultur in vitro karena: Laju multiflikasi yang tinggi.. variasi terjadi karena terjadinya sub kultur berulang yang tidak terkontrol Penggunaan teknik yang tidak sesuai. Upaya mencegah terjadinya kontaminsi:    Biasakan membersihkan berbagai sarana yang diperlukan dalam kultur jaringan. hal tersebut terjadi karena munculnya sifat instabilitas kromosom mungkin akibat teknis kultur. dan bukan sebagai upaya pemuliaan tanaman maka variasi genetik adalah kendala. virus. Variasi genetik yang paling umum terjadi pada kultur kalus dan kultur -suspensi sel.

BAB III PENUTUP III. sehingga tumbuh. dari mulai tanam hingga kurun waktu tertentu tidak mati tetapi tidak tumbuh. pertumbuahn dan perkembangannya dlama botol saja tetapi juga sangat bisa dipengaruhi oleh persyaratan kegiatan prapelakuan.Kesimpulan Pada dasarnya. proses reaksi dan alternatif pengelolaannya. suhu yang terlalu rendah aatau tinggi dapat mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan pada eksplan. yaitu sel atau irisan jaringan tanaman yang akan menjadi benih tanaman yang baru nanti setelah di kultur jaringan. Media juag dapat menjadi sebab terjadinya stagnasi pertumbuhan. Untuk menghindari hal itu dapat dilakukan dengan preventif menghindari bahan tanam yang tidak juvenil atau tidak meristematik. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan mengisolasi bagian tanaman seperti daun. Karena awal pertumbuhan eksplan akan dimulai dari selsel yang muda yang aktif membelah. atau dari sel-sel tua yang muda kembali. karena dari kondisi medialah suatu sel dapat atau tidak terdorong melakukan proses pembelahan dan pembesaran dirinya. Hambatan berupa bahan kimia penanganannya harus dimulai dari pengenalan senyawa aktif. Sehingga optimasi pertumbuhan tidak bisa diharapkan sama antara kultur yang satu dengan kultur yang lain. Kebutuhan antara satu tananaman dengan tanaman yang lain berbeda. Hambatan apat berupa hambatan kemikalis. Pada proses klutur jaringan yang bersifa inderict embriogenesis. fisik. serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptic yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap. Faktor eksplan yang perlu . kultur jaringan merupakan suatu tehnik membiakkan sel atau jaringan ke dalam media kultur.1. tahapan pembentukan kalus harus dilanjutkan dengan mendorong induksi embriosomatik dari sel-sel kalus. 7) Lingkungan Mikro Masalah lingkungan inkubator juga tidak bisa diabaiakan karena ini juga sering menjadi masalah. biologis. Dalam kultur jaringan digunakan eksplan. harus memperhatikan aspek yang dikulturkan. Prapelakuan dilakukan umumnya untuk tujuan-tujuan tertentu.Cara mengatasi masalah variasi genetik tentunya tidak sederhana. namunddemikian solusinya sulit dilakukan mengingat umumnya ruangan inkubator suatu ruangan laboratorium kultur jaringan tidak bisa dibuat variasi antara satu ruangan dengan bagian ruangan yang lainnya. 5) Pertumbuhan dan Perkembangan Masalah utama berkaitan dengan proses pertumbuhan adalah bila eksplan yang ditanam mengalami stagnasi. 6) Praperlakuan Masalah pada kegiatan in vitro bukan hanya dari penanaman eksplan saja. dan menghasilkan tumbuhan baru dengan cepat dan memiliki sifat yang sama dengan induknya. mata tunas. Suhu ruangan inkubator sangat menentukan optimasi pertumbuhan eksplan. Terjadinya embrio somatik dapat secara endogen atau eksogen. membelah. secara umum adalah dalam rangka menghilangkan hambatan. Pada kasus ini masalah akan muncul bila kegiatan prapelakuaan tidak dilakukan. potensi gangguan.

