Dasar Teori Teknik pengecatan Gram dikembangkan oleh Hans Christian Gram (dokter berkebangsaan Denmark, 1884).

Pengecatan Gram merupakan salah satu langkah awal mengidentifikasi sel bakteri yang memisahkan bakteri menjadi 2 kelompok yaitu bakteri Gram positif (berwarna ungu/biru) dan bakteri Gram negatif (berwarna merah) Perbedaan 2 kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel menahan (mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi oleh alkohol. Bakteri gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet dan pada tahap akhir pengecatan tidak terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol dan pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin. Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru. Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek. Alat dan bahan : - biakan bakteri - larutan kristal violet - larutan iodin - larutan alkohol (etil alkohol 95%) - kaca objek dan kaca penutup - mikroskop - jarum ose

- bunsen (lampu spiritus) - aquadesh Langkah Kerja : 1. Kaca objek dibersihkan dengan alkohol dan dilewatkan beberapa kali pada nyala api bunsen 2. Membuat olesan tipis bakteri dengan mengambil isolat bakteri dengan jarum ose secara aseptis dan diberi 1-2 tetes aquadesh. Kering anginkan dan melewatkannya pada nyala api bunsen (lampu sriritus) 3. Olesan tersebut dibubuhi kristal violet (Gram A = cat utama), dibiarkan selama 30 detik, kemudian dicuci pada air mengalir hingga tetesan menjadi bening, dianginkan hingga kering

4. Dibubuhi dengan larutan iodin (Gram B = larutan mordan), dibiarkan selama 30 detik, kemudian dicuci pada air mengalir hingga tetesan menjadi bening, dianginkan hingga kering 5. Melakukan dekolorisasi dengan dibubuhi etil alkohol 95% selama 10-20 detik, segera aliri dengan air selama beberapa detik untuk menghentikan aktivitas dekolorisasi, dianginkan hingga kering 6. Olesan bakteri ditetesi dengan safranin selama 20-30 detik, dicuci dengan air mengalir selama beberapa detik untuk menghabiskan sisa-sisa cat. Selanjutnya air dihisap dengan kertas penghisap dan kering anginkan 7. Melakukan pengamatan dengan mikroskop dan sel-sel yang tampak, digambar pada lembar kegiatan

Preparat basah bakteri dengan pewarnaan GramPerbesaran : kali Gambar. Keterangan1. 2. Mari kita diskusikan: 1. Bagaimana hasil pengamatan dari bakteri setelah dilakukan pewarnaan Gram? 2. Mengapa sel bakteri ada yang berwarna biru (ungu) dan merah? 3. Apakah sel yang berwarna merah selalu bakteri gram negatif? Catatan : - Kegiatan ini memerlukan bimbingan dari guru, membutuhkan peralatan dan bahan laboratorium khusus seperti jarum ose, kaca objek, bunsen, larutan kristal violet, iodin, alkohol, safranin dan mikroskop - Teknik aseptis dilakukan untuk menghindari terjadinya kontaminasi mikroba. Teknik aseptis yang dilakukan pada kegiatan ini pada saat awal membersihkan kaca benda dan pada saat membuat olesan pada kaca benda dari biakan bakteri Like Be the first to like this post.

Home My Friendster My Facebook ASC UGM Profile

PENGECATAN GRAM
Diposkan oleh Mohammad Septa Ayatullah | May 03 | Label: teknologi pangan |
Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Pemeriksaan ini dapat dilakukan

dengan cepat dan biaya murah serta, dalam kasus tertentu, dapat membantu dokter untuk memulai terapi suatu penyakit tanpa menunggu hasil kultur. Metode pengecatan tersebut pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode pengecatan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. PERSIAPAN Sebelum dilakukan pengecatan Gram, tentu harus disiapkan bahan (spesimen) yang akan diperiksa. Bahan yang akan diperiksa, dapat berasal dari : 1) langsung dari penderita dapat berupa sputum (dahak), pus (nanah), discharge telinga, discharge hidung, urin dan cairan serebrospinal. Spesimen yang akan dicat, sebelumnya dibuat sediaan atau preparat (smear) terlebih dulu. Pengertian preparat adalah sampel spesimen yang diletakkan atau dioleskan pada permukaan gelas obyek (object glass) atau slides, dengan atau tanpa pewarnaan, yang selanjutnya dapat diamati di bawah mikroskop. a. Pembuatan preparat Alat dan bahan yang diperlukan adalah : Alat :

