P. 1
transformasi tambahan nisa

transformasi tambahan nisa

|Views: 70|Likes:
Published by Rio Hadi Wandana

More info:

Published by: Rio Hadi Wandana on May 01, 2012
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOCX, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

03/31/2013

pdf

text

original

PENGEMBANGAN METODE TRANSFORMASI GENETIK TANAMAN UNTUK MENINGKATKAN KESEJAHTERAAN HIDUP MANUSIA

Metode transformasi

genetik tanaman merupakan metode alternatif untuk

menghasilkan tanaman pangan hasil rekayasa genetik yang memiliki sifat-sifat unggul, diantaranya ketahanan terhadap hama dan penyakit, ketahanan terhadap herbisida, perubahan kandungan nutrisi dan peningkatan daya simpan. Transformasi genetik adalah suatu perpindahan gen asing yang diisolasi dari tanaman, virus, bakteri atau hewan ke dalam suatu genom baru. Pada tanaman, keberhasilan transformasi genetik ditunjukkan oleh keberhasilan pertumbuhan tanaman baru yang normal, fertil dan dapat mengekspresikan gen baru hasil insersi. Proses transformasi genetik terdiri dari beberapa tahap yaitu insersi, integrasi, ekspresi dan pewarisan sifat DNA baru. Sampai saat ini telah banyak tanaman pangan transgenik yang dihasilkan, dan meskipun terdapat kontroversi tentang tanaman pagan transgenik, area tanaman hasil rekayasa genetika tersebut secara global terus meningkat, diantaranya jagung tahan hama dan herbisida, kedelai tahan herbisida, tomat tahan herbisida, kanola tahan herbisida dan lain-lainnya. Melalui perakitan tanaman transgenik, selain tanaman dapat menghasilkan panen yang lebih tinggi karena tahan terhadap serangan hama dan penyakit, petani dapat menggunakan herbisida secara tidak berlebihan dan mengurangi biaya pengolahan tanah. Hal ini telah menjadi bukti bahwa penggunaan tanaman produk bioteknologi memberikan kontribusi yang nyata bagi peningkatan kesejahteraan hidup manusia, yaitu meningkatkan hasil, mengurangi biaya budiaya, meningkatkan keuntungan serta membantu melindungi lingkungan. Tanaman produk bioteknologi yang telah disetujui untuk pangan merupakan tanaman yang direkayasa untuk memiliki sifat seperti: (1) ketahanan terhadap hama dan penyakit, (2) ketahanan terhadap herbisida, (3) perubahan kandungan nutrisi dan (4) peningkatan daya simpan. Usaha untuk mendapatkan tanaman dengan sifat-sifat tambahan yang berguna dilakukan dengan metode transformasi genetik, yaitu dengan cara menyisipkan gen tertentu ke dalam genom tanaman. Tujuan pengembangan metode transformasi genetik tanaman antara lain adalah (1) untuk meningkatkan nilai agrikultural, nilai hortikultural dan ornamental tanaman, (2) menjadikan tanaman transgenik sebagai pabrik biologi untuk memproduksi protein atau metabolit lainnya yang mempunyai nilai komersial tinggi dan (3) menjadikan tanaman transgenik sebagai obyek untuk mempelajari proses biologi tanaman, termasuk di antaranya biologi perkembangan.

