ADHESI Porphyromonas gingivalis PADA NEUTROFIL YANG DIINKUBASI EKSTRAK KELOPAK BUNGA ROSELLA (Hibiscus sabdariffa L.

)
Oleh : Lila Cita Pratiwi NIM 081610101025

Abstract The initial phase of the inflammatory response against bacterial infection is the process of bacterial adhesion on neutrophil inflammatory cells. One of the bacteria that most common found in cases of chronic periodontitis is Porphyromonas gingivalis. The more bacteria attached the more inflammatory response occured, which caused periodontal tissue’s destruction. Roselle (Hibiscus sabdariffa L.) known to have many benefits in health. Flavonoid content in Roselle suspected of having many anti-inflammatory effects. One of them, probably is the inhibitory action of bacterial adhesion on neutrophils. The aim of this research was to analyze the effect of Roselle’s extract in decreasing adhesion index of P. gingivalis on neutrophils. In this research, neutrophils were incubated by Roselle extract with various concentration ( 50% and 100%) and exposed with P.gingivalis, compared to neutrophils that exposed with P.gingivalis but not given the extract (control). The result showed that neutrophils that incubated by Roselle extract had fewer bacterial adhesion compared to neutrophils that not incubated by Roselle extract. Roselle extract with 100% concentration had more power to inhibit the bacterial adhesion compared to another concentration. It can be concluded that the extract of Roselle decrease adhesion index of P. gingivalis on neutrophils. Keywords: Adhesion, Neutrophils, Roselle, P.gingivalis

1

gingivalis. Susanti dan Rahayuningsih. pepsin. Rosella banyak diketahui bersifat sebagai anti inflamasi untuk mencegah peradangan dan mengurangi rasa nyeri pada saat infeksi terjadi. Sehingga inflamasi harus dikontrol. apabila respon berlangsung terusmenerus. Sebuah sel neutrofil biasanya dapat memfagositosis 3 sampai 20 bakteri sebelum sel itu menjadi inaktif dan mati. Perlekatan ini sangat tergantung dari sifat-sifat permukaan bakteri yang akan difagositosis. Neutrofil berperan penting pada respon radang akut. Setelah melekat. bisa berlanjut hingga terjadinya penurunan fungsi jaringan periodontal. yang akhirnya menimbulkan reaksi inflamasi yang pada awalnya diperankan oleh sel inflamatori neutrofil. 1995). 2008). bakteri dapat melekat pada sel neutrofil melalui reseptor yang terdapat pada membran neutrofil. Berdasarkan uraian di atas. Bakteri ini dapat memetabolisme asam amino dan menghasilkan sejumlah metabolit yang bersifat racun terhadap jaringan gingiva pada manusia (MicrobeWiki. Salah satu bakteri penyebab inflamasi di jaringan periodontal. 1993). dan banyak ditemukan pada kasus periodontitis kronis adalah Porphyromonas gingivalis. neutrofil akan membunuh bakteri dengan mekanisme bakterisidal. 2003). dan cathepsin. 1995. termasuk P. Proses ini mengakibatkan terjadinya respon inflamasi. yang mengakibatkan lisisnya jaringan (Grossman.2 PENDAHULUAN Tahap awal dari respon inflamasi terhadap infeksi bakteri adalah proses adhesi berupa perlekatan bakteri pada sel-sel inflamatori neutrofil. Perusakan neutrofil juga menyebabkan terjadinya pelepasan mediator inflamasi serta enzim proteolitik. proses perlekatan ini dapat dipermudah oleh proses opsonisasi yaitu proses pelapisan partikel antigen oleh antibodi yang terdapat di dalam serum darah. maupun melalui interaksi hidrofobik antara partikel hidrofob pada membran sel bakteri dan membran sel neutrofil (BSN Medical. Tanpa Tahun). Pada keadaan lain. misalnya hidrofobisitas dan tegangan permukaan (Bellanti. salah satunya dapat melalui pengendalian aktifitas sel inflamatori neutrofil. Penelitian . sehingga menyebabkan bakteri dapat melekat dengan mudah pada reseptornya yang terdapat di membran neutrofil (Robbins dan Kumar.

