BAB III METODE PENELITIAN A.

Waktu dan tempat penelitian Penelitian ini berlangsung selama 2 bulan, yaitu mulai pada minggu keempat bulan Februari sampai minggu keempat bulan April 2009. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biologi, Jurusan Biologi, Haluoleo. B. Subjek penelitian Subjek penelitian ini adalah isolat SSA2.B4.1 dan SSD2A7.1 hasil skrining bakteri penghasil kitinase dari tempat pemeliharaan udang (tambak), FMIPA, Universitas

penampungan udang, limbah pengolahan udang dan tempat pembuangan limbah padat udang yang terdapat dibeberapa daerah industri perikanan di Sulawesi Selatan dan Sulawesi Tenggara, yang dikarakterisasi sifat biokimianya dengan menggunakan berbagai uji biokimia yaitu uji fermentasi karbohidrat, uji hidrolisis pati, uji methyl red, uji Voges-Proskauer , uji oksidase, uji katalase, uji indol, uji sitrat, uji pencairan gelatin, uji urease, uji H2S, uji selulose dan uji protease.

C. Alat dan bahan yang digunakan 1. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu terdiri dari peralatan gelas dan bukan gelas serta peralatan instrumen. a. Peralatan gelas dan bukan gelas Peralatan gelas terdiri dari tabung reaksi (pyrex), cawan petri (pyrex), gelas ukur 100 mL dan 50 mL, gelas kimia (pyrex) 500 mL,

Erlenmeyer (pyrex) 250 mL, pipet volume (pyrex) 5 mL dan 10 mL, pipet tetes, tabung Durham, pembakar bunsen, alat penanam bakteri (jarum ose) ujung bulat dan ujung runcing. Peralatan bukan gelas terdiri dari karet pengisap (filler), pengaduk magnetik, pipet mikro, rak tabung reaksi dan botol semprot. b. Peralatan instrumen Peralatan instrumen terdiri dari autoklaf, neraca analitik (precisa 205 A), inkubator, mikroskop cahaya, pemanas (thermolyne), refrigerator, entkas. 2. Bahan Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah pepton, dekstrosa, kalium fosfat, ammonium dihidrogen fosfat, dikalium fosfat natrium klorida, natrium sitrat, magnesium sulfat, agar, brom timol biru (BTB) tripton, kalsium klorida, glukosa, laktosa, sukrosa, kalium dihidrogen fosfat, fenol merah, triple sugar iron agar (TSIA), gelatin, ekstrak ragi, susu skim, karboksimetilselulosa

51

(CMC), kalium nitrat, trypticase soy agar (TSA), metil merah, etanol 70% dan etanol 95 %, -naftol, hidrogen peroksida, asam sulfat pekat, larutan iodin, kalium hidroksida, manitol, maltosa, pati, dimetil-p-fenilendiamin oksalat, safranin, larutan lugol iodin, Simmon sitrat agar, kalium nitrit 0,5% , asam sulfanilat, -naftilamin, p-dimetilaminobenzaldehida, butanol, asam klorida pekat dan aquades. ..............................

52

D. Prosedur penelitian Secara umum, metode penelitian ini digambarkan dalam skema berikut : a. Pewarnaan Gram

Kaca penutup dan kaca objek -dibersihkan dengan alkohol 70% -dilewatkan di atas nyala lampu spirtus Isolat bakteri (1 ose) -diletakkan diatas kaca objek seluas 1 cm2 -dilakukan fiksasi di atas nyala lampu spritus
-

diteteskan zat warna dasar (kristal violet) (2 tetes) -didiamkan selama 1 menit -dicuci dengan air mengalir lalu dikeringkan

-ditetesi dengan larutan lugol iodin dan -diamkan 1 menit -dicuci dengan alkohol 95% (2 tetes) -didiamkan selama 30 detik -dicuci dengan air mengalir lalu dikeringkan -diberi larutan safranin (2 tetes) -didiamkan selama 2 menit -dicuci dengan air mengalir lalu dikeringkan -diamati dengan mikroskop bakteri gram positif berwarna biru keunguan sedangkan gram negatif berwarna merah

