You are on page 1of 29

METABOLISME NITROGEN PENDAHULUAN Nitrogen merupakan bagian dari sejumlah besar senyawa-senyawa penting yang ditemukan pada sel-sel

makhluk hidup. Misalnya pada asam amino, protein (enzim), dan asam nukleat (DNA dan RNA), contoh lainnya seperti poliamina, dan klorofil mempunyai peranan penting bagi beberapa organisme. Kebanyakan hewan umumnya tidak memiliki kemampuan untuk mengasimilasi nitrogen organik ataupun mensintesa separuh dari senyawa asam amino yang terdapat dalam protein, kecuali dengan dibantu bakteri-bakteri tertentu (misalnya bakteri rumen pada hewan-hewan ruminansia seperti sapi, domba, dan lain-lain). Walaupun nitrogen tersedia di udara bebas, hanya bakteri-bakteri tertentu (lihat Chapter 6.) yang mempunyai kemampuan untuk memfiksasi nitrogen dan mensintesa ammonia dalam hubungan simbiotik seperti pada bintil akar tanaman legume, ini merupakan proses yang sangat penting. Namun pada mayoritas tumbuh-tumbuhan, nitrat merupakan bahan dasar untuk pembentukan nitrogen dan diambil dari tanah melalui akar. Ammonia terdapat di tanah dalam bentuk NH4+ pada tanah-tanah anaerobik yang ber-pH rendah dan dapat langsung diserap oleh tanaman, misalnya tanaman conifera dan padi. Setelah diambil oleh akar, nitrogen kemudian ditransportasikan menuju bagian-bagian tanaman yang sedang bertumbuh. Pada akhirnya, nitrogen akan disimpan di dalam benih, dan pada beberapa tanaman budidaya yang penting seperti biji-bijian dan legume, hal inilah yang menjadi nilai penting dalam segi ekonomisnya. Gambar 7.1 memperliharkan jalur utama metabolisme nitrogen dalam tanaman secara sederhana. Bab ini akan membahas lebih lanjut mengenai proses metabolisme nitrogen. Selama 5 tahun terakhir, telah terjadi perkembangan besar terhadap pemahaman mengenai tata cara penyandian gen untuk sejumlah enzim yang terlibat dalam metabolisme nitrogen. Penelitian-penelitian l;ebih banyak dikonsentrasikan pada enzim-enzim awal asimilasi nitrat dan amonia. Namun demikian, sekarang, meskipun jalur sintesanya masih belumbenar-benar dipahami, tetapi penelitian terhadap sintasa lisin, prolin, dan histidin telah sampai pada level gen.

PENYERAPAN NITRAT Penelitian mengenai penyerapan nitrat terhambat oleh keterbatasan pengusutan radioaktif yang sesuai. Berbagai percobaan telah dilaksanakan dengan menggunakan 30ClO3-, dan percobaan-percobaan terbaru yang menggunakan isotop berumur pendek 13NO3- telah berhasil dilakukan. Datanya mungkin akan rumit, terutama karena adanya sistem efflux yang mengeluarkan nitrat dari akar. Pada tanaman barley yang dibudidayakan pada lingkungan bernitrat, influx 13NO3memperlihatkan sifat kenetik tipikal Michaelis-Menten (Gambar 7.2) dan telah membatasi afinitas tinggi sistem transportasi (HATS)2. namun bagaimanapun juga, jumlah penyerapan tergantung pada lamanya perlakuan nitrat sebelumnya, dengan anggapan bahwa ada dua bentuk HATS, salah satunya adalah bentuk konstitutif, dan yang satunya lagi disebabkan oleh nitrat. Pada tanaman yang sebelumnya tidak pernah terekspos nitrat, jumlah penyerapan rendah pada tingkat konsentrasi nitrat yang rendah, tapi pada konsentrai 0.2 mM jumlah penyerapan mengalami peningkatan secara linear (Gambar 7.3). proses inilah yang kemudian menentukan sistem transportasi afinitas rendah (Low Affinity Transport System = LATS) dan mengekspresikannya secara konstitutif. Famili yang memiliki gen HATS, protein penstransport nitrat hidropobik dengan 12 bidang transmembran, sekarang telah berhasil di isolasi dari barley. Penyerapan dengan kedua sistem tersebut terjadi berlawanan dengan gradien elektrokimiawi dan diduga berpasangan dengan proton bergerak menyeberangi membran plasma. Konsentrasi nitrat sitoplasmik relatif konstan karena nitrat dapat disimpan di dalam vakuola. REDUKSI NITRAT Nitrat direduksi menjadi amonia dengan proses dua langkah yang dikatalisa oleh enzim nitrat reduktase: NO3- + 2H+ + 2e- NO2- + H2O Dan nitrit reduktase: NO2- + 8H+ + 6e- NH4+ + 2H2O Energi untuk mereduksi nitrat disuplai oleh NADH, sedangkan untuk transfer 6 elektron pada reduksi nitrit diperlukan ferredoksin. Reduksi nitrat bisa berlangsung di akar maupun di pucuk, tergantung spesies tanaman, usia

perkembangan tanaman, ataupun ketersediaan nitrat, secara umum, seiring dengan peningkatan konsentrasi nitrat di luar sel, maka akan terjadi pula peningkatan proporsi transportasi nitrat ke dalam akar, sehingga meningkat pula tingkat reduksi. Enzim nitrit reduktase hanya terdapat pada kloroplas atau plastida. Meskipun pada beberapa penelitian, lokasi nitrat reduktase dalam kloroplas tidak berhasil dikonfirmasikan. Enzim ini terletak di sitoplasma, tetapi ada kemungkinan tidak terlalu dekat dengan membran kloroplas selama reduksi nitrat. Sistem semacam ini memungkinkan transportasi nitrat secara cepat ke dalam kloroplas dan mencegah potensi timbulnya metabolit toksik. NITRAT REDUKTASE Struktur Nitrat reduktase (NR) yang tergantung pada NADH terdiri dari dua subunit identik sekitar 100kDa, yang mengandung molybdate, Mo-pterin, haem dan FAD. Ada dua sisi aktif, salah satunya adalah sisi aktif dimana NADH memberikan 1 elektron ke FAD untuk memulai transportasi elektron melalui haem-FE menuju Mo, sementara di sisi aktif yang kedua, Mo-pterin, merupakan tempat dimana nitrat direduksi menjadi nitrit. Terdapat tiga bagian yang jelas pada protein enzim yang berhubungan dengan bidang pada protein homolog: (i) bidang pengikatan kofaktor Mo-pterin pada enzim sulfit oksidase mamalia, (ii) protein haem-Fe pada mamalian dan tanaman Cyt b5 dan (ii) Cyt b5 reduktase pada mamalia, FAD yang mengandung enzim. Diantara tempat atau bidang-bidang ini terdapat ikatan 2 lengan dari sekitar 30 asam amino. Genetika dan Biologi Molekular Seiring berbagai penelitian terhadap bakteri dan jamur, telah dipelajari pula mutasi yang terjadi pada penurunan aktivitas enzim NR pada tumbuhan tingkat tinggi. Satu gen struktural (narl) pada barley telah berhasil diidentifikasi. Pada mutant yang mengalami defisiensi NR yang tergantung NADH (NADH-dependent) memperlihatkan kehadiran enzim bispesifik kedua yang tergantung pada NAD(P)H. Pada tanaman lain, ditemukan bukti-bukti bahwa ada setidaknya dua gen yang menyandikan NR NADH-dependent.

Sebagai tambahan pada struktur gen mutan, aktifitas NR juga mengalami penurunan sebagai akibat dari mutasi gen yang mengendalikan kofaktor Mo-pterin. Mutasi ini telah berhasil diidentifikasi karena juga berpengaruh terhadap penurunan aktifitas enzim xanthine dehidrogenase. Analisis detail sel mutan pada tembakau dan barley mengindikasikan bahwa paling tidak ada enam yang terlibat dalam sintesa dan fungsi kofaktor molibdenum. Meskipun mutasi gen yang melibatkan pengaturan asimilasi nitrat pada jamur telah berhasil diidentifikasi, namun eksistensi dari gen pengatur semacam pada tumbuhan tingkat tinggi ini masih belum dikonfirmasikan. Sekarang ini NR telah berhasil diisolasi dari tumbuhan tingkat tinggi dan jamur. Perbandingan rantai lengkap DNAc Arabidopsis thaliana dengan rantai protein lain telah berhasil mengonfirmasikan bahwa NR mempunyai tiga bidang fungsional seperti yang sudah dijelaskan sebelumnya. Aktivitas Aktivitas NR pada berbagai varietas tanaman telah dipelajari. Seperti yang sudah diduga, ada spesies yang berbeda, namun ada pola umum yang sangat jelas yang berhasil didapat. Saat tanaman diekspos nitrat, ada peningkatan aktivitas ektrak-able (yang dapat diekstrak) NR dan protein yang dramatis baik pada akar maupun pada tajuk. Pada kenyataannya, NR merupakan enzim pertama yang menjadi bukti jelas adanya sintesa de novo pada tumbuhan tingkat tinggi. Responnya lebih tergantung pada peningkatan flux ke wilayah metabolisme nitrat daripada jumlah penyimpanan nitrat di vakuola. Namun demikian, beberapa literatur mengungkapkan adanya kebingungan yang muncul akibat kerumitan terhadap tipe-tipe pengujian yang dilakukan dan sifat instabilitas protein, yang juga berkaitan langsung dengan kehadiran enzim proteasi aktif dan inhibitor. Situasi ini telah dapat diperjelas dengan adanya pengujian DNAc, yang memungkinkan pendeteksian NR pada RNAm, dan sifat gen yang menyandikan NR terlihat berkaitan sangat erat dengan kehadiran nitrat sebagai faktor kunci. Peningkatan RNAm NR yang cepat dipacu oleh nitrat yang mengacu pada adanya peningkatan transnkripsi dan elemen els telah dipelajari dengan mendalam. Faktor lain, termasuk cahaya dan karbohidrat meningkatkan sifat-sifat NR, sementara