gingivalis pada neutrofil. heparin. HBSS. kandungan flavonoid pada kelopak bunga Rosella dapat menurunkan daya adhesi bakteri pada membran neutrofil. Alkohol. Penelitian diawali dengan pengekstrakan kelopak bunga Rosella. kemudian diuapkan dengan rotary evaporator sampai didapatkan ekstrak dengan konsentrasi 100%. kemudian dibandingkan dengan kelompok kontrol. P. Pembuatan ekstrak dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas MIPA Universitas Jember. Penelitian dilaksanakan pada bulan Agustus 2011 di Laboratorium Biomedik Bagian Mikrobiologi dan Laboratorium Bio Science Rumah Sakit Gigi dan Mulut Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember. Variabel terikat pada penelitian ini ialah indeks adhesi P. 2006). Kelopak kering Rosella yang telah dihaluskan dimaserasi dengan etanol 97% selama 24 jam di dalam shaker bath.3 membuktikan bahwa kelopak bunga Rosella mengandung berbagai macam zat aktif yang salah satunya adalah antosianin yang telah diteliti memiliki efek antioksidan yang kuat dan antiinflamasi. gingivalis galur murni ATCC strain 33277 dengan medium kulturnya yaitu medium BHI diperkaya dengan hemin dan vitamin K1. Variabel bebas pada penelitian ini adalah ekstrak kelopak bunga Rosella (Hibiscus sabdariffa) konsentrasi 50%. dextran. Septiana et al. dan 100%. BAHAN DAN METODE Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratoris in vitro. Flavonoid juga mampu menghambat perlekatan bakteri dengan cara mengikat protein permukaan bakteri dan menurunkan hidrofobisitas reseptor pada membran sel fagosit (Hamsafir. darah vena perifer. Bahanbahan yang diperlukan antara lain : ekstrak kelopak Bunga Rosella. isolat neutrofil yang didapatkan dari darah vena perifer orang sehat yang diisolasi dengan teknik gradient density menggunakan Ficoll Hypaque Centrifugation. aquadest steril. Oleh karena itu patut diduga bahwa. Rancangan penelitian menggunakan post test only control group design yaitu dilakukan pengukuran terhadap variabel yang diteliti setelah diberikan suatu perlakuan. Untuk membuat sediaan ekstrak kelopak bunga Rosella konsentrasi 50% dibuat dengan cara mengambil 1 ml . dan RPMI.. Ficoll Hypaque 1077.2010.

diinkubasi dalam shaker incubator selama 16 jam. Setelah itu indeks adhesi bakteri dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut. dan dicentrifuge 1350 RPM selama 30 menit hingga terbentuk 4 lapisan. diamati dengan mikroskop inverted. 370C dan 5% CO2. menyisakan lapisan terbawah yang mengandung neutrofil. Neutrofil yang sudah diresuspensi tersebut ditambahkan 1 cc dextran 6% dan didiamkan selama 90 menit. gingivalis dikultur dalam medium BHI yang diperkaya dengan vitamin K1 dan hemin. gingivalis 200µl. Kemudian dilanjutkan dengan kultur P. 5% CO2. Ekstrak kelopak bunga Rosella diberikan terhadap 4 dari 6 petridish masing-masing 50 μl. pada chamber 1-6 masing-masing ditambahkan suspensi P.4 sediaan 100% dicampur dengan 1 ml aquadest steril. Selanjutnya proses isolasi neutrofil. Secara perlahan. Uji indeks adhesi dilakukan dengan cara melapiskan isolat neutrofil pada 6 coverslip dalam 6 petridish. Hasil preparat yang sudah dicat dengan pewarnaan Giemsa. Darah vena perifer pasien diambil sebanyak 9cc dan langsung dicampur dengan antikoagulan. . serta dua petridish selanjutnya diberikan ekstrak dengan konsentrasi 100%. Konsentrasi Porphyromonas gingivalis dibuat menjadi 3x106 sel/ml. kemudian dikultur pada atmosfir anaerob (menggunakan anaerobic gas kit) selama 2x24 jam. Dua sisanya diberi 50 μl RPMI yang berfungsi sebagai kontrol. Serum diambil dengan pipet mikro dan diencerkan dengan 6 cc HBSS. kemudian dilakukan pembuatan hapusan dan pewarnaan. P. diinkubasikan selama 3 jam dalam suhu 370C. Perhitungan dilakukan dengan cara menghitung jumlah bakteri yang menempel per neutrofil sampai jumlah neutrofil keseluruhan . dengan dua kali pengulangan. 370C dan 5% CO2. kemudian diresuspensi dengan 6 cc HBSS. Darah dibagi menjadi 3 tabung falcon dan dicentrifuge 650 rpm selama 10 menit hingga terbentuk 2 lapisan (sel darah dan serum). Di akhir pengamatan chamber dicuci dengan HBSS. gingivalis. Dua petridish diberikan ekstrak dengan kosentrasi 50%. Supranatan diaspirasi dan diresuspensi dengan RPMI sampai dengan 500 µl. masing-masing 50 µl dan diinkubasi selama 15 menit. Tiga lapisan teratas dibuang. kemudian difiksasi dan dilakukan pewarnaan Giemsa. Darah dialirkan ke tabung falcon lain yang telah berisi 3cc larutan Ficoll. Setelah itu.

