BAB I PENDAHULUAN

1.1 Ciri Umum Kelompok Bacillus Secara umum, Kelompok Bacillus merupakan bakteri berbentuk batang (basil), dan tergolong dalam bakteri gram positif yang umumnya tumbuh pada medium yang mengandung oksigen (bersifat aerobik) sehingga dikenal pula dengan istilah aerobic sporeformers. Kebanyakan anggota genus Bacillus dapat membentuk endospora yang dibentuk secara intraseluler sebagai respon terhadap kondisi lingkungan yang kurang menguntungkan, oleh karena itu anggota genus Bacillus memiliki toleransi yang tinggi terhadap kondisi lingkungan yang berubah-ubah. Beberapa anggota Bacillus memiliki S-layer yang merupakan lapisan crystalline dipermukaan subunit protein atau glikoprotein. Bagian kapsul kebanyakan anggota Bacillus mengandung D atau L-glutamic acid, sedangkan beberapa lainnya memiliki kapsul yang mengandung karbohidrat. Variasi struktur dinding sel seperti pada kebanyakan bakteri gram negatif tidak ditemukan pada genus Bacillus. Dinding sel vegetatif kebanyakan anggota Bacillus terbuat dari peptidoglikan yang mengandung Meso-Diaminopimelic acid (DAP) dengan tipe Glyserol Teichoic Acid sangat bervariasi diantara spesies. Kebanyakan anggota genus Bacillus merupakan bakteri yang bersifat motil dan memiliki flagela tipe peritrik. Bakteri Bacillus sp. biasanya banyak ditemukan di tanah. Cara untuk mendapatkan bakteri Bacillus sp. yaitu dengan mengambil sampel tanah menggunakan sendok yang telah disterilisasikan terlebih dahulu kemudian ambil tanah sekitar kedalaman 3 cm dari permukaan tanah. Bacillus sp. merupakan bakteri gram positif dengan sel batang berukuran 0,3-22x1,27-7 m, sebagian bersifat motil (mampu bergerak) mobilitasnya ini disebabkan oleh flagel, jika dipanaskan akan membentuk endospora, yaitu bentuk dorman sel vegetatif sebagai bentuk pertahanan diri yang muncul saat kondisi ekstrim yang tidak menguntungkan bagi bakteri. Kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya, maka endospora berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop. Endospora dibentuk dalam sporangium di dalam sel dan dibentuk saat sel masak. Endospora memiliki dinding tebal, reaktif, dan sangat resisten. Letak endospora dalam sel ukuran selama pembentukannya tidak sama antara spesies satu

dengan lainnya. Beberapa spesies memiliki spora sentral, terminal, atau letal. Endospora dapat berbentuk oval, silindris, bulat, atau lainnya. Bacillus sp. bersifat aerob sampai anaerob fakultatif, metabolisme dengan fermentasi dan respirasi. Isolat-isolat murni tersebut dipelihara dalam medium agar miring. Untuk memastikan bahwa koloni-koloni tersebut adalah Bacillus, maka dilakukan serangkaian pengujian yang bersifat spesifik yaitu pengecetan gram, pengecetan negatif dan motilitasnya. Bacillus dibedakan dari anggota familia Bacillaceae lainnya berdasarkan sifat-sifatnya yaitu: keseluruhannya merupakan pembentuk spora, hidup pada kondisi aerob baik sebagai jasad yang sepenuhnya aerob maupun aerob fakultatif, selnya berbentuk batang, dan memproduksi katalase.

1.2 Jenis-jenis Bacillus Kebanyakan anggota genus Bacillus adalah organisme saprofit yang lazim terdapat dalam tanah, air, udara, dan tumbuh-tumbuhan, seperti Bacillus cereus dan Bacillus subtilis. Beberapa di antaranya patogen bagi insekta Bacillus cereus dapat tumbuh pada makanan dan menghasilkan enterotoksin yang menyebabkan keracunan makanan. Organisme ini kadang-kadang dapat menimbulkan penyakit pada orang fungsi imun yang terganggu (misalnya meningitis, endokarditis, endoftalmitis, konjungtivitis, atau gastro enteritis akut). Bacillus anthracis, penyebab antraks adalah bakteri patogen utama genus ini.

1.

Bacillus anthracis Kuman antraks banyak ditemukan pada penyakit zoonosis, infeksi pada ternak lembu, kambing, domba dan babi. Kuman dikelurakan melalui feses, urin dan saliva binatang yang terinfeksi dan bertahan hidup di ladang dalam bentuk spora untuk waktu yang lama sekali.

Morfologi Batang dengan ukuran 1 x 3-4 m, dapat tersusun dengan seperti bamboo, bentuk batangnya persegi atau cekung ujungnya, sendiri-sendiri, berpasangan atau membentuk rantai pendek, tidak bergerak, berspora oval yang letaknya sental, kadang-kadang berkapsul.

Struktur Antigen Bahan simpai B anthracis, yang terdiri atas polipeptida berbobot molekul tinggi yang mengandung asam D-glutamat, adalah suatu hapten. Badan bakteri mengandung protein dan suatu polisakarida somatic, keduanya bersifat antigenik.

Patogenesis Antraks terutama merupakan penyakit pada biri-biri, sapi, kuda, dan hewan lainnya; manusia jarang terserang. Infeksi biasanya didapat dengan masuknya spora melalui luka pada kulit atau selaput lendir, jarang dengan inhalasi spora ke dalam paru-paru. Pada hewan, pintu masuknya adalah mulut dan saluran pencernaan. Spora dari tanah yang tercemar mudah masuk bila termakan bersama tumbuhan berduri atau yang merangsang. Pada manusia, goresan pada kulit atau inhalasi menyebabkan timbulnya infeksi. Spora tumbuh pada jaringan di tempat masuk, dan pertumbuhan organisme vegetative mengakibatkan pembentukkan edema gelatinosa dan kongesti. Basil menyebar melalui getah bening ke dalam aliran darah, bakteri berkembang biak dengan bebas dalam darah dan jaringan segera sebelum dan setelah kematian hewan. Dalam plasma hewan yang mati karena antraks, telah ditemukan suatu faktor toksik. Bila diinokulasikan, zat ini mematikan mencit atau marmot dan secara spesifik dinetralisasi oleh antiserum antraks. Eksudat antraks mengandung polipeptida yang identik dengan polipeptida pada

simpai Bacillus, dan dapat menimbulkan reaksi histologik yang sama seperti reaksi akibat infeksi antraks. Protein lain yang diisolasi dari eksudat merangsang kekebalan yang kuat terhadap antraks bila disutikkan pada hewan. Dari filtrat (toksin antraks), telah dipisahkan tiga zat dengan filtrasi gelas dan kromatrografi: (1) antigen proktektif, (2) faktor edema, dan (3) faktor letal. Campuran dari (1), (2), dan (3) lebih toksik pada hewan, dan campuran seperti ini lebih imunogenik daripada masing-masing zat sendirisendiri. Pembentukan toksik berada di bawah pengaruh suatu plasmid; bila plasmid ini hilang, toksik tidak diproduksi. Tipe antraks yang lain adalah antraks pernapasan (penyakit tukang sortir wool). Spora atraks yang terhirup dari debu wool, bulu atau kulit mengakibatkan berkembangnya spora dalam paru-paru atau dalam kelenjar getah bening trakebronkial dan menimbulkan mediastinitis hemoragik, pneumonia, meningitis, dan sepsis yang biasa cepat menimbulkan kematian jumlah organisme dalam darah melebihi 10/ mL.

Patologi Pada hewan yang peka, organisme berkembang biak di tempat masuk. Simpai tetap utuh, dan organisme dikelilingi oleh sejumlah besar cairan seperti protein yang mengandung sedikit leukosit, organisme kemudian dengan cepat menyebar dan mencapai aliran darah. Pada hewan yang resisten, organisme berkembang biak selama beberapa jam, setelah itu terkumpul sejumlah besar leukosit. Simpai lambat laun mengalami disintegrasi dan menghilang. Organisme tetap terlokalisasi.

Gambaran Klinik Pada manusia, antraks menimbulkan infeksi kulit (pustula ganas). Mula-mula timbul popula dalam 12-36 jam setelah masuknya organisme atau spora melalui goresan. Papula ini dengan cepat berubah menjadi visikel, kemudian pustula, dan akhirnya menjadi ulkus nekrotik; lalu infeksi dapat menyebar, menimbulkan septikemia. Pada antraks pernapasan, gejala dini dapat berupa mediastinitis, sepsis, meningitis atau edema paru-paru hemoragik. Pneumonia hemoragik dengan syok merupakan gejala yang terakhir. Hewan sering terkena antraks dengan memakan sporanya dan organisme menyebar lewat saluran usus, tetapi pada manusia hal ini jarang terjadi. Karena itu, sakit perut, muntah dan diare berdarah jarang merupakan tanda-tanda klinik.

