ADHESI Porphyromonas gingivalis PADA NEUTROFIL YANG DIINKUBASI EKSTRAK KELOPAK BUNGA ROSELLA (Hibiscus sabdariffa L.

)
Oleh : Lila Cita Pratiwi NIM 081610101025

Abstract The initial phase of the inflammatory response against bacterial infection is the process of bacterial adhesion on neutrophil inflammatory cells. One of the bacteria that most common found in cases of chronic periodontitis is Porphyromonas gingivalis. The more bacteria attached the more inflammatory response occured, which caused periodontal tissue’s destruction. Roselle (Hibiscus sabdariffa L.) known to have many benefits in health. Flavonoid content in Roselle suspected of having many anti-inflammatory effects. One of them, probably is the inhibitory action of bacterial adhesion on neutrophils. The aim of this research was to analyze the effect of Roselle’s extract in decreasing adhesion index of P. gingivalis on neutrophils. In this research, neutrophils were incubated by Roselle extract with various concentration ( 50% and 100%) and exposed with P.gingivalis, compared to neutrophils that exposed with P.gingivalis but not given the extract (control). The result showed that neutrophils that incubated by Roselle extract had fewer bacterial adhesion compared to neutrophils that not incubated by Roselle extract. Roselle extract with 100% concentration had more power to inhibit the bacterial adhesion compared to another concentration. It can be concluded that the extract of Roselle decrease adhesion index of P. gingivalis on neutrophils. Keywords: Adhesion, Neutrophils, Roselle, P.gingivalis

1

Perusakan neutrofil juga menyebabkan terjadinya pelepasan mediator inflamasi serta enzim proteolitik. pepsin. 1995). Berdasarkan uraian di atas. Salah satu bakteri penyebab inflamasi di jaringan periodontal. Penelitian . Bakteri ini dapat memetabolisme asam amino dan menghasilkan sejumlah metabolit yang bersifat racun terhadap jaringan gingiva pada manusia (MicrobeWiki. 1995. bisa berlanjut hingga terjadinya penurunan fungsi jaringan periodontal. 2008). Tanpa Tahun).gingivalis. Setelah melekat. 1993). termasuk P. misalnya hidrofobisitas dan tegangan permukaan (Bellanti. neutrofil akan membunuh bakteri dengan mekanisme bakterisidal. Perlekatan ini sangat tergantung dari sifat-sifat permukaan bakteri yang akan difagositosis. apabila respon berlangsung terusmenerus. Rosella banyak diketahui bersifat sebagai anti inflamasi untuk mencegah peradangan dan mengurangi rasa nyeri pada saat infeksi terjadi. Neutrofil berperan penting pada respon radang akut. bakteri dapat melekat pada sel neutrofil melalui reseptor yang terdapat pada membran neutrofil. Proses ini mengakibatkan terjadinya respon inflamasi. maupun melalui interaksi hidrofobik antara partikel hidrofob pada membran sel bakteri dan membran sel neutrofil (BSN Medical. Sehingga inflamasi harus dikontrol. 2003). Pada keadaan lain. salah satunya dapat melalui pengendalian aktifitas sel inflamatori neutrofil. Sebuah sel neutrofil biasanya dapat memfagositosis 3 sampai 20 bakteri sebelum sel itu menjadi inaktif dan mati. dan banyak ditemukan pada kasus periodontitis kronis adalah Porphyromonas gingivalis. yang akhirnya menimbulkan reaksi inflamasi yang pada awalnya diperankan oleh sel inflamatori neutrofil. Susanti dan Rahayuningsih. dan cathepsin.2 PENDAHULUAN Tahap awal dari respon inflamasi terhadap infeksi bakteri adalah proses adhesi berupa perlekatan bakteri pada sel-sel inflamatori neutrofil. proses perlekatan ini dapat dipermudah oleh proses opsonisasi yaitu proses pelapisan partikel antigen oleh antibodi yang terdapat di dalam serum darah. sehingga menyebabkan bakteri dapat melekat dengan mudah pada reseptornya yang terdapat di membran neutrofil (Robbins dan Kumar. yang mengakibatkan lisisnya jaringan (Grossman.