menurunan bentuk nitrogen pada glutamin, khususnya, akan menurunkan aktifitas NR. Untuk mencegah sintesa nitrit toksik, khususnya dalam keadaan tidakadanya cahaya, NR pada daun akan dinonaktifkan. Residu serin spesifik pada posisi 543 difosforilasi dengan mekanisme yang melibatkan CA2+ dan protein penghambat nitrat reduktase (NIP) yang dapat mengikat dan menghambat enzim. eukariotik. NIP merupakan anggota protein 14-3-3 yang berhasil diisolasi dari organisme Protein-protein ini (yang memiliki banya isoform) kemungkinan memiliki banyak fungsi, khususnya yang berhubungan dengan fosforilasi (dalam interaksinya dengan protein kinase) dan dalam sinyal jalur transduksi. Struktur protein 14-3-3 berbentuk seperti kepingan yang berimpitan, yang mengikat protein target bersama-sama. Pada kondisi adanya cahaya, protein akan di-defosforilasi, NIP berdisosiasi dan nitrat reduktase diaktifkan kembali. NITRIT REDUKTASE Nitrit reduktase yang tergantung pada ferredoksin (NiR) meliputi satu subunit dengan massa molekul 60-64kDa. Polipeptidanya mengandung kelompok prostetik sirohaem dan kluster (4Fe-45) pada sisi aktifnya. Genetika dan Biologi Molekular Berlawanan banyaknya mutasi tanaman yang menghambat aktivitas enzim NR, mutasi yang menghambat aktivitas enzim NiR sangat sulit diisolasi. Hal ini kemungkinan berhubungan dengan sifat toksik alami nitrat, yang kemungkinan memiliki efek merusak yang sangat serius terhadap metabolisme. Beberapa laporan terbaru menyebutkan bahwa tidak bisa dipungkiri adanya mutasi yang menghambat NiR pada barley. Tanaman harus dikembangkan dengan sumber nitrogen dari amonia dalam konsentrasi rendah atau glutamin. Klon DNAc NiR mulai dari bayam hingga jagung telah berhasil dikarakterisasi. Gennya diuraikan menjadi 32 rantai utama asam amino, dimanan kemungkinan transit peptida lah yang memfasilitasi masuknya ke dalam kloroplas. Diperkirakan ada kesamaan (86%) antara rantai asam amino pada enzim jagung dan bayam, namun kesamaan ini tidak banyak (66%) terlihat pada DNAc.

Aktivitas Aktivitas NiR juga dipengaruhi oleh nitrat dan cahaya, namun efeknya tidak sekuat pada NR. Peningkatan aktivitas NiR kelihatannya berkaitan dengan sintesa protein de novo, namun aktivitas enzim dan protein tetap ada bahkan pada kondisi tidakadanya nitrat. Trankripsi RNAm NiR secara cepat dipicu oleh peningkatan nitrat hingga nilai puncak dalam 5 jam dan kemudian menurun ke level yang lebih rendah. Karbohidrat tidak mempengaruhi transkripsi gen NiR, asam amino Penelitianglutamat, glutamin dan aspargin mempunyai efek penghambat.

penelitian terbaru terhadap tanaman tembakau transgenik dengan aktivitas NiR yang berlebihan yang diduga bahwa sintesa protein NiR kemungkinan diperlambat oleh ion amonium pada level post-transkripsi. ASIMILASI AMONIA Pada pembahasan sebelumnya telah kita lihat bahwa asimilasi nitrat akan menghasilkan amonia. Secara umum, diduga amonia terikat dengan bentuk organiknya oleh aminasi reduktif 2-oksoglutarat yang dikatalisis oleh glutamat dehidrogenase (GDH). Saat ini dianggap bahwa fungsi enzim yang terletak di mitokondria dalam penghancuran glutamat, menghasilkan 2-oksiglutarat untuk metabolisme dalam siklus asam trikarboksilat, pada saat ketersediaan karbohidrat rendah, yang umumnya diikuti oleh senescence. Tujuh isoenzim GDH seringkali ditemui pada jaringan tanaman dan isolasi mutan pada jagung dan Arabidopsis thaliana mengesankan adanya 2 gen, salah satunya telah berhasil diklon. Banyak bukti-bukti organ tanaman yang memperlihatkan bahwa glutamin sintetase berpasangan dengan glutamat sintase (terbatas pada siklus glutamat sintase) merupakan bahan dasar sintesa amonia menjadi asam amino pada tumbuhan tingkat tinggi. GLUTAMIN SINTETASE Glutamin sintetase (GS) mengkatalisis konversi glutamat ATP-dependent (tergantung ATP) menjadi glutamin (Gambar 7.7) enzim ini mempunyai afinitas

yang sangat tinggi pada amonia (Km = 3 5 M) dan terdapat pada semua jaringan tanaman. Struktur GS pada tanaman tingkat tinggi merupakan protein oktamerat dengan massa molekul dasar 350 400 kDa. Pada ukuran dan struktur quaternary sangat mirip dengan enzim yang diisolasi dari mamalia, namun jelas berbeda dari enzim bakteri, yang mempunyai 12 subunit. GS dengan aktivitas yang sangat kuat telah berhasil diisolasi dari nodul akar yang mampu memfiksasi nitrogen. Pada kacang panjang (Phaseolus vulgaris), nodul GS dapat dipisahkan menjadi isoenzim GSn1 dan GSn2. GSn2 ini sangat mirip dengan enzim akar tanpa nodul. Analisis subunit GS individual memperlihatkan adanya 3 bentuk isoelektrik yang berbeda pada nodul (ditandai dengan , , dan ) dengan massa molekul 43 kDa. GSn1 terbentuk oleh subunit dan , sementara GSn2 terutama terdiri dari subunit . Pada daun, telah berhasil diisolasi dua isoenzim utama yang berada di sitoplasma (GS1) dan kloroplas (GS2). Proporsi bentuk kedua isoenzim ini bervariasi sesuai dengan tanaman tempatnya ditemukan, dan tegantung usia perkembangan jaringan. Pembentukan GS di sitoplasma terjadi di sistem vaskular dan kemungkinan berkaitan dengan sintesa glutamin untuk transportasi. Bentuk kloroplastik yang mempunyai satu subunit yang lebih besar dengan massa molekul 43 45 kDa ditandai dengan . Polipeptidanya disintesa di ribosom sitoplasma dan ditransport ke dalam kloroplas dengan pemindahan peptida 4 5 kDa. Aktivitas dan Biologi Molekular Tidak bisa dipungkiri bahwa pada P. vulgaris CG dikodekan oleh sekelompok kecil gen. Model sederhana mekanisme sintesa genetik GS pada P.vulgaris dapat dilihat pada gambar 7.8. Peranan dari gen ke-5 gln- masih belum diketahui dengan pasti. Relatif ada kesamaan asam amino (74%) antara rantai kloroplas dan sitoplasma, kemungkinan dissebabkan kedua gen ini berasal dari duplikasi gen inti yang ada sebelumnya, dan kemudian dimodifikasi. Karena rantai GS2 cDNAs dikotil lebih berkaitan erat dengan GS2 barley daripada rantai dikotil