yaitu bahwa setiap sel tanaman yang hidup dilengkapi dengan informasi genetik dan perangkat fisiologis yang lengkap untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman utuh. Inkubasi f. hipokotil. Penanaman eksplan e. artinya setiap sel memiliki potensi genetik seperti zigot yaitu mampu memperbanyak diri dan berediferensiasi menjadi tanaman lengkap. Totipotensi artinya kemampuan setiap sel tumbuhan untuk menjadi individu yang sempurna atau untuk beregenerasi menjadi tanaman lengkap kembali. embrio. Tanaman yang dimanfaatkan dalam kultur jaringan harus memiliki sifat Autonom. Pembuatan media kultur d. jika kondisinya sesuai. dan seks (jantan/betina). daun muda. Aklitimasi Peralatan Kultur Jaringan:              Laminar Air Flow Cabinet (LAFC) Entkas Shaker Autoklaf Timbangan Analitik Stirer Erlenmeyer Gelas Ukur Gelas Piala Petridish Pinset dan Scalpel Lampu Spiritus Tabung Reaksi Faktor yang Mempengaruhi Proses Regenerasi 1. Jadi sifat totipotensi ( total genetic potential) sel. ovari muda. dll. Prinsip dasar Kultur Jaringan yaitu : a. Sel dari suatu organisme multiseluler dimana pun letaknya. Teori Totipotensi Sel (Total Genetic Potential). 2. sebenarnya sama dengan sel zigot karena berasal dari satu sel tersebut (Setiap sel berasal dari satu sel).diperhatikan adalah genotipe/varietas. 1. Autonom artinya dapat mengatur aktivitas hidup sendiri. Inisiasi kultur b. Bentuk Regenerasi . sehingga tumbuhan yang bersifat Autonom akan dapat mengatur aktvitas yg dilakukannya sendiri. Bagian tanaman yang dapat digunakan sebagai eksplan adalah pucuk muda. kotiledon. dan sifat Totipotensi. letak pada cabang. b.karena seluruh bagian tanaman terdiri atas jaringan – jaringan hidup. batang muda. Teori ini mempercayai bahwa setiap bagian tanaman dapat berkembang biak. anther. endosperm. Sedangkan Tahap-tahap pada kultur jaringan tanaman yaitu : a. Sterilisasi c. umur eksplan.

Media 4.A. LAMPIRAN Laminar Air Flow Tempat penanaman eksplan dilakukan Autoklaf Tempat pensterilan media kultur Tahap Sterilisasi Tahap induksi tunas Tahap Multiplikasi Tunas Tahap Inkubasi Tunas Eksplan mulai berakar dan siap di aklitimasi DAFTAR PUSTAKA Pratiwi. Drs. Biologi.Saran Pelaksanaan kultur jaringan di Indonesia belum cukup banyak dilakukan. Lingkungan Tumbuh Masalah-masalah yang dapat terjadi dalam kultur jaringan:        Kontaminasi Pencokelatan/browning Vitrifikasi Variabilitas Genetik Masalah dalam pertumbuhan dan perkembangan eksplan Masalah dalam properlakuan Masalah dalam lingkungan mikro III. Eksplan 3. Surakarta: Aspirasi. Saya menyarankan kepada pemerintah. dkk. Hapsoro. D. sebaiknya pemerintah ikut memperhatikan masalah mengenai pertanian terutama dalam metode kultur jaringan yang seharusnya dapat menghasilkan keberhasilan yang besar. 2007.2.. Saya harap saran dipertimbangkan. Jakarta: Erlangga. Hal ini dikarenakan kurangnya dana dan fasilitas. Zat Pengatur Tumbuh Tanaman 5. .2. Biologi. Juga kepada SMAN 1 Purwakarta. untuk mengagendakan pembuatan laboratorium kultur jaringan di masa yang akan datang supaya para murid dapat dengan mudah mempraktekkan teori yang didapat mengenai kultur jaringan.

Ruang kultur atau inkubator yang lingkungannya terkontrol .: .com/2008/07/kultur-jaringan. sterilisasi dan penyimpanan .html http://hamdan-motor.wordpress.blogspot.Ruang persiapan media. meja kerja yang terbuat dari bahan yang tahan terhadap asam dan basa. rak pengering dan mempunyai saluran untuk air demineralisasi atau destilasi. Ruang Pencucian Ruang pencucian harus mempunyai bak cuci.Catatan hasil study tour ke Mekarsari.Ruang pencucian . alat/mesin pencuci dan pengering.com/ Blogspot http://rsf-gudangilmu.Ruang transfer aseptik . serta rak atau lemari penyimpanan alat.blogspot. Organisasi Dalam Laboratorium Kultur Jaringan Di setiap laboratorium dimana teknik kultur jaringan digunakan harus mempunyai sejumlah fasilitas yang mencakup al.google.1.com/ Search engine WordPress http://thafransisca.Ruang pengamatan dan koleksi data Diagram laboratorium kultur jaringan dapat dilihat pada gambar B-2. ruang untuk tempat oven pengering. a.com/2009/11/kultur-jaringan-dan-teori-totipotensi. . 26 Oktober 2010 SITUS WEB Google http://www.html Wikipedia 1.