gingivalis pada Neutrofil Kelompok kontrol (+ RPMI ) X ± SD 8.54 ± 1. Hal ini menunjukkan adanya penurunan indeks adhesi pada kelompok perlakuan dibandingkan dengan kelompok kontrol.59 Kelompok perlakuan 1 (+ekstrak Rosella 50%) 5.gingivalis pada neutrofil kelompok perlakuan 2 lebih sedikit daripada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan 1.5 Indeks adhesi = Jumlah bakteri yang melekat per neutrofil Jumlah neutrofil yang dihitung Data hasil penelitian ini diuji secara parametrik dengan One Way Anova untuk mengetahui adanya perbedaan antar kelompok.03 . Tabel 1. Rata.00 Kelompok perlakuan 2 (+ekstrak Rosella 100%) 3. kemudian dilanjutkan dengan uji LSD untuk mengetahui besarnya perbedaan antar kelompok. HASIL Hasil penelitian adhesi P. gingivalis pada neutrofil yang diinkubasi oleh ekstrak kelopak bunga Rosella menunjukkan bahwa pada kelompok kontrol (diinkubasi RPMI) adhesi bakteri lebih tinggi daripada kelompok perlakuan 1 (diinkubasi ekstrak Rosella 50%) dan kelompok perlakuan 2 (diinkubasi esktrak Rosella 100%).rata adhesi P.gingivalis pada neutrofil antara kelompok kontrol dan kelompok perlakuan Adhesi P. seperti dilihat pada Tabel 1 dan Gambar 1. Sedangkan rata-rata jumlah adhesi P.29 ± 1.40 ± 1.

gambaran adhesi bakteri P.gingivalis tampak sangat tinggi. Sehingga menyebabkan neutrofil mengalami lisis. Diagram batang rata-rata adhesi P.gingivalis terhadap sel neutrofil pada ketiga kelompok perlakuan dapat dilihat pada gambar berikut.54 5 0 Kelompok Kelompok Kelompok Kontrol Perlakuan Perlakuan 1 2 3. Neutrofil diinkubasi RPMI (kelompok kontrol) mengadhesi P.40 Gambar 1.29 * * 5. gingivalis pada Neutrofil * 10 Rata-rata adhesi P.6 Adhesi P. gingivalis pada neutrofil Keterangan : Kelompok kontrol Kelompok Perlakuan 1 Kelompok Perlakuan 2 : Neutrofil diinkubasi RPMI : Neutrofil diinkubasi ekstrak kelopak Rosella konsentrasi 50% : Neutrofil diinkubasi ekstrak kelopak Rosella konsentrasi 100% * : Terdapat perbedaan yang signifikan Secara mikroskopis. gingivalis 8. Pada kelompok kontrol (Gambar 2) adhesi bakteri P.gingivalis (tanda panah) dalam jumlah banyak ( > 7 bakteri / sel) sehingga menyebabkan neutrofil lisis (pembesaran 1000x) . Sedangkan pada kelompok perlakuan 1 (Gambar 3) dan kelompok perlakuan 2 (Gambar 4) terjadi penurunan adhesi bakteri pada neutrofil. Gambar 2.