GS1, kelihatannya duplikasi dan perbedaan gen GS leluhur akan mempengaruhi perbedaan antara monokotil dan dikotil. Aktiviotas GS sitoplastik di daun dipengaruhi oleh cahaya, kemungkinan melalui fitokrom dan reseptor cahaya biru. Pada daun gandum aktifitas enzim meningkat seiring dengan menuanya daun, dan ada korelasi yang jelas dengan kapasitas fotosintesis dan fotorespirasi. Pada kacang polong, RNAm GS2 kloroplas meningkat sekitar 20 kali lipat selama 72 jam selama illuminasi etiolasi pucuk. Transkripsi RNAm GS1 sitoplasma meningkat selama berlangsungnya senescence dan cekaman kekeringan. Aktivitas GS tumbuhan memperlihatkan adanya peningkatan beberapa kali lipat selama proses nodulasi pada banyak spesies kacang-kacangan (legume) (Lihat Chapter 6.). Peningkatan ini kelihatannya terjadi hampir bersamaan dengan Peningkatan GS RNAm selama munculnya aktivitas nitrogenase dalam bakteri Rhizobium dan leghaemoglobin diproduksi dalam sitosol pada sel tanaman. (Gambar 7.9). Pada bagian ini, perhatian difokuskan pada organisasi gen kacang panjang, namun namun harus ditekankan bahwa ada banyak penelitian yang juga telah dilakukan mengenai gen-gen sejenis pada tumbuhan lainnya seperti jagungjagungan, kacang polong, kedelai, alfalfa dan barley. Pola yang konsisten adalah bahwa GS sitoplasmik disandikan oleh sekelompok gen (di atas 6) tetapi GS kloroplas hanya disandikan oleh satu gen. GLUTAMAT SINTASE Enzim ini bertanggung jawab untuk transfer kelompok amida glutamin menjadi 2-oksoglutarat untuk menghasilkan dua molekul glutaman (gambar 7.20). pada tumbuhan tingkat tinggi terdapat dua bentuk glutamat sintase: bentuk yang pertama memanfaatkan penurunan feredoksin (Ferredoksi-dependent) sebagai sumber reduktan dan bentuk yang kedua menggunakan NADH (NADH-dependent). Kedua bentuk ini memperlihatkan perbedaan immunologis yang sangat jelas. Struktur nodulasi kacang panjang dapat dihitung melalui induksi gen gln- yang kuat

Glutamat sintase ferredoksin sintase yang terdapat dalam konsentrasi tinggi di daun, terletak tersendiri di kloroplas. Enzim ini sendiri merupakan flavoprotein besi-belerang dengan polipeptida tunggal dengan massa molekul 140-165 kDa. Glutamat sintase NADH- dependent terdapat dalam konsentrasi rendah di daun, namun peningkatan aktivitas yang tinggi ditemui pada berkas vaskular pada daun yang belum/tidak berkembang, karena inilah, bersama dengan GS1 sitoplasma, enzim ini diduga memainkan peranan utama dalam sintesa asam amino yang diperlukan untuk transport nitrogen. Glutamat sintase NADH terdapat dalam konsentrasi tinggi pada fiksasi nitrogen nodul akar legum (lihat Bab 6) dan berwujud monomer dengan massa molekul sekitar 200 kDa, yang kemungkinan salah satu massa molekul subunit enzim terbesar yang pernah diketahui. Aktivitas dan Biologi Molekular Isolasi klon rantai DNAc glutamat sintase ferredoksin-dependent yang pertama kali dilaporkan adalah dari jagung. Rantai asam amino memperlihatkan kesamaan (42%) dengan rantai enzim NADH-dependent asam amino untuk dipindahkan ke dalam kloroplas. pada E.coli dan mengandung sisi pengikat FMN yang potensial. Diperlukan Transit peptida 97 Klon rantai DNAc yang menyandikan enzim ini juga berhasil diisolasi dari tembakau, barley, dan Arabidopsis thaliana, dimana berhasil ditemukan dua kopi gen. Terdapat banyak kesamaan (lebih dari 80%) rantai asam amino pada enzim tanaman. RNAm yang menyandikan enzim meningkat secara dramatis pada semua tanaman yang diteliti seiring dengan illuminasi etiolasi daun, hal ini sesuai dengan hasil penelitianpenelitian sebelimnya. Gen yang menyandikan enzim NADH-dependent telah berhasil diisolasi dari nodul alfalfa. Beberapa bagian penting rantai DNA menunjukkan ciri-ciri yang signifikan. Peningkatan RNAm pada nodul yang sedang berkembang bertepatan dengan kemunculan nodul dari akar. Peningkatan dramatis aktifitas enzim glutamat sinbtase NADH-dependent, protein dan RNAm yang kedua terjadi seiring dengan fiksasi nitrogen. AMINOTRANSFERASE

Aminotransferase (dikenal juga dengan transaminase) mengkatalis transefer sekelompok amino dari posisi 2- pada statu asam amino ke 2-okso untuk menghasilkan asam amino baru dan asam okso baru. memerlukan adanya ikatan piridoksal yang Reaksi dapat balik ini Glutamat kuat koenzim 5-fosfat.

merupakan donor amino utama, dan ikut ambil bagian dalam dua reaksi penting (Gambar 7.11). Kedua reaksi tersebut yaitu reaksi pembebasan 2-okso glutarat, yang dapat kembali ke siklus GS. Aminotransferase ditemukan pada semua tumbuhan dan banyak bagian submolekular, dimana mereka terlibat dalam sinteesa asam amino, foto respirasi, fotosintesa C4, sintesa metabolit sekunder, pengikatan hidrogen dan karbon, transport dan peningkatan stabilitas relatif asam amino. Aminotransferase mempunyai kapasitas untuk mensintesa semua asam amino protein (kecuali prolin) apabila prekursor asam okso cukup tersedia. Sehingga nitrogen dapat segera didistribusikan dari glutamat, melalui aspartat dan alanin, menjadi segala jenis asam amino. Reaksi dapat balik memungkinkan terjadinya perubahan tiba-tiba dalam kebutuhannya akan asam amino utama, meskipun dalam jalur yang spesifik, misalnya pada fotorespirasi (Bab 2), enzim tertentu hanya berreaksi satu arah. jangkauan yang luas. Bab ini tidak cukup untuk menjabarkan semua aminotransferase, tetapi akan dijelaskan beberapa diantaranya, seperti aspartat aminotransferase (AspAT). Banyak bentuk isoenzim telah berhasil dideteksi pada tumbuhan tingkat tinggi, dan ada bukti-bukti bahwa sitoplasma, mitokondria, kloroplas dan peroksisom masingmasing mengandung isoenzimnya sendiri. Massa molekul AspAt bervariasi antara 95 hingga 110 kDa dan mengandung 2 subunit, DNAc dan klon gen yang menyandikan enzim telah berhasil diisolasi dari daun C4, nodul akar legum dan benih legum. Pada A.thaliana ditemukan 5 klon DNAc yang berbeda. Dua klon dinamakan ASP2 dan ASP4, menyandikan isoenzim sitoplasma, namun hanya ASP2 yang bekerja pada tingkatan tinggi. Isoenzim mitokondria sepertinya Mutasi yang menghambat disandikan oleh ASP1 danisoenzim kloroplas oleh ASP5, sedangkan ASP3 berkaitan dengan plastida atau bentuk peroksimal. isoenzim kloroplas dan sitosol juga sudah berhasil diisolasi. Model 3 dimensi yang Ada bukti yang meyakinkan bahwa aminotransferase menjanjikan dan menggunakan substrat asam amino dan asam okso dalam

dibuat dengan komputer mengindikasikan bahwa transit peptida dapat memblok dimerisasi dua subunit, sampai mereka sudah menyeberangi membran kloroplas, menahan enzim tetap non aktif sampai mencapai tujuan. TRANSPORTASI DAN PENYIMPANAN NITROGEN Ada saat dimana tanaman perlu mentransportasikan nitrogen dari satu organ ke organ lainnya, misalnya: 1. 2. 3. Fiksasi nitrogen nodul akar ke daun dan buah Dari daun tua ke daun muda dan buah Dari kotiledon dan endoperm benih yang berkecambah ke pucuk dan ujung akar yang sedang berkembang. Pada masa-masa ini ketersediaan karbon biasanya terbatas dan nitrogen ditransportasikan baik melalui xylem m,aupun floem sebagai senyawa dengan rasio N:C yang tinggi. Aspargin hampir secara universal digunakan tumbuhan tingkat itnggi sebagai senyawa penyimpanan dan transportasi, meskipun beberapa tanaman juga menggunakan glutamin dan arginin. Rasio N:C asparganian adalah 2 : 4, dan glutamin 1: 5. Metabolisme Aspargin Nitrogen amida aspargin diambil langsung dari kelompok amida glutamin, disintesa enzim asparginin sintetase (AS;Gambar 7.12). jadi amonia dapat dimasukkan kedalam kelompok amida asparginin melalui dua reaksi ATP-driven (dikendalikan ATP) molekul glutamat dapat didaur ulang untuk dapat mengkatalisa amonia oleh GS. Kotiledon kecambah dan nodul akar legum terbukti merupakan sumber utama AS. Enzim yang memerlukan Cl- untuk aktivitasnya dan dihambat oleh CA2+. Upaya untuk memurnikan atau menguji enzim di daun terbukti tidak berhasil sebagai akibat adanya penghambat. Gen enzim tanaman telah berhasil dikloning dengan menggunakan DNA enzim manusia. Dua klon DNAc (AS1 dan AS2) yang mengandung protein Analisis Northern blot homolog dan jelas telah diisolasi dari kacang polong.