Ose atau kapas lidi steril Gelas obyek Lampu spiritus

Bahan :

Bahan yang akan diperiksa.

Untuk bahan yang berbeda, memerlukan cara pembuatan preparat yang berbeda pula. Berikut cara pembuatan preparat untuk berbagai sumber bahan. a.1. Bahan langsung dari penderita Bahan disentrifuge terlebih dulu, kemudian endapannya dibuat preparat. Bahan yang berupa endapan (pellet) hasil sentrifuge tersebut diambil dengan ose steril atau kapas lidi steril kemudian digoreskan pada gelas obyek setipis mungkin. Panaskan gelas obyek di atas nyala api lampu spiritus sambil diayunkan secukupnya (jarak preparat sampai nyala api kira-kira 20 cm), sampai preparat tersebut kering. Setelah kering, teteskan formalin 1 % tunggu selama 5 menit dan keringkan sekali lagi. Setelah betul-betul kering, preparat siap dicat. a.2. Bahan dari biakan cair

Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus. Ambil kuman dari biakan cair (yang sebelumnya telah diaduk secara steril) dengan menggunakan ose steril, ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter kirakira 1-2 cm. Preparat yang sudah dibuat kemudian dikeringkan dan ditetesi formalin dengan cara seperti pembuatan preparat langsung. a.3. Bahan dari media pertumbuhan padat Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus. Teteskan satu ose kaldu atau NaCl pada gelas obyek tersebut. Dengan ose steril, ambil satu koloni kuman dan ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter 1 2 cm, campur dengan kaldu tadi sampai homogen kemudian tipiskan. Selanjutnya dikerjakan sebagaimana membuat preparat dengan bahan berasal dari penderita. Prinsip yang selalu harus diingat dan dipatuhi adalah :

Selalu mensterilkan ose, pada saat akan dipakai dan setelah dipakai. Letakkan ose pada tempatnya, jangan diletakkan di sembarang tempat (misal di atas meja) Jangan memegang mata (ujung) ose dengan tangan. Usahakan tidak banyak bicara pada saat kerja.

b. Cat Gram Cat Gram yang digunakan terdiri dari 4 macam, yaitu cat Gram A, B, C dan D. Masing-masing mempunyai komposisi dan fungsi yang berbeda. Komposisi dan fungsi masing-masing cat Gram, adalah sebagai berikut : 1. Cat Gram A Cat ini terdiri atas : Kristal violet : 2 gram Etil alkohol 95 : 20 ml Ammonium oksalat : 0,8 gram Akuades : 80 ml Cat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal violet). Cat Gram A merupakan cat primer yang akan memberi warna mikroorganisme target. Pada saat diberi cat ini, semua mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram A. 2. Cat Gram B Cat ini terdiri atas : Yodium : 1 gram

Kalium Yodida : 2 gram Akuades : 300 ml Cat Gram B berwarna coklat. Cat Gram B merupakan cat Mordan, yaitu cat atau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme target. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat). 3. Cat Gram C Cat ini terdiri atas : Aseton : 50 ml Etil alkohol 95 % : 50 ml Cat Gram C tidak berwarna. Cat ini berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya. Akibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan : Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian disebut bakteri Gram positif. Bakteri akan tidak berwarna, karena tidak tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif. 4. Cat Gram D Cat Gram D terdiri atas : Safranin : 0,25 gram Etil alkohol 95 % : 10 ml Akuades : 90 ml Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Akibat pemberian cat Gram D, akan terjadi 2 kemungkinan :

Bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu, karena telah jenuh mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu lagi mengikat cat Gram D. Bakteri Gram negatif akan berwarna merah, karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampu mengikat cat Gram D.