Penelitian dilaksanakan pada bulan Agustus 2011 di Laboratorium Biomedik Bagian Mikrobiologi dan Laboratorium Bio Science Rumah Sakit Gigi dan Mulut Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember. BAHAN DAN METODE Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratoris in vitro. kemudian diuapkan dengan rotary evaporator sampai didapatkan ekstrak dengan konsentrasi 100%. Untuk membuat sediaan ekstrak kelopak bunga Rosella konsentrasi 50% dibuat dengan cara mengambil 1 ml . Kelopak kering Rosella yang telah dihaluskan dimaserasi dengan etanol 97% selama 24 jam di dalam shaker bath. Ficoll Hypaque 1077. dan RPMI.2010. kandungan flavonoid pada kelopak bunga Rosella dapat menurunkan daya adhesi bakteri pada membran neutrofil.3 membuktikan bahwa kelopak bunga Rosella mengandung berbagai macam zat aktif yang salah satunya adalah antosianin yang telah diteliti memiliki efek antioksidan yang kuat dan antiinflamasi. Variabel terikat pada penelitian ini ialah indeks adhesi P. kemudian dibandingkan dengan kelompok kontrol. Variabel bebas pada penelitian ini adalah ekstrak kelopak bunga Rosella (Hibiscus sabdariffa) konsentrasi 50%. Flavonoid juga mampu menghambat perlekatan bakteri dengan cara mengikat protein permukaan bakteri dan menurunkan hidrofobisitas reseptor pada membran sel fagosit (Hamsafir. dextran. 2006). Rancangan penelitian menggunakan post test only control group design yaitu dilakukan pengukuran terhadap variabel yang diteliti setelah diberikan suatu perlakuan. gingivalis galur murni ATCC strain 33277 dengan medium kulturnya yaitu medium BHI diperkaya dengan hemin dan vitamin K1. Alkohol. dan 100%. Septiana et al. Oleh karena itu patut diduga bahwa. heparin. Pembuatan ekstrak dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas MIPA Universitas Jember. Penelitian diawali dengan pengekstrakan kelopak bunga Rosella. darah vena perifer. gingivalis pada neutrofil.. Bahanbahan yang diperlukan antara lain : ekstrak kelopak Bunga Rosella. aquadest steril. isolat neutrofil yang didapatkan dari darah vena perifer orang sehat yang diisolasi dengan teknik gradient density menggunakan Ficoll Hypaque Centrifugation. P. HBSS.

Setelah itu indeks adhesi bakteri dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut. Tiga lapisan teratas dibuang. kemudian diresuspensi dengan 6 cc HBSS. menyisakan lapisan terbawah yang mengandung neutrofil. Di akhir pengamatan chamber dicuci dengan HBSS. 370C dan 5% CO2. Ekstrak kelopak bunga Rosella diberikan terhadap 4 dari 6 petridish masing-masing 50 μl. Perhitungan dilakukan dengan cara menghitung jumlah bakteri yang menempel per neutrofil sampai jumlah neutrofil keseluruhan . gingivalis 200µl. Dua petridish diberikan ekstrak dengan kosentrasi 50%. diinkubasikan selama 3 jam dalam suhu 370C. masing-masing 50 µl dan diinkubasi selama 15 menit. serta dua petridish selanjutnya diberikan ekstrak dengan konsentrasi 100%. Serum diambil dengan pipet mikro dan diencerkan dengan 6 cc HBSS. Darah dialirkan ke tabung falcon lain yang telah berisi 3cc larutan Ficoll.4 sediaan 100% dicampur dengan 1 ml aquadest steril. diinkubasi dalam shaker incubator selama 16 jam. Dua sisanya diberi 50 μl RPMI yang berfungsi sebagai kontrol. Darah dibagi menjadi 3 tabung falcon dan dicentrifuge 650 rpm selama 10 menit hingga terbentuk 2 lapisan (sel darah dan serum). Selanjutnya proses isolasi neutrofil. kemudian difiksasi dan dilakukan pewarnaan Giemsa. gingivalis dikultur dalam medium BHI yang diperkaya dengan vitamin K1 dan hemin. Neutrofil yang sudah diresuspensi tersebut ditambahkan 1 cc dextran 6% dan didiamkan selama 90 menit. pada chamber 1-6 masing-masing ditambahkan suspensi P. Supranatan diaspirasi dan diresuspensi dengan RPMI sampai dengan 500 µl. . diamati dengan mikroskop inverted. Darah vena perifer pasien diambil sebanyak 9cc dan langsung dicampur dengan antikoagulan. kemudian dilakukan pembuatan hapusan dan pewarnaan. Kemudian dilanjutkan dengan kultur P. Setelah itu. P. kemudian dikultur pada atmosfir anaerob (menggunakan anaerobic gas kit) selama 2x24 jam. 370C dan 5% CO2. Konsentrasi Porphyromonas gingivalis dibuat menjadi 3x106 sel/ml. dengan dua kali pengulangan. Secara perlahan. 5% CO2. dan dicentrifuge 1350 RPM selama 30 menit hingga terbentuk 4 lapisan. gingivalis. Uji indeks adhesi dilakukan dengan cara melapiskan isolat neutrofil pada 6 coverslip dalam 6 petridish. Hasil preparat yang sudah dicat dengan pewarnaan Giemsa.