menunjukkan bahwa perlakuan gelam memicu akumulasi RNAm AS1 tingkat

tinggi di daun kacang polong, sementara perlakuan terang menahan efek ini hingga 30 kali lipat. AS1 dan AS2 berakumulasi di kotiledon benih yang sedang berkecambah dan di nodul akar yang sedang menfiksasi nitrogen. Pada A.thaliana, tiga gen yang menyandikan AS telah berhasil diisolasi dan aktivitas ASNI dalam sel-sel floem juga mengalami hambatan oleh cahaya. Suplai sukrosa eksogen menyebabkan penehanan pada gen tumbuhan gelap, tapi hal ini dapat dicegah dengan penambahan glutamat, glutamin dan asparginin. Pada rasio N:C yang tinggi sintesa AS dan Asparginin meningkat, tetapi bila rasionya rendah sintesa AS akan terhenti. Rute paling sederhana katabolisme aspargin adalah melalui enzim asparginase, yang mengkatalisa hidrolisis menghasilkan aspartat dan amonia (Gambar 7.13). Enzim ini terdapat pada daun muda yang sedang berkembang dan memainkan peranan penting dalam perkembangan pematangan benih legum. Amonia dilepaskan dengan reasimilasi melalui GS dan glutaman sintase. Pada pematangan benih legum, enzim bisa bergantung atau tidak bergantung pada potasium. Massa molekular enzim ini berkisar antara 58 dan 75 kDa dan mengandung dua subunit. Dari benih lupin telah behasil diisolasi rantai subunit klon DNAc yang berukuran 32,8 kDa. Gen ini dapat ditemukan pada benih polong dan testa lupin, selama periode keperluan transport aspargin maksimum. Data berlabel 15N memperlihatkan bahwa aspargin juga memetabolisasi dedaunan hijau selama fotorespirasi dan terlibat dalam sintesa glisin. Enzim yang bertanggung jawab adalah serin: glioksilat aminotranferase, yang spesifikasi yang luas dan mampu menggunakan aspargin sebagai substrat. Produk dari aspargin transaminasi adalah 2-oksosuksinamat, yang bisa didiaminasi secara langsung atau menjadi 2-hidroksisuksinamat. Ureides Ada tiga senyawa utama berdasarkan struktur urea pada tanaman, yaitu allantoin, asam allantoat dan sitrilin (Gambar 7.14) Allantoin dan asam allantoat merupakan 50-90% nitrogen organik pada banyak legum tropis(kedelai, kacang tunggak, dan kacang Phaseolus). Tidak ada bukti yang menyakinkan bahwa ureides disintesa sebagai produknitrogen terfiksasi

pada nodul akar legum tropis. Jalur sintesa ureida pada nodul akar legum panjang dan kompleks, dan tidak akan cukup dibahas dalam bab ini. Allantoin dan asam allantoat dihasilkan dari purin inosin monofosfat, yang disintesa dari ribosa 5-fosfat dan memerlukan nitrogen dari glutamin, aspartat dan glisin. Artikel Schubert dan Boland (1990) membahas tuntas mengenai jalur ini. Yang sangat penting adalah bahwa pada saat alantoin dan asam alantonat mencapai benih atau pucuk yang sedang berkembang, mereka akan dimetabolisme menjadi sumber nitrogen yang sangat penting. Secara umum dianggap bahwa seiring hidrolisis alantoin menjadi asam allantat oleh alantoinase, ureida dipotong untuk menghasilkan dua molekul urea dan glioksilat. Namun, peranan urea dan metabolisme subsequennya oleh urease menjadi karbon dioksida dan amonia telah dipertanyakan dan jalur kedua telah berhasil ditemukan. Pada jalur ini, empat atom nitrogen asam alantoat dilepaskan secara langsung sebagai amonia, tanpa perantara urea (Gambar 7.15) PERANAN AMONIA DALAM METABOLISME TUMBUHAN Yang menarik adalah bahwa amonia secara berkelanjutan dibentuk melalui beragam proses metabolis (Gambar 7.16) 1. nitrogen. 2. Fotorespirasi. Amonia dibebaskan dalam jumlah yg besar dalam konversi glisin menjadi serin selama fotorespirasi dalam mitokondria; kebanyakan amonia ini kemudian direasimilasi di kloroplas (Chapter 3.) 3. 4. Metabolisme transport senyawa. Reaksi asam amino spesifik. Amonia dilepaskan selama penguraian aspargin, arginin dan ureida. Amonia dilepaskan selama resksi metabilis spesifik yang melibatkan asam amino. Termasuk konversi fenilalanin menjadi cinnamat dalam proses produksi lignin (lihat Chapter 8.), konversi cystathionin mejadi homosistein dalam sintesa metionin, dan konversi threonin menjadi 2-oksobutirat dalam biosintesa isoleusin. 5. Katabolisme protein. Seperti yang sudah disebutkan sebelumnya, protein dapat di hidrolisa selama perkecambahan benih atau selama proses Asimilasi awal. Amonia merupakan produk reduksi nitrat dan fiksasi

penuaan daun. dehidrogenase.

Amonia kemungkinan dilepaskan dari operasi

glutamat

Kelompok amiono dari semua asam amino lainnya dapat diteruskan melalui glutam,at, membebaskan asam 2-okso yang dapat di metabolisme untuk menghasilkan energi. Jelas bahwa seiring dengan masuknya nitrogen sebagai nitrat di akar, amonia mungkin dilepaskan dalam jumlkah yang berbeda, tergantungtimbunan nitrogen yang ada pada protein cadangan benih. Pada setiap kesempatan, amonia direasimilasi dengan cepat ke posisi amida glutamin, dikatalisa oleh glutamin sintetase. Mayoritas nitrogen amida ditransfer ke asam amino lain melalui glutamat sintase, tetapi beberapa glutamin kemungkinan digunakan untuk transportasi langsung (lihat Gambar 7.6). konfirmasi siklus daur ulang amonia penting telah dihasilkan dengan menggunakan inhibitor spesifik GS, metionin sulfoksimin dan fosfinotrisin (Gambar 7.17). penambahan senyawa ini pada tanaman menimbulkan efek yang dramatis pada metabolisme dan menyebabkan akumulasi amonia di semua jaringan tanaman. Pada tanaman C3 (dan beberapa tanaman C4) fotosintesis dihambat oleh keperluan jangka pendek asam amino untuk konversi glioksilat menjadi glisin pada siklus fotorespirasi (lihat Chapter 2). Fosfinotricin merupakan dasar dari herbisida-herbisida penting yang dinamakan glufosinat atau Basta. untuk enzim dari Streptomyces spp. Bukti kunci mengenai pentingnya fotorespirasi dalam produksi amonia telah didapat dengan menggunakan mutasi tanaman C3 yang menghambat GS kloroplas (barley) dan /atau GS ferredoksin-dependent (barley, Arabidopsis, dan kacang polong). Tanaman mutan tersebut tidak mampu mengasimilasi pelepasan amonia selama konversi glisin menjadi serin dalam fotorespirasi. Tanaman memperlihatkan beberapa simpton stress setelah diekspos ke udara pada 350l-1 karbon dioksida tetapi tumbuh normal diudara pada tingkat karbondioksida 7000 l-1, pada saat fotorespirasi ditekan. Metabolisme perlakuan fotorespirasi dan tanaman yang kekurangan glutamin sintetase`serupa dan memberikan dukungan yang jelas terhadap anggapan bahwa jalur fotorespiratori (lihat Chapter 2) secara Ketahanan terhadap herbisida ini dapat dihasilkan dengan menciptakan tanaman transgenik dengan menintroduksi gen

kuantitatif jauh penting daripada jalur metabolisme yang memerlukan nitrogen lainnya di daun tanaman C3. KELUARGA ASAM AMINO Asam amino dapat dibagi kedalam kelompok-kelompok, masing-masing dengan prekursor kepalanya, berdasarkan jalur biosintesanya. menentukan lokasi asam amino individual. 1. Aspartat. Aspargin, lisin, treonin, metionin dan isoleusin. Meskipun leusinhj dan valin bukan merupakan derivat karbon dari aspartat, mereka memiliki jalur enzim umum yang sama dengan isoleusin. 2. 3. Glutamat. Glutamin, arginin, prolin dan -aminobutirat. Pyruvat. Derivat dari asam amino prekursor tiga karbon dan paling heterogen, mencakup alanin, serin, sistein, dan glisin. Piruvat menyumbangkan karbon ke lisisn, isoleusin, leusin, dan valin, dan fosfoenolpirvat ikut serta dalam sintesa asam amino aromatik melalui jalur shikimat. 4. 5. Erytrosa 4 fosfat. Asam amino aromatik fenilalanin, tirosin dan triptofan, melalui jalur shikimat. Ribosa 5-fosfat. Histidin. JALUR ASPARTAT Sumber utama protein tanaman adalah sereal dan biji legum. Sangat Pembagian ini sangat artifisial dan ada beberapa situasi dimana keputusan harus diambil untuk

disayangkan sereal mungkin tidak mengandung cukup banyak lisin dan treonin dan biji legum tidak mengandung cukup banyak treonin dan metionin. Suplementasi makanan dengan benih tanaman yang kaya akan asam amino sangat diperlukan untuk meningkatkan nilai gizi makanan. Karena inilah ada banyak sekali perhatian yang diarahkan pada jalur aspartat pada sintesa asam amino. Biosintesa lisin, treonin, metionin dan isoleusin ditunjukkan pada Gambar 7.18. Percobaan menggunakan aspartat 14C menunjukkan bahwa kloroplas dapat menyintesa lisin, treonin, isoleusin dan homosistein pada reksi terang yang berarti berlangsung selama fotosintesis. Penelitian subseluler berikutnya menunjukkan bahwa pada konversi homosistein menjadi metionin terjadi di sitoplasma. Bukan

kebetulan apabila semua asam amino esensial yang diperlukan hewan dari makanan mereka disentesa tumbuhan di dalam kloroplas. Dan hewan juga memiliki kemampuan untuk mengonfersi homosistein menjadi metionin. Sintesa Lisin Sejumlah enzim pada jalur aspartat bertujuan untuk mengakhiri

penghambatan produk balik.