Teknik kultur jaringan membuka peluang untuk menyediakan sel target yang terdapat dalam organ tanaman (daun. Teknik ini memanfaatkan konstruksi gen yang terdiri dari promoter bakteri atau virus. integrasi. jaringan meristem merupakan sumber yang paling baik karena berpotensi membentuk sel-sel embrionik. 1992). kecuali dalam hal sifat baru dari gen yang disisipkan. 1990). Pada monokotil. fertil dan dapat mengekspresikan gen baru hasil insersi. hipokotil dan kotiledon). 1992). Jaringan dari berbagai spesies. Hal ini merupakan faktor yang dapat menunjang keberhasilan proses transformasi. tujuan akhir adalah meregenerasi tanaman baru yang identik dengan induknya. Pada tanaman. ekspresi dan pewarisan sifat DNA baru. batang. Dasar keberhasilan transformasi genetik adalah kemampuan sel target untuk berkembang menjadi tanaman utuh. Metode insersi gen dapat dilakukan dengan menggunakan bakteri (species Agrobacterium) atau virus dan transfer gen langsung (direct gene transfer). bakteri atau hewan ke dalam suatu genom baru (new genetic background). Sel-sel tersebut harus dimultiplikasi terlebih dahulu dalam kultur sel sehingga membentuk kelompok sel embrionik yang dapat digunakan sebagai sel target untuk transfer gen dengan cara microinjection atau particle bombardment (Webb dan Morris. Sel-sel ini dapat diinduksi untuk berkembang menjadi tanaman baru melalui inisiasi pembentukan tunas baru atau melalui embriogenesis (Webb dan Morris. Daun-daun dari spesies dikotil dapat secara langsung ditransformasi dengan Agrobacterium atau dengan metode transfer gen langsung (direct gene transfer) pada protoplas. 1992). Proses transformasi genetik terdiri dari beberapa tahap yaitu insersi. termasuk sejumlah tanaman budidaya yang penting. virus. saat ini dapat diregenerasi menjadi tanaman baru dengan menghasilkan tunas atau embrio secara in vitro (Lal & Lal.METODE TRANSFORMASI GENETIK Webb dan Morris (1992) mendefinisikan transformasi genetik sebagai suatu perpindahan (transfer) gen asing yang diisolasi dari tanaman. yang terdapat dalam kalus atau kultur suspensi sel dan bahkan protoplas. Dalam sistem transformasi genetik. keberhasilan transformasi genetik ditunjukkan oleh keberhasilan pertumbuhan tanaman baru yang normal. Pemilihan metode transfer gen pada umumnya tergantung pada species tanaman yang digunakan dan kemampuan regenerasi tanaman tersebut secara in vitro (Webb dan Morris. .

tumefaciens (Marton et al. virus tanaman yang mengendalikan transkripsi dan translasi telah digunakan sebagai sumber elemen regulasi. stabil dan translasi mRNA. luciferase (luc). Adanya gen-gen reporter ini. 1989. dan yang paling sering digunakan adalah gen promoter 35S RNA dari Cauliflower Mosaic Virus (CaMV). Gen-gen ini mempengaruhi morfologi jaringan pada tanaman transforman. Bila dibandingkan antara cat. crown gall tumbuh terus menerus pada kultur in vitro dengan tidak adanya penambahan zat pengatur tumbuh. Besarnya perbedaan antara elemen regulator dari prokariot dan eukariot menyebabkan sekuen gen bakteri tidak dapat berfungsi dalam sel tanaman. Seleksi terhadap sel-sel transforman merupakan faktor kunci dalam keberhasilan metode yang dikembangkan untuk transformasi genetik. rhizogenes yang dapat berfungsi aktif pada sel-sel tanaman transforman..Untuk keperluan ekspresi di dalam sel tanaman. ketepatan dan keyakinan pada deteksi enzimatik. 1992). chloramfenicol acetyltransferase (cat). gus dan nptII sebagai gen reporter dibawah kendali promoter CaMV 35S pada tembakau menunjukkan bahwa ekspresi gen gus paling mudah dideteksi.. 1979. Promoter ini aktif dalam semua jaringan tetapi aktivitasnya bervariasi di antara tipe-tipe sel yang berbeda (Webb dan Morris. Gen-gen reporter ini telah digunakan secara luas untuk menganalisis fungsi promoter dan sekuen gen regulator lain. Sekuen yang mengkode gen-gen penghasil enzim pada bakteri dengan mudah dapat dianalisis. dapat meningkatkan kegunaannya untuk mendeteksi transient. yang aktivitasnya tidak ditemukan pada tanaman normal. rhizogenes (Tempe dan Casse-Delbart. 1992). ocs (octopine synthase) dan mas (mannopine synthase) yang berasal dari kedua macam bakteri tersebut telah berhasil digunakan sebagai sumber elemen regulasi. kemudian nptII dan terakhir cat (Webb dan Morris. sekuen awal 5’ dan terminator 3’ untuk menjamin transkripsi yang efisien. tumefaciens menyebabkan sel transforman membentuk pucuk abnormal yang pada umumnya infertil. Beberapa strain A. Enzim-enzim bakteri yang umum digunakan adalah nopaline synthase (nos). Gen-gen penyebab tumor yang berasosiasi dengan A. neomycin phosphotransferase (nptII). Pada peristiwa infeksi A. Ekspresi gen asing pada sel tanaman hasil transformasi dapat diketahui dengan cara menentukan aktivitas produknya. tumefaciens.. dan β-glucuronidase (gus). 1980) dan A. . Gen-gen promoter nos (nopaline synthase). 1989) dapat digunakan sebagai penanda seleksi. Hernalsteens et al. Zambryski et al. yang mempunyai sensitivitas. merupakan bentuk dasar dari beberapa reporter gen. gen-gen asing memerlukan promoter yang sesuai. Sebagai perkecualian dalam hal ini adalah adanya elemen regulator dari gen-gen tertentu pada Agrobacterium tumefaciens dan A. Selain itu.