Tes Diagnostik Laboratorium A. Bahan: Cairan atau nanah dari lesi lokal, darah, dahak. B. Pewarnaan Sediaan: Dari lesi lokal atau darah hewan yang mati; rantai bakteri terbentuk batang besar Gram-positif sering terlihat. Antraks dapat diidentifikasi pada sediaan kering dengan teknik pewarnaan imunofluoresensi. C. Biakan: Bila dibiakkan pada lempeng agar darah, organisme ini membentuk koloni kelabu nonhemolitik dengan morfologi mikroskopis yang khas. Peragian karbohidrat tidak bermanfaat. Pada perbenihan setengah padat, basil antraks selalu tidak bergerak, sedangkan organisme tidak patogen yang sejenis (misal B cereus) menunjukkan pergerakkan dengan menyebar. Biakan antraks virulen mematikan mencit atau marmot bila disutikkan secara intraperitoneal.

D. Tes Serologi: Antibodi penyebab presipitasi atau hemaglutinasi dapat diperlihatkan dalam serum orang atau hewan yang telah divaksinasi atau terinfeksi.

Resistensi dan Kekebalan Beberapa hewan (marmot) sangat peka, sedangkan yang lain (tikus) sangat resisten terhadap infeksi antraks. Kenyataan ini diperkirakan akibat sejumlah mekanisme pertahanan: aktivitas leukosit, suhu badan, dan daya bakterisidal darah. Polipeptida tertentu yang mematikan hasil antraks telah diisolasi dari jaringan hewan. Polilisin sintetik mempunyai daya kerja yang mirip. Kekebalan aktif terhadap antraks dapat diinduksi pada hewan yang peka oleh vaksinasi dengan basil hidup yang telah dilemahkan, dengan suspensi spora, atau dengan antigen proktektif dan filtrate biakan. Serum imun kadang-kadang disuntikkan bersama dengan basil hidup pada hewan. Imunisasi antraks didasarkan pada percobaan klasik Louis Pasteur, yang pada tahun 1881 membuktikkan bahwa biakan yang telah tumbuh dalam kaldu pada 42-52C selama beberapa bulan akan kehilangan sebagian besar virulensinya dan dapat disuntikkan hidup-hidup pada biri-biri dan sapi tanpa menyebabkan penyakit; selanjutnya hewan-hewan ini terbukti kebal. Terdapat banyak variasi mengenai kemanjuran berbagai vaksin.

Pengobatan Banyak antibiotika efektif terhadap antraks pada manusia, tetapi pengobatan harus dimulai sedini mungkin. Penisilin cukup memuaskan, kecuali pada pengobatan antraks pernapasan, dimana mortilitas tetap tinggi. Beberapa basil Gram-positif lainnya mungkin resisten terhadap penisilin karena membentuk--laktamase. Tetrasiklin, eritromisin, atau klidamisin mungkin efektif.

Epidemiologi, Pencegahan dan Pengendalian Tanah tercemar oleh spora antraks dari bangkai hewan. Spora-spora ini dapat tetap hidup selama puluhan tahun. Mungkin spora dapat tumbuh dalam tanah pada pH 6,5 pada suhu yang cocok. Hewan merumput yang terinfeksi melalui luka pada selaput lendir menjadi penyambung rantai infeksi terus-menerus. Kotak dengan hewan yang terinfeksi atau dengan kulit, rambut dan bulunya merupakan sumber infeksi pada manusia. Tindakan pengendalian meliputi (1) pembuangan bangkai hewan dengan membakar atau
5

mengubur pada sumur yang dalam disertai kapur, (2) dekontaminasi produk-produk hewan (biasanya dengan autoklaf), (3) baju dan sarung tangan pelindung waktu mengenai bahan-bahan yang mungkin tercemar dan (4) imunisasi aktif hewan peliharaan dengan vaksin hidup yang dilemahkan. Orang yang mempunyai resiko besar karena pekerjaanya harus diimunisasi dengan vaksin bebas-sel yang dapat diperoleh dari Centers for Disease Control, Atlanta, GA 30333.

2.

Bacillus cereus Dapat menyebabkan keracuann makanan dan juga menyebabkan pneumonia, bronkopneumonia dan luka.

Morfologi Bacillus cereus merupakan salah satu anggota genus Bacillus yang pertama kali diisolasi pada tahun 1969 dari darah dan cairan pleura pasien pneumonia. Bacillus cereus memiliki beberapa karakter morfologi diantaranya: Gram positif dengan lebar sel 0,9 1,2 m dan panjang 3 5 m. motilitas positif, spora elipsoidal, sentral atau parasentral, spora jarang keluar dari sporangia. Tidak membentuk kapsul, biasanya muncul dalam bentuk rantai panjang tipe R. Bentuk koloni irregular, opague terkadang waxy. Pada medium cair membentuk turbiditas moderate .

Enterotoksin Bacillus cereus memiliki karakter yang mirip dengan Bacillus thuringiensis dan Bacillus anthracis, namun tetap dapat dibedakan berdasarkan determinasi motilitas (kebanyakan Bacillus cereus bersifat motil) dan adanya kristal toxin (hanya dihasilkan oleh B. thuringiensis), aktivitas hemolisis (B cereus memiliki sifat ini, sedangkan B. anthracis bersifat non-hemolitik). Bacillus cereus menghasilkan beberapa enterotoksin dapat dalam makanan atau dibentuk dalam usus penyebab penting dari infeksi mata, keratitis berat, endoftalmitis dan panoftalmitis (khasnya bakteri masuk ke dalam mata melalui benda asing yang berkaitan dengan trauma). Enterotoksin penyebab diare bersifat keracunan lewat makan (diarrheal type). Enterotoksin penyebab muntah berkaitan pada nasi panas tercemar (emetic type) dengan gejala mual, kejang otot perut. Dalam pertumbuhan Bacillus cereus menghasilkan toksin selama pertumbuhan atau selama sporulasi.

Beberapa strain dari Bacillus cereus bersifat patogen dan berbahaya bagi manusia karena dapat menyebabkan foodborne illness, namun beberapa diantaranya yang bersifat saprofitik dapat bermanfaat sebagai probiotik dan juga penghasil antibiotik yang potensial. Bacillus cereus kebanyakan ditemukan terkandung dalam bahan pangan dan menyebabkan 2 tipe keracunan makanan: 1) emetic yang merupakan keracunan yang dimediasi oleh toksin yang sangat stabil yang dapat bertahan pada temperatur tinggi, pH ekstrim serta tahan terhadap enzim pencernaan seperti: trypsin, pepsin. 2) diarrhoeal yang dimediasi oleh enterotoksin yang labil terhadap panas dan asam. Bacillus cereus merupakan mikroorganisme yang dapat tumbuh pada kisaran temperatur yang luas dan terdapat strain yang tergolong psychrophilic hingga thermophilic. Karena kebanyakan strain Bacillus cereus hidup dalam gastro-intestinal dan menyebabkan infeksi diarrhoeal, maka temperatur 37oC merupakan temperatur pertumbuhan yang optimal.

Antibiotika Beberapa species utama genus Bacillus yang dapat memproduksi peptida antibiotik diantaranya: Bacillus brevis (contoh: Gramicidin, Tyrothricin), Bacillus cereus (Cerexin, Zwitermicin), Bacillus circulans (contoh: Circulin) , Bacillus laterosporus (contoh: Laterosporin). Bacillus licheniformis (contoh: Bacitracin), Bacillus polymyxa (Polymixin, Colistin), Bacillus pumilus (contoh: Pumilin) dan Bacillus subtilis (Difficidin, Subtilin, Mycobacillin). Bacillus cereus merupakan salah satu anggota genus Bacillus yang memiliki potensi antibiotik. Bacillus cereus memproduksi Biocercin yang efektif menghambat

Staphylococcus aureus dan Staphylococcus albus dengan menggunakan protease pepton agar sebagai medium uji. Spesies ini diketahui bersifat antagonistik terhadap Fusarium roseum var sambucinum yang merupakan agen penyebab Potato Dry Root dengan menggunakan medium uji potato dextrose agar. Bacillus cereus memproduksi Mycocercin yang merupakan antibiotik peptida yang efektif terhadap beberapa jenis yeast maupun mold dengan rentang minimal inhibitory concentration antara 19,5 78 mikrogram/mL. Cerexin B merupakan antibiotik yang efektif terhadap bakteri gram positif yang diproduksi oleh Bacillus cereus Gp-3 dan merupakan antibiotik amphoteric acylpeptide. Bacillus cereus BMG 366-UF5 melalui fermentasi dengan menggunakan spora sebagai inokulum awal, dapat memproduksi Prumycin yang merupakan antibiotik yang juga diproduksi oleh Streptomyces kagawaensis dengan aktivitas yang tidak jauh berbeda.
7

Zwittermicin A merupakan salah satu antibiotik golongan aminopolylol yang diketahui efektif dalam menghambat beberapa patogen yang menyerang tanaman dengan spektrum luas meliputi bakteri (baik gram positif maupun gram negatif), beberapa fungi (seperti: oomycetes) dan protista (contohnya: alga). Zwittermicin A diketahui diproduksi oleh beberapa strain Bacillus cereus diantaranya: Bacillus cereus UW 11, UW 32, UW 52, UW 56, UW 64, UW 78, UW 89, UW 96,UW 119 dan UW 120. Beberapa strain tersebut selain memproduksi Zwittermycin A, juga memproduksi Kanosamin yang merupakan antibiotik dengan spektrum luas.

