P. 1
HPLC

HPLC

|Views: 51|Likes:
Published by Ndach' Moetz

More info:

Published by: Ndach' Moetz on Apr 30, 2012
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOCX, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

05/10/2013

pdf

text

original

A.

Prinsip Dasar HPLC Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut : dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solute-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Computer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC. B. Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi, yaitu: 1. Fasa Gerak Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelariut. Berbeda dengan kromatografi gas, HPLC mempunyai lebih banyak pilihan fasa gerak, dibandingkan dengan fasa gerak

fasa gerak hanya sebagai pembawa solute melewati kolom menuju detector. Sebaliknya fasa gerak untuk kromatografi eksklusi bersifat non interaktif. zat cair harus mudah diperoleh. Dalam kromatografi gas. Kecepatan alir berkisar antara 0. Oleh karena itu. Menghasilkan tekanan sampai 600 psi (pons/in2) 2. Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor.1-10 mL/menit 4. dan tidak beracun. adsorpsi. Sebaliknya dalam HPLC. Bahan tahan korosi Dikenal tiga jenis pompa yang masing-masing memiliki kenutungan dan kekurangannya yaitu pompa reciprocating. Oleh karena itu. Akibatnya. Keluaran bebas pulsa 3. 4. dan penukar ion bersifat interaktif dalam arti fasa gerak berinteraksi dengan komponen-komponen cuplikan. displacement dan pneumatic. 3. Selain itu. sesuai dengan detektor. waktu retensi sangat dipengaruhi oleh jenis pelarut. fasa gerak dapat berinteraksi dengan solutesolut. Pompa reciprocating Jenis pompa ini sekarang banyak dipakai. zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan di analisis. waktu retensi dengan kromatografi ini tidak bergantung pada komposisi fasa gerak. Persyaratan fasa gerak HPLC Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa persyaratan berikut: 1. 2. keluaran pompa ini bebas pulsa. 2. zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat menganggu interpretasi kromatogram. fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan. murah.untuk kromatografi gas. Pompa Pompa dalam HPLC dapat dianalogikan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Pompa displacement Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakan oleh motor. Jenis fasa gerak Fasa gerak untuk kromatografi partisi. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung tekanan baik kolom dan viskositas pelarut. zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom. Akan tetapi pompa ini keterbatasan kapasitas pelarut (~250 mL) dan tidak mudah untuk melakukan pergantian pelarut. zat cair tidak kental. Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan : 1. 5. . 6. Piston berupa batang gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. tidak mudah terbakar. fasa gerak selain berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju detector.

Akan tetapi mempunyai keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan tekanan balik kolom. Kolom Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat dari gelas berdinding tebal. Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali. detector sepesifik memberi respon terhadap beberapa sifat solute yang tidak dimiliki oleh fasa gerak. Oleh karena itu.5 hingga 5 μL. 3. perlu diusahakan tekanan tidak menurun ketika memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak. Sebaliknya. walaupun demikian detector harus memenuhi persyaratan berikut: (1) cukup sensitive. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. cuplikan yang dimasukkan harus sekecil mungkin.(3) respon linear terhadap solute. detectoe yang bersifat umum terhadap solute setelah fasa gerak dihilangkan dengan penguapan. Loop dapat diganti-ganti dan tersedia berbagai ukuran volume dari 5 hingga 500μL. Injeksi Syringe Alat yang paling dulu dan paling mudah untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. Injeksi ‘stop-flow’ Injeksi stop-floe adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara. faktor ketidaktepatan pengukuran HPLC terletak pada keterulangan pemasukan cuplikan ke dalam peking kolom. 4. . Detector Berbagai detector untuk HPLC telah tersedia. 2. Masalahnya. sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. 3. (2)stabilitas dan keterulangan tinggi. Detector berdasarkan absorpsi UV merupakan detector HPLC yang paling banyak di pake. (b) kran diputar untuk mengubah posisi ‘load’ menjadi posisi ‘injeksi’ dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Syringe disuntikkan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. (4) waktu respon pendek sehinggatidak bergantung kecepatan alir . Dengan sistem pemasukan cuplikan ini memungkinkan memasukkan cuplikan pada tekanan 7000 psi dengan ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia dengan volume 0. Kran Cuplikan Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan. akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikit lebih baik dari 2-3 % dan sering lebih jelek. Selain itu.(5)realibilitas tinggi dan mudah digunakan. Unit Sistem Penyuntikan atau Penginjeksian Sampel Kadang kala. Detector elektrokimia paling banyak dipakai terutama dalam HPLC penukar ion.Pompa pneumatic Dalam pompa ini pelarut di dorong oleh gas bertekanan tinggi. beberapa puluh mikroliter. (6) tidak merusak cuplikan. Kolom utama berisi fas diam. Detector HPLC dikelompokan ke dalam tiga jenis. tempat terjadinya pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya. Untuk memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah: (a) sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi ‘load’. Terakhir. yaitu: detector umum memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi dengan adanaya solute. cuplikan masih berada dalam loop. kebanyakan memasukan cuplikan ke dalam kolom dapat menyebabkan band broadening. 5. Berikut beberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam sistem HPLC : 1.