rata 5 bakteri/ sel (pembesaran 1000x) Gambar 4.gingivalis (tanda panah) dengan jumlah rata.05. Berdasarkan uji Levene test diketahui bahwa nilai signifikansinya sebesar 0. Neutrofil diinkubasi ekstrak Rosella 50% (kelompok perlakuan 1) menunjukkan penurunan adhesi P.05.076 (p>0.05). . Neutrofil diinkubasi ekstrak Rosella 100% (kelompok perlakuan 2) menunjukkan adhesi P. Hasil uji normalitas menunjukkan bahwa data hasil penelitian ini memiliki nilai p>0.gingivalis (tanda panah) dalam jumlah sedikit dengan jumlah rata-rata 3 bakteri/ sel (pembesaran 1000x) Analisa data pada penelitian ini diawali dengan uji normalitas dan dilanjutkan dengan uji homogenitas sebagai syarat sebelum melakukan uji beda One Way ANOVA. hal ini membuktikan bahwa data yang didapat dari penelitian tersebut homogen. yang menunjukkan bahwa data terdistribusi normal.7 Gambar 3. Uji selanjutnya adalah uji homogenitas dengan menggunakan uji Levene test dengan p>0.

000* 0. Tabel 2.000* - Keterangan : * = Ada perbedaan yang bermakna (p<0. Seleksi data dilakukan berdasarkan modus (frekuensi data yang paling sering muncul).8 Data diketahui berdistribusi normal dan homogen.000 (p<0. dan perlakuan 2 adalah berbeda secara signifikan. pada kelompok perlakuan 1 antara 4-7 bakteri/ sel. tidak digunakan dalam analisa.000* 0. dan kelompok perlakuan 2 sebanyak 150 sel.gingivalis pada neutrofil kelompok kontrol . kelompok perlakuan 1 sebanyak 150 sel. pada kelompok kontrol modus yang didapatkan yaitu antara 7-11 bakteri/ sel.gingivalis pada neutrofil yang diinkubasi oleh ekstrak kelopak bunga Rosella. .000* Rosella 100% 0. Hal ini bertujuan untuk mendapatkan kualitas data yang memadai (quality control).000* Rosella 50% 0. Data indeks adhesi yang terlalu menyimpang (± 25%) dari total 600 sel yang didapatkan. sedangkan pada kelompok perlakuan 2 modus yang didapatkan adalah antara 2-5 bakteri/ sel. Sebagai contoh. Berdasarkan hasil uji One Way Anova didapatkan bahwa rata-rata adhesi P.05) artinya terdapat perbedaan yang signifikan rerata adhesi P. Ringkasan hasil uji lanjut Post Hoc LSD Kelompok Kontrol Rosella 50% Rosella 100% Kontrol 0. Selanjutnya untuk mengetahui kelompok mana yang memiliki perbedaan bermakna. dilakukan uji lanjut Post Hoc LSD dengan tingkat kemaknaan 95% (p<0.000* 0.gingivalis. Hal ini menunjukkan adanya penurunan adhesi P.05) PEMBAHASAN Analisa data indeks adhesi dilakukan pada 450 sel neutrofil yang terdiri dari kelompok kontrol sebanyak 150 sel.05). perlakuan 1. Hasil uji Post Hoc LSD (Tabel 2) antar kelompok perlakuan menunjukkan probabilitas sebesar 0. maka selanjutnya data diuji secara parametrik menggunakan uji One Way ANOVA.

