Cara Pewarnaan gram Dari sampel langsung, dengan pertumbuhan koloni yang berumur 1 x 24 jam dibuat pewarnaan gram

dengan cara: a) Dibuat sediaan pada kaca obyek, dengan meneteskan 1 tetes NaCl fisiologis dan ditambahkan 1-2 koloni b) Dilebarkan dan difiksasi diatas nyala api bunsen c) Setelah kering, dituangkan gentiaan violet (gram A), dibiarkan selama 3 menit, lalu dicuci dengan air mengalir. d) Setelah itu dituangkan lugol (gram B), dan dibiarkan 45 sampai 60 detik, lalu dicuci dengan air mengalir. e) Dicelupkan dalam benjana yang berisi alkohol 96% (Gram C), digoyang-goyang selama 30 detik atau sampai warna zat ungu hilang, lalu dicuci dengan air mengalir. f) Diwarnai dengan air fuchsin (gram D), selama 1 sampai 2 menit, lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. g) Preparat yang sudah kering diamati dibawah mikroskop, dengan penambahan oil emersi mengunakan lensa pembesaran 100x . Uji reaksi biokimia dan tes gula-gula serta pengamatan pada kuman basil gram negatif 1) TSIA (Tripel Sugar Iron Agar) 1 sampai 2 koloni diambil pada media pembiakan, kemudian ditusuk dan digores pada media TSIA. 2) SC (Simon Citrat) 1 sampai 2 koloni diambil pada media pembiakan, kemudian digores pada media SC. 3) SIM (Sulfur, Indol, Motil) 1 sampai 2 koloni diambil pada media pembiakan, kemudian digores pada media SIM. 4) Urea 1 sampai 2 koloni diambil pada media pembiakan, kemudian digores pada media Urea. 5) Mr/Vp (metil red / voges proskauer) 1 sampai 2 koloni diambil pada media pembiakan, kemudian digerus, lalu homogenkan pada media Mr/Vp. 6) Tes gula-gula (glukosa,laktosa,Sokrosa) 1 sampai 2 koloni diambil pada media pembiakan, kemudian digores pada media. Setelah semua di tanam pada media uji reaksi biokimia dan tes gula-gula, diinkubasi pada suhu 35 C - 37C selama 18-24 jam dan diamati dengan perbandingan tabel.

Cara Pengamatan Reaksi uji biop kimia dan gula2 :

1. Endo agar / Mac Konkey (MC) Diamati makroskopis dan hasil fermentatif pada media Endo agar / MC. 2. TSIA (Tripel Sugar Iron Agar) Diamati bagian slant, butt (merah/ kuning, kuning/ kuning, merah/ merah), pembentukan gas dan H2S. Merah=asam = K (simbol) Kuning=basa = A (simbol) 3. SC (Simon Citrat) Diamati perubahan warna media dari hijau menjadi biru menunjukan citrat positif. 4. SIM (Sulfur,Indol,Motil) Diamati warna pada media, apabila terbentuk warna hitam (sulfur) berarti H2S positif, pada motil, terlihat pergerakan kuman seperti awan, persis payung terbalik berarti motil positif dan pada indol ditambahkan 5 tetes reagen kovac, maka terbentuk cincin merah berarti indol positif . 5. Urea Diamati perubahan warna pada media, terjadi perubahan warna pada media urea positif. 6. Mr/Vp (metil red / voges proskauer) Media Mr/Vp yang telah diinkubasi dibagi menjadi 2 dalam tabung bersih dan steril. Tabung 1. Ditambahkan 1 sampai 2 tetes metil red, bila terbentuk cincin warna merah (pH <4,4) Mr positif. Tabung 2. Ditambahkan 0,6ml alphanaftol 5% dan ditambah 0,2 ml KOH 40%, bila terjadi perubahan warna terbentuk cincin merah (jangan dikocok), berarti Vp positif. 7. Tes gula-gula (glukosa,laktosa, sukrosa) Diamati perubahan warna pada media, terjadi perubahan warna pada media urea positif.

Prinsip Pengamatan Reaksi uji biokimia dan gula2 :

1. TSIA (Tripel Sugar Iron Agar), didapatkan hasil A/A atau kuning/kuning (asam/asam) berati bakteri mampu meragikan glukosa, laktosa dan sukrosa yang di tandai dengan perubahan warna media menjadi kuning dan terbentuknya gas yang ditandai dengan pecah atau terangkatnya media. 2. Tes citrat, tidak terjadi perubahan warna dari hijau menjadi biru (negatif), artinya bakteri tidak mempunyai enzim sitrat permiase yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat kedalam sel, berati bakteri tidak mampu memanfatkan karbon sebagai sumber metabolisme dalam suasana basa. 3. Tes H2S, Tidak terbentuknya warna hitam pada daerah tusukan yang menandai bakteri tidak memiliki kemampuan dalam pembentukan hydrogen sulfit atau H2S. 4. Tes Indol, setelah penambahan reagen kovac terbentuk cincin merah (positif) yang berarti bakteri mampu menguraikan protein karena mampu membentuk tryptopan sebagai sumber karbon. 5. Tes motiliti, terbentuknya awan seperti payung terbalik pada daerah tusukan yang menandakan bakteri bergerak. 6. Tes Urea, tidak terjadi perubahan warna pada media urea (negatif), artinya bakteri tidak mampu mengunakan urea dan perubahan pH menjadi media basa. 7. Tes Mr, terjadi pembentukan cincin merah pada media Mr setelah penambahan reagen metil red (positif), yang artinya bakteri mampu mempertahankan akhir dari meragi glukosa dan asam campuran.

8. Tes Vp, tidak terjadi pembentukan cincin merah pada media Vp setelah penambahan reagen barit dan omera (negatif), artinya asil akhir dari fermentasi bakteri berasal dari asetil metil carbional. 9. Reaksi gula-gula, glukosa, lakosa, sukrosa, terjadi perubahan warna pada setiap media (positif) yang artinya bakteri mampu memfermentasikan karbohidrat.