You are on page 1of 8

PENGEMBANGAN METODE TRANSFORMASI GENETIK TANAMAN UNTUK MENINGKATKAN KESEJAHTERAAN HIDUP MANUSIA

Metode transformasi

genetik tanaman merupakan metode alternatif untuk

menghasilkan tanaman pangan hasil rekayasa genetik yang memiliki sifat-sifat unggul, diantaranya ketahanan terhadap hama dan penyakit, ketahanan terhadap herbisida, perubahan kandungan nutrisi dan peningkatan daya simpan. Transformasi genetik adalah suatu perpindahan gen asing yang diisolasi dari tanaman, virus, bakteri atau hewan ke dalam suatu genom baru. Pada tanaman, keberhasilan transformasi genetik ditunjukkan oleh keberhasilan pertumbuhan tanaman baru yang normal, fertil dan dapat mengekspresikan gen baru hasil insersi. Proses transformasi genetik terdiri dari beberapa tahap yaitu insersi, integrasi, ekspresi dan pewarisan sifat DNA baru. Sampai saat ini telah banyak tanaman pangan transgenik yang dihasilkan, dan meskipun terdapat kontroversi tentang tanaman pagan transgenik, area tanaman hasil rekayasa genetika tersebut secara global terus meningkat, diantaranya jagung tahan hama dan herbisida, kedelai tahan herbisida, tomat tahan herbisida, kanola tahan herbisida dan lain-lainnya. Melalui perakitan tanaman transgenik, selain tanaman dapat menghasilkan panen yang lebih tinggi karena tahan terhadap serangan hama dan penyakit, petani dapat menggunakan herbisida secara tidak berlebihan dan mengurangi biaya pengolahan tanah. Hal ini telah menjadi bukti bahwa penggunaan tanaman produk bioteknologi memberikan kontribusi yang nyata bagi peningkatan kesejahteraan hidup manusia, yaitu meningkatkan hasil, mengurangi biaya budiaya, meningkatkan keuntungan serta membantu melindungi lingkungan. Tanaman produk bioteknologi yang telah disetujui untuk pangan merupakan tanaman yang direkayasa untuk memiliki sifat seperti: (1) ketahanan terhadap hama dan penyakit, (2) ketahanan terhadap herbisida, (3) perubahan kandungan nutrisi dan (4) peningkatan daya simpan. Usaha untuk mendapatkan tanaman dengan sifat-sifat tambahan yang berguna dilakukan dengan metode transformasi genetik, yaitu dengan cara menyisipkan gen tertentu ke dalam genom tanaman. Tujuan pengembangan metode transformasi genetik tanaman antara lain adalah (1) untuk meningkatkan nilai agrikultural, nilai hortikultural dan ornamental tanaman, (2) menjadikan tanaman transgenik sebagai pabrik biologi untuk memproduksi protein atau metabolit lainnya yang mempunyai nilai komersial tinggi dan (3) menjadikan tanaman transgenik sebagai obyek untuk mempelajari proses biologi tanaman, termasuk di antaranya biologi perkembangan.