Dasar teori cat Gram

Berdasarkan sifat terhadap cat Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi 2 yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Terdapat dua teori yang dapat menjelaskan dasar perbedaan ini yaitu : 1. Teori Salton Teori ini berdasarkan kadar lipid yang tinggi (20 %) di dalam dinding sel bakteri Gram negatif. Zat lipid ini akan larut selama pencucian dengan alkohol. Pori-pori pada dinding sel membesar, sehingga zat warna yang sudah diserap mudah dilepaskan dan bakteri menjadi tidak berwarna. Bakteri Gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding selnya akibat pencucian dengan alkohol. Protein menjadi keras dan beku, pori-pori mengecil sehingga kompleks kristal yodium yang berwarna ungu dipertahankan dan bakteri akan tetap berwarna ungu. 2. Teori permeabilitas dinding sel Teori ini berdasarkan tebal tipisnya lapisan peptidoglikan dalam dinding sel. Bakteri Gram positif mempunyai susunan dinding yang kompak dengan lapisan peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan. Permeabilitas dinding sel kurang, dan kompleks kristal yodium tidak dapat keluar. Bakteri Gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis, hanya 1 2 lapisan dan susunan dinding selnya tidak kompak. Permeabilitas dinding sel lebih besar sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks kristal yodium. CARA PENGECATAN GRAM Sebelum melakukan pengecatan Gram, siapkan alat dan bahan yang diperlukan. Pastikan semua alat dan bahan yang diperlukan serta tempat untuk mencuci terletak di tempat yang terjangkau. Jangan sampai terlalu jauh sehingga menyulitkan dan memakan waktu. Alat dan bahan yang diperlukan adalah : Alat :

Rak pengecatan Kran/sumber air yang mengalir

Bahan :

Cat Gram A, B, C dan D Preparat yang telah siap untuk dicat

KELEBIHAN DAN KEKURANGAN PENGECATAN GRAM Kelebihan :

1. Pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik,
sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri

terhadap antibiotik). Hal ini karena bakteri Gram positif dan negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika. 2. Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna diagnostik. Misalnya pada pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana) uretral, maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonore. Kekurangan : Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari 10 4 per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis. Pustaka acuan : Nirwati, Hera, _______, Pembuatan Preparat dan Pengecatan dalam Petunjuk Praktikum Mikrobiologi, Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Strohl, William A, Rouse,H, Fisher, BD, 2001, Lippincotts Illustrated Reviews: Microbiology, Lippincott William & Wilkins, USA

Metabolisme Karbohidrat DEFINISI Karbohidrat adalah gula. Beberapa gula sederhana, dan lainnya lebih kompleks. Sucrose (gula meja) dibuat dari dua gula yang lebih sederhana yaitu glukosa dan fruktosa. Lactose (gula susu) terbuat dari glukosa dan galactose. Baik sucrose maupun lactose harus dipecahkan ke dalam gula pembentuknya dengan enzim sebelum badan bisa menyerap dan memakai mereka. Karbohidrat pada roti, pasta, padi, dan makanan lain yang berisi karbohidrat adalah rangkaian panjang molekul gula sederhana. Molekul ini yang lebih panjang juga harus dibongkar oleh tubuh. Jika enzim yang diperlukan untuk mengolah gula tertentu hilang, gula bisa menumpuk di badan, menyebabkan masalah. 1. Penyakit Penyimpanan Glikogen Glikogen terbuat dari banyak molekul glukosa yang berikatan satu sama lain. Gula glukosa adalah sumber utama energi tubuh untuk otot (termasuk jantung) dan otak. Glukosa yang tidak dengan segera dipakai untuk tenaga disimpan sebagai cadangan di hati, otot, dan ginjal dalam bentuk glikogen dan dilepaskan kalau diperlukan oleh tubuh. Ada banyak berbagai penyakit penyimpanan glikogen (juga disebut glikogenosis), masing-masing dikenali dengan angka Roma. Penyakit ini disebabkan oleh kekurangan yang diturunkan dari salah satu enzim yang esensial untuk memproses glukosa menjadi glikogen dan memecah glikogen menjadi glukosa. Sekitar 1 dari 20.000 orang bayi mempunyai suatu bentuk penyakit penyimpanan glikogen.