Gejala-gejala Penyakit Keracunan makanan karena B. cereus merupakan penamaan secara umum, walaupun ada dua tipe penyakit yang disebabkan oleh dua metabolit yang berbeda. Penyakit dengan gejala diare (tipe diare) disebabkan oleh protein dengan berat molekul besar, sementara penyakit dengan gejala muntah (tipe emetik) diyakini disebabkan oleh peptida tahan panas dengan berat molekul rendah. Gejala-gejala keracunan makanan tipe diare karena B. cereus mirip dengan gejala keracunan makanan yang disebabkan oleh Clostridium perfringens . Diare berair, kram perut, dan rasa sakit mulai terjadi 6-15 jam setelah konsumsi makanan yang terkontaminasi. Rasa mual mungkin menyertai diare, tetapi jarang terjadi muntah (emesis). Pada sebagian besar kasus, gejala-gejala ini tetap berlangsung selama 24 jam. Keracunan makanan tipe emetik ditandai dengan mual dan muntah dalam waktu 0.5 sampai 6 jam setelah mengkonsumsi makanan yang terkontaminasi. Kadang-kadang kram perut dan/atau diare dapat juga terjadi. Umumnya gejala terjadi selama kurang dari 24 jam. Gejala-gejala keracunan makanan tipe ini mirip dengan gejala keracunan makanan yang disebabkan oleh Staphylococcus aureus . Beberapa strain B. subtilis dan B. licheniformis telah diisolasi dari kambing dan ayam yang dicurigai menjadi penyebab kasus keracunan makanan. Organisme-organisme ini menghasilkan racun yang sangat tahan panas yang mungkin mirip dengan racun penyebab muntah yang diproduksi oleh B. cereus . Keberadaan B. cereus dalam jumlah besar (lebih dari 10 6 organisme/g) dalam makanan merupakan indikasi adanya pertumbuhan dan pembelahan sel bakteri secara aktif, dan berpotensi membahayakan kesehatan.

Diagnosis Bacillus cereus dipastikan sebagai penyebab suatu kasus keracunan makanan, apabila (1) hasil isolasi Bacillus cereus menunjukkan bahwa strain-strain dari serotip yang sama ditemukan pada makanan yang dicurigai dan dari kotoran atau muntahan pasien, atau (2) hasil isolasi bakteri dari makanan yang dicurigai, kotoran, atau muntahan pasien menunjukkan adanya sejumlah besar Bacillus cereus dari serotip yang dikenal sebagai penyebab keracunan makanan, atau (3) dengan cara mengisolasi Bacillus cereus dari makanan yang dicurigai dan menentukan kemampuannya dalam menghasilkan enterotoxin ( enterotoxigenicity ) dengan uji serologis (untuk toxin penyebab diare) atau uji biologis (untuk tipe diare dan emetik). Pada tipe emetik, waktu yang cepat munculnya gejala segera setelah infeksi, didukung dengan beberapa bukti pada makanan, seringkali sudah cukup untuk mendiagnosis keracunan makanan tipe ini.

Tes Diagnostik Laboratorium Bacillus cereus non pathogen menunjukkan pergerakan dengan penyebaran (swarming) pada media kultur seengah padat. Sel vegetatif dari Bacillus cereus dapat tumbuh pada rentang temperatur 5 50 oC dengan temperatur optimal antara 35 - 40 oC, resisten terhadap pH 4,59,3. Dapat tumbuh pada anaerobic agar dan nutrien broth dan penambahan NaCl 7%, nutritive agar serta nutritive agar dengan 7 10 % darah domba. Waktu generasi relatif singkat, antara 20 30 menit. Dalam medium GA, Bacillus cereus telah mencapai fase eksponensial pada 6 jam inkubasi dan mencapai fase stasioner 20 jam setelah inkubasi.

Patogenesis Bacillus cereus bertanggung jawab untuk sebagian kecil penyakit bawaan makanan (2-5%), menyebabkan mual muntah, parah dan diare penyakit bawaan makanan Bacillus. Terjadi karena kelangsungan hidup endospora bakteri ketika makanan tidak benar matang. Memasak suhu kurang dari atau sama dengan 100 C (212 F) memungkinkan beberapa spora Bacillus cereus untuk bertahan hidup. Masalah ini diperparah ketika makanan itu tidak benar didinginkan, yang memungkinkan endospores untuk berkecambah. Makanan dimasak tidak dimaksudkan untuk dipakai sendiri atau pendinginan yang cepat dan pendinginan harus disimpan pada suhu di atas 60 C (140 F). Perkecambahan dan pertumbuhan umumnya terjadi antara 10-50 C (50-122 F), meskipun beberapa strain psychrotrophic hasil pertumbuhan bakteri dalam produksi
9

enterotoksin, salah satunya sangat tahan terhadap panas dan pH antara 2 dan 11;. konsumsi menyebabkan dua jenis penyakit, diare dan muntah (muntah) sindrom .

Makanan yang Terkait Berbagai jenis makanan, termasuk daging, susu, sayuran, dan ikan, berkaitan dengan penyebab keracunan makanan tipe diare. Kasus-kasus tipe emetik umumnya berkaitan dengan makanan dari beras. Walaupun demikian, makanan bertepung lainnya seperti kentang, pasta, dan keju juga dapat menjadi penyebabnya. Campuran makanan seperti saus, pudding, sup, casserole (sejenis makanan yang dimasak dalam wadah tertutup di atas api kecil), pastry (sejenis kue), dan salad sering dicurigai sebagai penyebab dalam kasus-kasus keracunan makanan.

Pencegahan Pencegahan secara total mungkin tidak dapat dilakukan. Namun demikian, makanan yang dimasak, dipanaskan, dan disimpan dengan benar umumnya aman dari racun yang menyebabkan muntah. Resiko paling besar yaitu kontaminasi silang, yakni apabila makanan yang sudah dimasak bersentuhan dengan bahan mentah atau peralatan yang terkontaminasi (misalnya alas pemotong). Tipe emetik umumnya berkaitan dengan makanan yang mengandung tepung, yang disimpan dengan cara yang tidak benar (misalnya nasi, pasta). Penyimpanan dengan benar (di bawah 7C dan hanya untuk beberapa hari) akan mencegah pertumbuhan mikroorganisme dan produksi racun.

Populasi Rentan Semua orang diyakini rentan terhadap keracunan makanan oleh Bacillus cereus.

Epidemiologi Bacillus sp termasuk kedalam family Bacillaceae. Untuk bakteri Bacillus cereus sendiri merupakan bakteri gram positif, bersifat aerobik, dan mampu membentuk spora yang dapat ditemukan di tanah, pada sayuran maupun produk pangan (Tay, et al., 1982). Spora dari jenis bakteri ini tahan terhadap panas dan kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan dan mampu membentuk kecambah dalam larutan yang mengandung NaOH dan HCL.

10

3.

Bacillus subtilis Dapat menyebabkan meningitis, endokarditis, infeksi mata dan lain-lainnya.