hal ini dikarenakan flavonoid memberikan perlindungan pada membran sel neutrofil dengan cara menyelimuti seluruh permukaan pada .2009). dan kelompok perlakuan 2 (neutrofil diinkubasi ekstrak dengan konsentrasi 100%) terjadi penurunan indeks adhesi dari P. konsentrasi ekstrak kelopak bunga Rosella yang diberikan pada kelompok perlakuan 1 dan kelompok perlakuan 2.gingivalis terhadap sel neutrofil sangat tinggi.gingivalis. dan ± 6. Mekanisme ekstrak kelopak bunga Rosella dalam menurunkan indeks adhesi P.12% untuk kelompok perlakuan 1. serta sel neutrofil mayoritas dalam keadaan masih utuh. Pada sel neutrofil yang diberikan ekstrak kelopak bunga Rosella konsentrasi 50% dan 100% dan kemudian dipapar dengan P.9 Hasil penelitian menunjukkan adanya penurunan indeks adhesi P. Semakin pekat warna kemerahan pada bunga Rosella. gingivalis menunjukkan adanya penurunan adhesi.gingivalis.gingivalis pada neutrofil diduga melalui peran flavonoid yang terkandung di didalamnya. maka semakin tinggi pula kandungan antosianin di dalamnya (Usman. Pada kelompok perlakuan 1 (neutrofil diinkubasi ekstrak dengan konsentrasi 50%). Pada penelitian kali ini perlu ditekankan bahwa. Neutrofil yang memfagosit banyak bakteri akan mengalami lisis dan menyebabkan tumpahnya cairan intrasel ke lingkungan ekstrasel. Kandungan flavonoid yang tinggi inilah yang diduga mampu menghambat perlekatan bakteri (Hamsafir. Hal tersebut telah dapat dibuktikan melalui penelitian ini. maka akan terkandung dalam larutan itu 51% antosianin (Muardi. Indeks adhesi yang paling rendah tampak pada kelompok dengan inkubasi ekstrak konsentrasi 100%.2010). Pada kelompok kontrol (neutrofil diinkubasi RPMI) indeks adhesi P. didapatkan konsentrasi ± 3.gingivalis pada neutrofil yang diinkubasi oleh ekstrak kelopak bunga Rosella. Sedangkan konsentrasi final setelah dilakukan penambahan media dan suspensi bakteri P.25% untuk kelompok perlakuan 2. 2010). Kelopak bunga Rosella yang dikeringkan lalu diencerkan dalam 300 ml air. yaitu masing-masing 50% dan 100% adalah konsentrasi saat pemberian pertama kali pada plastic plate chamber. Pigmen antosianin ini membentuk warna ungu kemerahan di kelopak bunga Rosella. Kandungan penting yang terdapat pada kelopak bunga Rosella adalah pigmen antosianin yang membentuk flavonoid yang berperan sebagai antioksidan.

flavonoid berperan dalam proses penyembuhan luka pasca pencabutan gigi dengan cara meningkatkan atau mempercepat proliferasi sel fibroblas dan produksi serabut kolagen. 1995). Kandungan flavonoid dalam kelopak bunga Rosella memiliki banyak manfaat lain dalam bidang kedokteran gigi antara lain sebagai berikut. antara lain bersifat antibakteri. Hasil interaksi ini menyebabkan perubahan permeabilitas dinding sel bakteri. 2003). 2003).10 membran sel neutrofil kemudian menurunkan hidrofobisitas membran sel neutrofil sehingga adhesi bakteri P. 2003). Rosella dimasyarakat telah banyak dimanfaatkan sebagai obat tradisional. Selain itu aplikasi flavonoid juga dapat mengurangi rasa sakit yang timbul pasca ekstraksi. mikrosom. selain itu flavonoid juga berperan menekan sintesis prostaglandin dan menstimulasi hidroksiprolin sehingga jaringan gingiva kembali normal. antikarsinogen. gingivalis pada sel neutrofil menurun dibandingkan pada neutrofil yang tidak diinkubasi oleh ekstrak kelopak bunga Rosella. antialergi. yaitu pada pengobatan periodontitis. flavonoid berperan dalam regenerasi pulpa gigi melalui kemampuannya menginduksi terbentuknya jembatan dentin pada perawatan direct pulp capping (Sabir. Flavonoid juga memiliki aktivitas biologis maupun farmakologis. antiinflamasi. antioksidan. Flavonoid berperan dalam memperkuat dinding pembuluh darah kapiler sehingga perdarahan yang timbul dapat terhenti. Flavonoid bersifat antibakteri karena mampu berinteraksi dengan DNA bakteri. Sifat antiinflamasi dapat meringankan proses fagositosis dan bahan yang memiliki sifat anti bakteri dapat menekan pertumbuhan bakteri patogen sehingga dapat meminimalisir infeksi sekunder yang menghambat penyembuhan luka (Robbins & Kumar. 2) Bidang bedah mulut. 3) Bidang konservasi gigi. dan lisosom (Bryan dan Wilson dalam Sabir. Dengan adanya penelitian ini diharapkan dapat dikembangkan pengolahan Rosella . dan melindungi pembuluh darah (Sabir. 1) Bidang periodontologi. Penggunaan bahan yang memiliki efek antiinflamasi dan antibakteri sekaligus dalam satu formulasi efektif dalam mempercepat proses penyembuhan luka.