kemudian dilanjutkan dengan uji LSD untuk mengetahui besarnya perbedaan antar kelompok.54 ± 1.rata adhesi P.gingivalis pada neutrofil antara kelompok kontrol dan kelompok perlakuan Adhesi P.00 Kelompok perlakuan 2 (+ekstrak Rosella 100%) 3. Sedangkan rata-rata jumlah adhesi P. Tabel 1.40 ± 1. Hal ini menunjukkan adanya penurunan indeks adhesi pada kelompok perlakuan dibandingkan dengan kelompok kontrol.03 .gingivalis pada neutrofil kelompok perlakuan 2 lebih sedikit daripada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan 1. seperti dilihat pada Tabel 1 dan Gambar 1.5 Indeks adhesi = Jumlah bakteri yang melekat per neutrofil Jumlah neutrofil yang dihitung Data hasil penelitian ini diuji secara parametrik dengan One Way Anova untuk mengetahui adanya perbedaan antar kelompok.59 Kelompok perlakuan 1 (+ekstrak Rosella 50%) 5. HASIL Hasil penelitian adhesi P.29 ± 1. gingivalis pada neutrofil yang diinkubasi oleh ekstrak kelopak bunga Rosella menunjukkan bahwa pada kelompok kontrol (diinkubasi RPMI) adhesi bakteri lebih tinggi daripada kelompok perlakuan 1 (diinkubasi ekstrak Rosella 50%) dan kelompok perlakuan 2 (diinkubasi esktrak Rosella 100%).gingivalis pada Neutrofil Kelompok kontrol (+ RPMI ) X ± SD 8. Rata.

Neutrofil diinkubasi RPMI (kelompok kontrol) mengadhesi P. gambaran adhesi bakteri P. Sehingga menyebabkan neutrofil mengalami lisis.gingivalis tampak sangat tinggi. gingivalis 8.6 Adhesi P.29 * * 5.gingivalis (tanda panah) dalam jumlah banyak ( > 7 bakteri / sel) sehingga menyebabkan neutrofil lisis (pembesaran 1000x) . Sedangkan pada kelompok perlakuan 1 (Gambar 3) dan kelompok perlakuan 2 (Gambar 4) terjadi penurunan adhesi bakteri pada neutrofil.40 Gambar 1. gingivalis pada neutrofil Keterangan : Kelompok kontrol Kelompok Perlakuan 1 Kelompok Perlakuan 2 : Neutrofil diinkubasi RPMI : Neutrofil diinkubasi ekstrak kelopak Rosella konsentrasi 50% : Neutrofil diinkubasi ekstrak kelopak Rosella konsentrasi 100% * : Terdapat perbedaan yang signifikan Secara mikroskopis. Pada kelompok kontrol (Gambar 2) adhesi bakteri P. Gambar 2.54 5 0 Kelompok Kelompok Kelompok Kontrol Perlakuan Perlakuan 1 2 3.gingivalis terhadap sel neutrofil pada ketiga kelompok perlakuan dapat dilihat pada gambar berikut. Diagram batang rata-rata adhesi P. gingivalis pada Neutrofil * 10 Rata-rata adhesi P.