Beberapa penyakit ini menyebabkan sedikit gejala; yang lain fatal. Gejala spesifik, usia dimana gejala mulai, dan keparahan mempengaruhi variasi di antara penyakit ini. Untuk jenis II, V, dan VII, gejala utamanya adalah merasa lemah. Untuk jenis I, III, dan VI, gejalanya adalah kadar gula rendah di darah dan perut membuncit (karena kelebihan atau glikogen abnormal dapat memperbesar hati). Kadar gula darah rendah menyebabkan rasa lemah, berkeringat, kebingungan, dan kadang-kadang pingsan dan koma. Akibat lain bagi anak mungkin termasuk pertumbuhan terhambat, sering infeksi, atau luka pada mulut dan usus. Penyakit penyimpanan Glikogen cenderung menyebabkan asam urat, limbah, menumpuk di sendi (yang bisa menyebabkan encok) dan di ginjal (yang bisa menyebabkan batu ginjal). Pada jenis I penyakit penyimpanan glikogen, kegagalan ginjal biasa terjadi setelah beberapa lama. Diagnosa spesifik dibuat ketika pemeriksaan kimiadari jaringan sampel, biasanya otot atau hati, menentukan bahwa enzim tertentu hilang. Pengobatan tergantung pada jenis penyakit penyimpanan glikogen. Bagi banyak orang, makan beberapa kali sedikit makanan kaya karbohidrat menolong mencegah kadar gula darah turun. Bagi orang yang mempunyai penyakit penyimpanan glikogen yang menghasilkan gula darah rendah, kadar glukosa dipelihara dengan memberi tepung maizena mentah setiap 4 sampai 6 jam. Kadang-kadang larutan karbohidrat diberikan melalui tabung perut sepanjang malam untuk mencegah kadar kadar gula darah turun malam hari. Tipe dan karakterisitik penyakit penyimpanan glikogen Nama Tipe O Penyakit von Gierke (Tipe IA) Tipe IB Organ yang terkena Hati, otot Gejala Memperbesar hati dengan penumpukan lemak di dalam sel hati (hati berlemak); episode kadar gula darah rendah (hypoglycemia) kalau berpuasa Memperbesar hati dan ginjal; memperlambat pertumbuhan; kadar gula darah yang sangat rendah; kadar asam yang luar biasa tinggi, lemak, dan asam urat di darah. Sama seperti penyakit von Gierke tetapi mungkin lebih tidak parah; sel darah putih hitung rendah; infeksi berulang mulut dan usus atau penyakit Crohn Memperbesar hati dan jantung, otot lemah . Memperbesar hati atau sirosis; kadar gula darah rendah; kerusakan otot dan kerusakan jantung pada beberapa orang. Sirosis pada tipe awal; kerusakan otot dan kelumpuhan jantung (terlambat datangnya) pada tipe lanjut.

Hati, ginjal

Hati, sel darah putih

Penyakit Semua organ Pompe (Tipe II) tubuh Hati, otot, Penyakit Forbes jantung, sel (Tipe III) darah putih Penyakit Hati, otot, Andersen (Tipe hampir semua

IV) Penyakit McArdle (tipe V) Penyakit Hers (tipe VI)

jaringan Otot Hati Kejang otot atau kelemahan selama aktivitas fisik. Memperbesar hati; episode kadar gula darah rendah (hypoglycemia) kalau berpuasa, sering kali tanpa gejala.