Morfologi Bacillus subtilis termasuk jenis Bacillus. Bakteri ini termasuk bakteri gram positif, katalase positif yang umum ditemukan di tanah. Bacillus subtilis mempunyai kemampuan untuk membentuk endospora yang protektif yang memberi kemampuan bakteri tersebut mentolerir keadaan yang ekstrim. Tidak seperti species lain seperti sejarah, Bacillus subtilis diklasifikasikan sebagai obligat anaerob walau penelitian sekarang tidak benar. Bacillus subtilis tidak dianggap sebagai patogen walaupun kontaminasi makanan tetapi jarang menyebabkan keracunan makanan. Sporanya dapat tahan terhadap panas tinggi yang sering digunakan pada makanan dan bertanggung jawab terhadap kerusakan pada roti. Bacillus subtilis selnya berbentuk basil, ada yang tebal dan yang tipis. Biasanya bentuk rantai atau terpisah. Sebagian motil dan adapula yang non motil. Semua membentuk endospora yang berbentuk bulat dan oval. Bacillus subtilis merupakan jenis kelompok bakteri termofilik yang dapat tumbuh pada kisaran suhu 45 C 55 C dan mempunyai pertumbuhan suhu optimum pada suhu 60 C 80 . Bacilus Subtilis ini awalnya bernama Vibro subtilis oleh Christian Gottfried Ehrenberg pada tahun 1835. Kemudian nama Bacillus subtilis dikenalkan oleh Ferdinand Cohn pada 1872. Bacillus subtilis telah digunakan sepanjang 1950 sebagai alternatif dari obat karena efek immunostimulatory sel dari masalah, yang pada pencernaan telah ditemukan secara signifikan untuk kekebalan aktivasi antibodi spesifik GM, IgG ,dan Iga keluarnya. Bakteri ini dipasarkan di seluruh Amerika dan Eropa dari 1946 sebagai immunostimulatory bantuan dalam usus dan perawatan dari penyakit urinary tract seperti Rotavirus dan Shigella, tetapi ditolak popularitasnya setelah pengenalan konsumen antibiotik murah walaupun kurang menyebabkan reaksi alergi kesempatan yang cukup rendah dan racun normal flora usus.

Toksik Bacillus subtilis tidak dianggap sebagai manusia pathogen; dapat mencemari makanan tetapi jarang menyebabkan keracunan makanan. Bacillus subtilis produces the proteolytic enzyme subtilisin . Bacillus subtilis menghasilkan enzim proteolytic yang subtilisin. Bacillus subtilis spores dapat hidup yang ekstrim pemanasan yang sering digunakan
11

untuk memasak makanan, dan bertanggung jawab untuk menyebabkan kekentalan yang lengket, membenang konsistensi yang disebabkan oleh bakteri produksi panjang rantai polysaccharides dan manja dalam adonan roti. Bacillus subtilis dapat membagi asymmetrically, memproduksi sebuah endospore yang tahan terhadap faktor lingkungan seperti panas, asam, dan garam, yang dapat berada di dalam lingkungan dalam jangka waktu yang lama. Endospore adalah yang dibentuk pada saat gizi stres, memungkinkan organisme untuk terus berada di dalam lingkungan sampai kondisi menjadi baik. Sebelum proses untuk menghasilkan spora bakteri melalui proses produksi flagella dan mengambil DNA dari lingkungan. Bacillus subtilis terbukti untuk manipulasi genetik, karena itu telah menjadi banyak diadopsi sebagai model organisme untuk penelitian laboratorium, terutama dari sporulation, yang merupakan contoh sederhana dari diferensiasi selular. Hal ini juga sangat flagellated, yang memberikan B. subtilis kemampuan untuk bergerak sangat cepat. Keguanaan lain bakteri ini cukup banyak sekarang dangan berkembangnya teknologi. Bacillus subtilis strain QST 713 (dipasarkan sebagai QST 713 atau serenade) memiliki alam berhubung dgn fungisida aktivitas, dan bekerja sebagai agen kontrol biologi. populer di seluruh dunia sebelum pengenalan konsumen antibiotik immunostimulatory sebagai agen untuk membantu perawatan gastrointestinal dan penyakit urinary tract. Hal ini masih banyak digunakan di Eropa Barat dan Timur Tengah sebagai alternatif obat. dapat dikonversi menjadi peledak berbahaya compounds dari nitrogen, karbon dioksida, dan air. recombinants Bacillus subtilis str. pBE2C1 dan Bacillus subtilis str. pBE2C1AB digunakan dalam produksi polyhydroxyalkanoates (PHA) dan agar mereka dapat menggunakan gandum terendam air limbah sebagai sumber karbon untuk menurunkan biaya produksi PHA.

12

BAB II IDENTIFIKASI

2.1 Metode Penanaman Bakteri Penanaman bakteri atau biasa disebut juga inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Untuk melakukan penanaman bakteri (inokulasi) terlebih dahulu diusahakan agar semua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium agar tetap steril, hal ini agar menghindari terjadi kontaminasi. Berdasarkan wujud atau bentuk media dan sifat media, dimana dikenal beberpa cara penanaman bakteri, yaitu: A. Penanaman pada media padat bentuk plate Tujuan: Untuk mengisolasi/ memisahkan pertumbuhan bakteri satu dengan lainnya (yang ditanam specimen) Untuk memperbanyak bakteri (yang ditanam culture bakteri atau koloni bakteri) Untuk menghitung jumlah kuman (yang ditanam, suspensi sampel)

Cara penanaman: 1. Goresan sejajar : (isolasi) a. Ose dibakar sampai steril, dinginkan b. Dengan ose yang sudah steril diambil sampel atau bakteri culture, dipulaskan di salah sisi/ tepi media jangan menyentuh dinding petridish c. Dengan ose steril yang lain, pulasan itu digores-goreskan sejajar sampai memenuhi permukaan media. 2. Goresan sejajar melingkar : (isolasi) a. Ose dibakar sampai steril, dinginkan b. Dengan ose yang sudah steril diambil sampel atau bakteri cultur, dipulaskan di salah sisi/ tepi media jangan menyentuh dinding petridish c. Dengan ose steril yang lain, pulasan itu digores-goreskan sejajar pada salah satu tepi media, dengan salah satu sisinya d. Ose dibalik dengan melanjutkan goresan-goresan sejajar pertama, setelah medianya diputar 90C
13

e. Dengan ose yang dimiringkan goresan-goresan sejajar kedua, digoreskan sejajar lagi setelah medianya diputar 90C f. Media diputar 90C, goresan-goresan sejajar yang ketiga digoreskan sejajar lagi dengan ose yang sudah dibalik, sampai memenuhi permukaan media plate. 3. Cara taburan : (isolasi dan memperbanyak) a. Suspensi sampel, sampel cair atau cultur bakteri di dalam media cair diambil dengan pipet steril sebanyak 0,1 ml diteteskan di permukaan media plate tepat ditengah-tengahnya b. Dengan menggunakan spatel yang terbuat dari kaca/kawat, yang sudah steril dan dingin, tetesan itu diratakan pada seluh permukaan media plate. 4. Cara penuangan : (penghitungan) a. Suspensi sampel/ sampel cair diteteskan ke dalam petridish steril ssebanyak 0,1 atau 1 ml secara steril b. Dituangi media padat steril yang dicairkan, sebanyak sampai menutupi semua permukaan dasar petridish c. Campur baik-baik, tunggu sampai agar-agarnya membeku d. Dibalik, masuk incubator 37C 48 jam Catatan: Media yang digunakan tergantung dari jenis bakteri yang dihitung. Pembacaan: Pertumbuhan bakteri pada media padat disebut koloni yaitu kelompokankelompokan bakteri yang tumbuh pada media tersebut Koloni bakteri pada media padat dengan tujuan isolasi dapat dibedakan berdasarkan criteria sebagai berikut: 1. Ukuran 2. Warna 3. Bentuk 4. Permukaan 5. Sifatnya : diukur berapa diameternya dengan satuan mm : putih, kuning, hitam, hijau, merah dan sebagainya : bulat, serabut, bergelombang, rhizoid dan sebagainya : datar, cembung, cekung, kasar (rough), halus (smooth) : keruh, jernih, kering, berlendir, melekat pada perbenihan,

menjalar, haemolytis, anhaemolytis dan sebagainya. Koloni bakteri yang tumbuh pada media padat bentuk plate, dengan tujuan memperbanyak, yang penting diperhatikan selain adanya pertumbuhan koloni juga kemurniaan koloni itu
14

Koloni bakteri yang tumbuh pada media padat bentuk plate, dengan tujuan penghitungan, criteria koloni tidak perlu diperhatikan, tetapi tinggal dihitung saja.