gingivalis (tanda panah) dengan jumlah rata. yang menunjukkan bahwa data terdistribusi normal. hal ini membuktikan bahwa data yang didapat dari penelitian tersebut homogen.076 (p>0.gingivalis (tanda panah) dalam jumlah sedikit dengan jumlah rata-rata 3 bakteri/ sel (pembesaran 1000x) Analisa data pada penelitian ini diawali dengan uji normalitas dan dilanjutkan dengan uji homogenitas sebagai syarat sebelum melakukan uji beda One Way ANOVA. Berdasarkan uji Levene test diketahui bahwa nilai signifikansinya sebesar 0. Hasil uji normalitas menunjukkan bahwa data hasil penelitian ini memiliki nilai p>0.7 Gambar 3.05.05. .rata 5 bakteri/ sel (pembesaran 1000x) Gambar 4.05). Neutrofil diinkubasi ekstrak Rosella 100% (kelompok perlakuan 2) menunjukkan adhesi P. Neutrofil diinkubasi ekstrak Rosella 50% (kelompok perlakuan 1) menunjukkan penurunan adhesi P. Uji selanjutnya adalah uji homogenitas dengan menggunakan uji Levene test dengan p>0.

000* Rosella 100% 0.000 (p<0. pada kelompok kontrol modus yang didapatkan yaitu antara 7-11 bakteri/ sel. sedangkan pada kelompok perlakuan 2 modus yang didapatkan adalah antara 2-5 bakteri/ sel. Hasil uji Post Hoc LSD (Tabel 2) antar kelompok perlakuan menunjukkan probabilitas sebesar 0. dan perlakuan 2 adalah berbeda secara signifikan. dilakukan uji lanjut Post Hoc LSD dengan tingkat kemaknaan 95% (p<0. Sebagai contoh.000* - Keterangan : * = Ada perbedaan yang bermakna (p<0. Tabel 2.000* 0. Hal ini menunjukkan adanya penurunan adhesi P. maka selanjutnya data diuji secara parametrik menggunakan uji One Way ANOVA. Seleksi data dilakukan berdasarkan modus (frekuensi data yang paling sering muncul). pada kelompok perlakuan 1 antara 4-7 bakteri/ sel.8 Data diketahui berdistribusi normal dan homogen.gingivalis.05). dan kelompok perlakuan 2 sebanyak 150 sel. perlakuan 1.000* 0.05) PEMBAHASAN Analisa data indeks adhesi dilakukan pada 450 sel neutrofil yang terdiri dari kelompok kontrol sebanyak 150 sel. Ringkasan hasil uji lanjut Post Hoc LSD Kelompok Kontrol Rosella 50% Rosella 100% Kontrol 0. Selanjutnya untuk mengetahui kelompok mana yang memiliki perbedaan bermakna. Hal ini bertujuan untuk mendapatkan kualitas data yang memadai (quality control). kelompok perlakuan 1 sebanyak 150 sel. Berdasarkan hasil uji One Way Anova didapatkan bahwa rata-rata adhesi P.000* Rosella 50% 0. . tidak digunakan dalam analisa.000* 0.gingivalis pada neutrofil yang diinkubasi oleh ekstrak kelopak bunga Rosella.gingivalis pada neutrofil kelompok kontrol . Data indeks adhesi yang terlalu menyimpang (± 25%) dari total 600 sel yang didapatkan.05) artinya terdapat perbedaan yang signifikan rerata adhesi P.