METODE TRANSFORMASI GENETIK Webb dan Morris (1992) mendefinisikan transformasi genetik sebagai suatu perpindahan (transfer) gen asing yang diisolasi dari tanaman, virus, bakteri atau hewan ke dalam suatu genom baru (new genetic background). Pada tanaman, keberhasilan transformasi genetik ditunjukkan oleh keberhasilan pertumbuhan tanaman baru yang normal, fertil dan dapat mengekspresikan gen baru hasil insersi. Proses transformasi genetik terdiri dari beberapa tahap yaitu insersi, integrasi, ekspresi dan pewarisan sifat DNA baru. Metode insersi gen dapat dilakukan dengan menggunakan bakteri (species Agrobacterium) atau virus dan transfer gen langsung (direct gene transfer). Teknik ini memanfaatkan konstruksi gen yang terdiri dari promoter bakteri atau virus. Pemilihan metode transfer gen pada umumnya tergantung pada species tanaman yang digunakan dan kemampuan regenerasi tanaman tersebut secara in vitro (Webb dan Morris, 1992). Dasar keberhasilan transformasi genetik adalah kemampuan sel target untuk berkembang menjadi tanaman utuh. Teknik kultur jaringan membuka peluang untuk menyediakan sel target yang terdapat dalam organ tanaman (daun, batang, hipokotil dan kotiledon), yang terdapat dalam kalus atau kultur suspensi sel dan bahkan protoplas. Sel-sel ini dapat diinduksi untuk berkembang menjadi tanaman baru melalui inisiasi pembentukan tunas baru atau melalui embriogenesis (Webb dan Morris, 1992). Daun-daun dari spesies dikotil dapat secara langsung ditransformasi dengan Agrobacterium atau dengan metode transfer gen langsung (direct gene transfer) pada protoplas. Pada monokotil, jaringan meristem merupakan sumber yang paling baik karena berpotensi membentuk sel-sel embrionik. Sel-sel tersebut harus dimultiplikasi terlebih dahulu dalam kultur sel sehingga membentuk kelompok sel embrionik yang dapat digunakan sebagai sel target untuk transfer gen dengan cara microinjection atau particle bombardment (Webb dan Morris, 1992). Dalam sistem transformasi genetik, tujuan akhir adalah meregenerasi tanaman baru yang identik dengan induknya, kecuali dalam hal sifat baru dari gen yang disisipkan. Jaringan dari berbagai spesies, termasuk sejumlah tanaman budidaya yang penting, saat ini dapat diregenerasi menjadi tanaman baru dengan menghasilkan tunas atau embrio secara in vitro (Lal & Lal, 1990). Hal ini merupakan faktor yang dapat menunjang keberhasilan proses transformasi.

Untuk keperluan ekspresi di dalam sel tanaman, gen-gen asing memerlukan promoter yang sesuai, sekuen awal 5 dan terminator 3 untuk menjamin transkripsi yang efisien, stabil dan translasi mRNA. Besarnya perbedaan antara elemen regulator dari prokariot dan eukariot menyebabkan sekuen gen bakteri tidak dapat berfungsi dalam sel tanaman. Sebagai perkecualian dalam hal ini adalah adanya elemen regulator dari gen-gen tertentu pada Agrobacterium tumefaciens dan A. rhizogenes yang dapat berfungsi aktif pada sel-sel tanaman transforman. Gen-gen promoter nos (nopaline synthase), ocs (octopine synthase) dan mas (mannopine synthase) yang berasal dari kedua macam bakteri tersebut telah berhasil digunakan sebagai sumber elemen regulasi. Selain itu, virus tanaman yang mengendalikan transkripsi dan translasi telah digunakan sebagai sumber elemen regulasi, dan yang paling sering digunakan adalah gen promoter 35S RNA dari Cauliflower Mosaic Virus (CaMV). Promoter ini aktif dalam semua jaringan tetapi aktivitasnya bervariasi di antara tipe-tipe sel yang berbeda (Webb dan Morris, 1992). Ekspresi gen asing pada sel tanaman hasil transformasi dapat diketahui dengan cara menentukan aktivitas produknya. Sekuen yang mengkode gen-gen penghasil enzim pada bakteri dengan mudah dapat dianalisis, yang aktivitasnya tidak ditemukan pada tanaman normal, merupakan bentuk dasar dari beberapa reporter gen. Enzim-enzim bakteri yang umum digunakan adalah nopaline synthase (nos), chloramfenicol acetyltransferase (cat), luciferase (luc), neomycin phosphotransferase (nptII), dan -glucuronidase (gus). Gen-gen reporter ini telah digunakan secara luas untuk menganalisis fungsi promoter dan sekuen gen regulator lain. Adanya gen-gen reporter ini, yang mempunyai sensitivitas, ketepatan dan keyakinan pada deteksi enzimatik, dapat meningkatkan kegunaannya untuk mendeteksi transient. Bila dibandingkan antara cat, gus dan nptII sebagai gen reporter dibawah kendali promoter CaMV 35S pada tembakau menunjukkan bahwa ekspresi gen gus paling mudah dideteksi, kemudian nptII dan terakhir cat (Webb dan Morris, 1992). Seleksi terhadap sel-sel transforman merupakan faktor kunci dalam keberhasilan metode yang dikembangkan untuk transformasi genetik. Gen-gen penyebab tumor yang berasosiasi dengan A. tumefaciens (Marton et al., 1979; Hernalsteens et al., 1980) dan A. rhizogenes (Tempe dan Casse-Delbart, 1989; Zambryski et al., 1989) dapat digunakan sebagai penanda seleksi. Gen-gen ini mempengaruhi morfologi jaringan pada tanaman transforman. Pada peristiwa infeksi A. tumefaciens, crown gall tumbuh terus menerus pada kultur in vitro dengan tidak adanya penambahan zat pengatur tumbuh. Beberapa strain A. tumefaciens menyebabkan sel transforman membentuk pucuk abnormal yang pada umumnya infertil.