B. Penanaman pada media padat di dalam tabung bentuk miring Tujuan: Untuk memperbanyak bakteri Untuk identifikasi Untuk menyimpan bakteri

Cara penanaman: 1. Goresan zig-zag: a. Dengan ose yang sudah steril dan dingin, diambil koloni bakteri b. Tutup tabung media dibuka dengan menjepit menggunakan jari kelingking kanan, mulut tabung dibakar dengan nyala api tidak berjelaga c. Ose yang sudah berisi koloni bakteri digoreskan zig-zag pada permukaan media, betul-betul ditengah media tidak terlalu kebawah/ keatas dan juga tidak terlalu kekiri/ kekanan d. Mulut tabung dibakar lagi, segera ditutup dengan tutupnya e. Ose dibakar lagi sampai steril Contoh: Media nutrient agar 2. Goresan zig-zag dan ditusuk: Pelaksanaan penanamannya seperti nomor 1 dengan perbedaan sebagai berikut: Urutan c setelah digoreskan zig-zag kemudian ditusukkan ditengah-tengahnya 1 sampai 2 kali, Contoh: Media TSIA Pembacaan: Koloni yang tumbuh diperhatikan kemurniannya, kemudian dibaca perubahanperubahan yang terjadi pada media dengan atau tanpa penambahan reagensia. C. Penanaman pada media semisolid di dalam tabung Tujuan: Untuk identifikasi bakteri Untuk menyimpan bakteri

15

Cara penanaman: a. Ose jarum penanam steril, dinginkan b. Dengan ose itu diambil koloni bakteri c. Tutup tabung dibuka dengan menggunakan jari kelingking kanan d. Mulut tabung dibakar sebentar, ose yang sudah ada koloni bakterinya ditusukkan tegak lurus di permukaan bagian tengah sampai dasar tabung e. Mulut tabung dibakar lagi dan ditutup kembali. Begitu pula osenya dibakar/ disteril kembali. Pembacaan: Koloni yang tumbuh diperhatikan kemurniannya dahulu, kemudian dibaca perubahanperubahan yang terjadi pada media itu (warna, gerak, dan sebagainya) dengan atau tanpa penambahan reagensia. D. Penanaman pada media cair Tujuan: Untuk memperbanyak cultur bakteri Untuk melihat gerak bakteri Untuk identifikasi

Cara penanaman: a. Ose dibakar sampai steril, dinginkan b. Dengan ose yang sudah steril dan dingin, diambil koloni bakteri c. Tutup tabung media dibuka, mulutnya dibakar d. Ose yang sudah berisi koloni bakteri digores-goreskan pada dinding tabung bagian dalam sebelah atas yang tadinya tertutup oleh cairan media e. Mulut tabung dibakar, tutup kembali. Ose bekas pakai juga dibakar sampai steril f. Setelah tabung diletakkan pada raknya (ditegakkan), goresan bakteri akan terendam cairan media. Pembacaan: Kalau bakteri yang ditanam dapat tumbuh didalam media cair itu, medianya menjadi keruh. Kalau tidak tumbuh medianya tetap jernih. Apabila bakterinya ditanam didalam media yang untuk identifikasi, disamping kekeruhan dapat juga diikuti perubahan warna indikatornya yang merupakan pertanda adanya perubahan/ pemecahan gula/bahan kimia yang terkandung dalam itu.
16

2.2 Identifikasi Bakteri Tujuan identifikasi bakteri, yaitu: 1. Menentukan arti penting pengobatan 2. Pedoman perawatan klinis 3. Menentukan uji kepekaan terhadap antibiotika 4. Menentukan apakah jenis mikroorganisme berbahaya berpengaruh pada kesehatan Adapun prinsip identifikasi, yaitu: 1. Identifikasi mikroorganisme menggunakan kriteria Genotip: Identifikasi karakteristik bakteri menggunkan teknik molekuler untuk analisis DNA dan RNA 2. Identifikasi mikroorganisme menggunakan kriteria Fenotif: Mikroskopis dengan pewarnaan Gram Isolasi : morfologi koloni dengan identifikasi Kebutuhan lingkungan untuk pertumbuhan Kepekaan terhadap antibiotika Kebutuhan nutrisi dan kemampuan metabolik

2.3 Isolasi dan Identifikasi Bacillus A. Alat Jarum ose Object glass Mikroskop Mikrometer Kertas merang Tabung reaksi Pipet tetes Beaker glass Cawan petri Oven Pembakar spirtus Inkubator Wrapper

B. Bahan Aquades Alkohol 70% Alumunium foil Medium Nutrient Agar (NA) Nitrat Broth (NB) Malachite Green Sterch Agar (SA) SIMA Semisolid Skim Milk Agar (SMA) Simon Citrat
17

MR-VP Broth KOH-Alfanafto Reagen A dan B, NB 0% NB +NaCl (6,5%, dan 10 %) Kristal Violet Lugols Iodine

Safranin Etanol 96% Reagen HO Media Rafinosa Laktosa Reagen Oksidase

C. Metode Hari I : Spesimen ditanam pada Blood agar plate dan Mac Conkey. Masuk inkubator 37C 24 jam. (hasil pada Hari II) Hari II : Koloni yang tersangka dari Blood agar plate dicat Gram. Kalau ditemukan Gram (+) batang kemudian ditanam pada media gula dan media lainnya. Masuk inkubator 37C 24 jam. (hasil pada Hari III) Hari III : Dibaca dan dicatat pertumbuhan pada media gula dan media lainnya, dilakukan test kimia.

D. Cara Kerja a. Pengambilan Sampel 1. Tanah diambil secara aseptis 2. Alumunium foil disiapkan yang sebelumnya disterilkan terlebih dahulu dengan alkohol 70% 3. Sampel diambil dengan cepat dan dengan hati-hati dimasukkan ke dalam alumunium foil steril kemudian ditutup rapat. b. Tahap Isolasi Bacillus 1. Preparasi suspensi dilakukan 2. Sampel tanah dimasukkan ke dalam tabung pengenceran pertama 3. Sampel tanah direbus pada suhu 80oC selama 10 menit

18

c. Tahap Pemurnian Dengan Metode Streak Kuadran 1. Dipilih satu koloni yang nampak terdiri dari satu tipe sel 2. Jarum ose dibakar, setelah dingin disentuhkan ke permukaan koloni bakteri yang akan disteak pada plating NA 3. Streak ini dianggap sebagai sterak primer pada permukaan NA 4. Jarum ose dibakar, diangkat lalu didinginkan dan disteakan melewati streak primer kesatu atau kedua dan kemudian dilanjutkan kestreak sekunder tanpa kembali kestreak primer 5. Jarum ose dibakar, diangkat lalu didinginkan melewati streak sekunder dan kemudian dilanjutkan kestreak tersier tanpa kembali kestreak primer dan sekunder diinkubasi pada suhu 30oC selama 2 x 24 jam d. Pengamatan Morfologi Koloni 1. Dibuat biakan pada media Nutrient Agar (NA) cawan 2. Diinkubasi 2 x 24 jam pada suhu 30oC 3. Diamati perbedaan bentuk koloni, ukuran, margin, elevasi, dan permukaan. e. Pengukuran Panjang Dan Lebar Sel 1. Disiapkan mikroskop yang telah dipasang mikrometer okuler yang sudah terkalibrasi 2. Dibuat preparat ulas bakteri uji dengan metode pewarnaan sederhana mengggunakan pewarna Methylen Blue 3. Diukur panjang dan lebar sel, kemudian dihitung panjang dan lebar sel sebenarnya f. Uji Pewarnaan Gram 1. Dibuat ulasan bakteri pada object glass, kemudian difiksasi 2. Ditetesi dengan gram A (Kristal violet), dibiarkan selama 60 detik 3. Dicuci dengan air mengalir, lalu dikeringanginkan 4. Ditetesi dengan gram B (lugols iodine), dibiarkan selama 60 detik 5. Dicuci dengan air mengalir, lalu dikeringanginkan 6. Dicuci dengan gram C(ethanol 96%) setetes demi settee sampai etanol yang jatuh berwarna bening 7. Ditetesi dengan gram D (safranin), dibiarkan selama 45 detik, dicuci dan dikeringanginkan 8. Diamati dibawah mikroskop

19

g. Uji Pewarnaan Endospora 1. Dibuat ulasan bakteri pada object glass lalu ditutupi dengan kertas merang 2. Ditetesi dengan Malachite Green diatas kertas merang dan diletakkan di atas air mendidih 3. Dibiarkan selama lim menit, jika pinggir mulai mongering, ditambahkan lagi Malachite Green h. Uji Motilitas 1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium SIMA semisolid sebanyak 1 ose 2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC 3. Dilihat pertumbuhan koloni bakterinya yang ada pada amedium SIMA semisolid i. Uji Hidrolisis Starch 1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium padat Starch Agar sebanyak 1 ose. 2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperature 30oC 3. Permukaan media ditetesi dengan larutan Lugols Iodine. 4. Diamati perubahan yang terjadi, jika terbentuk zona jernih di sekitar koloni menandakan hasil uji positif, dan jika tidak terbentuk zona jernih (warna biru reagen) menandakan hasil uji negatif j. Uji Hidolisis kasein 1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium padat SMA sebanyak 1 ose. 2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC 3. Diamati perubahan yang terjadi, jika terbentuk zona jernih di sekitar koloni menandakan hasil uji positif, dan jika warna media tetap menandakan hasil uji negatif k. Uji VP (Voges Proskauer) 1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium cair MR-VP sebanyak 1 ose 2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC 3. Bakteri ditetesi dengan alfanaftol 3 tetes dan KOH 40 % 2 tetes 4. Diamati perubahan yang terjadi, jika media berubah menjadi merah muda s.d merah setelah penambahan alfanaftol dan KOH 40% menandakan hasil uji positif, dan jika tidak terbentuk warna tersebut maka menandakan hasil uji negatif

20

l.