Tekanan solven di atur dengan pengatur dan pengukur tekanan. Kolom yang tersedia mempunyai banyak sekali pelat teori (lebih dari 100. dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang di analisis. Beberapa kelebihan KCKT diantaranya ialah 1. HPLC juga dapat menganalisis senyawa yang tidak mudah menguap dan termolabil. 4. dapat dilaksanakan pada suhu kamar. pelarut pengembang bisa dipakai berulang kali demikian juga dengan kolomnya. Pompa pemasuk solven pada tekanan konstan hingga tekanan kurang lebih 4500 psi dengan laju alir rendah. peka. 6. . lipid dan gula. HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak. Rekorder menghasilkan kromatogram zat-zat yang dipisahkan dari suatu sampel.C. mudah memperoleh cuplikan. misalnya terpenoid tinggi. detektor HPLC dapat divariasi dan unik. 9. Dengan pertolongan mikrosiring. misalnya CH3 berair yang secara bertingkat mengalami perubahan menjadi CH3OH murni. 2. yakni beberapa milliliter per menit. 8. sampel dimasukan ke dalam sampel loop yang kemudian bersama-sama dengan solven masuk ke dalam kolom. yang penampakannya ditunjukan oleh perekam (pencatat = recorder). Tahap pemekatan dengan ekstraksi solven dan penguapan untuk memperkecil volum sering kali diperlukan sebelum pengerjaan sampel dengan HPLC. kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT atau HPLC = High Performance Liquid Chromatography) mempunyai beberapa kelebihan. D. E. Minyak atsiri terdiri atas campuran yang sangat rumit dan oleh karena itu HPLC berguna untuk memisahkan campuran rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponenkomponennya. segala senyawa jenis fenol. menjamin pemisahan yang baik pada C-18 yang terikat pada silica gel. 5. cepat dan mudah melaksanakannya.000 untuk kolom 100 cm). alkaloid. ideal untuk molekul besar dan ion. 7. HPLC baik digunakan untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spekrum UV atau spectrum sinar tampak. yang dipasang tepat pada sampel loop. Aplikasi HPLC Dalam Kehidupan HPLC juga cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Suatu solven dengan polaritas rendah. Solven ini dikemudian masuk ke dalam katup injeksi berbutar. Kelebihan HPLC Dibandingkan dengan kromatografi gas. Hal ini terutama sering dilakukan untuk analisis senyawa-senyawa hidrokarbon aromatic polisiklik (PAH) atau residu pestisida dalam makanan. Sebagai alternative lain. Hasil pemisahan dideteksi oleh detector. 3. Cara Kerja HPLC Mula-mula solven diambil melalui pompa. sampel air dapat di absorpsi oleh suatu adsorben padat (C8 atau C18 yang terikat pada silica gel). daya pisahnya baik. diikuti dengan desorpsi dalam suatu solven yang kemudian langsung dimasukan kedalam kolom.

dengan fase diam berupa kolom dan larutan tertentu sebagai fase geraknya • Instrumentasi HPLC yaitu: 1. lipid dan gula. Fasa Gerak 2. Pompa 3. Unit Sistem Penyuntikan atau Penginjeksian Sampel 4. . IV. KESIMPULAN • Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan analit berdasarkan kepolarannya. kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT atau HPLC = High Performance Liquid Chromatography) mempunyai beberapa kelebihan. misalnya terpenoid tinggi. • HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak. Cuplikan dapat dipisahkan secara preparative. Detector • Dibandingkan dengan kromatografi gas. Kolom 5.dan kromatografi dilakukan dalam kondisi mendekati kondisi ideal demikian rupa sehingga dapat diperoleh dalam beberapa menit dan ditafsirkan secara kuantitatif dengan ketepatan yang lumayan. segala senyawa jenis fenol. alkaloid.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->