Karakteristik lain adalah, biasanya ditentukan oleh gen-gen tunggal yang dominan mengkode resistensi tertentu pada bahan selektif. Gen-gen ini tidak rusak pada proses regenerasi tanaman, oleh karena itu dapat digunakan untuk seleksi transforman. Gen-gen penanda seleksi yang sama juga dapat digunakan untuk identifikasi sel transforman pada metode transfer gen secara langsung (Webb dan Morris, 1992). Beberapa faktor mempengaruhi kemampuan atau efektifitas bahan kimia yang digunakan untuk seleksi. Bahan-bahan penyeleksi tersebut bersifat toksik untuk sel tanaman. Jadi toksin yang paling efektif adalah toksin yang menghambat pertumbuhan atau membunuh sel-sel non-transforman secara perlahan-lahan. Tekanan seleksi akan optimal apabila menggunakan konsentrasi toksin yang paling rendah yang mampu membunuh jaringan untransforman (Webb dan Morris, 1992). Pemilihan toksin sebagai bahan penyeleksi harus berhati-hati supaya dapat membatasi jumlah sel non-transforman yang hidup. Gen-gen yang resisten terhadap berbagai senyawa toksik, seperti methotrexate, antibiotik, dan herbisida telah disisipkan pada promoter yang sesuai dan digunakan untuk menyeleksi dan mengidentifikasi sel-sel transforman. Antibiotik kanamisin, G418 dan higromisin adalah antibiotik yang saat ini secara luas digunakan sebagai bahan penyeleksi. Ketiganya adalah antibiotika aminoglikan yang mempengaruhi aktivitas translasi sel. Gen nptII diisolasi dari transposon Tn5-coli K12. Enzim yang dihasilkan akan menonaktifkan antibiotik pada dikotil termasuk tembakau, kentang, dan tomat (An et al., 1986), kacang-kacangan (White dan Greenwood, 1987) dan kacang kapri (Pounti-Kaerlas et al, 1989) serta tanaman berkayu seperti Pseudostuga menziesii (Ellis et al., 1989). Gen hpt (hygromycin phosphotransferase) dikembangkan untuk resistensi terhadap antibiotika higromisin. Gen ini diisolasi dari E. coli dan telah berhasil digunakan dalam strawberi (Nehra et al., 1990) dan padi (Dekeyser et al., 1989; Shimamoto et al., 1987). Selain itu variasi tingkat resistensi terhadap higromisin telah ditemukan pada spesies yang tergolong Gramineae yang lain (Hauptmann et al., 1988).