53

b. Uji sifat biokimia isolat

Sterilisasi alat yang akan digunakan -sterilisasi dengan menggunakan metode panas lembab (autoklaf) pada suhu 121oC selama 15 menit -dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu 80oC selama 15 menit Pembuatan media uji mikroba - disterilisasi dengan metode panas lembab (autoklaf) pada suhu 121oC selama 15 menit media uji mikroba steril reagen uji Pembuatan reagen uji

Inokulasi isolat bakteri kitinolitik pada tiap-tiap media uji Inkubasi pada suhu dan waktu sesuai tiap-tiap uji biokimia Karakterisasi isolat bakteri dengan berbagai uji biokimia, yaitu : - uji fermentasi karbohidrat - uji hidrolisis pati -uji methyl red - uji Voges-Proskauer - uji oksidase - uji katalase - uji indol - uji sitrat - uji pencairan gelatin - uji urease - uji H2S - uji selulase - uji protease - uji nitrat

54

D. Identifikasi isolat Isolat diidentifikasi berdasarkan pewarnaan gram untuk mengetahui bentuk sel bakteri dan sifat gram (gram negatif/gram positif) dan uji karakterisasi sifat biokimia isolat. a. Pewarnaan Gram Kaca penutup dan kaca obyek dibersihkan dengan alkohol hingga bebas lemak, kemudian dilewatkan di atas nyala lampu spritus. Diambil secara aseptik sebanyak satu ose isolat bakteri dan diletakkan pada kaca obyek seluas 1 cm2 kemudian dilakukan fiksasi di atas nyala lampu spritus. Diteteskan zat warna dasar (kristal violet) sebanyak 2 tetes dan didiamkan selama 1 menit. Setelah itu dicuci dengan air mengalir lalu dikeringkan, kemudian ditetesi dengan larutan lugol iodin dan diamkan selama 1 menit. Setelah kering, dicuci dengan larutan peluntur/pemucat (alkohol 95%) sebayak 2 tetes dan didiamkan selama 30 detik. Selanjutnya dicuci dengan air mengalir lalu dikeringkan. Setelah kering diberi larutan zat warna pembanding/penutup (safranin) sebanyak 2 tetes dan didiamkan selama 2 menit dan dicuci dengan air mengalir lalu dikeringkan. Setelah itu diamati dengan mikroskop, bakteri gram positif tampak berwarna biru keunguan sedangkan gram negatif berwarna merah (Lay, 1994).

55

b. Uji sifat biokimia isolat Uji fermentasi karbohidrat Langkah-langkah yang digunakan dalam uji fermentasi karbohidrat adalah menyiapkan kaldu karbohidrat yaitu glukosa, sukrosa, laktosa, maltosa, dan manitol masing-masing 1%. Kaldu karbohidrat yang mengandung BTB (brom timol biru) sebagai indikator pH dan ditambahkan pepton sebagai sumber nitrogen, vitamin dan mineral dimasukkan dalam tabung reaksi yang dilengkapi tabung Durham. Kemudian diinokulasi dengan biakan bakteri. Setelah itu diinkubasi dalam inkubator pada suhu 30oC selama 24 jam. Selanjutnya fermentasi karbohidrat diperiksa dengan melihat pembentukan asam (warna kuning) dan pembentukan gas dalam tabung Durham (Lay, 1994). Uji methyl red Langkah-langkah yang digunakan dalam uji methyl red adalah disiapkan kaldu MR-VP, lalu dimasukkan 5 mL kaldu MR-VP dalam tabung reaksi dan diinokulasikan biakan bakteri ke dalam kaldu MR-VP, diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam atau pada suhu 30oC selama 72 jam. Hari berikutnya ditambahkan reagen metil merah 5 tetes, jika kaldu berwarna merah setelah penambahan reagen metil merah maka menunjukan hasil uji positif, dan jika warna kaldu berwarna kuning maka hasil uji negatif (Lay, 1994).