Penyakit Tarui Otot skeletal, Kejang otot selama aktivitas fisik; perusakan sel darah merah (tipe VII) sel darah merah (hemolysis).

2. Galactosemia Galactosemia (kadar galactose darah tinggi) disebabkan dengan kekurangan salah satu enzim yang diperlukan untuk memetabolisme galactose, gula yang ada dalam lactose (gula susu). Metabolite menjadi banyak menjadi racun pada hati dan ginjal dan juga merusak lensa mata, menyebabkan katarak. Bayi baru lahir dengan galactosemia nampak normal pada mulanya tetapi dalam beberapa hari atau minggu kehilangan selera makannya, muntah, menjadi kuning, mengalami diare, dan berhenti bertambah besar secara normal. Fungsi sel darah putih terpengaruh, dan infeksi serius bisa timbul. Jika pengobatan lambat, anak yang terkena tetap pendek dan mengalami keterbelakangan mental atau mungkin mati. Galactosemia dapat diketahui dengan pemeriksaan darah. Tes ini dilakukan sebagai tes skrining rutin pada bayi baru lahir terutama bila seorang anggota keluarga diketahui mempunyai gangguan ini. Galactosemia diobati dengan cara menghilangkan secara menyeluruh susu dan produk susu - sumber galactose dari makanan anak yang terkena. Galactose juga ada di beberapa buah-buahan, sayur, dan produk laut, seperti rumput laut. Dokter tidak yakin apakah jumlah yang sedikit di dalam makanan ini menyebabkan masalah dalam jangka panjang. Orang yang mempunyai gangguan harus membatasi pemasukan galactose sepanjang hidup. Jika galactosemia dikenali sejak lahir dan diobati dengan baik, masalah hati dan ginjal tidak berkembang, dan perkembangan jiwa normal. Tetapi, dengan pengobatan yang tepat pun, anak dengan galactosemia sering mempunyai kuosien kecerdasan lebih rendah (IQ) daripada saudara kandung mereka, dan mereka sering mempunyai masalah bicara. Anak perempuan sering mempunyai indung telur yang tidak berfungsi, dan hanya sedikit yang dapat menjadi hamil secara alami. Namun untuk anak laki-laki, , mempunyai fungsi testicular normal. 3. Intoleransi Fruktosa Turunan

Pada gangguan ini, badan kehilangan enzim yang mencerna fruktosa, gula yang ada di gula meja (sucrose) dan banyak buah-buahan. Akibatnya, sebuah hasil sampingan fruktosa menumpuk di badan, menghalangi pembentukan glikogen dan konversinya ke glukosa untuk digunakan sebagai tenaga. Menggunakan sedikit saja fruktosa atau sucrose menyebabkan kadar gula darah rendah (hypoglycemia), berkeringat, kebingungan, dan kadang-kadang pingsan dan koma. Anak yang terus makan makanan berisi fruktosa mengalami kerusakan ginjal dan hati, menghasilkan penyakit kuning, muntah, pemburukan jiwa, pingsan, dan kematian. Gejala ronis termasuk tidak mau makan, kegagalan untuk berkembang pesat, gangguan pencernaan, kegagalan hati, dan kerusakan ginjal. Diagnosa dibuat kalau pemeriksaa kimia sampel jaringan hati ditemukan enzim hilang. Pengobatan melibatkan mengeluarkan fruktosa (umumnya ditemukan di buah-buahan manis), sucrose, dan sorbitol (tiruan gula) dari diet. Serangan akut dirawat denganmemberi glukosa dengan infus; serangan yang lebih ringan hypoglycemia diobati dengan tablet glukosa, yang sebaiknya dibawa oleh siapa saja yang mempunyai keturunan intolerasni fruktosa. PENGECATAN GRAM Oleh: Shofyatul Yumna Triyana

Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Pemeriksaan ini dapat dilakukan dengan cepat dan biaya murah serta, dalam kasus tertentu, dapat membantu dokter untuk memulai terapi suatu penyakit tanpa menunggu hasil kultur. Metode pengecatan tersebut pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode pengecatan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. PERSIAPAN Sebelum dilakukan pengecatan Gram, tentu harus disiapkan bahan (spesimen) yang akan diperiksa. Bahan yang akan diperiksa, dapat berasal dari : 1) langsung dari penderita dapat berupa sputum (dahak), pus (nanah), discharge telinga, discharge hidung, urin dan cairan serebrospinal. Spesimen yang akan dicat, sebelumnya dibuat sediaan atau preparat (smear) terlebih dulu. Pengertian preparat adalah sampel spesimen yang diletakkan atau dioleskan pada permukaan gelas obyek (object glass) atau slides, dengan atau tanpa pewarnaan, yang selanjutnya dapat diamati di bawah mikroskop.

Pembuatan preparat

Alat dan bahan yang diperlukan adalah : Alat : Ose atau kapas lidi steril Gelas obyek Lampu spiritus Bahan : Bahan yang akan diperiksa.

Untuk bahan yang berbeda, memerlukan cara pembuatan preparat yang berbeda pula. Berikut cara pembuatan preparat untuk berbagai sumber bahan. a.1. Bahan langsung dari penderita Bahan disentrifuge terlebih dulu, kemudian endapannya dibuat preparat. Bahan yang berupa endapan (pellet) hasil sentrifuge tersebut diambil dengan ose steril atau kapas lidi steril kemudian digoreskan pada gelas obyek setipis mungkin. Panaskan gelas obyek di atas nyala api lampu spiritus sambil diayunkan secukupnya (jarak preparat sampai nyala api kira-kira 20 cm), sampai preparat tersebut kering. Setelah kering, teteskan formalin 1 % tunggu selama 5 menit dan keringkan sekali lagi. Setelah betul-betul kering, preparat siap dicat.

a.2. Bahan dari biakan cair Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus. Ambil kuman dari biakan cair (yang sebelumnya telah diaduk secara steril) dengan menggunakan ose steril, ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter kira-kira 1-2 cm. Preparat yang sudah dibuat kemudian dikeringkan dan ditetesi formalin dengan cara seperti pembuatan preparat langsung. a.3. Bahan dari media pertumbuhan padat Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus. Teteskan satu ose kaldu atau NaCl pada gelas obyek tersebut. Dengan ose steril, ambil satu koloni kuman dan ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter 1 2 cm, campur dengan kaldu tadi sampai homogen kemudian tipiskan. Selanjutnya dikerjakan sebagaimana membuat preparat dengan bahan berasal dari penderita.

Prinsip yang selalu harus diingat dan dipatuhi adalah :

Selalu mensterilkan ose, pada saat akan dipakai dan setelah dipakai. Letakkan ose pada tempatnya, jangan diletakkan di sembarang tempat (misal di atas meja) Jangan memegang mata (ujung) ose dengan tangan. Usahakan tidak banyak bicara pada saat kerja. Cat Gram Cat Gram yang digunakan terdiri dari 4 macam, yaitu cat Gram A, B, C dan D. Masing-masing mempunyai komposisi dan fungsi yang berbeda. Komposisi dan fungsi masing-masing cat Gram, adalah sebagai berikut : Cat Gram A Cat ini terdiri atas : Kristal violet : 2 gram Etil alkohol 95 : 20 ml Ammonium oksalat : 0,8 gram Akuades : 80 ml Cat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal violet). Cat Gram A merupakan cat primer yang akan memberi warna mikroorganisme target. Pada saat diberi cat ini, semua mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram A. Cat Gram B Cat ini terdiri atas : Yodium : 1 gram Kalium Yodida : 2 gram Akuades : 300 ml Cat Gram B berwarna coklat. Cat Gram B merupakan cat Mordan, yaitu cat atau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme target. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat). Cat Gram C Cat ini terdiri atas : Aseton : 50 ml Etil alkohol 95 % : 50 ml