Uji Katalase 1. Dibuat preparat ulas bakteri pada objek glass 2. Ditetesi dengan larutan H2O2 3. Diamati perubahan yang terjadi 4. Jika terbentuk gelembung gas menunjukka bahwa hasil uji positif dan sebaliknya

m. Uji Oksidase 1. Dibuat preparat ulas bakteri pada objek glass, tutup dengan potongan tissue 2. Ditetesi dengan reagen oksidase 3. Diamati perubahan yang terjadi 4. Hasil positif jika berwarna biru marun, hasil uji negatif yaitu tidak terbentuk warna biru marun n. Uji Penggunaan Sitrat 1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium agar miring Simons Citrate sebanyak 1 ose 2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC 3. Diamati perubhan yang tejadi, jika hasil positif media berwarna biru sedangkan hasil negatif tetap berwarna hijau. o. Uji Gula 1. Bakteri uji ditumbuhkan pada medium Rafinosa dan Laktosa 2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC 3. Diamati perubahannya, hasil positif jika media berubah warna dari ungu menjadi kuning dan hasil negatif jika media tetap berwarna ungu. p. Uji Reduksi Nitrat 1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium cair Nitrate Broth sebanyak 1 ose 2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC 3. Diteteskan 1 ml nitrat reagen A dan dilanjutkan dengan nitrate reagen B 4. Hasil positif jika terbentuk warna merah tua/ merah gelap, jika belum terbentuk warna merah, ditambahkan bubuk seng (sampai dengan 5 mg/ml media) dan diamati jika terbentuk warna merah maka hasi pengujian positif

21

q. Uji Toleransi NaCl Dibuat tiga buah tabung Nutrient Broth yang mengandung Nacl 0%, 6,5 %, dan 10 % 1. Isolat diinokulasikan dengan streak kontinyu 2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC 3. Diamati hasilnya dengan melihat tingkat kekeruhan pada media r. Penentuan Spesies Melalui Pendekatan Homologi 1. Data-data yang diperoleh dibandingkan dengan data karakter bakteri dari sumber 2. Ditentukan persen homologinya dengan rumus % Homologi = Jumlah karakter yang sama x 100% Jumlah karakter yang diujikan E. Hasil Pengamatan dan Pembahasan a. Hasil Tabel 1. Pengamatan Morfologi Sel No 1. 2. 3. 4. 5, Pengamatan Bentuk koloni Ukuran Elevasi Margin Permukaan Circular Moderate Convex Entire Halus mengkilap Hasil

Tabel 2. Perbandingan Isolat dan Spesies-spesies Bacillus No 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Jenis Uji Gram Endospora Katalase Starch Casein Rafinossa NaCl 10% Isolat + + + + + + + + + + d + + d + + d + + + d
22

A + +

B + +

C + +

D + +

E + +

8. 9.

Sitrat Motilitas

+ +

+ d

d + + d

+ + + d

+ + -

+ + + -

10. VP 11. Oksidase

Tabel3. Pada Media Gula-gula No 1. 2. 3. Spesies B. anthracis B. cereus B. subtilis Glukosa Laktosa Mannitol Maltosa + +
+

Sukrosa + +/+

+ +

Tabel 4. Pengukuran Homologi No 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Jenis Uji Gram Endospora Starch Casein Rafinossa NaCl 10% Sitrat Motilitas VP IA 1 1 1 1 1 0 0 1 1 IB 1 1 1 1 1 0 0 0 1 IC 1 1 1 1 1 0 0 0 1 ID 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 5 IE 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 5

10. Oksidase 1 1 1 Jumlah karakter 8 7 7 yang sama % Homologi = Jumlah karakter yang sama x 100% Jumlah karakter yang diujikan = 8 x 100 % 10 Keterangan : d = 16-84% strain positif A = Bacillus anthracis B = Bacillus cereus = 80 %

C = Bacillus thuringiensis D = Bacillus megaterium E = Bacillus subtilis

23

24

b. Pembahasan Pengambilan sampel (tanah kandang) dilakukan dengan cara sterilisasi sendok yang ingin dipakai terlebih dahulu dengan menggunakan autoklaf kemudian ambil sampel tanah kedalaman 3cm dari permukaan, masukkan kedalam alumunium foil yang sebelumnya disterilisasikan terlebih dahulu dengan menggunakan alkohol 70% kemudian ditutup rapat. Pengambilan sampel dilakukan dengan mensterilisasikan alat terlebih dahulu agar dapat dilindungi dari kontaminasi. Dilakukan dengan prosedur kerja aseptik dengan senyawa desinfektan yang sesuai. Menyesuaikan wadah sampel yang diambil dan metode yang sesuai dengan jenis sampel. Kemudian sampel yang mengandung bakteri tersebut dijaga agar tetap menggambarkan kondisi yang ada sebelum memasuki tahap analisa. Isolasi Bacillus sp. dilakukan dengan cara sampel tanah yang telah didapat dimasukkan kedalam tabung yang berisi akuades steril kemudian direbus 10 menit dengan suhu 80C diatas dandang, tanah rebusan diinokulasikan kedalam cawan yang telah berisi medium NA kemudian disreak sinambung, inkubasi selama 2x24 jam dengan suhu ruang. Proses perebusan dilakukan agar bakteri yang diinginkan (Bacillus sp.) membentuk endospora. Terbentuknya endospora bertujuan untuk melindungi bakteri dari lingkungan yang kurang menguntungkan (Sudjadi, 2006). Misalnya, lingkungan yang terlalu kering, banyak mengandung bahan kimia, dan panas yang terlalu tinggi. Endospora memiliki dinding yang tebal, oleh karena itu bakteri yang menghasilkan endospora dapat bertahan hidup pada lingkungan yang ekstrim. Jika keadaan lingkungan membaik, maka pembungkus spora segera pecah dan bakteri kembali memulai aktivitas hidupnya sebagaimana biasanya. Contoh bakteri yang menghasilkan endospora adalah Bacillus dan Clostridium (Sudjadi, 2006). Pemurnian sampel dari hasil yang telah diisolasi dilakukan dengan cara pemilihan satu koloni (koloni tunggal) yang nampak terdiri dari satu tipe sel, amati bakteri Bacillus sp. inokulasikan ke media NA disteak kuadran kemudian diinkubasi selama 2x24 jam dengan suhu ruang 30oC. Hasil pemurnian ambil koloni tunggal kemudian diamati bentuk, ukuran, elevasi, permukaan, dan margin didapatkan hasil koloni berbentuk bulat atau circular,
25

berukuran sedang atau moderate, elevasi convex, permukaan halus mengkilap, dan margin entre. Bacillus berbentuk bulat (coccus), memiliki permukaan yang halus dan mengkilap. Koloni tunggal yang terbentuk diperiksa menggunakan pewarnaan Gram untuk melihat karakteristik dinding sel dan bentuk dari sel tersebut. Pengamatan dengan mikroskop dilakukan dengan menggunakan mikroskop jenis mikroskop cahaya. Untuk pengamatan dinding sel bakteri, digunakan perbesaran sebesar 1000x dan menggunakan minyak imersi. Selain diamati ciri-ciri morfologi koloninya hasil pemurnian juga digunakan untuk pembuatan stok di media NA miring kemudian diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu ruang. Pembuatan stok dilakukan dua kali, digunakan untuk melakukan berbagai macam uji. Pengukuran panjang dan lebar sel dilakukan dengan menyiapkan mikroskop yang telah dipasang micrometer okuler yang terkalibrasi, dibuat preparat ulas bakteri uji dengan metode pewarnaan sederhana dengan menggunakan pewarnaan metilen blue kemudian diukur panjang dan lebar sel kemudian dihitung panjang dan lebar sel sebenarnya (m). Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah memilen biru, krisdal violet dan karbol fuehsin (Sudjadi, 2006). Hasil perhitungan kalibrasi dimana skala object dibagi dengan skala okuler dikali 10 m didapatkan hasil 2,5 m, sehingga didapatkan panjang sel sebenarnya, skala panjang dikali hasil kalibrasi yaitu 2,5 m kemudian lebar sel sebenarnya, skala lebar dikali hasil kalibrasi yaitu didapatkan 2,5 m. Bacillus thuringiensis atau biasa disebut Bt berbentuk batang dengan ukuran panjang 3-5 m dan lebar 1,0-1,2 m. Bacillus antracis yaitu bakteri berbentuk batang berukuran panjang 1-8 m, lebar 1-1,5 m (Sudjadi, 2006). Uji pewarnaan gram dilakukan dengan mengulas bakteri pada object glass kemudian difiksasi selama 3-5 kali tujuan dari fiksasi adalah untuk
26