Proses ini memungkinkan asam amino disintesa

secara individual sesuai dengan kebutuhan, tapi mencegah sintesa kelompok, yang membutuhkan banyak karbon dan nitrogen. Enzim aspartat kinase mengkatalis fosforilasi ATP-dependent kelompok aspartat -karboksil (enzim 1, gambar 7.18; lihat gambar 7.19). Tiga isoenzim aspartat kinase telah berhasil diisolasi dari jaringan tumbuhan tingkat tinggi, dan keberadaannya dibuktikan dengan analisis genetik. Isoenzim pertama (AKI) bertujuan untuk menghambat hasil balik treonin dan hanya ada dalam jumlah yang sedikit pada jaringan yang sedang bertumbuh. Enzim co-purify dengan treonin sensitif homoserin dehidrogenase dan isolasi klon DNAc mengkonfirmasikan bahwa kedua enzim berada di protein bifungsional yang sama dengan yang ada pada E.coli. enzim lainnya (AKII dan AKIII) serupa satu sama lain dan keduanya menghambat lisin. Dua gen homolog menyandikan subunit 52,5 kDa lisin sensitif AK dgn kloroplas transit peptida yg diisolasi dari A.thaliana, mengkonfirmasi data biokimia awal. Metionin sendiri tidak memberikan pengaruh langsung terhadap isoenzim aspartat kinase, namun mampou mempengaruhi jalur karbon melalui aktivasi bentuk S-adenosil metionin. AKII dan AKIII bertujuan untuk pernghambatan sinergis S-adenosilmetionin dan lisin. Sadenosilmetionin sendiri memiliki kemampuan menghambat yang sangat kecil, tetapi dapat sangat mengurangi konsentrasi apabila bekerja bersama dgn lisisn. Hal ini dapat dgn mudah dilihat pada gambar 7.20 (lihat juga gambar 7.34) Seiring dgn reduksi aspartil fosfat menjadi aspartat semialdehid (2;gambar 7.21), cabang pertama dari jalur ini mengarah pada sintesa lisin. Dihidrodifikolinat dibentuk dari kombinasi piruvat dan aspartat semialdehid dan dikalasisis oleh dihidrodipikolinat sintase (DHDPS, 3; Gambar 7.22). enzim ini sangat sensitif pada kehadiran lisin, yang merupakan inhibitor kompetitif berkenaan dengan aspartat semialdehid, dan nonkompetitif berkenaan dengan piruvat. Seperti yang akan

dibahas selanjutnya, DHDPS merupakan enzim utama dalam sintesa lisin pada tumbuhan tingkat tinggi. Gen yang menyandikan 35-38 kDa subunit enzim ini telah berhasil diisolasi dari sejumlah tanaman dan telah menunukkan kandungan trasnsit peptida kloroplas. Meskipun jalur dari dehidrodipikolinat menuju meso-2,6diaminopimalat pada tumbuhan tingkat tinggi masih kabur, bukti-bukti tak langsung tetap mengindikasikan bahwa rute yang ditunjukkan pada Gambar 7.18 benar. Meskipun telah diajukan satu enzim memiliki kemampuan untuk membantu reaksi 5-8, hasilnya masih belum dikonfirmasi. Tidak ada bukti bahwa pada tumbuhan tingkat tinggi lisisn dapat disintesa melalui asam -aminoadipat, jalur yang ada pada jamur. Sintesa Teonin Aspartat semialdehid dikonversi menjadi homoserin oleh homopseri dehidrogenase (HSDH.10; Gambar 7.23). enzim ini terdapat dalam dua bentuk isoenzim, salah satunya sensitif tidak terhadap penghambatan oleh treonin dan terletak di sitoplasma, dan yang satunya lagi sensitif terhadap penghambatan oleh treonin dan terletak di kloroplas. Bentuk yang kedua merupakan bagian dari protein bifungsional bersama dengan aspaertat kinase. Homoserin difosforilasi oleh homoserin kinase (11) pada reaksi ATPdependent untuk menghasilkan fosfohomoserin (Gambar 7.24), yang dapat dikonversi menjadi treonin oleh treonin sintase (12; Gambar 7.25). Yang tidak biasa adalah bahwa enzim ini memerlukan sadenosilmetionin untuk bereaksi. Pada tumbuhan tertentu (misalnya kacang polong) homoserin dapat berakumulasi pada konsentrasi tinggi dan digunakan sebagai nitrogen cadangan dan senyawa transport. Sintesa Metionin Fosfohomoserin juga merupakan prekursor metionin dan bereaksi dengan sistein untuk menghasilkan sistationin, dikatalisis oleh sistationin--sintase (13; Gambar 7.26). Tingkat aktivitas enzim dapat ditekan dengan kehadiran metionin dan meningkat pada kondisi kekurangan metionin (Gambar 7.27).

Sistationin dipotong oleh -liase untuk menghasilkan homosistein (14; Gambar 7.28). Reaksi yang terjadi pada tanaman harus lebih mudah dikenali dibandingkan reaksi -liase yang terjadi pada hewan, dimana sistationin dipotong untuk menghasilkan sistein dan 2-oksobutirat. Analisis klon DNAc menyanbdikan kedua enzim metabolisme sistationin mengindikasikan bahwa keduanya mempunyai rantai transit kloroplas. 7.28). Sekelompok metil derivat dari N-

metiltetrahidrofolat diperlukan untuk langkah akhir dalam sintesi metionin (Gambar S-adenosilmetionin dibentuk oleh S-adenosilmetionin sintase yang mengiringi reaksi metionin dengan ATP (16; Gambar 7.29). Kedua enzim tersebut berada di sitoplasma, dan tidak seperti semua enzim lain di jalur aspartat pada biosintesa asam amino. S-adenosilmetionin (AdoMet) merupakan reagen metilasi universal, menyumbangkan sekelompok metil untuk protein, asam nukleat dan senyawasenyawa lain seperti fosfolipid dan lignin. Produk S-adenosilhgomosistein dpt direkonversi menjadi metionin, pada tumbuhan tingkat tinggi atom karbon utama dari S-adenosilmetionin juga dapatdigunakan untuk sintesa etilen dan poliamin (Gambar 7.30). metiltioadenosin (MTA), produk dari kedua reaksi, dapat didaur ulang untuk menyintesa metionin tanpa homosistein sebagai penengah. Rangka metionin C4 merupakan derivat dari kelompok ribosol ATP. Sintesa Isoleusin Langkah pertama dalam sintes isoleusin adalah deaminasi treonin oleh treonin dehidratase (deaminase) menjadi 2-oksobutirat dan amonia. Enzim kloroplas daun bertujuan untuk menghalangi penghambatan oleh isoleusin. Namun, bentuk enzim ke-dua yang tidak sensitif isoleusin dpat beraksi pada tingkat tinggi pada bunga dan daun yang menua, yang kemungkinan juga mencakup katabolisme treonin. Langkah kunci dalam konversi treonin menjadi isoleusin adalam kombinasi 2-oksobutirat dengan piruvat untujk menghasilkan asetohidroksibutirat (Gambar7.31). Reaksi ini sangat erat hubunannya dengan sintesa valin dan leusin dimana dua molekul -piruvat bereaksi untuk membentuk asetolaktat (Gambar 7.32). Kedua reaksi ini kelihatannya dikatalisis oleh enzim yang sama, yaitu asam asetohidroksi sintase. Enzim ini bertujuan untuk membatasi penghambatan oleh

isoleusin, leusin dan valin. sintase.

Sebagai tambahan, leusin dgn unik mampu

mengaktifkan enzim pertama untuk sintesanya sendiri, yaitu -isopropil-malat Ensim asam asetohidroksi sintase tyelah banyak diteliti, seiring dgn penemuan bahwa enzim ini merupakan zat aktif pada dua kelas herbisida utamasulfonilureas dan imidazolinon (Gambar 7.33). nilai K1 herbisida sulfonilurea berkisar antara 5-20 nM, sedangkan amidazolinon berkisar antara 2 60 M. Afinitas enzim yang tinggi memastikan bahwa herbisida hanya perlu diaplikasikan pada tanaman pada dosis yang sangat rendah. Sejumlah kecil subunit kode gen enzim yang memiliki massa molekul yang berkisar antara 58 66 kDa telah berhasil dideteksi pada tumbuhan tingkat tinggi. Mutasi tumbuhan mutasi yang tahan herbisida telah berhasil diisolasi, dan analisis rantai DNA gen asam asetohidroksi insensitif herbisida sintase menunjukkan bahwa mutasi pada satu poin yang mengubah satu asam amino, dapat menghasilkan ketahanan. Tanaman transegenik yang mengandung mutan dari asam asetohidroksi sintase juga tahan terhadap herbisida. Pengaturan Menyeluruh Jalur Aspartat Skema sederhana jalur sintesa menyeluruh ditunjukkan pada Gambar 7.34; prosesnya dapat diringkas sebagai berikut: 1. 2. Lisin menghambnat dua isoenzim aspartat kinase dan enzim pertama khusus untuk sintesanya sendiri, dihidrodipikolinat sintase Teonin menghambat salah satu isoenzim aspartat kinase dan saru isoenzim homosistein dehidrogenase. Mekanisme berikutnya belum terlihat berkerja pada kondisi in vivo. 3. Metionin muncul dan bekerja melalui aktivasi bentuk S-adenosilmetionin. Dua isoenzim aspartat karena kinase adanya secara lisin. sinergis dihambat oleh Sadenosilmetionin S-adenosilmetionin mampu

mengaktifkan treonin sintase. 4.