dll. Deionisasi menghilangkan dari bahan yang bersifat ionik dan proses destilasi menghilangkan molekul-molekul organik. dll. peralatan gelas dan peralatan lain. nitrogen) dan bahan-bahan lain (minyak. HEPA filter harus mempunyai pori sekitar 0. d. Didalam pembuatan media kultur. Penyaring udara harus mempunyai filter udara dengan efisiensi tinggi atau ”highefficiency particulate air (HEPA filter). gelas kultur dan penutupnya. yang menghilangkan bahan-bahan partikulat dan kontaminasi oleh bakteri. Meja yang kokoh atau ”bench” untuk penyimpanan ”hot plate magnetic stirrer”. kompor gas. Air ledeng atau sumur tidak digunakan untuk pembuatan media karena mengandung kation-kation (amonium. dan bahan organik dan mempunyai konduktivitas elektrik kurang dari 1. CO2. jamur.3 µm dengan efisiensi kerja berkisar 99. besi. bakteri). Ruang Persiapan Media Di dalam ruang persiapan media harus tersedia tempat untuk penyimpanan bahan-bahan kimia. c. Agar lebih akurat.b. klorida. bahan organik dan bahan partikulat. fosfat.97 – 99. dan peralatan gelas yang diperlukan untuk pembuatan media. gambar Metoda yang paling umum untuk pemurnian air standar type II adalah dengan deionosasi yang diikuti dengan satu atau dua destilasi gelas. magnesium natrium. (2) penyaringan dengan membran. Metode-metode lain yang dapat digunakan untuk mendapatkan air murni type II adalah (1) penyaringan dengan cara absorpsi. Oleh karena itu pemindahan atau transfer biakan dikerjakan dalam ruang transfer steril atau laminar air flow. Laminar air flow yang digunakan dalam kultur jaringan tanaman adalah tipe horizontal dan dirancang dengan mempunyai ruangan yang bebas dari partikel debu yang halus dan dilengkapi dengan sinar ultra violet (UV) serta unit penyaring udara. mikroorganisme dan pirogen. pH meter. Ruang Transfer Teknik kultur jaringan dapat berlangsung dengan sukses apabila dilakukan dibawah kondisi laboratorium yang sangat bersih. bahan organik dll. kalsium. dan (3) reverse osmosis. mikroorganisme (algae. Air yang digunakan dalam kultur jaringan harus mempunyai standar type II (minimum) yaitu bebas pirogen. bunsen. sirkulasi udara. refrigerator (kulkas) dan freezer untuk penyimpanan larutan stok dan bahan kimia. kelmbaban maupun kualitas dan lamanya cahaya. Faktor-faktor lingkungan tersebut akan mempengaruhi proses pertumbuhan dan diferensiasi biakan baik secara langsung maupun tidak .). Air yang digunakan dalam pembuatan media harus berkualitas tinggi yang mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi.0 µmho/cm. bahanbahan kimia yang digunakan harus yang bertaraf analitik dan penimbangannya harus baik dan benar. Peralatan lain yang biasanya ada di ruang persiapan dan pembuatan media antara lain alat vaccum. Semua permukaan ruang kerja dalam laminar harus dirancang dan mempunyai konstruksi sedemikian rupa sehingga debu dan mikroorganisme tidak dapat berakumulasi dan permukaan tempat kerja dapat mudah dibersihkan dan diidisinfeksi. anion-anion (bikarbonat.99%. dengan menggunakan karbon aktif untuk menghilangkan kontaminan organik dan bebas klorine.). timbangan.). oven dan autoclave untuk sterilisasi mdia. yang menghilangkan sekitar 99% bakteri. gas. dalam pembuatan media harus dilakukan tahap demi tahap dan bahanbahan yang digunakan harus di ”checklist”. flourida. distiling unit. dan dispenser harus tersedia. gas-gas (oksigen. mikrowave. Ruang Kultur Semua jenis kultur harus disimpan dalam tempat yang terkontrol baik temperatur.