mematikan sel bakteri tanpa merubah bentuk dan strukturnya, membuka poripori dari sel bakteri sehingga mudah terwarnai, dan merekatkan bakteri ke object glass (Udin, 2001). Kemudian ditetesi dengan gram A yaitu Kristal violet didiamkan selama 60 detik, pemberian Kristal violet bertujuan untuk memberikan warna dasar atau pewarna primer yaitu pewarnaan dinding sel bakteri. Kemudian dicuci keringanginkan, ditetesi lugols iodine dibiarkan selama 60 detik bertujuan sebagai pewarna kedua atau pewarna pengganti. Setelah terwarnai dicuci keringanginkan kemudian dicuci dengan gram C (ethanol 96%) setetes demi setetes sampai ethanol yang jatuh berwarana bening, namun jangan sampai terlalu banyak. Berfungsi untuk melarutkan pewarna (decolorizing agent) kemudian ditetesi dengan gram D (safranin) dibiarkan 45 detik lalu cuci keringanginkan, pemberian safranin digunakan sebagai pewarna pembanding (James, 2008). Setelah itu amati dibawah mikroskop. Hasil yang didapat terlihat warna ungu muda. Bakteri gram positif mempertahankan zat warna gentian violet dan bakteri gram negatif mempertahankan warna merah (Udin, 2001). Uji pewarnaan endospora dilakukan dengan mengulas bakteri pada object glass kemudian ditutup dengan kertas merang lalu ditetesi dengan malachite green diatas kertas merang kemudian diuapkan diatas dandang, pemberian malachite green bertujuan untuk melumuri fiksasi panas. Jangan sampai mengering jika kering ditetesi lagi malachite green. Pemanasan bertujuan untuk membantu warna menembus dinding endospora. Kemudian bilas dengan aquades lalu ditetesi dengan safranin sebagai counterstain yang digunakan untuk melumuri bagian warna dari sel yang lain daripada endospora (James, 2008). Didiamkan selama 45 detik, dicuci keringanginkan kemudian diamati dibawah mikroskop didapatkan hasilkan endospora berwarna hijau sedangkan sel vegetative berwarna merah. Uji mortilitas bakteri yang diinokulasikan pada medium SIMA semisolid sebanyak 1 ose kemudian diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu ruang 30oC, menunjukan tidak adanya pertumbuhan koloni pada medium tegak SIMA yang telah ditusuk dengan jarum ose, hasilnya hanya tumbuh diatas permukaan medium. Banyaknya koloni bakteri yang tumbuh pada suatu substrat sangat dipengaruhi oleh tersedianya kondisi fisik, nutrisi, dan sifat
27

hudupnya

(Priyani,

2006). Pertumbuhan

dipermukaan

medium

ini

dikarenakan Bacillus merupakan bakteri yang bersifat aerob. Namun tidak membuktikan mortilitas, hal ini disebabkan pada saat menginokulasikan bakteri dengan menggunakan jarum ose, bakteri tersebut tidak masuk ke dalam media hanya tertanam dipermukaan. Namun ada beberapa

spesies Bacillus yang tidak bersiat motil salah satunya adalah Bacillus anthracis merupakan bakteri berbentuk batang, berukuran 1,6 m, tidak mempunyai alat gerak atau motil (Akoso, 2009). Uji hidrolisis starch dengan menggunakan medium padat Starch Agar sebanyak 1 ose yang diinkubasi selama 2x24 jam dalam suhu ruang kemudian permukaan media digenangi dengan larutan Lugols iodine menghasilkan positif karena terbentuknya zona jernih pada media hal ini disebabkan karena enzim amilase yang bersifat eksoenzim akan memecah amilum menjadi monomer-monomernya. Starch atau pati dipecah menjadi unit-unit yang lebih kecil yaitu dengan memotong ikatan-ikatan glikosidiknya. Salah satu yang dapat memotong ikatan glokosidik adalah enzim amilase (Anonim, 2011). Uji hidrolisis kasein menggunakan medium padat Skim Milk Agar (SMA) diinokulasikan bakteri sebanyak 1 ose kedalam medium tersebut kemudian diinkubasi selama 2x24 jam suhu ruang. Hasil menunjukan positif yaitu terdapatnya zona jernih pada media SMA. Kaseinase akan memecah kasein menjadi parakaseinase yang dapat bereaksi dengan susu tersebut sehingga menghasilkan kalsium parakaseinat. Uji VP (Voges Proskaner) menggunakan medium cair MR-VP yang telah diinokulasikan dengan 1 ose bakteri kemudian diinkubasi selama 2x24 jam pada temperature 30oC, bakteri ditetesi dengan alfanaftol sebanyak 3 tetes dan KOH 40% 2 tetes menunjukan hasi positif karena warna media menjadi orange muda mendekati merah. Penambahan alfanaftol akan bereaksi dengan aseton sedangkan pemberian KOH 40% untuk mengoksidasi proses tersebut sehingga terjadi warna orange sampai merah. Prinsip dari uji ini adalah menentukan kemampuan beberapa mikroorganisme untuk menghasilkan produk akhir yang netral (asetil-mythyil karbinol) dari fermentasi glukosa. Uji ini digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme yang melaksanakan fermentasi 2,3-butanadiol. Bila bakteri memfermentasikan karbohidrat menjadi 2,3-butanadiol sebagai produk utama,
28

akan terjadi penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan (Sudjadi, 2006). Penambahan 40% KOH dan 5% larutan alfanaphtol dalam etanol dapat menentukan adanya asetolin (asetilmethylkarbinol), suatu senyawa pemuka dalam sintetis 2,3-butanadiol. Penambahan KOH adanya asetolin ditunjukan oleh perubahan warna kaldu menjadi merah muda. Perubahan warna ini diperjelas dengan penambahan larutan alfanaphtol. Perubahan warna kaldu biakan lebih jelas pada bagian yang berhubungan dengan udara, karena sebagian 2,3-butanadiol dioksidasi kembali menjadi asetolin sehingga memperjelas hasil reaksi (Sudjadi, 2006). Uji katalase dilakukan dengan membuat preparat ulas bakteri pada object glass, ditetesi dengan larutan H2O2 kemudian diamati perubahan yang terjadi hasil menunjukan positif karena terbentuknya gelembung gas. Selama respirasi aerobik (proses fosforilasi oksidatif), mikroorganisme menghasilkan hydrogen peroksida, bahkan ada yang menghasilkan superoksida yang sangat beracun. Senyawa ini dalam jumlah yang besar akan menyebabkan kematian pada mikroorganisme. Senyawa ini dihasilkan oleh mikroorganisme aerobik, fakultatif aerob maupun mikroaerofilik yang menggunakan jalur repirasi aerobik. Superoksida dismutase adalah enzim yang bertanggung jawab untuk menguraikan khususnya superoksida pada organisme aerob yang bersifat katalase negatif. Produksi katalase bisa diidentifikasikan dengan menambahkan reagen H2O2 pada suspense bakteri. Jika dihasilkan gelembung gas, berarti bakteri tersebut mampu memproduksi enzim katalase. Jika tidak dihasilkan gelembung gas berarti uji katalase dinyatakan negative. Uji oksidase dilakukan dengan membuat preparat ulas bakteri pada object glass, ditutup dengan potongan tissue, ditetesi dengan reagen oksidase kemudian diamati perubahan yang terjadi. Hasil yang didapat positif karena hasil ulasan yang telah ditetesi reagen oksidase berwarna biru marun. Enzim oksidase memegang peranan penting dalam transport electron selama respirasi aerobik. Sitokrom oksidase mengkatalisis oksidasi dan reduksi sitokrom oleh molekul oksigen. Enzim oksidase dihasilkan oleh bakteri aerob, fakultatif anaerob, dan mikroaerofilik. Sifat kemoorganotrop dan fakultatif anaerob pada

29

Bacillus sp. Menyebabkan bakteri ini mampu memanfaatkan sumber karbon tersedia (Priyani, 2006). Mikroorganisme ini menggunakan oksigen, sebagai akseptor elektron terakhir selama penguraian karbohidrat untuk menghasilkan energi.