Cat Gram C tidak berwarna. Cat ini berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya. Akibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan : Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian disebut bakteri Gram positif. Bakteri akan tidak berwarna, karena tidak tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif. Cat Gram D Cat Gram D terdiri atas : Safranin : 0,25 gram Etil alkohol 95 % : 10 ml Akuades : 90 ml Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Akibat pemberian cat Gram D, akan terjadi 2 kemungkinan : Bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu, karena telah jenuh mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu lagi mengikat cat Gram D. Bakteri Gram negatif akan berwarna merah, karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampu mengikat cat Gram D.

Dasar teori cat Gram Berdasarkan sifat terhadap cat Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi 2 yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Terdapat dua teori yang dapat menjelaskan dasar perbedaan ini yaitu : Teori Salton Teori ini berdasarkan kadar lipid yang tinggi (20 %) di dalam dinding sel bakteri Gram negatif. Zat lipid ini akan larut selama pencucian dengan alkohol. Pori-pori pada dinding sel membesar, sehingga zat warna yang sudah diserap mudah dilepaskan dan bakteri menjadi tidak berwarna. Bakteri Gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding selnya akibat pencucian dengan alkohol. Protein menjadi keras dan beku, pori-pori mengecil sehingga kompleks kristal yodium yang berwarna ungu dipertahankan dan bakteri akan tetap berwarna ungu. Teori permeabilitas dinding sel Teori ini berdasarkan tebal tipisnya lapisan peptidoglikan dalam dinding sel. Bakteri Gram positif mempunyai susunan dinding yang kompak dengan lapisan peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan. Permeabilitas dinding sel kurang, dan kompleks kristal yodium tidak dapat keluar.

Bakteri Gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis, hanya 1 2 lapisan dan susunan dinding selnya tidak kompak. Permeabilitas dinding sel lebih besar sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks kristal yodium. CARA PENGECATAN GRAM Sebelum melakukan pengecatan Gram, siapkan alat dan bahan yang diperlukan. Pastikan semua alat dan bahan yang diperlukan serta tempat untuk mencuci terletak di tempat yang terjangkau. Jangan sampai terlalu jauh sehingga menyulitkan dan memakan waktu. Alat dan bahan yang diperlukan adalah : Alat : Rak pengecatan Kran/sumber air yang mengalir Bahan : Cat Gram A, B, C dan D Preparat yang telah siap untuk dicat Skema cara pengecatan Gram : Preparat yang telah siap dicat, digenangi dengan cat Gram A selama 1 3 menit

Cat dibuang, lalu preparat dicuci dengan air mengalir

Preparat digenangi cat Gram B selama 0,5 1 menit

Cat dibuang, lalu preparat dicuci dengan air mengalir

Preparat ditetesi dengan cat Gram C sampai warna cat tepat dilunturkan.

Cat dibuang, lalu preparat dicuci dengan air mengalir

Preparat digenangi dengan cat Gram D selama 1 2 menit

Sisa cat dibuang lalu preparat dikeringkan di udara

Preparat siap diamati dibawah mikroskop

KELEBIHAN DAN KEKURANGAN PENGECATAN GRAM Kelebihan : Pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri terhadap antibiotik). Hal ini karena bakteri Gram positif dan negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika. Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna diagnostik. Misalnya pada pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana) uretral, maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonore. Kekurangan : Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari 104 per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis. Pustaka acuan : Nirwati, Hera, _______, Pembuatan Preparat dan Pengecatan dalam Petunjuk Praktikum Mikrobiologi, Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Strohl, William A, Rouse,H, Fish

materi referensi:
http://72.14.235.132/search?q=cache:n6ND http://www.google.co.id/search?hl=id&cli