Gen nptII diisolasi dari transposon Tn5-coli K12. Gen hpt (hygromycin phosphotransferase) dikembangkan untuk resistensi terhadap antibiotika higromisin.. Shimamoto et al. Bahan-bahan penyeleksi tersebut bersifat toksik untuk sel tanaman.. 1993. Gen-gen ini tidak rusak pada proses regenerasi tanaman. kacang-kacangan (White dan Greenwood. dan herbisida telah disisipkan pada promoter yang sesuai dan digunakan untuk menyeleksi dan mengidentifikasi sel-sel transforman. 1989) serta tanaman berkayu seperti Pseudostuga menziesii (Ellis et al. Pemilihan toksin sebagai bahan penyeleksi harus berhati-hati supaya dapat membatasi jumlah sel non-transforman yang hidup. biasanya ditentukan oleh gen-gen tunggal yang dominan mengkode resistensi tertentu pada bahan selektif. Gen-gen penanda seleksi yang sama juga dapat digunakan untuk identifikasi sel transforman pada metode transfer gen secara langsung (Webb dan Morris. kentang. Tekanan seleksi akan optimal apabila menggunakan konsentrasi toksin yang paling rendah yang mampu membunuh jaringan untransforman (Webb dan Morris.. Enzim yang dihasilkan akan menonaktifkan antibiotik pada dikotil termasuk tembakau. 1987) dan kacang kapri (Pounti-Kaerlas et al. oleh karena itu dapat digunakan untuk seleksi transforman. Beberapa faktor mempengaruhi kemampuan atau efektifitas bahan kimia yang digunakan untuk seleksi. TEKNIK TRANSFORMASI GEN DENGAN PERANTARA Agrobacterium sp. G418 dan higromisin adalah antibiotik yang saat ini secara luas digunakan sebagai bahan penyeleksi. 1992). dan tomat (An et al.. antibiotik. 1989). Teknik transformasi gen ke dalam tanaman didasari oleh penemuan bakteri tanah Agrobacterium tumefaciens yang merupakan fitopatogen tanah yang menyebabkan penyakit crown gall di dalam jaringan luka pada berbagai macam tanaman dikotil dan mempunyai kemampuan untuk memindahkan DNA ke dalam sel tanaman (Gelvin. Antibiotik kanamisin. 1990) dan padi (Dekeyser et al. coli dan telah berhasil digunakan dalam strawberi (Nehra et al.. 1988). Ketiganya adalah antibiotika aminoglikan yang mempengaruhi aktivitas translasi sel. 1986).. 1989. seperti methotrexate. Gen ini diisolasi dari E.Karakteristik lain adalah. 1992). 1987). Old dan . Gen-gen yang resisten terhadap berbagai senyawa toksik. Jadi toksin yang paling efektif adalah toksin yang menghambat pertumbuhan atau membunuh sel-sel non-transforman secara perlahan-lahan. Selain itu variasi tingkat resistensi terhadap higromisin telah ditemukan pada spesies yang tergolong Gramineae yang lain (Hauptmann et al.