Ada bukti bahwa metionin dan/atau S-

adenosilmetionin dapat menekan sintesa sistationin--sintase. Isoleusin menghambat enzim pertama yang khusus untuk sintesanya sendiri, treonin dehidratase.

Produksi Berlebihan Lisin dan Treonin Pada Gambar 7.34 menunjukkan bahwa apanila lisin dan treonin ditambahkan bersama-sama mereka akan secara total mencegah aliran karbon ke metionin, dengan penghambatan aspartat kinase. Hipotesis ini dapat diuji pada tan yg ditumbuhkan pada media steril, dimana kombinasi 2 mM lisin dan treonin menghambar pertumbuhan. Penambahan metionin dgn konsentrasi rendah secara total melepaskan penghambatan pertumb ini. Baris mutan pada barley, tembakau dan jamung yg tahan terhadap reaksi toksik lisin dan treonin telah diisolasi. Baris ketahanan individu barley memperlihatkan kemampuan memutasi bentuk AKII atau AKIII yg tidak lagi bertujuan untuk menghambat lisin (Gambar 7.35). tumb mutasi seperti ini mmperlihatkan peningkatan konsentrasi treonin di daun. Tembakau mutan yg telah berhasil diisolasi tahan terhadap toksisitas analog lisin S-amonietilsistein (AEC). Tan mutan menperlihatkan peningkatan 28 kali lipat larutan lisisn di daun, dan enzim DHDPS tidak lagi sensitif terhadap hambatbalik lisin. Saat mutan dengan tahan AEC yg tinggi disilangkan dgn mutan lisin dan treonin (treonin tinggi), kenurunannya mengandung lisin dalam konsentrasi yg jauh lebih tinggi, namun treonin dalam konsentrtasi yang dibawah normal. Data yang mengkonfirmasikan bahwa DHDPS mempunyai kapasitas untuk mendesak pengendalian yang kuat terhadap njalur aspartat dan dapat menyebabkan kekurangan aspartat semialdehid pada lisin saat enzim di deregulasi. Banyak upaya dilakukan untuk meningkatklan kandungan lisin dan treonin dengan rekayasa genetic. Transformasi tanaman tembakau dengan sandi enzim bakteri AK insensitive dan DHDPS menyebabkan peningkatan yang dramatis konsentrasi larutan treonin dan lisin di daun, khususnya saat enzim diarahkan ke kloroplas. Upaya menigkatkan konsentrasi lisin pada tembakau dengan induksi penghentiad jalur lisin tidak berhasil. Namun percobaan dgn menggunakan canola dan kedelai transgenik menggunakan gen dari bakteri Corynebacterium glutamicum, yang menyandikan DHDPS insensitif-lisin, telah menghasilkan hasil yang dramatis, dimana total kandungan lisin meningkat lebih dari 5 kali lipat dari 5,4 menjadi 34% dari total asam amino pada benih. Falco et al menghitung bahwa kebutuhan lisin dalam makanan hewan adalah s1.20 per lbs (52,60 per kg). Kedelai

trasngenik yang mempunyai kandungan lisin dua kali lipat yaitu sekitar 3 lb tambahan lisin per 100 ld biji yang dimakan. akan memberikat peningkatan hasil sebanyak 35%. ASAM AMINO GLUTAMAT Prolin Seperti juga kebanyakan protein yang terdapat dalam biji-bijian, prolin juga diduga memiliki kemampuan sebagai pelindung osmotik pada tanaman yang mengalami cekaman kekeringan atau salinitas. Contoh akumulasi prolin pada barley yang mengalami secakam kekeringan ditunjukkan pada Gambar 7.36. penelitian menunjukkan bahwa akumulasi prolin mengacu pada peningkatan 10 kali lipat peningkatan sintesa dan reduksi degradasi secara bersamaan. mengalami kemunduran seiring dengan cekaman kekeringan. Glutamate dikonversi menjadi glutamate semi aldehyd dalam dua reaksi yang serupa dengan yang sudah kita lihat pada aspartat. Klon DNAc telah diisolasi dari nodul Vigna acontifolia yang menyandikan enzim bifungsi -prolin-5-karboksilat sintase, yang menghambat aktivitas -glutamil kinase dan glutamate semialdehid dehidrogenase (Gambar 7.37). sebelumnya terbukti musthil menguji aktivitas enzim pada tumbuhan normal, tetapi protein menunjukkan reaksi berlebihan pada E.coli dan aktivitas -glutamil kinase memperlihatkan reaksi balik oleh prolin. Tembakau transgenic y mengandung gen berlebih -prolin-5-karboksilat sintase mengakumulasi prolin dan menjadi lebih tahan terhadap cekaman kekeringan. Glutamate semialdehid diubah secara nonenzim menjadi bentuk -prolin-5karboksilat yang menurunkan hasil prolin dengan -prolin-5-karboksilat reduktase (Gambar 7.37). aktivitas enzim ini terhadap cekaman kekeringan tidak pada level RNAm, yang memiliki 29 kDa subunit protein. Tanaman transgenik memiliki aktivitas -prolin-5-karboksilat reduktase yang tidak meningkatkan konsentrasi prolin 50 kali lipat lebih tinggi, mengindikasikan bahwa enzim ini tidak mengontrol jalur. Gen yang menyandikan prolin dehidrogenase yang bertanggungjawab terhadap oksidasi prolin Jadi kedlai transgenik sama berharganya dgn tambahan 53,60 per 100 lb diatas biji komoditas normal, yang

Arginin Arginin adalah senyawa penyimpan nitrogen utama pada tumbuhan, dimana arginin dapat membentuk 40% nitrogen pada protein benih dan 50-90% nitrogen terlarut pada pohon-pohonan, grape vines dan umbi bunga. Arginin dan ornitin juga dapat menjadi precursor untuk metabolit sekunder poliamin. Sentesa arginin diproses melalui ornitin, yang merupakan derivat glutamat pada jalur asetilasi (Gambar 7.38). ingat bahwa formasi semi aldehid serupa dgn tahapan utama sintesa prolin. Namun kehadiran kelompok N-asetil pencegah reaksi siklus nonenzim yang memungkinkan reaksi transaminasi sintesis ornitin. Ornitin dikonversi menjadi arginin, seiring dengan masuknya dua kelompok amino tambahan, yang merupakan derivat dari karbonil fosfat dan aspartat. Nitrogen dari karbamoil fosfat merupakan derivat dari nitrogen amida glutamin, dikatalisis oleh karbamoil fosfat sintase (Fambar 7.39). enzim ini juga diperlukan untuk sintesa pirimidin dan dihambat oleh UMP, namun diaktifkan oleh ornitin. fosfat; jalur sintesa arginion ditunjukkan pada Gambar 7.40. Peda kotiledon kecambah legum, arginin didegradasi oleh arginase menjadi ortinin dan urea, yang secara subsekuen dapat dimetabolis oleh eurease menjadi amonia dan CO2. juga ada bukti bahwa arginin dapat dimetabolis di dalam kloroplas untuk menghasilkan amonia dan citrulin, yang dapat dimetabolis lebin lanjut melalui karbamoil fosfat menjadi amonia dan CO2. mekanisme seperti ini memungkinkan transport CO2 dan ammonia ke dalam kloroplas. -Aminobutirat meskipun asam amino non protein, sintesa -aminobutirat (GABA) dalam jumlah besar sebagai akibat dari beragam cekaman lingkungan, termasuk hipoksia, suhu rendah, kejut panas, pH rendah dan kerusakan kimiawi, telah seringkali direkam. GABA disintesa oleh -dekarboksilasi glutamat oleh glutamat dekarboksilase dgn membebasjkan CO2 dan konsumsi proton. Secara khusus, enzim hanya aktif pada pH tertentu pada sitoplasma. Namun, seiring dgn isolasi dan penerjemahan rantai DNAc glutamat dekarboksilase, enzim ini kelihatanhya diaktifkan oleh kalsium dan kalmodulin dan dapar berekasi pada pH 7,0. Ornitin karbamoiltransferase mengkatalisis sintesa citrulin dari ornitin dan karbamoil