Kemampuan bakteri memproduksi sitokrom oksidase dapat diketahui dari reaksi yang ditimbulkan setelah pemberian reagen oksidase pada koloni bakteri. Enzim ini merupakan bagian dari kompleks enzim yang berperan dalam proses foforilasi oksidatiif. Reagen yang digunakan adalah tetramethylD- phenylenediaminedihyrocloride. Reagen akan mendonorkan electron terhadap enzim ini sehingga akan terosidasi membentuk senyawa yang berwarna biru kehitaman. Positif tertunda (warna biru muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi) menandakan bahwa bakteri uji memiliki sedikit enzim. Tidak adanya perubahan warna mengindikasikan bahwa uji yang dilakukan negatif (James, 2008). Uji penggunaan sitrat dilakukan dengan menginokulasikan bakteri uji pada medium agar miring Simon Citrate sebanyak 1 ose, inkubasi selama 2x24 jam pada temperature 30oC kemudian diamati perubahan yang terjadi, hasil yang didapat adalah negatif karena media tetap berwarna biru. Sumber karbon asam sitrat akan dipecah menjadi oksalo asetat kemudian menjadi asam asetat. Karena adanya proses peningkatan ph sehingga berwarna biru. Uji lactose dan raffinosa dilakukan dengan cara bakteri uji ditumbuhkan pada medium lactosa dan raffinosa, diinkubasi selama 2x24 jam pada temperature 30oC kemudian diamati perubahan warna pada media, hasil menunjukan bahwa warna media tidak berubah tetap berwarna ungu. Uji toleransi NaCl dibuat tiga buah tabung Nutrient broth yang mengandung NaCl 0%, 6,5%, dan 10%, isolate diinokulasikan kedalam ketiga tabung masing-masing 1 ose, diinkubasi selama 2x24 jam pada temperature 30oC kemudian diamati hasilnya dengan melihat tingkat kekeruhan media. Hasil yang didapat tingkat kekeruhan yang paling tinggi adalah pada konsentrasi NaCl 0%. Penentuan spesies melalui pendekatan homologi dilakukan dengan mengumpulkan data-data yang diperoleh kemudian dibandingkan dengan data karakter bakteri dari sumber. Berdasarkan hasil perhitungan persen

homologi, jumlah terbesar adalah 80% yaitu antara isolat dengan spesies A
30

(Bacillus anthracis). Karena pengambilan sampel tanah disekitar kandang maka tanah tersebut mengandung banyak Bacillus anthracis. Bakteri ini banyak menyerang hewan herbivora. Misalnya domba, lembu, unta, rusa, sejenis campuran kuda-keledai, kuda, dan kambing. Bacillus anthracis termasuk klasifikasi gram positif, nonmotile, yang menjadi cikal bakal bakteri spora. Kuman ini berkembang dan bertahan tahunan dalam berbagai keadaan di tanah, air, atau benda apa pun. Vegetasi sel berukuran panjang 8 mikron dengan lebar 1-1,5 mikron ini mampu hidup selama bertahun-tahun di tanah (Akoso, 2009).

31

BAB III PENUTUP

3.1 Kesimpulan Kelompok Bacillus merupakan bakteri berbentuk batang (basil), dan tergolong dalam bakteri gram positif yang umumnya tumbuh pada medium yang mengandung oksigen (bersifat aerobik) sehingga dikenal pula dengan istilah aerobic sporeformers. Bacillus adalah organisme saprofit yang lazim terdapat dalam tanah, air, udara, dan tumbuh-tumbuhan. Penyebab antraks adalah bakteri Bacillus anthracis. Bakteri ini bersifat aerob, memerlukan oksigen untuk hidup. Di alam bebas bakteri ini membentuk spora yang tahan puluhan tahun dalam tanah dan bisa menjadi sumber penularan pada hewan dan manusia. Hewan tertular akibat memakan spora yang menempel pada tanaman yang dimakan. Hewan yang mati akibat antraks harus langsung dikubur atau dibakar, tidak boleh dilukai supaya bakteri tidak menyebar. Penularan pada manusia bisa lewat kontak langsung spora yang ada di tanah, tanaman, maupun bahan dari hewan sakit (kulit, daging, tulang atau darah); mengonsumsi produk hewan yang kena antraks: atau melalui udara yang mengandung spora, misalnya, pada pekerja di pabrik wool atau kulit binatang. Karenanya ada empat tipe antraks yaitu antraks kulit, antraks usus (pencernaan), antraks paru (pernapasan) dan antraks otak.Antraks otak terjadi jika bakteri terbawa darah masuk ke otak. Bacillus cereus dapat menyebabkan keracuann makanan oleh enterotoksin yang terdapat pada makanan seperti nasi yang telah dimasak tetapi kemudian diletakkan ditempatyang hangat sehingga terjadi sporulasi dan terbentuklah toksin itu. Dapat juga menyebabkan pneumonia, bronkopeumonia dan luka. Bakteri ini adalah jenis bakteri yang umum ditemukan di tanah, air, udara dan materi tumbuhan yang terdekomposisi. Termasuk kelompok bakteri gram positif, aerobik, mampu membentuk endospora. Bacillus subtilis memiliki kemampuan memproduksi antibiotik dalam bentuk lipopeptida, salah satunya adalah iturin. Iturin membantu Bacillus subtilis berkompetisi dengan mikroorganisme lain dengan cara membunuh

mikroorganisme lain atau menurunkan tingkat pertumbuhannya. Iturin juga memiliki aktivitas fungisida terhadap pathogen. ada beberapa penelitian ditemukan bahwa penambahan Bacillus subtilis perairan dapat meningkatkan kualitas perairan dengan
32

mengurangi konsentrasi CO2 perairan. Penggunaan Bacillus subtilis pada tambak udang menunjukkan bahwa Bacillus subtilis mampu meningkatkan kesintasan larva udang windu dan mencegah dari penyakit vibriosis akibat Vibrio harveyi. Selain itu Bacillus subtilis secara alami bersimbiosis pada saluran pencernaan udang windu. Bacillus sp. memiliki ciri-ciri morfologi sebagai berikut: koloni berbentuk bulat atau circular, berukuran sedang atau moderate, elevasi convex, permukaan halus mengkilap, dan margin entre. Lebar sel Bacillus sebenarnya 2,5 sedangkan Panjang sel sebenarnya 2,5 . Hasil uji positif yaitu uji pewarnaan gram, pewarnaan endospora, uji hidrolisis starch, uji hidrolisis kasein, uji VP, uji katalase, dan uji oksidase. Hasil uji negatif yaitu uji lactose dan raffinosa, uji motilitas, uji penggunaan sitrat, dan uji toleransi NaCl. Berdasarkan hasil perhitungan persen homologi, jumlah terbesar adalah 80% yaitu isolat Bacillus anthracis karena sampel yang digunakan adalah tanah kandang.

33

DAFTAR PUSTAKA

Jawetz, Melnick dan Adelberg. 1996. Mikrobiologi Kedokteran. EGC: Jakarta. Rahim, Abdul dkk. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi. Binarupa Aksara: Jakarta. Dwidjoseputro, D. 1998. Dasar dasar Mikrobiologi. Djambatan: Malang. Soemarno. 2000. Isoalsi dan Identifikasi Bakteri Klinik. Akademi Analis Kesehatan: Yogyakarta. Akoso., B. 2009. Epidemiologi dan Pengendalian Anthrax Penyakit Menular pada Hewan dan Manusia. Penerbit Kanisius (Anggota IKAPI): Yogyakarta. Barrow, G. I and Feltham, R.K.A.1993. Cowan and Steels Manual for The Identification of Medical Bacteria Third Education. Cambridge: University Press, Australia. Dwipayana., Herto. D. 2010. Identification of Bacterial Diversity in Waste Recycling Paint Sludge by Conventuonal Microbiological Technique. Environmental Engineering Study Program. Bandung. James. J., Colin. B. 2008. Prinsip-Prinsip Sains untuk Keperawatan. Penerbit Erlangga: Jakarta.

Sudjadi. B., S. Laila. 2006. Biologi Sains dalam Kehidupan. Penerbit Yudhistira.

Priyani. N., Liliyanto., dan Kiki. N. 2006. Uji Potensi Bacillus sp. dan Escherichia coli dalam Mendegradasi Alkil Berzen Sebagai Bahan Aktif Sumatra. Vol. 1 (2). ISSN 1907-5537. Hal 35-37. http://dede-bogel.blogspot.com/2011/07/karakteristik-dan-potensi-antibiotik.html http://id.shvoong.com/exact-sciences/biochemistry/2174115-bakteri-bacilluscereus/#ixzz1raKQo3MA
34

Detergen.Jurnal

Biologi

http://lutfiblurry.blogspot.com/2011/02/bacillus-subtilis-dan-aplikasinya-dalam.html http://yongkikastanyaluthana.wordpress.com/2008/11/22/4141 file:///F:/laporan-isolasi-dan-identifikasi.html

35