pertumbuhan tumor ini dapat tumbuh terus walaupun dalam media tidak ditambahkan auksin dan sitokinin. Sebagian dari DNA plasmid ini yaitu T-DNA (transfer) dipindahkan ke dalam sel tanaman yang terluka dan disisipkan ke dalam genom tanaman. yang biasanya kedua senyawa ini diperlukan untuk pertumbuhan jaringan tumbuhan secara in vitro (Day dan Lichtenstein. 1992. 1992). Pada biakan jaringan. 1998. Heldt. 1999) Mekanisme infeksi Agrobacterium ke dalam sel tanaman meliputi tiga tahap. 1989. tumefaciens mengandung plasmid single copy yang berukuran besar (150-250 kb) yang disebut Plasmid Ti (tumour inducing)(Gambar 1). White. 1999). Akibatnya jaringan yang terinfeksi akan mengalami proliferasi sel yang tidak terkendali dan menghasilkan jaringan tumor. tetapi mampu diekspresikan pada sel tanaman. sebagai berikut (Day dan Lichtenstein. Rossi et al. 1. Ekspresi gen-gen tersebut adalah sintesis fitohormon (auksin dan sitokinin) dan sintesis opin.Primrose. Strain onkogenik A. Pengenalan Agrobacterium dengan molekul sinyal yang dihasilkan oleh sel tanaman yang terluka. Heldt. 1999).. Diagram plasmid Ti (Heldt. . Gambar 1. 1993. kemudian secara kemotaksis Agrobacterium bergerak dan menempel pada sel tanaman. Walaupun gen-gen T-DNA berasal dari bakteri.

yaitu : oktopin. Pembatas T-DNA kemudian dipotong oleh dua protein yang dihasilkan oleh operon virD yaitu VirD1 dan VirD2 (Yanofsky et al. Acetosiryngone kemudian berinteraksi dengan virA dan menghasilkan sinyal intraseluler yang berupa aktivasi virG. 1988). ada 6 strain Agrobacterium yang dihasilkan oleh plasmid Ti. D dan E).. leusinopin. nopalin. pscA dan att (Douglas et al. Secara skematis mekanisme transformasi T-DNA ke dalam genom tanaman dengan perantara Agrobaterium digambarkan pada Gambar 2.2. yaitu chvA. Senyawa fenol. Ziemienowicz. 1986. 3. . (1986) gen chvA dan chvB mempunyai fungsi yang ekuivalen dengan gen ndvA dan ndvB pada Rhizobium. 1986. 1993). chvB. Pada dasarnya Agrobacterium memberikan respon kemotaksis terhadap senyawa fenol yang dilepaskan oleh jaringan tanaman yang terluka dan bergerak menurut gradien konsentrasi menuju sel yang terluka. 1986. Stachel et al. Filichkin dan Gelvin. C. Kontak Agrobacterium dengan senyawa yang dilepaskan oleh tanaman yang terluka (acetosyringone) menginduksi transkripsi daerah vir pada plasmid Ti. Gen-gen vir pada plasmid Ti merespon molekul sinyal yang dihasilkan oleh sel tanaman dan selanjutnya menginduksi ekspresi gen-gen vir untuk memotong rantai tunggal T-DNA dan memindahkannya ke dalam inti sel tanaman.. 1985). seperti acetosyringone telah terbukti mampu menginduksi gen-gen vir pada konsentrasi 1. Respon kemotaksis merupakan ekspresi konstitutif dari gen-gen kromosomal Agrobacterium. sedangkan ekspresi gen-gen opin bertanggungjawab untuk sintesis derivat asam amino opin. T-DNA terintegrasi ke dalam genom tanaman dan gen-gen pada T-DNA diekspresikan dalam sel tanaman. tetapi respon ini tergantung pada ekspresi plasmid Ti yang mengkode gen-gen vir.. Berdasarkan jenis opin. VirG yang aktif ini mengaktifkan gen virulen lainnya (virB.. suksinamopin dan agropin. Induksi gen vir diikuti dengan pengenalan sekuen pembatas 25 pasang basa terulang (imperfect direct repeat/border sequences) yang mengapit T-DNA. Menurut Dylan et al. 1987). terutama virA dan virG (Shaw et al.5 – 10 x 10 M (Stachel et al. 2001). Ekspresi gen-gen onc (oncogen) menyebabkan sel berproliferasi. sehingga diperoleh untai tunggal T-DNA.. Pada konsentrasi yang rendah (10 7 -6 - M) senyawa tersebut mampu menginduksi respon kemotaksis pada Agrobacterium (Asbhy et al.. manopin.