ASAM AMINO AROMATIK Jalur biosintesa ( melalui jalur shikimat) sintesis tiga asam amino aromatik fenilalanin, tirosin dan triptofan sangat panjang dan kompleks. Struktur dan nama dari mayoritas penengah tidak bisa dibahas di bagian ini. Ketiga asam amino tersebut dan beberapa penengah merupakan precursor dari produk sekunder Secara ringkasnya jalur ini dapat tanaman, yang dibahas pada Chapter 8.

digambarkan seperti yang terlihat pada Gambar 7.41. Jalur shikimat dapat dibagi menjadi tiga bagian. Sintesis korismat sangat umum untuk ketiga asam amino aromatik ini. Di atas korismat, ada cabang yang menuju fenilalanin, tirosin dan satu cabang lain menuju triptofan. Ada bukti yang kuat bahwa jalur shikimat komplek dapat berlangsung dikloroplas, namun keberadaan jalur sitoplasmik kedua masih diperdebatkan. Dua bentuk isoenzimdari enzim pertama (1).3-deoksi-arabinoheptulosonat-7P (DAHP) sintase, telah berhasil diisolasi dari tanaman, salah satunya memerlukan Mn2+ dan yang satunya lagi memerlukan Co2+ untuik aktivitasnya. Arogenat dan prepenat menghambat enzim Mn-dependent, dan pada beberapa lingkup triptofan dapat mengaktifkan kembali enzim ini. Aktivitas DAHP sintase meningkat seiring dengan adanya luka, berkorelasi dengan peningkatan sintesa metabolit sekunder. Dua rantai DNAc enzim ini telah berhasil diisolasi, dimana keduanya menampakkan perbedaan dalam jaringan tanaman dan mempunyai respon yang berbeda terhadap luka dan serangan patogen. Korismat mutase (13) mengkatalis konversi korismat menjadi prepenat dan juga terdapat dlm dua bentuk isoenzim. Korismat mutase-1 bertujuan untuk memfeedback penghambatan oleh tirosin dab fenilalanin dan aktivasi oleh triptofan, sedangkan isoenzim yang kedua insensitif terhadap asam amino aromarik. Pada beberapa tanaman, seperti alfalfa, terdapat tiga isoenzim, yang dapat menghambat metabolit sekunder. Awalnya dianggap prepenat dikonversi menjadi bentuk lain fenilpiruvat (14) atau hidroksi fenilpurivat (16) dengan transaminasi rantai (15) untuk menghasilkan fenilalanin dan tirosin. Namun sekarang terbukti bahwa pada kebanyakan tumbuhan tingkat tinggi fenilalanin disintesa oleh dan diatur oleh

arogenat dehidratse (18), sementara tirosin disintesa oleh dan diatur oleh arogenat dehidrogenase (19). Antranilat sintase (8) bertujuan untuk mem-feedback aktivitas triptofan, namun tidak mem-feedback antivitas tirosin atau fenilalanin. terdapat dalam bentuk 22. Protein enzim mengandung dua subunit yang berbeda ditandai dengan dan dan kemungkinan pada A.thalianan, dua sandi gen yang memiliki subunit dan 3 sandi gen subunit telah berhasil diisolasi dan dapat dibedakan. Satu enzim yang tidak begitu penbting dalam sintedsa korismat adalah 5enol-piruvylshikimat 3-fosfat (Gambar 7.42). glufosfat merupakan penghambat yang potensial dan terikat pada sisi aktif PEP. Herbisida yang menyebabkan shikimat dan shikimat 3-fosfat, dan munculnya sifat racun dapat dilawan menambahkan fenilalanin, tirosin dan triptofan. Dua gen yang menyandikan EPSP sintase telah berhasil ditemukan dari beragam tanaman, salah satunya yang memiliki aktivitas tinggi pada kelopak bunga petunia. Enzim ini awalnya disintesa sebagai precursor 55 kDa pada ribosom sitoplasma dan ditranportasikan ke kloroplas dengan memindahkan 7 kDa peptide transit. Tanaman yang tahan herbisida telah dihasilkan dari penambahan gen bakteri yang menyandikan EPSP sintase yang insensitive tehaap penghambatan oleh glifosfat. Tanaman ini sekarang penting dalam dunia pertanian komersil. Histidin disintesa dalam jalur lurus yang terpisah dari fosforibosil pirofosfat yang memerlukan 10 langkah enzim termasuk penengah imidazol kemplek. Informasi mengenai bagaimana jalur ini berkerja pada tumbuhan tingkat tinggi masih sangat sedikit. Namun seiring dengan identifikasi kelas herbisida baru yang menghambat sintesa histidin, imidazolgliserol fosfat dehidratese telah berhasil dimurnikan dan rantai gen DNAnya yang mengandung 25 kDa subunit berhasil diisolasi. Reaksi akhir pada jalur ini dikatalisa oleh histidinol dehidrogenase dan menghasilkan langkah reduksi 4 elektron dari histidonol menjadi histidin. Enzim ini berhasil dimurnikan dari kubis. ASIMILASI SULFAT Sulphur merupakan bagian penting dalam sistein, metionin dan glutionin, sehingga penting sekali untuk mempertimbangkan asimilasi sulfat. Sulfat diserap

oleh akar dengan sistem proton sulfat ko-transport, yang dapat terjadi dengan cara yang serupa dengan transport nitrat, baik pada afinitas rendah maupun tinggi. Pengiriman dengan afinitas tinggi telah berhasil diklon dengan komplementasi mutasi ragi dan transkripsi gen yang dipicu oleh difisiensi sulfat. Diperkirakan rantai protein memiliki 12 titik trans-membran. Reduksi Sulfonat Sifat kimia sulfat sangat stabil dan memerlukan masukan energi sebelum dapar di reduksi. Aktivasi terjadi pada saat ATP diubah menjadi APS, dalam reaksi yang dikatalisa ATP sulfurilase, suatu enzim yang dominant berada di kloroplas: Langkah enzim antara APS dan sistein, bentuk organik pertama sulfur diketahiu dapat disintesa dengan memerlukan 8 elektron dan hal ini sudah cukup lama menjadi kontroversi. Hipotesa sebelumnya menyimpulkan: (i) eksistensi ikatan intermediate glutationin tiosulfat melibatkan enzim APS-sulfotransferase, mengikuti reduksi oleh tiosulfonat reduktase; (ii) langkah aktivasi ATP ke-dua menjadi 3-fosfoadenosin 5-fosfosulfat (PAPS), diikuti oleh reduksi oleh PAPS reduktase dan sulfit reduktase. Sekarang diketahui enzim APS reduktase memainkan peranan penting dalam jalur: APS SO32- S2APS reduktase, yang juga terdapat di kloroplas, mengkatalisa konversi APS menjadi sulfit dan mempunyai struktur seperti tioredoksin pada ujung karboksil. 6 elektron yang diperlukan untuk reduksi sulfit menjadi sulfida merupakan derivate dari ferredoksin yang tereduksi, yang dibentuk langsung melalui fotosistem I dalam kloroplas. Reaksi ini dikatalisis oleh sulfit reduktase, yang mengandung sirohaem dan kluster 4FE-4S yang sama seperti pada nitrat eduktase. Sulfit bebas dikonversi menjadi sistein, dalam kombinasi dengan Oasetilserin dalam reaksi yang dikatalisis oleh enzim O-asetilserin (tiol) liase (Gambar 7.43). enzim ini diketahui berada di kloroplas, mitokondria, dan sitoplasma, kemingkinan karena ketidakmampuan sistein untuk menembus membrane. O-asetilserin disintesa oleh asetilasi serin, menggunakan asetil koA sebagai substrat dan enzim serin asetiltransferase.

Penelitian terhadap pembelahan sel dan molecular mengindikasikan bahwa serin asetiltransferase terdapat di sitoplasma dan organel-organel. Aktivitas enzim yang diekstraksi dari jaringan tanaman lebih rendah dari pada O-asetilserin (tiol) liase dan dapat ikut serta dalam mengendalikan jalur asimilasi. sistein sintase. Koordinasi penting antara asimilasi nitrat dan sulfat telah ditemukan. Bentuk nitrogen tereduksi menstimulasi reduksi fosdat, dan barlaku sebaliknya. Glutationin Konsentrasi sistein bebas pada tumb tingkat tinggi normalnya sangat rendah, dikarenakan adanya aktivitas sekelompok tiol bebas. Sistein juga bereaksi dengan fosfomoserin dalam biosintesa metionin atau di konversi menjadi tripeptida glutationin: Glutationin terdapat dalam bentuk tereduksi sebagai GHS atau bentuk teroksidasi sebagai GSSG, di mana dua moleku terikat dengan ikatan sulfida, sama seperti yang ditemukan pada strukjtur tersier pada beberapa protein. Glutationin dapat bersifat sebagai senyawa sulphur simpanan atau pun senyawa sulphur yang ditransportasikan, namun ada kemungkinan tripeptida juga mempunyai peranan penting dalam pertahanan tanaman terhadap berbagai cekamam lingkungan, misalnya dingin, pasan, kekeringan, cahaya tinggi, serangan jamur, dll. Glutationin dapat mengikat herbisidan dan senobiotik lannya melalui enzim glutationin Stransferase. Fitokelatin merupakan polimer dari -glutamilsistein, yang terlibat dalam kelasi logam toksik tertentu seperti cadmium. Glutationin dan askorbat memainkan peranan khusus yang penting di kloroplas dalam mendetoksifikasi spesies yang diaktifkan oksigen yang kemungkinan terbentuk pada saat jumlah electron transport melalui PSI melampaui jumlah reduksi karbon dioksida, misalnya pada cahaya tinggi dan suhu rendah. Superoksida (O2- ), terbentuk oleh reduksi oksigen yang dengan cepat dikonversi menjadi peroksida melalui operasi dismutasi superoksida: Dua enzi Oasetilserin (tiol) liase dan serin asetiltransferase dapat berasosiasi bersama dengan