56

Uji Voges Proskauer Kaldu MR-VP sebanyak 5 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi, diinokulasi bakteri pada kaldu MR-VP, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Setelah itu ditambahkan 10 tetes larutan KOH 40% dan 15 tetes larutan -naftol, dikocok dan dibiarkan 30 menit. Uji positif jika kaldu berwarna merah dan uji negatif jika kaldu tidak mengalami perubahan warna setelah penambahan reagen (Lay, 1994).

Uji oksidase Biakan ditumbuhkan pada media nutrien agar (NA), diinkubasi selama pada suhu 30oC selama 24 jam, kemudian ditambahkan reagen uji oksidase (campuran 1:1 larutan -naftol 1% dan 1% larutan dimetil-p-fenilendiamin

oksalat) pada koloni bakteri dan didiamkan selama 30 menit. Uji positif jika warna koloni berubah menjadi hitam (Lay, 1994). Uji katalase Biakan ditumbuhkan pada media NA dengan cara ditotolkan dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30oC kemudian ditambahkan reagen H2O2 3 %. Uji positif ditandai dengan pembentukan gelembung udara pada biakan dan disekitarnya (Lay, 1994).

57

Uji indol Medium tripton cair dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 mL, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35oC, kemudian ditambahkan

beberapa tetes reagen Kovacs. Jika terbentuk warna merah dipermukaan medium menunjukkan hasil uji positif (Waluyo, 2008). Uji sitrat Biakan diinokulasi pada media Simmon sitrat agar dengan inokulum yang tipis, kemudian diinkubasi pada suhu 350C selama 48 jam. Jika terjadi perubahan warna dari hijau menjadi biru menunjukan uji positif (Lay, 1994). Uji pencairan gelatin Biakan diinokulasi pada media dengan cara menusukkan mikroba yang akan diujikan sedalam bagian dari lapisan permukaan, kemudian diinkubasi pada suhu 350C selama 24 jam. Jika media gelatin mencair, maka langkah selanjutnya dimasukkan dalam lemari es selama 30 menit. Diamati pencairan gelatin, jika terdapat gelatin yang mencair menunjukkan uji positif. Namun jika tidak mencair maka di inkubasi kembali selama 1 minggu pada suhu 350C. Uji negatif jika setelah 1 minggu gelatin tidak mencair sedikitpun (Lay, 1994).

58

Uji hidrogen sulfida ( H2S) Inokulasi biakan pada tabung reaksi yang telah berisi media TSIA 7 mL dengan cara menusukkan jarum ose ke dalam media kemudian baru diinokulasi pada bagian slant TSIA. Inkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Diamati pertumbuhannya pada bagian Butt dan Slant (Lay, 1994).

Uji urease Inokulasi biakan pada media urea agar miring dengan mikroorganisme, kemudian diinkubasi pad suhu 350C selama 24 jam. Jika terjadi perubahan warna dari kuning menjadi merah keunguan maka menunjukkan uji positif

(Hadioetomo, 1985). Uji selulase Inokulasi biakan pada media Luria agar (LA) yang mengandung CMC (karboksimetilselulase) pada cawan Petri dengan melubangi agar pada cawan dengan menggunakan cut borer sebanyak 4 sampai 5 lubang (Gambar 19.a), kemudian diinokulasi dengan cara mengambil 1 ose biakan kemudian dimasukkan dalam 1 mL aquades steril lalu dihomogenkan dengan menggunakan pipet mikro sebelum dipipet lalu diinokulasi pada lubang yang terdapat pada agar sebanyak 100 L . Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada inkubator dengan posisi tidak terbalik pada suhu 37oC. Uji positif ditunjukkan dengan terbentukknya zona bening di sekitar daerah inokulasi (Yulianingsih, 2007).

59

O O O

O O

(a)

( b)

Gambar 19. (a) Bentuk lubang dan (b) bentuk goresan pada media uji.