Sel Tanaman Gambar 2. LB : left border. (Ziemienowicz. Mekanisme transformasi T-DNA dari plasmid Ti ke dalam genom inti sel tanaman dengan perantara Agrobacterium. 2001) . Keterangan ada dalam teks. NPC : nuclear pore complex. RB: right border.

. 1996).. 1988.. Mayerhofer et al. Saat ini.. Matsumoto et al. tetapi faktorfaktor yang terlibat dalam proses tersebut masih sedikit yang diketahui. 1996) dan VirB2 menjadi subunit mayor dari pilipili tersebut.. T-DNA yang terintegrasi direplikasikan oleh sel tanaman seperti DNA milik tanaman itu sendiri dan karena juga mengandung promotor. berperan pada proses terbentuknya tumor (Berger dan Christie. Pada sel-sel eukariotik transpor aktif protein dan kompleks nukleoprotein membutuhkan sinyal spesifik yaitu NLS (nuclear localization signal) yang dikenali oleh faktor yang terdapat dalam sitosol inti sel yang disebut importin.. 1990) dan telah dijelaskan empat belas tahun yang lalu (Gheysen et al. 1997). Masing-masing gen. 1999). VirD2 dan VirE2 mengandung NLS yang berfungsi memasukkan protein ke dalam inti sel tanaman dan senyawa importin telah berhasil diidentifikasi oleh Ballas dan Citovsky (1997). Pada organisme tingkat tinggi seperti tanaman.. maka juga akan ditranskripsi (Heldt. 1991.. Offringa et al.Proses pemindahan T-DNA dikode oleh operon virB yang terdiri dari 11 gen (Christie. Protein VirB menunjukkan aktivitas ATPase dan diduga digunakan sebagai sumber energi untuk melepaskan subunit protein lain untuk keperluan transpor T-DNA. 1994). Jembatan berupa pili yang dibentuk oleh VirB memungkinkan kompleks TDNA-VirD2 dipindahkan ke dalam sitoplasma sel tanaman. telah diketahui bahwa protein VirB dapat membentuk pili yang menyerupai pili konjugatif (Fullner et al. suatu mekanisme bergabungnya dua molekul DNA yang tidak mempunyai homologi secara luas. Di dalam inti sel tanaman T-DNA diintegrasikan ke dalam genom tanaman dengan cara illegitimate recombination. 1990. Masuknya kompleks T-DNA ke dalam inti sel tanaman dengan perantaraan protein-protein yang berasal dari Agrobacterium yaitu VirD2 dan VirE2. Kompleks T-DNA-VirD2 dan protein VirE yang telah berada di dalam sitoplasma sel tanaman kemudian masuk ke dalam inti sel tanaman. Di dalam sitoplasma sel tanaman kompleks T-DNA-VirD2 dibungkus oleh protein VirE2 yang berperan melindungi T-DNA dari degradasi yang disebabkan oleh enzim-enzim nuklease tanaman (Rossi et al. 1991). kecuali virB1. illegitimate recombination adalah mekanisme yang dominan terjadi pada integrasi DNA (Paszkowski et al. T-DNA yang terintegrasi ke dalam genom inti sel tanaman mempunyai sifat seperti gen sel eukariotik dan diwariskan sesuai hukum Mendel.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->