Hydrogen peroksida didetoksifikasi melalui serangkaian reaksi pada siklus glutationin/askorbat yang tergantung pada NADPH yang dibentuk pada reaksi terang fotosintesis sebagai sumber reduktan (Gambar 7.44). Kedua enzim ATP-dep[endent yang terlibat dalam sintesis glutationin, glutamilsistein sintase dan glutationin sintetase terbukti sangat sulit diuji pada jaringan tanaman, tetapi rantai DNAc yang menyandikan enzim-enzim tersebut sekarang telah berhasil diisolasi.tan transgenic (termasuk poplar) mengandung enzim-enzim ini dalam tingkatan yang ditinggikan dan sekarang sedang diuji ketahanannya terhadap berbegai cekaman lingkungan. Telah dikemukakan bahwa konsentrasi hydrogen peroksida sdan rasio GSH ; GSSG kemungkinan terlibat dalam mekanisme penyinalan intra selular untuk toleransi terhadap cekaman. FOTOSINTESIS YANG MELIBATKAN METABOLISME NITROGEN DAN SULFUR Secara singkat sering diajarkan bajhwa fotosintesis adalah asimilasi karbondioksida menjadi karbohidrat yang dilakukan kloroplas dengan bantuan cahaya. Tapi pernyataan ini tidaklah mampu menggambarkan keseluruhan proses fotosintesis. lipid: 1. 2. 3. Nitrit (bukan nitrat) dapat direduksi oleh kloroplas pada reaksi terang Nitrit reduktase, bagian utama glutamin sintetase dan glutamat sintase Jalur reaksi terang fotorespirasi mencakup sintesa glisin oleh menjadi glutamin dan glutaman terletak di dalam kloroplas. transaminasi glioksilat. Pelepasan amonia mengikuti konversi glisin menjadi serin direasimilasi dalam kloroplas 10 kali lebih cepat dari pada asimilasi njitrat (Chapter 2). 4. Pada tumbuhan C4, aspartat, alanin, dan glutamate terlibat secara ekstensif dalam transport metabolit antara seludang berkas dan mesofil sel selama proses fotosintesis (lihan bab 3). 5. Kloroplas memiliki kapasitas untuk mengkonversi aspartat, treonin, isoleusin dan homosistein (tapi bukan metionin) dalam reaksi terang. Kloroplas NADPH dan ATP yang dibentuk melalui dua fotosistem dapat digunakan untuk mnyintesa sejumlah besar senyawa, mulai dari asam amino hingga

juga mempunyai kapasitas untuk mengkonversi piruvat menjadi leusin, isoleusin dan valin dan menyintesa asam amino aromatik. 6. Bagian utama (jika tidak semua) enzim yang diperlukan untuk fotosintesis asam amino esensial lisin, treonin, isoleusin, isoleusin, homosistein, leusin, valin, triptofan, fenilalanin, dan tirosin terletak di kloroplas. Sebagai tambahan , beberapa enzim yang terlibat dalam sintesis argininb dan prolin juga terletak di kloroplas. 7. Kloroplas memiliki kapasitas untuk mereduksi sulfat menjadi sistein, dan enzim yang terlibat dalam jalur ini terletak di kloroplas, meskipun sintesis sistein terjadi di ruang antara sel. Reduksi glutationin sebagai mekanisme detoksifikasi superoksida juga merupakan reaksi terang yang terjadi dalam kloroplas. 8. Sejumlah protein (misalnya subunit besar rubisco, subunit ATP saat mendapat sintase dan sitokrom tertentu) disandikan oleh DNA kloroplas. Kloroplas mempunyai kapasitas untuk menyintesa protein-protein ini masukan asam amino radioaktif dalam reaksi terang. Sebagai tambahan, kloroplas mempunyai kapasitas untuk menyintesis sejumlah asam lemak jenuh, asam nukleat dan klorofil yang menggunakan NADPH dan ATP yang dibentuk secara langsung dengan fotosistem. Pada jaringan yang tidak hijau, pada daerah akar, sejumlah proses yang digambarkan diatas masih bisa berlangsung pada tingkatan yang lebih rendah. Plastida tetap merupakan tempat penting untuk metabolisme nitrogen, walaupun energi yang diperlukan harus di dapat dari katabolisme gula yang ditransfer dari daun. Gambar 7.1. gambaran sederhana jalur yang dilalui nitrogen mulai dari penyerapan di akar hingga deposisi akhir sebagai protein dalam benih menurut B.J.Miflin. Gambar 7.2. aliran 13NO3- ke dalam akar barley pada tanaman yang diberi perlakuan 0,1 mM NO3- selama 1 hari (), 4 hari (X) atau dengan 10 mM NO3selama 4 hari (). Dari Siddiqi et al., 1990, dengan izin dari American Society of Plant Physiologists (Perhimpunan Fisiologi Tumbuhan Amerika). Gambar 7.3. aliran 13NO3- ke dalam akar barley yang tidak diberi perlakuan. Gambar 7.4. analisis RNAm yang menyandikan nitrat reduktase dari A.thaliana yang diberi perlakuan nitrogen dari berbagai sumber seperti yang diperlihatkan. Aktivitas nitrat reduktase (NRA) diukur pada jaringan yang sama. Direproduksi dengan izin dari N.M.Crawford et al., 1998. Gambar 7.5. model spekulasi mekanisme pengendalian aktivitas dapat balik NR pada daun abaym. Konversi NR pada reaksi gelap ke bentuk aktivitas rendah

memerlukan NR kinase dan protein penghambat 14-3-3-nitrat reduktase (NIP), yang memiliki kapasitas untuk mengikat dua protein sasaran. Pada reaksi terang NR diaktifkan dengan pelepasan kelompok fosfat oleh NR fosfatase (PP2A). Direproduksi dengan izin dari Mackintosh et al.,(1995). Gambar 7.6. asimilasi ammonia pada tumbuhan tingkat tinggi melalui siklus glutamat sintetase/glutamin sintase. Gambar 7.8. kontrol genetik isoenzim GS pada P. vulgaris. Gambar 7.9. Peningkatan RNAm yang berkaitan dengan 4 gen GS P.vulgaris pada nodul akar dan daun. Gambar 7.16. reaksi metabolisme yang memproduksi amonia pada tanaman. Jalur 1-5 digambarkan pada teks. GDH = Glutamat dehidrogenase, 2-OG = 2oksogutarat. Berdasarkan diagram dari K.W.Joy (1988). Gambar 7.18. jalur metabolisme yang diperlukan untuk sintesa asam amino derivat aspartat lisin, treonin., metionin, dan isoleusin pada tumb tingkat tinggi. Enzim 1-6 dijelaskan dalam teks. Gambar 7.20. perhambatan sinergis aspartat kinase barley. () hanya Sadenosilmetionin; () hanya lisin; () lisin tambah S-adenosilmetionin; dengan konsentrasi molar yang sama. Dari Rognes et al (1980) Gambar 7.27. pengaruh berbagai asam amino terhadap tingkan ekstraktabel sistionin sintase, diisolasi dari benih barley yang dikecambahkan pada kondisi steril. Gambar 7.34. pengaturan biosintesis asam amino derivat aspartat. (-) penghambatan enzim; (+) aktivasi enzim; - - - -, penahanan enzim. Gambar 7.34. inhibisi feedback isoenzim aspartat kinase yang diekstrak dari tumb liar (+/+), oleh lisin dan lisin ditambah ketahanan treonin yang didapat dari mutasi induk R2501 (Ltla/Ltla) dan tumbuhan heterozigot (Ltla+). Gambar 37.36. hubungan antara potensi air dan kandungan prolin pada daun barley terhadap cekaman kekeringan oleh pengurangan pasokan air. Perlu diingat akumulasi bersar-besaran prolin di daun sebagai akibat dari cekaman yang dialami tanaman. Potensi Air, tanaman yang diairi (- - - ); potensi air, tanaman yang mendapat cekaman (- - - ); konsentrasi prolin, tanaman yang diairi ( ) ; konsentrasi prolin, tanaman yang mendapat cekaman (). Gambar 7.44. siklus glutation/askorbat yang memperlihatkan detoksifikasi hidrogen peroksida pada kloroplas. NADPH di bentuk dari fotosistem. Gambar 7.45. asimilasi nitrogen dalam kloroplas, menunjukkan interaksi ATP dan regenerasi NADPH serta metabolisme fotosintetis nitrogen.

You might also like