Hal:18-39 BSN Medical.cutimedsorbact. Tanpa Tahun. Samik Wahab.1993. Selain itu diperlukan pula perbaikan pada penelitian lebih lanjut tentang konsentrasi suspensi P. Ilmu Endodontik dalam Praktik. M. Cutimed Sorbact. [online]. Imunologi III.Hal: 128 . JA. 1995.11 sebagai obat topical yang sekaligus berperan sebagai antibiotik untuk penderita periodontitis. Ed. DAFTAR PUSTAKA Bellanti. SARAN Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang efek pemberian ekstrak kelopak bunga Rosella terhadap adhesi mikroflora lain yang bersifat patogen di rongga mulut pada sel neutrofil.Sc selaku Dosen Pembimbing Anggota. atas bimbingan dan fasilitas yang diberikan selama penelitian. Jakarta : EGC. IDA Susilawati. Dengan demikian diharapkan bakteri P. KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan.Kes melalui proyek RISBIN IPTEKDOK serta drg.com/Indonesia/faq. Desi Sandra Sari.11. gingivalis bisa dibunuh dengan mekanisme bakterisidal. UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. melalui pengendalian aktifitas neutrofil. serta perlu adanya penelitian mengenai aplikasi ekstrak kelopak bunga Rosella sebagai obat topikal pada penderita penyakit periodontal. maka dapat ditarik kesimpulan bahwa pemberian ekstrak kelopak bunga Rosella dapat menurunkan indeks adhesi Porphyromonas gingivalis pada neutrofil. Rio CED.htm [ 18 Mei 2011] Grossman IL. Terjemahan oleh A. http://www. MD.gingivalis dan konsentrasi ekstrak Rosella yang terlalu tinggi.drg. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. namun kerusakan jaringan yang terjadi akibat proses inflamasi bisa lebih terkendali. Oliet S.

T. Pemanfaatan flavonoid di Bidang Kedokteran Gigi. Rosella. Skripsi. [1 Juni 2011] McGaw.XVII (3) : 221-226 Susanti. Vol. 2010.)”.A.html.http://microbewiki.http://www. . 2008. Aktivitas Fagositosis Neutrofil Terhadap Staphylococcus aureus Isolat Sapi di Jawa Tengah dengan Teknik Acridine Orange Fluorescence.. Surabaya : Airlangga University Pers. [11 Januari 2012] online]. Surabaya: Fakultas Teknologi Industri Universitas Pembangunan Nasional ”Veteran” Jawa Timur. Muchtadi.php/Porphyromonas.12 Hamsafir.html. R.com/artikel-19-rosella-cantik-penuhmanfaat. Robbins. Teh Dapat Menghambat Pembentukan Karies Gigi. [Online] Porphyromonas. Zakaria. 2003. V. Vol. 2006. 2010. dan Kumar..KG Dental Journal Edisi Khusus Temu Ilmiah Nasional III.infogigi.com/kesehatan-gigi/teh-dapat-menghambatpembentukan-karies-gigi.kenyon.edu/index. D. S. [serial online]. E. Tidak Diterbitkan. ”Karakteristik Dan Aktivitas Antioksidan Bunga Rosella Kering (Hibiscus sabdariffa L.) (Staf pengajar laboratorium patologi anatomik FK UI. Periodontal Disease and Preterm Delivery of Low Birth Weight Infants. 68(3) : 165-9 MicrobeWiki. M. 2002. 2009. Berkas Penelitian Hayati Usman. penerjemah). [ 27 April 2011 ] Muardi. Buku ajar patologi I (4th ed. 1995. Jakarta: EGC Sabir. Vol.ummi-online. [serial http://www. Penghambatan Oksidasi LDL dan Akumulasi Kolesterol Pada Makrofag oleh Ekstrak Temulawak (Curcuma xanthorriza Roxb). dan Rahayuningsih. Maj. 2003. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan. Dwiyanti. Cantik Penuh Manfaat.38:135-141 Septiana. J Can Dent Assoc. D.L.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful