You are on page 1of 12

ADHESI Porphyromonas gingivalis PADA NEUTROFIL YANG DIINKUBASI EKSTRAK KELOPAK BUNGA ROSELLA (Hibiscus sabdariffa L.

)
Oleh : Lila Cita Pratiwi NIM 081610101025

Abstract The initial phase of the inflammatory response against bacterial infection is the process of bacterial adhesion on neutrophil inflammatory cells. One of the bacteria that most common found in cases of chronic periodontitis is Porphyromonas gingivalis. The more bacteria attached the more inflammatory response occured, which caused periodontal tissues destruction. Roselle (Hibiscus sabdariffa L.) known to have many benefits in health. Flavonoid content in Roselle suspected of having many anti-inflammatory effects. One of them, probably is the inhibitory action of bacterial adhesion on neutrophils. The aim of this research was to analyze the effect of Roselles extract in decreasing adhesion index of P. gingivalis on neutrophils. In this research, neutrophils were incubated by Roselle extract with various concentration ( 50% and 100%) and exposed with P.gingivalis, compared to neutrophils that exposed with P.gingivalis but not given the extract (control). The result showed that neutrophils that incubated by Roselle extract had fewer bacterial adhesion compared to neutrophils that not incubated by Roselle extract. Roselle extract with 100% concentration had more power to inhibit the bacterial adhesion compared to another concentration. It can be concluded that the extract of Roselle decrease adhesion index of P. gingivalis on neutrophils. Keywords: Adhesion, Neutrophils, Roselle, P.gingivalis

PENDAHULUAN Tahap awal dari respon inflamasi terhadap infeksi bakteri adalah proses adhesi berupa perlekatan bakteri pada sel-sel inflamatori neutrofil. Perlekatan ini sangat tergantung dari sifat-sifat permukaan bakteri yang akan difagositosis, misalnya hidrofobisitas dan tegangan permukaan (Bellanti, 1993). Pada keadaan lain, proses perlekatan ini dapat dipermudah oleh proses opsonisasi yaitu proses pelapisan partikel antigen oleh antibodi yang terdapat di dalam serum darah, sehingga menyebabkan bakteri dapat melekat dengan mudah pada reseptornya yang terdapat di membran neutrofil (Robbins dan Kumar, 1995; Susanti dan Rahayuningsih, 2003). Salah satu bakteri penyebab inflamasi di jaringan periodontal, dan banyak ditemukan pada kasus periodontitis kronis adalah Porphyromonas gingivalis. Bakteri ini dapat memetabolisme asam amino dan menghasilkan sejumlah metabolit yang bersifat racun terhadap jaringan gingiva pada manusia

(MicrobeWiki, 2008), yang akhirnya menimbulkan reaksi inflamasi yang pada awalnya diperankan oleh sel inflamatori neutrofil. Neutrofil berperan penting pada respon radang akut. Sebuah sel neutrofil biasanya dapat memfagositosis 3 sampai 20 bakteri sebelum sel itu menjadi inaktif dan mati. Perusakan neutrofil juga menyebabkan terjadinya pelepasan mediator inflamasi serta enzim proteolitik, pepsin, dan cathepsin, yang mengakibatkan lisisnya jaringan (Grossman, 1995). Berdasarkan uraian di atas, bakteri dapat melekat pada sel neutrofil melalui reseptor yang terdapat pada membran neutrofil, maupun melalui interaksi hidrofobik antara partikel hidrofob pada membran sel bakteri dan membran sel neutrofil (BSN Medical, Tanpa Tahun). Setelah melekat, neutrofil akan

membunuh bakteri dengan mekanisme bakterisidal, termasuk P.gingivalis. Proses ini mengakibatkan terjadinya respon inflamasi, apabila respon berlangsung terusmenerus, bisa berlanjut hingga terjadinya penurunan fungsi jaringan periodontal. Sehingga inflamasi harus dikontrol, salah satunya dapat melalui pengendalian aktifitas sel inflamatori neutrofil. Rosella banyak diketahui bersifat sebagai anti inflamasi untuk mencegah peradangan dan mengurangi rasa nyeri pada saat infeksi terjadi. Penelitian

membuktikan bahwa kelopak bunga Rosella mengandung berbagai macam zat aktif yang salah satunya adalah antosianin yang telah diteliti memiliki efek antioksidan yang kuat dan antiinflamasi. Flavonoid juga mampu menghambat perlekatan bakteri dengan cara mengikat protein permukaan bakteri dan menurunkan hidrofobisitas reseptor pada membran sel fagosit (Hamsafir,2010; Septiana et al., 2006). Oleh karena itu patut diduga bahwa, kandungan flavonoid pada kelopak bunga Rosella dapat menurunkan daya adhesi bakteri pada membran neutrofil.

BAHAN DAN METODE Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratoris in vitro. Rancangan penelitian menggunakan post test only control group design yaitu dilakukan pengukuran terhadap variabel yang diteliti setelah diberikan suatu perlakuan, kemudian dibandingkan dengan kelompok kontrol. Variabel bebas pada penelitian ini adalah ekstrak kelopak bunga Rosella (Hibiscus sabdariffa) konsentrasi 50%, dan 100%. Variabel terikat pada penelitian ini ialah indeks adhesi P. gingivalis pada neutrofil. Penelitian dilaksanakan pada bulan Agustus 2011 di Laboratorium Biomedik Bagian Mikrobiologi dan Laboratorium Bio Science Rumah Sakit Gigi dan Mulut Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember. Pembuatan ekstrak dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas MIPA Universitas Jember. Bahanbahan yang diperlukan antara lain : ekstrak kelopak Bunga Rosella, P. gingivalis galur murni ATCC strain 33277 dengan medium kulturnya yaitu medium BHI diperkaya dengan hemin dan vitamin K1, isolat neutrofil yang didapatkan dari darah vena perifer orang sehat yang diisolasi dengan teknik gradient density menggunakan Ficoll Hypaque Centrifugation, aquadest steril, darah vena perifer, heparin, dextran, Ficoll Hypaque 1077, Alkohol, HBSS, dan RPMI. Penelitian diawali dengan pengekstrakan kelopak bunga Rosella. Kelopak kering Rosella yang telah dihaluskan dimaserasi dengan etanol 97% selama 24 jam di dalam shaker bath, kemudian diuapkan dengan rotary evaporator sampai didapatkan ekstrak dengan konsentrasi 100%. Untuk membuat sediaan ekstrak kelopak bunga Rosella konsentrasi 50% dibuat dengan cara mengambil 1 ml

sediaan 100% dicampur dengan 1 ml aquadest steril. Kemudian dilanjutkan dengan kultur P. gingivalis. P. gingivalis dikultur dalam medium BHI yang diperkaya dengan vitamin K1 dan hemin, kemudian dikultur pada atmosfir anaerob (menggunakan anaerobic gas kit) selama 2x24 jam. Konsentrasi Porphyromonas gingivalis dibuat menjadi 3x106 sel/ml. Selanjutnya proses isolasi neutrofil. Darah vena perifer pasien diambil sebanyak 9cc dan langsung dicampur dengan antikoagulan. Darah dibagi menjadi 3 tabung falcon dan dicentrifuge 650 rpm selama 10 menit hingga terbentuk 2 lapisan (sel darah dan serum). Serum diambil dengan pipet mikro dan diencerkan dengan 6 cc HBSS. Darah dialirkan ke tabung falcon lain yang telah berisi 3cc larutan Ficoll, dan dicentrifuge 1350 RPM selama 30 menit hingga terbentuk 4 lapisan. Tiga lapisan teratas dibuang, menyisakan lapisan terbawah yang mengandung neutrofil, kemudian diresuspensi dengan 6 cc HBSS. Neutrofil yang sudah diresuspensi tersebut ditambahkan 1 cc dextran 6% dan didiamkan selama 90 menit. Supranatan diaspirasi dan diresuspensi dengan RPMI sampai dengan 500 l, kemudian dilakukan pembuatan hapusan dan pewarnaan. Uji indeks adhesi dilakukan dengan cara melapiskan isolat neutrofil pada 6 coverslip dalam 6 petridish, masing-masing 50 l dan diinkubasi selama 15 menit, 370C dan 5% CO2. Ekstrak kelopak bunga Rosella diberikan terhadap 4 dari 6 petridish masing-masing 50 l. Dua petridish diberikan ekstrak dengan kosentrasi 50%, serta dua petridish selanjutnya diberikan ekstrak dengan konsentrasi 100%. Dua sisanya diberi 50 l RPMI yang berfungsi sebagai kontrol. Setelah itu, diinkubasi dalam shaker incubator selama 16 jam, 370C dan 5% CO2. Secara perlahan, pada chamber 1-6 masing-masing ditambahkan suspensi P. gingivalis 200l, diinkubasikan selama 3 jam dalam suhu 370C, 5% CO2. Di akhir

pengamatan chamber dicuci dengan HBSS, kemudian difiksasi dan dilakukan pewarnaan Giemsa. Hasil preparat yang sudah dicat dengan pewarnaan Giemsa, diamati dengan mikroskop inverted. Perhitungan dilakukan dengan cara menghitung jumlah bakteri yang menempel per neutrofil sampai jumlah neutrofil keseluruhan , dengan dua kali pengulangan. Setelah itu indeks adhesi bakteri dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut.

Indeks adhesi

Jumlah bakteri yang melekat per neutrofil Jumlah neutrofil yang dihitung

Data hasil penelitian ini diuji secara parametrik dengan One Way Anova untuk mengetahui adanya perbedaan antar kelompok, kemudian dilanjutkan dengan uji LSD untuk mengetahui besarnya perbedaan antar kelompok.

HASIL Hasil penelitian adhesi P. gingivalis pada neutrofil yang diinkubasi oleh ekstrak kelopak bunga Rosella menunjukkan bahwa pada kelompok kontrol (diinkubasi RPMI) adhesi bakteri lebih tinggi daripada kelompok perlakuan 1 (diinkubasi ekstrak Rosella 50%) dan kelompok perlakuan 2 (diinkubasi esktrak Rosella 100%). Sedangkan rata-rata jumlah adhesi P.gingivalis pada neutrofil kelompok perlakuan 2 lebih sedikit daripada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan 1, seperti dilihat pada Tabel 1 dan Gambar 1. Hal ini menunjukkan adanya penurunan indeks adhesi pada kelompok perlakuan dibandingkan dengan kelompok kontrol.
Tabel 1. Rata- rata adhesi P.gingivalis pada neutrofil antara kelompok kontrol dan kelompok perlakuan Adhesi P.gingivalis pada Neutrofil Kelompok kontrol (+ RPMI ) X SD 8,29 1.59 Kelompok perlakuan 1 (+ekstrak Rosella 50%) 5,54 1.00 Kelompok perlakuan 2 (+ekstrak Rosella 100%) 3,40 1.03

Adhesi P. gingivalis pada Neutrofil


*

10
Rata-rata adhesi P. gingivalis

8.29

* *

5.54 5 0 Kelompok Kelompok Kelompok Kontrol Perlakuan Perlakuan 1 2 3.40

Gambar 1.

Diagram batang rata-rata adhesi P. gingivalis pada neutrofil

Keterangan : Kelompok kontrol Kelompok Perlakuan 1 Kelompok Perlakuan 2

: Neutrofil diinkubasi RPMI : Neutrofil diinkubasi ekstrak kelopak Rosella konsentrasi 50% : Neutrofil diinkubasi ekstrak kelopak Rosella konsentrasi 100%

: Terdapat perbedaan yang signifikan

Secara mikroskopis, gambaran adhesi bakteri P.gingivalis terhadap sel neutrofil pada ketiga kelompok perlakuan dapat dilihat pada gambar berikut. Pada kelompok kontrol (Gambar 2) adhesi bakteri P.gingivalis tampak sangat tinggi. Sehingga menyebabkan neutrofil mengalami lisis. Sedangkan pada kelompok perlakuan 1 (Gambar 3) dan kelompok perlakuan 2 (Gambar 4) terjadi penurunan adhesi bakteri pada neutrofil.

Gambar 2.

Neutrofil diinkubasi RPMI (kelompok kontrol) mengadhesi P.gingivalis (tanda panah) dalam jumlah banyak ( > 7 bakteri / sel) sehingga menyebabkan neutrofil lisis (pembesaran 1000x)

Gambar 3. Neutrofil diinkubasi ekstrak Rosella 50% (kelompok perlakuan 1) menunjukkan penurunan adhesi P.gingivalis (tanda panah) dengan jumlah rata- rata 5 bakteri/ sel (pembesaran 1000x)

Gambar 4.

Neutrofil diinkubasi ekstrak Rosella 100% (kelompok perlakuan 2) menunjukkan adhesi P.gingivalis (tanda panah) dalam jumlah sedikit dengan jumlah rata-rata 3 bakteri/ sel (pembesaran 1000x)

Analisa data pada penelitian ini diawali dengan uji normalitas dan dilanjutkan dengan uji homogenitas sebagai syarat sebelum melakukan uji beda One Way ANOVA. Hasil uji normalitas menunjukkan bahwa data hasil penelitian ini memiliki nilai p>0,05, yang menunjukkan bahwa data terdistribusi normal. Uji selanjutnya adalah uji homogenitas dengan menggunakan uji Levene test dengan p>0,05. Berdasarkan uji Levene test diketahui bahwa nilai signifikansinya sebesar 0,076 (p>0,05), hal ini membuktikan bahwa data yang didapat dari penelitian tersebut homogen.

Data diketahui berdistribusi normal dan homogen, maka selanjutnya data diuji secara parametrik menggunakan uji One Way ANOVA. Berdasarkan hasil uji One Way Anova didapatkan bahwa rata-rata adhesi P.gingivalis pada neutrofil kelompok kontrol , perlakuan 1, dan perlakuan 2 adalah berbeda secara signifikan. Selanjutnya untuk mengetahui kelompok mana yang memiliki perbedaan bermakna, dilakukan uji lanjut Post Hoc LSD dengan tingkat kemaknaan 95% (p<0,05). Hasil uji Post Hoc LSD (Tabel 2) antar kelompok perlakuan menunjukkan probabilitas sebesar 0,000 (p<0,05) artinya terdapat perbedaan yang signifikan rerata adhesi P.gingivalis. Hal ini menunjukkan adanya penurunan adhesi P.gingivalis pada neutrofil yang diinkubasi oleh ekstrak kelopak bunga Rosella.
Tabel 2. Ringkasan hasil uji lanjut Post Hoc LSD Kelompok Kontrol Rosella 50% Rosella 100% Kontrol 0.000* 0.000* Rosella 50% 0.000* 0.000* Rosella 100% 0.000* 0.000* -

Keterangan : * = Ada perbedaan yang bermakna (p<0,05)

PEMBAHASAN Analisa data indeks adhesi dilakukan pada 450 sel neutrofil yang terdiri dari kelompok kontrol sebanyak 150 sel, kelompok perlakuan 1 sebanyak 150 sel, dan kelompok perlakuan 2 sebanyak 150 sel. Data indeks adhesi yang terlalu menyimpang ( 25%) dari total 600 sel yang didapatkan, tidak digunakan dalam analisa. Hal ini bertujuan untuk mendapatkan kualitas data yang memadai (quality control). Seleksi data dilakukan berdasarkan modus (frekuensi data yang paling sering muncul). Sebagai contoh, pada kelompok kontrol modus yang didapatkan yaitu antara 7-11 bakteri/ sel, pada kelompok perlakuan 1 antara 4-7 bakteri/ sel, sedangkan pada kelompok perlakuan 2 modus yang didapatkan adalah antara 2-5 bakteri/ sel.