TEKNIK TRANSFORMASI GEN DENGAN PERANTARA Agrobacterium sp. Teknik transformasi gen ke dalam tanaman didasari oleh penemuan bakteri tanah Agrobacterium tumefaciens yang merupakan fitopatogen tanah yang menyebabkan penyakit crown gall di dalam jaringan luka pada berbagai macam tanaman dikotil dan mempunyai kemampuan untuk memindahkan DNA ke dalam sel tanaman (Gelvin, 1993; Old dan

Primrose, 1989; Rossi et al., 1998, Heldt, 1999). Strain onkogenik A. tumefaciens mengandung plasmid single copy yang berukuran besar (150-250 kb) yang disebut Plasmid Ti (tumour inducing)(Gambar 1). Sebagian dari DNA plasmid ini yaitu T-DNA (transfer) dipindahkan ke dalam sel tanaman yang terluka dan disisipkan ke dalam genom tanaman. Walaupun gen-gen T-DNA berasal dari bakteri, tetapi mampu diekspresikan pada sel tanaman. Ekspresi gen-gen tersebut adalah sintesis fitohormon (auksin dan sitokinin) dan sintesis opin. Akibatnya jaringan yang terinfeksi akan mengalami proliferasi sel yang tidak terkendali dan menghasilkan jaringan tumor. Pada biakan jaringan, pertumbuhan tumor ini dapat tumbuh terus walaupun dalam media tidak ditambahkan auksin dan sitokinin, yang biasanya kedua senyawa ini diperlukan untuk pertumbuhan jaringan tumbuhan secara in vitro (Day dan Lichtenstein, 1992; White, 1993; Heldt, 1999).

Gambar 1. Diagram plasmid Ti (Heldt, 1999) Mekanisme infeksi Agrobacterium ke dalam sel tanaman meliputi tiga tahap, sebagai berikut (Day dan Lichtenstein, 1992). 1. Pengenalan Agrobacterium dengan molekul sinyal yang dihasilkan oleh sel tanaman yang terluka, kemudian secara kemotaksis Agrobacterium bergerak dan menempel pada sel tanaman.

2. Gen-gen vir pada plasmid Ti merespon molekul sinyal yang dihasilkan oleh sel tanaman dan selanjutnya menginduksi ekspresi gen-gen vir untuk memotong rantai tunggal T-DNA dan memindahkannya ke dalam inti sel tanaman. 3. T-DNA terintegrasi ke dalam genom tanaman dan gen-gen pada T-DNA diekspresikan dalam sel tanaman. Ekspresi gen-gen onc (oncogen) menyebabkan sel berproliferasi, sedangkan ekspresi gen-gen opin bertanggungjawab untuk sintesis derivat asam amino opin. Berdasarkan jenis opin, ada 6 strain Agrobacterium yang dihasilkan oleh plasmid Ti, yaitu : oktopin, nopalin, leusinopin, manopin, suksinamopin dan agropin. Secara skematis mekanisme transformasi T-DNA ke dalam genom tanaman dengan perantara Agrobaterium digambarkan pada Gambar 2.

Pada dasarnya Agrobacterium memberikan respon kemotaksis terhadap senyawa fenol yang dilepaskan oleh jaringan tanaman yang terluka dan bergerak menurut gradien konsentrasi menuju sel yang terluka. Respon kemotaksis merupakan ekspresi konstitutif dari gen-gen kromosomal Agrobacterium, yaitu chvA, chvB, pscA dan att (Douglas et al., 1986; Ziemienowicz, 2001). Menurut Dylan et al. (1986) gen chvA dan chvB mempunyai fungsi yang ekuivalen dengan gen ndvA dan ndvB pada Rhizobium. Senyawa fenol, seperti acetosyringone telah terbukti mampu menginduksi gen-gen vir pada konsentrasi 1,5 10 x 10 M (Stachel et al., 1985). Pada konsentrasi yang rendah (10
7 -6 -