serta sel neutrofil mayoritas dalam keadaan masih utuh.12% untuk kelompok perlakuan 1. didapatkan konsentrasi ± 3.gingivalis terhadap sel neutrofil sangat tinggi.gingivalis. Pada sel neutrofil yang diberikan ekstrak kelopak bunga Rosella konsentrasi 50% dan 100% dan kemudian dipapar dengan P. maka akan terkandung dalam larutan itu 51% antosianin (Muardi. Pada kelompok perlakuan 1 (neutrofil diinkubasi ekstrak dengan konsentrasi 50%). dan ± 6. gingivalis menunjukkan adanya penurunan adhesi. yaitu masing-masing 50% dan 100% adalah konsentrasi saat pemberian pertama kali pada plastic plate chamber. Kelopak bunga Rosella yang dikeringkan lalu diencerkan dalam 300 ml air. konsentrasi ekstrak kelopak bunga Rosella yang diberikan pada kelompok perlakuan 1 dan kelompok perlakuan 2. Semakin pekat warna kemerahan pada bunga Rosella.9 Hasil penelitian menunjukkan adanya penurunan indeks adhesi P. Indeks adhesi yang paling rendah tampak pada kelompok dengan inkubasi ekstrak konsentrasi 100%.25% untuk kelompok perlakuan 2.2010). dan kelompok perlakuan 2 (neutrofil diinkubasi ekstrak dengan konsentrasi 100%) terjadi penurunan indeks adhesi dari P. Kandungan flavonoid yang tinggi inilah yang diduga mampu menghambat perlekatan bakteri (Hamsafir.gingivalis. Kandungan penting yang terdapat pada kelopak bunga Rosella adalah pigmen antosianin yang membentuk flavonoid yang berperan sebagai antioksidan. Hal tersebut telah dapat dibuktikan melalui penelitian ini.gingivalis pada neutrofil diduga melalui peran flavonoid yang terkandung di didalamnya. Sedangkan konsentrasi final setelah dilakukan penambahan media dan suspensi bakteri P.gingivalis pada neutrofil yang diinkubasi oleh ekstrak kelopak bunga Rosella.2009). maka semakin tinggi pula kandungan antosianin di dalamnya (Usman. Pigmen antosianin ini membentuk warna ungu kemerahan di kelopak bunga Rosella. hal ini dikarenakan flavonoid memberikan perlindungan pada membran sel neutrofil dengan cara menyelimuti seluruh permukaan pada . Neutrofil yang memfagosit banyak bakteri akan mengalami lisis dan menyebabkan tumpahnya cairan intrasel ke lingkungan ekstrasel. 2010). Pada penelitian kali ini perlu ditekankan bahwa. Mekanisme ekstrak kelopak bunga Rosella dalam menurunkan indeks adhesi P. Pada kelompok kontrol (neutrofil diinkubasi RPMI) indeks adhesi P.

2003). antioksidan. gingivalis pada sel neutrofil menurun dibandingkan pada neutrofil yang tidak diinkubasi oleh ekstrak kelopak bunga Rosella. Flavonoid berperan dalam memperkuat dinding pembuluh darah kapiler sehingga perdarahan yang timbul dapat terhenti. flavonoid berperan dalam proses penyembuhan luka pasca pencabutan gigi dengan cara meningkatkan atau mempercepat proliferasi sel fibroblas dan produksi serabut kolagen.10 membran sel neutrofil kemudian menurunkan hidrofobisitas membran sel neutrofil sehingga adhesi bakteri P. mikrosom. Kandungan flavonoid dalam kelopak bunga Rosella memiliki banyak manfaat lain dalam bidang kedokteran gigi antara lain sebagai berikut. antara lain bersifat antibakteri. 2003). Selain itu aplikasi flavonoid juga dapat mengurangi rasa sakit yang timbul pasca ekstraksi. antikarsinogen. Rosella dimasyarakat telah banyak dimanfaatkan sebagai obat tradisional. 3) Bidang konservasi gigi. Flavonoid bersifat antibakteri karena mampu berinteraksi dengan DNA bakteri. Sifat antiinflamasi dapat meringankan proses fagositosis dan bahan yang memiliki sifat anti bakteri dapat menekan pertumbuhan bakteri patogen sehingga dapat meminimalisir infeksi sekunder yang menghambat penyembuhan luka (Robbins & Kumar. Dengan adanya penelitian ini diharapkan dapat dikembangkan pengolahan Rosella . antiinflamasi. 1995). antialergi. Hasil interaksi ini menyebabkan perubahan permeabilitas dinding sel bakteri. selain itu flavonoid juga berperan menekan sintesis prostaglandin dan menstimulasi hidroksiprolin sehingga jaringan gingiva kembali normal. dan lisosom (Bryan dan Wilson dalam Sabir. flavonoid berperan dalam regenerasi pulpa gigi melalui kemampuannya menginduksi terbentuknya jembatan dentin pada perawatan direct pulp capping (Sabir. 2003). yaitu pada pengobatan periodontitis. 1) Bidang periodontologi. Penggunaan bahan yang memiliki efek antiinflamasi dan antibakteri sekaligus dalam satu formulasi efektif dalam mempercepat proses penyembuhan luka. dan melindungi pembuluh darah (Sabir. 2) Bidang bedah mulut. Flavonoid juga memiliki aktivitas biologis maupun farmakologis.

maka dapat ditarik kesimpulan bahwa pemberian ekstrak kelopak bunga Rosella dapat menurunkan indeks adhesi Porphyromonas gingivalis pada neutrofil. 1995. Desi Sandra Sari.htm [ 18 Mei 2011] Grossman IL. atas bimbingan dan fasilitas yang diberikan selama penelitian. gingivalis bisa dibunuh dengan mekanisme bakterisidal.drg.11 sebagai obat topical yang sekaligus berperan sebagai antibiotik untuk penderita periodontitis. Jakarta : EGC. IDA Susilawati. DAFTAR PUSTAKA Bellanti.com/Indonesia/faq.1993. Ilmu Endodontik dalam Praktik. namun kerusakan jaringan yang terjadi akibat proses inflamasi bisa lebih terkendali. Hal:18-39 BSN Medical.11. http://www.gingivalis dan konsentrasi ekstrak Rosella yang terlalu tinggi. JA. Selain itu diperlukan pula perbaikan pada penelitian lebih lanjut tentang konsentrasi suspensi P.Kes melalui proyek RISBIN IPTEKDOK serta drg. Rio CED.Hal: 128 . serta perlu adanya penelitian mengenai aplikasi ekstrak kelopak bunga Rosella sebagai obat topikal pada penderita penyakit periodontal.cutimedsorbact.Sc selaku Dosen Pembimbing Anggota. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan. M. Samik Wahab. SARAN Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang efek pemberian ekstrak kelopak bunga Rosella terhadap adhesi mikroflora lain yang bersifat patogen di rongga mulut pada sel neutrofil. UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. [online]. Ed. Oliet S. Cutimed Sorbact. Dengan demikian diharapkan bakteri P. Terjemahan oleh A. melalui pengendalian aktifitas neutrofil. Tanpa Tahun. MD. Imunologi III.

)”.kenyon. E. [Online] Porphyromonas. [11 Januari 2012] online]. [ 27 April 2011 ] Muardi.com/kesehatan-gigi/teh-dapat-menghambatpembentukan-karies-gigi.KG Dental Journal Edisi Khusus Temu Ilmiah Nasional III. Teh Dapat Menghambat Pembentukan Karies Gigi. . Surabaya : Airlangga University Pers. 2008. 1995. [1 Juni 2011] McGaw. Robbins.http://microbewiki. Buku ajar patologi I (4th ed. Cantik Penuh Manfaat. ”Karakteristik Dan Aktivitas Antioksidan Bunga Rosella Kering (Hibiscus sabdariffa L. 2003. dan Rahayuningsih.com/artikel-19-rosella-cantik-penuhmanfaat.infogigi.12 Hamsafir. 2003. 2010. 68(3) : 165-9 MicrobeWiki. D. Periodontal Disease and Preterm Delivery of Low Birth Weight Infants. Zakaria. 2006. 2010. 2009.html. 2002.edu/index. Maj.php/Porphyromonas. Aktivitas Fagositosis Neutrofil Terhadap Staphylococcus aureus Isolat Sapi di Jawa Tengah dengan Teknik Acridine Orange Fluorescence. Penghambatan Oksidasi LDL dan Akumulasi Kolesterol Pada Makrofag oleh Ekstrak Temulawak (Curcuma xanthorriza Roxb). D. T. J Can Dent Assoc.) (Staf pengajar laboratorium patologi anatomik FK UI.XVII (3) : 221-226 Susanti. dan Kumar. V.A. [serial online]. Rosella. Vol. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan. S. Pemanfaatan flavonoid di Bidang Kedokteran Gigi. [serial http://www.html. Vol. penerjemah). Tidak Diterbitkan. Skripsi.38:135-141 Septiana.L.. Jakarta: EGC Sabir.http://www.. R. Surabaya: Fakultas Teknologi Industri Universitas Pembangunan Nasional ”Veteran” Jawa Timur. Muchtadi. Berkas Penelitian Hayati Usman.ummi-online. M. Vol. Dwiyanti.