Hasil

penelitian

menunjukkan

adanya

penurunan

indeks

adhesi

P.gingivalis pada neutrofil yang diinkubasi oleh ekstrak kelopak bunga Rosella. Pada kelompok kontrol (neutrofil diinkubasi RPMI) indeks adhesi P.gingivalis terhadap sel neutrofil sangat tinggi. Neutrofil yang memfagosit banyak bakteri akan mengalami lisis dan menyebabkan tumpahnya cairan intrasel ke lingkungan ekstrasel. Pada kelompok perlakuan 1 (neutrofil diinkubasi ekstrak dengan konsentrasi 50%), dan kelompok perlakuan 2 (neutrofil diinkubasi ekstrak dengan konsentrasi 100%) terjadi penurunan indeks adhesi dari P.gingivalis, serta sel neutrofil mayoritas dalam keadaan masih utuh. Indeks adhesi yang paling rendah tampak pada kelompok dengan inkubasi ekstrak konsentrasi 100%. Pada penelitian kali ini perlu ditekankan bahwa, konsentrasi ekstrak kelopak bunga Rosella yang diberikan pada kelompok perlakuan 1 dan kelompok perlakuan 2, yaitu masing-masing 50% dan 100% adalah konsentrasi saat pemberian pertama kali pada plastic plate chamber. Sedangkan konsentrasi final setelah dilakukan penambahan media dan suspensi bakteri P.gingivalis, didapatkan konsentrasi 3,12% untuk kelompok perlakuan 1, dan 6,25% untuk kelompok perlakuan 2. Mekanisme ekstrak kelopak bunga Rosella dalam menurunkan indeks adhesi P.gingivalis pada neutrofil diduga melalui peran flavonoid yang terkandung di didalamnya. Kandungan penting yang terdapat pada kelopak bunga Rosella adalah pigmen antosianin yang membentuk flavonoid yang berperan sebagai antioksidan. Pigmen antosianin ini membentuk warna ungu kemerahan di kelopak bunga Rosella. Semakin pekat warna kemerahan pada bunga Rosella, maka semakin tinggi pula kandungan antosianin di dalamnya (Usman,2010). Kelopak bunga Rosella yang dikeringkan lalu diencerkan dalam 300 ml air, maka akan terkandung dalam larutan itu 51% antosianin (Muardi,2009). Kandungan flavonoid yang tinggi inilah yang diduga mampu menghambat perlekatan bakteri (Hamsafir, 2010). Hal tersebut telah dapat dibuktikan melalui penelitian ini. Pada sel neutrofil yang diberikan ekstrak kelopak bunga Rosella konsentrasi 50% dan 100% dan kemudian dipapar dengan P. gingivalis menunjukkan adanya penurunan adhesi, hal ini dikarenakan flavonoid memberikan perlindungan pada membran sel neutrofil dengan cara menyelimuti seluruh permukaan pada

10

membran sel neutrofil kemudian menurunkan hidrofobisitas membran sel neutrofil sehingga adhesi bakteri P. gingivalis pada sel neutrofil menurun dibandingkan pada neutrofil yang tidak diinkubasi oleh ekstrak kelopak bunga Rosella. Flavonoid juga memiliki aktivitas biologis maupun farmakologis, antara lain bersifat antibakteri, antiinflamasi, antialergi, antikarsinogen, antioksidan, dan melindungi pembuluh darah (Sabir, 2003). Flavonoid bersifat antibakteri karena mampu berinteraksi dengan DNA bakteri. Hasil interaksi ini menyebabkan perubahan permeabilitas dinding sel bakteri, mikrosom, dan lisosom (Bryan dan Wilson dalam Sabir, 2003). Kandungan flavonoid dalam kelopak bunga Rosella memiliki banyak manfaat lain dalam bidang kedokteran gigi antara lain sebagai berikut. 1) Bidang periodontologi, yaitu pada pengobatan periodontitis. Flavonoid berperan dalam memperkuat dinding pembuluh darah kapiler sehingga perdarahan yang timbul dapat terhenti, selain itu flavonoid juga berperan menekan sintesis prostaglandin dan menstimulasi hidroksiprolin sehingga jaringan gingiva kembali normal. 2) Bidang bedah mulut, flavonoid berperan dalam proses penyembuhan luka pasca pencabutan gigi dengan cara meningkatkan atau mempercepat proliferasi sel fibroblas dan produksi serabut kolagen. Selain itu aplikasi flavonoid juga dapat mengurangi rasa sakit yang timbul pasca ekstraksi. 3) Bidang konservasi gigi, flavonoid berperan dalam regenerasi pulpa gigi melalui kemampuannya menginduksi terbentuknya jembatan dentin pada perawatan direct pulp capping (Sabir, 2003). Penggunaan bahan yang memiliki efek antiinflamasi dan antibakteri sekaligus dalam satu formulasi efektif dalam mempercepat proses penyembuhan luka. Sifat antiinflamasi dapat meringankan proses fagositosis dan bahan yang memiliki sifat anti bakteri dapat menekan pertumbuhan bakteri patogen sehingga dapat meminimalisir infeksi sekunder yang menghambat penyembuhan luka (Robbins & Kumar, 1995). Rosella dimasyarakat telah banyak dimanfaatkan sebagai obat tradisional. Dengan adanya penelitian ini diharapkan dapat dikembangkan pengolahan Rosella

11

sebagai obat topical yang sekaligus berperan sebagai antibiotik untuk penderita periodontitis. Dengan demikian diharapkan bakteri P. gingivalis bisa dibunuh dengan mekanisme bakterisidal, namun kerusakan jaringan yang terjadi akibat proses inflamasi bisa lebih terkendali, melalui pengendalian aktifitas neutrofil.

KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, maka dapat ditarik kesimpulan bahwa pemberian ekstrak kelopak bunga Rosella dapat menurunkan indeks adhesi Porphyromonas gingivalis pada neutrofil.

SARAN Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang efek pemberian ekstrak kelopak bunga Rosella terhadap adhesi mikroflora lain yang bersifat patogen di rongga mulut pada sel neutrofil, serta perlu adanya penelitian mengenai aplikasi ekstrak kelopak bunga Rosella sebagai obat topikal pada penderita penyakit periodontal. Selain itu diperlukan pula perbaikan pada penelitian lebih lanjut tentang konsentrasi suspensi P.gingivalis dan konsentrasi ekstrak Rosella yang terlalu tinggi.

UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr.drg. IDA Susilawati, M.Kes melalui proyek RISBIN IPTEKDOK serta drg. Desi Sandra Sari, MD.Sc selaku Dosen Pembimbing Anggota, atas bimbingan dan fasilitas yang diberikan selama penelitian.

DAFTAR PUSTAKA Bellanti, JA.1993. Imunologi III. Terjemahan oleh A. Samik Wahab. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Hal:18-39 BSN Medical. Tanpa Tahun. Cutimed Sorbact. [online]. http://www.cutimedsorbact.com/Indonesia/faq.htm [ 18 Mei 2011] Grossman IL, Oliet S, Rio CED. 1995. Ilmu Endodontik dalam Praktik. Ed.11. Jakarta : EGC.Hal: 128

12

Hamsafir, E. 2010. Teh Dapat Menghambat Pembentukan Karies Gigi. [serial online].http://www.infogigi.com/kesehatan-gigi/teh-dapat-menghambatpembentukan-karies-gigi.html. [1 Juni 2011] McGaw, T. 2002. Periodontal Disease and Preterm Delivery of Low Birth Weight Infants. J Can Dent Assoc. Vol. 68(3) : 165-9 MicrobeWiki. 2008. [Online] Porphyromonas.http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Porphyromonas. [ 27 April 2011 ] Muardi, D. 2009. Rosella, Cantik Penuh Manfaat. [serial http://www.ummi-online.com/artikel-19-rosella-cantik-penuhmanfaat.html. [11 Januari 2012] online].

Robbins, S.L., dan Kumar, V. 1995. Buku ajar patologi I (4th ed.) (Staf pengajar laboratorium patologi anatomik FK UI, penerjemah). Jakarta: EGC Sabir,A. 2003. Pemanfaatan flavonoid di Bidang Kedokteran Gigi. Maj.KG Dental Journal Edisi Khusus Temu Ilmiah Nasional III. Surabaya : Airlangga University Pers. Vol.38:135-141 Septiana, Dwiyanti, Muchtadi, Zakaria. 2006. Penghambatan Oksidasi LDL dan Akumulasi Kolesterol Pada Makrofag oleh Ekstrak Temulawak (Curcuma xanthorriza Roxb). Jurnal Teknologi dan Industri Pangan. Vol.XVII (3) : 221-226 Susanti, R., dan Rahayuningsih, M. 2003. Aktivitas Fagositosis Neutrofil Terhadap Staphylococcus aureus Isolat Sapi di Jawa Tengah dengan Teknik Acridine Orange Fluorescence. Berkas Penelitian Hayati Usman, D. 2010. Karakteristik Dan Aktivitas Antioksidan Bunga Rosella Kering (Hibiscus sabdariffa L.). Tidak Diterbitkan. Skripsi. Surabaya: Fakultas Teknologi Industri Universitas Pembangunan Nasional Veteran Jawa Timur.

You might also like