M) senyawa tersebut mampu menginduksi respon kemotaksis pada Agrobacterium (Asbhy et

al., 1987), tetapi respon ini tergantung pada ekspresi plasmid Ti yang mengkode gen-gen vir, terutama virA dan virG (Shaw et al., 1988). Kontak Agrobacterium dengan senyawa yang dilepaskan oleh tanaman yang terluka (acetosyringone) menginduksi transkripsi daerah vir pada plasmid Ti. Acetosiryngone kemudian berinteraksi dengan virA dan menghasilkan sinyal intraseluler yang berupa aktivasi virG. VirG yang aktif ini mengaktifkan gen virulen lainnya (virB, C, D dan E). Induksi gen vir diikuti dengan pengenalan sekuen pembatas 25 pasang basa terulang (imperfect direct repeat/border sequences) yang mengapit T-DNA. Pembatas T-DNA kemudian dipotong oleh dua protein yang dihasilkan oleh operon virD yaitu VirD1 dan VirD2 (Yanofsky et al., 1986; Stachel et al., 1986; Filichkin dan Gelvin, 1993), sehingga diperoleh untai tunggal T-DNA.

Sel Tanaman Gambar 2. Mekanisme transformasi T-DNA dari plasmid Ti ke dalam genom inti sel tanaman dengan perantara Agrobacterium. LB : left border, RB: right border, NPC : nuclear pore complex. Keterangan ada dalam teks. (Ziemienowicz, 2001)

Proses pemindahan T-DNA dikode oleh operon virB yang terdiri dari 11 gen (Christie, 1997). Masing-masing gen, kecuali virB1, berperan pada proses terbentuknya tumor (Berger dan Christie, 1994). Protein VirB menunjukkan aktivitas ATPase dan diduga digunakan sebagai sumber energi untuk melepaskan subunit protein lain untuk keperluan transpor T-DNA. Saat ini, telah diketahui bahwa protein VirB dapat membentuk pili yang menyerupai pili konjugatif (Fullner et al., 1996) dan VirB2 menjadi subunit mayor dari pilipili tersebut. Jembatan berupa pili yang dibentuk oleh VirB memungkinkan kompleks TDNA-VirD2 dipindahkan ke dalam sitoplasma sel tanaman. Di dalam sitoplasma sel tanaman kompleks T-DNA-VirD2 dibungkus oleh protein VirE2 yang berperan melindungi T-DNA dari degradasi yang disebabkan oleh enzim-enzim nuklease tanaman (Rossi et al., 1996). Kompleks T-DNA-VirD2 dan protein VirE yang telah berada di dalam sitoplasma sel tanaman kemudian masuk ke dalam inti sel tanaman. Masuknya kompleks T-DNA ke dalam inti sel tanaman dengan perantaraan protein-protein yang berasal dari Agrobacterium yaitu VirD2 dan VirE2. Pada sel-sel eukariotik transpor aktif protein dan kompleks nukleoprotein membutuhkan sinyal spesifik yaitu NLS (nuclear localization signal) yang dikenali oleh faktor yang terdapat dalam sitosol inti sel yang disebut importin. VirD2 dan VirE2 mengandung NLS yang berfungsi memasukkan protein ke dalam inti sel tanaman dan senyawa importin telah berhasil diidentifikasi oleh Ballas dan Citovsky (1997). Di dalam inti sel tanaman T-DNA diintegrasikan ke dalam genom tanaman dengan cara illegitimate recombination, suatu mekanisme bergabungnya dua molekul DNA yang tidak mempunyai homologi secara luas. Pada organisme tingkat tinggi seperti tanaman, illegitimate recombination adalah mekanisme yang dominan terjadi pada integrasi DNA (Paszkowski et al., 1988; Offringa et al., 1990) dan telah dijelaskan empat belas tahun yang lalu (Gheysen et al., 1991; Matsumoto et al., 1990; Mayerhofer et al., 1991), tetapi faktorfaktor yang terlibat dalam proses tersebut masih sedikit yang diketahui. T-DNA yang terintegrasi ke dalam genom inti sel tanaman mempunyai sifat seperti gen sel eukariotik dan diwariskan sesuai hukum Mendel. T-DNA yang terintegrasi direplikasikan oleh sel tanaman seperti DNA milik tanaman itu sendiri dan karena juga mengandung promotor, maka juga akan ditranskripsi (Heldt, 1999).

You might also like