Uji protease Inokulasi biakan pada media LA yang mengandung susu skim pada cawan Petri dengan membagi media menjadi 4 bagian dengan menggunakan spidol pada bagian luar cawan petri, kemudian digoreskan inokulum pada 4 bagian media tersebut (Gambar 19.b). Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada inkubator dengan suhu 37oC. Uji positif ditunjukkan dengan terbentukknya zona bening di sekitar daerah goresan (Akhdiya, 2003).

Uji hidrolisis pati Biakan diinokulasi pada media NA yang mengandung pati, dengan cara melubangi agar pada cawan dengan menggunakan cut borer sebanyak 4 sampai 5 lubang (Gambar 19.a), kemudian diinokulasi dengan cara mengambil 1 ose biakan kemudian diencerkan dalam 1 mL aquades steril lalu dihomogenkan dengan menggunakan pipet mikro sebelum dipipet dan diinokulasi pada lubang yang terdapat pada agar sebanyak 100 L . Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada inkubator dengan posisi tidak terbalik pada suhu 37oC. Uji positif ditunjukkan dengan terbentukknya zona bening di sekitar daerah inokulasi (Yulianingsih, 2007).

60

Uji reduksi nitrat Uji nitrat dilakukan dengan menumbuhkan mikroorganisme pada kaldu nitrat dalam tabung reaksi yang telah dilengkapi dengan tabung Durham,

kemudian diinkubasi pada suhu 35oC selama 24 jam. Setelah masa inkubasi, diperhatikan adanya gas dalam tabung Durham dan nitrit dalam media biakan. Keberadaan nitrit dalam media diuji dengan penambahan asam sulfanilat dan -naftilamin yang akan bereaksi dengan nitrit yang ditunjukkan dengan perubahan warna media menjadi merah atau merah muda. Pada tabung yang tidak menunjukkan perubahan warna, ditambahkan bubuk Zn untuk melihat reduksi nitrat menjadi nitrit. Bila didapatkan nitrat dalam medium, maka kaldu berubah warna menjadi merah muda atau merah karena Zn mereduksi nitrat menjadi nitrit dan nitrit ini bereaksi dengan reagen uji dan terbentuk warna merah (Lay, 2004). E. Desain penelitian Tabel 6. Desain penelitian hasil perlakuan pada pewarnaan Gram terhadap isolat SSA2.B4.1 dan SSD2A7.1.

No
1 2 3 4

Reagen yang diberikan

Kristal violet Larutan lugol Larutan pemucat (Alkohol 95%) Safranin Kesimpulan

Warna isolat
SSA2.B4.1 SSD2A7

61

Tabel 7. Desain penelitian hasil uji sifat biokimia isolat SSA2.B4.1 dan SSD2A7.1.
No 1 Nama isolat 2 Jenis uji 3 1. Fermentasi karbodidrat a. Fermentasi glukosa b. Fermentasi manitol c. Fermentasi laktosa d. Fermentasi sukrosa 2. Uji indol 3. Uji Methyl red 4. Uji Voges Proskauer 5. Uji sitrat 6. Uji urease 7. Uji Hidrogen sulfida 8. Uji katalase 9. Uji selulase 10. Uji protease 11. Uji hidrolisis pati 12. Uji pencairan gelatin 13. Uji oksidase 14. Uji nitrat Hasil uji 4 Keterangan 5

1.

SSD2A7.1.

62

No 1

Nama isolat 2

Jenis uji 3 1. Fermentasi karbodidrat a. Fermentasi glukosa b. Fermentasi manitol c. Fermentasi laktosa d. Fermentasi sukrosa 2. Uji indol 3. Uji Methyl red 4. Uji Voges Proskauer 5. Uji sitrat 6. Uji urease 7. Uji Hidrogen sulfida 8. Uji katalase 9. Uji selulase 10. Uji protease 11. Uji hidrolisis pati 12. Uji pencairan gelatin 13. Uji oksidase 14. Uji nitrat

Hasil uji 4

Keterangan 5

2.

SSA2B4.1.

63