.: 1. Suhu dan cahaya harus dapat diprogram selama 24 jam. Hal yang paling perlu diperhatikan adalah akurasi. suspensi sel dan kultur anther adalah yang paling sensitif terhadap kondisi lingkungan. Bahan kimia yang diperlukan untuk pembuatan media (Lampiran) 20. Hot plate/magnetic stirrer atau kompor 2. forcep. Erlenmeyer dari berbagai ukuran (50. Botol kultur dengan penutupnya 8.5oC. 500. akan tetapi kisaran suhu yang lebih besar mungkin diperlukan untuk tujuan percobaan. Disinfectant 19. Laminar air flow 18. Prosedur Dasar Laboratorium Umumnya penggunaan operasional di lab perbanyakan tanaman dengan kultur jaringan dapat dipelajari dengan mudah. Refrigerator 11. Tabung gelas.000 lux. 125. Ventilasi udara harus baik dengan kelembaban berkisar 20-98%. Shaker 17. Pipet ukur 16. botol jam atau bekas selai juga sering digunakan sebagai botol kultur. Mikroskop 15. pipet dan labu ukur. Timbangan (analitical dan bench top loading) 6. kebersihan dan keamanan saat bekerja dengan teknik kultur jaringan. Distiling unit atau water deionizer 12. Gelas ukur gradual 7. gelas ukur. 250. scalpel (pinset). Peralatan dan Bahan Dasar Dalam Laboratorium Kultur Jaringan Peralatan yang diperlukan dari suatu laboratorium umumnya adalah sbb. Suhu ruang kultur untuk pertumbuhan umumnya berkisar antara 15o – 30oC. 2. Peralatan gelas (gelas ukur. semua bahan yang ditimbang harus dilakukan dengan hati-hati meskipun untuk pembuatan media dalam skala komersial. Alat diseksi (spatula. erlenmeyer) atau stainless steel untuk memanaskan dan melarutkan media 3. Peralatan gelas lain yang biasanya digunakan adalah gelas piala. Dispenser 9. cawan petri. Setiap penggunaan timbangan atau alat-alat lain harus memperhatikan instruksi dari pabrikannya. Peralatan gelas yang digunakan di lab kultur jaringan umumnya terbuat dari Pyrex. Dll. Ruang kultur harus mempunyai pencahayaan hingga 10. Oven 13. pH meter 5.langsung. Microwave 14. gunting) 10. Peralatan gelas tesebut harus tahan panas selama proses sterilisasi dengan oven atau autoclave. dengan fluktuasi kurang dari ±0. 3. 1000 atau 2000 ml) digunakan untuk wadah kultur dan pembuatan media. Penimbangan Pada saat pembuatan media. Kultur protoplas. Alat sterilisasi dengan tekanan uap (autoclave) 4.

Jangan pernah menggunakan mulut untuk memipet. (iii) yang terpenting lagi. Beberapa persyaratan yang harus diperhatikan agar diperoleh penimbangan yang akurat adalah (i) timbangan harus ditempatkan pada tempat yang keras. stabil. Waktu sterilisasi bervariasi tergantung dari ukuran ruang transfer itu sendiri dan harus dilakukan apabila tidak ada kegiatan dalam ruang tersebut. diikuti dengan pembilasan dengan air panas dan air destilasi. (ii) daerah sekitar penimbangan harus terjaga kebersihannya. Cairan dihisap kedalam pipet dengan menekan tombol bagian atas dan melepaskan cairan dengan menekan tombol bagian bawah. Ruang transfer dapat juga disterilisasi dengan mencuci/mengepel 1-2 kali setiap bulan dengan bahan anti jamur (fungisida) komersial. erlenmeyer dan pipet diperlukan untuk pembuatan media.Jenis timbangan yang sering digunakan di lab antara lain top-loading balance dan analytical balance yang memungkinkan akurasi penimbangan hingga skala milligram. (ii) pipet penghisap yang dioperasikan menggunakan roda kecil pada bagian atas alat penghisap. Penggunaan pipet harus dibantu dengan alat penghisap larutan (pipetor). Jenis-jenis pipetor yang umum digunakan antara lain (i) tipe bola penghisap yang dilengkapi dengan beberapa katup pengontrol. (iv) penimbangan disarankan menggunakan wadah atau alas yang ringan atau kertas daripada menempatkan bahan yang ditimbang secara langsung di atas piring timbangan. maka akan terjadi kontaminasi. Ruang kerja dalam laminar flow biasanya sudah dilengkapi dengan lampu UV. Karena asam kromat dapat menyebabkan korosif. Apabila spora jamur kontak dengan media kultur dan kondisinya optimal untuk perkecambahan jamur. Membersihkan peralatan gelas Metoda konvensional pencucian peralatan gelas dilakukan dengan merendam gelas dalam larutan asam kromat yang diikuti pembilasan dengan air kran dan air destilasi. a. permukaannya rata yang bebas getaran dan kebocoran. (iii) alat penghisap dengan bantuan pompa udara secara elektrik. Spora jamur sangat ringan dan ada disekeliling lingkungan. (iv) pipet mikro. Sterilisasi Ruang Kultur dan Transfer Sterilisasi ruang kultur yang paling baik adalah dilakukan dengan penggunaan sinar ultraviolet (UV). biasanya untuk pengambilan larutan dengan volume yang sangat kecil (mikro liter). Radiasi UV sangat berbahaya bagi mata dan kulit. dikeringkan dalam oven pada suhu 150oC dibungkus dengan aluminium foil. Pengukuran larutan dengan menggunakan pipet dan labu ukur hanya akan akurat apabila bagian dasar dari cekungan antara air dan udara berada tepat pada tanda pengukuran. Ruang kultur harus dibersihkan dengan sabun kemudian dilap dengan Na-hypoklorit 2% (merek komersial seperti Sunclin. maka cara ini banyak ditinggalkan kecuali untuk peralatan gelas yang terkontaminasi tinggi. Bakteri dan jamur adalah dua kontaminan yang paling banyak dijumpai dalam kultur. Bayclin atau pembersih lantai lain yang . penimbangan jangan sampai pernah overload. Sterilisasi Bagian yang sangat penting dalam teknik in vitro adalah sterilisasi bahan tanaman dan media dan menjaga kondisi aseptik yang telah dicapai. kemudian disimpan dalam lemari tertutup. sehingga sterilisasinya dilakukan dengan UV dan diikuti dengan membasuh/melap permukaan tempat bekerja dalam laminar dengan alkohol 95% sebelum mulai bekerja. Peralatan gelas yang telah dicuci. 100 dan 1000 ml banyak digunakan untuk mengukur volume. 25. tetapi pengukuran yang lebih akurat diperlukan labu ukur dan pipet. Pengukuran cairan/larutan Peralatan gelas yang mempunyai ukuran seperti gelas piala. Gelas ukur kapasitas 10. Pencucian yang lebih aman adalah dengan air panas (>70oC) + sabun.

Peralatan yang terbuat dari metal. dapat disterilsasi dengan cara pengeringan dalam oven pada suhu 130o-170oC selama 2-4 jam. pakaian lab. Peralatan gelas yang akan menampung media yang disterilisasi dengan filter harus sudah disterilisasi dahulu dengan autoclave. Umumnya media diautoclave pada tekanan 15 psi dengan suhu 121oC.mengandung disinfektan) atau alkohol 95%. Media kultur. Teknik ini harus dilakukan dengan ekstra hati-hati karena alkohol sangat mudah terbakar. Tekanan jangan melebhi dari 20 psi karena dapat mengakibatkan dekomposisi karbohidrat dan bahan lain dalam media yang bersifat thermolabile. Hampir semua mikroba dapat mati bila diautoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 15 psi selama 15-20 menit. tetapi untuk jumlah yang besar (2-4 liter) selama 30-40 menit. Teknik ini disebut sterilisasi pembakaran (flame sterilization). dapat dibuat dengan cara: (i) larutan yang mengandung komponen heat-stable disterilisasi dengan autoclave. b. Akan tetapi. Semua peralatan tersebut harus dibungkus sebelum di oven. saringan dari nylon. Sterilisasi Media Ada dua metoda untuk sterilisasi media yang umum digunakan. Bahan-bahan atau alat yang dapat disterilisasi dengan cara autoclave ini antara lain kapas penutup tabung. setelah disterilisasi dalam oven harus direndam dahulu dalam alkohol 96% kemudian dibakar di atas lampu bunsen. Untuk volume larutan per wadah yang sedikit (< 100 ml). air. yaitu dengan autoclave dan filter membran. Beberapa senyawa yang tergolong dalam kelompok protein. pipet. peralatan gelas. larutan dari bahan-bahan yang bersifat tidak stabil (heat-labile) harus menggunakan filter. d d. Media yang sebagian mengandung komponen thermolabile. tutup plastik. Untuk peralatan diseksi yang akan digunakan pada ruang transfer atau laminar. (iii) kedua larutan yang sudah disterilisasi dengan metoda yang berbeda tersebut digabungkan dalam kondisi aseptik. air destilasi dan campuran yang stabil dapat disterilisasi dalam autoclave dengan menggunakan wadah yang ditutup dengan kapas. Filter Millipore yang mempunyai porositas ± 0.. kemudian didinginkan sampai suhu 50o-60oC pada kondisi steril (biasanya dalam laminar). larutan yang mengandung komponen besifat thermolabile disterilisasi dengan filter. vitamin. sehingga harus disterilisasi dengan filter. Sterilisasi Bahan Tanaman . waktu yang dibutuhkan adalah 15-20 menit. dll. hormon dan karbohidrat ada yang bersifat thermolabile yang mungkin akan mengakibatkan dekomposisi bila disterilisasi dengan autoclave. ekstrak tanama. (ii) pada bagian lain dalam kondisi yang steril. Lantai ruangan dan dinding harus dibesihkan seminggu sekali dengan bahan yang sama. gelas. dan media kultur. aluminium foil atau plastik. Sterilisasi dengan menggunakan autoclave tidak dsarankan untuk bahan yang erbuat dari metal karena akan menyebabkan karat. c. aluminium foil. Sterilisasi Peralatan Gelas dan Peralatan Lain. tetapi jangan menggunakan kertas karena akan akan terdekomposisi pada suhu 170oC. Autoclave adalah metoda sterilisasi dengan menggunakan tekanan uap air.2 mikron (µm) merupakan salah satu filter yang banyak digunakan untuk sterilisasi bahan yang bersifat thermolabile. asam amino.

pH dapat memengaruhi kelarutan ion-ion di dalam media. kemampuan agar untuk menjadi gel dan selanjutnya mempengaruhi pertumbuhan sel-sel. Tidak ada metoda yang baku untuk sterilisasi eksplan. Semua permukaan eksplan yang disteriliasi harus terendam dalam sterilan.1 sebelum diautoclave.Mendapatkan bahan tanaman yang steril merupakan hal yang sulit.7 ± 0. . Larutan yang digunakan harus yang aman bagi jaringan/eksplan tetapi bersifat dapat membunuh kontaminan baik bakteri maupun jamur. Umumnya pengukuran pH media menggunakan pH meter. Meskipun bermacam tindakan pencegahan sudah dilakukan. Menentukan pH larutan pH larutan diukur berdasarkan konsentrasi ion hidrogen dalam larutan. karena sebagai bahan biologis tidak dapat dilakukan dengan cara pemanasan yang ekstrim. Untuk tanaman berkayu. pH dari media kultur umumnya diatur 5. tetapi tidak untuk tanaman jenis herbaceous. sehingga waktu perendaman dalam larutan disinfektan merupakan kisaran karena tergantung pada jenis bahan dan tanaman yang akan disterilisasi. umbi dll. Skala pH mulai dari 0 (sangat asam) hingga 14 (sangat basa) dan skala 7 adalah titik netral. Organ atau jaringan tanaman harus disterilisasi dengan larutan disinfektan. Oleh karena itu akurasi pH media menjadi faktor yang penting untk diperhatikan. 95% kultur akan mengalami kontaminasi apabila eksplan tidak didisinfeksi. dan setelahnya harus dibilas dengan akuades steril sekurang-kurangnya tiga kali. biasanya sebelum disterilisasi dengan larutan disinfektan harus dibersihkan dahulu dengan sabun dan dibilas dengan air mengalir.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful